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WO2007052643A1 - ワイン発酵もろみ由来の免疫調節作用を有する乳酸菌 - Google Patents

ワイン発酵もろみ由来の免疫調節作用を有する乳酸菌 Download PDF

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WO2007052643A1
WO2007052643A1 PCT/JP2006/321723 JP2006321723W WO2007052643A1 WO 2007052643 A1 WO2007052643 A1 WO 2007052643A1 JP 2006321723 W JP2006321723 W JP 2006321723W WO 2007052643 A1 WO2007052643 A1 WO 2007052643A1
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WO
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lactobacillus
lactic acid
composition
bacterium
acid bacteria
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PCT/JP2006/321723
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takako Yamamura
Taeko Iino
Kyoko Ashikari
Keiichi Abe
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Suntory Ltd
Original Assignee
Suntory Ltd
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Publication date
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/24—Lactobacillus brevis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a Lactobacillus genus having an immunomodulatory action, a composition containing the same, and a method for efficiently separating lactic acid bacteria having an immunomodulatory action.
  • Lactic acid bacteria are known to have beneficial physiological activities such as intestinal regulation and immunostimulation. It is also highly recognized as a material with a health effect for general consumers. Many of the lactic acid bacteria having such beneficial physiological activity are lactic acid bacteria derived from animal materials isolated from fermented milk products and intestinal tract.
  • strains having an immunostimulatory effect have been found in plant lactic acid bacteria derived from plant materials.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 10-167972 (publication date: June 23, 1998) describes Lactobad llus plantarum L-137 strain as a lactic acid bacterium having an immunostimulatory action.
  • Lactobacillus brevis Labre strain isolated from Kyoto's traditional pickle “Suguki” and Lactobacillus pentosus DA74 N strain isolated from “Shiba pickled” are also known to have an immunostimulatory effect (see: (1) Publication No. 7-55908 (publication date: July 26, 1994), (2) Pasken Journal 15.
  • Kishi Kyoko, Kokubo Aoi, Akaya Kaoru, Ogiya Eriko, Fujita Tetsuya, Kishida Tsunataro Screening for selection of useful lactic acid bacteria 1) In vitro immunostimulatory effect of plant lactic acid bacteria in human peripheral blood, (3) 6th Annual Meeting of the Intestinal Bacteria Society (2002.05.30-31) Abstract, Satoshi Akaya, Satoko Kishi, Eriko Ougiya, Aoi Kokubo, Tetsuya Fujita, Tsunataro Kishida).
  • Plant lactic acid bacteria based on plant materials are known to be deeply involved in the brewing of pickles and liquors, and many bacteria can be isolated from the brewing process.
  • strains having useful physiological activities such as immunostimulatory action.
  • Lactobacillus plantarum is a strain that can be isolated from wine brewing processes and has a high separation frequency.
  • isolated bacteria research has mainly focused on brewing effects and contributions to flavors, etc., and little research has been done on the effects of bacteria themselves on living organisms. Therefore, it is expected to find a strain having useful physiological activity among lactic acid bacteria isolated from the liquor brewing process.
  • a unique fermentation odor may be produced.
  • countermeasures and considerations for sensory functions may be required.
  • an object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium having an immunomodulating action, a composition containing the lactic acid bacterium, and a method for separating the lactic acid bacterium having an immunomodulating action.
  • the present inventors investigated the immunoregulatory effect of lactic acid bacteria isolated from the product of the liquor brewing process power, and selected Lactobacillus plantarum and The lactic acid bacteria belonging to Lactobacillus brevis were investigated in more detail for their immunomodulatory effects. As a result, it was found that the lactic acid bacterium has a high immunoregulatory effect, and the fermented product using the lactic acid bacterium exhibits a good flavor, and the present invention has been completed.
  • IL-12 interleukin 12
  • IL-12 interleukin 12
  • lactic acid bacteria with high efficiency and immunomodulatory activity can be isolated, and IL-12 when treated to in vitro peritoneal macrophages prepared with the strength of the strain belonging to Ratatobacillus 'plantarum and Lactobacillus' brevis.
  • IL-12 when treated to in vitro peritoneal macrophages prepared with the strength of the strain belonging to Ratatobacillus 'plantarum and Lactobacillus' brevis.
  • administration of a heated bacterial solution in vivo into the abdominal cavity of mice induced the production of IL-12, a thi-type cyto force-in.
  • the present invention is a Lactobacillus genus bacterium having an immunomodulatory action, which is contained in a microorganism-containing component in a liquor production process.
  • the microorganism-containing component is fermentation mash
  • the liquor production process is a wine brewing process.
  • the present invention also relates to Lactobacillus plantarum or Lactobacillus brevis having an immunomodulatory action.
  • the present invention provides a method wherein Lactobacillus plantarum having an immunomodulatory action is Lactobacillus S. plantarum SAM2446 strain (FERM ABP-10438) or Lactobacillus brevis is Lactobacillus brevis SAM2447 strain (FERM ABP-10439).
  • the present invention is a composition having an immunomodulatory action containing a Lactobacillus genus having an immunomodulatory action, which is contained in the microorganism-containing component of the alcoholic beverage production process.
  • the composition is a food or drink or a pharmaceutical product.
  • the present invention includes a step of separating microorganisms from microorganism-containing components in a liquor production process, a step of measuring the immunomodulating action of each separated microorganism, and a process of selecting lactobacilli having a strong immunomodulating action.
  • the microorganism-containing component is fermentation mash
  • the liquor production process is a wine brewing process.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of measuring serum IL-12 concentration after intraperitoneal administration of 12 types of lactic acid bacteria to mice.
  • FIG. 2 shows the 16S rRNA gene sequence of SAM2446 strain that was decoded.
  • the underlined portion shows the sequence difference with Lactobacillus plantarum JCM1149T (ATCC14917)
  • FIG. 3 shows the decoded 16S rRNA gene sequence of SAM2447 strain.
