[go: up one dir, main page]

WO2006112000A1 - 大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース - Google Patents

大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース Download PDF

Info

Publication number
WO2006112000A1
WO2006112000A1 PCT/JP2005/006022 JP2005006022W WO2006112000A1 WO 2006112000 A1 WO2006112000 A1 WO 2006112000A1 JP 2005006022 W JP2005006022 W JP 2005006022W WO 2006112000 A1 WO2006112000 A1 WO 2006112000A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
doi
deoxy
gene
inosose
glucose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/006022
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masamichi Takagi
Takahisa Kogure
Naoki Wakisaka
Hiroaki Takaku
Katsumi Kakinuma
Katsumi Ajisaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NIIGATA BIO-RESEARCH CENTER Inc
NIIGATA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Original Assignee
NIIGATA BIO-RESEARCH CENTER Inc
NIIGATA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37086767&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2006112000(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by NIIGATA BIO-RESEARCH CENTER Inc, NIIGATA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY filed Critical NIIGATA BIO-RESEARCH CENTER Inc
Priority to PCT/JP2005/006022 priority Critical patent/WO2006112000A1/ja
Priority to EP06729749A priority patent/EP1865056B1/en
Priority to AT06729749T priority patent/ATE496994T1/de
Priority to PCT/JP2006/305782 priority patent/WO2006109479A1/ja
Priority to CN2006800107712A priority patent/CN101151368B/zh
Priority to JP2007512466A priority patent/JP4598826B2/ja
Priority to DE602006019835T priority patent/DE602006019835D1/de
Priority to US11/887,445 priority patent/US8758741B2/en
Priority to KR1020077024620A priority patent/KR101019759B1/ko
Priority to BRPI0607623-8A priority patent/BRPI0607623B1/pt
Publication of WO2006112000A1 publication Critical patent/WO2006112000A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US14/178,496 priority patent/US20140256960A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/16—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D309/28—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/30—Oxygen atoms, e.g. delta-lactones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01009—Glucose-6-phosphate isomerase (5.3.1.9)

