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WO2006035741A1 - Ｅｓ細胞特異的発現遺伝子及びその利用 - Google Patents

Ｅｓ細胞特異的発現遺伝子及びその利用 Download PDF

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WO2006035741A1
WO2006035741A1 PCT/JP2005/017689 JP2005017689W WO2006035741A1 WO 2006035741 A1 WO2006035741 A1 WO 2006035741A1 JP 2005017689 W JP2005017689 W JP 2005017689W WO 2006035741 A1 WO2006035741 A1 WO 2006035741A1
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WO
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gene
cell
cells
ecat15
marker
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PCT/JP2005/017689
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shinya Yamanaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Pharma Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP05787921A priority patent/EP1811023A4/en
Priority to JP2006537735A priority patent/JPWO2006035741A1/ja
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    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a gene specifically expressed in ES cells (embryonic stem cells) and use thereof.
  • Embryonic stem cells are stem cells established from the inner cell mass of mammalian blastocysts and proliferate indefinitely while maintaining the ability to differentiate into all cells (differentiated pluripotency) It can be made.
  • ES cells were first established in mice in 1981, bringing about a revolutionary technique of gene function analysis using knockout mice. Furthermore, in 1998, the establishment of human ES cells was reported, and its power was greatly expected to be applied to regenerative medicine. The goal is to transplant the heart muscle and nerve cells differentiated from ES cells to patients with myocardial infarction or neurodegenerative disease to achieve functional recovery.
  • ES cells have an important role in pluripotent cells. It is a specifically expressed gene (ES cell associated transcript gene).
  • the ECAT gene is a marker of whether the cell is an ES cell.
  • a regulatory region that causes ES cell-specific expression of the ECAT gene with a drug resistance gene, it is possible to efficiently select mixed culture ES cells of many types of cells (see Patent Document 1).
  • by inducing the expression of the ECAT gene in somatic cells it may promote conversion to ES-like cells.
  • Oct3 also referred to as Oct4, POU5fl; hereinafter referred to as Oct3 / 4
  • ECAT The transcription factor Oct3 gene
  • a similar gene has also been reported in humans (h0ct3 / 4 gene; see Non-Patent Document 1), but it has hOct-3 / 4 gene! If proved, no report! /.
  • ECAT1 gene to ECAT9 gene (see Patent Document 2).
  • ECAT4 is a factor also called Nanog, and it became clear that it was an essential factor for maintaining the totipotency (split pluripotency) of ES cells (see Non-Patent Document 2).
  • ECAT5 is also a factor called ERas and has been shown to be a factor that promotes the proliferation of ES cells (see Non-Patent Document 3).
  • Patent Document 1 US Pat. No. 6,146,888
  • Patent Document 2 WO 02/097090
  • Non-patent literature l Takeda et al, Nucleic Acids Research, 20: 4613-4620 (1992)
  • Non-patent literature 2 Mitsui, K., et al "Cell, 113: 631-642 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Takahashi, K., et al., Nature, 423: 541-545 (2003)
  • An object of the present invention is to provide a novel ECAT gene.
  • this invention describes a method for detecting ES cells using the new ECAT genes ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7, and LOC380905 (TDRD4).
  • the purpose is to provide a screening method for cell nuclear reprogramming substances or a screening method for ES cell maintenance substances.
  • the present inventor is searching for a new ECAT gene from the viewpoints of basic research of ES cells, regenerative medicine, and application to ES cell transplantation.
  • ECAT 15-1 gene (SEQ ID NO: 1-4)
  • the ECAT15-1 gene, the ECAT15-2 gene, and the ECAT16 gene are all ECAT genes that are expressed specifically in ES cells. It became clear that it is a marker gene that characterizes cells.
  • the novel ECAT gene of the present invention is a gene that is specifically expressed in ES cells, the V gene is also detected by ES cells, screening for somatic cell nuclear reprogramming substances, Or it is used effectively in screening of ES cell maintenance substances.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention is as follows: (1) A marker for ES cell detection containing a polynucleotide derived from one of ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene,
  • the marker according to any one of (1) to (6) V above which contains a polynucleotide containing at least 15 consecutive bases and a polynucleotide complementary to Z or the polynucleotide,
  • a marker for detecting ES cells comprising a polynucleotide containing a base and ⁇ or a polynucleotide complementary to the polynucleotide,
  • ECAT15-1 is a protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • ECAT152 is a protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 or 8.
  • LOC380905 (TDRD4) is a protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 or 16.
  • ES cell detection method comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a method for screening a nuclear reprogramming substance in a somatic cell comprising the following steps (a) and (b):
  • step (b) after the step (a), examining whether or not a marker gene-expressing cell appears, and selecting a test substance on which the cell appears as a somatic cell nuclear reprogramming candidate substance,
  • Marker genes are drug resistance genes, fluorescent protein genes, luminescent enzyme residues
  • step (b) after the step (a), examining the presence or absence of viable cells in a selective medium, and selecting a test substance that has produced the viable cells as a somatic cell nuclear reprogramming candidate substance;
  • a step of selecting a marker gene-expressing cell as an ES-like cell comprising the following steps (a) and (b): (a) a somatic cell containing a gene in which a drug resistance gene is present at a position that is regulated by the expression regulatory region of the ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene , The process of contacting the somatic cell nuclear reprogramming substance,
  • step (b) after the step (a), selecting a viable cell in the selective medium as an ES-like cell;
  • step (b) After the step (a), a step of examining the presence or absence of a marker gene-expressing cell, and selecting a test substance in which the cell is present as a candidate substance for ES cell undifferentiation / pluripotency maintenance
  • step (b) After the step (a), the presence or absence of viable cells in the selective medium is examined, and the test substance in which the viable cells are present is selected as a candidate substance for ES cell undifferentiation / pluripotency maintenance.
  • ECAT15-1 gene ECAT15-2 gene
  • ECAT16 gene ECAT16 gene
  • Rnfl7 gene The ES cell according to (30), comprising a gene obtained by knocking in a marker gene into a child or a LOC380905 (TDRD4) gene,
  • a protein containing any one of ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnf 173 ⁇ 4yt «LOC380905 (TD RD4), or a conjugate according to the above (33) or (34) as an active ingredient Contains an ES cell function maintenance agent,
  • a polynucleotide of the ECAT16 gene comprising any of the following (a) to (d):
  • ECAT16 protein consisting of any of the following (a) to (c):
  • a method for producing a recombinant protein comprising culturing the cell according to (45) under conditions allowing expression of the expression vector according to (44),
  • ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, RnH7 gene and LOC380905 (TDRD4) gene of the present invention are genes that are specifically expressed in ES cells, these genes or those genes
  • the encoded protein is effectively used for ES cell detection, somatic cell nuclear reprogramming substance screening, ES cell maintenance substance screening, and the like.
  • ECAT15-1 gene ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, RnH7 gene, LOC380905 (TDRD4) gene
  • ECAT15-1 gene ECAT15-2 gene
  • ECAT16 gene ECAT16 gene
  • RnH7 gene LOC380905 (TDRD4) gene
  • polynucleotide is used to include RNA and DNA!
  • the “antibody” refers to a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or the above-mentioned antibody having antigen-binding properties such as a fragment generated by a Fab fragment or Fab expression library. Is included.
  • ECAT15-1 gene means a mouse ECAT15-1 gene comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and a human ECA T15- containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3. 1 gene or a gene containing a base sequence similar to these base sequences It is.
  • ECAT15-2 gene refers to a mouse ECAT15-2 gene comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 5, a human ECA T15-2 gene comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 7, Alternatively, a gene containing a base sequence similar to these base sequences can be mentioned.
  • ECAT16 gene refers to a mouse ECAT16 gene containing the base sequence described in SEQ ID NO: 17, the human ECAT16 gene containing the base sequence described in SEQ ID NO: 33, or these base sequences. And a gene containing a similar base sequence.
  • Rnfl7 gene refers to a mouse Rnfl 7 gene containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9, a human Rnfl 7 gene containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11, or Include genes containing a base sequence similar to these base sequences.
  • the “LOC380905 (TDRD4) gene” is a gene called LOC380905 gene or TDRD4 gene.
  • the mouse LOC380905 gene containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15
  • a human TDRD4 gene human homologous gene of mouse LOC380905 containing the nucleotide sequence described in 1) or a gene containing a nucleotide sequence similar to these nucleotide sequences.
  • the above "gene containing a similar base sequence” refers to a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by the above SEQ ID NO. And a gene containing a nucleotide sequence having high homology with the nucleotide sequence represented by the above-mentioned SEQ ID NO.
  • the “gene containing a highly homologous base sequence” specifically refers to 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90%, with respect to the base sequence indicated by the sequence number.
  • Another embodiment includes a gene that hybridizes under stringent conditions with the base sequence (complementary strand) represented by the SEQ ID NO.
  • the stringent conditions can be adjusted by appropriately changing the temperature, salt concentration, etc. during the hybridization reaction and washing, and are set according to the desired homology.
  • the salt concentration 6 X SSC, temperature: 65 ° C hybridizing condition.
  • each ECAT gene of the present invention When these "genes containing a similar base sequence (to each ECAT gene of the present invention)" are used as a marker, it is possible to detect ES cell-specific expression of each ECAT gene. It must have features! In addition, when used as an ES cell function maintenance agent, which will be described later, it may have the same ES cell function maintenance activity as each ECAT gene.
  • ECAT15-1 means mouse ECAT15-1 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, human EC AT15- containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. 1 protein, or a protein containing an amino acid sequence similar to these amino acid sequences.
  • ECAT15-2 means mouse ECAT15-2 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, human EC AT15-2 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, Alternatively, a protein containing an amino acid sequence similar to these amino acid sequences can be mentioned.
  • ECAT16 means mouse ECAT16 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, human ECAT 16 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34, or these amino acid sequences. And a protein containing a similar amino acid sequence.
  • Rnfl7 means a mouse RnH7 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, a human Rnfl7 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, or these Examples include proteins containing an amino acid sequence similar to the amino acid sequence.
  • LOC380905 (TDRD4) means mouse LOC380905 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, human TDRD4 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (human of mouse LOC380905) Homologous proteins), or proteins containing amino acid sequences similar to these amino acid sequences.
  • a protein containing a similar amino acid sequence means "a gene containing a similar base sequence (to each ECAT gene of the present invention)".
  • the protein coded by Specifically, it is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NO. Examples include proteins containing amino acid sequences having the above homology.
  • the ECAT15-1 gene, the ECAT15-2 gene, the ECAT16 gene, the Rnfl7 gene, and the LOC380905 (TDRD4) gene (hereinafter sometimes referred to as the gene of the present invention) are ES cells. Based on the finding that it is specifically expressed, it is based on the finding that whether or not the test cell is an ES cell can be detected by detecting the presence or absence and the level of expression of these genes. Specifically, the present invention is for ES cell detection, comprising these ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene! Provide a marker.
  • ES cells include ES-like cells in addition to so-called ES cells.
  • the “ES-like cell” means a cell having properties as an ES cell, that is, a cell having undifferentiated 'pluripotency.
  • the "specific polynucleotide” refers to a polynucleotide having a length capable of distinguishing and specifying each gene from other genes.
  • genes of the present invention there are genes that overlap on the gene sequence, such as ECAT16 gene, Rnfl7 gene and LOC380905 (TDRD4) gene. Since these genes are all ES cell-specific expressed genes, there is no problem in using polynucleotides that bind to two or more of the ECAT16 gene, Rnfl7 gene, and LOC380905 (T DRD4) gene as markers. . Therefore, the ECAT16 gene, Rnfl7 gene and LOC380905 (TDRD4) gene are excluded from the category of “other genes”.
  • ECAT15-1 gene eg mouse and human
  • ECAT15-2 gene eg mouse and human
  • ECAT16 gene eg mouse
  • Rnfl 7 gene eg mouse and human
  • TDRD4 gene eg mouse and human
  • the marker for detecting ES cells of the present invention usually has 15 bases, it is possible to identify one gene by distinguishing it from other genes. Therefore, as one specific example of the marker of the present invention, a polycondensation containing at least 15 consecutive bases in the base sequence of the ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene. Examples include ES cell detection markers consisting of nucleotides and Z or polynucleotides complementary thereto.
  • the marker of the present invention has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 or 33, which is either And a marker for detecting ES cells containing a polynucleotide containing at least 15 consecutive bases and Z or a polynucleotide complementary thereto.
  • the complementary polynucleotide (complementary strand, reverse strand) is the full-length sequence of a polynucleotide comprising the base sequence of the gene of the present invention, or a 15-base length at least continuous with the base sequence.
  • the strong complementary strand is not limited to the case where it forms a completely complementary sequence with the target positive strand base sequence, but is complementary enough to allow hybridization with the target positive strand under stringent conditions. It may have a relationship.
  • stringent conditions herein are complex or as taught by Berger and Kimmel (1987, uuide to Molecular and lonmg Techniques Metnods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). This can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to which the probe is bound.
  • Tm melting temperature
  • the cleaning conditions after noble normalization are usually about “1 X SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”.
  • the complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under strong conditions.
  • the cleaning conditions are about ⁇ 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C '' as stricter noise reduction conditions, and ⁇ 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C '' as stricter hybridization conditions.
  • a complementary strand a strand consisting of a base sequence completely complementary to the base sequence of the target positive strand, and at least 90%, preferably 95% homology with the strand. Examples of the chain also have a base sequence ability.
  • the polynucleotide on the positive strand side has a more complementary relationship to the base sequence of the above-mentioned complementary strand than just the base sequence of the gene of the present invention or the partial sequence thereof. Chains that also have base sequencing power can be included.
  • the above-mentioned normal and complementary (reverse) polynucleotides may each be used as a marker in a single-stranded form, or may be used as a marker in a double-stranded form.
  • those in which the polynucleotide is labeled for detection are also included in the category of the polynucleotide of the present invention.
  • the marker for detecting ES cells of the present invention may be a polynucleotide having the nucleotide sequence (full-length sequence) of the gene of the present invention, or a polynucleotide having a complementary sequence. May be. Further, the polynucleotide may also be a partial sequence of the full-length sequence or a complementary sequence thereof as long as it selectively (specifically) recognizes the gene of the present invention or a polynucleotide derived from the gene. In this case, examples of the partial sequence include a polynucleotide having at least 15 consecutive base lengths arbitrarily selected from the base sequence of the full-length sequence or its complementary sequence.
  • “selectively (specifically)” means that, for example, in the Northern plot method, the gene of the present invention or a polynucleotide derived therefrom can be specifically detected, In the RT-PCR method, it means that the gene of the present invention or a polynucleotide derived from the gene of the present invention is specifically produced. It is only necessary to be able to determine that it is derived from the above.
  • the marker of the present invention includes, for example, the mouse ECAT15-1 gene represented by SEQ ID NO: 1, the human ECAT15-1 gene represented by SEQ ID NO: 3, the mouse ECAT15-2 gene represented by SEQ ID NO: 5, Human ECAT15-2 gene shown in SEQ ID NO: 7, mouse Rnfl 7 gene shown in SEQ ID NO: 9, human Rnfl 7 gene shown in SEQ ID NO: 11, mouse LOC380905 gene shown in SEQ ID NO: 13, sequence No.
  • the marker of the present invention is not limited as long as it has a length of at least 15 consecutive bases as described above. Specifically, the length is appropriately selected and set according to the use of the marker. That's right.
  • the test cell force is an S cell is detected by evaluating the presence or absence of the expression level (expression level) of the gene of the present invention in the test cell.
  • the marker of the present invention is used as a primer for specifically recognizing and amplifying the RNA or the polynucleotide derived from the expression of the gene of the present invention, or the RNA derived therefrom. It can be used as a probe for specifically detecting nucleotides.
  • the marker of the present invention when used as a primer in the detection of ES cells, those having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp can be exemplified. More preferably, those having a base length of 20 bp to 35 bp are exemplified.
  • those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.
  • the marker of the present invention is a known method for specifically detecting a specific gene, such as Northern blotting, RT-PCR, in situ hybridization, DNA chip, etc. Or it can utilize as a probe. Based on the use, the presence or absence or expression level (expression level) of the gene of the present invention in the test cell can be evaluated.
  • total RNA prepared from test cells may be used, and various polynucleotides prepared based on the RNA may be used. Also, use the cell itself as the sample to be measured.
  • the present invention provides ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnf17 or LOC380905 (TDRD4) (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention) as a marker for ES cell detection!
  • ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnf17 or LOC380905 (hereinafter sometimes referred to as the protein of the present invention) as a marker for ES cell detection!
  • TDRD4 LOC380905
  • the antibody includes mouse ECAT15-1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, human ECAT15-1 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, and set forth in SEQ ID NO: 6.
  • Human Rnfl7 containing the sequence mouse LOC380905 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14, human TDRD4 containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16, containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18
  • Examples thereof include an antibody capable of specifically recognizing human ECAT16 containing the mouse ECAT16 or the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34.
  • an antibody that specifically recognizes means the same specificity as the above-mentioned “specific polynucleotide”. That is, even if an antibody recognizes two or more of ECAT16, RnH7, and LOC380905 (TDRD4), as long as it does not recognize other proteins unrelated to these, it falls within the category of “specific antibody”. included.
  • ECAT15-1 eg mouse and human
  • ECAT15-2 eg Mouse and human
  • ECAT16 eg mouse and human
  • Rnfl7 eg mouse and human
  • TDRD4 two or more species of LOC380905
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody having the protein of the present invention as an immunizing antigen with no particular restriction on its form, or may be a monoclonal antibody thereof. Furthermore, an antibody having an antigen-binding property to a polypeptide having at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids, which is at least contiguous among the amino acid sequences of the protein of the present invention, is also an antibody of the present invention. included.
  • the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12 to 11.13 (2000)).
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody
  • the protein of the present invention is expressed using the protein of the present invention expressed and purified in Escherichia coli or the like according to a conventional method, or according to a conventional method. It is possible to synthesize non-human animals such as rabbits by synthesizing the oligopeptides they have and obtain them from the sera of the immunized animals according to a conventional method.
  • a monoclonal antibody it was obtained by immunizing a non-human animal such as a mouse with the protein of the present invention expressed and purified in Escherichia coli according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of these proteins. It is possible to obtain the intermediate strength of hyperidoma cells prepared by fusing spleen cells and myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jonn Wiley and bons. Section 11). 4-11.11).
  • the protein of the present invention used as an immunizing antigen for the production of an antibody contains the sequence information of the gene provided by the present invention (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33). ) Based on DNA cloning, construction of each plasmid, transfection into the host, culture of the transformant and recovery of the protein from the culture. These operations are based on methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). Can be done.
  • a recombinant DNA (expression vector) in which a gene encoding the protein of the present invention can be expressed in a desired host cell is prepared, introduced into the host cell, and transformed.
  • a protein as an immunizing antigen for producing the antibody of the present invention can be obtained by culturing the body and recovering the target protein from the obtained culture.
  • these partial peptides of the protein of the present invention are commonly used according to the amino acid sequence information provided by the present invention (SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 34). It can also be produced by chemical synthesis (peptide synthesis).
  • the antibody of the present invention may also be prepared using an oligopeptide having a partial amino acid sequence of the protein of the present invention. It is desirable that the oligo (poly) peptide used for the production of a strong antibody has the same immunogenic properties as the protein of the present invention.
  • An oligo (poly) peptide preferably having this immunogenic property and consisting of at least 8 amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of the protein of the present invention can be exemplified.
  • an antibody against such an oligo (poly) peptide can also be carried out by enhancing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and lysolecithin, pull mouth nick polyol, polyion, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol.
  • Surface-active substances such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and human adjuvants such as Corynebaterum-Parvum.
  • the antibody of the present invention has a property of specifically binding to the protein of the present invention
  • the protein of the present invention (ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LOC380905 (TDRD4) is obtained by using the antibody. )) Can be specifically detected. That is, the antibody is useful as a probe for detecting the presence or absence of expression of the protein of the present invention in a test cell tissue.
  • the present invention provides a method for detecting an ES cell using the marker of the present invention described above.
  • the ES cell detection method of the present invention comprises gene expression of a gene of the present invention (ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LOC380 905 (TDRD4) gene) contained in a test cell.
  • ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LOC380 905 (TDRD4) gene contained in a test cell.
  • Levels and protein levels derived from these genes are measured to determine whether the test cell is an ES cell. Is.
  • the detection method of the present invention is carried out as follows.
  • ES cell detection can be specifically performed by a method including the following steps (a), (b) and (c):
  • RNA derived from a test cell or its transcribed complementary polynucleotide and the marker of the present invention ECAT15-1, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene! / , A polynucleotide derived from any one of them
  • the detection method of the present invention is carried out by detecting and measuring the expression level of the gene of the present invention in the RNA. Specifically, using the marker of the present invention having the above-described polynucleotide ability as a primer or probe, Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, in situ hybridization analysis, etc. It can implement by performing a well-known method.
  • the presence or absence of expression of the gene of the present invention in RNA and its expression level can be detected and measured by using the marker of the present invention as a probe.
  • the test subject in which the marker complement of the present invention is labeled with a radioisotope ( 32 P, 33 P, etc .: RI) or a fluorescent substance, and transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method.
  • the formed double-stranded marker and RNA are labeled with the marker label (RI or fluorescent substance).
  • Examples thereof include a method for detecting and measuring light with an X-ray film or the like, a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film) or a fluorescence detector. After labeling the marker (probe DNA) according to the protocol using AlkPhos Direct Labelingana Detection System (Manhamfanoreman / Nioac) and hybridizing with RNA derived from the test cell Alternatively, a method of detecting and measuring a signal derived from the marker label with a multi-bio imager STORM860 (Amersham Almacia Biotech) can also be used.
  • STORM860 Amersham Almacia Biotech
  • the presence or absence and expression level of the gene of the present invention in RNA can be detected and measured by using the marker of the present invention as a primer.
  • the marker of the present invention (a pair of primers) is prepared so that a cDNA can be prepared from RNA derived from a test cell according to a conventional method and the region of the target gene (the gene of the present invention) can be amplified using this as a cocoon.
  • the amplified double-stranded DNA is detected by a method of detecting by agarose gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining, and using the primers previously labeled with RI or a fluorescent substance.
  • the labeled double-stranded DNA produced by this method is detected, the produced double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and the labeled marker of the present invention is used as a probe to hybridize with this. Detection method can be used.
  • the produced labeled double-stranded DNA product can be measured with an Agilent 2100 Bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems).
  • RT-PCR reaction solution prepares an RT-PCR reaction solution according to the protocol using S YBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems) and react with ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems).
  • the reaction product can also be detected.
  • a DNA chip on which the marker of the present invention is attached as a DNA probe is prepared, and RNA is extracted from the test cell. And a method of detecting the double strand of DNA and cRNA formed by hybridization with the cRNA prepared by the above-described method by binding to a labeled probe prepared from the marker of the present invention.
  • a protein is used as a measurement target
  • the ES cell detection method of the present invention is performed by detecting the protein of the present invention (ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LOC38 0905 (TDRD4)) in a test cell.
  • ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LOC38 0905 (TDRD4) protein of the present invention
  • TDRD4 LOC38 0905
  • Whether a cell is an ES cell is determined by determining whether the test cell is V, the expression level (level) of the gene of the present invention, or the expression level (level) of the protein of the present invention. Be measured). Either the gene or protein of the present invention is expressed Or that the expression level is higher than that in somatic cells, it can be determined that the test cell is an ES cell. At that time, it is desirable to confirm that other ES cell-specific genes such as Oct3 / 4 and Nanog (ECAT4) are expressed.
  • ECAT4 Oct3 / 4 and Nanog
  • a somatic cell containing a gene in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression regulatory region of an ES cell-specific expression gene can only be used when the marker gene is converted into an ES-like cell.
  • conversion to ES-like cells can be easily monitored by expression of a marker gene such as drug resistance.
  • a marker gene such as drug resistance.
  • ES-like cells can be efficiently selected using the expression of the marker gene as an index.
  • the above-mentioned system of "easily monitoring the conversion to ES-like cells by the expression of a marker gene such as drug resistance” can be applied to screening of undifferentiated 'pluripotency-maintaining substances in ES cells.
  • a marker gene such as drug resistance
  • a test substance is added under culture conditions where the ES cell state cannot be maintained.
  • Marker gene By examining the presence or absence of the present cell, it is possible to easily screen for an ES cell undifferentiated / pluripotent maintenance (candidate) substance.
  • Patent applications have already been filed for the above screening methods and the like (Japanese Patent Application No. 2004-2).
  • the “gene of the present invention” sometimes refers to a genomic gene according to common technical knowledge.
  • the present invention provides the following steps (a) and (b):
  • step (b) after the step (a), the presence or absence of the marker gene-expressing cell is examined, and the test substance in which the cell is expressed is selected as a somatic cell nuclear reprogramming candidate substance;
  • a method for screening a somatic cell nuclear reprogramming substance is provided.