  • the underlined portion shows the sequence difference from Lactobacillus brevis JCM1059T (ATCC14869).
  • FIG. 4 shows the measurement results of NK activity.
  • FIG. 5 shows measurement results of IFN-y concentration.
  • Lactobacillus sp. Is a kind of lactic acid bacterium, and the present invention is a Lactobacillus sp. That has an immunomodulatory action and is contained in the microorganism-containing component of the alcoholic beverage production process.
  • the Lactobacillus spp. Is preferably Lactobacillus plantarum or Lactobacillus brevis belonging to Lactobacillus brevis.
  • lactic acid bacteria include Lactobacillus 'plantarum SAM2446 strain and Lactobacillus' brevis SAM2447 strain.
  • This fungus has been deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, the Patent Biological Depositary Center (0, 1 Tsukuba 1-chome, 1-chome, Ibaraki-ken, 1st, 6th, 6th) .
  • the deposit number is FERM ABP-10 438, And FERM ABP—10439.
  • the bacteriological properties of Lactobacillus' plantarum SAM2446 strain (FERM ABP-10438) are shown in Table 1, and the bacteriological properties of Lactobacillus brevis SAM2447 strain (FERM ABP-10439) are shown in Table 2.
  • “having an immunomodulatory action” means an action that activates a steady state or immune function is lowered (immunostimulatory action), or an immune function that is excessively enhanced. This means that it has at least one of the following actions: suppressing this to make it an appropriate immune state (immunosuppressive action), and optimizing the balance between cellular immunity and humoral immunity .
  • the immunomodulating action include the promotion or suppression of cytoforce-in production, lymphocyte activation, lucidity killer) activity enhancement, ThlZT h2 balance improvement, immune decline suppression, antiallergic action, etc. It can be mentioned, but is not limited to these.
  • the Lactobacillus genus of the present invention separates microorganisms from microorganism-containing components in the liquor production process. It can be obtained by measuring the immunoregulatory action of each separated microorganism, and selecting bacteria having a strong immunomodulatory action.
  • the “alcohol production process” is a series of processes related to alcohol production.
  • “alcoholic beverages” include fruit liquors such as wine, malt fermented beverages such as beer and sparkling liquor, distilled liquors such as sake and whiskey.
  • the microorganism-containing component refers to a component in which microorganisms are present in the alcoholic beverage production process, for example, a raw material to be fed, a fermented koji, and the like.
  • the Lactobacillus bacterium according to the present invention can be used as a composition containing the Lactobacillus genus.
  • use as a pharmaceutical composition having an immunomodulatory action is preferred.
  • Lactobacillus examples include Lactobacillus (live and dead), Lactobacillus-containing, Lactobacillus fermented, Lactobacillus-treated Etc.
  • Viable bacteria can be obtained from Lactobacillus-containing substances such as the Lactobacillus culture solution.
  • Dead bacteria can be obtained, for example, by subjecting live bacteria to heating, ultraviolet irradiation, formalin treatment and the like. The obtained live and dead bacteria can be further processed by grinding or crushing.
  • the Lactobacillus genus-containing composition using the Lactobacillus genus bacterium of the present invention includes the Lactobacillus genus bacterium according to the present invention, the Lactobacillus genus bacteria-containing product, the Ratatobacillus genus fermented product, It only needs to contain at least one of the processed Lactobacillus species.
  • the Lactobacillus-containing substance include, for example, a Lactobacillus suspension, an extra-L.
  • Bacillus culture including cells, culture supernatant, and medium components
  • Ratatobacillus culture solution bacterial culture
  • lactobacillus fermented milk ratatobacillus beverage, sour milk, yogurt, etc.
  • any medium can be used without particular limitation as long as it can grow microorganisms belonging to the genus Lactobacillus.
  • the Lactobacillus-treated product includes, for example, a ground product, a crushed product, a liquid product (extracted liquid, etc.), a concentrate, a paste product, a dried product (spray-dried product, freeze-dried product, vacuum-dried product, vacuum-dried product, drum-dried product) Etc.), dilutions, etc. Can be mentioned.
  • Lactobacillus plantarum SAM2446 strain and Lactobacillus brevis SAM2447 strain according to the present invention are also separated in wine brewing process power, for example, fruit vegetables and cereals are produced by Lactobacillus sp.
  • What contains the fermented material fermented is also suitable as one form of the lactic acid bacteria containing composition using the Lactobacillus genus bacteria of this invention.
  • the Lactobacillus genus bacteria based on this invention were originally isolate
  • the Lactobacillus-containing composition using the Lactobacillus genus of the present invention is preferably used as a pharmaceutical composition having an immunomodulatory action.
  • a pharmaceutical composition having an immunomodulatory action For example, food / beverage products, pharmaceuticals, feed and the like can be mentioned.
  • it When used in foods and drinks, it is preferably implemented as a healthy food having an immunomodulatory action.
  • it may be mixed with various components such as known sweeteners, acidulants, vitamins, etc. to make a product that suits the user's taste.
  • it can be provided in the form of dairy products such as tablets, capsules, drinks, troches, gums, yogurts, ice creams, beverages, alcoholic beverages, seasonings, processed foods, desserts, confectionery, etc. is there.
  • the pharmaceutical formulation technology field such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, solubilizers, suspension agents, coating agents and the like as main agents.
  • the dosage form include tablets, capsules, granules, powders, syrups, suppositories, injections and the like, and are not particularly limited.
  • the route of administration of this drug include oral administration, rectal administration, and enteral administration, but are not particularly limited.
  • bacterial cells When used for feed, for example, bacterial cells can be mixed with raw materials such as pet food or livestock feed. Alternatively, it may be added to commercially available animal feed. Especially, it can use suitably for food, such as a dog, a cat, or a bird of a bird.
  • the immunomodulation effect may be measured by any method known to those skilled in the art.
  • IL-12 interleukin 12
  • induction ability test of Thl-type site force-in IL-12 by in vitro treatment of peritoneal macrophages prepared in mouse force This is done by measuring the production amount.