Definitions

  • the present invention relates to a gene expression cassette, a transformant, a method for synthesizing 2-deoxyshiro noose by E. coli mutant strain, and purification of 2-deoxy silo noose synthesized by this method from a culture solution And a method of recovering it, and a 2-deoxy single ino source obtained by this method.
  • Carbon six-membered ring compounds have conventionally been produced from petroleum as a raw material in the petrochemical field.
  • DOI synthetase is an enzyme involved in the biosynthesis of aminoglycoside antibiotics containing 2-deoxystreptamine as aglycone, and its product, DOI, is useful as a pharmaceutical raw material or chemical resource. It is a substance. Whereas the method of immunologically synthesizing DOI uses multistep reactions and harmful or expensive metals, DOI synthetic enzymes can be used to efficiently produce DOI in a short process. So far, a method has been established for producing DOI in a short step using glucose-6-phosphate activity using a recombinant DOI synthetase obtained by expressing DOI synthetase in E. coli (Patent Document 1).
  • 2-deoxy 1-mono inosose can be prepared by using glucose with 2-deoxy mono-synose synthase and hexokinase, or glucose-6-phosphate with 2-deoxy It is known that it can be synthesized in one step of enzyme reaction by acting on Oxyshiro inoside synthetase (Patent Document 1, Non-patent Document 1). In addition, it is also reported that conversion to catechol can be performed without purifying DOI by concentrating the enzyme reaction solution and reacting hydrogen chloride with acetic acid solution (Patent Document 1).
  • DOI is synthesized by an enzyme reaction to convert DOI remaining as a reaction composition, but a method for purifying and isolating DOI itself has still been reported. Absent. Furthermore, in the microorganism culture solution of the present invention, which contains various metal ions such as amino acids derived from peptone in addition to various medium components and glucose as a carbon source in various amounts from the enzyme reaction solution. There is no information at all on purifying the DOI. That is, there is no report on purification of DOI from enzyme reaction solution and microorganism culture solution, and the purification method that can be applied industrially is completely established at present.
  • Non Patent Literature 1 K. Kakinuma, E. Nango, F. Kudo, Y. Matsushima, and T. Eguchi, Tetrahedron Letters, 41, 1935-1938 (2000) Disclosure of the Invention
  • DOI which is a useful resource, can be efficiently and efficiently made short from abundant D-Dalcose derived from North America. There is a possibility that it can be produced in the process.
  • DOI as a host cell as a novel synthesis method of DOI.
  • an industrial method which was intensively studied to develop a simple and inexpensive method for producing L. by fermentation, for example, when the culture solution is also flowed at the top of the column, it was purified from the lower part.
  • the method based on the principle that the DOI flows out is preferable. That is, an object of the present invention is to search for a column base material which adsorbs substances other than DOI and which flow out first without being adsorbed.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems, and as a result, the btrC gene encoding DOI synthetase is introduced into E. coli as a host cell, and DOI is synthesized by highly expressing it. It has been found that it is sufficient to complete the present invention.
  • the present invention is a gene expression cassette characterized in that it is a gene cassette involved in the synthesis of 2-deoxy single inocose (DOI).
  • DOI 2-deoxy single inocose
  • the present invention also relates to E. coli species as host cells or host cells described in the list of GILSP genetically modified microorganisms (as of October 2004, Bacillus' amimouth liquefaciens, Bacillus. Bacillus 'Brevis HPD 31-M 3, Bacillus' Riche-Hormis DN 2461, Bacillus 'Riche-Falmis DN 2717, Nocillus' Sacillus K 2 A 1, Bacillus 'Sacritus M 168 derived strain, Corynebacterium' glutamicum, esheliichia coli K 12 derived strain It is a transformant characterized in that at least one gene expression cassette which is involved in the synthesis of the above-mentioned 2 deoxyribonucleic acid is introduced into 'Stearo thermophilus'.
  • the present invention in order to suppress the decomposition metabolism of glucose-6-phosphate, which is a direct substrate for DOI production, by bacteria, and to enhance DOI production ability, the present invention is directed to the metabolism of glucose-6-phosphate.
  • a strain in which the genes encoding phosphodalcose isomerase and dulconate dehydrogenase (pgi gene and zwf gene, respectively), which are enzymes involved (pgi gene and zwf gene, respectively) are individually disrupted, or strains in which both of them are disrupted simultaneously are used.
  • the pgi gene encoding phosphodalcose isomerase and the above-mentioned host cell in which the zw f gene encoding dulconate dehydrogenase alone is disrupted alone or both of them are disrupted.
  • the above-mentioned host cell It is a transformant characterized by introducing at least one gene expression cassette which is a gene force involved in the synthesis of the above-mentioned 2-deoxy-port-inocose (DOI). This introduction is carried out in order to enhance the synthesis efficiency of 2-deoxy single ino source.
  • DOI 2-deoxy-port-inocose
  • the present invention is a method for synthesizing 2-deoxy 1 inose, characterized in that the above-mentioned transformant is used in a method for synthesizing 2 deoxyshiro inose from a carbon source.
  • the present invention is a method for synthesizing the above-mentioned 2-deoxycylloino source, wherein the carbon source is selected from D glucose, oligosaccharide, polysaccharide, starch, rice bran, shift force.
  • the present invention is characterized by DOI characterized by being synthesized by the above method.
  • a culture solution which is obtained by the above-mentioned synthesis method and contains 2-deoxysiloinosose is a hydrogen ion type strong acid cation exchange resin and an organic acid ion type basic negative anion. It is a purification method of 2-deoxycyloinosose characterized in that it is treated with a mixed bed column made of ion exchange resin.
  • the organic acid ion type basic anion exchange resin is an acetate ion type.
  • the present invention is a purified DOI.
  • Carbon six-membered ring compounds that are important as pharmaceutical raw materials and industrial raw materials have been manufactured by petroleum-based petrochemicals.
  • bacteria as a raw material to synthesize D-glucose, which is a six-membered carbon ring compound from a renewable plant resource (biomass), as a raw material. It became possible. Also, the culture solution can be processed to recover purified DOI.
  • FIG. 1 is a view showing a reaction pathway in which D-glucose force is also generated by DOI and a reaction catalyzed by DOI synthetase.
  • FIG. 2 shows the structure of pLEX-btrC.
  • FIG. 8 is a view showing SDS-PAGE pattern of cell extract when cultured at each time for each time.
  • FIG. 4 It is an HPLC chart of the oximization reaction supernatant of culture (2XYT 3 L, 30 ° C, pH 7.5, 5% D-glucose, culture for 24 hours) of E. coli strain GI724 A pgi containing pLEX-btrC. .
  • FIG. 5 Cultivation of E. coli strain GI724Apgi containing pLEX-btrC (2XYT + 2% glucose (o), or 2XYT + 5% D glucose (country), 3 L ⁇ 30 ° C, pH 7.5,)
  • FIG. 5 is a diagram showing the time course (the horizontal axis is the elapsed time after addition of glucose) of the turbidity of the culture medium, (B) D-glucose concentration, and (C) DOI production amount.
  • FIG. 6 Cultivation of (A) medium with culture of E. coli GI724ApgiAzwf strain containing pLEX-btrC (2XYT + 3% man-toll + 5% D glucose, 3 L, 30 ° C, pH 7.5), (B) Fig. 14 is a diagram showing the time course (the horizontal axis is the elapsed time after glucose addition) of D) glucose concentration, and (C) DOI production amount.
  • FIG. 7 A diagram in which pH, conductivity and DOI concentration of fractions obtained by flowing a culture solution through an ion exchange resin by the method of Example 8 are plotted.
  • FIG. 8 It is a C-13 NMR ⁇ vector of DOI obtained by purification by the method of Example 8.
  • FIG. 9 A diagram in which pH, conductivity and DOI concentration of fractions obtained by flowing a culture solution through an ion exchange resin by the method of Example 9 are plotted.
  • FIG. 10 It is a C-13 NMR ⁇ vector of DOI obtained by purification by the method of Example 9. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • bacteria which have been deposited in a depository (for example, IFO, ATCC etc.) of a strain which is not limited.
  • a gene encoding phosphodalcose isomerase and dulconate dehydrogenase which are enzymes involved in glucose 6 phosphate metabolism possessed by host cells (pgi gene and zwf gene, respectively)
  • pgi gene and zwf gene There are two single gene disruptions, or two double disruptions. This will inhibit the bacterial degradation of glucose 6-phosphate, which is a direct substrate for DOI production, and enhance DOI production capacity.
  • E. coli is taken as a host cell.
  • coli host cells described in the list of GILSP genetically modified microorganisms (as of October 2004, Bacillus' Amilorique faciens, Bacillus' Brevis HPD31, Bacillus' Brevis HPD31 — M3, Bacillus' Ricce-Hormis DN2461, Bacillus' Risheniphonoremis DN 2717, Bacillus' Sacillus K2A1, Bacillus' Saccharis M168 strain, Corynebacterium 'daltamicum, Eschilichia. Is illustrated.
  • the gene involved in DOI synthesis from D-glucose is not particularly limited, and in general, the btrC gene encoding the 42 kDa subunit of DOI synthetase derived from Bacillus circulans can be used.
  • Japanese Patent No. 3122762 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-236881
  • a gene encoding an enzyme having DOI synthetase activity a gene derived from an organism other than Bacillus' circulans can also be used.
  • the base sequence of the above gene is a gene that synthesizes the enzyme having DOI synthetase activity of the present invention, a mutation such as deletion, substitution, or insertion may occur in the base sequence of the gene .
  • a DNA sequence such as a promoter or UAS (a sequence involved in transcription activity) is linked to the 5 'upstream of the gene. It is necessary to connect the DNA sequences of poly A addition signal, terminator 1 and so on.
  • These DNA sequences may be any sequences that function in E. coli.
  • IPTG Isopropyl galactopyranoside isopronvl-thio- galactooyranoside
  • inducers are commonly used.
  • an expression system that provides high expression of a target gene without using an expensive inducer such as IPTG.
  • an expensive inducer such as IPTG.
  • P Expression System Invitrogen
  • the expression of the gene integrated on the vector is controlled by the promoter which provides constitutively strong expression derived from ⁇ phage, and is controlled by the promoter, and the concentration of tributophan in the medium Control expression by
  • the complete medium usually used for culturing E. coli contains tributophane in an amount sufficient to induce promoter activity, and it is not necessary to separately carry tributophane for induction of expression. That is, high expression of the target gene is possible without using an expensive inducer.
  • the above promoter, terminator 1 functions in the organism used for the synthesis of DOI.
  • Gene disruption was carried out using Gene Bridges' Quick and Easy BAC Modification Kit V, based on the method described in the attached manual.
  • PCR used to generate a cassette used for single disruption of the pgi gene The sequences of the primer set are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the sequences of the PCR primer set used for amplification of the cassette used for single disruption of the zwf gene are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • a sequence of PCR primers used to amplify a cassette for disrupting pgi gene is compared with a single disruptant strain of zwf gene as SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8.
  • pSClOl-BAD-gbaA-tetra a vector encoding enzymes that promote homologous recombination in E. coli, attached to the Kit, was introduced into a host E. coli strain (GI 724).
  • the strain was precultured overnight in LB medium supplemented with 8 g Zml of tetracycline.
  • the precultured cells were inoculated at a concentration of 1% in LB medium supplemented with 8 g Z ml of tetracycline, and cultured at 30 ° C. to an OD of 0.2. At that time, arabinose was added at a final concentration of 1.5%, and further incubation was performed at 37 ° C.
