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WO2006129755A1 - Epo誘導体含有血液関連疾患治療剤 - Google Patents

Epo誘導体含有血液関連疾患治療剤 Download PDF

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WO2006129755A1
WO2006129755A1 PCT/JP2006/310989 JP2006310989W WO2006129755A1 WO 2006129755 A1 WO2006129755 A1 WO 2006129755A1 JP 2006310989 W JP2006310989 W JP 2006310989W WO 2006129755 A1 WO2006129755 A1 WO 2006129755A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
epo
blood
therapeutic agent
derivative
bone marrow
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2006/310989
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ken Toba
Kiminori Kato
Masato Higuchi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Niigata TLO Corp
Original Assignee
Niigata TLO Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US11/916,109 priority patent/US20100040581A1/en
Priority to CN2006800195145A priority patent/CN101247822B/zh
Priority to CA002610782A priority patent/CA2610782A1/en
Priority to EP06747090A priority patent/EP1889627A4/en
Publication of WO2006129755A1 publication Critical patent/WO2006129755A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to a blood flow increasing agent, a blood vessel promoting agent or a therapeutic agent for ischemic disease, which comprises an EPO derivative as an active ingredient.
  • EPO Erythropoietin
  • EPO Erythropoietin
  • the red blood cells that are most abundant in the blood are destroyed in the spleen after functioning for a certain period of time (average life span is about 120 days in humans). The total red blood cell count is always kept constant. EPO plays a central role in maintaining the homeostasis of these living red blood cells. Clinically, EPO is used for anemia treatment and pre- and postoperative management.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent that can be used as a therapeutic agent for ischemic diseases and the like.
  • an EPO derivative particularly a cashmere EPO
  • has a blood flow increasing action a blood vessel promoting action or an ischemic disease therapeutic action, and has completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • a therapeutic agent for ischemic disease comprising an erythropoietin (EPO) derivative as an active ingredient.
  • EPO erythropoietin
  • a blood vessel promoter comprising an EPO derivative as an active ingredient.
  • a blood flow increasing agent comprising an EPO derivative as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of a treatment experiment with an EPO derivative using a lower limb ischemia model in an ICR mouse (left figure: survival effect, right figure: revascularization effect).
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a treatment experiment with an EPO derivative administered with bone marrow cells using the ICR mouse lower limb ischemia model (left: survival effect, right: revascularization effect). It is.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a treatment experiment (blood flow recovery effect) using the ICR mouse lower limb ischemia model.
  • FIG. 4 is a graph showing the results (angiogenic effect) of a treatment experiment using a lower limb ischemia model of an ICR mouse.
  • FIG. 5 is a graph showing the effects of untreated ICR mice on the onset of polycythemia of EPO and cashmere EPO.
  • the EPO used in the present invention is a force that can be used with any EPO, preferably a highly purified EPO, more specifically, a biological activity substantially the same as a mammalian EPO, particularly a human EPO. It is what has.
  • the EPO used in the present invention may be produced by any method, for example, natural human EPO (Japanese Patent Publication No. 1-38800, etc.) obtained by purifying human extract. It can also be produced by various methods using E. coli, yeast, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), C127 cells, COS cells, myeloma cells, BHK cells, insect cells, etc. by genetic engineering techniques. Separated and purified human EPO can be used.
  • the EPO used in the present invention is preferably an EPO produced using a mammalian cell (especially a CHO cell) preferred by an EPO produced by a genetic engineering technique (for example, Japanese Patent Publication No. 1-44317). Kenneth Jacobs et al., Nature, 313 806-810 (1985)).
  • the EPO obtained by the genetic recombination method has the same amino acid sequence as that of naturally-occurring EPO, or one obtained by deleting, substituting, or adding one or more amino acids in the amino acid sequence. Those having the same biological activity as naturally-occurring EPO may be used. Amino acid deletion, substitution, addition and the like can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, those skilled in the art will recognize site-directed mutagenesis (Gotoh, T. et al. (1995) Gene 15 2, 271-275; Zoller, MJ and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468 -500; Kra mer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441— 9456; Kramer, W. and Fritz, HJ
  • the amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), having hydroxyl-containing side chains Amino acids (S, T, ⁇ ), amino acids with sulfur atom-containing side chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), base-containing side chains Amino acids (R, K, ⁇ ) and amino acids having aromatic side chains (H, F, Y, W) can be mentioned (all parentheses indicate single letter amino acids).
  • hydrophobic amino acids A, I, L, M, F, P, W, Y, V
  • hydrophilic amino acids R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T
  • amino acids having aliphatic side chains G,
  • a fusion protein of EPO and another protein it is also possible to use a fusion protein of EPO and another protein.
  • DNA encoding EPO and DNA encoding another protein are linked so that the frames coincide with each other, introduced into an expression vector, and expressed in a host. That's fine.
  • Other proteins to be subjected to fusion with the EPO of the present invention are not particularly limited.
  • chemically modified EPO examples include, for example, polyethylene glycol 'vitamin B12, etc., and EPO to which a compound such as an inorganic or organic compound is bound.
  • the soot derivative means soot that has been modified with an amino acid in the soot molecule or soot that has been modified with a sugar chain in the soot molecule.
  • the modification of the sugar chain in the soot molecule includes addition, substitution, deletion and the like of the sugar chain.
  • examples of sugar chain modifications include deletion of sialic acid in the molecule.
  • any of EPO derived from urine and urine produced by recombinant animal cells is obtained as an EPO composition containing various EPOs having different sugar chain structures.
  • the number of sialic acids attached to EPO molecules in an EPO composition varies depending on the individual EPO molecule. Usually, 11 to 15 sialic acids are attached to one EPO molecule! / Remove these sialic acids This makes it possible to create a cashified EPO.
  • the number of sialic acids to be removed during cationization is not particularly limited, and all sialic acids may be removed, or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, or 14 sialic acids may be removed.
  • the preferred mouth opening EPO has 10 or less sialic acid attached to the EPO molecule, more preferably 5 or less, and particularly preferably 2 or less.
  • the number of sialic acids used in the present invention is the average number of EPO molecules contained in the EPO composition.
  • the average sialic acid per molecule can be measured by methods known to those skilled in the art (EP0428267, etc.).
  • EPO from which sialic acid has been removed can be produced by a method known to those skilled in the art, and can be produced, for example, by treating EPO with an enzyme such as sialidase.
  • an enzyme such as sialidase.