  • Selection of a lactic acid bacterium having a strong immunomodulatory effect can be performed by selecting a strain having a high immunomodulatory effect by measuring the immunomodulatory effect.
  • Selection criteria may be set as appropriate, for example, by comparison with known lactic acid bacteria having known immunomodulatory effects, comparison with controls, or comparison with average values.
  • the immunoregulatory action whether or not it has the ability to grow well in a general medium for lactic acid bacteria can be added to the selection criteria.
  • the “alcohol production process” is a series of processes related to alcohol production.
  • “alcoholic beverages” include fruit liquors such as wine, malt fermented beverages such as beer and sparkling liquor, and distilled liquors such as sake whiskey.
  • the microorganism-containing component refers to a component in which microorganisms are present in the alcoholic beverage production process, for example, a raw material to be fed, a fermented koji, and the like.
  • mice (7-week-old male) were administered intraperitoneally with 4.05% thioglycolate, and 4 days later, intraperitoneal macrophages were collected using PBS, and 2X using RPMI medium containing 10% FBS. After adjusting to 10 6 cells / mL, 0.5 mL each was seeded on a 24 well plate. Heat-killed bacteria of each strain (1 ⁇ g / mL) were added to each well, and the IL-12 concentration in the culture supernatant after 24 hours of culture was measured. The control line was not added with dead bacteria. IL-12 (p70) was measured because the active form of IL-12 is p70 in which the subunits of p35 and p40 are bound. IL — For the measurement of 12, OptEIA mouse IL-12 measurement kit (BD Pharmingen) was used.
  • Example 1 The 12 strains of lactic acid bacteria selected in Example 1 were subjected to an experiment for comparing IL-12 induction ability by in vivo stimulation.
  • mice 7-week-old male were intraperitoneally administered with a suspension (solvent: physiological saline) of each of the above strains (500 ⁇ g / 0.2 mL / mouse) and 6 hours later After cervical dislocation, blood was collected from the heart. In addition, an equal amount of physiological saline was administered to control mice. After blood collection Serum was collected by heart separation, and the IL-12 concentration in the serum was measured using an OptEIA mouse IL-12 measurement kit (BD Pharmingen).
  • solvent physiological saline
  • Serum IL-12 levels were particularly strong in the A and L strains. Therefore, these were named SAM2446 strain and SAM2447 strain, respectively.
  • Table 1 shows the results of the examination of the bacteriological properties of SAM2446
  • Table 2 shows the results of the examination of the mycological properties of SAM2447.
  • SAM2446 strain was Lactobacillus plantarum and SAM2447 strain was Lactobacillus brevis.
  • Lactobacillus plantarum is known for its ability to assimilate and not assimilate sorbitol
  • the SAM2446 strain is a lactic acid bacterium species that assimilate sorbitol.
  • Lactobacillus brevis is known to be both assimilating and not assimilating D-xylose, but as shown in Table 2, SAM2447 strain does not assimilate D-xylose. It is a species of lactic acid bacteria.
  • the 16S rRNA gene region was decoded.
  • the decoded 16S rRNA gene sequence of SAM2446 strain (SEQ ID NO: 1) was identified as Lactobacillus plantarum because 99% homology was obtained with the 16S rRNA gene sequence of Lactobacillus plantarum JCM1149T (ATCC14917) ( Figure 2).
  • the 16S rRNA gene sequence of SAM2447 strain (SEQ ID NO: 2) was identified as ratatobatinoles' brevis because it obtained 97% homology with the 16S rRNA gene sequence of Lactobacillus brevis JCM1059T (ATCC14869) (Fig. 3).
  • mice C57BL / 6 mice (Charles River Japan Co., Ltd., 7-week-old male, 4 mice per group), SAM2 446 strain, SAM2447 strain (dead cells) can be freely consumed for 1 week (equivalent to 0.2 mg / day) Ingested.
  • a control group was established in which SAM2446 and SAM2447 strains were not taken.
  • the spleen was removed. Spleen cells were prepared according to conventional methods, such as the excised spleen strength, and NK activity and cyto force-in-producing ability were measured.
  • splenocytes and target cells, Yac-1 were co-cultured at a ratio of 200: 1 or 100: 1 for 4 hours to determine the cytotoxic activity of splenocytes by flow cytometry. It was measured by the PINK method using In addition, spleen cells (5 ⁇ 10 6 ZmL) were allowed to act on concanaparin A (na force lyesta) 2.5 mg / mL for 24 hours, and the IFN- ⁇ concentration produced in the culture supernatant was determined by ELISA (OptEIA ( BD Bioscience)).
  • NK activity (%) represents cytotoxicity of mouse spleen cells to Yac-1
  • E T ratio represents the number of splenocytes reacted: the number of Yac-1.
  • the NK activity of splenocytes prepared from mice orally ingested with the SAM2446 strain and SAM2447 strain was significantly increased compared to the control group (control).
  • FIG. 5 shows the measurement results of the IFN-y concentration.
  • IFN- ⁇ concentrations were clearly increased in the spleen cells prepared with the mouse power that were orally ingested with the SAM2446 and SAM2447 strains compared with the control group (control).
  • mice orally ingested with the SAM2446 and SAM2447 strains ⁇ activity increased and production of IFN-y, which is a Thl-type site force-in, was promoted. Therefore, it was revealed that the SAM2446 strain and the SAM2447 strain have immunostimulatory action and immunoregulatory action.
  • the SAM2446 fermented bacterial solution was added to soy milk on the market so that it was not contaminated with other microorganisms, and allowed to stand at 30 ° C for 24 hours to obtain a fermented soymilk.
  • the fermentation proceeded quickly, lowering the acidity increases and P H was observed.
  • the obtained fermented product did not show an unpleasant fermentation odor or the like as compared with the conventional plant fermented product, and showed a sensory excellent flavor.
  • Example 6 Production of soymilk containing lactic acid bacteria powder
  • the SAM2447 fermented bacterial solution was sterilized by heating, and the cells were collected by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes). The resulting cells were freeze-dried.