  • marker gene refers to all genes that enable selection and selection of cells by introducing the marker gene into cells. Specific examples include a drug resistance gene, a fluorescent protein gene, a luminescent enzyme gene, a chromogenic enzyme gene, or a gene related to a combination thereof.
  • drug resistance genes include neomycin resistance gene (neo), tetracycline resistance gene (tet), kanamycin resistance gene, zeocin resistance gene (zeo), hygromycin resistance gene (hygro) and the like. .
  • a selective medium By culturing the cells in a medium containing each drug (referred to as a selective medium), only cells in which the drug resistance gene has been introduced and expressed survive. Therefore, by culturing cells in a selective medium, it contains a drug resistance gene Cells can be easily selected.
  • fluorescent protein gene examples include GFP (green fluorescent protein) gene, YFP (yellow fluorescent protein) gene, RFP (red fluorescent protein) gene, equolin gene, and the like.
  • Cells expressing these fluorescent protein genes can be detected with a fluorescence microscope.
  • use the difference in fluorescence intensity to separate and select with a cell sorter, etc., or limit the number of cells to 1 cell per well or less.
  • the cells can be selected by detecting below.
  • colonies can be formed on a soft agar medium and selected under a fluorescence microscope.
  • the luminescent enzyme gene include a luciferase gene.
  • Cells expressing these luminescent enzyme genes can be detected by adding a luminescent substrate and measuring the amount of luminescence with a luminescence photometer.
  • chromogenic enzyme gene examples include a j8 galactosidase gene, a j8 dalk mouth nidase gene, an alkaline phosphatase gene, or a secreted alkaline phosphatase SEAP gene.
  • Cells expressing these chromogenic enzyme genes can be detected by adding a chromogenic substrate and observing the presence or absence of color development. In addition, cells are limited and diluted to 1 cell or less per well, then cultured and proliferated, and each cell is harvested.A part of the cells is collected, and the cells are selected by observing the color development by adding a chromogenic substrate. can do.
  • genes related to the combination of these marker genes include ⁇ geo gene, which is a fusion gene of neomycin resistance gene (neo) and ⁇ -galactosidase gene ( ⁇ -gal).
  • any of the above marker genes is well known to those skilled in the art, and vectors containing such marker genes are available from Invitrogen, Amersham Biosciences, Plug Mega, MBL (Medical and Biological Laboratories). Etc. are commercially available.
  • marker genes it is particularly preferable from the viewpoint of easy selection of cells.
  • “somatic cell” means all cells except undifferentiated 'pluripotency maintenance cells such as normal ES cells. Specifically, for example, (1) neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells such as sperm stem cells (somatic stem cells), (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelial cells, Differentiated cells such as muscle cells, fibroblasts, (4) ES cell force Undifferentiated cells by some technique ⁇ Cells that have lost pluripotency, (5) Fusion cells of somatic cells and ES cells ⁇ Non-pluripotent cells, etc.
  • somatic cells containing a gene in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression control region of the gene of the present invention are used as screening cells.
  • the “expression control region” refers to a region that regulates gene expression (transcription), and means a “promoter region” or a region including a “promoter and a cell region”.
  • a marker gene When using a marker (mouse) to make a marker gene exist, (3-1-2) When using a marker gene at the cell level without using an individual There is.
  • the marker gene When a marker gene is present using an individual (mouse), the marker gene is present at a position on the genome that is subject to expression regulation by the expression regulatory region of the gene of the present invention.
  • the gene of the present invention itself that the individual has may be present in an expressible form, or may be present in a form in which the gene of the present invention is destroyed.
  • the gene expression regulatory region is usually upstream of exon 1. Therefore, in order for the marker gene to be regulated by the expression regulatory region of the gene of the present invention, it is desirable that the marker gene is present in the downstream region from the exon 1 start site of the gene of the present invention. In this case, as long as it is downstream from the exon 1 start site, it may be present at any position. [0086] (3- 1-1- a) When disrupting the gene of the present invention
  • any method known to those skilled in the art may be used.
  • the most frequently used technique is to contain a marker gene and perform homologous recombination at an arbitrary position of the gene of the present invention.
  • a vector of the present invention hereinafter referred to as a targeting vector
  • a marker gene is present at this position instead.
  • the destruction of the gene of the present invention and the presence of the marker gene at that position is referred to as “knock-in of the marker gene to the gene of the present invention”.
  • the present invention includes the following (a) and (b):
  • step (b) after the step (a), examining the presence or absence of viable cells in a selective medium, and selecting a test substance that has produced the viable cells as a somatic cell nuclear reprogramming candidate substance;
  • a screening method for a somatic cell nuclear reprogramming substance comprising the steps of:
  • the promoter trap method is preferably used as a method for knocking in a marker gene.
  • the promoter trap method involves inserting a V or targeting vector without a promoter into the genome by homologous recombination, and if homologous recombination has occurred correctly, the endogenous promoter (promoter of the gene of the present invention) can be used as a marker gene. Is expressed.
  • the endogenous promoter promoter of the gene of the present invention
  • Genome sequence of the gene of the present invention necessary for targeting is determined. If the Genome IJ is already publicly known, such as Mouse Genome Resources (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/mouse/) Sequence information can be used for sequencing. If unknown, a part of the gene of the present invention described in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 33 is used as a primer. The genomic clones containing the desired genomic region of the gene of the present invention can be isolated and the genomic nucleotide sequence can be determined by screening a genomic library available to the user by PCR, etc. .
  • mouse BA bacterial artincial chromosome nofifuri ⁇ (Invitrogen)
  • PAC P1-dendried artificial chromosome fib? ⁇ (Invitrogen), etc.
  • the genomic region of the gene of the present invention to be replaced with the marker gene is determined (hereinafter referred to as the present gene genomic region A).
  • the 5 ′ side region (5 ′ arm) and 3 ′ side region (3 ′ arm) sandwiching the genomic region A of the present invention are amplified by PCR using genomic DNA as a cage.
  • examples of the genomic DNA to be a cage include genomic DNA of a mouse BAC clone containing the gene of the present invention.
  • PCR primers can be designed based on the genomic DNA sequence of the present invention. Insert the amplified 5 'arm and 3' arm on both sides of the promoter trap targeting vector marker gene cassette.
  • IRES internal ribosome entry site
  • ⁇ geo a fusion gene of ⁇ -galactosidase and neomycin resistance gene
  • IRES-Hygro cassette a fusion gene of ⁇ -galactosidase and neomycin resistance gene cassette
  • the IRES-Hygro cassette can be prepared by replacing the ⁇ geo part of the IR ES- ⁇ geo cassette with Hygro (Invitrogen).
  • the prepared targeting vector is digested with a restriction enzyme to linearize it, and this is introduced into ES cells by means of an electoral position or the like.
  • ES cells used for introduction include RF8 cells (Meiner, V. et al., Proc. Natl. Acad.
  • ES cells into which the targeting vector has been introduced are selected based on the characteristics of the marker gene used (for example, a drug resistance gene).
  • the correct homologous recombination has occurred in the selected ES cells can be confirmed by Southern plot using a part of the gene of the present invention as a probe.
  • an ES cell containing a gene obtained by knocking in a marker gene into the gene of the present invention (genomic gene) can be prepared.
  • any medium known to those skilled in the art may be used for culturing ES cells.
  • the following composition 15% FBS, O.lmM Non Essential Amino Acids (GIBCO BR L), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml penicillin-streptomycin, 0.1 ImM 2-ME (GIBCO BRL) / Dulbecco's Examples include Modified Eagle Medium (DMEM) medium.
  • DMEM Modified Eagle Medium
  • Commercially available prepared media for example, Dainippon Pharmaceutical No.R-ES-101 can also be used.
  • the feeder cell is a fibroblast prepared from a mouse embryo by a conventional method or a fibroblast-derived STO cell line (Meiner, V. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14041-14046 (1996)) or commercially available products may be used.
  • a fibroblast-derived STO cell line or commercially available products may be used.
  • commercially available products include feeder cells such as PMEF-N, PMEF-NL, PMEF-H, and PMEF-HL (Dainippon Pharmaceutical). It is desirable that feeder cells be used for ES cell culture after growth is stopped by mitomycin C treatment.
  • the culture can be performed with LIF (Leukemia Inhibitory Factor) added.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • mouse recombinant LIF rat recombinant LIF (such as Chemicon) are used.
  • an ES cell containing the targeting vector is introduced into a mouse to produce a knockout mouse (marker gene knockin mouse).
  • the marker gene knock In-mouse production methods are well known to those skilled in the art. Specifically, chimera is obtained by infecting the ES cells into blastocysts of mice (eg C57BL / 6 etc.) and transplanting them into the pupae of pseudo-pregnant female mice (ICR etc.). Mice are made. Thereafter, a chimeric mouse and a normal mouse (C57BL / 6, etc.) are mated to produce a heterozygous mutant mouse in which the marker gene is heterozygously knocked in. By crossing heterozygous mutant mice, homozygous mutant mice in which a single marker gene is knocked in homozygously can be obtained.
  • ECAT3 knock-in mice (Tokuzawa, Y., et al, Molecular and Cellular Biology, 23 (8): 2699-2708 (2003)), ECAT4 knock-in mice (Mitsui, K., et al , Cell, 113: 631-642 (2003)), ECAT5 knock-in mouse (Takahas hi, K., K. Mitsui, and S. Yamanaka, Nature, 423 (6939): p541-545 (2003), JP 2003 -Please refer to 265166).
  • somatic cells used in the screening for a somatic cell nuclear reprogramming substance of the present invention include somatic cells isolated from the above-mentioned hetero knock-in mice and somatic cells isolated from homo-knock-in mice.
  • a marker gene is placed at a position that is regulated by the expression regulatory region of the gene of the present invention.
  • One example is a technique that uses a transgenic non-human animal produced by introducing an existing BAC vector or PAC vector into an individual such as a mouse or rat.
  • the BAC vector will be described below as an example.
  • the BAC clone containing the expression control region of the gene of the present invention used here is simply based on the sequence information of the gene of the present invention. Can be identified.
  • a part of the gene of the present invention can be easily replaced with a marker gene using, for example, Red / ET Recombination (Gene Bridges).
  • the expression control region of each gene of the present invention is usually present upstream of exon 1 of the gene of the present invention. Therefore, in order for the marker gene to be regulated by the expression regulatory region of the gene of the present invention, the marker gene must be an exogene of the gene of the present invention. It is desirable to exist in the downstream area. In this case, the marker gene may be present at any position on the gene of the present invention as long as it is downstream from exon 1.
  • a BAC vector in which a marker gene is present at a position where expression regulation is performed by the expression regulatory region of the gene of the present invention produced as described above (hereinafter sometimes referred to as a marker gene-containing BAC vector).
  • Methods for producing the introduced transgenic animals are well known, and can be produced, for example, based on the experimental medicine separate volume “New Genetic Engineering Handbook Revised 3rd Edition” (Yodosha, 1999). In the following, the production of transgenic animals will be described using mice as examples.
  • the method for introducing a gene into a mouse fertilized egg is not particularly limited, and it can be introduced by a microinjection method, an electo-poration method, or the like. After the introduction, the obtained egg cells are cultured, transplanted to the oviduct of the temporary parent mouse, and then the transplanted mouse ⁇ ! Is bred and the desired pup mouse power is selected. The selection can be performed, for example, by examining the feasibility of the transgene using DNA derived from a pup mouse by the dot blot hybridization method or the PCR method.
  • the pup mouse and wild type mouse are mated to produce a heterotransgenic mouse (a mouse containing the introduced gene by heterogene).
  • a heterotransgenic mouse a mouse containing the introduced gene by heterogene.
  • a somatic cell isolated from the heterotransgenic mouse or a somatic cell isolated from a homotransgenic mouse can be used.
  • a somatic cell derived from a homotransgenic mouse because the gene of the present invention inherent in the mouse has not been destroyed.
  • double transgenic mice can be produced by mating transgenic mice with different ECAT genes.
  • each transgenic mouse to be bred contains a different marker gene.
  • the somatic cells isolated from the above knock-in mice or transgenic mice may be any cells (or those with low expression levels) that express the marker gene. Yes.
  • Specific examples include cells other than pluripotent cells such as ES cells, such as (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, sperm stem cells, ( 2) Tissue progenitor cells, or (3) Differentiated cells such as lymphocytes, epithelial cells, muscle cells, fibroblasts.
  • a gene may be present.
  • a method of introducing a vector containing a marker gene into a cell can be mentioned.
  • the cells used for gene transfer may be somatic cells or ES cells.
  • the somatic cells used here may be somatic cells derived from any species such as mouse, human, monkey and the like.
  • the somatic cells may be primary cultured cells or established cell lines.
  • primary cultured cells such as fetal fibroblasts (MEF), bone marrow-derived mesenchymal stem cells, or sperm stem cells, Examples include cell lines such as NIH3T3.
  • ES cells from human monkeys can also be used as ES cells.
  • examples of human ES cells include KhES-l, KhES-2, and KhES-3 (Kyoto University Research Institute for Stem Cell Medicine), and monkey ES cells include force-quizal ES cells ( Asahi Techno Glass).
  • KhES-l KhES-l
  • KhES-2 KhES-2
  • KhES-3 Kyoto University Research Institute for Stem Cell Medicine
  • monkey ES cells include force-quizal ES cells ( Asahi Techno Glass).
  • a normal introduction method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electo-poration method, and a method using a gene-specific liquid (Lipofectamine; Lipofectin; Invitrogen).
  • vectors used for the introduction include BAC vectors, PAC vectors, plasmid vectors, and the targeting vectors described in (3-1-1) above, which are vectors capable of cloning up to about 300 kb of DNA.
  • BAC vectors PAC vectors
  • plasmid vectors plasmid vectors
  • targeting vectors described in (3-1-1) above which are vectors capable of cloning up to about 300 kb of DNA.
  • a marker gene can be present at a position where expression control is performed by the gene expression control region of the present invention.
  • the following is an explanation using the BAC vector as an example.
  • the BAC clone containing the expression control region of the gene of the present invention used here (hereinafter referred to as the gene-containing BAC clone of the present invention) is based on the sequence information of the gene of the present invention as described in (3-1-1) above. Isolated 'can be identified.
  • a part of the gene of the present invention can be easily replaced with a marker gene using, for example, Red / ET Recombination (Gene Bridges).
  • the expression control region of each gene of the present invention is usually present upstream from exon 1 of the gene of the present invention.
  • the marker gene is preferably present in the downstream region from the exon 1 start site of the gene of the present invention.
  • the marker gene may be present at any position on the gene of the present invention as long as it is downstream from the exon 1 start site.
  • the body for screening of the present invention can be obtained by introducing a BAC vector in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression regulatory region of the gene of the present invention produced as described above. It can be a cell.
  • the BAC vector introduced here may be one type or two or more types of BAC vectors containing different genes of the present invention. It is preferable that a gene containing a drug resistance gene (hereinafter referred to as a second drug resistance gene) is inserted into the BAC vector so that the BAC vector-introduced cell can be easily selected in a selective medium.
  • the second drug resistance gene is a different type of drug resistance gene which may be the same type of drug resistance gene as the marker gene present in the position where expression is regulated by the expression control region of the gene of the present invention. However, it is desirable that the drug resistance gene is of a different type.
  • a loxP sequence or FRT sequence is added to both sides of the second drug resistance gene, BAC vector-introduced cells are selected in a selective medium, and recombinase is then added.
  • a second drug resistance gene can be excised with Cre or FLP.
  • a second expression vector containing the second drug resistance gene is co-transfection with the BAC vector
  • a BAC vector in which a marker gene is present at a position subject to expression regulation by the expression regulatory region of the gene of the present invention is introduced into an ES cell
  • the marker gene is introduced based on the properties of the marker gene used.
  • Expressing ES cells can be selected. Thereafter, the ES cells can be differentiated into somatic cells to obtain somatic cells for the screening of the present invention. Since ES cells differentiate under culture conditions in the absence of feeder cells, differentiation is performed using somatic cells obtained by differentiation under such conditions, or differentiation inducers known to those skilled in the art, such as retinoic acid. Thus obtained somatic cells can be used in the screening of the present invention.
  • somatic cells in which the ES cell force is also distributed include, for example, tissue stem cells, tissue progenitor cells, or somatic cells (neural cells, skin keratinocytes, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, blood cells, splenocyte cells, or pigment cells). Etc.).
  • the screening cell of the present invention can be prepared by inserting a fusion gene of the expression regulatory region of the gene of the present invention and a marker gene into a plasmid vector having no promoter and transforming the cell.
  • vectors used here include pBluescript (Stratagene) and pCR2.1 (Invitrogen)! No plasmid promoter! /, Plasmid vectors.
  • Examples of the expression control region of the gene of the present invention used here include about 1 kb upstream, preferably about 2 kb upstream of the transcription start site of the gene.
  • the expression regulatory region of each gene of the present invention is, for example, (i) 5'-RACE method (for example, carried out using 5'foll Race Core Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.)), oligo cap method, Step of determining the 5 'end by the usual method such as S1 primer mapping; (ii) Obtaining the 5'-upstream region using Genome Walker Kit (Clontech) etc. And a step of measuring the promoter activity.
  • the marker gene is fused to the 3 'side of the expression control region of the gene of the present invention identified above and inserted into the plasmid vector, the marker gene is present at a position that is subject to expression control by the expression control region of the gene of the present invention.
  • the prepared plasmid vector can be prepared.
  • the somatic cell for screening of the present invention can be prepared by introducing the vector prepared as described above into a somatic cell or ES cell in the same manner as in the above (3-l-2-a).
  • the somatic cells for screening of the present invention can also be prepared by introducing the targeting vector described in (3-1-1) above into somatic cells or ES cells.
  • a gene containing a drug resistance gene (No. 1) as in (3-1-2-a) so that the vector-introduced cell can be easily selected in a selective medium.
  • Second drug resistance gene is present on the targeting vector, or a second expression vector containing the second drug resistance gene is co-transfected with the targeting vector and co-transfected in the selective medium. More preferably, somatic cells obtained by selection are used in the screening of the present invention. In that case, it is desirable to introduce the target vector using a large excess of the targeting vector rather than the second expression vector.
  • a marker gene introduced 'expressing cell can be selected based on the nature of the marker gene above the targeting vector (for the production method, see Tokuzawa, Y., et al., Molecular and Cellular Biology, 23 (8): 2699-2708 (2003)).
  • the method of induction from ES cells into somatic cells is the same as in (3-1-2-a) above.
  • the somatic cells prepared as described above are brought into contact with the test substance.
  • test substance used here is not limited, but may be a nucleic acid, a peptide, a protein, an organic compound, an inorganic compound, a mixture thereof, or the like.
  • the test substance is contacted with the somatic cell.
  • More specific examples of powerful test substances are cell extracts, gene (genome, cDNA) libraries, RNAi libraries, antisense nucleic acids, genes (genome, cDNA, mRNA), tags Examples include proteins, peptides, low molecular compounds, high molecular compounds, natural compounds, and the like. More specifically, ES cells, eggs, ES cell and egg cell extracts (extracted fractions), ES cell and egg-derived cDNA libraries, genomic libraries or tanks as shown in the reference examples described later. For example, a protein library or a growth factor.
  • cDNA libraries As described above, undifferentiated cells such as ES cells and eggs are preferred as the origin of cDNA libraries, protein libraries or cell extracts (organic compounds, inorganic compounds, etc.).
  • cDNA library preparation kit for example, a clone minor cDNA library preparation kit (Invitrogen), a Creator SMART cDNA library preparation kit (BD Biosciences), etc.
  • a protein library can be prepared with reference to WO 00/71580 and the like.
  • test substances are brought into contact with somatic cells in a form that can be taken up by somatic cells.
  • the test sample is a nucleic acid (such as a cDNA library)
  • RF8 cells For example, in the case of RF8 cells, the following composition: 15% FBS, O.lmM Non Essentia 1 Amino Acids (GIBCO BRL), 2 mM L—glutamine ⁇ 50 U / ml penicillin—streptomycin, 0.1 ImM 2-ME (GIBCO BRL) / Examples include Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Alternatively, a commercially available prepared medium (for example, Dainippon Pharmaceutical No.R-ES-101) can be used.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • a commercially available prepared medium for example, Dainippon Pharmaceutical No.R-ES-101 can be used.
  • the feeder cell is a fibroblast prepared from a mouse embryo by a conventional method or a fibroblast-derived STO cell line (Meiner, V. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14041-14046 (1996)) or commercially available products may be used. Examples of commercially available products include feeder cells such as PMEF-N, PMEF-NL, PMEF-H, and PMEF-HL (Dainippon Pharmaceutical). One feeder cell is my It is desirable to use it for ES cell culture after growth is stopped by treatment with tomycin C.
  • the culture can be performed with LIF (Leukemia Inhibitory Factor) added.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • Examples of LIF include mouse recombinant LIF and rat recombinant LIF (such as Chemicon).
  • the culture days under the ES cell culture conditions are preferably about 1 to 3 days with a force that can be appropriately changed depending on the state of the cells.
  • a gene containing a drug resistance gene is used as a marker gene
  • selection is performed in a medium (selective medium) containing the corresponding drug.
  • the drug may be contained in the medium at the time of contact between the somatic cell and the test substance, or may be contained after the contact. Furthermore, after culturing under ES cell culture conditions, the drug may be included in the medium.
  • step (b) After the step, the presence or absence of the marker gene-expressing cell is examined, and the test substance in which the cell appears is selected as a candidate substance for a somatic cell nuclear reprogramming substance (step (b)).
  • step (b) The process (b) is described below.
  • the marker gene-expressing cells can be selected by culturing in a selective medium as described above.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • the marker gene expression is observed by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, and in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate. Cells can be detected.
  • test sample used here is the somatic cell nuclear reprogramming substance.
  • test substance is the somatic cell nuclear reprogramming substance.
  • the screening can be repeated as many times as necessary. For example, if a cDNA library or cell extract and a mixture are used in the first screening, the mixture is further subdivided (fractionated) and the same screening is repeated after the second time. Finally, a candidate substance for a somatic cell nuclear reprogramming factor can be selected. [0120] As an example for increasing the efficiency of screening, screening in which a test substance is added to a fused cell in which a somatic cell and an ES cell are fused without using the somatic cell as it is for screening. The system is effective. That is, the screening method of the present invention includes
  • step (b) after the step (a), the presence or absence of the marker gene-expressing cell is examined, and the test substance in which the cell is expressed is selected as a somatic cell nuclear reprogramming candidate substance;
  • a method for screening a somatic cell nuclear reprogramming substance is also included.
  • fusion cell refers to a cell that is a fusion cell of a somatic cell and an ES cell and expresses the marker gene! /, Na! (Or low expression level! /). If the number of colonies increases when a test substance is added as compared to the number of colonies of ES-like cells generated by fusing somatic cells and ES cells, the test substance is selected as a candidate for somatic cell nuclear reprogramming It can be done.
  • somatic cell nuclear reprogramming (candidate) substance selected in the screening of the present invention has the ability to reinitialize the somatic cell nucleus is determined by (1) the somatic cell force is also converted by the nuclear reprogramming (candidate) factor.
  • ES-like cells express ES cell marker genes such as Oct3 / 4 or Ecat4 (Nanog), and (2) whether the ES cells can be differentiated in vitro by retinoic acid stimulation, etc. (3) It can be confirmed by injecting the ES cells into a mouse blast cyst and examining whether or not a chimeric mouse is born.
  • the present invention relates to a knock-in mouse containing a gene obtained by knocking in a marker gene into the ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene, and a body used in the screening of the present invention for the mouse. It provides use as a source of cells.
  • the method for producing the knock-in mouse and the like are as described in (3-1) Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance of the present invention.
  • the present invention provides a somatic cell containing a gene in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression control region of the gene of the present invention. That is, the present invention provides a somatic cell containing a gene in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression regulatory region of the ECA T15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene.
  • ECA T15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene will provide a. Specific examples include somatic cells containing a gene obtained by knocking in a marker gene into the ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, RnH7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene.
  • the somatic cell production method and the like are as described in (3-1) Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance of the present invention.
  • the somatic cell of the present invention is effectively used in the screening method of the present invention or the ES-like cell selection method of the present invention described later.
  • the present invention also provides the following steps (a) and (b):
  • Somatic cells in which a marker gene is present at a position that is subject to expression regulation by the expression regulation region of the gene of the present invention as described in the screening method of the present invention are also effective for selection of ES-like cells.
  • ES-like cells that appear by stimulating human somatic cells with a nuclear reprogramming substance are separated (purified) from other cells (somatic cells) and used for later treatment. It is desirable.
  • the present invention Since the system can easily select ES-like cells using the expression of marker genes such as drug resistance genes as an index, it can be used effectively when selecting and separating ES-like cells.