  • a commercially available sialidase can be used. (Special Table 2 005-507426, Nobuo Imai et al., Eur. J. Biochem, 194, 457-462 (1990), etc.)
  • amino acid modification in the EPO molecule examples include force rubamylation, piotinization, amidineation, acetylation, guazination, and the like.
  • Preferred amino acid modification in the present invention is force ruvalylation. is there.
  • amino acid residue to be modified is not particularly limited, and examples thereof include lysine, arginine, glutamic acid, tributophan, and the like.
  • a preferred amino acid modified in the present invention is lysine.
  • EPO in which the lysine is carbamylated can be mentioned (Marcel L et al. Derivatives of ery thropoietin that are tissue protective but not erythropoietic Science, 2004; 305: 23 9, Fiordaliso E et al. A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury. PNAS, 2005; 102: 2046, etc.).
  • EPO's force ruby milling includes force ruby milling by reaction with cyanate ions, etc., alkyl one-off ruby milling by reaction with alkyl-isocyanate, etc. .
  • the therapeutic agent of the present invention is useful as a blood flow increasing agent, a blood vessel promoting agent, or an ischemic disease therapeutic agent. It is.
  • the increase in blood flow refers to an increase in blood flow at a site where an EPO derivative is locally administered or a site located more distally than the site, or reaches an ischemic tissue.
  • Means increased blood flow. Whether or not an effect of increasing blood flow can be obtained can be measured by a method known to those skilled in the art, and can be quantified using, for example, radioactive microspheres by a flow technique (Am. J Physiol. 243: H371-H378, (1982)). Furthermore, it can be measured and confirmed by methods such as skin temperature, thermography, laser blood flow meter, lower limb Z upper limb blood pressure ratio, tissue oxygen partial pressure.
  • blood vessel promotion means promotion of angiogenesis, promotion of blood vessel regeneration, or promotion of growth and development of blood vessels.
  • the blood vessel whose newborn, regeneration, growth, development, etc. are promoted by the EPO derivative is not particularly limited, but an artery is preferred, and a peripheral artery is particularly preferred.
  • the force with which the blood vessel promoting action is obtained can be measured by a method known to those skilled in the art, for example, by measuring the capillary density using alkaline phosphatase staining or the like. Furthermore, it can be measured and confirmed by a method such as angiography.
  • the therapeutic agent of the present invention is useful for the treatment of ischemic diseases.
  • Ischemic diseases are caused by various factors such as stenosis of blood vessels, formation of blood clots, occlusion of blood vessels, vasculitis, vasoconstriction, increased blood viscosity, etc. It is a medical condition that falls into.
  • ischemic diseases include peripheral circulation disorder, ischemic heart disease (ischemic cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemic heart failure, etc.), ischemic kidney disease, ischemic lung disease, ischemic disease related to infection. There are patients, etc.
  • the ischemic disease targeted by the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention is not particularly limited, and any ischemic disease is targeted, but it is preferable to target peripheral circulation disorders.
  • Peripheral circulatory disturbance is caused by stenosis of blood vessels, formation of blood clots, occlusion of blood vessels, vasculitis, vasoconstriction, increased blood viscosity, etc. resulting in decreased blood flow in peripheral arteries and peripheral tissues becoming ischemic. It is a medical condition.
  • obstructive arteriosclerosis chronic arterial occlusion such as Buerger's disease, progressive systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, Reino's disease, vibration disease, aneurysm, vasculitis, etc. be able to.
  • chronic arterial occlusion such as Buerger's disease, progressive systemic sclerosis, systemic lupus erythematosus, Reino's disease, vibration disease, aneurysm, vasculitis, etc.
  • the therapeutic agent of the present invention includes a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizer, and an isotonic agent as necessary.
  • Preservatives Preservatives, adsorption inhibitors, surfactants, diluents, excipients, pH adjusters, soothing agents, buffers, sulfur-containing reducing agents, antioxidants, and the like can be appropriately added.
  • suspending agent examples include methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragacanth powder, sodium carboxymethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate and the like.
  • solution adjuvant examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, nicotinic acid amide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, tuna gol, castor oil fatty acid ethyl ester, and the like.
  • Examples of the stabilizer include dextran 40, methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, and sodium metasulfite.
  • amino acid added as stabilizers include free amino acids, salts such as sodium salts, potassium salts and hydrochlorides thereof.
  • One or more amino acids can be added in combination.
  • the amino acid added as a stabilizer is not particularly limited, but preferred amino acids include leucine, tributophan, serine, glutamic acid, arginine, histidine, and lysine.
  • Examples of the tonicity agent include D-manntol and sorbate.
  • Examples of the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, and black mouth talesol.
  • Examples of the adsorption inhibitor include human serum albumin, lecithin, dextran, ethylene oxide / propylene oxide copolymer, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyethylene glycol and the like.
  • Surfactants include nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, glycerin monomylate, glycerin mono Glyce such as stearate Phosphorus fatty acid ester; polyglycerin fatty acid ester such as decaglyceryl monostearate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan Polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as monostearate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, polyoxyethylene sorbitan tristearate; polyoxyethylene sorbitan tetrastearate, polyoxyethylene sorbite tetra Poly
  • surfactants can be added to the preparation of the present invention.
  • Preferred surfactants are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer such as Pull Knick F-68 (registered trademark) is also preferred.
  • sulfur-containing reducing agent examples include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocysteine, thiotate, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, thio Examples thereof include those having a sulfhydryl group such as sodium sulfate, dartathione, and thioalkanoic acids having 1 to 7 carbon atoms.
  • Antioxidants include, for example, erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxylsol, a -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and its salts, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbic acid stearate, hydrogen sulfite
  • the chelating agent include sodium, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, and sodium metaphosphate.
  • inorganic salts such as sodium chloride, potassium salt, calcium salt, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium bicarbonate; sodium citrate, potassium citrate, sodium acetate, etc.
  • organic salts such as sodium chloride, potassium salt, calcium salt, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium bicarbonate; sodium citrate, potassium citrate, sodium acetate, etc.
  • organic salts such as sodium chloride, potassium salt, calcium salt, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium bicarbonate; sodium citrate, potassium citrate, sodium acetate, etc.
  • organic salts such as sodium chloride, potassium salt, calcium salt, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium bicarbonate; sodium citrate, potassium citrate, sodium acetate, etc.
  • the sustained-release preparation can be prepared by a known method, for example, a method using a polymer as a base.
  • the polymer used as the base is preferably a polymer that is degraded in vivo.