  • the target gene disrupted strain (pgi gene disrupted strain, zwf gene disrupted strain and pgi, zwf) is selected by selecting transformants in LB medium at 37 ° C. containing chloramphetol or neomycin or both. A double gene disruption strain was obtained.
  • the pgi disrupted strain is able to utilize D-glucose as a carbon source.
  • the growth rate with D-glucose is significantly slower than that of the wild-type strain, and it is thought that consumption of D-glucose by cells is suppressed.
  • the pgiZzwf double gene disruption strain can not grow using D-glucose as a single carbon source, it was considered that the degradation of glucose-6-phosphate was almost completely suppressed. From this, it can be expected that the use of these disrupted strains will increase the DOI production and DOI conversion efficiency more than the wild type strains.
  • double-destructed strains can be improved in growth by supplementarily adding non-fermentable carbon sources such as man-tall and darconate.
  • DOI is collected from the culture supernatant obtained by culturing the transformant of the present invention.
  • DOI by culturing the transformant of the present invention can be carried out as follows.
  • a carbon source used for culture any source can be used as long as it can be assimilated by E. coli, and D-glucose is further added.
  • an inducer may be added as appropriate.
  • P Expression System Invitrogen
  • expensive inducers can not be used.
  • the culture temperature is more preferably 20 ° C. to 37 ° C., as long as the growth temperature of the bacterium is reached.
  • the culture time is not particularly limited, but may be about 1 to 7 days. Thereafter, the obtained culture supernatant fluid force also recovers the DOI.
  • monosaccharides derived from D-glucose monosaccharides such as glycerin or oligosaccharides, or polysaccharides such as carbohydrates (starch, rice bran, waste molasses, etc.) can be used.
  • nitrogen sources include salt ammonium, casamino acids, peptone, yeast extract and the like.
  • inorganic salts include sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, sodium chloride and the like.
  • the following methods can be used, for example, as a method for recovering the culture solution of DOI.
  • the culture solution is subjected to centrifugation, filtration or the like to remove the cells to obtain a culture supernatant.
  • the culture supernatant is further subjected to a filtration treatment, and solid substances such as cells are
  • the filtrate is added to the ion exchange resin and eluted with distilled water.
  • the fraction containing no impurities while measuring the refractive index, pH, and conductivity can be fractionated, the solvent of the aqueous solution can be removed, and the DOI can be recovered.
  • the obtained DOI is analyzed, for example, by high performance liquid chromatography or nuclear magnetic resonance.
  • the DOI synthesis method of the present invention is configured as described above, and therefore DOI can be synthesized from D-glucose via hexokinase and DOI synthetase in high yield. Also, as shown in FIG. 1, D-glucose glucose 6-phosphate is obtained by the method of preparing A pgi ZGI 724 or A pgi A zw f Z G I 24 transformed strain etc. carrying plasmid pLEX-btrC described above, and culturing it. Through the five-step reaction catalyzed by DOI synthetase, DOI is produced.
  • Impurities to be removed which are contained in the culture solution in which the culture has been completed include glucose as a residual carbon source, various amino acids or peptides, and various metal ions.
  • the examination of culture conditions made it possible to continue the culture until glucose was completely consumed, and the remaining impurities became various amino acids or peptides, and various metal ions.
  • amino acids there are basic amino acids having a plurality of amino groups such as lysine, histidine and tryptophan, and acidic amino acids having a plurality of carboxyl groups such as glutamic acid asparasitic acid.
  • metal ions are naturally cations, but at the same time chloride ions and sulfate ions as counter ions are also present in the medium. Therefore, it is sufficient to search for a base material that completely adsorbs such impurities and that does not adsorb DOI.
  • ion exchange resins that are widely used, for example, sodium ion type or hydrogen ion type strongly acidic cation exchange DOI can not be purified with high yield by the method that uses salt and chloride ion type or hydroxide ion type basic anion exchange resin. That is, even if a two-bed column in which each is connected or a mixed bed column in which both are mixed, The result could not be achieved. Amino acids bind to either of two ion exchange resins.
  • the inventors of the present invention conducted extensive research on the base material and the purification conditions, and as a result, a method using an organic acid ion as a counter ion of anion exchange resin, ie, an organic acid ion type anion exchange resin It has been found that DOI can be efficiently purified by using a mixed bed column using a hydrogen ion type cation exchange resin.
  • organic acids that can be used include acetic acid, propionic acid and oxalic acid, acetic acid is preferably used. This invention was completed only after the discovery that DOI is stable only under weakly acidic conditions of pH 3 to 5, which is extremely easy to be decomposed in an alkaline region of pH 8 or more.
  • the culture solution is flowed through a two-bed column in which the commonly used anion exchange resin and cation exchange resin are concentrated on separate columns. But it would have been possible to remove the above mentioned impurities. In addition, if it has the same stability as fructose in both regions, purification with mixed bed column would be possible.
  • the inventors of the present invention are the first to find that DOI is unstable in the alkaline region to such an extent that decomposition occurs even if a dual bed column as well as a mixed bed column is used.
  • the inventors of the present invention have found a method of using an organic acid ion as a counter ion of the anion exchange resin as a result of examining the selection of the counter ion to be bound to the ion exchange resin to be used.
  • the organic acid remains in the eluate and is mixed in the eluted fraction of DOI, which is effective for keeping the eluate at around pH 4.
  • acetic acid has an advantage that it can be removed by concentration.
  • H + type cation exchange resin and organic acid ion type anion exchange resin are mixed.
  • the culture solution By passing the culture solution through the mixed bed ion exchange column prepared in combination, it became clear that the DOI can be purified, and the present invention was completed. This is a method that is well suited to industrial mass production.
  • a btrC gene encoding a 42 kDa subunit of 2 deoxyinolinose (DOI) synthetase derived from Bacillus circulans
  • the plasmid pDS4 (Kudo, F., et al. J. Antibiot., vol. 52 559-571 (1999)) containing the full-length btrC gene is designated as primer 1 and primer 1 shown in FIG.
  • the PCR conditions for PCR are as follows: 94 ° CX 30 seconds, 52 ° CX 30 seconds, 68 ° CX 1 minute, using the primers shown in 2 for PCR amplification of the btrC gene using KOD polymerase (TOYOBO) , Went 30 cycles.
  • PLEX-btrC was constructed by inserting the PCR amplified DNA fragment digested with Ndel and Xbal into the Ndel-Xbal site of the multicloning site of vector pLEX (Invitrogen) (Fig. 2).
  • a strain of GI724ZpLEX-btrC is obtained by transforming a host E. coli strain (GI724) with pLE X-btrC according to the protocol described in the attached instruction of Kit of Gene Bridges, and selecting on a medium containing ampicillin.
  • pLEX-btrC is transformed to GI724 A pgi, GI 724 A z wf, and GI 724 A pgi A z wf gene-disrupted strains, respectively, and GI 724 A pgi / p LEX-btr C strain, GI 724 A zwf / p LEX — BtrC strain, GI724 A pgi ⁇ zwf ZpLEX-btrC strain was obtained respectively.
  • Lane 1 is molecular weight marker
  • lane 2 is GI724 strain containing pLEX-btrC in an induction medium supplemented with tryptophan
  • lane 3 is an extract of cultured cells
  • lane 3 is a culture without Tributophane!
  • Culture in 2XYT medium The extract of the cultured cells
  • lane 4 is an extract of the cells cultured in 2 XYT medium supplemented with tryptophan.
  • GI724 ⁇ pgi / pLEX ⁇ btrC strain was placed in a 300 ml Erlenmeyer flask with 35 ml of pre-culture solution (RMG medium, 6% sodium hydrogen phosphate, 3% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% sodium chloride, 1 % Ammonium chloride, 2% casamino acid, 1% glycerol, ImM magnesium chloride) and cultured for 15 hours. Subsequently, cells were inoculated at a concentration of 1% in a 10 liter culture tank containing 3 liters of 2XYT medium.
  • RMG medium 6% sodium hydrogen phosphate, 3% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% sodium chloride, 1 % Ammonium chloride, 2% casamino acid, 1% glycerol, ImM magnesium chloride
  • Oxidized D OI is dissolved in an appropriate amount of methanol, and a portion thereof is analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography) analysis to obtain DOI Detection and quantification were performed.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • SHIMADZU LC-10AT and a column, Phronomenex Luna 5u C18 (column length 150 mm, column internal diameter 4.6 mm) were used, and 20% methanol was used as an eluent. UV absorption at 262 nm was measured.
  • the amount of DO-O- (4-trobenzyl) oxide derivative was quantified by standard curve method.
  • FIG. 4 in the HPLC analysis, a peak corresponding to an Oxime of DOI was confirmed. Also, Figure 5 shows DOI production, turbidity of culture medium, and time course of D glucose concentration.
  • GIMGlApgiAzwf ZpLEX-btrC strain in 35 ml of 1% methanol-RMG medium (6% sodium hydrogen phosphate, 3% potassium dihydrogen phosphate, 0.5% sodium chloride, 1% sodium ammonium salt-1% sodium chloride)
  • the cells were inoculated into Umm, 2% casamino acid, 1% glycerol, ImM magnesium chloride) and precultured for 1 cell. Then, the cells are inoculated at a concentration of 1% in 2XYT medium (in a 10L culture tank) containing 3L of 3% man-torl, and the agitation speed is 300rpm, air 10L Zm, pH 7. 7 at 30 ° C.
  • the culture was carried out under the following conditions, and when the OD of 600 nm was 0.7, 3% glucose was added and culture was continued. At each culture time, cells were removed by centrifugation and the glucose concentration and DOI amount of the culture supernatant were analyzed. The measurement of the DOI production amount was performed in the same manner as in Example 6.
  • Figure 6 shows the time course of DOI production, turbidity of culture medium, and glucose concentration.
  • the culture temperature is 30 ° C.
  • agitation speed is 300 rpm
  • air is 10 LZm
  • pH 7.7 pH 7.7
  • D-glucose is added at 2% or 5% concentration for further 24 hours Culture was performed.
  • the culture broth was centrifuged to remove the cells, and the culture supernatant was collected.
  • the quantification of DOI accumulated in the culture supernatant was performed according to the following procedure. At each time, the culture fluid is collected and equal to the supernatant fluid H 2 O, twice the volume of the supernatant fluid methanol, and
  • Oxidization of DOI was induced by mixing with a final concentration of 1.5 mg Z-ml O- (4-) open-ended benzyl) hydroxylamine (NBHA) and incubating at 60 ° C. for 1 hour. After evaporation of the solvent by Speep Vac System (Thermo ISS 110), the oximized DOI is dissolved in an appropriate amount of methanol, and a portion thereof is analyzed by HPLC (high performance liquid chromatography) analysis to obtain DOI. Detection and quantification.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the fractions were divided into 4 blocks, collected and lyophilized, and the purity and amount of DOI in each block were measured. The results are shown in Table 2.
  • the C-13 NMR ⁇ vector of the resulting purified DOI is shown in FIG.
  • the C-13 NMR spectrum was measured using a Bruker DPX-250 NMR apparatus (C-13 nucleus is resonant at 67.5 MHz) for a sample dissolved in heavy water.
  • the designation of the deposited microorganism used in the present invention is as follows.
  • production of various carbon six-membered cyclic compounds is carried out by fermentation using biomass-derived raw materials such as starch, which are renewable resources, in place of conventional petroleum-derived chemicals. It has become possible to produce high purity DOI, which is the starting material for