  • This lactic acid bacteria powder is added to commercially available soy milk.
  • the lactic acid powder added soy milk obtained by stirring and suspending and dissolving in soy milk does not show an unpleasant fermentation odor etc. compared to conventional fermented foods containing lactic acid bacteria, and is functional. Also showed excellent flavor
  • Production Example 1 Pharmaceuticals containing lactic acid bacteria
  • a pharmaceutical product (tablet) containing lactic acid bacteria was produced by the method shown below.
  • Magnesium stearate 0.5 g was added to lOOg of SAM2447 strain cell powder, compressed, ground, sized and sieved to obtain 20-50 mesh granules.
  • Production Example 2 Various foods and drinks containing lactic acid bacteria
  • composition (Parts by weight) Frozen leakage ffl tangerine juice 5 • 0 Fructose glucose leakage 11 ⁇ 0 Quenic acid 0.2
  • Lactic acid bacteria beverage
  • Production Example 3 Feed containing lactic acid bacteria
  • a feed containing lactic acid bacteria was produced with the composition shown below.
  • Lactobacillus genus of the present invention is ingested or the like, it is possible to suppress a decrease in immune function by stimulating immune function. In addition, by adjusting the balance of immune functions, it is possible to suppress excessive enhancement of immune functions that adversely affect the living body, and various unpleasant symptoms for the living body derived therefrom. Moreover, according to the present invention, lactic acid bacteria having an immunomodulating action can be obtained efficiently.

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Description

明 細 書
ワイン発酵もろみ由来の免疫調節作用を有する乳酸菌
技術分野
[0001] 本発明は、免疫調節作用を有するラクトバチルス属菌、それを含有する組成物、お よび免疫調節作用を有する乳酸菌の効率のよい分離方法に関する。
背景技術
[0002] 乳酸菌は整腸作用や免疫賦活作用といった有益な生理活性を有することが知られ ている。また、一般消費者にとって健康効能感のある素材としての認知度も高い。こ のような有益な生理活性を有する乳酸菌の多くは発酵乳製品や腸管から分離された 動物素材由来の乳酸菌である。
[0003] 一方で、植物素材を分離元とする植物性乳酸菌においても免疫賦活作用を有する 株が見出されている。例えば、特開平 10— 167972号公報 (公開日:平成 10年 6月 23 日）には免疫賦活作用を有する乳酸菌として、ラクトバチルス 'プランタラム (Lactobad llus plantarum) L—137株が記載されている。また、京都の伝統的な漬物である「す ぐき」から分離されたラクトバチルス'ブレビス（Lactobacillus brevis) Labre株や、 「し ば漬け」から分離されたラクトバチルス ·ペントーサス (Lactobacillus pentosus) DA74 N株なども免疫賦活作用を有することが知られて ヽる（参照： (1)特公平 7-55908号公 報 (公開日：平成 6年 7月 26日）、（2) Pasken Journal 15. 21-26, 2002,岸惇子、小久保 あおい、赤谷薫、扇谷えり子、藤田哲也、岸田綱太郎：有用乳酸菌選定のためのスク リーユング 1)ヒト末梢血における植物性乳酸菌の in vitro免疫賦活効果、（3)第 6回 腸内細菌学会 (2002.05.30-31)要旨、赤谷薫、岸惇子、扇谷えり子、小久保あおい、 藤田哲也、岸田綱太郎）。
[0004] 植物素材を分離元とする植物性乳酸菌は、漬物や酒類の醸造に深く関わっている ことが知られており、醸造工程からは多くの菌が分離可能である。上記以外にも免疫 賦活作用等の有用な生理活性を有する菌株が存在すると考えられる。例えば、酒類 の醸造工程のうちワイン醸造工程力 分離される菌株で、分離頻度が高い株にラクト バチルス ·プランタラムが挙げられる。し力しながら、このような酒類の醸造工程力も分 離された菌については、醸造における作用や香味等への寄与に関する研究が主で あり、菌自体が生体へ及ぼす効能についてはあまり研究されていない。それゆえ、酒 類醸造工程より分離される乳酸菌の中から有用な生理活性を有する菌株を見出すこ とが期待できる。また、植物性乳酸菌を用いると独特の発酵臭を生じる場合があり、 製造する食品の種類によっては、官能への対策、配慮を要する場合がある。
発明の開示
[0005] 本発明は、上記の現状に鑑み、免疫調節作用を有する乳酸菌、それを含有する組 成物、および免疫調節作用を有する乳酸菌を分離する方法を提供することを目的と する。