  • the therapeutic agent of the present invention is usually 0.001 to EPO derivatives ⁇ g / kg / day ⁇ 1000 ⁇ g / kg / day, good Mashiku is 0.01 ⁇ ⁇ / 13 ⁇ 4 / (1 & ⁇ 100 / ⁇ g / kg / day, more preferably 0.1 g / kg / day to 30 g / kg / day
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention for each patient is the patient's age, weight, symptoms, route of administration, etc. Determined by the doctor in consideration of
  • the EPO derivative is preferably administered locally.
  • the site to be locally administered is not particularly limited, and can be administered to a site where is promoted angiogenesis or increased blood flow! /, Or a site (tissue, organ, etc.) is ischemic.
  • Specific examples of local administration sites include lower limb skeletal muscle, upper limb skeletal muscle, and heart (myocardium). Togashi.
  • the local administration is not particularly limited as long as it is a method that can efficiently administer the EPO derivative to the affected area without affecting the whole body, and local administration is performed using a normal syringe, needle, local needle or the like. It is possible.
  • local administration usually means that angiogenesis is promoted or blood flow is increased! /, Where the site is ischemic and the EPO derivative is administered directly to the site or its vicinity. However, it may have been promoted angiogenesis or increased blood flow! /, Or the site may become ischemic and may be administered to blood vessels directly connected to the site (eg, the liver is For example, when an EPO derivative is administered to the hepatic artery in the case of a blood site).
  • the therapeutic agent also includes a prophylactic agent for the purpose of prevention.
  • the therapeutic agent of the present invention When the therapeutic agent of the present invention is administered together with a stem cell-containing substance, the therapeutic effect is enhanced.
  • Stem cells are cells having the ability to distinguish from self-replicating ability, and the stem cells used in the present invention may be hematopoietic stem cells, other stem cells, or may be shifted.
  • the stem cell-containing substance is not particularly limited as long as it is a composition containing stem cells, and may contain only stem cells, or other components other than stem cells. May be included.
  • the stem cell-containing substance include bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood and the like.
  • the stem cell-containing substance is bone marrow cells.
  • the bone marrow cells may be autologous bone marrow! /, Or other bone marrow! /. It is also preferable that the bone marrow tissue compatible antigen (HLA or MHC) type to be administered does not necessarily match the patient!
  • Bone marrow cells can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, a mammal can be anesthetized and collected from a part of the pelvis (eg, iliac and femur). The collected bone marrow may be separated from nucleated cell components or low density cell components by a known method such as specific gravity centrifugation.
  • Bone marrow cells are usually 1 X 10 6 to 1 X 10 12 cells / body, preferably 1 X 10 8 cells to 1 X 10 1Q cells / body, more preferably 3 X 10 9 to 6 X 10 cells. Nine / body is administered.
  • Bone marrow cells can be administered in a plurality of locations or divided into a plurality of times.
  • an example of administration for limb ischemia treatment is a method of intramuscular administration of a bone marrow cell-containing solution concentrated to 50 ml divided into 50 sites (lml per site).
  • An example of administration for treatment is a method of intramuscular administration of 50 ml of bone marrow-containing solution concentrated to 10 ml (0.2 ml per site).
  • the present invention also provides a blood flow increasing agent, a blood vessel promoting agent, or an ischemic disease therapeutic agent characterized by combining an EPO derivative and a stem cell-containing substance.
  • the EPO derivative and the stem cell-containing substance may be administered simultaneously or sequentially.
  • the present inventors conducted a therapeutic effect experiment using a lower limb ischemia model. (Survival effect) is observed, and recovery from cyanosis is not observed with EPO alone, but recovery from cyanosis (effective revascularization effect) is observed with single oral EPO administration It was. In addition, the combination of bone marrow cell transplantation and cashmere EPO administration significantly promoted survival and effective revascularization.
  • an EPO derivative can be used for the treatment of increased blood flow, promotion of angiogenesis, or ischemic disease without causing undesirable effects such as polycythemia.
  • EPO lyophilized powder and neurominidase (Seikagaku Corporation) were dissolved in 10 mM citrate phosphate buffer (pH 6.5) and mixed to 1 mg / ml and 250 mU, respectively. After incubation at 37 ° C for 1 hour, the cashier EPO was purified by gradient elution of cetonitrile on a C4 reverse phase HPLC column (Vydac).
  • EPO-dependent cell lines were used as an index for the ability of EPO to have bioactivity. That is, the AS-E2 cell line that proliferates in an EPO-dependent manner (Reference: iiyazaki Y. Kunyama K. higuchi M. Tsushima H. Sohda H. Imai. Baito M. Kondo T. Tomonaga M. Establishment and characterization of a new erythropoietin— de pendent acute myeloid leukemia cell line, AS-E2.
  • Leukemia.ll (ll: 1941-9, 1997 Nov.) 10000 pcs 0.04-10 ng / ml cashmere mouth EPO or 20% FCS / containing EPO Incubate in IMDM medium (Hyclone) at 37 ° C, 5.0% CO for 3-4 days.
  • IMDM medium Hyclone
  • the number of viable cells was measured. It was confirmed that the same growth stimulation as that of EPO can be obtained in the cashier EPO.
  • mice Male 8-week-old ICR mice (30-35g) were purchased from Yokohama, Japan and used in the experiments. All experiments were performed aseptically based on the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication No. 86-23; National Institute of Health, Bethesda, MD). Mice were anesthetized by intraperitoneal administration of ketamine (60 mg / kg BW) and xylazine (6 mg / kg BW).
  • mice All mice were given normal food and drinking water.
  • Example 3 Treatment effect experiment using a lower limb ischemia model (survival effect and revascularization effect) (Experimental method)
  • Group E EPO (400 U / kg body weight, intramuscular injection of ischemic site) treated by daily administration for 6 days
  • AE group The same amount of the same administration method
  • Group B Treatment by intramuscular injection of 1 x 10 7 bone marrow cells (administered in 4 locations on the first day)
  • B + E group Combined use of B (bone marrow cells) and E (EPO)
  • B + AE group Combined use of B (bone marrow cells) and AE (Cashiaro EPO)
  • Example 4 Treatment effect experiment using lower limb ischemia model (blood flow recovery effect)
  • Example 3 Lower limb survival / recovery model The blood flow was measured using the same mouse as the lower limb survival / recovery model and the mouse lower limb ischemia model prepared by the same procedure.
  • J ii Measure blood flow in both lower limbs using moorLDI laser Doppler system from Moor Instruments dry soil (Wilmington, Delaware, UbA) The value obtained from J was defined as the flux ratio.