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　宿主細胞としての大腸菌に、２－デオキシ－シロ－イノソースの合成に関与する遺伝子からなる遺伝子発現カセットを少なくとも１種類導入して形質転換体を調製し、この形質転換体を用いて、Ｄ－グルコース、オリゴ糖、多糖、でんぷんまたは米ぬかから２－デオキシ－シロ－イノソースを合成する。この２－デオキシ－シロ－イノソースを含有する培養液を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂からなる混合ベッド型カラムで処理する。

Description

明 細 書
大腸菌変異株による 2_デォキシ—シロ—イノソースの合成および精製す る方法並びに得られた 2—デォキシ一シロ一イノソース
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子発現カセット、形質転換体、大腸菌変異株による 2—デォキシー シローイノソースの合成方法、この方法により合成された 2—デォキシーシローイノソ ースを培養液中から精製して回収する方法、およびこの方法により得られた 2—デォ キシ一シロ一イノソースに関する。
背景技術
[0002] 炭素 6員環化合物は従来石油化学の分野において、石油を原料として生産されて きた。
一方、ブチロシン生産菌バチルス ·サーキュランス (Bacillus circulans)にお!/、て 、グルコース— 6—リン酸 (G— 6— P)を基質として、炭素 6員環化合物である 2—デ ォキシーシローイノソース（以下、 DOIともいう）を合成する反応を触媒する、 DOI合 成酵素が見いだされた (図 1、特許文献 1)。
[0003] DOI合成酵素は 2—デォキシストレプタミンをァグリコンとして含有するアミノグリコシ ド抗生物質の生合成に関与する酵素であり、その生成物である DOIは、医薬原料や 化学工業資源として有用な物質である。 DOIをィ匕学的に合成する方法は多段階の 反応と有害又は高価な金属を使用するのに対し、 DOI合成酵素を用いれば、効率 的に短工程で DOIを生産することができる。これまでに、 DOI合成酵素を大腸菌に 発現させることによって得られる組み換え DOI合成酵素を用いて、グルコース— 6— リン酸力も短工程で DOIを生産する方法が確立されている（特許文献 1)。
[0004] し力しながら、 DOI合成酵素を組み込んだ大腸菌を用いた、バイオマス由来の D— グルコースを原料とする、発酵による DOIの合成方法は課題として提起されて 、なか つた o
さらに、 2—デォキシ一シ口一イノソース（DOI)は、グルコースに 2—デォキシ一シ ローイノソース合成酵素とへキソキナーゼを、またはグルコースー6—リン酸に 2—デ ォキシーシローイノソース合成酵素作用させることにより一段階の酵素反応で合成で きることが知られている (特許文献 1、非特許文献 1)。また、酵素反応液を濃縮して酢 酸溶液としョゥ化水素を作用させることにより、 DOIを精製することなくカテコールに 変換できることも報告されて ヽる (特許文献 1)。
[0005] 現在までに、酵素反応により DOIを合成して、反応組成物のままの DOIを変換する ことは報告されて 、るが、 DOIそのものを精製 ·単離する方法は未だ報告されて 、な い。更に、酵素反応液中より多種多量の培地成分、炭素源であるグルコースの他、 ペプトンなどに由来するアミノ酸類ある 、は各種の金属イオン類が含まれて 、る本発 明の微生物培養液中から DOIを精製することに関する情報は全く無い。すなわち、 酵素反応液および微生物培養液から DOIを精製する報告はなぐ況ゃ工業的に応 用可能な精製方法にっ 、ては全く確立されて 、な 、のが現状である。
[0006] 培養液中力 DOIを精製するには、実験室的には HPLCによる分取あるいは活性 炭カラムクロマトグラフィーによる方法が知られている。しかし、 HPLCによる分取がェ 業的生産には適さないことはいうまでもない。また活性炭カラムによる方法では、培地 中の有機化合物をいちど活性炭に吸着させた後、アルコールなどの有機溶媒の濃 度を変化させながら、吸着力の差を利用して順次溶出させることになる。したがって 大量の DOIを生産する場合、培地中の大部分の有機化合物を吸着させるだけの量 の活性炭が必要となり、この方法も大量精製には不向きである。そのようなことから、 これまでは工業的方法で DOIを精製する適切な方法は確立されていな力つた。 特許文献 1 :日本国特許第 3122762号:特開 2000— 236881号公報
非特許文献 1 :K. Kakinuma, E. Nango, F. Kudo, Y. Matsushima , and T. Eguchi, Tetrahedron Letters, 41, 1935— 1938 (2000) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] DOI合成酵素の特性を考えると、当該酵素を他の微生物に導入する事により、豊 富に存在するノィォマス由来の D—ダルコースを原料として、有用資源である DOIを 効率的に、短工程で生産できる可能性がある。
[0008] そこで本発明者らは、 DOIの新規な合成方法として、大腸菌を宿主細胞として DOI を発酵法により簡便安価な方法で生産する方法を開発するために鋭意検討を行った 工業的方法で DOIを精製するには、例えば培養液をカラムの上部力も流すと、下 部から精製された DOIが流出してくるような原理に基づく方法が好ましい。すなわち 本発明の課題は、 DOI以外の物質を吸着して、且つ DOIは吸着されずに最初に流 出してくるようなカラム基材を探索することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、宿主細胞としての大 腸菌に、 DOI合成酵素をコードする btrC遺伝子を導入し、高発現させることにより、 DOIを合成すればよいことを見出し、本発明を完成させるに至った。
[0010] 従って、本発明は、 2—デォキシ一シ口一イノソース（DOI)の合成に関与する遺伝 子カゝらなることを特徴とする遺伝子発現カセットである。
[0011] また、本発明は、宿主細胞としての大腸菌種または GILSP遺伝子組み換え微生物 リストに記載されている宿主細胞（平成 16年 10月現在のもの、バシラス'アミ口リケフ ァシエンス、バシラス.ブレビス HPD31、バシラス'ブレビス HPD31— M3、バシラ ス 'リシェ-フオルミス DN2461、バシラス'リシェ-フオルミス DN2717、ノ シラス' サチリス K2A1、バシラス'サチリス M168由来株、コリネバタテリゥム 'グルタミカム 、ェシエリキア.コリ K12由来株、ゲォバシラス'ステアロサーモフィラス）に、上記の 2 —デォキシ一シロ一イノソースの合成に関与する遺伝子力 なる遺伝子発現カセット を少なくとも 1種類導入してなることを特徴とする形質転換体である。
[0012] また、本発明において、 DOI生産のための直接の基質となるグルコース一 6—リン 酸の菌による分解代謝を抑制し、 DOI生産能を高めるために、グルコースー6—リン 酸の代謝に関わる酵素である、ホスホダルコースイソメラーゼ及びダルコネートデヒド ロゲナーゼをコードする遺伝子 (それぞれ、 pgi遺伝子および zwf遺伝子）をそれぞれ 単独で破壊した株、またはその両者を同時に遺伝子破壊した株を用いる。
[0013] 従って、本発明は、ホスホダルコースイソメラーゼをコードする pgi遺伝子、および、 ダルコネートデヒドロゲナーゼをコードする zwf遺伝子がそれぞれ単独で遺伝子破壊 された上記の宿主細胞、またはその両者が遺伝子破壊された上記の宿主細胞に、 上記の 2—デォキシ一シ口一イノソース（DOI)の合成に関与する遺伝子力 なる遺 伝子発現カセットを少なくとも 1種類導入してなることを特徴とする形質転換体である 。この導入は、 2—デォキシ一シ口一イノソースの合成効率を高めるために行う。
[0014] 本発明は、炭素源から 2 デォキシーシローイノソースを合成する方法において、 上記の形質転換体を用 、ることを特徴とする 2—デォキシ シロ一イノソースの合成 方法である。
[0015] さらにまた、本発明は、前記炭素源が D グルコース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、 米ぬかの 、ずれ力から選択される上記の 2—デォキシ シローイノソースの合成方 法である。
さらに本発明は、上記の方法により合成してなることを特徴と DOIである。
[0016] さらにまた本発明は、上記の合成方法により得られ、かつ、 2 デォキシーシローイ ノソースを含有する培養液を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン 型塩基性陰イオン交換樹脂からなる混合ベッド型カラムで処理することを特徴とする る 2—デォキシ シロ イノソースの精製法である。好ましくは前記有機酸イオン型塩 基性陰イオン交換樹脂が酢酸イオン型である。また、本発明は精製された DOIであ る。
発明の効果
[0017] 医薬品原料やィ匕学工業原料として重要な炭素 6員環化合物は、これまで、石油を 原料とする石油化学によって製造されていた。し力しながら、本発明の技術を用いる ことにより、再生可能な植物資源 (バイオマス）由来の D グルコースを原料として炭 素 6員環化合物である 2 デォキシ シローイノソース (DOI)を細菌により合成する ことが可能となった。また、培養液を処理して、精製された DOIを回収することができ る。
図面の簡単な説明
[0018] [図 1]D—グルコース力も DOIが生成する反応経路及び DOI合成酵素が触媒する反 応を示す図である。
[図 2]pLEX— btrCの構造を示す図である。
[図 3]pLEX—btrCを含む大腸菌 GI724 A pgi株を 2XYT培地、または米ぬか培地 で各時間培養したときの菌体抽出物の SDS— PAGEパターンを示す図である。
[図 4]pLEX— btrCを含む大腸菌 GI724 A pgi株の培養（2XYT 3L、 30°C、 pH7. 5、 5%D—グルコース、培養 24時間）上清のォキシム化反応物の HPLCチャートで ある。
[図 5]pLEX—btrCを含む大腸菌 GI724Apgi株の培養 (2XYT+ 2%グルコース（ ♦)、または、 2XYT+ 5%D グルコース（國）、 3Lゝ 30°C、 pH7. 5、 )に伴う（A)培 地の濁度、（B) D—グルコース濃度、及び (C) DOI生産量のタイムコース (横軸は、 グルコース添加後の経過時間）を示す図である。
[図 6]pLEX—btrCを含む大腸菌 GI724ApgiAzwf株の培養 (2XYT+ 3%マン- トール + 5%D グルコース、 3L、 30°C、 pH7. 5、）に伴う（A)培地の濁度、（B) D —グルコース濃度、及び (C) DOI生産量のタイムコース (横軸は、グルコース添加後 の経過時間）を示す図である。
[図 7]実施例 8の方法で培養液をイオン交換樹脂に流して得られたフラクションの pH 、伝導度、 DOI濃度をプロットした図である。
[図 8]実施例 8の方法で精製して得られた DOIの C— 13NMR ^ベクトルである。
[図 9]実施例 9の方法で培養液をイオン交換樹脂に流して得られたフラクションの pH 、伝導度、 DOI濃度をプロットした図である。
[図 10]実施例 9の方法で精製して得られた DOIの C— 13NMR ^ベクトルである。 発明を実施するための最良の形態
[0019] [宿主細胞]
使用する菌の種類には特に制限はなぐ菌株の寄託機関 (例えば IFO、 ATCC等) に寄託されて 、る菌を使用することができる。
[0020] ある好ましい態様では、宿主細胞が保有する、グルコース 6 リン酸の代謝に関 わる酵素である、ホスホダルコースイソメラーゼ及びダルコネートデヒドロゲナーゼをコ ードする遺伝子 (それぞれ、 pgi遺伝子および zwf遺伝子）がそれぞれ単独で遺伝子 破壊されているカゝ、または両者が二重に遺伝子破壊されている。これによつて、 DOI 生産のための直接の基質となるグルコース 6—リン酸の菌による分解代謝が抑制さ れ、 DOI生産能が高まるだろう。 [0021] 本発明では大腸菌を宿主細胞として取り上げる。次に、大腸菌以外の宿主細胞とし て、 GILSP遺伝子組み換え微生物リストに記載されている宿主細胞（平成 16年 10 月現在のもの、バシラス'アミロリケファシエンス、バシラス'ブレビス HPD31、バシラ ス 'ブレビス HPD31— M3、バシラス'リシェ-フオルミス DN2461、バシラス'リシ ェニフォノレミス DN2717、バシラス 'サチリス K2A1、バシラス 'サチリス M168由 来株、コリネバタテリゥム 'ダルタミカム、ェシエリキア.コリ K12由来株、ゲォバシラス 'ステアロサーモフィラス）が例示される。
[0022] [DOI合成酵素をコードする遺伝子]
D—グルコースからの DOI合成に関与する遺伝子としては特に限定されず、通常、 バチルス ·サーキュランス (Bacillus circulans)由来の DOI合成酵素の 42kDaサブ ユニットをコードする btrC遺伝子を用いることができる。