  • the ES-like cell selection method of the present invention can be used to select (separate) ES cells not only in the aforementioned human treatment but also in various in vitro and in vivo ES cell-related studies. It can also be used for purposes.
  • a method for producing a somatic cell containing a gene in which a single gene is present at a position subject to expression regulation by the expression regulatory region of the gene of the present invention 2) the somatic cell and the somatic cell nucleus initial stage
  • the method for contacting with an activating substance and 3) the method for selecting a marker gene-expressing cell are all the same as those described in “(3-1) Screening method for somatic cell nuclear reprogramming substance of the present invention”.
  • the marker gene-expressing cells can be easily selected (separated) by culturing in a selective medium.
  • the cell when a fluorescent protein gene, luminescent enzyme gene, or chromogenic enzyme gene is used as a marker gene, the cell can be selected (separated) by using a cell sorter, limiting dilution method, or soft agar colony method. I'll do it.
  • nuclear reprogramming substance refers to a substance involved in somatic cell nuclear reprogramming as obtained by screening of the somatic cell nuclear reprogramming substance.
  • the marker gene-expressing cell is selected as an ES-like cell by using the ES cell itself as a somatic cell nuclear reprogramming substance.
  • the somatic cell used in the selection method for ES-like cells is a vector in which a marker gene is inserted at a position where expression regulation is performed by the expression regulatory region of the gene of the present invention in consideration of human treatment. It is desirable to be a human somatic cell containing Specifically, somatic cells prepared as follows are used.
  • somatic cells are first prepared by isolating them from humans.
  • somatic cells include somatic cells involved in diseases and somatic cells involved in disease treatment.
  • Any of the vectors described in the above section (3-1-2) is introduced into the human somatic cell.
  • a BAC vector a marker gene is placed downstream of the expression control region of the gene of the present invention. It is desirable to introduce the existing BAC vector) or PAC vector.
  • the BAC vector (PAC vector) introduced here may be one type or two or more types of BAC vectors containing different genes of the present invention.
  • ES-like cells are selected according to the nature of the marker gene used. For example, when a drug resistance gene is used as a marker gene, ES-like cells can be easily selected using drug resistance as an index by selecting in a selective medium after adding a nuclear reprogramming substance.
  • the present invention provides the following steps (a) and (b):
  • ES cell undifferentiation ⁇ Provide a screening method for pluripotency maintenance substance.
  • ES cells in which a marker gene is present at a position that is subject to expression regulation by the expression regulatory region of the gene of the present invention were cultured in a medium that could not maintain the state of ES cells (undifferentiated / pluripotent). In some cases, the expression of the marker gene disappears or decreases. On the other hand, if there is an ES cell undifferentiated / pluripotency-maintaining substance in the medium, the marker gene expression continues. By utilizing this property, ES cell undifferentiated 'pluripotency maintenance (candidate) substances can be easily screened.
  • the ES cell used in the screening step (a) is any ES cell containing a gene in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression regulatory region of the gene of the present invention. It may be a thing. Specifically, for example, the ES cell derived from the knock-in mouse described in the above (3-1-1-a), or the transgenic mouse described in the above (3-1-1-b). ES cell, BAC vector described in (3-1-2-a) above Alternatively, an ES cell containing a PAC vector, an ES cell containing the plasmid vector described in (3-1-2-b) above, or a targeting vector described in (3-l-2-c) above Examples thereof include ES cells.
  • the "medium incapable of maintaining undifferentiated / pluripotent ES cells" used in the screening step (a) is a medium that cannot maintain the state of ES cells, and maintains the undifferentiated state. Any medium that can not be used may be used.
  • mouse ES cells are known to require serum or feeder cells to maintain (undifferentiated and maintain pluripotency) at low density. Examples include conditions in which cells or both are removed.
  • feeder cells are essential for maintaining human ES cells (maintaining undifferentiated 'pluripotency), and thus the culture conditions of human ES cells include conditions where feeder cells are removed.
  • cells that can be separated even in the presence of a feeder cell appear, and therefore, culture conditions in the presence of a feeder cell may be used.
  • Serum Examples include conditions where the feeder cells or both of them are removed.
  • the step (a) is performed by contacting the ES cell with a test substance in a medium that cannot maintain the undifferentiated pluripotency of the ES cell.
  • Test substance is contacted with ES cells before, during, or after transferring ES cells to undifferentiated, pluripotent non-maintenance medium.
  • Test substances (test samples) used in this screening are limited. It is not a nucleic acid, peptide, protein, organic compound, inorganic compound, or a mixture thereof, and the screening of the present invention is specifically carried out by contacting these test substances with the ES cells. .
  • test substances include cell secretion products, serum, cell extract, gene (genome, cDNA) library, RNAi library, nucleic acid (genome, cDNA, mRNA), antisense nucleic acid, low molecular weight compound, polymer
  • gene gene (genome, cDNA) library
  • RNAi library nucleic acid (genome, cDNA, mRNA)
  • antisense nucleic acid low molecular weight compound
  • polymer examples include compounds, proteins, peptides, and natural compounds. Specific examples include animal serum or a fraction thereof, a secreted product of a feeder cell or a fraction thereof.
  • test substances are in contact with somatic cells in a form that can be taken up by somatic cells. Make it.
  • the test substance is a nucleic acid (such as a cDNA library)
  • a gene containing a drug resistance gene is used as a marker gene
  • selection is performed in a medium (selective medium) containing the corresponding drug.
  • the drug may be contained in the medium at the time of contact between the ES cells and the test substance, or may be contained after the contact. Furthermore, after culturing in an undifferentiated / pluripotent non-maintenance medium for ES cells in the presence of a test substance, the drug may be contained in the medium.
  • step (b) After the step (a), the presence or absence of marker gene-expressing cells is examined, and the test substance in which the cells are present is selected as a candidate substance for ES cell undifferentiation / pluripotency maintenance (step ( b)).
  • the step (b) is as described in “(3-1) Screening method for a somatic cell nuclear reprogramming substance of the present invention”. If marker gene-expressing cells are observed, the test sample (test substance) used here is selected as a candidate substance for maintaining undifferentiated / pluripotent ES cells.
  • the screening can be repeated as many times as necessary. For example, when a mixture of feeder-cell-secreted products and serum is used in the first screening, the mixture is further subdivided (fractionated) and the same screening is repeated after the second time. Finally, a candidate substance for maintaining undifferentiated pluripotency of ES cells can be selected.
  • an ES cell proliferation promoting substance may be selected together with an ES cell undifferentiated / pluripotency maintaining substance. That is, when a certain mixture (fraction A) is subjected to the screening method of the present invention, when viable cells are confirmed and the number of cells of the viable cells increases, the ES cells are undifferentiated in the fraction. 'It is thought that ES cell growth-promoting substances are included along with pluripotency maintenance substances (of course, one substance may have both properties). In that case, when fraction A is further fractionated and one fraction (fraction B) is subjected to the screening of the present invention, viable cells are confirmed, but no increase in the number of cells is observed.
  • fraction C When the other fraction (fraction C) was subjected to the screening of the present invention, when no viable cells were observed, fraction B contained an ES cell undifferentiated / pluripotent maintenance substance, Fraction C contains ES cells It is considered that a growth promoting substance is included.
  • the screening of the present invention is also useful for selection of such ES cell proliferation promoting (candidate) substances.
  • an ES cell immortalization maintaining substance should be selected in the same manner as the ES cell growth promoting (candidate) substance.
  • ES cell undifferentiated 'pluripotency maintenance selected by the screening of the present invention (candidate) Whether or not a substance maintains ES cell undifferentiation ⁇ ES cell undifferentiation ⁇ ES cell undifferentiation ⁇ This can be confirmed by culturing ES cells under culture conditions in which the candidate substance is added in a medium that cannot maintain pluripotency, and examining various abilities as ES cells.
  • ES cells cultured under the above culture conditions (1) Oct3 / 4 or Ecat4 (Nanog) t ⁇ , whether or not the ES cell marker gene is expressed, (2) ES It can be confirmed by examining whether cells differentiate in vitro by stimulation with retinoic acid, etc., and (3) injecting the ES cells into mouse blast cysts to produce chimeric mice.
  • the present invention provides an ES cell containing a gene in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression control region of the ECAT gene. That is, the present invention relates to an ES cell containing a gene in which a marker gene is present at a position where expression is regulated by the expression regulatory region of ECA T15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, Rnfl7 gene or LOC380905 (TDRD4) gene.
  • the method for producing the ES cell is as described in detail in (3-1) above.
  • the ES cell of the present invention is effectively used in a screening method for an ES cell undamaged / pluripotent maintenance substance.
  • the present invention provides a conjugate of a protein containing any of ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LOC380905 (TDRD4) and a substance that promotes the uptake of the protein into cells.
  • the protein of the present invention is a protein specifically expressed in ES cells found by the same analysis method as ECAT4 (Nanog) and ECAT5 (ERas), and is involved in maintaining the functions of ES cells. ing. In order to exert such actions related to maintenance of ES cell functions, a conjugate of the protein of the present invention and a substance that promotes uptake into various cells is effectively used.
  • the “substance that promotes uptake into cells” may be either a protein or a chemical substance.
  • the substance for promoting uptake into cells is a protein (peptide)
  • it can be in the form of a fusion protein of the protein and the protein of the present invention.
  • the protein for promoting uptake into the cell (peptide) include the following G) to Gii):
  • HIV-derived TAT Green and Loewnstein, Cell, 56 (6), 1179-88 (1988), Frankel and Pabo, Cell, 55 (6), 1189-93 (1988)
  • Drosophila Antenna Pedia's homeodomain Vives et al., J. Biol. Chem, 272 (25), 16010-7 (1997)
  • VP22 derived from HSV Ell iott and O'Hare, Cell, 88 (2), 223-33 (1997)
  • HIV Rev fragment virus Rev fragment
  • FHV Coat flock house virus Coat
  • BMV Gag brome mosaic virus Gag
  • HTLV—II Rex human T cell leukemia—II Rex
  • cowpea chlorotic mottle virus Fragment of Gag CCMV Gag
  • P 22 N fragment of ⁇ ⁇
  • ⁇ 21 ⁇ ⁇ ⁇ or fragment of yeast PRP6 J. Biol. Chem., 276, 5836-5840 (2001)
  • the protein transduction domain (hereinafter referred to as "PTD") having the ability to penetrate the cell membrane has been identified as the fragment in (i) above, the HIV TAT fragment, which is the protein transduction domain, and the antenna peptide are identified.
  • the fragment of the deia homeodomain and the fragment of HSV V P22 include those fragments having these PTD forces. It is known that it can be introduced into cultured cells by fusing a heterologous protein and PTD, and its production method is also known (Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (2), 664-8 (1994), Elliott and O'Hare (1997), Phelan et al., Nature Biotech.
  • HIV TAT fragments include those described in the above-mentioned known literatures, and the HIV TAT fragment described in Patent No. 2702285 is preferred.
  • the HIV Rev fragment in (ii) above is HIV Rev- (34-50) peptide
  • the FHV Coat fragment is FHV Coat- (35-49) peptide
  • the BMV Gag fragment is Examples of BMV Gag- (7-25) peptide and HTLV-II Rex fragment include HTLV-II Rex- (4-16) peptide.
  • CCMV Gag fragment is CC MV Gag- (7-25) peptide
  • P22 N fragment is P22 N- (14-30) peptide
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ fragment is ⁇ ⁇ - (1-22)
  • the peptide has ⁇ 21N-(12-29) peptide strength as a fragment of ⁇ 21N and yeast PRP6- (129-144) peptide strength as a fragment of yeast PRP6, respectively.
  • a plurality of amino acids may be substituted with arginine.
  • the intracellular uptake-promoting protein may be fused to either the N-terminal side or the C-terminal side of the protein of the present invention, but is preferably fused to the N-terminal side of the protein of the present invention.
  • a linker sequence may be inserted between the protein for promoting uptake into cells and the protein of the present invention.
  • the fusion protein can be produced by preparing an expression vector containing a polynucleotide encoding the fusion protein by a conventional method and introducing it into an appropriate host cell (see below for specific examples of expression vectors and cells). (See (5) and (6) above). In addition, for example, in vitro synthesis using the PureGene system, It can be refined.
  • the intracellular uptake promoting substance is a chemical substance
  • examples of the chemical substance include compounds having binding activity to P-glycoprotein and branched peptides having arginine.
  • examples of the “compound having binding activity to P glycoprotein” include BCRP inhibitors. Specifically, for example, BCRP inhibitor GF120918 and the like can be mentioned.
  • BCRP inhibitor GF120918 and the like By chemically binding the compound of the present invention to a compound having binding activity to P-glycoprotein and the protein of the present invention, the chemical conjugate is taken up specifically in various somatic stem cells called SP cells.
  • the “branched peptide having arginine” mentioned above has, for example, about 8 argins having cell membrane permeability as described in the literature (Biochemistry, 41, 7925-7930, (2002). This is a branched peptide. Specifically, the (R) peptide and (RG
  • Examples of the binding method between the protein of the present invention and a substance that promotes the uptake of the protein into cells include covalent bonds and ionic bonds.
  • covalent bonds for example, in the case of ionic bonding, an electrostatic complex with collagen, an electrostatic complex with N-acetyl-chitosan and the like can be mentioned.
  • the present invention provides an ES cell function maintenance agent comprising a protein of the present invention (ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LO C38090 5 (TDRD4)), or a protein containing any of them as an active ingredient. provide.
  • a protein of the present invention ECAT15-1, ECAT15-2, ECAT16, Rnfl7 or LO C38090 5 (TDRD4)
  • TDRD4 LO C38090 5
  • the protein of the present invention is a protein specifically expressed in ES cells found by the same analysis method as ECAT4 (Nanog) and ECAT5 (ERas), and is involved in maintaining the functions of ES cells.
  • “maintaining ES cell function” means maintaining ES cell undifferentiated ability, maintaining ES cell pluripotency, maintaining ES cell proliferative ability, maintaining ES cell immortalized state, or non-ES cell. It means that it is involved in the maintenance of ES cell function (ES-like cell formation, somatic cell nuclear reprogramming) upon introduction. In particular, it is involved in maintaining the undifferentiated ability of ES cells and maintaining the proliferative ability of ES cells.
  • the protein of the present invention as an active ingredient (ECAT15-1, ECAT15_2, ECAT16, RnH7 or As the protein containing LOC380905 (TDRD4), the protein of the present invention itself can be used, or a conjugate with a substance that promotes uptake into cells can be used. Can be introduced into cells in a form that can be taken up into cells well known to those skilled in the art.
  • Cell transfer in the form of protein is reversible, unlike irreversible gene transfer (incorporation into the chromosome), and it can be added to the medium only when necessary, and removed from the medium if unnecessary. And it has the merit.
  • a polynucleotide containing the gene encoding the protein or conjugate (fusion protein) of the present invention can also be used as an active ingredient of a function maintenance agent for ES cells.
  • the expression vector can be appropriately selected according to the host to be used, the purpose, and the like, and examples thereof include a plasmid, a phage vector, and a virus vector.
  • plasmid vectors such as pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, and pRc / CMV, and viruses such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors.
  • the vector may contain factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a marker gene for selection, and a terminator. Further, it may contain a gene encoding a marker protein (marker gene).
  • factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a marker gene for selection, and a terminator. Further, it may contain a gene encoding a marker protein (marker gene).
  • the "marker gene” refers to a gene that can distinguish between a target gene-introduced cell and a non-introduced cell.
  • fluorescence of CFP or YFP that is a mutant of GFP or GFP examples include protein genes, drug resistance genes, luminescent enzyme genes, and chromogenic enzyme genes.
  • a marker gene-added vector By introducing such a marker gene-added vector into cells, cells expressing the gene of the present invention can be easily detected and selected.
  • an expression vector containing the gene of the present invention can be prepared using a conditional gene expression control system.
  • a conditional gene expression control system For example, a forced expression system that expresses the target gene introduced in the presence of tetracycline and does not express it in the absence of coexistence. (Niwa et al., (2000). Nat Genet 24, 372-6.)
  • a recombinase Cre-loxP system or a recombinase FLP-FRT system can be used as a system for turning on / off the expression of a target gene.
  • the vector may be a vector having a property of disappearing under certain conditions.
  • a pCAG-IP vector can be mentioned.
  • Examples of methods for introducing cells include the calcium phosphate method, DEAE-dextran method, eletroporation method, a method using a lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL), and microinduction. And known methods such as an electric pulse method.
  • the agent for maintaining the function of ES cells of the present invention is introduced into various mammalian cells.
  • mammalian cells as used herein means cells derived from mammalian tissues such as humans, monkeys, mice, and rats, such as organs. good.
  • the cell type may be an undifferentiated 'pluripotent maintenance cell such as an ES cell, or a somatic cell ((a) tissue stem cell such as neural stem cell, hematopoietic stem cell, mesenchymal stem cell, sperm stem cell ( Somatic stem cells), (b) tissue progenitor cells, (c) differentiated cells such as lymphocytes, epithelial cells, muscle cells, fibroblasts, etc.). Details of these cells are as described in (3) Screening for somatic cell nuclear reprogramming substances or ES cell undifferentiated / pluripotency maintaining substances.
  • the amount of the ES cell function maintenance agent of the present invention to be added to the cell is a force that can be appropriately adjusted depending on the cell type, the number of cells, etc. 0.0001 ⁇ to 1000 ⁇ in the normal medium, preferably 0.0001 ⁇ -10 ⁇ , more preferably 0.0001 ⁇ -1 ⁇ , which is added to the cells as necessary.
  • the agent for maintaining the function of ES cells of the present invention is effectively used as a therapeutic agent or reagent in regenerative medicine and as a research reagent related to regenerative medicine.
  • the present invention includes the following (a) to (d):
  • the polynucleotide of ECAT16 gene which consists of one of these is provided.
  • the ECAT16 gene of the present invention is a long transcription product in which a known gene, the Rnfl7 gene and the LOC380905 gene are linked in overlapping portions, and is a novel gene discovered by the present inventors.
  • ECAT16 gene specifically refers to the force exemplified by the mouse ECAT16 gene containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
  • a gene encoding a protein having 70% or more homology with the mouse ECAT16 gene containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 and a complement of the mouse ECAT16 gene containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17 A gene that hybridizes under stringent conditions to the chain and encodes a protein having the function of ECAT16 is also included in the category of the ECAT16 gene of the present invention.
  • a specific example of such a gene is the human ECAT16 gene (SEQ ID NO: 33).
  • the human ECAT16 gene containing the base sequence described in SEQ ID NO: 33 has 70% or more homology, Furthermore, it hybridizes under stringent conditions to a gene encoding a protein having the function of ECAT16 and the complementary chain of the human ECAT16 gene containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33, and has the function of ECAT16 A gene encoding a protein is also included in the category of the ECAT16 gene of the present invention.
  • the Rnfl7 gene and the LOC380905 gene are not included in the category of the “ECAT16 gene”.
  • a polynucleotide having 70% or more homology specifically means A polynucleotide containing a base sequence having a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with respect to the base sequence represented by the SEQ ID NO: Point to.
  • the “stringent condition” in the above (d) includes a gene that hybridizes under stringent conditions with the complementary strand of the gene specified by the sequence number.
  • “stringent conditions” refer to Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) and ij i Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory As taught by Press (1989), it can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid to which the complex or probe is bound.
  • Hybridization conditions include, for example, 6 X SSC (20 X SSC represents 333 mM Sodium citrate, 333 mM NaCl), 42 ° C in a solution containing 0.5% SDS and 50% formamide. And hybridization conditions at 65 ° C in a solution containing 6 X SSC (without 50% formamide! /).
  • the conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • the complementary strand is preferably one that maintains the target positive strand and the hybridized state even when washed under strong conditions.
  • cleaning conditions such as “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C” are given as stricter hybridization conditions, and “0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C” are given as stricter hybridization conditions. be able to.
  • a recombinant expression vector for expressing the ECAT16 protein can be prepared by inserting the polynucleotide into an expression vector.
  • the expression vector used here can be appropriately selected according to the host to be used, the purpose, and the like, and includes plasmids, phage vectors, virus vectors and the like.
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and phage vectors such as ⁇ and gtll.
  • vectors include pYES2 and pYEUra3.
  • pAcSGHisNT-A can be mentioned.
  • plasmid vectors such as pCEP4, pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, pRc / CMV, retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, etc.
  • a viral vector is mentioned.
  • the vector may contain factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a selection marker gene, and a terminator. Further, it may contain a gene encoding a marker protein (marker gene). Refer to the section (3-1) for the best gene.
  • the above-described expression vectors include the above-described conditional gene expression control system (Niwa et al., (2000). Nat Genet 24, 372-6), recombinase Cre-loxP system, recombinase FLP. -You may contain the arrangement
  • the vector may be a vector having a property of disappearing under a certain condition (for example, pCAG-IP vector).
  • a sequence expressed as a fusion protein with thioredoxin, His tag, GST (Dalthathione S-transferase) or the like may be added so that isolation and purification can be facilitated.
  • a GST fusion protein vector such as pGEX4T
  • an appropriate promoter such as lac, tac, trc, tr p, CMV, or SV40 early promoter
  • a tag sequence such as Myc or His Vectors (such as pcDNA3.1 / Myc-His) and vectors that express fusion proteins with thioredoxin and His tags (pET32a) can be used.
  • a transformed cell containing the expression vector By transforming a host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
  • Examples of the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • E. coli include E. coli K-12 strains HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, AD494 (DE3) strain, and the like.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae etc. Is mentioned.
  • animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, Hela cells, and 293-EBNA cells. Insect cells include sl9.
  • Various cells (ES cells, somatic cells) described in the above item (5) can also be used.
  • a method for introducing an expression vector into a host cell a conventional method suitable for the host cell may be used. Specific examples include calcium phosphate method, DEAE-dextran method, electo-poration method, method using lipid for gene transfer (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL), electric pulse method and the like.
  • a transformed cell having the expression vector introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
  • ECAT16 can be produced by continuing to culture the transformed cells obtained as described above under suitable conditions.
  • the obtained protein can be further isolated and purified by a general biochemical purification means.
  • purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and the like.
  • the protein of the present invention when expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, it can be isolated and purified by a purification method utilizing the properties of these fusion protein and tag.
  • the present invention also provides the following (a) to (c):
  • (c) A protein having an ECAT16 function, wherein the protein of (a) contains an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, Z or added, and has the function of ECAT16! Provide ECAT16 protein consisting of either.
  • ECAT16 specifically refers to a force exemplified by mouse ECAT16 protein containing the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18.
  • SEQ ID NO: More than 70% homology with mouse ECAT16 protein containing the amino acid sequence described in 18. 1 or more amino acids are substituted, deleted and Z or added in the protein having the properties and the function of ECAT16 and the mouse ECAT16 protein containing the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18.
  • a protein having the amino acid sequence and having the function of ECAT16 is also included in the category of ECAT16 of the present invention. Specific examples of such a protein include human ECAT16 (human ECAT16 protein, SEQ ID NO: 34).
  • a protein having 70% or more homology with the human ECAT16 protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 and having the function of ECAT16, or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34 A protein having an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, Z, or added and having the function of ECAT16 in the human ECAT16 protein containing ECAT16 is also included in the category of ECAT16 of the present invention.
  • Rnfl7 and LOC380905 are not included in the category of “ECAT16”.
  • the "protein having 70% or more homology” is specifically 70% or more, preferably 80% or more, more preferably the amino acid sequence represented by the SEQ ID NO. Or a polynucleotide containing an amino acid sequence having homology of 90% or more, particularly preferably 95% or more.
  • a protein containing an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted and Z or added means an artificially prepared so-called modified protein or a living body. It means a protein such as an allelic variant.
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as ECAT16 activity is maintained. Indicators that determine how many amino acid residues need to be deleted, substituted and Z or added in this way without loss of activity are computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star. Can be found using software.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted should be an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as residue polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and amphiphilicity. preferable.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Trp are amino acids classified as nonpolar amino acids, and Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin are uncharged amino acids.
  • Asp and G1 u are amino acids that are classified as acidic amino acids, and Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
  • the above ECAT16 protein can be obtained by culturing the transformant. It can also be synthesized in vitro using, for example, the PureGene system.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to ECAT16.
  • the antibody can be prepared by the method described in (1-3) above.
  • the present invention provides a polynucleotide containing at least 15 consecutive nucleotides specific to a polynucleotide of ECAT16 and a polynucleotide complementary to Z or the polynucleotide (however, the Rnfl7 gene and the LOC380905 gene are not included) ). Details of the polynucleotide are as described in the above (1-1) and (1-2).
  • the present invention provides a polypeptide containing at least 6 consecutive amino acids specific for ECAT16 (but not Rnfl7 and LOC380905).
  • the definition of “at least 6 amino acids” is based on the reason that generally 6 amino acids are enough to distinguish one protein from another.