  • Example 5 Treatment effect experiment using an limb ischemia model (Angiogenesis effect)
  • Example 4 after measuring blood flow with a Laser Doppler, the ischemic lower limb thigh muscle was taken out as a specimen, and blood vessels were stained with anti-CD31 antibody and peroxidase method. The number of blood vessels and muscle fibers were counted, and the former divided by the latter was taken as the number of blood vessels per muscle fiber.
  • Group C Contorole Group E: Single dose of EPO 40, 400 or 4,000 U / kg body weight
  • Figure 5 shows the effect of each administration on Sp: spleen weight, Hb: hemoglobin concentration, Hct: hematocrit, and Ret: reticulocyte ratio. The results are summarized as follows.

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Abstract

　エリスロポエチン（EPO）誘導体を有効成分とする血流増加剤、血管促進剤又は虚血性疾患治療剤。

Description

明 細 書
EPO誘導体含有血液関連疾患治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、 EPO誘導体を有効成分とする血流増加剤、血管促進剤又は虚血性疾 患の治療剤に関する。
背景技術
[0002] エリスロポエチン (以下において EPOと記載することもある）は、赤血球系前駆細胞 の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであり、主として腎臓力ゝら産生さ れる。血液中に最も豊富に存在する赤血球は、一定期間機能した後に脾臓などで破 壊される（ヒトでは平均寿命が約 120日）力 骨髄カゝら絶えず供給されることによって、 正常な状態では末梢の全赤血球数は常に一定に保たれている。 EPOはこのような生 体の赤血球の恒常性維持において中心的な役割を担っている。臨床的には EPOは 貧血の治療や術前術後の管理に利用されている。
[0003] また、 EPOが血管新生促進作用を有し、虚血性疾患の治療剤として有用であること も報告されている（Anatole B et al, The New England Journal of Medicine, 339(9),58 4-590, (1998)、 Christopher H et al" Blood, 102(4), 1340— 1346ズ 2003)、 Ferdinand H B et al.,Blood,103(3),921-926, (2004)、 Kyle J S et al, Cardiovascular Research,(59), 538—548,(2003)、 Ferdinand H B et al, Kidney International,64, 1648— 1652,(2003))。 しかし、血管新生作用の目的で EPOを投与する場合、本来の目的ではない赤血球 増加を引き起こす可能性がある。従って、赤血球増加作用ができるだけ抑制され、か つ虚血性疾患などの血液関連疾患の治療剤として使用できる新規な治療剤が求め られている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、虚血性疾患などの治療剤として使用できる治療剤を提供することを目的 とする。
課題を解決するための手段 [0005] 本発明者らは、 EPO誘導体、特にァシァ口 EPOが血流増加作用、血管促進作用又 は虚血性疾患治療作用を有することを見出し、本発明を完成させた。
[0006] すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)エリスロポエチン (EPO)誘導体を有効成分とする虚血性疾患治療剤。
(2) EPO誘導体がァシァ口 EPOである（1)の治療剤。
(3)幹細胞含有物質とともに投与される (1)または (2)の治療剤。
(4)幹細胞含有物質が骨髄細胞である（3)の治療剤。
(5) EPO誘導体を有効成分とする血管促進剤。
(6) EPO誘導体がァシァ口 EPOである（5)の促進剤。
(7)幹細胞含有物質とともに投与される (5)または (6)の促進剤。
(8)幹細胞含有物質が骨髄細胞である（7)の促進剤。
(9) EPO誘導体を有効成分とする血流増加剤。
(10) EPO誘導体がァシァ口 EPOである（9)の増加剤。
(11)幹細胞含有物質とともに投与される（9)または（10)の増加剤。
( 12)幹細胞含有物質が骨髄細胞である（11)の増加剤。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]図 1は、 ICRマウスの下肢虚血モデルを用いた EPO誘導体による治療実験の結 果 (左図:生存効果、右図：血管再生効果)を示すグラフである。
[図 2]図 2は、 ICRマウスの下肢虚血モデルを用いた骨髄細胞とともに投与される EP O誘導体による治療実験の結果 (左図：生存効果、右図：血管再生効果)を示すダラ フである。
[図 3]図 3は、 ICRマウスの下肢虚血モデルを用 、た治療実験の結果 (血流回復効果 )を示すグラフである。
[図 4]図 4は、 ICRマウスの下肢虚血モデルを用いた治療実験の結果 (血管新生効果 )を示すグラフである。
[図 5]図 5は、無処置の ICRマウスを用いた、 EPO及びァシァ口 EPOの多血症の発症 に及ぼす効果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態 [0008] EPO
本発明に用いる EPOは、どのような EPOでも用いることができる力 好ましくは高度 に精製された EPOであり、より具体的には、哺乳動物 EPO、特にヒト EPOと実質的に 同じ生物学的活性を有するものである。
[0009] 本発明で用いる EPOは、いかなる方法で製造されたものでもよぐ例えば、ヒト由来 の抽出物力も精製して得られた天然のヒト EPO (特公平 1-38800号公報、など)や、あ るいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細 胞（CHO細胞）、 C127細胞、 COS細胞、ミエローマ細胞、 BHK細胞、昆虫細胞、な どに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したヒト EPOなどを用いることができ る。本発明において用いられる EPOは、遺伝子工学的手法により製造された EPOが 好ましぐ哺乳動物細胞 (特に CHO細胞）を用いて製造された EPOが好ま ヽ (例え ば、特公平 1-44317号公報、 Kenneth Jacobs et al., Nature, 313 806-810 (1985)、な ど)。
[0010] 遺伝子組換え法により得られる EPOには、天然由来の EPOとアミノ酸配列が同じで あるもの、あるいは該アミノ酸配列中の 1または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等 したもので、天然由来の EPOと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。 アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。 例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法 (Gotoh, T. et al. (1995) Gene 15 2, 271-275 ;Zoller, M.J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500 ;Kra mer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441— 9456 ; Kramer, W. and Fritz, H.J.