(日本国特許第 3122762号：特開 2000— 236881号公報）
(Genbank AB066276)
(非特許文献 l :Kudo, F. , et al. J. Antibiot. , vol. 52 559— 571 (1999) )
DOI合成酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子であればバチルス'サーキユラ ンス以外の生物に由来する遺伝子も利用できる。また、上記遺伝子の塩基配列は、 本発明の DOIの合成酵素活性を有する酵素を合成する遺伝子であれば、その遺伝 子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていてもよい。
[0023] [遺伝子発現カセットの構築]
大腸菌を宿主細胞とするタンパク質の大量発現系においては、当該遺伝子の 5'上 流にプロモーター、 UAS (転写活性ィ匕に関与する配列）等の DNA配列の連結、当 該遺伝子の 3'下流にポリ A付加シグナル、ターミネータ一等の DNA配列の連結が 必要である。これらの DNA配列は大腸菌内で機能する配列であればどのような配列 でもよい。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあ る。いずれのプロモーターを用いてもよぐ好ましくは発現の制御が可能なものである 。また、大腸菌を宿主とする遺伝子発現においては、通常、 IPTG (イソプロピルーチ オーガラクトピラノシド isopronvl— thio— galactooyranoside)をはじめとする比較 的コストの高 、誘導物質が一般的に用いられる。
[0024] 本発明では、 IPTGのような高価な誘導物質を用いずに目的遺伝子の高発現をも たらす発現系を用いることが望ましい。そのための宿主'ベクター系としては、例えば 、 P Expression System (Invitrogen)を禾 lj用することができる。
L
この系では、ベクター (pLEX、アンピシリン耐性マーカー）上に組み込んだ遺伝子 の発現は、 λファージ由来の、構成的に強力な発現をもたらすプロモーターである Ρ プロモーターによる制御を受け、また培地中のトリブトファン濃度によって発現制御 し
を受け、トリブトファン濃度の高い培地で発現が誘導される仕組みになっている。
[0025] 一方、大腸菌の培養に通常用いる完全培地にはプロモーター活性を誘導するのに 十分な量のトリブトファンがあり、発現誘導のためにトリブトファンを別途カ卩える必要は ない。すなわち、高価な誘導物質を用いずに、目的遺伝子の高発現が可能である。 また、本発明の形質転換体においては、上記プロモーター、ターミネータ一は、 DO Iの合成に使用する生物において機能するものとする。
以下、本発明の形質転換体に用いられる遺伝子発現カセット構築の例を示す。
[0026] [グルコース 6 リン酸の分解に関与する遺伝子の破壊株の作製]
DOIを可能な限り高収率で合成するためには、菌体による D グルコースの異化 代謝をできる限り抑制する必要があると考えられる。大腸菌において、 D ダルコ一 スの異化代謝に関わる酵素をコードする遺伝子としては、解糖系においてグルコース - 6—リン酸からフルクトース 6—リン酸への変換に関わるホスホグルコース 'イソメ フーセ (phosphoglucose isomerase) コードする (pgi)遺 1zS子と、ペントースリン 酸経路にぉ 、て、グルコース 6—リン酸からホスホダルコノラタトンへの変換に関与 する酵素グノレコネート'デヒドロゲナーゼ (gluconate dehydrogenase)をコードす る zwf遺伝子の 2種が存在する。これらの遺伝子を破壊することによって、 DOI合成 酵素の基質となるグルコース 6—リン酸の、菌体の増殖に伴う異化分解を抑制する ことが可能であると考えられる。
[0027] そこで、これらの遺伝子の破壊を行った。遺伝子破壊は、 Gene Bridges社の Qui ck and Easy BAC Modification Kitを用い、その添付説明書の方法に基づ V、て行った。 pgi遺伝子の単独破壊に用いるカセットの作製のために使用した PCR プライマーセットの配列を配列番号 3と配列番号 4に示す。 zwf遺伝子の単独破壊に 用いるカセットの増幅に用いた PCRプライマーセットの配列を配列番号 5と配列番号 6に示す。 pgi遺伝子と zwf遺伝子の二重破壊株を得るために、 zwf遺伝子の単独破 壊株に対し、 pgi遺伝子を破壊するためのカセットを増幅するために用いた PCRブラ イマ一セットの配列を配列番号 7と配列番号 8に配列示す。
[0028] Kitに添付されている、大腸菌内での相同組み替えを促進する酵素群をコードする ベクター、 pSClOl— BAD— gbaA— tetraをホスト大腸菌株（GI724)に導入した。 その株を 8 gZmlのテトラサイクリンを添加した LB培地で一夜前培養を行った。前 培養菌体を、 8 gZmlのテトラサイクリンを添加した LB培地に 1%濃度植菌し、 30 °Cで O. D = 0. 2まで培養した。その時点で、ァラビノースを終濃度 1. 5%添加し、さ らに 37°Cで 1時間培養することにより、相同組み換えの促進に関与する酵素群を誘 導発現した。さらに遺伝子破壊用カセットをそれぞれ形質転換し、ターゲット遺伝子 の遺伝子破壊を誘導した。形質転換体を、クロラムフエ-コール、またはネオマイシン 、またはその両者を含有する、 37°Cの LB培地で選択することにより、目的の遺伝子 破壊株 (pgi遺伝子破壊株、 zwf遺伝子破壊株及び pgi,zwf二重遺伝子破壊株）を 得た。
[0029] 野生型株及び各遺伝子破壊株の各種単一炭素源での生育レベルを表 1に示す。
pgi破壊株は、 D—グルコースを炭素源として利用できる力 D—グルコースによる 生育速度は野生型株よりも顕著に遅くなつており、菌体による D—グルコースの消費 が抑えられていると考えられた。また、 pgiZzwf二重遺伝子破壊株は D—グルコース を単一炭素源として生育できな 、ことから、グルコース― 6—リン酸の分解はほぼ完 全に抑制されていると考えられた。このことから、これらの破壊株を用いることで、野生 型株よりも DOI生産量、及び DOI変換効率が高まることが期待できる。また、二重破 壊株はマン-トールやダルコネートなどの非発酵性炭素源を補助的に加えることで、 生育を改善させることが可能である。
[0030] [表 1] 各炭素源を 1 %含む M 9最小培地で各 ffi株を 2 7時間培養した 牛育度合い
Figure imgf000011_0001
[0031] [DOIの合成方法]
本発明の DOIの合成方法では、本発明の形質転換体を培養して得られる培養上 清から、 DOIを採取することとする。
本発明の形質転換体を培養することによる DOIの製造は、次のようにして行うことが できる。培養に用いる炭素源としては、大腸菌が資化できるものであればどのようなも のでもよく、さらに D—グルコースを添加する。また、プロモーターの発現が誘導型で ある場合には、適時誘導物質を添加すればよい。前述のように、宿主'ベクター系と して P Expression System(Invitrogen)を用いると、高価な誘導物質を用いな
L
くてもよい。炭素源以外の栄養源としては、窒素源、無機塩類、その他有機栄養源を 含む培地を使用できる。培養温度はその菌の生育可能な温度であればよぐ 20°C乃 至 37°Cがより好ましい。培養時間には特に制限はないが、 1日乃至 7日程度でよい。 その後、得られた培養上清液力も DOIを回収する。
[0032] 炭素源としては、 D—グルコース、グリセリンなどの単糖類もしくはオリゴ糖類または 炭水化物 (でんぷん、米ぬか、廃糖蜜など)の多糖類に由来する単糖類を用いること ができる。
窒素源としては、例えば、塩ィ匕アンモ-ゥム、カザミノ酸、ペプトン、酵母エキスなど が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素力リウ ム、塩化マグネシウム、塩ィ匕ナトリウムなどが挙げられる。
[0033] 本発明において、 DOIの培養液力もの回収法としては、例えば、次のような方法が 使用できる。培養終了後、培養液を遠心分離器や濾過装置などで菌体を除き、培養 上清液を得る。この培養上清液に対してさらに濾過処理を行い、菌体等の固形物を 除き、その濾液をイオン交換樹脂に添加し、蒸留水で溶出を行う。屈折率、 pH、伝 導率を測定しながら不純物を含まな 、フラクションを分取して、その水溶液の溶媒を 取り除いて DOIを回収することができる。得られた DOIの分析は、例えば、高速液体 クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。
[0034] 本発明の DOIの合成方法は、上述のような構成からなるので、 D グルコースから へキソキナーゼ（hexokinase)と DOI合成酵素を介すことで DOIを高収率で合成で きる。また、上述したプラスミド pLEX— btrCを有する A pgiZGI724形質転^ ¾や A pgi A zwfZGI724形質転換株等を作製し、培養する方法により、図 1に示すよう に、 D グルコース力 グルコース 6—リン酸を経て、更に DOI合成酵素が触媒する 5段階の反応を経て、 DOIが生産される。
[0035] D—グルコースからグルコースー6 リン酸への変換は、菌体が保有するへキソキ ナーゼによって触媒される。グルコース 6—リン酸から DOIへの変換をもたらす多 段階の反応は、菌体に導入した DOI合成酵素によって触媒される。
培養が終了した培養液中に含まれる除去すべき不純物としては、残存している炭 素源としてのグルコース、各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各種の金属イオン 類がある。このうち培養条件の検討により、グルコースが完全に消費されるまで培養 を続けることが可能になり、残る不純物は各種アミノ酸あるいはペプチド類、および各 種の金属イオン類となった。アミノ酸類の中には、リジンやヒスチジン、トリプトファンの ようにァミノ基が複数個ある塩基性アミノ酸もあれば、グルタミン酸ゃァスパラギン酸の ようにカルボキシル基を複数個持っている酸性アミノ酸も存在する。また、金属イオン は当然カチオンであるが、同時にそのカウンターイオンとしての塩素イオンや硫酸ィ オンなども培地中には存在している。したがって、そのような不純物をすベて吸着さ せて、かつ、 DOIを吸着させない基材を探索すればよいことになる。
[0036] 本発明者らは、そのような考えに基づいて基材の探索と溶出条件を検討した結果、 汎用されるイオン交換榭脂、例えば、ナトリウムイオン型または水素イオン型強酸性 陽イオン交換榭脂および塩素イオン型または水酸イオン型塩基性陰イオン交換榭脂 を用いる方法では DOIを収率よく精製することはできな力つた。すなわち、それぞれ を連結した二床式カラム、または両者を混合した混合ベッド型のカラムを用いても、そ の目的を達成することはできない結果となった。アミノ酸は 2種類のイオン交換樹脂の どちらかに結合する。また金属イオンは陽イオン交換樹脂に結合するのに対し、 DOI はイオン性の官能基を持たな 、ために、 V、ずれのイオン交換榭脂にも結合しな!ヽ特 性を持っている。従って、アミノ酸類および金属塩類はイオン交換樹脂に結合し、 D OIのみが吸着せずに溶離してくると推察されるが、結果は異なっていた。 DOIの回 収率は 50%以下となり、かつイオン交換樹脂の使用条件により大きく変動した。大量 処理する工業的方法に適合するためには、回収率がより高く加えて安定した成績が 必要とされる。
[0037] 本発明者らは、基材と精製条件を更に拡大して鋭意検討した結果、陰イオン交換 榭脂のカウンターイオンとして有機酸イオンを用いる方法、すなわち有機酸イオン型 陰イオン交換樹脂と水素イオン型陽イオン交換榭脂を用いた混合ベッド型カラムを 用いることにより、 DOIを効率よく精製できることを見いだした。有機酸としては、酢酸 、プロピオン酸、シユウ酸などが挙げられる力 中でも酢酸が好ましく使用できる。この 発明は DOIが pH8以上のアルカリ性領域で極めて分解し易ぐ pH3〜5の弱酸性条 件下でのみ安定であるという性質を発見して初めて完成することができたものである 。すなわち、 DOIが酸性とアルカリ性の両領域で完全に安定であれば、汎用されて いる陰イオン交換樹脂と陽イオン交換榭脂を別々のカラムに重点した二床式カラム に培養液を流すという方法でも上記の不純物を除くことができたであろう。また、両領 域でフルクトースと同等の安定性を有して ヽれば、混合ベッド型カラムで精製が可能 となったであろう。 DOIが二床式カラムはもちろん、混合ベッド型カラムを使用しても 分解が起こるほどアルカリ領域で不安定であることを見いだしたのは本発明者らが初 めてである。
[0038] この問題を解決するために、用いるイオン交換樹脂に結合するカウンターイオンの 選択を検討した結果、本発明者らは陰イオン交換樹脂のカウンターイオンとして有機 酸イオンを用いる方法を見いだした。これにより溶離液中には有機酸が残り、 DOIの 溶離画分にも混入するが、これは溶離液を pH4前後に保つのに有効である。有機酸 の中でも酢酸は濃縮により除去できる長所を有して 、る。