  • a polypeptide containing 8 amino acids, more preferably 10 amino acids or more is provided.
  • the present invention provides a genetically modified animal in which ECAT16 gene has been artificially inserted into a chromosome or knocked out either of them.
  • “gene-modified animal with ECAT16 gene artificially inserted into the chromosome” means a transgenic animal of ECAT16 gene
  • “gene-modified animal with knockout of ECAT16 gene” means ECAT16 gene knockout animal
  • the method for producing the genetically modified animal is well known to those skilled in the art, and for example, it can be produced by the method described in the above section (3-1).
  • the present invention provides an antisense nucleic acid or siRNA of the ECAT16 gene.
  • the “antisense nucleic acid” refers to an antisense polynucleotide or an antisense oligonucleotide, and specifically, an antisense nucleic acid complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 33 or a part thereof. Is exemplified.
  • the antisense nucleic acid usually has a base strength of about 10 to 1000, preferably about 15 to 500, and more preferably about 16 to 30.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide that constitutes antisense DNA are chemically modified, such as phosphorothioate, methinorephosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted with a phosphate residue.
  • These antisense nucleic acids can be produced using a known DNA synthesizer.
  • the antisense nucleic acid can hybridize with the RNA of the ECAT16 gene or the initial transcription product that generates the RNA by post-transcriptional processing, and has the ability to inhibit the synthesis or function of the RNA of the ECAT16 gene. Can regulate and control the expression of the ECAT16 gene through its interaction with the RNA.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can also be used in a special form such as ribosome and microsphere.
  • Such forms include polycationic substances such as polylysine, which act to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, and lipids that enhance interaction with cell membranes or increase uptake of nucleic acids (e.g. phospholipids). And hydrophobic substances such as cholesterol).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3, or 5 'end of nucleic acids and can be attached via bases, sugars, or intramolecular nucleoside linkages.
  • Examples of the other group include a cap group specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid, which prevents degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • Such capping groups are known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylenedaricol.
  • Examples of the hydroxyl group protecting group include, but are not limited to.
  • RNA is a short interfering RNA, specifically, a partial sequence in the coding region of mRNA of the ECAT16 gene or its initial transcript (in the case of the initial transcript, it contains an intron).
  • RNAi RNA interference
  • the double-stranded oligo RNA having the RNAi activity can be prepared by synthesizing the sense strand and the antisense strand with a DNA / RNA automatic synthesizer and annealing them in an appropriate annealing buffer.
  • the present invention relates to a mouse ECAT15-1 gene (polynucleotide) containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a mouse ECAT15-2 gene (polynucleotide) containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5. provide.
  • the present invention also provides mouse ECAT15-1 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and mouse ECAT15-2 containing the amino acid sequence shown in 6.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of ECAT15 derived from these 129 mouse ES cells are novel genes that differ from the genes registered in public gene banks (GenBak, etc.) by several amino acid residues.
  • ECAT15-1 gene and ECAT15-2 gene the gene, protein, expression vector, transformed cell, antibody, partial polynucleotide, partial peptide, and gene are also based on the above (6-1) to (6-7). Modified animals can be made.
  • the present invention provides a complex of ECAT15-1 and ECAT15-2. As long as the ECAT15-1 and ECAT15-2 complexes are formed, additional ECAT15-1 may be bound to form a complex, and further ECAT15-2 is bound to form a complex. May be formed.
  • the complex is also in the form of a conjugate with a substance that promotes cellular uptake. (See paragraph (4) above).
  • ECAT15-1 and ECAT15-2 complexes or conjugates with substances that promote the uptake of these complexes into cells, have the ES cell function maintenance agent described in (5) above. It can be an active ingredient. More specifically, it can be used as an active ingredient of an ES cell undifferentiated ability maintenance agent and an ES cell growth ability maintenance agent. Since ECAT15-1 and ECAT15-2 form a complex, they are preferably used simultaneously as agents for maintaining the function of ES cells.
  • the present invention provides the following (a) and (b):
  • An ES cell function maintaining agent containing a polynucleotide containing the ECAT15-2 gene or an expression vector containing the same as an active ingredient is also provided. Since both are expressed to form a complex, they are preferably used simultaneously as agents for maintaining the function of ES cells.
  • ECAT15-1 “ECAT15-2”, “ECAT15-1 gene” and “EC AT15-2 gene” are similar to a specific sequence as described above, but not limited to a specific sequence. Those containing the amino acid sequence or base sequence of
  • the Expressed Sequence Tag (EST) database was analyzed by the Digital Differential Display method.
  • gene expression frequency analysis was performed on a group of libraries derived from the following five cells and organs by the digital differential display method.
  • the numbers in parentheses for each group indicate the number of clones analyzed. From group 1 to group 5, all relevant libraries were analyzed. Group 6 has a huge amount of data, so we analyzed 23 libraries that were extracted to contain organs and cells as much as possible.
  • a mouse-derived EST database was searched using BlastN, and pluripotent cell-derived Considered whether EST exists only in the library
  • ECAT15 containing SAP (SAF-A / B, Acin us, and PIAS) motif ⁇ which is a DNA binding domain among ECAT candidate genes selected by analysis by Digital differential display method and EST database search by BlastN
  • -l and Rnfl7 which is suggested to bind to the oncogene myc.
  • the expression of these two genes in ES cells and 13 organs was analyzed by RT-PCR. That is, the expression of ECAT15-1 gene and RNF17 (RNF17, long form) gene in ES cells (undifferentiated Z differentiation) and 13 kinds of organs of adult mice was analyzed by RT-PCR.
  • the primer sequences used are as follows.
  • ECAT15- 1- gw- s CACCATGGAGACTGCTGGAGACAAGAAG (SEQ ID NO: 19)
  • ECAT15-l-gw-as2 GGACCTATTCCAGAGGAACTGTCAC (SEQ ID NO: 20)
  • Rnfl7-RT-S GACCGGGCTGGCTTCCTGTCACCTAGT (SEQ ID NO: 27)
  • Rnfl 7-RT-AS TTTACCATTTTCGGTGGCAAGGCTTCC (SEQ ID NO: 28)
  • Fig. 1 shows the analysis results of the ECAT15-1 gene
  • Fig. 2 shows the analysis results of the Rnfl 7 gene.
  • the ECAT15-1 gene was expressed in undifferentiated ES cells (MG1.19 ES cells and RF8 ES cells), and its expression was markedly reduced when ES cells were induced to differentiate with retinoic acid. Expression was observed in 13 organs of adult mice.
  • the Rnfl 7 gene (Rn fl7L in the figure) was only expressed in undifferentiated ES cells (MG1.19 ES cells and RF8 ES cells) and testis. Testicular expression is likely to originate in primordial germ cells and spermatocytes, as in the Oct3 / 4 gene. From these results, it has been clarified that all 5-15 15-1 genes and 13 ⁇ 4117 genes are ES cell-specific expression genes.
  • the ECAT15-2 gene exists as a sequence and structurally similar gene to the ECAT15-1 gene, and the same RT-PCR analysis was performed for this ECAT15-2 (Fig. 1).
  • the primer sequences used are as follows.
  • ECAT15- 2- gw- s CACCATGTCATACTTCGGCCTGGAGACT (SEQ ID NO: 21)
  • ECAT15-2-gw-as2 ACTCTACTCTTTTCTCCTTTGGCACCC (SEQ ID NO: 22)
  • LOC380905-RT-S AAGCTGGCATATGTTGAACCAAGTAAA (SEQ ID NO: 29)
  • LOC380905-RT-AS TTCATAAGATGCTAGGCCCTCTTTCAC (SEQ ID NO: 30)
  • ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, 13 ⁇ 4117 gene, 0 and 3809 05 genes are all ECAT genes that are specifically expressed in ES cells, and are marker genes that characterize ES cells. It became clear that it became power.
  • Example 2
  • ECAT15-1 gene and ECAT15-2 gene cDNA was amplified from the mRNA of RF8 ES cells by RT-PCR, and the nucleotide sequences were determined.
  • the determined nucleotide sequence of mouse ECAT15-1 (m ECAT15-1) is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence of mouse ECAT15-2 (mECAT15-2) is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NOs: 11, 12 were identified. Moreover, SEQ ID NOs: 13 and 14 were identified as mouse LOC380905 (mLOC380905), and hTDRD4 (SEQ ID NOs: 15, 16) as human homologous genes were identified from the gene database.
  • Rnfl7 gene and LOC380905 gene in RF8 ES cells was examined by Northern blot analysis.
  • the approximately 2 kb band corresponding to Rnfl 7 or LOC380905 was not confirmed, but instead only a new approximately 4 kb band was confirmed. It was done.
  • the gene corresponding to this new band was named ECAT16 gene.
  • the primer sequences used are as follows.
  • Rnfl 7-S CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGTCGACCGG (SEQ ID NO: 23)
  • Rnfl 7L-AS CTAAAACTCCACAGCCTTTGAGGGAGAATC (SEQ ID NO: 24) [LOC380905 ORF amplification primer]
  • the expression level of the ECAT16 gene was remarkably increased, as was the expression of the V-shift gene (ECAT16 gene, 13 ⁇ 4117 gene expression 0 and 380905 gene). Therefore, the expression of the Rnfl7 (Rnfl7L) gene and the LOC380905 gene in Fig. 2 became clear that most of them were the expression of the ECAT16 gene, that is, the ECAT16 gene was mainly the ES cell-specific expression gene. .
  • ECAT16 gene cDNA was amplified from the mRNA of RF8 ES cells by RT-PCR, and the nucleotide sequence was determined.
  • the determined mouse ECAT16 gene base sequence is shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the 5th and 16th genes are long transcripts in which the 13 ⁇ 4117 gene and the LOC380905 gene are overlapped and linked, and it became clear that the gene was a novel gene.
  • the human ECAT16 gene was identified.
  • the human ECAT16 gene cDNA was amplified from human testis mRNA by RT-PCR, and the nucleotide sequence was determined. Primer sequences used for amplification are as follows.
  • hRnfl7-S CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGAAGAC (SEQ ID NO: 31)
  • hLOC380905-AS TTATTCATCTTTATCTGCAAGCCCCATTT (SEQ ID NO: 32)
  • SEQ ID NO: 33 The determined nucleotide sequence of the human ECAT16 gene is SEQ ID NO: 33, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 34. Shown in As a result of blastp, blastn, BLAT, and blast (genome) searches, both the nucleotide sequence and amino acid sequence of the human ECAT16 gene as well as the mouse ECAT16 gene were disclosed, and it was a novel gene. Mouse ECAT16 and human ECAT16 at the gene level Homology was 71% and protein level homology was 72.5%.
  • ECATS ⁇ ge. Mouse A knockin mouse (hereinafter referred to as ECATS ⁇ ge. Mouse) was produced. This ECATS ⁇ ge. Mice were prepared based on the literature (Tokuzawa, Y., et al, Molecular and Cellular Biology, 23 (8): 2699-2708 (200 3)).
  • ECATS ⁇ ge. Lymphocytes were collected by a conventional method for thymic strength of mice. The cells were cultured for 2 days under the ES cell culture conditions described in the literature (Meiner, V et., Et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (24): pl4041-14046 (1996)) Selected with G418 (0.25 mg / ml). As a result, all these lymphocytes were killed, and no drug-resistant colonies were obtained. It was also confirmed that all normal ES cells were killed at this G418 concentration.
  • ECATS 13 ⁇ According to the method of Tada et al. (Tada, M., et al., Curr. Biol, 11 (19): pl553-1558 (2001), mouse lymphocytes and RF8 cells were electrically fused, and the ES cells were When cultured on feeder cells (STO cells) for 2 days under the same culture conditions and selected with G418 (0.25 mg / ml), a large number of ES cell-like colonies were obtained. RNA was collected, and these cells expressed Oct3 / 4 and ECAT4 (Nanog) in all clones by Northern blotting, and chimeric mice were formed when this clone was transplanted into mouse blast cysts.
  • STO cells feeder cells
  • G418 0.25 mg / ml
  • ECAT15 BAC clone of ECAT15
  • BAC—S2 AGATTCATTTACTTCACCGCTCCATCATAC / 3
  • ECAT15-BAC-AS2 TCCTGGTAATAAAATTCCGTCGCTGTTG
  • Reaction solution 25 ⁇ L: dNTP 2 mM, 5 and 3 ′ primer 5 pmol, rTaq polymerase lunit, template DNA 100 ng. Temperature conditions: 94 ° C, 5 sec. (94 ° C, 2 sec. 55 ° C, 2 sec. 72 ° C, 5 min.) X 55 cycle, 68 ° C, 5 min. 4 ° C. After the PCR reaction, electrophoresis was performed with a 2.0% agarose gel containing EtBr, and a band-amplified clone of about 560 bp was screened. As a result, a newly identified # 290 plate was obtained.
  • a BAC targeting vector was constructed as follows using Rec / ET, an E. coli recombination enzyme, from a BAC clone of about 140 kbp including ECAT15-1 and 15-2.o
  • a targeting vector is constructed by introducing the 15-1 site into the neomycin resistance gene cassette and the 15-2 site into the hygromycin resistance gene cassette.
  • a selection marker neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene
  • a site to be introduced into BAC by PCR was prepared.
  • a primer for this PCR a total of 74 bp oligo containing 24 bp homologous to the saddle and 50 bp homologous to BAC was used.
  • RepeatMasker2 http: / 1 ftp. Genome. Washington. Edu /
  • the prepared BAC targeting vector was treated with Sail (NEB) and linearized, extracted with phenol chloroform, ethanol precipitated, and dissolved in PBS.
  • the confluent RF8 cells were passaged 1: 2 on a 10 cm cell culture plate the day before, washed with PBS on the day, and then treated with trypsin and collected in a 15 ml tube. This was centrifuged at 800 rpm for 5 minutes to remove the supernatant and resuspended in 800 / zL of PBS.
  • 20 g of a linearized targeting vector was added and transferred to an erect mouth position cuvette (BM Equipment Co.). Elect mouth por- tion was performed with Gene pullser II (BIO-RAD.
  • colonies were picked up with a micropipette, transferred to a 96-well plate containing trypsin 20 L, treated with trypsin, neutralized by adding ES medium 180 L, and then subcultured onto MSTO in a 24-well plate.
  • Confined cells were trypsinized and subcultured to a 0.1 well gelatin-coated 24-well plate for genome extraction, and the rest were frozen with the plate added with cell freezing medium. When cells passaged for genome extraction became confluent, they were washed twice with PBS to extract the genome.
  • ECAT15-3 'probe-s (5,-GCTCCAAATG ACCACAAGACTAACAGGC-3,) (SEQ ID NO: 41) and ECAT15-3' probe- Using the Rediprime II Random Prime Labeling system (Amersham Biosciences. Co.), the fragment obtained by PCR using as (5, -GTG CACATTCCTCCAAGTAGGTAT GAA A-3 ') (SEQ ID NO: 42) is used.
  • SEQ ID NO: 42 the fragment obtained by PCR using as (5, -GTG CACATTCCTCCAAGTAGGTAT GAA A-3 ') (SEQ ID NO: 42) is used.
  • [32P] -dCTP The radiation intensity of the labeled probe was measured by liquid scintillation.
  • 1.2 x 10 7 dpm probe treated at 100 ° C for 5 minutes is added to the pre-hybridized membrane bottle and hybridized at 68 ° C for 3 hours It was. After 3 hours, an appropriate amount of first wash buffer (2 X SSC, 10% SDS) was added and washed at room temperature for 5 minutes. Next, an appropriate amount of second wash buffer (0.2 X SSC, 10% SDS) was added, and washing was performed twice at 68 ° C for 20 minutes. The washed membrane was wrapped in wrap, exposed to light on an imaging plate (Fuji. Co.), and analyzed the next day using BAS 5000 (Fuji. Co.).
  • the Taq man probe is 20-30 bases in length and avoids the 5 'terminal G. 4 or more consecutive Gs were avoided. Primers were designed in such a way as to sandwich this probe. The above site was designed after confirming that there was no repeated sequence (RepeatMasker2). Designed at 15-1, 15-2 and the site where the Nanog gene was targeted as a control (Cell, 113, p631-642 (2003). Quantitative PCR was performed as follows using these sites.
  • Q 15-l-s2 (5'-AGAAGAGAAGAATGAGCGTTACAA T-3,) (SEQ ID NO: 43), Q15-l-as2 (5 '-GGATTCTAAATTCCTTCCTAACAA A- 3') (SEQ ID NO: 44), Q15-2-S (5 -ATG AATACAGTGTATTTACCAGTGT-3 ') (SEQ ID NO: 45), Q15-2-as (5 , -GAGCTACTACTGCCAGTTGATGACT-3,) (SEQ ID NO: 46), Qnanog-s (5'-GTCCTTAGAAGTTGCTGTAATGTA A-3 ') (SEQ ID NO: 47), Qnanog-as (5, -TCACATAATTATGATTTTAACAGGC-3,) (SEQ ID NO: 48) Buffer: QuickGoldStar Mastermix Plus (NIPPON GENE Co.)
  • nanogTaq (5'-TGAATCGAACTAACGTCTGGACGTC-3,) (SEQ ID NO: 51)
  • ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems Co.)
  • ECAT15 BAC clones containing the full length of ECAT15-1 and 15-2 and having a total length of about 140 kbp were obtained.
  • an ECAT15 BAC targeting vector was prepared. This vector replaces the 2nd to 7th exons of 15-1 with the neomycin resistance gene, and the 15th second exon strength of the 15th exon to the 7th exon with the neomycin resistance gene (Fig. 3).
  • ECAT15-1, 2 double heterozygous mutant cells were identified as clones that were confirmed by quantitative PCR and Southern blotting.
  • the 15-1 and 15-2 heterozygous mutant ES cells tended to differentiate with a slow growth compared to control cells (power cells that did not undergo homologous recombination). From the above results, it was confirmed that ECAT15 plays an important role in the proliferation and maintenance of ES cells!
  • ECAT15- gw- s (5, -CACCATGGAGACTGCTGGAGACAAGAAG-3,) (SEQ ID NO: 52),
  • GETEWAY Cloning Technology uses pCAG—Myc—ECAT15—1, pCAG—Myc—EC AT 15—2, pCAG— Flag— ECAT15—
  • pCAG-Flag-ECAT15-2 was created.
  • PDEST17 the expression vector in E. coli, was reacted with pENTR- ECAT15-1, 2, and pDEST17- ECAT15-1, 2 was produced.
  • Buffer A 0.01 M Tris-HCl pH 8.0, 6 M Guanidine Hydrochloride ⁇ 0.1 M NaH PO / Na HPO
  • the recombinant protein was dialyzed against 6 M Urea / PBS using Slide-A-Lyzer Cassette (PIERCE).
  • the titer of the prepared antibody was confirmed by western blotting.
  • the blood was collected from the ear artery as much as possible in the week following the fifth immunization, and then the whole blood was collected by stenosis. This was treated in the same manner as above to obtain anti-ECAT15-1 and 15-2 sera.
  • Myc- tagged ECAT15-2 (hereinafter Mycl5-2) and Flag- tagged ECAT15-1 (hereinafter Flagl5-1), Myc- tagged ECAT15-1 (hereinafter Mycl5-1) and Flagl5-1, or Mycl5-2 and Flag- tagged ECAT15-2 (Flagl5-2), pCAG -Myc- EC ATI 5-1, pCA G—Myc— EC AT 15—2, pCAG—Flag— EC ATI 5—1, pCAG—Flag — EC AT 15-2 was transfected into MG1.19 ES cells with lipophectamine 2000. First, add 4 / z g of DMEM 250 ⁇ vector.
  • Centrifugation was performed at 12000 rpm for 10 seconds, and the buffer was washed 4 times with Nacl (final 150 mM) and NP40 (final 0.05%) in a buffer.
  • An SDS sample buffer was added to the beads and treated at 100 ° C for 5 minutes, and Western blotting was performed.
  • Proteins were collected from MG1.19 ES cells and washed with the above buffer. NP40 was added to Buffer to a concentration of 0.05%, followed by lysis, and the supernatant was collected.
  • normal mouse IgG Ac was rotated at 5 ⁇ 1 ° C at 4 ° C for 30 minutes.
  • 7.5 ⁇ 1 of anti-15-1, 2 and normal serum were added to the supernatant and rotated at 4 ° C for 2 hours.
  • 10 ⁇ l of ProteinA-Sepharose was added and rotated for 1 hour. After centrifugation at 12000 rpm for 10 seconds, the buffer was washed 4 times with Nacl (final 150 mM) and NP40 (final 0.05%) added.
  • the beads were treated with SDS sample buffer at 100 ° C for 5 minutes and analyzed by Western blot.
  • ECAT15-1 gene, ECAT15-2 gene, ECAT16 gene, RnH7 gene, LOC380905 gene five ECAT genes specifically expressed in ES cells.
  • the ES cell-specific expression gene of the present invention and the protein encoded by it are effectively used for detection of ES cells, screening of somatic cell nuclear reprogramming substances, screening of ES cell maintenance substances, etc. .
  • FIG. 1 shows the results of RT-PCT analysis of the expression of mECAT15-1 and mECAT15-2 in 13 types of organs of ES cells and adult mice. As a positive control, mNATl expression was also analyzed.
  • Lane 1 undifferentiated MG1.19 ES cells
  • lane 2 differentiated MG1.19 ES cells
  • lane 3 undifferentiated RF8 ES cells (RT minus control)
  • lane 4 undifferentiated RF8 ES cells
  • lane 5 min ⁇ RF8 ES cells
  • lane 6 brain
  • lane 7 heart
  • lane 8 kidney
  • lane 9 testis
  • lane 10 spleen
  • lane 11 muscle
  • lane 12 lung
  • lane 13 stomach
  • lane 14 ovary
  • Lane 15 Thymus
  • Lane 16 Liver
  • Lane 17 Skin
  • Lane 18 Intestine.
  • FIG. 2 shows the results of RT-PCT analysis of ECAT16 (mRnH7, LOC380905) expression in 13 types of organs of ES cells and adult mice. MNAT as a positive control The expression of 1 was also analyzed. Lane 1: undifferentiated MG1.19 ES cells, lane 2: differentiated MG1.19 ES cells, lane 3: undifferentiated RF8 ES cells (RT minus control), lane 4: undifferentiated RF8 ES cells, lane 5: min ⁇ RF8 ES cells, lane 6: brain, lane 7: heart, lane 8: kidney, lane 9: testis, lane 10: spleen, lane 11: muscle, lane 12: lung, lane 13: stomach, lane 14: egg nest Lane 15: Thymus, Lane 16: Liver, Lane 17: Skin, Lane 18: Intestine, Lane 19: Water (negative control).
  • FIG. 3 is a diagram showing the ECAT15 gene targeting vector and the concept of ECAT15 gene disruption using it.
  • the upper row shows the positions of the ECAT15-1 and ECAT1 5-2 genes on the wild-type genome
  • the break shows the conceptual diagram of the BAC targeting vector
  • the lower row shows the conceptual diagram of the genome after homologous thread replacement.
  • the open squares indicate neomycin resistance genes
  • the black squares indicate hygromycin resistance genes.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of confirming by Southern blot that homologous recombination of ECAT15 gene was performed.
  • + / + shows the result of normal ES cells
  • +/- shows the result of ES cells that have been mutated to the ECAT15 gene.
  • FIG. 5 shows formation of a complex of ECAT15 protein.
  • the left row shows the connection between ECAT15-1 and ECAT15-2
  • the middle row shows the connection between ECAT15-1
  • the right row shows the connection between ECAT15-2.
  • IP indicates immunoprecipitation
  • WB indicates Western blot.
  • FIG. 6 shows formation of a complex of ECAT15 protein (endogenous).
  • the left row shows the results of immunoprecipitation with anti-ECAT15-1 antibody
  • the right row shows the results of immunoprecipitation with anti-ECAT15-2 antibody.
  • Input shows the result of the cell extract before immunoprecipitation.
  • the base sequences described in SEQ ID NO: 19 to SEQ ID NO: 32 are primers.
  • the base sequences described in SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 48 are primers.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 49 to SEQ ID NO: 51 is a probe.
  • the base sequences described in SEQ ID NO: 52 to SEQ ID NO: 55 are primers.