(1987) Methods Enzymol. 154, 350-367 ;Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 82, 488-492 ;Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763- 2766)などを用いて 、 EPOのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、 EPOと機能的に同等なポリべプチ ドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的 に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミ ノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K 、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有す るアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及び アミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ離 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる (括弧 内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数 個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾された アミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知ら れている（Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662- 5666 ; Zolle r, M.J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487— 6500 ; Wang, A. et al., Science 224, 1431— 1433 ; Dalbadie—McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413) o
[0011] 又、 EPOと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリべ プチドを作製するには、例えば、 EPOをコードする DNAと他のタンパク質をコードす る DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発 現させればよい。本発明の EPOとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限 定されない。
[0012] 又、化学修飾した EPOを用いることも可能である。化学修飾した EPOの例としては、 例えば、ポリエチレングリコール 'ビタミン B12等、無機あるいは有機化合物等の化合 物を結合させた EPOなどを挙げることができる。
EPO纏 ί本
本発明において ΕΡΟ誘導体とは、 ΕΡΟ分子中のアミノ酸を修飾した ΕΡΟ又は ΕΡΟ 分子中の糖鎖を修飾した ΕΡΟのことをいう。
[0013] ΕΡΟ分子中の糖鎖の修飾としては、糖鎖の付加、置換、欠失などが含まれる。本発 明にお ヽて好まし 、糖鎖の修飾としては、 ΕΡΟ分子中のシアル酸の欠失を挙げるこ とがでさる。
[0014] 通常、組換え動物細胞により生産した ΕΡΟ、尿由来の EPOのいずれにおいても、糖 鎖構造の異なる多様な EPOを含む EPO組成物として得られる。 EPO組成物中の EPO 分子に付カ卩しているシアル酸の数は、個々の EPO分子によって異なる力 通常、 1つ の EPO分子に 11個〜 15個のシアル酸が付カ卩して!/、る。これらのシアル酸を除去する ことによりァシァ口化された EPO (ァシァロ EPO)を作製することが可能である。ァシァ 口化の際に除去されるシアル酸の数は特に限定されず、全てのシアル酸を除去して もよいし、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、又は 14個のシアル酸を除去して もよい。本発明において好ましいァシァ口 EPOは、 EPO分子に付カ卩しているシアル酸 の数が 10個以下であり、さらに好ましくは 5個以下であり、特に好ましくは 2個以下で ある。なお、本発明において用いられるシアル酸の数は、 EPO組成物に含まれている EPO分子の平均数を用いる。 1分子あたりのシアル酸の平均は当業者に公知の方法 によって測定することが可能である（EP0428267公報、など)。
[0015] シアル酸が除去された EPO (ァシァロ EPO)は当業者に公知の方法で作製すること ができ、例えば、シァリダーゼなどの酵素で EPOを処理すること等により作製すること が可能である。シァリダーゼは市販されているものを用いることが可能である。 （特表 2 005- 507426号、 Nobuo Imai et al.， Eur.J.Biochem, 194, 457-462 (1990)、など）
EPO分子中のアミノ酸の修飾としては、力ルバミル化、ピオチン化、アミジン化、ァセ チル化、グァ-ジン化、などを挙げることができる力 本発明において好ましいァミノ 酸の修飾は力ルバミル化である。
[0016] 修飾されるアミノ酸残基は特に限定されず、例えば、リジン、アルギニン、グルタミン 酸、トリブトファンなどを挙げることができるが、本発明において修飾される好ましいァ ミノ酸はリジンである。
[0017] 従って、本発明においてアミノ酸が修飾された EPOの特に好ましい態様として、リジ ンがカルバミル化された EPOを挙げることができる（Marcel L et al. Derivatives of ery thropoietin that are tissue protective but not erythropoietic. Science, 2004; 305: 23 9、 Fiordaliso E et al. A nonerythropoietic derivative of erythropoietin protects the myocardium from ischemia- reperfusion injury. PNAS, 2005; 102: 2046、など)。 EPO の力ルバミル化には、シアナ一トイオン等との反応による力ルバミル化、アルキルーィ ソシアナート等との反応によるアルキル一力ルバミル化、ァリール イソシアナート等 との反応によるァリール一力ルバミルィ匕などが含まれる。 本発明の治療剤は、血流増加剤、血管促進剤又は虚血性疾患治療剤として有用 である。
[0018] 本発明において血流増加とは、 EPO誘導体が局所投与された部位又は該部位より 末梢に位置する部位における血流量が投与前に比べて増加すること、又は虚血組 織に到達する血流量が増加することを意味する。血流増加作用が得られたかどうか については、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば、フロー 技術により放射活性ミクロスファーを用いて定量することが可能である (Am. J. Physiol . 243:H371-H378、（1982))。さらに、皮膚温、サーモグラフィー、レーザー血流計、下 肢 Z上肢血圧比、組織酸素分圧などの方法により測定、確認することもできる。
[0019] 本発明にお 、て血管促進とは、血管新生の促進、血管再生の促進、又は血管の成 長 ·発達の促進をいう。 EPO誘導体により新生、再生、成長、発達などが促進される 血管は特に限定されないが、動脈が好ましぐ特に末梢動脈が好ましい。血管促進 作用が得られた力どうかについては、当業者に公知の方法により測定することが可能 であり、例えば、アルカリフォスファターゼ染色などを用いて毛細血管密度を測定する こと等により可能である。さらには、血管造影などの方法で測定、確認することもでき る。
[0020] 本発明の治療剤は虚血性疾患の治療に有用である。虚血性疾患は血管内腔の狭 窄、血栓の生成、血管の閉塞、血管炎、血管の収縮、血液粘性の増加などの様々な 要因により、血管における血流量が減少し、組織が虚血状態に陥る病状である。虚 血性疾患の例としては、末梢循環障害、虚血性心疾患 (虚血性心筋症、心筋梗塞症 、虚血性心不全など)、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾 患、などがある。