これにより、 H+型の陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型の陰イオン交換榭脂を混 合して作成した混合ベッド型イオン交換カラムに、培養液を通過させることにより、 D OIを精製できることが明らかになり、本発明が完成された。これは工業的大量生産に も十分叶う方法である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例 にその技術範囲が限定されるものではない。
実施例 1
[0039] DOI合成酵素遺伝子
糖質環化酵素遺伝子としては、バチルス ·サーキュランス (Bacillus circulans)由 来の、 2 デォキシ シローイノソース（DOI)合成酵素の 42kDaサブユニットをコー ドする btrC遺伝子
(特開 2000— 236881号公報、 Genbank AB066276、 (Ota, Y. , et al. J. Antibiot. , vol. 53, 1158— 1167 (2000) ) )
を利用する。
実施例 2
[0040] 組み換えプラスミド及び組み換え株の構築
btrC遺伝子全長を含むプラスミド pDS4 (Kudo, F. , et al. J. Antibiot. , vol. 52 559- 571 (1999) )を録型として酉己歹 lj番号 1に示すプライマー 1と酉己 列番号 2に示すプライマーを用い、 btrC遺伝子の PCR増幅には、 KODポリメラーゼ (TOYOBO)を用い、 PCRの反応条件は、 94°C X 30秒、 52°C X 30秒、 68°C X 1 分を 1サイクルとして、 30サイクル行った。 PCR増幅した DNA断片を Ndelと Xbalで 消化したものを、ベクター pLEX(Invitrogen)のマルチクロー-ングサイトの Ndel— Xbal部位に挿入することによって、 pLEX - btrCを構築した（図 2)。
実施例 3
[0041] Gene Bridges社の Kitの添付説明書に記載されているプロトコールに従って pLE X— btrCにより宿主大腸菌株 (GI724)を形質転換し、アンピシリンを含む培地で選 択することにより、 GI724ZpLEX— btrC株を得た。また、 GI724 A pgi、 GI724 A z wf、 GI724 A pgi A zwfの各遺伝子破壊株に対しても同様に pLEX—btrCを形質転 換し、 GI724 A pgi/pLEX— btrC株、 GI724 A zwf/pLEX— btrC株、 GI724 A pgi Δ zwfZpLEX— btrC株をそれぞれ得た。
実施例 4
[0042] DOI合成酵素の発現の確認
GI724 A pgiZpLEX— btrC株を誘導培地（6%リン酸水素ナトリウム、 3%リン酸 二水素カリウム、 0. 5%塩ィ匕ナトリウム、 1%塩ィ匕アンモ-ゥム、 0. 2%カザミノ酸、 0. 5%D—グルコース、 ImM塩化マグネシウム）にて、 30°Cで O. D=0. 7まで培養し た後、 2XYT培地 (大腸菌用完全培地、 1. 6%トリブトファン、 1%酵母エキス、 0. 5 %塩ィ匕ナトリウム）に移し、 37°Cでさらに 6時間培養した後、菌体を回収し、 btrCタン ノ ク質の発現を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動より確認した。その結果を図 3に 示す。 2XYT培地で 6時間培養することにより、 btrCが大量発現することが確認され た。レーン 1は分子量マーカー、レーン 2は pLEX—btrCを含む GI724株を、トリプト ファンを添加した誘導培地で、培養した菌体の抽出物、レーン 3はトリブトファンを添 加しな!ヽ 2XYT培地で培養した菌体の抽出物、レーン 4はトリプトファンを添カ卩した 2 XYT培地で培養した菌体の抽出物である。 2XYT培地を用いた場合、トリプトファン を添加しなくても btrCが高発現したことから、この発現系を用いることで、高価な誘導 物質を使わずに DOI合成酵素遺伝子の高発現が可能であることが示された。
実施例 5
[0043] (pLEX—btrCを含む GI724 Δ pgi株を用いた DOIの合成）
GI724 Δ pgi/pLEX— btrC株を 300ml三角フラスコに入れた 35mlの前培養液 ( RMG培地、 6%リン酸水素ナトリウム、 3%リン酸二水素カリウム、 0. 5%塩ィ匕ナトリウ ム、 1%塩化アンモ-ゥム、 2%カザミノ酸、 1%グリセリン、 ImM塩化マグネシウム）に 接種し、 15時間培養した。次いで、 3リットルの 2XYT培地を入れた 10リットル培養槽 に 1%の濃度で菌体を植菌した。これを培養温度 30°C、攪拌速度 300rpm、空気 10 L/m、 pH7. 7の条件で、 600 nmの O. D.が 0. 7になった時点で D—グルコース を 2%または 5%濃度添加し、さらに 24時間培養を行った。培養液を遠心分離して菌 体を除き、培養上清液を回収した。
実施例 6
[0044] (DOI生産量の測定） 培養上清中に蓄積する DOIの定量を以下に示す手順に従って行った。各時間に おいて、培養液を採取し、上清液と等量の H20、上清液の 2倍量のメタノール、及び 終濃度 1. 5 mgZmlの O— (4 -卜口ベンジル）ヒドロキシルァミン（NBHA)をカロ え混合し、 60°Cで 1時間インキュベートすることにより DOIのォキシム化を誘導した。 Speep Vac System (Thermo社 ISS 110)で溶媒を蒸発させた後、ォキシム化 D OIを適当量のメタノールに溶解し、その一部を HPLC (高速液体クロマトグラフィー） 分析法にて分析し、 DOIの検出及び定量を行った。高速液体クロマトグラフィーでは SHIMADZU社 LC— 10AT、カラムは Phrnomenex社 Luna 5u C18 (カラム長 150mm,カラム内径 4. 6mm)を用い、溶離液として 20%メタノールを用いた。 262 nmにおける紫外線吸収を測定した。 DOIの O—（4 -トロベンジル)ォキシム誘導 体の量を標準曲線法により定量した。
図 4に示すように、 HPLC分析においては、 DOIのォキシム体に相当するピークが 確認された。また、図 5に DOI生産量、培地の濁度、及び D グルコース濃度のタイ ムコースを示す。
実施例 7
[0045] pLEX— btrCを含む GI724ApgiAzwf株を用いた DOIの合成
GI724ApgiAzwf ZpLEX— btrC株を 35mlの 1%マン-トールを含む RMG培 地（6%リン酸水素ナトリウム、 3%リン酸二水素カリウム、 0. 5%塩ィ匕ナトリウム、 1% 塩ィ匕アンモ-ゥム、 2%カザミノ酸、 1%グリセリン、 ImM塩化マグネシウム）に植菌し 、 1晚前培養を行った。次いで、 3リットルの 3%マン-トールを含む 2XYT培地（10リ ットル培養槽内）に 1%の濃度で菌体を植菌し、 30°C、攪拌速度 300rpm、空気 10L Zm、 pH7. 7の条件で、培養し、 600nmの O. D.が 0. 7にった時点でグルコース を 3%濃度添加し、さらに培養を続けた。各培養時間において、遠心分離により菌体 を除去し、培養上清のグルコース濃度と DOI量を分析した。 DOI生産量の測定は、 実施例 6と同様に行った。図 6に DOI生産量、培地の濁度、及びグルコース濃度のタ ィムコースを示す。
[0046] [参考例 1]
(pLEX— btrCを含む GI724 Δ pgi株を用いた DOIの合成） GI724 Δ pgi/pLEX— btrC株を 300ml三角フラスコに入れた 35mlの前培養液 ( RMG培地、 6%リン酸水素ナトリウム、 3%リン酸二水素カリウム、 0.5%塩ィ匕ナトリウ ム、 1%塩化アンモ-ゥム、 2%カザミノ酸、 1%グリセリン、 ImM塩化マグネシウム）に 接種し、 15時間培養した。次いで、 3リットルの 2XYT培地を入れた 10リットル培養槽 に 1%の濃度で菌体を植菌した。これを培養温度 30°C、攪拌速度 300rpm、空気 10 LZm、 pH7.7の条件で、 600 nmの O.D.が 0.7になった時点で D—グルコースを 2 %または 5%濃度添加し、さらに 24時間培養を行った。培養液を遠心分離して菌体 を除き、培養上清液を回収した。
[0047] [参考例 2]
(DOI生産量の測定）
培養上清中に蓄積する DOIの定量を以下に示す手順に従って行った。各時間に おいて、培養液を採取し、上清液と等量の H 0、上清液の 2倍量のメタノール、及び
2
終濃度 1.5 mgZmlの O— (4— -卜口ベンジル）ヒドロキシルァミン（NBHA)をカロえ 混合し、 60°Cで 1時間インキュベートすることにより DOIのォキシム化を誘導した。 Sp eep Vac System (Thermo社 ISS 110)で溶媒を蒸発させた後、ォキシム化 DOI を適当量のメタノールに溶解し、その一部を HPLC (高速液体クロマトグラフィー）分 析法にて分析し、 DOIの検出及び定量を行った。高速液体クロマトグラフィーでは S HIMADZU社 LC— 9A、カラムは Phrnomenex社 Luna 5u C18 (カラム長 150 mm、カラム内径 4.6mm)を用い、溶離液として 20%メタノールを用いた。 262nmに おける紫外線吸収を測定した。 DOIの O—（4一二トロベンジル)ォキシム誘導体の量 を標準曲線法により定量した。
実施例 8
[0048] アンバーライト IR120とアンバーライト IRA410の混合ベッド型榭脂を用いる方法
H+型のアンバーライト IR120と酢酸型のアンバーライト IRA410を各 200mlずつ 混合した後、カラム（ φ 5cm X 25cm)に充填した。これ〖こ pH2.96〖こ調整した、参考 例 1の培養液 100ml (1.4gの DOIを含む）を添カ卩した後、蒸留水を流速 2mlZmin で流すことにより溶離を行った。 6mlずつのフラクションを集め、得られたフラクション について 1本おきに pHおよび伝導度を測定した。また、 3本おきに DOIの定量も行つ た。 DOIの定量は、 0- (4— nitrobenzyl) oximeに誘導した後、 HPLCで面積を測 定した後、検量線より計算した。このときの結果を図 7に示す。また、フラクションを 4つ のブロックに分けて集めて凍結乾燥した後、それぞれのブロック中の DOIの純度およ び量を測定した。結果を表 2に示す。得られた精製 DOIの C— 13NMR ^ベクトルを 図 8に示す。 C—13NMRスペクトルは、重水に溶解した試料を Bruker社の DPX— 250NMR装置（C— 13核は 67.5MHzで共鳴）を用いて測定した。
実施例 9
[0049] アンバーライト IR200とアンバーライト IRA410の混合ベッド型榭脂を用いる方法
H+型のアンバーライト IR200と酢酸型のアンバーライト IRA410を各 200mlずつ 混合した後、カラム（ φ 5cm X 25cm)に充填した。これ〖こ pH2.97〖こ調整した、参考 例 1の培養液 50ml(562mgの DOIを含む）を添カ卩した後、蒸留水を流速 2mlZmin で流すことにより溶出を行った。 6mlずつのフラクションを集め、得られたフラクション について 1本おきに pHおよび伝導度を測定した。また、 3本おきに DOIの定量も行つ た。このときの結果を図 9に示す。また、フラクションを 4つのブロックに分けて集めて 凍結乾燥した後、それぞれのブロック中の DOIの純度および量を測定した。結果を 表 3に示す。得られた精製 DOIの C 13NMR ^ベクトルを図 10に示す。 DOIの定 量方法および C—13NMR ^ベクトルの測定方法は実施例 8と同様にして行った。
[0050] [表 2]
Figure imgf000018_0001
[0051] [表 3] 重量 (mg) DO ΐ鼍 （mg) . i%)
F r . 26-45 85. 7 71. 4 83. 3
F r. 46-71 120 1 14. 1 95. 1
F r. 72-95 31. 6 25. 1 79. 5
F r. 96- 11. 9 1. 3 10. 8
249. 2 21 1. 9
[0052] [寄託微生物の表示]
本発明において使用される寄託微生物の表示は以下のとおりである。
Escherichia coli GI724 Δ pgi Δ zwf/pLEX- btrC FER AP- 20462
1. 受領機関名：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
2. 受領日： 平成 17年 3月 18日
3. 受領番号： FERM AP- 20462
産業上の利用の可能性
[0053] 本発明により、従来の石油由来の化学物質に代わり、再生可能な資源である、でん ぶんなどのバイオマス由来の原料を用いて、発酵により、様々な炭素 6員環化合物の 製造のための出発原料となる高純度 DOIを製造することが可能となった。