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Abstract

　ＥＣＡＴ１５－１遺伝子、ＥＣＡＴ１５－２遺伝子、ＥＣＡＴ１６遺伝子、Ｒｎｆ１７遺伝子またはＬＯＣ３８０９０５（ＴＤＲＤ４）遺伝子のいずれかに由来するポリヌクレオチドを含有する、ＥＳ細胞検出用マーカー等に関する。

Description

ES細胞特異的発現遺伝子及びその利用
技術分野
[0001] 本発明は、 ES細胞（embryonic stem cells)に特異的に発現している遺伝子及びそ の利用に関する。
背景技術
[0002] 胚性幹細胞 (ES細胞）は哺乳動物胚盤胞の内部細胞塊より榭立した幹細胞であり 、すべての細胞へと分化する能力（分化多能性)を維持したまま、無限に増殖させる ことができる。 ES細胞は 1981年にまずマウスで榭立され、ノックアウトマウスによる遺 伝子機能解析という画期的な技術をもたらした。さらに、 1998年にヒト ES細胞の榭立 が報告されて力もは、再生医学への応用が大きく期待されるようになった。 ES細胞か ら分化させた心筋や神経細胞を心筋梗塞や神経変性疾患の患者へ移植して機能回 復を計ろうというものである。
[0003] 白血病に対する骨髄移植に代表されるように細胞移植療法は既に実施されて ヽる 力 十分な移植細胞の確保と拒絶反応の抑制という 2つの課題を抱えている。半永 久的に分裂する ES細胞を用いると、十分な細胞の確保という問題を一気に解決でき る。さらに体細胞クローン技術と組み合わせると、拒絶反応も克服することが可能であ る。患者の体細胞力 作製したクローン胚力 ES細胞を榭立し移植に用いれば、患 者と同じ遺伝子を持っため拒絶は起こり得ない。したがって、 ES細胞は細胞移植療 法における 2つの課題をともに克服する可能性を持つ。
[0004] このように大きな可能性を秘めた ES細胞である力 ヒト ES細胞はマウスの ES細胞 に比べて榭立と維持が困難であり、確実な榭立技術および培養技術の開発が必要 である。さらにヒト ES細胞を榭立するためには胚を犠牲にする必要がある。さらに体 細胞クローン技術と組み合わせた場合は、クローン人間の作製に容易につながる。こ のような倫理的問題点を解決するために、分化多能性を持った ES様細胞を体細胞 力 胚を経ずに直接作り出す技術の開発が望まれて 、る。
[0005] これらの技術開発にぉ 、て重要な役割を果たすのが ES細胞等分ィ匕多能性細胞で 特異的に発現する遺伝子（ES cell associated transcript gene,以下 ECAT遺伝子）で ある。 ECAT遺伝子は、細胞が ES細胞であるかどうかのマーカーとなる。また ECAT 遺伝子の ES細胞特異的発現を引き起こす調節領域と薬剤耐性遺伝子を組み合わ せることにより、多種類の細胞の混合培養力 ES細胞を効率よく選択することができ る（特許文献 1を参照)。さらに体細胞において ECAT遺伝子を発現誘導することによ り、 ES様細胞への変換を促進させる可能性もある。
これまでに ECAT遺伝子として報告されているものとしては、転写因子 Oct3(Oct4、 P OU5flとも呼ばれる。以下 Oct3/4という）遺伝子が知られている。また、同様な遺伝子 がヒトでも報告されて ヽるが (h〇ct3/4遺伝子；非特許文献 1を参照）、 hOct-3/4遺伝 子につ!、ては ES細胞特異的な発現を証明したと 、う報告はな！/、。
[0006] 近年我々のグループは、 ES細胞と内部細胞塊の両方で分ィ匕多能性を積極的に維 持する未知因子の探索をめざし、 ESTデータベースを Digital Differential Displayで 解析し、 ES細胞で特異的に発現する 9個の遺伝子を見出し、これを ECAT1遺伝子〜 ECAT9遺伝子と命名した (特許文献 2を参照）。このうち ECAT4は Nanogとも呼ばれる 因子であり、 ES細胞が有する全能性 (分ィ匕多能性)の維持に必須の因子であること が明ら力となった (非特許文献 2を参照)。また ECAT5は ERasとも呼ばれる因子であり 、 ES細胞の増殖を促進する因子であることが明らかになつている (非特許文献 3を参 照)。
前記の解析においては、他にも実験的に多能性細胞特異的な発現が報告されて いる Oct3/4、 UTF1、 REX1なども同定されており、スクリーニング法として極めて有効 であることが証明されている。
[0007] 特許文献 1：米国特許第 6146888号公報
特許文献 2 :WO 02/097090号公報
非特許文献 l :Takeda et al, Nucleic Acids Research, 20:4613-4620(1992) 非特許文献 2 : Mitsui, K., et al" Cell, 113: 631-642(2003)
非特許文献 3 :Takahashi, K., et al., Nature, 423: 541-545(2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明は、新規な ECAT遺伝子を提供することを目的とする。さら〖こ詳しくは、本発 明は、新たな ECAT遺伝子である ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺 伝子、 Rnfl7遺伝子および LOC380905(TDRD4)遺伝子を利用した ES細胞の検出法 、体細胞核初期化物質のスクリーニング法または ES細胞維持物質のスクリーニング 法などを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者は、 ES細胞の基礎研究や再生医学、 ES細胞の細胞移植への応用と 、 つた観点から、新たな ECAT遺伝子の探索を進めて 、る。
[0010] 本発明者は新たな ECAT遺伝子を同定するために、 ESTデータベースを Digital Dif ferential Displayで解析し、候補遺伝子の探索を行った。候補遺伝子のうち、 DNA結 合ドメインである SAPモチーフを含有する ECAT15-1遺伝子、および癌遺伝子 mycへ の結合が示唆されている Rnfl 7遺伝子にまず着目し、鋭意検討を進めた結果、以下 の（1)〜（5)：
(1) ECAT 15-1遺伝子（配列番号： 1〜4)、
(2) ECAT15-2遺伝子（配列番号： 5〜8)、
(3) ECAT16遺伝子（配列番号： 17〜18および配列番号： 33〜34)、
(4) Rnfl 7遺伝子（配列番号： 9〜 12)、
(5) LOC380905遺伝子（配列番号： 13〜16)、
の 5種類の遺伝子 (上記配列番号は対応のアミノ酸配列も含む)、中でも ECAT15-1遺 伝子、 ECAT15-2遺伝子および ECAT16遺伝子は、いずれも ES細胞特異的に発現 する ECAT遺伝子であり、 ES細胞を特徴付けるマーカー遺伝子であることが明らかと なった。
本発明の新規 ECAT遺伝子は、 Vヽずれも ES細胞特異的に発現する遺伝子であるた め、これら遺伝子または当該遺伝子よりコードされるタンパク質は、 ES細胞の検出、 体細胞核初期化物質のスクリーニング、または ES細胞維持物質のスクリーニング等 において有効に用いられる。
本発明はこのような知見に基づき完成するに至ったものである。
[0011] すなわち本発明は、下記に掲げるものである： (1) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝 子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の!/ヽずれかに由来するポリヌクレオチドを 含有する、 ES細胞検出用マーカー、
(2) ECAT15— 1遺伝子が配列番号： 1または 3に記載の塩基配列を含有する遺 伝子である、前記（1)記載のマーカー、
(3) ECAT15— 2遺伝子が配列番号： 5または 7に記載の塩基配列を含有する遺 伝子である、前記（1)記載のマーカー、
(4) ECAT16遺伝子が配列番号： 17または 33に記載の塩基配列を含有する遺伝 子である、前記（1)記載のマーカー、
(5) Rnf 17遺伝子が配列番号： 9または 11に記載の塩基配列を含有する遺伝子で ある、前記（1)記載のマーカー、
(6) LOC380905 (TDRD4)遺伝子が配列番号： 13または 15に記載の塩基配列 を含有する遺伝子である、前記（1)記載のマーカー、
(7) 連続する少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び Z又は該ポリヌクレ ォチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、前記（1)〜（6) V、ずれか記載のマー カー、
(8) 酉己歹 IJ番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17また ίま 33の!/、ずれ力に記載の塩基 配列にお 、て、連続する少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び Ζ又は該 ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、 ES細胞検出用マーカー、
(9) ES細胞の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される、前記（1) 〜（8) V、ずれか記載のマーカー、
(10) ECAT15- 1, ECAT15- 2, ECAT16, Rnf 17¾yt«LOC380905 (TD RD4)のいずれかを認識する抗体を含有する、 ES細胞検出用マーカー、
(11) ECAT15— 1が配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質である、前記（10)記載のマーカー、
( 12) ECAT15 2が配列番号： 6または 8に記載のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質である、前記（10)記載のマーカー、
(13) ECAT16が配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク 質である、前記（10)記載のマーカー、
(14) Rnfl7が配列番号： 10または 12に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質 である、前記（10)記載のマーカー、
(15) LOC380905 (TDRD4)が配列番号： 14または 16に記載のアミノ酸配列を 含有するタンパク質である、前記（10)記載のマーカー、
[0013] (16) 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、 ES細胞の検出方法：
(a)被験細胞に由来する RNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、 前記（1)〜（9) V、ずれか記載のマーカーとを結合させる工程、
(b)該マーカーに結合した被験細胞由来の RNAまたは該 RNAから転写された相補 的ポリヌクレオチドを、上記マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ!/、て、被験細胞力 ¾S細胞であるか否かを判断する 工程、
(17) 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、 ES細胞の検出方法：
(a)被験細胞に由来するタンパク質と、前記（ 10)〜（ 15) 、ずれか記載のマーカーと を結合させる工程、
(b)該マーカーに結合した被験細胞由来のタンパク質を、上記マーカーを指標として 測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ!/、て、被験細胞力 ¾S細胞であるか否かを判断する 工程、
[0014] (18) 以下の（a)および (b)の工程を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング 方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触さ せる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を 出現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
(19) マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺 伝子、発色酵素遺伝子またはこれらの組み合わせに係る遺伝子である、前記（18) 記載のスクリーニング方法、
(20) 以下の（a)および (b)の工程を含む、前記（18)または（19)記載のスクリー- ング方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックイン した遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を生 じさせた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
[0015] (21) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝 子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子 を含有するノックインマウス、
(22) 前記（21)記載のノックインマウスの、前記（18)〜（20)いずれか記載のスクリ 一ユング方法にぉ 、て用いる体細胞の供給源としての使用、
[0016] (23) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝 子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける 位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞、
(24) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝 子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子 を含有する、前記（23)記載の体細胞、
[0017] (25) 以下の（a)および (b)の工程を含む、 ES様細胞の選択方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化 物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞を ES様細胞として選択する工程 (26) 以下の（a)および (b)の工程を含む、前記（25)記載の選択方法： (a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置に薬剤耐性遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化 物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、選択培地中での生存細胞を ES様細胞として選択するェ 程、
(27) 前記（23)または（24)記載の体細胞の、前記（18)〜（20)いずれか記載のス クリーニング方法または前記（25)〜（26) V、ずれか記載の選択方法における使用、 [0018] (28) 以下の（a)および (b)の工程を含む、 ES細胞の未分化'多能性維持物質のス クリーニング方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する ES細胞を、 ES細胞の未分化' 多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を 存在させた被験物質を ES細胞未分化 ·多能性維持の候補物質として選択する工程
(29) 以下の（a)および (b)の工程を含む、前記（28)記載のスクリーニング方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックイン した遺伝子を含有する ES細胞を、 ES細胞の未分化 ·多能性を維持できな!/ヽ培地中 で被験物質と接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を存 在させた被験物質を ES細胞未分化 ·多能性維持の候補物質として選択する工程、
[0019] (30) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝 子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける 位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する ES細胞、
(31) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝 子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子 を含有する、前記（30)記載の ES細胞、
(32) 前記（30)または（31)記載の ES細胞の、前記（28)または（29)記載のスクリ 一二ング方法における使用、
[0020] (33) ECAT15- 1, ECAT15- 2, ECAT16, Rnf 17¾yt«LOC380905 (TD RD4)の ヽずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを 促進する物質との結合体、
(34) ECAT15— 1、 ECAT15— 2、 ECAT16、 Rnf 17または LOC380905 (TD RD4)の ヽずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを 促進するタンパク質との融合タンパク質である、前記（33)記載の結合体、
(35) 前記（34)記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有するポリヌクレ ォチド、
(36) 前記（35)記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
(37) 前記（36)記載の発現ベクターを導入した細胞、
[0021] (38) ECAT15- 1, ECAT15- 2, ECAT16, Rnf 17¾yt«LOC380905 (TD RD4)の ヽずれかを含有するタンパク質、若しくは前記（33)または（34)記載の結合 体を有効成分として含有する ES細胞の機能維持剤、
(39) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝 子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の!/、ずれかを含有するポリヌクレオチド、ま たはこれを含有する発現ベクターを有効成分として含有する ES細胞の機能維持剤、 [0022] (40) 以下の (a)〜（d)のいずれかよりなる ECAT16遺伝子のポリヌクレチド：
(a)配列番号： 17または 33に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する ポリヌクレオチド、
(c)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の相同性を有し、且つ ECAT1 6の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチド (相補鎖）に対してストリンジェントな条件下 でハイブリダィズし、且つ EC ATI 6の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレ ォチド、
(41) 以下の（a)〜（c)の!、ずれかよりなる ECAT16タンパク質：
(a)配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(b)前記 (a)のタンパク質と 70%以上の相同性を有し、且つ ECAT16の機能を有す るタンノ ク質、
(c)前記 (a)のタンパク質において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び Z又 は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質、 (42) 配列番号： 1または 5に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(43) 配列番号： 2または 6に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(44) 前記 (40)または (42)記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
(45) 前記 (44)記載の発現ベクターを導入した細胞、
(46) 前記 (45)記載の細胞を、前記 (44)記載の発現ベクターの発現可能な条件 下で培養することを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法、
(47) 前記 (41)または (43)記載のタンパク質に特異的に結合する抗体、
(48) 前記 (40)または (42)記載のポリヌクレオチドの 、ずれかに特異的な、連続す る少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び Z又は該ポリヌクレオチドに相補 的なポリヌクレオチド、
(49) 前記 (41)または (43)記載のタンパク質のいずれかに特異的な、連続する少 なくとも 6アミノ酸を含有するポリペプチド、
(50) 前記 (40)または (42)記載のポリヌクレオチドの 、ずれかを人為的に染色体 中に挿入したか、あるいは 、ずれかをノックアウトさせた遺伝子改変動物、
(51) 前記 (40)または (42)記載のポリヌクレオチドの 、ずれかに相補的なアンチセ ンス核酸または短 、干渉 RNA (siRNA)、
(52) ECAT15— 1および ECAT15— 2の複合体、
(53) 前記（52)記載の複合体、または当該複合体の細胞内への取り込みを促進す る物質との結合体を有効成分として含有する、前記（38)記載の ES細胞の機能維持 剤、ならびに
(54) 以下の（a)および (b) : (a) ECAT15— 1遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現べク ター、
(b) ECAT15 2遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現べク ター、
を有効成分として含有する、前記（39)記載の ES細胞の機能維持剤。
発明の効果
[0024] 本発明の ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 RnH7遺伝子及 び LOC380905(TDRD4)遺伝子は、 ES細胞で特異的に発現する遺伝子であることか ら、これら遺伝子または当該遺伝子よりコードされるタンパク質は、 ES細胞の検出、 体細胞核初期化物質のスクリーニング、または ES細胞維持物質のスクリーニング等 において有効に用いられる。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、本明細書にぉ 、て、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号 による表示は、 IUPAC— IUBの規定〔IUPAC- IUB Communication on Biological No menclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明 細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における 慣用記号に従う。
[0026] 本明細書にお!、て「遺伝子（ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝 子、 RnH7遺伝子、 LOC380905(TDRD4)遺伝子）」という用語を用いる場合、技術内 容に応じて、 cDNA(mRNA)のみならずゲノム DNAを指す場合もある。
本明細書にぉ 、て「ポリヌクレオチド」とは、 RNAおよび DNAの!、ずれをも包含する 趣旨で用いられる。
本明細書において「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗 体、一本鎖抗体、または Fabフラグメントや Fab発現ライブラリーによって生成されるフ ラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
[0027] 本明細書において「ECAT15-1遺伝子」とは、配列番号： 1に記載の塩基配列を含 有するマウス ECAT15-1遺伝子、配列番号： 3に記載の塩基配列を含有するヒト ECA T15-1遺伝子、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げら れる。
本明細書において「ECAT15-2遺伝子」とは、配列番号： 5に記載の塩基配列を含 有するマウス ECAT15-2遺伝子、配列番号： 7に記載の塩基配列を含有するヒト ECA T15-2遺伝子、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げら れる。
[0028] 本明細書において「ECAT16遺伝子」とは、配列番号： 17に記載の塩基配列を含有 するマウス ECAT16遺伝子、配列番号： 33に記載の塩基配列を含有するヒト ECAT16 遺伝子、またはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。
[0029] 本明細書において「Rnfl7遺伝子」とは、配列番号： 9に記載の塩基配列を含有する マウス Rnfl 7遺伝子、配列番号： 11に記載の塩基配列を含有するヒト Rnfl 7遺伝子、ま たはこれら塩基配列に類似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。
本明細書において「LOC380905(TDRD4)遺伝子」とは、 LOC380905遺伝子または T DRD4遺伝子と呼ばれる遺伝子であり、具体的には配列番号： 13に記載の塩基配列 を含有するマウス LOC380905遺伝子、配列番号： 15に記載の塩基配列を含有するヒ ト TDRD4遺伝子（マウス LOC380905のヒト相同遺伝子）、またはこれら塩基配列に類 似の塩基配列を含有する遺伝子が挙げられる。
[0030] 前記にお!、て「類似の塩基配列を含有する遺伝子」とは、前記配列番号に示される 塩基配列中、 1若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を 含有する遺伝子や、前記配列番号で示される塩基配列と高!ヽ相同性を有する塩基 配列を含有する遺伝子が挙げられる。
ここで「高い相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子」とは、具体的には前記配 列番号で示された塩基配列に対して 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 9 0%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する遺伝子が 挙げられる。また別の態様としては、前記配列番号で示された塩基配列 (相補鎖)と ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする遺伝子が挙げられる。ここでストリンジェ ントな条件とは、ハイブリダィズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させる ことにより調節することができ、所望の相同性に応じて設定されるが、例えば塩濃度： 6 X SSC、温度： 65°Cのハイブリダィズ条件が挙げられる。 [0031] これら「 (本発明の各 ECAT遺伝子と)類似の塩基配列を含有する遺伝子」は、マー カーとして使用する場合は、各 ECAT遺伝子の ES細胞特異的な発現を検出できると Vヽぅ特徴を有すればよ!ヽ。また後述の ES細胞の機能維持剤として使用する場合は、 各 ECAT遺伝子と同様の ES細胞の機能維持活性を有すれば良い。
[0032] 本明細書において「ECAT15-1」とは、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を含有す るマウス ECAT15-1タンパク質、配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を含有するヒト EC AT15-1タンパク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタン パク質が挙げられる。
本明細書において「ECAT15-2」とは、配列番号: 6に記載のアミノ酸配列を含有す るマウス ECAT15-2タンパク質、配列番号： 8に記載のアミノ酸配列を含有するヒト EC AT15-2タンパク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタン パク質が挙げられる。
[0033] 本明細書において「ECAT16」とは、配列番号： 18に記載のアミノ酸配列を含有する マウス ECAT16タンパク質、配列番号： 34に記載のアミノ酸配列を含有するヒト ECAT 16タンパク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質 が挙げられる。
[0034] 本明細書において「Rnfl7」とは、配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を含有するマ ウス RnH7タンパク質、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含有するヒト Rnfl7タンパ ク質、またはこれらアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げら れる。
本明細書において「LOC380905(TDRD4)」とは、配列番号： 14に記載のアミノ酸配 列を含有するマウス LOC380905タンパク質、配列番号： 16に記載のアミノ酸配列を 含有するヒト TDRD4タンパク質（マウス LOC380905のヒト相同タンパク）、またはこれら アミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。
[0035] 前記にお!ヽて「 (本発明の各 ECATと)類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質」と は、前記「 (本発明の各 ECAT遺伝子と)類似の塩基配列を含有する遺伝子」によりコ ードされるタンパク質が挙げられる。具体的には前記配列番号で示されたアミノ酸配 列と 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以 上の相同性を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。
[0036] これら「 (本発明の各 ECATと)類似のアミノ酸配列を含有するタンパク質」は、マー カー (抗体)を作製するための抗原として使用する場合は、各 ECATと同様の抗原性 を有すると!ヽぅ特徴を有すればよ!ヽ。また後述の ES細胞の機能維持剤として使用す る場合は、各 ECATと同様の ES細胞の機能維持活性を有すれば良 、。
[0037] (1)ES細胞検出用マーカー
(1-1)ポリヌクレオチド
本発明は前述するように、 ES細胞において、 ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝 子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子及び LOC380905(TDRD4)遺伝子（以下、本発明 遺伝子と称する場合がある）が ES細胞で特異的に発現しているという知見を発端に、 これらの遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって、被験細胞が ES 細胞であるか否かを検出できるという知見に基づくものである。具体的には本発明は 、これら ECAT15- 1遺伝子、 ECAT15- 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子また は LOC380905(TDRD4)遺伝子の!/、ずれかに特異的なポリヌクレオチドからなる、 ES 細胞検出用マーカーを提供する。
ここで「ES細胞」とはいわゆる ES細胞の他、 ES様細胞も含まれる。当該「ES様細胞」 とは、 ES細胞としての性質を有する細胞、すなわち未分化'多能性を有する細胞を意 味する。
[0038] ここで「特異的なポリヌクレオチド」とは、前記各遺伝子を他の遺伝子と区別して特 定することのできる長さを有するポリヌクレオチドを指す。なお本発明遺伝子の中には 、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子および LOC380905(TDRD4)遺伝子という、遺伝子配 列上オーバーラップする遺伝子が存在して ヽる。これらの遺伝子は!ヽずれも ES細胞 特異的発現遺伝子であるため、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子および LOC380905(T DRD4)遺伝子の 2種以上に結合するポリヌクレオチドをマーカーとして使用しても何ら 支障はない。よって ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子および LOC380905(TDRD4)遺伝 子はお互いに「他の遺伝子」の範疇から除外するものとする。具体的には、 ECAT16 遺伝子、 Rnfl7遺伝子および LOC380905(TDRD4)遺伝子のうちの 2種以上を認識す るポリヌクレオチドであっても、これらと無関係な他の遺伝子を認識しない限り、前記「 特異的なポリヌクレオチド」の範疇に含まれる。