[0021] 本発明の虚血性疾患治療剤が対象とする虚血性疾患は特に限定されず、如何な る虚血性疾患も対象となるが、末梢循環障害を対象とすることが好ましい。末梢循環 障害は血管内腔の狭窄、血栓の生成、血管の閉塞、血管炎、血管の収縮、血液粘 性の増加などにより末梢動脈の血流が減少し、末梢の組織が虚血状態に陥る病状 である。末梢循環障害を伴う疾患としては、閉塞性動脈硬化症、 Buerger病などの慢 性動脈閉塞症、進行性全身硬化症、全身性エリテマトーデス、レイノ一病、振動病、 動脈瘤、血管炎などを挙げることができる。 '治療用製剤
本発明の治療剤には、必要に応じて、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤
、保存剤、吸着防止剤、界面活性剤、希釈剤、賦形剤、 pH調整剤、無痛化剤、緩衝 剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。
[0022] 懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート 80、ヒドロキシェチルセル口 ース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシ エチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。
[0023] 溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート 80、ニコチ ン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪 酸ェチルエステル等を挙げることができる。
[0024] 安定化剤としては、デキストラン 40、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム 、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
[0025] また、安定化剤としてある種のアミノ酸を添加することも可能である（例えば、特開平 10-182481号公報など)。安定化剤として添加されるアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そ のナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩などが含まれる。アミノ酸は 1種又は 2種 以上を組み合わせて添加することができる。安定化剤として添加されるアミノ酸は特 に限定されないが、好ましいアミノ酸としては、ロイシン、トリブトファン、セリン、グルタ ミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンを挙げることができる。
[0026] 等張化剤としては例えば、 D—マン-トール、ソルビート等を挙げることができる。
[0027] 保存剤としては例えば、パラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、 ソルビン酸、フエノール、クレゾール、クロ口タレゾール等を挙げることができる。
[0028] 吸着防止剤としては例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレン オキサイド 'プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセ ルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることが できる。
[0029] 界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソル ビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリ セリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセ リン脂肪酸エステル;デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、 デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソ ルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノォレエート、ポリオキシェチ レンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリ ォキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレー ト等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテ トラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシェチレ ンソルビット脂肪酸エステル;ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオ キシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポ リエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオ キシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオ キシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキル エーテル；ポリオキシェチェレンノニルフエニルエーテル等のポリオキシエチレンアル キルフエ-ルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ 油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキ シエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシェチレ ンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体;ポリオキシエチレンステアリン酸アミ ド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の HLB6〜18を有するもの；陰イオン界面 活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム 等の炭素原子数 10〜 18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレン ラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル 基の炭素原子数が 10〜 18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウ リルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜 18のァ ルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、ダリセロリ ン脂質；スフインゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数 12〜 18の脂肪酸のショ 糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これ らの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添加することができる。好まし い界面活性剤は、ポリソルベート 20, 40, 60又は 80などのポリオキシエチレンソルビ タン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート 20及び 80が特に好ましい。また、ポロキサ マー（プル口ニック F— 68 (登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキ シプロピレングリコールも好まし 、。
[0030] 含硫還元剤としては例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセチルホモシスティン 、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリセロール、チォソルビ トール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、ダルタチオン、炭素原子 数 1〜 7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