[0006] 本発明者らは力かる課題を解決するため、酒類醸造工程力 の生成品より分離さ れた乳酸菌について、その免疫調節作用を調査し、その中から選択したラクトバチル ス ·プランタラムおよびラクトバチルス ·ブレビスに属する乳酸菌につ 、て、より詳細に 免疫調節作用を調査した。その結果、当該乳酸菌は高い免疫調節作用を有し、また それを用いた発酵物は良好な香味を示すことを見出し、本発明を完成させるに至つ た。
[0007] 具体的には、酒類醸造工程力 の生成品より分離された乳酸菌について、 Thl型 サイト力インのインターロイキン 12 (以下「IL— 12」と略記する）誘導能を比較した結 果、高効率で免疫調節作用を有する乳酸菌を分離できることを見出し、特にラタトバ チルス 'プランタラム、およびラクトバチルス 'ブレビスに属する菌株力 マウス力 調 製した腹腔マクロファージに対してインビトロで処理した場合に IL— 12の産生を上昇 させることを見出した。更に、マウス腹腔内へのインビボでの加熱菌液投与を行い、 T hi型サイト力インの IL— 12の産生を誘導することも確認した。
[0008] すなわち、本発明は、酒類製造工程の微生物含有成分に含まれる、免疫調節作用 を有するラクトバチルス属菌である。特に、微生物含有成分は発酵もろみであり、酒 類製造工程はワインの醸造工程である。
[0009] また、本発明は、免疫調節作用を有するラクトバチルス 'プランタラム (Lactobacillus plantarum)またはラクトバチルス ·ブレビス（Lactobacillus brevis)である。
[0010] さらに本発明は、免疫調節作用を有するラクトバチルス ·プランタラムがラクトバチル ス ·プランタラム SAM2446株（FERM ABP-10438)またはラクトバチルス ·ブレビスが ラクトバチルス ·ブレビス SAM2447株（FERM ABP- 10439)である。
[0011] また、本発明は、酒類製造工程の微生物含有成分に含まれる、免疫調節作用を有 するラクトバチルス属菌を含有する免疫調節作用を有する組成物である。特に前記 組成物は飲食品または医薬品である。
[0012] さらに本発明は、酒類製造工程の微生物含有成分から微生物を分離する工程、分 離された各微生物の免疫調節作用を測定する工程、および免疫調節作用の強い乳 酸菌を選抜する工程を含む、免疫調節作用を有する乳酸菌を分離する方法である。 特に、微生物含有成分は発酵もろみであり、酒類製造工程はワインの醸造工程であ る。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、 12種類の乳酸菌をマウスに腹腔内投与した後の血清 IL— 12濃度を測 定した結果を示すグラフである。
[図 2]図 2は、解読された SAM2446株の 16S rRNA遺伝子配列を示す。下線部は 、ラクトバチルス.プランタラム JCM1149T(ATCC14917)との配列の相違部分を示す
[図 3]図 3は、解読された SAM2447株の 16S rRNA遺伝子配列を示す。下線部は 、ラクトバチルス 'ブレビス JCM1059T(ATCC14869)との配列の相違部分を示す。
[図 4]図 4は、 NK活性の測定結果を示す。
[図 5]図 5は、 IFN- y濃度の測定結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0014] <ラクトバチルス属菌 >
ラクトバチルス属菌は、乳酸菌の一種であり、本発明は酒類製造工程の微生物含 有成分に含まれる、免疫調節作用を有するラクトバチルス属菌である。ラクトバチルス 属菌は、ラクトバチルス ·プランタラム（Lactobacillus plantarum)、またはラクトバチルス 'ブレビス（Lactobacillus brevis)に属するラクトバチルス属菌が好ましい。
[0015] ラクトバチルス属菌の菌学的性質は、バージーズ 'マニュアル 'ォブ 'システマティッ ク.バタテリォロジ一（BERGEY'S MANUAL of Systematic Bacteriology) (第 1卷 1984 年、第 2卷 1986年、第 3卷 1989年、第 4卷 1989年）に記載されている。
[0016] 本発明に係る乳酸菌の代表的なものとして、ラクトバチルス 'プランタラム SAM244 6株、およびラクトバチルス'ブレビス SAM2447株を挙げることができる。本菌は独 立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター ( 0本国 茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6)に寄託されており、その受託番号は FERM ABP-10 438、および FERM ABP— 10439である。ラクトバチルス 'プランタラム SAM2446 株（FERM ABP- 10438)の菌学的性質を表 1に、ラクトバチルス'ブレビス SAM2447 株（FERM ABP-10439)の菌学的性質を表 2に示す。
[0017] [表 1] ラク バチルス 'プラン夕ラム S AM 2446株 （FERM ABP- 1 0438)
Figure imgf000005_0001
[0018] [表 2] ラクトバチルス ·ブレビス S AM 2 4 4 7株 （F E R M A B P - 1 0 4 3 9 )
Figure imgf000006_0001
[0019] 本発明において、「免疫調節作用を有する」とは、定常状態や免疫機能が低下して いる場合にこれを活性化する作用（免疫賦活作用）、または免疫機能が過度に亢進 して 、るときにこれを抑制して適切な免疫状態とする作用（免疫抑制作用）、細胞性 免疫と液性免疫のバランスを最適化する作用の少なくともいずれか一方の作用を有 することを意味する。免疫調節作用としては、例えば、サイト力イン産生の促進または 抑制作用、リンパ球活性化作用、 ΝΚけチュラル'キラー)活性増強作用、 ThlZT h2バランス改善作用、免疫低下抑制作用、抗アレルギー作用等を挙げることができ るが、これらに限定されるものではない。
[0020] 本発明のラクトバチルス属菌は、酒類製造工程の微生物含有成分から微生物を分 離し、分離された各微生物の免疫調節作用を測定し、免疫調節作用の強い菌を選 抜すること〖こより得ることができる。
[0021] 本発明において「酒類製造工程」とは、酒類製造に関わる一連の工程である。ここ で、「酒類」には、ワイン等の果実酒、ビールや発泡酒等の麦芽発酵飲料、清酒、ウイ スキーなどの蒸留酒等も含まれる。