また、同一因子に関してヒトとマウスといった種間の相違は「他の遺伝子」の範疇か ら除外するものとする。具体的には、 ECAT15-1遺伝子の 2種以上の種 (例えばマウス とヒト）、 ECAT15-2遺伝子の 2種以上の種（例えばマウスとヒト）、 ECAT16遺伝子の 2 種以上の種 (例えばマウスとヒト）、 Rnfl 7遺伝子の 2種以上の種 (例えばマウスとヒト）、 または LOC380905(TDRD4)遺伝子の 2種以上の種（例えばマウスとヒト）を認識するポ リヌクレオチドであっても、これと無関係な他の遺伝子を認識しない限り、前記「特異 的なポリヌクレオチド」の範疇に含まれる。
[0039] 本発明の ES細胞検出用マーカーは、具体的には、通常 15塩基もあれば、 1つの遺 伝子を他の遺伝子から区別して特定することが可能である。従って本発明のマーカ 一の具体例として、前記 ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rn fl7遺伝子又は LOC380905(TDRD4)遺伝子の塩基配列において、連続する少なくと も 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び Zまたはそれに相補的なポリヌクレオチドか らなる ES細胞検出用マーカーが挙げられる。
より具体的には、本発明のマーカーは、配列番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17ま たは 33の 、ずれかに記載の塩基配列にお!/、て、連続する少なくとも 15塩基を含有 するポリヌクレオチド及び Zまたはそれに相補的なポリヌクレオチドを含有する ES細 胞検出用マーカーが挙げられる。
[0040] ここで相補的なポリヌクレオチド (相補鎖、逆鎖）とは、前記本発明遺伝子の塩基配 列からなるポリヌクレチドの全長配列、または該塩基配列にぉ 、て少なくとも連続した 15塩基長の塩基配列を有するその部分配列に対して、 A:Tおよび G:Cといった塩基 対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただ し、力かる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合 に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイスすることができる 程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、 Berger and Kimmel (1987, uuide to Molecularし lonmg Techniques Metnods in Enzy mology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されるように、複合体或い はプローブを結合する核酸の融解温度 (Tm)に基づ 、て決定することができる。例え ばノヽイブリダィズ後の洗浄条件として、通常「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程度の条件を 挙げることができる。相補鎖は力かる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダィ ズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいノヽイブ リダィズ条件として「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイブリダィズ条 件として「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的 には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある 塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも 90%、好ましくは 95%の相同性を有す る塩基配列力もなる鎖を例示することができる。
[0041] ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、本発明遺伝子の塩基配列、またはその部 分配列を有するものだけでなぐ上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関 係にある塩基配列力もなる鎖を含めることができる。
[0042] さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖 (逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一 本鎖の形態でマーカーとして使用されても、また二本鎖の形態でマーカーとして使用 されてもよい。また前記ポリヌクレオチドが検出用に標識されたものも、本発明のポリ ヌクレオチドの範疇に含まれる。
[0043] 本発明の ES細胞検出用マーカーは、具体的には、本発明遺伝子の塩基配列 (全 長配列）力もなるポリヌクレオチドであってもよ 、し、その相補配列力もなるポリヌクレ ォチドであってもよい。また本発明遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチ ドを選択的に (特異的に)認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配 列の部分配列力もなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては 、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも 15 個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
[0044] なお、ここで「選択的に（特異的に)認識する」とは、例えばノーザンプロット法にお いては、本発明遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出でき ること、また RT-PCR法においては本発明遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオ チドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなぐ当業者が上 記検出物または生成物が本発明遺伝子に由来するものであると判断できるものであ ればよい。 [0045] 本発明のマーカーは、例えば配列番号： 1で示されるマウス ECAT15-1遺伝子、配 列番号： 3で示されるヒト ECAT15-1遺伝子、配列番号： 5で示されるマウス ECAT15-2 遺伝子、配列番号： 7で示されるヒト ECAT15-2遺伝子、配列番号： 9で示されるマウス Rnfl 7遺伝子、配列番号： 11で示されるヒト Rnfl 7遺伝子、配列番号： 13で示されるマウ ス LOC380905遺伝子、配列番号： 15で示されるヒト TDRD4遺伝子、配列番号： 17で 示されるマウス ECAT16遺伝子、配列番号： 33で示されるヒト ECAT16遺伝子の塩基 酉己歹 IJをもとに、例えば primer 3 ( HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin I primer/ primer ^ gi http://www.genome.wi.mit.edu/ cgi— bin/ primer/ primer «3. egリあ るいはベクター NTI (Infomax社製)を利用して設計することができる。具体的には前記 本発明遺伝子の塩基配列を primer 3またはベクター NTIのソフトウェアにかけて得ら れる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含 む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。具体例としては、配 列番号： 19〜32に記載の塩基配列からなるプライマーが例示される。
[0046] 本発明のマーカーは、上述するように連続する少なくとも 15塩基の長さを有するも のであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定す ることがでさる。
[0047] (1-2)プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
被験細胞力 ¾S細胞であるか否かの検出は、被験細胞における本発明遺伝子の!/ヽ ずれかの発現の有無または発現レベル (発現量)を評価することによって行われる。 この場合、上記本発明のマーカーは、本発明遺伝子の発現によって生じた RNAま たはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーと して、または該 RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するため のプローブとして利用することができる。
[0048] 本発明のマーカーを ES細胞の検出においてプライマーとして用いる場合には、通 常 15bp〜100bp、好ましくは 15bp〜50bp、より好ましくは 15bp〜35bpの塩基長を有す るものが例示できる。さらに好ましくは 20bp〜35bpの塩基長を有するものが例示され る。また検出プローブとして用いる場合には、通常 15bp〜全配列の塩基数、好ましく は 15bp〜 lkb、より好ましくは 100bp〜 lkbの塩基長を有するものが例示できる。 [0049] 本発明のマーカーは、ノーザンブロット法、 RT- PCR法、 in situハイブリダーゼーショ ン法、 DNAチップなどといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法におい て、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によ つて被験細胞における本発明遺伝子の発現の有無または発現レベル (発現量)を評 価することができる。
測定対象試料としては、被験細胞から常法に従って調製した total RNAを用いても よいし、さらに該 RNAをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。 また細胞そのものを測定対象試料として用いてもょ 、。
[0050] (1-3)抗体
本発明は、 ES細胞検出用マーカーとして、 ECAT15-1、 ECAT15-2、 ECAT16、 Rnf 17または LOC380905(TDRD4) (以下、本発明タンパク質と称する場合がある）の！、ず れカを特異的に認識することのできる抗体を提供する。
当該抗体として、具体的には、配列番号: 2に記載のアミノ酸配列を含有するマウス ECAT15- 1、配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を含有するヒト ECAT15-1、配列番号 : 6に記載のアミノ酸配列を含有するマウス ECAT15- 2、配列番号: 8に記載のアミノ酸 配列を含有するヒト ECAT15-2、配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を含有するマウス Rnfl7、配列番号： 12に記載のアミノ酸配列を含有するヒト Rnfl7、配列番号： 14に記 載のアミノ酸配列を含有するマウス LOC380905、配列番号： 16に記載のアミノ酸配列 を含有するヒト TDRD4、配列番号： 18に記載のアミノ酸配列を含有するマウス ECAT1 6または配列番号: 34に記載のアミノ酸配列を含有するヒト ECAT16を特異的に認識 することのできる抗体を挙げることができる。これらの抗体は、被験細胞における本発 明タンパク質の発現の有無またはその程度を検出することによって、被験細胞が ES 細胞であるか否かを検出することのできるツールとして有用である。
[0051] ここで「(本発明タンパク質を)特異的に認識する抗体」とは、前記「特異的なポリヌク レオチド」と同様の特異性を意味する。すなわち、 ECAT16、 RnH7および LOC380905 (TDRD4)のうちの 2種以上を認識する抗体であっても、これらと無関係な他のタンパク を認識しない抗体である限り、前記「特異的な抗体」の範疇に含まれる。
また ECAT15-1の 2種以上の種（例えばマウスとヒト）、 ECAT15-2の 2種以上の種（例 えばマウスとヒト）、 ECAT16の 2種以上の種（例えばマウスとヒト）、 Rnfl7の 2種以上の 種（例えばマウスとヒト）、または LOC380905(TDRD4)の 2種以上の種（例えばマウスと ヒト)を認識する抗体であっても、これと無関係な他のタンパクを認識しな ヽ抗体であ る限り、前記「特異的な抗体」の範疇に含まれる。
[0052] 本発明の抗体は、その形態に特に制限はなぐ本発明タンパク質を免疫抗原とする ポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに本 発明タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常 8アミノ酸、好ましくは 1 5アミノ酸、より好ましくは 20アミノ酸力 なるポリペプチドに対して抗原結合性を有す る抗体も、本発明の抗体に含まれる。
[0053] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造することができる（Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11.12〜1 1.13(2000)) o具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に 従って大腸菌等で発現し精製した本発明タンパク質を用いて、あるいは常法に従つ て本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等 の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。 一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製した本 発明タンパク質、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴぺプチ ドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合さ せて調製したハイプリドーマ細胞の中力 得ることができる（Current protocols in Mol ecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jonn Wiley and bons. Section 11. 4〜11.11)。
[0054] 抗体の作製に免疫抗原として使用される本発明タンパク質は、本発明により提供さ れる遺伝子の配列情報（配列番号 1,3,5,7,9,11, 13,15, 17,33)に基づいて、 DNAクロ 一-ング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフエクシヨン、形質転換体の培養およ び培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当 業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))などに準じ て行うことができる。 [0055] 具体的には、本発明タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現で きる組み換え DNA (発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し 、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、 目的タンパク質を回収すること〖こ よって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。 また、これら本発明タンパク質の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配 列の情報（配列番号 2,4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18,34)に従って、一般的な化学合成法 (ぺ プチド合成）〖こよって製造することもできる。
[0056] 本発明抗体はまた、本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチド を用いて調製されるものであってょ 、。力かる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ ポリ）ペプチドは、本発明タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望 ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つ本発明タンパク質のアミノ酸配列にお いて少なくとも連続する 8アミノ酸、好ましくは 15アミノ酸、より好ましくは 20アミノ酸から なるオリゴ (ポリ）ペプチドを例示することができる。
[0057] かかるオリゴ (ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバ ントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、 そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラ ルゲル、並びにリゾレシチン、プル口ニックポリオル、ポリア-オン、ペプチド、油乳剤 、キーホールリンペットへモシァニン及びジニトロフエノールのような表面活性物質、 B CG (カルメット一ゲラン桿菌）やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントが 含まれる。
[0058] 本発明の抗体は本発明タンパク質に特異的に結合する性質を有することから、該 抗体を利用することによって、本発明タンパク質（ECAT15-1、 ECAT15-2、 ECAT16、 Rnfl7または LOC380905(TDRD4))を特異的に検出することができる。すなわち、当該 抗体は被験細胞 袓織における本発明タンパク質の発現の有無を検出するためのプ ローブとして有用である。
[0059] (2)ES細胞の検出方法
本発明は、前述した本発明のマーカーを利用した ES細胞の検出方法を提供する ものである。 具体的には、本発明の ES細胞検出方法は、被験細胞に含まれる本発明遺伝子 (E CAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LOC380 905(TDRD4)遺伝子）の遺伝子発現レベル、およびこれらの遺伝子に由来するタンパ ク質レベル（ECAT15- 1、 ECAT15- 2、 ECAT16、 Rnfl7または LOC380905(TDRD4)) を測定し、被験細胞が ES細胞である力否かを判断すると 、うものである。
本発明の検出方法は、具体的には下記のようにして実施される。
[0060] (2-1)測定対象として RNAを利用する場合
測定対象物として RNAを利用する場合、 ES細胞の検出は、具体的に下記の工程 (a )、（b)及び (c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験細胞に由来する RNAまたはそれ力 転写された相補的ポリヌクレオチドと、 本発明のマーカー（ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7 遺伝子または LOC380905(TDRD4)遺伝子の!/、ずれかに由来するポリヌクレオチド）と を結合させる工程、
(b)該マーカーに結合した被験細胞由来の RNAまたは該 RNAから転写された相補 的ポリヌクレオチドを、上記マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、被験細胞力 ¾S細胞であるか否かを判断するェ 程。
[0061] 測定対象物として RNAを利用する場合は、本発明の検出方法は該 RNA中の本発 明遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前 述のポリヌクレオチド力 なる本発明のマーカーをプライマーまたはプローブとして用 いて、ノーザンブロット法、 RT- PCR法、 DNAチップ解析法、 in situハイブリダィゼーシ ヨン解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
[0062] ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明のマーカーをプローブとして用いるこ とによって、 RNA中の本発明遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定す ることができる。具体的には、本発明のマーカー湘補鎖)を放射性同位元素 (32P、 33 Pなど: RI)や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にト ランスファーした被験細胞由来の RNAとハイブリダィズさせた後、形成されたマーカ 一と RNAとの二重鎖を、マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナ ルを X線フィルム等で検出するカゝ、放射線検出器 (BAS-1800II、富士フィルム社製)ま たは蛍光検出器等で検出、測定する方法を例示することができる。また、 AlkPhos Dir ect Labelling ana Detection System、 マンャムファノレマン /'ノ ィオアク社製)を用 ヽ て、該プロトコールに従ってマーカー（プローブ DNA)を標識し、被験細胞由来の RN Aとハイブリダィズさせた後、マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオ イメージヤー STORM860 (アマシャムフアルマシアバイオテク社製）で検出、測定する 方法を使用することもできる。
[0063] RT-PCR法を利用する場合は、本発明のマーカーをプライマーとして用いることによ つて、 RNA中の本発明遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することがで きる。具体的には、被験細胞由来の RNAから常法に従って cDNAを調製して、これを 铸型として標的遺伝子 (本発明遺伝子)の領域が増幅できるように、本発明のマーカ 一（一対のプライマー）をこれとハイブリダィズさせて、常法に従って PCR法を行 、、 得られた増幅二本鎖 DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅され た二本鎖 DNAの検出は、ァガロースゲル電気泳動後ェチジゥムブロマイド染色によ り検出する方法、上記 PCRを予め RIや蛍光物質で標識してぉ 、たプライマーを用い て行うことによって産生される標識二本鎖 DNAを検出する方法、産生された二本鎖 DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した本発明 のマーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダィズさせて検出する方法などを 用いることができる。なお、生成された標識二本鎖 DNA産物はアジレント 2100バイオ アナライザ (横河アナリティカルシステムズ社製)などで測定することができる。また、 S YBR Green RT- PCR Reagents (アプライドバイオシステム社製)で該プロトコールに 従って RT- PCR反応液を調製し、 ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (ァプ ライドバイオシステム社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
[0064] DNAチップ解析を利用する場合は、本発明のマーカーを DNAプローブ（1本鎖ま たは 2本鎖）として貼り付けた DNAチップを用意し、これに被験細胞由来の RNAから 常法によって調製された cRNAとハイブリダィズさせて、形成された DNAと cRNAとの二 本鎖を、本発明のマーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法 を挙げることができる。 [0065] (2-2)測定対象としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合、本発明の ES細胞の検出方法は、被験 細胞中の本発明タンパク質（ECAT15-1、 ECAT15-2、 ECAT16、 Rnfl7または LOC38 0905(TDRD4))を検出することによって実施される。具体的には下記の工程 (a)、（b)及 び (c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験細胞に由来するタンパク質と、本発明のマーカー（ECAT15- 1、 ECAT15-2、 ECAT16、 Rnfl7または LOC380905(TDRD4)のいずれかを認識する抗体）とを結合さ せる工程、
(b)該マーカーに結合した被験細胞由来のタンパク質を、上記マーカーを指標として 測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、被験細胞力 ¾S細胞であるか否かを判断するェ 程。
[0066] より具体的には、抗体に関する本発明のマーカーを用いて、被験細胞、または被験 細胞抽出液などを試料として用い、ウェスタンプロット法や組織免疫学的染色法など の公知方法で、本発明タンパク質を検出、定量する方法を挙げることができる。
[0067] ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明のマーカーを用いた後、二次抗体と して1251などの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルォキシターゼ (HR P)などの酵素等で標識した標識抗体 (一次抗体に結合する抗体)を用い、得られる 標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを X線フィルム 等で検出するか、放射線測定器 (BAS-1800II :富士フィルム社製など）、蛍光検出器 などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明のマー カーを用いた後、 ECL Plus Western Blotting Detction System (アマシャムファノレマ シァバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオィメー ジャー STORM860(アマシャムフアルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
[0068] (2-3)ES細胞の検出
ES細胞 (ES様細胞)である力否かの判断は、被験細胞にぉ 、て本発明遺伝子の V、ずれかの発現量 (レベル）、若しくは本発明タンパク質の 、ずれかの発現量 (レべ ル)を測定することで実施できる。本発明遺伝子またはタンパク質のいずれかが発現 していること、または体細胞での発現と比較して発現レベルが高いことをもって、被験 細胞が ES細胞であると判断することができる。その際、 Oct3/4や Nanog(ECAT4)とい つた他の ES細胞特異的発現遺伝子が発現して ヽることも、併せて確認することが望 ましい。
[0069] (3)体細胞核初期化物質または ES細胞未分化 ·多能性維持物質等のスクリーニング 参考例 1に記載したように、本発明者らは、本発明遺伝子と同じく ES細胞特異的発 現遺伝子である ECAT3遺伝子にマーカー遺伝子である β geo遺伝子をノックインした ノックインマウスカゝら体細胞（リンパ球)を調製した。この体細胞を ES細胞の培養条件 で培養し、 G418で選択したところ、全て死滅し、薬剤耐性コロニーは一つも得られな かった。一方、前記体細胞を正常 ES細胞と融合し、 ES細胞の培養条件で培養し、 G4 18で選択したところ、生存細胞が出現した。この生存細胞を解析した結果、 ECAT4や Oct3/4を発現し、 ES細胞としての性質を有する ES様細胞であることが分力つた。以上 の実験結果より、体細胞と ES細胞との融合により体細胞の核が初期化（リブログラミン グ）されたために ES様細胞が出現し、そして ECAT3遺伝子に置き換えられた β geoが 発現して薬剤耐性となったことが明らかとなった。
[0070] このように ES細胞特異的発現遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置 にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞は、 ES様細胞に変換され た時にのみ、マーカー遺伝子を発現する。すなわち ES様細胞への変換を薬剤耐性 等のマーカー遺伝子の発現で容易にモニターすることができる。この性質を利用す れば、体細胞力も ES様細胞への変換を誘導する核初期化因子を、薬剤耐性等のマ 一力一遺伝子の発現を指標として効率的にスクリーニングすることができる。また同様 に、前記マーカー遺伝子の発現を指標として、 ES様細胞を効率的に選択することが できる。
[0071] さらに「ES様細胞への変換を薬剤耐性等のマーカー遺伝子の発現で容易にモニタ 一する」という前記システムは、 ES細胞の未分化'多能性維持物質のスクリーニング にも応用することができる。すなわち本発明の前記システムによれば、 ES細胞状態を 薬剤耐性等のマーカー遺伝子の発現で容易にモニターすることができるため、例え ば ES細胞状態を維持できな ヽ培養条件下に被験物質を添加し、マーカー遺伝子発 現細胞の存在の有無を調べることにより、 ES細胞の未分化 ·多能性維持 (候補)物質 を容易にスクリーニングすることができる。
[0072] 以上のスクリーニング方法等については既に特許出願がなされている（特願 2004-2
76572、出願日： 2004年 9月 24日（優先日： 2004年 2月 19日）、出願人：山中伸弥、住 友製薬株式会社）（その後 2005年 2月 16日国際出願。国際出願番号: PCT/JP2005/0
02842、国際公開番号: WO2005/080598)。
[0073] なお、前記で体細胞力 核初期化物質により変換されて生じた「ES様細胞」とは、 E
S細胞としての性質を有する細胞、すなわち未分化 ·多能性を有する細胞を意味する 以下において「本発明遺伝子」とは、技術常識に応じてゲノム遺伝子を指す場合も ある。
[0074] (3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
本発明は、以下の (a)および (b)の工程：
(a) ECAT15-l遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LOC 380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺 伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出 現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング方法を提供する。
[0075] 前記で「マーカー遺伝子」とは、当該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、 細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子全般を指す。具体的には薬剤耐性遺 伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子またはこれらの組 み合わせに係る遺伝子が挙げられる。
[0076] 薬剤耐性遺伝子としては、具体的にはネオマイシン耐性遺伝子 (neo)、テトラサイク リン耐性遺伝子 (tet)、カナマイシン耐性遺伝子、ゼォシン耐性遺伝子 (zeo)、ハイグ ロマイシン耐性遺伝子 (hygro)等が挙げられる。各薬剤を含有する培地 (選択培地と いう）で細胞を培養することにより、薬剤耐性遺伝子が導入'発現した細胞のみが生 き残る。従って、選択培地で細胞を培養することにより、薬剤耐性遺伝子を含有する 細胞を容易に選択することができる。
[0077] 蛍光タンパク質遺伝子としては、具体的には GFP (緑色蛍光タンパク質)遺伝子、 Y FP (黄色蛍光タンパク質)遺伝子、 RFP (赤色蛍光タンパク質)遺伝子、ェクオリン遺 伝子等が挙げられる。これら蛍光タンパク質遺伝子が発現した細胞は、蛍光顕微鏡 で検出することができる。また蛍光強度の違いを利用することによりセルソーター等で 分離 '選択することや、細胞を限界希釈して 1ゥエルあたり 1細胞以下とした後に培養 •増殖させ、蛍光を発する細胞 (ゥエル)を蛍光顕微鏡下で検出することにより当該細 胞を選択することができる。さらに、軟寒天培地などの上でコロニーを形成させ、蛍光 顕微鏡下などでコロニーを選択することもできる。