[0031] 酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒ ドロキシァ-ソール、 a—トコフエロール、酢酸トコフエロール、 L—ァスコルビン酸及 びその塩、 Lーァスコルビン酸パルミテート、 Lーァスコルビン酸ステアレート、亜硫酸 水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食子酸プロピルあるいはェ チレンジァミン四酢酸ニナトリウム (EDTA)、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム 等のキレート剤が挙げられる。
[0032] さらには、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸力 リウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩;クェン酸ナトリウム、クェン酸カリウム、酢酸 ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んで 、てもよ 、。
[0033] 本発明を徐放性製剤として行う場合、徐放性製剤は公知の方法、例えば基剤とし てポリマーを用いる方法などにより調製することが可能である。基剤として用いるポリ マーは生体内で分解されるポリマーを用いることが好ましい。
[0034] 本発明の治療剤は、通常、 EPO誘導体を 0.001 μ g/kg/day〜1000 μ g/kg/day,好 ましくは 0.01 μ §/1¾/(1&γ〜100 /ζ g/kg/day、より好ましくは 0.1 g/kg/day〜30 g/kg /dayの投与量で投与する。本発明の治療剤の個々の患者に対する投与量は患者の 年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して医師により決定される。
[0035] 本発明の治療剤においては、 EPO誘導体は局所投与されることが好ましい。局所 投与される部位は特に限定されず、血管新生促進や血流増加を起こした!/、部位 (組 織、器官など)ゃ虚血状態になっている部位などに投与することができる。具体的な 局所投与部位の例としては、下肢骨格筋、上肢骨格筋、心臓 (心筋)などを挙げるこ とがでさる。
[0036] 局所投与は、全身に大きな影響を及ぼすことなく患部局所に効率的に EPO誘導体 を投与できる方法であれば特に限定されず、通常の注射器、ニードル、局所針など を用いて局所投与することが可能である。
[0037] 本発明にお 、て局所投与とは、通常、血管新生促進や血流増加を起こした!/、部位 ゃ虚血状態になって 、る部位やその近傍などに直接 EPO誘導体を投与することを ヽ うが、血管新生促進や血流増加を起こした!/、部位ゃ虚血状態になって 、る部位など に直接つながっている血管に投与してもよい（例えば、肝臓が虚血部位である場合 に、肝動脈に EPO誘導体を投与する場合、など)。
[0038] 本発明にお 、て治療剤は、予防を目的とした予防剤も含む。
鍾 驢
本発明の治療剤は幹細胞含有物質とともに投与すると、治療効果が増強される。
[0039] 幹細胞は自己複製能と分ィ匕する能力を持った細胞であり、本発明で用いられる幹 細胞は造血幹細胞でもそれ以外の幹細胞でも 、ずれでもよ 、。
[0040] 本発明にお 、て幹細胞含有物質とは、幹細胞が含まれて 、る組成物であれば特 に限定されず、幹細胞のみが含まれていてもよいし、幹細胞以外にその他の成分が 含まれていてもよい。幹細胞含有物質としては、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血など を挙げることができ、好ま 、幹細胞含有物質は骨髄細胞である。
[0041] 骨髄細胞は、自家の骨髄でもよ!/、し他家の骨髄でもよ!/、。又、投与される骨髄の組 織適合抗原 (HLA又は MHC)型は必ずしも患者と一致して!/ヽる必要はな ヽが、一致 して 、ることが好ま 、。骨髄細胞は当業者に公知の方法により調製することが可能 であり、例えば、哺乳動物を全身麻酔し、骨盤の一部 (腸骨、大腿骨など)から採取 することが可能である。採取された骨髄は、比重遠心法などの公知の方法により有核 細胞成分あるいは低比重細胞成分を分離してもよ 、。
[0042] 骨髄細胞は、通常、 1 X 106〜1 X 1012個/ body、好ましくは 1 X 108個〜 1 X 101Q個/ bo dy、さらに好ましくは 3 X 109〜6 X 109個/ bodyが投与される。
[0043] 投与方法は特に限定されず、如何なる方法により投与されてもよいが、局所投与が 好ましぐ特に虚血部位に筋肉内注射することが好ま 、。 [0044] 骨髄細胞の投与は複数個所または複数回に分けて投与することも可能である。例 えば、四肢虚血治療の為の投与の例としては、 50mlに濃縮した骨髄細胞含有溶液 を 50箇所（1箇所当たり lml)に分けて筋肉内投与する方法を挙げることができ、心筋 虚血治療の為の投与の例としては、 10mlに濃縮した骨髄含有溶液を 50箇所（1箇所 当たり 0. 2ml)に分けて筋肉内投与する方法を挙げることができる。
[0045] 本発明はまた、 EPO誘導体と幹細胞含有物質を組み合わせることを特徴とする血 流増加剤、血管促進剤又は虚血性疾患治療剤を提供する。 EPO誘導体と幹細胞含 有物質は同時に投与しても、あるいは逐次投与してもよ 、。
本発明の効
本発明者らは、後述の実施例に示したように、下肢虚血モデルを用いる治療効果 実験を行ったところ、ァシァ口 EPO単独投与は EPO単独投与に比べて、下肢の壊死 をさらに強く抑制する（生存効果)が観察され、また、 EPO単独投与によってはチアノ ーゼからの回復が見られないが、ァシァ口 EPO単独投与によってチアノーゼからの回 復 (実効的な血管再生効果)が観察された。さらに、骨髄細胞移植とァシァ口 EPO投 与の併用によって、生存効果および実効的な血管再生効果が著しく助長された。
[0046] 同じぐ下肢虚血モデルを用いる治療効果実験により血流回復効果を測定したとこ ろ、下肢の血流の回復に関して、ァシァ口 EPOは EPOよりも、単独治療および骨髄細 胞移植併用の両方で優れて!、た。
[0047] さらに、下肢虚血モデルを用いる治療効果実験により血管新生効果を測定したとこ ろ、血管の新生に関して、ァシァ口 EPOは EPOよりも、単独治療および骨髄細胞移植 併用の両方で優れて!ヽた。
[0048] また、下肢虚血を作成しな!、無処置の ICRマウスを用いて、多血症の発症に及ぼす 効果を実験したところ、 EPO投与では、赤芽球造血の亢進 (Ret)、脾臓での髄外造血 の亢進（Sp)および多血症（Hb、 Hct)が観察されたのに対し、ァシァ口 EPOの投与に よっては、このような副作用が観察されな力つた。
[0049] 本発明者は、以下の理論に拘束されるものではないが、ァシァ口 EPOは EPOに比 ベて血中での分解速度が速ぐ血中に滞留しないので、多血症のような副作用を生 じないものと推測している。 [0050] 本発明に従い、 EPO誘導体を投与することにより、多血症などの好ましくない作用を 引き起こすことなぐ血流増加、血管新生促進又は虚血性疾患の治療に使用するこ とがでさる。
[0051] 本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種 々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
[0052] なお、以下の実施例における統計的解析は、全てのデータを平均値士 SDで表す。
群間の比較を ANOVA、次いでフィッシャーの確率検定により行った。顕著な違いを p 〈0. 05で定義した。
実施例
[0053] 実施例 1：ァシァ口 EPOの調製
CHO細胞を用いて遺伝子組換え法で作製した EPO (中外製薬株式会社製)から、 文献 (Imai N. Higuchi M. Kawamura A. Tomonoh K. Oh- Eda M. Fujiwara M. Shimon aka Y. Ochi N. Physicochemical and biological characterization of asialoerythropoiet in. Suppressive effects of sialic acid in the expression of biological activity of human erythropoietin in vitro. European Journal of Biochemistry. 194(2) :457-62, 1990 Dec 12.)記載の方法により、ァシァ口 EPOを調製した。シアル酸が除去されたことは SDSゲ ル電気泳動による分子量低下ならびに等電点電気泳動による pi変化により確認した 。また、生物活性が保持されていることは EPO依存性細胞株の増殖を指標としたバイ オアッセィにより確認した。
ァシァ口 EPOの作製
EPO凍結乾燥粉末およびノィラミニダーゼ (生化学工業)を 10 mMクェン酸 リン酸 緩衝液 (pH 6.5)で溶解し、それぞれ 1 mg/mlおよび 250 mUとなるよう混和した。 37°C にて 1時間インキュベートした後、 C4逆相 HPLCカラム (バイダック）のァセトニトリル濃 度勾配溶出によってァシァ口 EPOを精製した。