Claims

請求の範囲
[1] 2—デォキシ一シ口一イノソースの合成に関与する遺伝子力 なることを特徴とする 遺伝子発現カセット。
[2] 宿主細胞としての大腸菌種または GILSP遺伝子組み換え微生物リストに記載されて いる宿主細胞（平成 16年 10月現在のもの）に、請求項 1に記載の 2 デォキシ―シ 口一イノソースの合成に関与する遺伝子カゝらなる遺伝子発現カセットを少なくとも 1種 類導入してなることを特徴とする形質転換体。
[3] ホスホグルコースイソメラーゼをコードする pgi遺伝子、および、ダルコネートデヒドロゲ ナーゼをコードする zwf遺伝子がそれぞれ単独で遺伝子破壊された請求項 2に記載 の宿主細胞、またはその両者が遺伝子破壊された請求項 2に記載の宿主細胞に、請 求項 1に記載の 2—デォキシ一シ口一イノソースの合成に関与する遺伝子力 なる遺 伝子発現カセットを少なくとも 1種類導入してなることを特徴とする形質転換体。
[4] 炭素源から 2—デォキシーシローイノソースを合成する方法において、請求項 2に記 載の形質転換体を用 、ることを特徴とする 2—デォキシ シロ一イノソースの合成方 法。
[5] 前記炭素源が D グルコース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、米ぬかのいずれかから選 択される請求項 4に記載の 2 デォキシ シローイノソースの合成方法。
[6] 請求項 4乃至 5のいずれかの方法により合成してなることを特徴とする 2 デォキシ一 シローイノソース。
[7] 請求項 4の合成方法により得られ、かつ、 2 デォキシーシローイノソースを含有する 培養液を、水素イオン型強酸性陽イオン交換樹脂と有機酸イオン型塩基性陰イオン 交換樹脂からなる混合ベッド型カラムで処理することを特徴とするる 2—デォキシ一シ 口一イノソースの精製法。
[8] 前記有機酸イオン型塩基性陰イオン交換樹脂が酢酸イオン型である請求項 7に記載 の 2—デォキシーシローイノソースの精製法。
[9] 請求項 7乃至 8のいずれかの方法により精製されてなることを特徴とする 2 デォキシ ーシローイノソース。
PCT/JP2005/006022 2005-03-30 2005-03-30 大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース Ceased WO2006112000A1 (ja)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2005/006022 WO2006112000A1 (ja) 2005-03-30 2005-03-30 大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース
BRPI0607623-8A BRPI0607623B1 (pt) 2005-03-30 2006-03-23 escherichia coli transgênica
DE602006019835T DE602006019835D1 (de) 2005-03-30 2006-03-23 Genexpressionskassette und transformante sowie verfahren zur herstellung von 2-desoxyscylloinosose unter verwendung der transformante
AT06729749T ATE496994T1 (de) 2005-03-30 2006-03-23 Genexpressionskassette und transformante sowie verfahren zur herstellung von 2- desoxyscylloinosose unter verwendung der transformante
PCT/JP2006/305782 WO2006109479A1 (ja) 2005-03-30 2006-03-23 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法及び２－デオキシ－シロ－イノソースの精製方法
CN2006800107712A CN101151368B (zh) 2005-03-30 2006-03-23 基因表达盒及转化体、及使用该转化体的2-脱氧-青蟹肌糖的制备方法及2-脱氧-青蟹肌糖的精制方法
JP2007512466A JP4598826B2 (ja) 2005-03-30 2006-03-23 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法及び２−デオキシ−シロ−イノソースの精製方法
EP06729749A EP1865056B1 (en) 2005-03-30 2006-03-23 Gene expression cassette and transformant, and process for production of 2-deoxy-scyllo-inosose and process for purification of 2-deoxy-scyllo-inosose using the transformant
US11/887,445 US8758741B2 (en) 2005-03-30 2006-03-23 Gene expression cassette and a transformant, and a method for manufacturing 2-deoxy-scyllo-inosose and a method for purifying 2-deoxy-scyllo-inosose using said transformant
KR1020077024620A KR101019759B1 (ko) 2005-03-30 2006-03-23 유전자 발현카세트 및 형질전환체, 및 이 형질전환체를사용하는 2-디옥시실로이노소스의 제조방법 및2-디옥시실로이노소스의 정제방법
US14/178,496 US20140256960A1 (en) 2005-03-30 2014-02-12 Gene expression cassette and a transformant, and a method for manufacturing 2-deoxy-scyllo-inosose and a method for purifying 2-deoxy-scyllo-inosose using said transformant

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2005/006022 WO2006112000A1 (ja) 2005-03-30 2005-03-30 大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006112000A1 true WO2006112000A1 (ja) 2006-10-26