[0078] 発光酵素遺伝子としては、具体的にはルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。これ ら発光酵素遺伝子を発現した細胞は、発光基質を加えて発光光度計で発光量を測 定すること〖こより検出することができる。また細胞を限界希釈して 1ゥエルあたり 1細胞 以下とした後に培養 ·増殖させ、各ゥエルから一部の細胞を採取し、発光基質を加え て発光光度計で発光の如何を測定することにより当該細胞を選択することができる。
[0079] 発色酵素遺伝子としては、具体的には j8ガラクトシダーゼ遺伝子、 j8ダルク口ニダ ーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、又は分泌型アルカリフォスファターゼ である SEAP遺伝子等が挙げられる。これら発色酵素遺伝子が発現した細胞は、発色 基質を加えて発色の有無を観察することにより検出することができる。また細胞を限 界希釈して 1ゥエルあたり 1細胞以下とした後に培養 ·増殖させ、各ゥエル力 一部の 細胞を採取し、発色基質を加えて発色の如何を観察することにより当該細胞を選択 することができる。
[0080] これらマーカー遺伝子の組み合わせに係る遺伝子としては、具体的にはネオマイ シン耐性遺伝子 (neo)と βガラクトシダーゼ遺伝子（ β -gal)との融合遺伝子である β g eo遺伝子が挙げられる。
[0081] 以上のようなマーカー遺伝子はいずれも当業者に周知であり、このようなマーカー 遺伝子を含有するベクターはインビトロジェン社、アマシャムバイオサイエンス社、プ 口メガ社、 MBL (医学生物学研究所)等から市販されて ヽる。
[0082] 前記マーカー遺伝子のうち、細胞の選択が容易であるという観点から、特に好まし いのは薬剤耐性遺伝子、または当該薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子である。
[0083] 前記において「体細胞」とは、正常 ES細胞等の未分化'多能性維持細胞を除く全て の細胞を意味する。具体的には、例えば（1)神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細 胞、精子幹細胞等の組織幹細胞 (体性幹細胞）、（2)組織前駆細胞、（3)リンパ球、 上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の分化した細胞、（4)ES細胞力 何らかの手法 で未分化 ·多能性を消失させた細胞、（5)体細胞と ES細胞との融合細胞であって未分 化 ·多能性を有さな 、細胞、などが挙げられる。
[0084] 本発明のスクリーニング方法においては、本発明遺伝子の発現調節領域により発 現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞を、ス クリーニング用細胞として用いる。
ここで「発現調節領域」とは、遺伝子の発現 (転写)を調節する領域のことであり、「 プロモーター領域」、若しくは「プロモーター及びェンノ、ンサ一領域」を含む領域を意 味する。
本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を 存在させる方法は、いろいろ知られており、当業者に周知の如何なる方法を用いて マーカー遺伝子を存在させても良い。大別すると、 (3-1-1)個体 (マウス)を利用して マーカー遺伝子を存在させる場合と、 (3-1-2)個体を利用せずに細胞レベルでマー カー遺伝子を存在させる場合がある。
[0085] (3-ト 1)個体 (マウス）を利用してマーカー遺伝子を存在させる方法
個体 (マウス)を利用してマーカー遺伝子を存在させる場合は、本発明遺伝子の発 現調節領域により発現調節を受けるゲノム上の位置にマーカー遺伝子を存在させる 。この場合、個体が有する本発明遺伝子自身は、発現可能な形で存在していても良 く、また本発明遺伝子が破壊された形で存在して ヽても良 、。
遺伝子の発現調節領域は、通常ェクソン 1より上流域に存在する。従って、本発明 遺伝子の発現調節領域によりマーカー遺伝子が発現調節を受けるためには、当該 マーカー遺伝子は、本発明遺伝子のェクソン 1開始部位より下流域に存在させること が望ましい。この場合、ェクソン 1開始部位より下流であれば、どのような位置に存在 していても良い。 [0086] (3- 1-1- a)本発明遺伝子を破壊する場合
本発明遺伝子を破壊する方法は、当業者に周知の如何なる方法を用いても良いが 、最も良く使われる手法としては、マーカー遺伝子を含有し、かつ本発明遺伝子の任 意の位置で相同組換えを起こすベクター（以下ターゲッティングベクターと称する）を 用いて、相同組換えにより当該本発明遺伝子を標的破壊し、代わりにマーカー遺伝 子をこの位置に存在させる方法が挙げられる。このように本発明遺伝子を破壊し、そ の位置にマーカー遺伝子を存在させることを、「本発明遺伝子にマーカー遺伝子をノ ックインする」と言う。
[0087] すなわち本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング法の具体例として、本発 明は以下の (a)および (b) :
(a) ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LO C380905(TDRD4)遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックインした遺伝子を 含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を生 じさせた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
の工程を含む、体細胞核初期化物質のスクリーニング方法を提供する。
[0088] マーカー遺伝子をノックインする方法は種々知られている力 中でもプロモータート ラップ法が好適に用いられる。当該プロモータートラップ法は、プロモーターを持たな V、ターゲッティングベクターを相同組換えによりゲノム中に挿入し、相同組換えが正し く起こった場合に内在性プロモーター (本発明遺伝子のプロモーター）によりマーカ 一遺伝子が発現するというものである。以下、当該プロモータートラップ法により本発 明遺伝子発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させ る方法につき具体例を示す。
[0089] まず、ターゲッティングに必要な本発明遺伝子のゲノム配列を決定する。当該ゲノ ム酉己歹 IJは、例えば公的ァータベースである Mouse Genome Resources (http://www.n cbi.nlm.nih.gov/genome/guide/mouse/)等において既に公知である場合はこの配列 情報を利用して配列決定することができる。また未知の場合は、配列番号： 1、 3、 5、 7 、 9、 11、 13、 15、 17、 33に記載の本発明遺伝子の一部をプライマーとして用い、当業 者に入手可能なゲノムライブラリーを PCR法等でスクリーニングすることなどにより、所 望の本発明遺伝子のゲノム領域を含有するゲノミッククローンを単離することや、ゲノ ム塩基配列を決定することができる。ここで用いるゲノムライブラリ一としては、例えば マウス BAし (bacterial artincial chromosomeノフィフフリ ~~ (Invitrogen)や PAC(P1— denv ed artificial chromosome)フイブフリ ~~ (Invitrogen)等力 けられる。
[0090] 次に、前記で同定した本発明遺伝子のゲノム DNA配列に基づき、マーカー遺伝子 と置き換える本発明遺伝子のゲノム領域を決定する (以下、本発明遺伝子ゲノム領域 Aと称する)。この本発明遺伝子ゲノム領域 Aを挟む 5'側領域 (5'アーム）と 3'側領域 (3 'アーム）を、ゲノム DNAを铸型として PCRを行うことなどにより増幅する。ここで铸型と なるゲノム DNAとしては、本発明遺伝子を含有するマウス BACクローンのゲノム DNA 等が挙げられる。 PCRのプライマーは前記本発明遺伝子ゲノム DNAの配列に基づき 設計することができる。増幅した 5'アームおよび 3'アームを、プロモータートラップ用タ ーゲッティングベクターのマーカー遺伝子カセットを挟む両側に挿入する。ここで用 いるプロモータートラップ用ターゲッティングベクターとしては、例えば IRES (internal r ibosome entry site)- β geo( βガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子の融合遺伝 子）カセット（Mountford P.et al, Proc.Natl.Sci.USA,91 :4303- 4307(1994))を含有する pBSSK(- )- IRES- j8 geoや、 IRES- Hygro (ハイグロマイシン而性遺伝子）カセットを含有 する同様のベクターなどを挙げることができる。ここで IRES-Hygroカセットは、前記 IR ES- β geoカセットの β geo部分を Hygro (Invitrogen)に置き換えることなどにより作製す ることがでさる。
次に作製されたターゲッティングベクターを制限酵素で消化して直鎖化し、これを エレクト口ポレーシヨン等により ES細胞に導入する。
[0091] 導入に用いる ES細胞としては、たとえば RF8細胞（Meiner,V. et al.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,93: 14041- 14046(1996))、 JI細胞（Li,E. et al.,Cell,69:915— 926(1992))、 CG R8細胞 (Nichols, J. et al., Development, 110: 1341-1348(1990》、 MG1.19細胞（Gassm ann,M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92: 1292- 1296(1995))や、市販されているマ ウス ES細胞 129SV(No.R- CMTI- 1- 15, R- CMTI- 1A)、マウス ES細胞 C57/BL6 (No. R-CMTI-2A)、マウス ES細胞 DBA- 1 (No.R- CMTI- 3A) (以上大日本製薬）等の ES細 胞が挙げられる。
[0092] ターゲッティングベクターの ES細胞への導入は、エレクト口ポレーシヨン（Meiner,V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041- 14046(1996)等参照）、リン酸カルシウム法 、 DEAE-デキストラン法、エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectam ine、 Lipofectin; Invitrogen)を用いる方法などにより行われる。その後当該ターゲッテ イングベクターが導入された ES細胞を、用いたマーカー遺伝子 (例えば薬剤耐性遺 伝子）の特性に基づき選択する。選択された ES細胞において正しく相同組み換えが 起こっていることは本発明遺伝子の一部をプローブとして用いたサザンプロット等に より確認することができる。以上のようにして本発明遺伝子 (ゲノム遺伝子）にマーカ 一遺伝子をノックインした遺伝子をへテロで含有する ES細胞を作製することができる
[0093] ES細胞の培養には、当業者に知られた如何なる培地を用いても良い。例えば RF8 細胞の場合、以下の組成： 15%FBS、 O.lmM Non Essential Amino Acids (GIBCO BR L)、 2mM L- glutamine、 50U/mlペニシリン-ストレプトマイシン、 0.1 ImM 2- ME(GIBCO BRL)/Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)の培地等が挙げられる。また巿販 の調製済み培地 (例えば大日本製薬 No.R-ES-101等）を用いることもできる。
[0094] ES細胞の培養においてフィーダ一細胞を用いる場合、当該フィーダ一細胞は、マ ウス胚から常法により調製した繊維芽細胞や繊維芽細胞由来の STO細胞株 (Meiner, V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041- 14046(1996))を用いても良ぐまた巿販 品を用いても良い。市販品としては、例えば PMEF-N、 PMEF-NL、 PMEF- H、 PMEF -HL (以上大日本製薬)などのフィーダ一細胞が挙げられる。フィーダ一細胞は、マイ トマイシン C処理することにより増殖を停止させた後に ES細胞の培養に用いることが 望ましい。
また、 ES細胞の培養において前記フィーダ一細胞を用いない場合は、 LIF (Leukem ia Inhibitory Factor)を添カ卩して培養を行うことができる。 LIFとしてはマウス組み換え L IF、ラット組み換え LIF (ケミコン社等)などが用いられる。
[0095] 次に、前記ターゲッティングベクターを含有する ES細胞をマウスに導入してノックァ ゥトマウス（マーカー遺伝子ノックインマウス）を作製する。当該マーカー遺伝子ノック インマウスの作製方法は当業者に周知である。具体的には、前記 ES細胞をマウス (例 えば C57BL/6等）の胚盤胞（blastocyst)にインジヱタトし、偽妊娠させたメスのマウス（I CR等)の子宫内に移植することによりキメラマウスを作製する。その後キメラマウスと通 常のマウス (C57BL/6等)とを交配させ、マーカー遺伝子がヘテロでノックインされた ヘテロ変異マウスを作製する。ヘテロ変異マウス同士を交配させることにより、マーカ 一遺伝子がホモでノックインされたホモ変異マウスが得られる。
以上のノックインマウスの作製については、 ECAT3ノックインマウス（Tokuzawa, Y., et al, Molecular and Cellular Biology, 23(8): 2699- 2708(2003))、 ECAT4ノックインマ ウス（Mitsui, K., et al., Cell, 113: 631- 642(2003))、 ECAT5ノックインマウス（Takahas hi, K., K. Mitsui, and S. Yamanaka, Nature,423(6939): p541- 545(2003)、特開 2003- 265166号公報)等を参考にされたい。
[0096] 本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニングで用いる体細胞は、前記へテロノッ クインマウスから単離された体細胞、ホモノックインマウスから単離された体細胞が挙 げられる。
[0097] (3-1-1-b)本発明遺伝子を破壊しな!ヽ場合
本発明遺伝子を破壊することなぐ本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節 を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させる手法としては、当該本発明遺伝子の発 現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた BACベクタ 一または PACベクター等を、マウスやラット等の個体に導入して作製したトランスジェ ニック非ヒト動物を利用する手法が挙げられる。以下 BACベクターを例にとり説明する ここで用いる本発明遺伝子の発現調節領域を含有する BACクローンは、前記 (3-1- 1-a)に記述したように、本発明遺伝子の配列情報に基づき単離 ·同定することができ る。本発明遺伝子含有 BACクローンにおいて、本発明遺伝子の一部をマーカー遺伝 子に置き換えるには、例えば Red/ET Recombination(Gene Bridges)を用いて容易に 行うことができる。各本発明遺伝子の発現調節領域は、通常、本発明遺伝子のェクソ ン 1より上流域に存在する。従って、本発明遺伝子の発現調節領域によりマーカー遺 伝子が発現調節を受けるためには、当該マーカー遺伝子は、本発明遺伝子のェクソ ンはり下流域に存在させることが望ましい。この場合、ェクソン 1より下流であれば、 本発明遺伝子上のどのような位置にマーカー遺伝子を存在させても良い。
[0098] 以上のようにして作製された本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受け る位置にマーカー遺伝子を存在させた BACベクター（以下、マーカー遺伝子含有 BA Cベクターと称することがある）を導入したトランスジヱニック動物を作製する方法は周 知であり、例えば実験医学別冊「新遺伝子工学ハンドブック改訂第 3版」（羊土社, 199 9年)等に基づき作製することができる。以下、マウスを例にとりトランスジエニック動物 の作製につき説明する。
マウス受精卵への遺伝子の導入方法は特に限定されるものではなぐマイクロイン ジェクシヨン法やエレクト口ポレーシヨン法等により導入することができる。導入後、得 られた卵細胞を培養し、仮親マウスの輸卵管に移植し、その後被移植マウス^!司育し 、産まれた仔マウス力も所望の仔マウスを選択する。当該選択は、例えば仔マウス由 来の DNAをドットブロットハイブリダィゼーシヨン法や PCR法で導入遺伝子の可否を調 ベること〖こより行うことができる。
前記仔マウスと野生型マウスとを交配させ、ヘテロトランスジヱニックマウス (導入遺 伝子をへテロで含有するマウス）を作製する。ヘテロマウス同士を交配させることによ り、マーカー遺伝子含有 BACベクターをホモで含有するトランスジエニックマウスを得 ることがでさる。
[0099] 本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニングにおいては、前記へテロトランスジ エニックマウスから単離された体細胞、ホモトランスジェニックマウスから単離された体 細胞のいずれも用いることができる。トランスジエニックマウスの場合、マウスが本来有 している本発明遺伝子は破壊されていないため、ホモトランスジエニックマウス由来の 体細胞を利用することが好まし 、。
さらに異なる ECAT遺伝子のトランスジエニックマウス同士を交配させることにより、ダ ブルトランスジェニックマウスを作製することができる。その際、交配させる各トランスジ エニックマウスは、それぞれ異なるマーカー遺伝子を含有して 、ることが好ま 、。
[0100] 以上のノックインマウスまたはトランスジエニックマウスから単離する体細胞は、マー カー遺伝子の発現して 、な ヽ (若しくは発現量の少な 、）如何なる細胞であっても良 い。具体的には ES細胞等の分ィ匕全能性細胞以外の細胞が挙げられ、例えば（1)神 経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞 (体性幹細胞） 、（2)組織前駆細胞、または (3)リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の分 化した細胞が挙げられる。
[0101] (3-1-2)個体を利用せずに細胞レベルでマーカー遺伝子を存在させる方法
個体を利用せずに、細胞内において、本発明遺伝子発現調節領域により発現調 節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させる方法はいろいろ知られており、当業 者に周知の如何なる方法を用いてマーカー遺伝子を存在させても良い。一般的には 、マーカー遺伝子を含有するベクターを細胞に導入する方法が挙げられる。
[0102] 遺伝子導入に用いられる細胞は、体細胞であっても ES細胞であっても良 、。ここで 用いる体細胞としては、マウス、ヒト、サル等の如何なる種に由来する体細胞であって も良い。当該体細胞は初代培養細胞であっても株化細胞であっても良ぐ具体的に は、胎児繊維芽細胞 (MEF)、骨髄由来間葉系幹細胞、または精子幹細胞等の初代 培養細胞や、 NIH3T3のような株化細胞などが挙げられる。また ES細胞としては、前記 に挙げたマウス ES細胞の他、ヒトゃサルの ES細胞も用いることができる。ここでヒト ES 細胞としては、 KhES-l、 KhES-2あるいは KhES-3 (以上、京大再生研付属幹細胞医 学研究センター）などが挙げられ、またサル ES細胞としては力-クイザル ES細胞 (旭 テクノグラス）を挙げることができる。これら ES細胞を本発明のスクリーニングに用いる 場合は、何らかの手法で ES細胞の未分化'多能性を消失させて力 用いる。
[0103] 細胞へのベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法 を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、エレクト口 ポレーシヨン法、遺伝子¾人用リヒッド (Lipofectamine、 Lipofectin; Invitrogen)を用 ヽ る方法などが挙げられる。
[0104] 導入に用いるベクターとしては、約 300kbの DNAまでクローユング可能なベクターで ある BACベクターや PACベクター、プラスミドベクター、さらには前記 (3-1-1)に記載し たターゲッティングベクターなどが挙げられる。以下これら各ベクターを用いて本発明 遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させ た体細胞を作製する方法にっ 、て記載する。 [0105] (3- 1- 2- a)BACベクター、 PACベクターを用いる場合
本発明遺伝子の発現調節領域を含有する BACベクターや PACベクターを利用する ことにより、本発明遺伝子発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺 伝子を存在させることができる。以下 BACベクターを例にとり説明する。
ここで用いる本発明遺伝子の発現調節領域を含有する BACクローン (以下本発明 遺伝子含有 BACクローンと称する）は、前記 (3- 1-1)に記述したように、本発明遺伝子 の配列情報に基づき単離'同定することができる。本発明遺伝子含有 BACクローンに おいて、本発明遺伝子の一部をマーカー遺伝子に置き換えるには、例えば Red/ET Recombination(Gene Bridges)を用いて容易に行うことができる。各本発明遺伝子の 発現調節領域は、通常、本発明遺伝子のェクソン 1より上流域に存在する。従って、 本発明遺伝子の発現調節領域によりマーカー遺伝子が発現調節を受けるためには 、当該マーカー遺伝子は、本発明遺伝子のェクソン 1開始部位より下流域に存在さ せることが望ましい。この場合、ェクソン 1開始部位より下流であれば、本発明遺伝子 上のどのような位置にマーカー遺伝子を存在させても良い。
[0106] 以上のようにして作製された本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受け る位置にマーカー遺伝子を存在させた BACベクターを体細胞に導入することにより、 本発明のスクリーニング用の体細胞とすることができる。ここで導入する BACベクター は 1種類であっても、異なる本発明遺伝子を含有する 2種類以上の BACベクターであ つても良い。なお、当該 BACベクター導入細胞を選択培地中で容易に選択できるよう に、 BACベクター中に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子 (以下第 2の薬剤耐性遺伝子と 称する）が挿入されていることが好ましい。この場合、体細胞での発現を可能とするた めに、当該第 2の薬剤耐性遺伝子の 5'側または 3'側に体細胞で発現するプロモータ 一が付加されている必要がある。また当該第 2の薬剤耐性遺伝子は、本発明遺伝子 の発現調節領域により発現調節を受ける位置に存在するマーカー遺伝子と同じ種類 の薬剤耐性遺伝子であっても良ぐ異なる種類の薬剤耐性遺伝子であっても良 、が 、異なる種類の薬剤耐性遺伝子であることが望ましい。前記で同じ種類の薬剤耐性 遺伝子を用いた場合は、第 2の薬剤耐性遺伝子の両側に loxP配列または FRT配列を 付加しておき、 BACベクター導入細胞を選択培地中で選択した後に、リコンビナーゼ Creまたは FLPにより第 2の薬剤耐性遺伝子を切り出すことができる。
前記と異なり、 BACベクター中に第 2の薬剤耐性遺伝子を挿入しない場合は、当該 第 2の薬剤耐性遺伝子を含有する第 2の発現ベクターを、前記 BACベクターと共に共 導入 (co-transfection)し、選択培地で選択しても良い。その場合、第 2の発現べクタ 一よりも BACベクターを大過剰に用いて導入を行うことが望ま U、。
[0107] 前記本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝 子を存在させた BACベクターを ES細胞に導入した場合は、用いたマーカー遺伝子の 性質に基づき、マーカー遺伝子が導入'発現している ES細胞を選択することができる 。その後、当該 ES細胞を体細胞に分化させることにより、本発明のスクリーニングに用 V、る体細胞とすることができる。 ES細胞はフィーダ一細胞の存在しな 、培養条件下で 分化するため、このような条件下で分化させて得られた体細胞や、レチノイン酸等の 当業者に知られた分化誘導剤で分化させて得られた体細胞を、本発明のスクリー- ングに用いることができる。ここで ES細胞力も分ィ匕させた体細胞としては、例えば組織 幹細胞、組織前駆細胞、または体細胞 (神経細胞、皮膚角質細胞、心筋細胞、骨格 筋細胞、血液細胞、脾島細胞または色素細胞など）が挙げられる。
[0108] (3-1-2-b)プロモーターを有さな!/、プラスミドベクターを用いる場合
本発明遺伝子の発現調節領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子を、プロモーター を有さないプラスミドベクターに挿入し、細胞を形質転換することにより、本発明のスク リーニング用の細胞を作製することができる。
ここで用いるベクターとしては、例えば pBluescript(Stratagene)、 pCR2.1(Invitrogen) と！、つたプロモーターを有さな!/、プラスミドベクターが挙げられる。
ここで用いる本発明遺伝子の発現調節領域は、例えば該遺伝子の転写開始部位 上流約 lkb、好ましくは約 2kbが挙げられる。
[0109] 各本発明遺伝子の発現調節領域は、例えば (i)5'-RACE法 (例えば、 5'foll Race Co re Kit (宝酒造社製)等を用いて実施される）、オリゴキャップ法、 S1プライマーマツピン グ等の通常の方法により 5'末端を決定するステップ; (ii)Genome Walker Kit (クローン テック社製)等を用いて 5'-上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモー ター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することができる。このようにし て同定した本発明遺伝子発現調節領域の 3'側にマーカー遺伝子を融合し、これを 前記プラスミドベクターに挿入することにより、本発明遺伝子の発現調節領域により発 現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させたプラスミドベクターを作製するこ とがでさる。
以上のようにして作製したベクターを、前記 (3- l-2-a)と同様にして体細胞や ES細胞 に導入することにより、本発明のスクリーニング用体細胞を作製することができる。
[0110] (3-1-2-c)ターゲッティングベクターを用いる場合
前記 (3- 1-1)に記載したターゲッティングベクターを体細胞若しくは ES細胞に導入 することによつても、本発明のスクリーニング用体細胞を作製することができる。
前記ターゲッティングベクターを体細胞に導入する場合は、ベクター導入細胞を選 択培地中で容易に選択できるように、前記 (3-1-2-a)と同様に薬剤耐性遺伝子を含 む遺伝子 (第 2の薬剤耐性遺伝子)をターゲッティングベクター上に存在させるか、ま たはターゲッティングベクターと共に第 2の薬剤耐性遺伝子を含有する第 2の発現べ クタ一を共導入 (co-transfection)し、選択培地で選択して得られた体細胞を本発明 のスクリーニングに用いることがより好ましい。その場合、第 2の発現ベクターよりも前 記ターゲッティングベクターを大過剰に用いて導入を行うことが望ましい。
[0111] 前記ターゲッティングベクターを ES細胞に導入する場合は、ターゲッティングベクタ 一上のマーカー遺伝子の性質に基づいて、マーカー遺伝子導入'発現細胞を選択 することができる（作製法については Tokuzawa, Y., et al.， Molecular and Cellular Bio logy, 23(8): 2699-2708(2003)等を参照）。 ES細胞から体細胞への誘導方法は、前記 ( 3-1-2-a)と同様である。
[0112] 本発明のスクリーニング工程 (a)においては、以上のようにして作製した体細胞と、 被験物質とを接触させる。
ここで用いられる被験物質 (被験試料)は制限されないが、核酸、ペプチド、タンパ ク質、有機化合物、無機化合物あるいはこれらの混合物などであり、本発明のスクリ 一二ングは、具体的にはこれらの被験物質を前記体細胞と接触させることにより行わ れる。力かる被験物質としてより具体的には、細胞抽出液、遺伝子 (ゲノム、 cDNA)ラ イブラリー、 RNAiライブラリー、アンチセンス核酸、遺伝子（ゲノム、 cDNA、 mRNA)、タ ンパク質、ペプチド、低分子化合物、高分子化合物、天然ィ匕合物などが挙げられる。 より具体的には、後述の参考例に示したような ES細胞、卵、 ES細胞や卵の細胞抽出 物 (抽出画分）、 ES細胞や卵由来の cDNAライブラリー、ゲノムライブラリーまたはタン ノ ク質ライブラリー、あるいは増殖因子などが挙げられる。
[0113] cDNAライブラリー、タンパク質ライブラリーまたは細胞抽出物 (有機化合物や無機 化合物等）の由来としては、前述のように ES細胞や卵のような未分ィ匕細胞が好ま 、 ここで cDNAライブラリ一は、巿販の cDNAライブラリー作製キット（例えばクローンマ イナ一 cDNAライブラリー作製キット (Invitrogen)や Creator SMART cDNAライブラリー 作製キット (BD Biosciences)等）を用いて作製することができる。またタンパク質ライブ ラリーは WO 00/71580等を参考にして作製することができる。
[0114] これら被験物質は、体細胞への取り込み可能な形態で体細胞と接触させる。例え ば被験試料が核酸 (cDNAライブラリ一等）の場合は、リン酸カルシウム、 DEAE-デキ ストラン、遺伝子導入用リピッドまたは電気パルス等を用いて体細胞に導入する。
[0115] 体細胞と被験物質とを接触させる条件は、該細胞が死滅せず且つ被験物質が取り 込まれるのに適した培養条件 (温度、 pH、培地組成など)であれば特に制限はない。 前記体細胞と被験物質との接触の前に、接触の際に、若しくは接触後に、 ES細胞 の培養条件で細胞培養を行う。 ES細胞の培養は、当業者に知られた如何なる方法を 用いても良い。例えば RF8細胞の場合、以下の組成： 15%FBS、 O.lmM Non Essentia 1 Amino Acids (GIBCO BRL)、 2mM L— glutamineゝ 50U/mlペニシリン—ストレプトマイシ ン、 0.1 ImM 2-ME(GIBCO BRL)/Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)の培 地等が挙げられる。また市販の調製済み培地 (例えば大日本製薬 No.R-ES-101等） を用いることちでさる。
[0116] ES細胞の培養においてフィーダ一細胞を用いる場合、当該フィーダ一細胞は、マ ウス胚から常法により調製した繊維芽細胞や繊維芽細胞由来の STO細胞株 (Meiner, V. et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93: 14041- 14046(1996))を用いても良ぐまた巿販 品を用いても良い。市販品としては、例えば PMEF-N、 PMEF-NL、 PMEF- H、 PMEF -HL (以上大日本製薬)などのフィーダ一細胞が挙げられる。フィーダ一細胞は、マイ トマイシン C処理することにより増殖を停止させた後に ES細胞の培養に用いることが 望ましい。
また、 ES細胞の培養において前記フィーダ一細胞を用いない場合は、 LIF (Leukem ia Inhibitory Factor)を添カ卩して培養を行うことができる。 LIFとしてはマウス組み換え L IF、ラット組み換え LIF (ケミコン社等)などが挙げられる。
前記 ES細胞の培養条件における培養日数は、細胞の状態等により適宜変更できる 力 1日〜 3日程度が好ましい。
[0117] マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬 剤を含む培地 (選択培地)で選択を行う。当該薬剤は、体細胞と被験物質との接触の 際に培地に含まれていても良ぐまた接触後に含ませても良い。さらに、 ES細胞の培 養条件で培養した後に前記薬剤を培地に含ませても良!ヽ。
[0118] 前記工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出現さ せた被験物質を体細胞の核初期化物質の候補物質として選択する（工程 (b))。以下 当該工程 (b)につ 、て記述する。
[0119] マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子の場合は、前記のように選択培 地で培養することによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマー カー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、 発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場 合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができ る。