[0054] 得られたァシァ口 EPOにおいてシアル酸が除去されていることは、 SDSゲル電気泳 動による分子量低下ならびに等電点電気泳動による pi変化により確認した。すなわち 、ァシァ口 EPO 5.0 gを SDS-PAGEサンプルバッファー（テフコ）中で 100°C、 10分間 の変成処理を行い、その全量 14%アクリルアミドゲル (テフコ）にて電気泳動した。ゲル を CBB染色し、約 5kDaの分子量の低下を確認した。また、 PhastGel IEF 3-9 (アマシ ャム）にて等電点電気泳動を行った後、 20%トリクロ口酢酸溶液で固定化処理し、 Phas tGel Protein Silver Staining Kitを用いて銀染色を行った。シアル酸の解離によって pi 力 .0付近に変化して 、ることを確認した。
ァシァ口 EPOの生物活性
ァシァ口 EPOが生物活性を有して 、ることは、 EPO依存性細胞株の増殖を指標とし たバイオアツセィにより確認した。すなわち、 EPO依存性に増殖する AS-E2細胞株 (文 献： iiyazaki Y. Kunyama K. higuchi M. Tsushima H. Sohda H. Imai . baito M. Ko ndo T. Tomonaga M. Establishment and characterization of a new erythropoietin— de pendent acute myeloid leukemia cell line, AS- E2. Leukemia. l l(l l :1941-9, 1997 N ov.) 10000個を 0.04〜10 ng/mlのァシァ口 EPOあるいは EPOを含む 20% FCS/IMDM 培地（Hyclone)中で、 37°C, 5.0% CO条件下で 3〜4日間培養し、 WST-1試薬（宝酒
2
造）にて生細胞数を測定した。ァシァ口 EPOにおいても EPOと同様の増殖刺激が得ら れることを確認した。
実施例 2： ICRマウスによる下肢虚血モデルの作製
チヤ一ルスリバ一（Yokohama, Japan)より雄 8週齢の ICRマウス（30 - 35g)を購入し 実験に用いた。すべての実験手川頁は Guide for the Care and Use of Laboratory Ani mals (NIH publication No.86 - 23; National Institute of Health, Bethesda, MD)に基 づき無菌的に行われた。マウスをケタミン（60 mg/kg BW)およびキシラジン（6 mg/kg BW)の腹腔内投与により麻酔した。 Isnerの方法に準じ左下肢の中間部に皮膚切開 をカロえ、血管を露出した（Couffinhal T, Silver M, Zheng LP, Kearney M, Witzenbichl er B, Isner JM: Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol 152: 1667 - 1679, 1998) 。大腿動脈起始部を結紮ののちその末梢の伏在動脈を結紮し、その他の側枝を剥 離して本管とともに切除した。
なお、全てのマウスには通常の食事及び飲み水を与えた。
実施例 3：下肢虚血モデルを用いる治療効果実験 (生存効果および血管再生効果） (実験方法）
実施例 2の方法によって作製した ICRマウスの下肢虚血モデルを用いて治療実験 を行った。実験では、下肢の壊死を死と定義した (survival)。また、下肢のチアノーゼ 力 の回復を回復と定義した（recovery)。
[0056] 実験には以下の各群を用いた (各群 13匹)。
C群：無治療
E群： EPO (400 U/kg体重、虚血部位筋肉内注射）の 6日間連日投与によって治療 AE群：同量同投与法のァシァ口 EPOによって治療
B群： 1 X 107個の骨髄細胞を虚血部位筋肉内注射して治療（1日目に 4箇所に分け て投与）
B+E群： B (骨髄細胞)と E(EPO)を併用
B+AE群： B (骨髄細胞)と AE (ァシァロ EPO)を併用
(結果）
各治療の生存効果及び回復効果に及ぼす結果を図 1及び図 2に示す。結果をまと めると以下の通りである。
(1) EPO単独投与は下肢の壊死を抑制する力 ァシァ口 EPO単独投与は下肢の壊 死をさらに強く抑制する（生存効果)。
(2) EPO単独投与によってはチアノーゼからの回復が見られないが、ァシァ口 EPO単 独投与によってチアノーゼからの回復が観察される（実効的な血管再生効果)。
(3)骨髄細胞移植によって生存効果および実効的な血管再生効果が観察されるが、 これに EPO投与を併用するとこれらの効果が助長され、 EPOのかわりにァシァ口 EPO 投与を併用するとこれらの効果がさらに著しく助長される。
実施例 4：下肢虚血モデルを用いる治療効果実験 (血流回復効果）
実施例 3の下肢生存 ·回復モデルと同じマウス、同じ手技によって作成したマウス下 肢虚血モデルを用いて血流を測定した。
(実験方法）
下肢虚血作成の当日に治療開始した (day l)o移植は day 1に行った。 EPO等の投 与は day 1 - 6の 6日間行った。 Day 7にレーザ一'ドップラーを用いて下肢血流の回 復を測定した。
[0057] 実験には以下の各群を用いた。 C群：生理食塩液筋肉内注射 6日間（n=12)
E群： EPO 400 IU/kg体重の筋肉内注射 6日間（n=5)
A群：ァシァ口 EPO 400 IU/kg体重の筋肉内注射 6日間（n=10)
B群：同種同系骨髄細胞移植 (lxlO7骨髄細胞） (n=7)
BE群： Bと Eの併用 (n=5)
BA群： Bと Aの併用 （n=6)
視 !j定 ii、 Moor Instruments干土 (Wilmington, Delaware, UbA)の moorLDI laser Dopp ler systemを用いて両下肢の血流を測定し、虚血肢の測定値を健常肢の測定値で 害 |Jつた値を flux ratioとした。
(結果）
得られた結果を図 3に示す。下肢の血流の回復に関して、ァシァ口 EPOは EPOよりも 、単独治療および骨髄細胞移植併用の両方で優れて!ヽた。
実施例 5：下肢虚血モデルを用いる治療効果実験 (血管新生効果）
(実験方法）
実施例 4で、 Laser Dopplerで血流を測定したのち、虚血下肢大腿筋を取り出して 標本にし、抗 CD31抗体とペルォキシダーゼ法で血管を染色した。血管数と筋繊維数 を計数し、前者を後者で割った値を、筋繊維あたりの血管数とした。
(結果）
得られた結果を図 4に示す。血管の新生に関して、ァシァ口 EPOは EPOよりも、単独 治療および骨髄細胞移植併用の両方で優れて!/ヽた。
実施例 6：多血症の発症に及ぼす効果
(実験方法）
EPOの副作用である多血症の発症を見る目的で、下肢虚血を作成しない無処置の ICRマウスに EPOまたはァシァ口 EPOを 6日間連日投与（下肢筋肉内注射）し、投与初 日の 10日後に採血したのち安楽死させ、脾臓の重量 (Sp)を測定した。また、へモグ ロビン濃度 (Hb)、へマトクリット値 (Hct)及び網赤血球比率 (Ret)を測定した。
実験には以下の各群を用いた (各群 8匹)。
C群：コントローノレ E群： EPOの一回あたり投与量 40、 400または 4,000 U/kg体重
AE群：同量のァシァ口 EP0
(結果）
各投与による Sp :脾臓重量、 Hb :ヘモグロビン濃度、 Hct :へマトクリット値、 Ret:網赤 血球比率に及ぼす効果を図 5に示す。結果をまとめると以下の通りである。
(1) EPOの投与によって、赤芽球造血の亢進 (Ret)、脾臓での髄外造血の亢進 (Sp) および多血症（Hb、 Hct)が観察された。
(2)ァシァ口 EPOの投与によっては、このような副作用が観察されな力つた。

Claims

請求の範囲
[I] エリスロポエチン (EPO)誘導体を有効成分とする虚血性疾患治療剤。
[2] EPO誘導体がァシァ口 EPOである請求項 1に記載の治療剤。
[3] 幹細胞含有物質とともに投与される請求項 1または 2いずれかに記載の治療剤。
[4] 幹細胞含有物質が骨髄細胞である請求項 3記載の治療剤。
[5] EPO誘導体を有効成分とする血管促進剤。
[6] EPO誘導体がァシァ口 EPOである請求項 5に記載の促進剤。
[7] 幹細胞含有物質とともに投与される請求項 5または 6 、ずれかに記載の促進剤。
[8] 幹細胞含有物質が骨髄細胞である請求項 7記載の促進剤。
[9] EPO誘導体を有効成分とする血流増加剤。
[10] EPO誘導体がァシァ口 EPOである請求項 9に記載の増加剤。
[II] 幹細胞含有物質とともに投与される請求項 9または 10いずれかに記載の増加剤。
[12] 幹細胞含有物質が骨髄細胞である請求項 11記載の増加剤。
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