[0022] 微生物含有成分とは、酒類製造工程中で、微生物が存在する成分をいい、例えば 仕込み原料、発酵醪等である。
[0023] <組成物>
本発明に係るラクトバチルス属菌は、当該ラクトバチルス属菌を含有する組成物とし て利用することができる。特に、免疫調節作用を有する薬学的組成物としての利用が 好適である。
[0024] 上記組成物に含有されるラクトバチルス属菌としては、ラクトバチルス属菌（生菌お よび死菌）、ラクトバチルス属菌含有物、ラクトバチルス属菌発酵物、ラクトバチルス属 菌処理物等を挙げることができる。生菌は当該ラクトバチルス属菌培養液等のラクト バチルス属菌含有物力 得ることができる。死菌は、例えば、生菌に対して加熱、紫 外線照射、ホルマリン処理などを行うことにより得ることができる。得られた生菌、死菌 は、さらに磨砕や破砕等により、処理物とすることができる。
[0025] すなわち、本発明のラクトバチルス属菌を利用するラクトバチルス属菌含有組成物 は、本発明に係るラクトバチルス属菌、当該ラクトバチルス属菌含有物、当該ラタトバ チルス属菌発酵物、当該ラクトバチルス属菌処理物の少なくともいずれか 1つを含有 していればよい。前記ラクトバチルス属菌含有物としては、例えば、ラクトバチルス属 菌懸濁液、ラ外バチルス属菌培養物 (菌体、培養上清、培地成分を含む)、ラタトバ チルス属菌培養液 (菌培養物カゝら固形分を除去したもの）、ラクトバチルス属菌発酵 乳 (ラタトバチルス属菌飲料、酸乳、ヨーグルト等）を挙げることができる。ラクトバチル ス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、ラクトバチルス属に属する微生物 が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができる。また、ラクトバチルス属 菌処理物としては、例えば、磨砕物、破砕物、液状物 (抽出液等）、濃縮物、ペースト 化物、乾燥物 (噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物等)、希釈物等 を挙げることができる。また、本発明に係るラクトバチルス ·プランタラム SAM2446株 、およびラクトバチルス 'ブレビス SAM2447株はワイン醸造工程力も分離されたもの であるので、例えば、果菜類や穀類を本発明に係るラクトバチルス属菌により発酵さ せた発酵物を含有するものも本発明のラクトバチルス属菌を利用する乳酸菌含有組 成物の 1形態として好適である。なお、上述のように、本発明に係るラクトバチルス属 菌は元来食品から分離されたものであるため、安全性は高い。
[0026] 本発明のラクトバチルス属菌を利用するラクトバチルス属菌含有組成物は、免疫調 節作用を有する薬学的組成物として用いることが好ましい。例えば、飲食品、医薬品 、飼料等を挙げることができる。飲食品に用いる場合には、免疫調節作用を有する健 康食品として実施することが好適である。また、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の 各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすればよい。例えば、錠剤、カプセ ル剤、ドリンク剤、トローチ、ガム、ヨーグルト等の乳製品、アイスクリーム、飲料、アル コール飲料、調味料、加工食品、デザート類、菓子等の形態で提供することが可能 である。
[0027] また、医薬品に用いる場合には、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯 臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常 使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、錠剤、カブ セル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定さ れるものではない。本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経 腸投与等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
[0028] 飼料に用いられる場合には、例えば、ペットフード、あるいは、家畜用飼料などの原 料に菌体を混合することができる。あるいは、市販の動物用飼料に添加してもよい。 中でも、犬や猫、あるいは-ヮトリの鳥類等の食餌に好適に用いることができる。
[0029] <免疫調節作用を有する乳酸菌の分離方法 >
免疫調節作用の測定は、当業者に知られる方法のいずれであってもよい。一例を 挙げれば、 Thl型サイト力インのインターロイキン 12 (以下「IL— 12」と略記する）誘 導能試験で、マウス力 調製した腹腔マクロファージに対するインビト口での処理によ る IL— 12の産生量を測定することにより行う。 [0030] 免疫調節作用の強い乳酸菌の選抜は、上記免疫調節作用の測定により、免疫調 節作用の高い菌株を選抜することにより行うことができる。選抜の基準としては、公知 の免疫調節作用が知られている乳酸菌との比較、コントロールとの比較を行う、ある いは平均値と比較するなど適宜設定すればよい。また、免疫調節作用の他に、一般 的な乳酸菌用培地中で良好な増殖を示す力否かを選抜基準に加えることができる。
[0031] 本発明において「酒類製造工程」とは、酒類製造に関わる一連の工程である。ここ で、「酒類」には、ワイン等の果実酒、ビールや発泡酒等の麦芽発酵飲料、清酒ウイ スキーなどの蒸留酒等も含まれる。
[0032] 微生物含有成分とは、酒類製造工程中で、微生物が存在する成分をいい、例えば 仕込み原料、発酵醪等である。
[0033] 分離源として、上記ワインの醸造工程の発酵もろみ等を用いることにより、極めて効 率よく免疫調節作用を有する乳酸菌を分離することができる。
[0034] 本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明は上述した各実施形態に 限定されるものではなぐ請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実 施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態に ついても本発明の技術的範囲に含まれる。
[0035] <実施例 >
実施例 1
〔使用乳酸菌株〕
ワイン醸造醪から、乳酸菌を 104株分離し、 Thl型免疫賦活能の高い菌株を選択 するためインターロイキン 12 (IL— 12)誘導能を比較する実験に供した。