Family

ID=37086767

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/006022 Ceased WO2006112000A1 (ja) 2005-03-30 2005-03-30 大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース
PCT/JP2006/305782 Ceased WO2006109479A1 (ja) 2005-03-30 2006-03-23 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法及び２－デオキシ－シロ－イノソースの精製方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/305782 Ceased WO2006109479A1 (ja) 2005-03-30 2006-03-23 遺伝子発現カセット及び形質転換体、並びにこの形質転換体を用いた２－デオキシ－シロ－イノソースの製造方法及び２－デオキシ－シロ－イノソースの精製方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8758741B2 (ja)
EP (1) EP1865056B1 (ja)
JP (1) JP4598826B2 (ja)
KR (1) KR101019759B1 (ja)
CN (1) CN101151368B (ja)
BR (1) BRPI0607623B1 (ja)
DE (1) DE602006019835D1 (ja)
WO (2) WO2006112000A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009125581A1 (ja) 2008-04-11 2009-10-15 三井化学株式会社 カテコールの製造方法
WO2010053052A1 (ja) * 2008-11-05 2010-05-14 三井化学株式会社 ２－デオキシ－シロ－イノソース（ｄｏｉ）生産細菌及びこれを用いた２－デオキシ－シロ－イノソース（ｄｏｉ）生産方法
WO2010109916A1 (ja) * 2009-03-26 2010-09-30 旭化成ケミカルズ株式会社 新規２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素
WO2010125807A1 (ja) 2009-04-28 2010-11-04 三井化学株式会社 多価フェノールを製造する方法
WO2015005451A1 (ja) * 2013-07-12 2015-01-15 三井化学株式会社 ２－デオキシ－シロ－イノソースの生産方法
JP2020065494A (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 株式会社Ｉｈｉプラントエンジニアリング トリヒドロキシベンゼンを製造するためのシステム
WO2020085435A1 (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 株式会社Ihi トリヒドロキシベンゼンの製造方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7521481B2 (en) 2003-02-27 2009-04-21 Mclaurin Joanne Methods of preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation
JP2010523602A (ja) 2007-04-12 2010-07-15 ワラタ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 眼疾患の治療におけるシクロヘキサンヘキソール誘導体の使用
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
JP5661250B2 (ja) * 2009-03-26 2015-01-28 旭化成ケミカルズ株式会社 新規グルコース−６−リン酸定量方法および定量試薬
JP5457058B2 (ja) * 2009-03-27 2014-04-02 旭化成ケミカルズ株式会社 リン酸濃度制御による２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法
WO2013125666A1 (ja) * 2012-02-23 2013-08-29 株式会社日本触媒 イノシトール高生産微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法
JP6487852B2 (ja) 2013-12-16 2019-03-20 旭化成株式会社 ２−デオキシ−シロ−イノソース還元酵素
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2017029353A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Transition Therapeutics Ireland Limited Treatment of behaviors in dementia patients
KR101718508B1 (ko) * 2015-11-17 2017-03-21 고려대학교 산학협력단 2-데옥시-실로-이노소스 생합성 경로를 가지는 재조합 고초균 및 이를 이용한 2-데옥시-실로-이노소스의 제조방법
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11499175B2 (en) 2017-03-27 2022-11-15 Mitsui Chemicals, Inc. Mutant type 2-deoxy-scyllo-inosose synthase
CN116121209A (zh) * 2022-11-30 2023-05-16 江南大学 一种酶活性改变的2-脱氧-青蟹肌糖合酶突变体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000236881A (ja) * 1999-02-22 2000-09-05 Tokyo Inst Of Technol ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素、アミノ酸配列、遺伝子塩基配列
JP2005000072A (ja) * 2003-06-11 2005-01-06 Hokko Chem Ind Co Ltd （−）−２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10014546A1 (de) * 2000-03-23 2001-09-27 Degussa Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
JP4019706B2 (ja) * 2000-12-22 2007-12-12 味の素株式会社 発酵法による目的物質の製造法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000236881A (ja) * 1999-02-22 2000-09-05 Tokyo Inst Of Technol ２−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素、アミノ酸配列、遺伝子塩基配列
JP2005000072A (ja) * 2003-06-11 2005-01-06 Hokko Chem Ind Co Ltd （−）−２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUTLER M J, ET AL: "Engineering of primary carbon metabolism for improved antibiotic production in streptomyces lividans", APPL. ENVIRON: MICROBIOL., vol. 68, no. 10, 2002, pages 4731 - 4739, XP008052363 *
KUDO F, ET AL: "Molecular cloning of the gene for the key carbocycle-forming enzyme in the biosynthesis of 2-deoxystreptamine-containing aminocyclitol antibiotics and its comparison with dehydroquinate synthase", J. ANTIBIOT., vol. 52, no. 6, 1999, pages 559 - 571, XP002990832 *
YAMAUCHI N, ET AL: "Biochemical-studies on 2-deoxy-scyllo-inosose, an early intermediate in the biosynthesis of 2-deoxystreptamine. 1. Chemical synthesis of 2-deoxy-scyllo-inosose and (2, 2-2H2)-2-deoxy-scyllo-inosose", J. ANTIBIOT., vol. 45, no. 5, 1992, pages 756 - 766, XP002990831 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009125581A1 (ja) 2008-04-11 2009-10-15 三井化学株式会社 カテコールの製造方法
US9150868B2 (en) 2008-11-05 2015-10-06 Mitsui Chemicals, Inc. Bacterium producing 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) and method of producing 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) by using same
WO2010053052A1 (ja) * 2008-11-05 2010-05-14 三井化学株式会社 ２－デオキシ－シロ－イノソース（ｄｏｉ）生産細菌及びこれを用いた２－デオキシ－シロ－イノソース（ｄｏｉ）生産方法
JPWO2010053052A1 (ja) * 2008-11-05 2012-04-05 三井化学株式会社 ２−デオキシ−シロ−イノソース（ｄｏｉ）生産細菌及びこれを用いた２−デオキシ−シロ−イノソース（ｄｏｉ）生産方法
WO2010109916A1 (ja) * 2009-03-26 2010-09-30 旭化成ケミカルズ株式会社 新規２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素
US8703466B2 (en) 2009-03-26 2014-04-22 Asahi Kasei Chemicals Corporation 2-deoxy-scyllo-inosose synthase
WO2010125807A1 (ja) 2009-04-28 2010-11-04 三井化学株式会社 多価フェノールを製造する方法
JPWO2015005451A1 (ja) * 2013-07-12 2017-03-02 三井化学株式会社 ２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法
WO2015005451A1 (ja) * 2013-07-12 2015-01-15 三井化学株式会社 ２－デオキシ－シロ－イノソースの生産方法
JP2020065494A (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 株式会社Ｉｈｉプラントエンジニアリング トリヒドロキシベンゼンを製造するためのシステム
WO2020085435A1 (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 株式会社Ihi トリヒドロキシベンゼンの製造方法
WO2020085436A1 (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 株式会社Ihi トリヒドロキシベンゼンを製造するためのシステム
JP2020066604A (ja) * 2018-10-25 2020-04-30 株式会社Ｉｈｉプラントエンジニアリング トリヒドロキシベンゼンの製造方法
CN112912362A (zh) * 2018-10-25 2021-06-04 三井化学株式会社 三羟基苯的制造方法
JP7173538B2 (ja) 2018-10-25 2022-11-16 株式会社Ihi トリヒドロキシベンゼンの製造方法
JP7260872B2 (ja) 2018-10-25 2023-04-19 株式会社Ihi トリヒドロキシベンゼンを製造するためのシステム
CN112912362B (zh) * 2018-10-25 2023-05-30 三井化学株式会社 三羟基苯的制造方法
US11685704B2 (en) 2018-10-25 2023-06-27 Mitsui Chemicals, Inc. Trihydroxybenzene production method

Also Published As

Publication number Publication date
CN101151368A (zh) 2008-03-26
EP1865056B1 (en) 2011-01-26
US20100015672A1 (en) 2010-01-21
BRPI0607623A2 (pt) 2009-09-22
DE602006019835D1 (de) 2011-03-10
EP1865056A1 (en) 2007-12-12
WO2006109479A1 (ja) 2006-10-19
US8758741B2 (en) 2014-06-24
EP1865056A4 (en) 2008-04-16
JPWO2006109479A1 (ja) 2008-10-23
US20140256960A1 (en) 2014-09-11
BRPI0607623B1 (pt) 2021-03-02
KR101019759B1 (ko) 2011-03-04
KR20080005931A (ko) 2008-01-15
JP4598826B2 (ja) 2010-12-15
CN101151368B (zh) 2011-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006112000A1 (ja) 大腸菌変異株による２－デオキシ－シロ－イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２－デオキシ－シロ－イノソース
JP7209977B2 (ja) ニコチンアミド誘導体を製造するための組換え微生物及び方法、並びにそれに用いられるベクター
CN107267579B (zh) 微生物发酵生产n-乙酰-d-氨基葡萄糖和/或d-氨基葡萄糖盐的方法
KR20110046560A (ko) 2-히드록시-이소부티레이트 (2-ｈｉｂａ)의 효소적 생산
CN113462669B (zh) 酮泛解酸羟甲基转移酶突变体、编码基因及其应用
CN107312737A (zh) 一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4‑二羟基丁酸的方法
CN112080453A (zh) 一种合成d-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用
KR20220119128A (ko) D-자일룰로오스 4-에피머라아제, 그 변이체 및 용도
US8852891B2 (en) N-acetylglucosamine-2-epimerase and method for producing CMP-neuraminic acid using the same
JPWO2008139844A1 (ja) グルクロン酸発酵によるグルクロン酸の製造方法
EP4581134A2 (en) Compositions and methods for producing rebaudioside m
CN108410831A (zh) 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN110607335B (zh) 一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸类化合物生物合成方法
JP6989746B2 (ja) 変異型２－デオキシ－シロ－イノソース合成酵素
CN102199644B (zh) 胞苷三磷酸的基因工程制备方法
JP2015000015A (ja) パラアミノ安息香酸の生産方法
KR20160043498A (ko) D-자일로스로부터 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 재조합 대장균, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 1，2，4-부탄트리올을 생산하는 방법
Wen et al. D-tagatose biotransformation from lactose by lactase and recombinant Bacillus subtilis expressing L-arabinose isomerase, and the product separation, purification and crystallization
CN116445442A (zh) 一种UDP-糖基转移酶及其在合成α-常春藤苷糖苷化合物中的应用
CN118497167B (zh) 一种l-苏氨酸转醛酶突变体及其在l-对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用
JP2006262846A (ja) 酵母による２−デオキシ−シロ−イノソースの合成および精製する方法並びに得られた２−デオキシ−シロ−イノソース
CN105154487A (zh) 氨基转移酶和异构酶在催化形成L-allo-Ile中的应用
CN103233047B (zh) JadG蛋白在催化角蒽环芳香聚酮氧化开环和氨基酸插入反应中的应用
Sohng et al. Cloning, expression, and biological function of a dTDP-deoxyglucose epimerase (gerF) gene from Streptomyces sp. GERI-155
CN119709677B (zh) 一种糖基转移酶及其在制备金线莲苷中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 05727936

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 5727936

Country of ref document: EP