[0036] 〔インビトロ刺激による IL 12誘導〕
BALB/cマウス（7週齢'雄）に 4.05%チォグリコレートを腹腔内投与し、 4日後に PB Sを用いて腹腔内マクロファージを回収し、 10%FBSを含む RPMI培地を用いて 2 X 106cells/mLに調整した後、 24ゥエル（well)プレートに 0.5mLずつ播き込んだ。各ゥェ ルに各菌株の加熱死菌（1 μ g/mL)を添加し 24時間培養後の培養上清中の IL— 12 濃度を測定した。コントローノレは、死菌無添加のものとした。 IL— 12の活性型は p35 と p40のサブユニットが結合した p70であることから、 IL—12 (p70)を測定した。なお IL — 12の測定には OptEIA mouse IL- 12測定キット（BD Pharmingen社製）を使用した。
[0037] 分離した乳酸菌 104株についてインビトロによる IL-12産生能を評価した結果、 IL-1
2産生能を有する菌株が多く含まれていた。これら幾つかについて、 IL-12産生能は、 免疫調節作用の知られて 、る乳酸菌に比較しても十分に高 、活性を有して 、ると考 えられた。このうち、コントロールに対して 10倍を超える IL-12産生能を有する 12株に つ!、て、高 、IL-12産生能を有して 、る株として選択した。
[0038] コントロールに対して 10倍と!/、う極めて高!、基準を考慮すると、この確率は、相当の 高値と考えられ、ワイン醸造醪は、免疫調節乳酸菌の分離源として非常に有用であ ると考えられた。
[0039] [表 3]
Figure imgf000010_0001
* 1 : コントロールに対する各試料の - 12産生量
* 2 :後述の SAM 2446株（FERM ABP- 1 0438)
* 3 :後述の SAM 2447株（FERM ABP-1 0439)
[0040] 実施例 2
〔使用乳酸菌株〕
実施例 1で選択した乳酸菌 12株を、インビボ刺激による IL— 12誘導能を比較する実 験に供した。
[0041] 〔インビボ刺激による IL— 12誘導〕
BALB/cマウス（7週齢.雄）に上記各菌株の加熱死菌（500 μ g/0.2mL/mouse)の 懸濁液 (溶媒:生理的食塩水)を腹腔内投与し、 6時間後に頸椎脱臼後、心臓より採 血した。なお、コントロールのマウスには生理的食塩水を等量投与した。採血後、遠 心分離により血清を採取し、血清中の IL—12濃度を OptEIA mouse IL-12測定キット (BD Pharmingen社製）を用いて測定した。
[0042] 結果を図 1に示した。血清 IL— 12濃度は、 A株と L株で特に強かった。そこで、これ らをそれぞれ、 SAM2446株、 SAM2447株と命名した。
[0043] 実施例 3 SAM2446株、 SAM2447株の同定
SAM2446株の菌学的性質の検討結果を表 1に、 SAM2447株の菌学的性質の 検討結果を表 2に示した。
[0044] これらの検討結果により、 SAM2446株はラクトバチルス 'プランタラムと、 SAM24 47株はラクトバチルス ·ブレビスと推定された。ラクトバチルス ·プランタラムはソルビト 一ルの資化性のあるものと無いものの両者が知られている力 表 1に示したように、 S AM2446株はソルビトールの資化性を有する乳酸菌種である。また、ラクトバチルス 'ブレビスは D-キシロースの資化性のあるものと無いものの両者が知られているが、 表 2に示したように、 SAM2447株は D-キシロースの資化性を持たな 、乳酸菌種で ある。
[0045] SAM2446株、および SAM2447株より DNAを抽出後、 16S rRNA遺伝子領域 について解読を行った。解読された SAM2446株の 16S rRNA遺伝子配列（配列 番号 1)は、ラクトバチルス 'プランタラム JCM1149T (ATCC14917)の 16S rRNA遺伝 子配列と 99%相同性が得られたため、ラクトバチルス ·プランタラムと同定した（図 2)。 また、 SAM2447株の 16S rRNA遺伝子配列（配列番号 2)は、ラクトバチルス'ブレ ビス JCM1059T (ATCC14869)の 16S rRNA遺伝子配列と 97%相同性が得られたた め、ラタトバチノレス 'ブレビスと同定した（図 3)。
[0046] 実施例 4 経口摂取による、免疫賦活および免疫調節作用
C57BL/6マウス（日本チャールズリバ一株式会社、 7週齢'雄、 1群 4匹）に、 SAM2 446株、 SAM2447株（死菌体）を 1週間飲水（0.2mg/day相当）にて自由に摂取させ た。また、 SAM2446株、 SAM2447株を摂取させない対照群を設けた。 1週間後に 脾臓を摘出した。摘出した脾臓力ゝら常法に従い脾細胞を調製し、 NK活性と、サイト 力イン産生能を測定した。 NK活性は脾細胞とターゲット細胞である Yac-1を 200:1、ま たは 100:1の割合で 4時間共培養し、脾細胞の細胞障害性活性をフローサイトメトリー を用いた PINK法で測定した。また、脾細胞（5 X 106個 ZmL)にコンカナパリン A (ナ 力ライテスタ） 2. 5mg/mLを 24時間作用させ、培養上清中に産生される IFN— γ濃 度を ELISA法（OptEIA(BD Bioscience))で測定した。
[0047] NK活性の測定結果を図 4に示した。図 4中、 NK活性 (%)はマウス脾細胞の Yac-1 に対する細胞傷害性を表し、 E:T比は反応させた脾細胞数: Yac-1数を表す。図 4か ら明らかなように、 SAM2446株、 SAM2447株を経口摂取したマウスから調製した 脾細胞の NK活性は対照群 (control)と比較して顕著に上昇して 、た。
[0048] IFN- y濃度の測定結果を図 5に示した。図 5から明らかなように、 SAM2446株、 SAM2447株を経口摂取したマウス力も調製した脾細胞では対照群 (control)と比 較して IFN— γ濃度が明らかに増加していた。
[0049] 以上のように、 SAM2446株、 SAM2447株を経口摂取したマウスにおいて、 ΝΚ 活性が増加し、 Thl型サイト力インである IFN— yの産生が促進された。したがって、 SAM2446株、 SAM2447株は、免疫賦活作用および免疫調節作用を有すること が明らかとなった。
[0050] 実施例 5 豆乳発酵物の製造
SAM2446株発酵菌液を、他の微生物汚染を受けな 、よう市販の豆乳に添加し、 30°Cで 24時間静置して豆乳発酵物を得た。発酵は速やかに進行し、酸度上昇およ び PHの低下が見られた。得られた発酵物は、従来の植物発酵品にくらべ不快な発 酵臭等を示さず、官能的に優れた香味を示した。
[0051] 実施例 6 乳酸菌末添加豆乳の製造
SAM2447株発酵菌液を加熱殺菌後、遠心分離 (3000rpm、 10分）により菌体を回 収し、得られた菌体について凍結乾燥を行った。この乳酸菌菌体末を市販の豆乳に 添加 '攪拌し豆乳中に懸濁溶解させて得られる乳酸菌末添加豆乳は、従来の乳酸 菌含有発酵食品にくらべ不快な発酵臭等を示さず、官能的にも優れた香味を示した
[0052] 実施例 7 乳酸菌含有組成物の製造
製造例 1：乳酸菌を含有する医薬品
錠剤： 以下に示す方法により、乳酸菌を含有する医薬品 (錠剤)を製造した。
[0053] SAM2446株菌体末 50gを、乳糖 250gおよびステアリン酸マグネシウム 2gとともに 混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径 10mm、重量 300mgの錠剤を 製造した。
顆粒剤：
SAM2447株菌体末 lOOgに、ステアリン酸マグネシウム 0.5gを加え、圧縮、粉砕 、整粒し、篩別して 20〜50メッシュの顆粒剤を得た。
製造例 2：乳酸菌を含有する各種飲食物
以下に示す組成にて、乳酸菌入りの、各種飲食品を製造した。
[0054] [表 4] 飴：
(繊） （重量部）
粉末ソルビトール 99. 7
香料 0. 2
SAM2446株菌体末 0. 05
ソルビ! ^一ルシード 0. 05
100. 00
[0055] [表 5] ゼリ一 （コーヒーゼリー)
誠）
グラニュー糖 15. 0
ゼラチン 1. 0
コ一ヒーエキス 5. 0
水 78. 93
SAM2447株菌体末— 0. 07
全 100. 00 [0056] [表 6]
(組成） (重量部） 冷凍漏 fflみかん果汁 5 • 0 果糖ブドウ糖漏 11 ■ 0 クェン酸 0 . 2
L—ァスコルビン酸 0 • 02
SAM2446株 ¾'体未 0 . 05 香料 0 . 2 色素 0 • 1 水 83 • 43 全量 100 . 00
[0057] [表 7]
(麵 (重量部） グラニュー糖 8. 0 βレモン采汁 1. 0
Lーァスコルビン酸 0. 10 クェン酸 0. 09 クェン酸ナトリウム 0. 05 着色料 0. 05 香料 0. 15 炭酸水 90. 55
SAM2447株菌体未 0. 01
100. 00 [0058] [表 8]
乳酸菌飲料：
(麵 (重量部）
乳固形分 21%発酵し 14. 76
果糖ブドウ糖賺 13. 31
ぺクチン 0. 5
クェン酸 0. 08
香料 0. 15
水 71. 14
SAM2446株難末 0. 06
[0059] [表 9」 乳酸菌飲料：
(滅） (重量部） 乳固形分 21%の5八 12447觀醱し 14. 82 赚ブドウ糖灘 13. 31 ぺクチン 0. 5 クェン酸 0. 08 香料 0. 15 水 71. 14
100. 00
[0060] [表 10] コ―ヒ—飲料：
舰）
グラニュー糖 8. 0
5. 0 カラメル 0. 2 コーヒー抽出物 2. 0 香料 0. 1 ポリグリセリン JI旨肪酸エステル 0. 05 髓 0. 05 水 84. 56
SAM2446株菌体末 0. 04 全量 100. 00
[0061] [表 11]
アルコー 料：
(細 (重， t部)
50容量％エタノール 32. 0 砂糖 8. 4
2. 4
SAM2447株菌体末 0. 2 精製水 57. 0 全量 100. 0
[0062] [表 12] 発泡酒：
(編 運量部）
発泡酒 99. 98
SAM2447株菌体末 0. 02
100. 0
[0063] 製造例 3:乳酸菌を含有する飼料
以下に示す組成にて、乳酸菌入りの飼料を製造した。
[0064] [表 13] 飼料：
(誠） （重量部）
市販ドックフード 99, 98
SAM2446株菌体未 Q. 02
Ά 100. 0 産業上の利用可能性
[0065] 本発明のラクトバチルス属菌を摂取等すれば、免疫機能を賦活ィ匕することにより免 疫機能低下を抑制できる。また、免疫機能のバランスを調節することにより生体に悪 影響を及ぼす免疫機能の過度の亢進やそれに派生する生体にとっての様々な不快 症状等をも抑制できる。また、本発明によれば、効率よく免疫調節作用を有する乳酸 菌を得ることができる。
Figure imgf000018_0001
受理官庁記入欄
-4 この用紙は国際出顔とともに受理した
(はい Zいいえ）
-4-1 権限のある職員 国際事務局記入欄
-5 この用紙が国際事務局に受理された日
-5-1 権限のある職員
差替え用紙（規則 26)

Claims

請求の範囲
[1] ワイン醸造工程の発酵もろみに含まれる、免疫調節作用を有するラクトバチルス属菌
[2] ラクトバチルス属菌カラクトバチルス 'プランタラム（Lactobacillus plantarum)である、 請求項 1記載の菌。
[3] ラクトバチルス属菌がラクトバチルス'ブレビス（Lactobacillus brevis)である、請求項 1 記載の菌。
[4] ラクトバチルス 'プランタラムがソルビトール資化' を有するものである、請求項 2記載 の菌。
[5] ラクトバチルス 'ブレビスが D-キシロースの資化性を有しなレ、ものである、請求項 3記 載の菌。
[6] ラクトバチルス ·プランタラムがラクトバチルス ·プランタラム SAM2446株（FERM ABP
-10438)である、請求項 2記載の菌。
[7] ラクトバチルス ·ブレビスがラクトバチルス ·ブレビス SAM2447株（FERM ABP- 10439
)である、請求項 3記載の菌。
[8] 請求項 1乃至 7のいずれか一項記載のラクトバチルス属菌を含有し、免疫調節作用 を有する組成物。
[9] 前記組成物が飲食品である、請求項 8記載の組成物。
[10] 前記組成物が医薬品である、請求項 8記載の組成物。
[11] 前記組成物が飼料である、請求項 8記載の組成物。
[12] 免疫調節作用を有する乳酸菌を分離する方法であって、
(a)酒類製造工程の微生物含有成分から微生物を分離する工程、
(b)分離された各微生物の免疫調節作用を測定する工程、および
(c)免疫調節作用の強い乳酸菌を選抜する工程、
を含む、前記方法。
[13] 乳酸菌がラクトバチルス属菌である、請求項 12記載の方法。
[14] 前記微生物含有成分が発酵もろみである、請求項 12または 13記載の方法。
[15] 前記酒類製造工程力 Sワインの醸造工程である、請求項 12乃至 14のいずれか一項記
差替え用紙（規則 26) 載の方法。
差替え用紙（規則 26)
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