被験物質非添加の場合に比してマーカー遺伝子発現細胞が検出された場合 (発 現量が増力!]した場合も含む)、ここで用いた被験試料 (被験物質)を、体細胞核初期 化物質の候補物質として選択する。
前記スクリーニングは、必要に応じて何度でも繰り返し行うことができる。例えば 1回 目のスクリーニングで cDNAライブラリーや細胞抽出物と 、つた混合物を用いた場合、 2回目以降は、さらに当該混合物を細分化 (分画)して同様のスクリーニングを繰り返 し行うことにより、最終的に、体細胞核初期化因子の候補物質を選択することができ る。 [0120] なお、スクリーニングの効率を上げるための 1つの例として、前記体細胞をそのまま スクリーニングに用いるのではなぐ体細胞と ES細胞とを融合させた融合細胞に対し て、被験物質を添加するスクリーニング系が有効である。即ち本発明のスクリーニング 方法には、
以下の (a)および (b) :
(a) ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LO C380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー 遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と ES細胞とを融合させた融合細胞 (体 細胞)と、被験物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を出 現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程、
を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング方法も含まれる。
ここで「融合細胞」とは、体細胞と ES細胞との融合細胞であって前記マーカー遺伝子 が発現して!/、な!、 (若しくは発現量が少な!/、)細胞を意味する。体細胞と ES細胞とを 融合させて生じる ES様細胞のコロニー数に比して、さらに被験物質を添加した際にコ ロニー数が増加した場合、当該被験物質は体細胞核初期化候補物質として選択す ることがでさる。
[0121] 本発明のスクリーニングで選択された体細胞核初期化 (候補)物質が体細胞の核を 初期化する力否かは、 (1)当該核初期化 (候補)因子により体細胞力も変換された ES 様細胞が Oct3/4や Ecat4(Nanog)といった ES細胞のマーカー遺伝子を発現している か否か、（2)前記 ES細胞が in vitroにおいてレチノイン酸刺激等で分ィ匕するカゝ否力、 (3)前記 ES細胞をマウスブラストシストにインジェクションしてキメラマウスが誕生する か等を調べることにより、確認することができる。
[0122] (3-2)本発明のノックインマウス及び当該ノックインマウスの新規用途 (本発明スクリー ニング用体細胞の供給源としての使用）
本発明は、 ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905(TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有 するノックインマウス、および当該マウスの本発明のスクリーニングにおいて用いる体 細胞の供給源としての用途を提供するものである。当該ノックインマウスの作製法等 については、前記 (3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法におい て述べた通りである。
[0123] (3-3)本発明の体細胞
本発明は、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー 遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞を提供する。すなわち本発明は、 ECA T15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を 存在させた遺伝子を含有する体細胞を提供する。具体的には ECAT15-1遺伝子、 E CAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 RnH7遺伝子または LOC380905(TDRD4)遺伝子 にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含有する体細胞が例示される。
当該体細胞の作製法等については、前記 (3-1)本発明の体細胞核初期化物質のス クリーニング方法において述べた通りである。本発明の体細胞は、前記本発明のスク リー-ング方法、または後述の本発明の ES様細胞の選択方法において、有効に使 用される。
[0124] (3-4)本発明の ES様細胞の選択方法
本発明はまた、以下の (a)および (b)の工程：
(a) ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LO C380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー 遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化物質とを接触さ せる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞を ES様細胞として選択する工程、 を含む ES様細胞の選択方法を提供する。
[0125] 前記本発明のスクリーニング方法において述べたような本発明遺伝子の発現調節 領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた体細胞は、 ES様細 胞の選択のためにも有効に用いられる。例えば幹細胞療法を念頭においた場合、ヒ トの体細胞を核初期化物質で刺激することにより出現した ES様細胞を、他の細胞 (体 細胞)から分離 (純化)し、後の治療に用いることが望ましい。前述のように、本発明の システムは、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の発現を指標として、 ES様細胞を 容易に選択できるシステムであるため、 ES様細胞を選択 ·分離する際に有効に用い ることがでさる。
本発明の ES様細胞の選択方法は、前記ヒトの治療のみならず、イン'ビトロおよびィ ン ·ビボでの ES細胞関連の様々な研究にぉ 、て、 ES細胞を選択 (分離)する如何なる 目的においても使用することができる。
[0126] 前記において、 1)本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマ 一力一遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞の作製方法、 2)当該体細胞と 体細胞核初期化物質との接触方法、および 3)マーカー遺伝子発現細胞の選択方法 については、全て「(3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリーニング方法」に記 述したものと同様である。なお、マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝 子を用いた場合は選択培地で培養することにより、マーカー遺伝子発現細胞を容易 に選択 (分離)することができる。またマーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子、 発光酵素遺伝子、または発色酵素遺伝子を用いた場合は、セルソーター、限界希釈 法または軟寒天コロニー法などを利用することにより、当該細胞を選択 (分離)するこ とがでさる。
前記で「核初期化物質」とは前記体細胞核初期化物質のスクリーニングで得られる ような、体細胞の核初期化に関与する物質を指す。なお、後述の参考例においては 、体細胞の核初期化物質として ES細胞自身を用いることにより、マーカー遺伝子発 現細胞を ES様細胞として選択して 、る。
[0127] ES様細胞の選択方法にぉ 、て用いる体細胞は、ヒトの治療を念頭にぉ 、た場合は 、本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を 挿入したベクターを含有するヒト体細胞であることが望ましい。具体的には以下のよう にして作製された体細胞が用いられる。
[0128] すなわちまず、患者の体細胞をヒトから単離することなどにより調製する。体細胞と しては、疾患に関与する体細胞、疾患治療に関与する体細胞などが挙げられる。こ のヒト体細胞に対し、前記 (3- 1-2)の項に記載のいずれかのベクターを導入する。具 体的には BACベクター (本発明遺伝子の発現調節領域の下流にマーカー遺伝子を 存在させた BACベクター）または PACベクターを導入することが望まし 、。ここで導入 する BACベクター（PACベクター）は 1種類であっても、異なる本発明遺伝子を含有す る 2種類以上の BACベクターであっても良い。この BACベクター導入細胞に対して核 初期化物質を添加することにより、 ES様細胞を出現させる。この ES様細胞を、用いた マーカー遺伝子の性質に応じて選択する。例えばマーカー遺伝子として薬剤耐性遺 伝子を用いた場合は、核初期化物質添加後に選択培地で選択することにより、薬剤 耐性を指標として、 ES様細胞を容易に選択することができる。
[0129] (3-5)本発明の ES細胞未分化'多能性維持物質のスクリーニング方法
本発明は、以下の (a)および (b)の工程：
(a) ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LO C380905(TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー 遺伝子を存在させた遺伝子を含有する ES細胞を、 ES細胞の未分化 ·多能性を維持 できない培地中で被験物質と接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を 存在させた被験物質を ES細胞未分化 ·多能性維持の候補物質として選択する工程 を含む ES細胞の未分化 ·多能性維持物質のスクリーニング方法を提供する。
[0130] 本発明遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を 存在させた ES細胞を、 ES細胞としての状態 (未分化 ·多能性)を維持できな 、培地中 で培養した場合、マーカー遺伝子の発現は消失若しくは低下する。一方、前記培地 中に ES細胞の未分化 ·多能性維持物質が存在して!/ヽれば、マーカー遺伝子の発現 は存続する。この性質を利用することにより、 ES細胞の未分化'多能性維持 (候補)物 質を容易にスクリーニングすることができる。
[0131] 前記スクリーニング工程 (a)において用いられる ES細胞としては、本発明遺伝子の発 現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を 含有する ES細胞であればどのようなものであっても良い。具体的には、例えば、前記 ( 3-1- 1-a)に記載されたノックインマウス由来の ES細胞、前記 (3-1- 1-b)に記載されたト ランスジヱニックマウス由来の ES細胞、前記 (3-1-2- a)に記載された BACベクター若し くは PACベクターを含有する ES細胞、前記 (3-1-2-b)に記載されたプラスミドベクター を含有する ES細胞、若しくは前記 (3- l-2-c)に記載されたターゲッティングベクターを 含有する ES細胞を挙げることができる。
[0132] 前記スクリーニング工程 (a)にお 、て用いられる「ES細胞の未分化 ·多能性を維持で きない培地」とは、 ES細胞としての状態を維持できない培地、未分化状態を維持でき ない培地であれば、どのような培地であっても良い。例えばマウス ES細胞は、低密度 では、その維持 (未分化'多能性維持）に血清またはフィーダ一細胞が必須であるこ とが知られているため、当該 ES細胞の培養条件から血清、フィーダ一細胞又はその 両者を除去した条件が挙げられる。またヒト ES細胞の維持 (未分化'多能性維持）に はフィーダ一細胞が必須であるため、ヒト ES細胞の培養条件力もフィーダ一細胞を除 去した条件が挙げられる。さらにヒト ES細胞の場合はフィーダ一細胞存在下でも分ィ匕 する細胞が出現するため、フィーダ一細胞存在下の培養条件でも良い。
具体的には、文献（Meiner, V丄.， et al.'Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 93(24): pl40 41-14046(1996))に記載の ES細胞の培養条件力 血清、フィーダ一細胞又はその両 者を除去した条件などが例示される。
[0133] 前記工程 (a)は、前記 ES細胞を、 ES細胞の未分化'多能性を維持できない培地中で 被験物質と接触させることにより行われる。被験物質は、 ES細胞を未分化，多能性非 維持培地に移す前に、また移す際に、若しくは移した後に、当該 ES細胞と接触させる 本スクリーニングで用いられる被験物質 (被験試料)は制限されないが、核酸、ぺプ チド、タンパク質、有機化合物、無機化合物またはこれらの混合物などであり、本発 明のスクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質を前記 ES細胞と接触させること により行われる。力かる被験物質としては、細胞分泌産物、血清、細胞抽出液、遺伝 子（ゲノム、 cDNA)ライブラリー、 RNAiライブラリー、核酸（ゲノム、 cDNA、 mRNA)、ァ ンチセンス核酸、低分子化合物、高分子化合物、タンパク質、ペプチド、天然化合物 などが挙げられる。具体的には、動物血清またはその画分、フィーダ一細胞の分泌 産物またはその画分などが挙げられる。
これら被験物質 (被験試料）は、体細胞への取り込み可能な形態で体細胞と接触さ せる。例えば被験物質が核酸 (cDNAライブラリ一等）の場合は、リン酸カルシウム、 D EAE-デキストランや遺伝子導入用リピッドを用いて体細胞に導入する。
[0134] マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬 剤を含む培地 (選択培地)で選択を行う。当該薬剤は、 ES細胞と被験物質との接触 の際に培地に含まれていても良ぐまた接触後に含ませても良い。さらに被験物質存 在下、 ES細胞の未分化 ·多能性非維持培地中で培養した後に前記薬剤を培地に含 ませても良い。
[0135] 前記工程 (a)の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を存在 させた被験物質を ES細胞の未分化 ·多能性維持の候補物質として選択する（工程 (b ))。当該工程 (b)については、前記「(3-1)本発明の体細胞核初期化物質のスクリー二 ング方法」に記載した通りである。マーカー遺伝子発現細胞が認められた場合、ここ で用 ヽた被験試料 (被験物質)を、 ES細胞の未分化 ·多能性維持の候補物質として 選択する。
前記スクリーニングは、必要に応じて何度でも繰り返し行うことができる。例えば 1回 目のスクリーニングでフィーダ一細胞分泌産物や血清と 、つた混合物を用いた場合、 2回目以降は、さらに当該混合物を細分化 (分画)して同様のスクリーニングを繰り返 し行うことにより、最終的に、 ES細胞の未分化'多能性維持の候補物質を選択するこ とがでさる。
なお、前記のように被験試料として混合物を用いてスクリーニングを行った場合、 ES 細胞の未分化 ·多能性維持物質と共に ES細胞の増殖促進物質も選択される可能性 がある。すなわち、ある混合物 (画分 A)を前記本発明のスクリーニング方法に供し、 生存細胞が確認され且つ当該生存細胞の細胞数が増加した場合には、当該画分中 には、 ES細胞の未分化'多能性維持物質と共に、 ES細胞の増殖促進物質も含まれ ていると考えられる (もちろん 1つの物質が両方の性質を兼ね備えている場合もある） 。その場合、当該画分 Aをさらに分画し、片方の画分 (画分 B)を本発明のスクリーニン グに供した場合には生存細胞が確認されるが細胞数の増加は認めらず、もう片方の 画分 (画分 C)を本発明のスクリーニングに供した場合は生存細胞が認められなかつ た場合、画分 Bには ES細胞の未分化 ·多能性維持物質が含まれ、画分 Cには ES細胞 の増殖促進物質が含まれることが考えられる。本発明のスクリーニングは、そのような ES細胞の増殖促進 (候補)物質の選択にも有用である。
また、生存細胞が確認され且つ当該生存細胞が不死化状態を保った場合には、前 記 ES細胞の増殖促進 (候補)物質と同様にして、 ES細胞の不死化維持物質を選択す ることちでさる。
[0136] 前記本発明のスクリーニングにより選択された ES細胞の未分化'多能性維持 (候補） 物質が ES細胞の未分化 ·多能性を維持するか否かは、 ES細胞の未分化 ·多能性を 維持できない培地中に当該候補物質を添加した培養条件下で ES細胞を培養し、 ES 細胞としての種々の能力を調べることにより、確認することができる。具体的には、例 えば前記培養条件下で培養した ES細胞力 (1) Oct3/4や Ecat4(Nanog) t\、つた ES 細胞のマーカー遺伝子を発現しているか否か、（2)前記 ES細胞が in vitroにおいて レチノイン酸刺激等で分化するか否か、 (3)前記 ES細胞をマウスブラストシストにイン ジェクシヨンしてキメラマウスが誕生するか等を調べることにより、確認することができる
[0137] (3-6)本発明の ES細胞
本発明は、 ECAT遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー 遺伝子を存在させた遺伝子を含有する ES細胞を提供する。すなわち本発明は、 ECA T15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置にマーカー遺伝子を 存在させた遺伝子を含有する ES細胞を提供する。当該 ES細胞の作製法等にっ ヽて は、前記 (3-1)において詳しく述べたとおりである。本発明の ES細胞は、 ES細胞の未 分ィ匕 ·多能性維持物質のスクリーニング方法にぉ 、て有効に使用される。
[0138] (4)タンパク質の細胞内取り込み促進物質との結合体
本発明は、 ECAT15- 1、 ECAT15- 2、 ECAT16、 Rnfl7または LOC380905(TDRD4)の いずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進する 物質との結合体を提供する。
本発明のタンパク質は、 ECAT4 (Nanog)や ECAT5(ERas)と同様の解析手法により見 出された ES細胞で特異的に発現するタンパク質であり、 ES細胞の機能維持に関与し ている。このような ES細胞の機能維持に関わる作用を発揮するために、本発明のタン パク質と各種細胞への取り込みを促進する物質との結合体が有効に用いられる。 ここで「細胞内への取り込みを促進する物質」とは、タンパク質、化学物質のいずれ であっても良い。
[0139] 細胞内への取り込み促進物質がタンパク質 (ペプチド)の場合、当該タンパク質と本 発明タンパク質との融合タンパク質の形態とすることができる。当該細胞内への取り 込み促進タンパク (ペプチド）としては、例えば以下の G)〜Gii)が例示される：
(i) HIV由来の TAT (Green and Loewnstein, Cell, 56(6), 1179-88 (1988)、 Frankel and Pabo, Cell, 55(6), 1189-93 (1988))、ショウジヨウバエ由来のアンテナぺディア'ホメォ ドメイン（Vives et al., J. Biol. Chem, 272(25), 16010-7 (1997))、 HSV由来の VP22 (Ell iott and O'Hare, Cell, 88(2), 223-33 (1997))、またはこれらのフラグメント。
(ii) HIV Revのフラグメント、 flock house virus Coat (FHV Coat)のフラグメント、 brome mosaic virus Gag (BMV Gag)のフラグメント、 human T cell leukemia— II Rex(HTLV—II Rex)のフラグメント、 cowpea chlorotic mottle virus Gag (CCMV Gag)のフラグメント、 P 22 Nのフラグメント、 λ Νのフラグメント、 φ 21Νのフラグメントまたは酵母 PRP6のフラグ メント（J.Biol.Chem., 276, 5836-5840(2001)) 0
(iii)オリゴアルギニンを有するペプチド（J.Biol.Chem., 276, 5836-5840(2001)、 J.Biol. Chem., 277(4), 2437-2743 (2002)) 0
[0140] 前記 (i)におけるフラグメントとしては、細胞膜を貫通する能力を有する蛋白トランス ダクシヨンドメイン（以下「PTD」 )が同定されて ヽるため、タンパク質導入ドメインである HIV TATのフラグメント、アンテナぺディア ·ホメォドメインのフラグメントおよび HSV V P22のフラグメントとしては、これらの PTD力もなるフラグメントが例示される。異種蛋白 と PTDを融合することにより、培養細胞中に導入することができることは公知であり、そ の作製方法も知られている（Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(2), 664-8 ( 1994)、 Elliott and O'Hare (1997), Phelan et al., Nature Biotech. 16, 440—443 (1998) および Dilber et al., Gene Ther., 6(1), 12-21 (1999)、特許番号第 2702285号）。 HIV TATの PTDについては、 HIV TAT蛋白由来の 11アミノ酸よりなる PTDに融合した j8— ガラクトシダーゼ蛋白力 生きたマウスの組織に浸潤し、すべての単一細胞に到達で きることが報告されている（Schwarze et al.， Science, 285(5433), 1569-72 (1999))。
[0141] HIV TATのフラグメントとしては、具体的には、前記の公知文献等に記載されてい るものを挙げることができるが、好ましくは特許番号第 2702285号に記載の HIV TAT フラグメントが挙げられる。
アルギニンに富む塩基性ペプチドは細胞膜透過能を有しており、 HIV TATのフラグ メントは分子中央部を全てアルギニンに置換しても、該フラグメント (ペプチド）は細胞 膜透過能を有することが知られているため（J.Biol.Chem., 276, 5836-5840(2001))、 H IV TATのフラグメント、アンテナぺディア ·ホメォドメインのフラグメントおよび HSV VP 22のフラグメントは、複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されていても良い。
[0142] 前記 (ii)における HIV Revのフラグメントとしては HIV Rev-(34-50)ペプチドが、 FHV Coatのフラグメントとしては FHV Coat-(35-49)ペプチドが、 BMV Gagのフラグメントと しては BMV Gag- (7- 25)ペプチドが、 HTLV- II Rexのフラグメントとしては HTLV- II Re x-(4-16)ペプチドが、それぞれ挙げられる。また CCMV Gagのフラグメントとしては CC MV Gag- (7-25)ペプチドが、 P22 Nのフラグメントとしては P22 N-(14-30)ペプチドが、 λ Νのフラグメントとしては λ Ν- (1-22)ペプチドが、 φ 21Nのフラグメントとしては φ 21N -(12- 29)ペプチド力 酵母 PRP6のフラグメントとしては酵母 PRP6- (129- 144)ペプチド 力 それぞれ挙げられる。また、これらのフラグメントの配列において複数個のァミノ 酸がアルギニンに置換されても良い。
[0143] 前記 (iii)のオリゴアルギニンを有するペプチドとしては、オリゴアルギニン (n=5〜9) を有するペプチドが好ましぐオリゴアルギニン (n=6〜8)を有するペプチドが更に好 ましい。
[0144] 前記細胞内への取り込み促進タンパク質 (ペプチド）は、本発明タンパク質の N末端 側、 C末端側のいずれに融合しても良いが、好ましくは本発明タンパク質の N末端側 に融合する。その際、細胞内への取り込み促進タンパクと本発明タンパク質との間に リンカ一配列を挿入しても良い。当該融合タンパク質は、常法により融合タンパク質を コードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを作製し、適当な宿主細胞に導 入することにより製造することができる（発現ベクターや細胞の具体例については後 述の (5)及び (6)を参照）。また、例えば PureGeneシステム等を用いて in vitroで合成、 精製することちでさる。
[0145] 細胞内への取り込み促進物質が化学物質の場合、当該化学物質としては、例えば P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物や、アルギニンを有する分岐型ペプチド等 が例示される。
ここで「P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物」とは、例えば BCRPインヒビターを 挙げることができる。具体的には、例えば、 BCRPインヒビターである GF120918などを 挙げることができる。 P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物と本発明タンパク質と化 学的に結合させることにより、化学的結合体は SP細胞と呼ばれる各種体性幹細胞特 異的に取り込まれる。
前記で「アルギニンを有する分岐型ペプチド」とは、例えば、文献 (Biochemistry, 41, 7925-7930, (2002》に記載されて 、るような細胞膜透過能をもつ 8個程度のアルギ- ンを有する分岐型ペプチドのことであり、具体的には、該文献の (R )ペプチドや (RG
2 4 3
R)ペプチドなどが挙げられる。
4
[0146] 本発明のタンパク質と当該タンパク質の細胞内への取り込み促進物質との結合様 式としては、共有結合やイオン結合が挙げられる。例えばイオン結合の場合には、コ ラーゲンとの静電複合体や N-ァセチル-キトサンとの静電複合体等が挙げられる。
[0147] (5)ES細胞の機能維持剤
本発明は、本発明タンパク質（ECAT15-1、 ECAT15-2、 ECAT16、 Rnfl7または LO C380905(TDRD4))の!、ずれかを含有するタンパク質を有効成分として含有する、 ES 細胞の機能維持剤を提供する。
本発明のタンパク質は、 ECAT4 (Nanog)や ECAT5(ERas)と同様の解析手法により見 出された ES細胞で特異的に発現するタンパク質であり、 ES細胞の機能維持に関与し ている。ここで「ES細胞の機能維持」とは、 ES細胞の未分化能維持、 ES細胞の多能性 維持、 ES細胞の増殖能維持、 ES細胞の不死化状態維持、または ES細胞以外の細胞 に導入した際の ES細胞の機能維持 (ES様細胞化、体細胞核初期化）に関与すること を意味する。特に ES細胞の未分化能維持、および ES細胞の増殖能維持に関与する ことを意味する。
[0148] 有効成分となる本発明タンパク質（ECAT15-1、 ECAT15_2、 ECAT16、 RnH7または LOC380905(TDRD4》の!、ずれかを含有するタンパク質としては、本発明タンパク質 そのものを用いることもできれば、前記細胞内への取り込み促進物質との結合体を用 いることもできる。これらタンパク質または結合体は、当業者に周知の細胞内への取り 込み可能な形態で、細胞に導入することができる。
なおタンパク質の形態での細胞導入は、不可逆的な遺伝子導入 (染色体への組み 込み）と異なり可逆的であり、必要な時だけ培地に添加し、不必要であれば培地から 除去すれば良 、と 、うメリットを有する。
[0149] また、これら本発明のタンパク質や結合体 (融合タンパク質)をコードする遺伝子を 含有するポリヌクレオチドも、 ES細胞の機能維持剤の有効成分とすることができる。こ の場合、前記ポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターの形態 で細胞に導入することが好まし 、。
[0150] ここで発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ 、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。具体的には、例え ば pCEP4、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3.1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミ ドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスべ クタ一などのウィルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子 、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を含有していても良い。また、 マーカータンパク質をコードする遺伝子 (マーカー遺伝子）を含有していても良い。
[0151] ここで「マーカー遺伝子」とは、 目的遺伝子導入細胞と非導入細胞とを区別すること の可能な遺伝子のことであり、例えば、 GFPや GFPの変異体である CFPや YFPなど の蛍光タンパク質遺伝子、薬剤耐性遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子等 を挙げることができる。詳しくは前記 (3-1)項を参照されたい。このようなマーカー遺伝 子を付加したベクターを細胞内に導入することにより、本発明遺伝子を発現する細胞 を簡便に検出、選別することができる。
更に、本発明の遺伝子を含む発現ベクターをコンデイショナルな遺伝子発現制御 システムを利用して作製することもできる。例えばテトラサイクリンの共存下では導入し た目的遺伝子が発現し、非共存下では発現しない強制発現システムを挙げることが できる（Niwa et al. , (2000). Nat Genet 24, 372-6.)。また目的遺伝子の発現をオン/ オフするシステムとしてリコンビナーゼ Cre-loxPシステムや、リコンビナーゼ FLP-FRT システムなども用いることができる。
さらに前記ベクターは、一定条件下で消失する性質を有するベクターであってもよ い。具体的には、例えば、 pCAG-IPベクターを挙げることができる。
[0152] 細胞への導入法としては、例えばリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、エレ タトロポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofectin; Gibco- BRL 社)を用いる方法、マイクロインジヱクシヨン法、電気パルス法等の公知の方法が挙げ られる。
[0153] 本発明の ES細胞の機能維持剤は、種々の哺乳動物細胞に導入される。ここで哺乳 動物細胞とは、ヒト、サル、マウスやラット等の哺乳動物の組織'臓器等由来の細胞を 意味し、個体力も取り出した初代細胞であっても、また培養細胞であっても良い。細 胞の種類としては、 ES細胞等の未分化'多能性維持細胞であっても良ぐまた体細胞 ((a)神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞 (体性 幹細胞）、（b)組織前駆細胞、（c)リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞等の 分化した細胞)であっても良 、。これら細胞の詳細にっ 、ては前記 (3)体細胞核初期 化物質または ES細胞未分化 ·多能性維持物質等のスクリーニングの項に記載した通 りである。
[0154] 本発明の ES細胞機能維持剤の細胞への添加量は、細胞の種類、細胞数等により 適宜調整することができる力 通常培地に 0.0001 μ Μ〜1000 μ Μ、好ましくは 0.0001 μ Μ〜10 μ Μ、より好ましくは 0.0001 μ Μ〜1 μ Μであり、これを必要に応じて細胞に 添加する。
本発明の ES細胞の機能維持剤は、再生医療における治療薬または試薬として、ま た再生医療に関連する研究用試薬として、有効に用いられる。
[0155] (6)ECAT16
(6-l) ECAT16遺伝子
本発明は、以下の (a)〜(d) :
(a)配列番号： 17または 33に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、 (b)配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポ リヌクレ才チド、
(c)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の相同性を有し、且つ ECAT16の 機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチド (相補鎖）に対してストリンジェントな条件下で ハイブリダィズし、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド、、
のいずれかよりなる ECAT16遺伝子のポリヌクレオチドを提供する。
[0156] 本発明の ECAT16遺伝子は、公知の遺伝子である Rnfl7遺伝子と LOC380905遺伝 子とがー部オーバーラップして連結した長い転写産物であり、本発明者により見出さ れた新規な遺伝子である。
ここで「ECAT16遺伝子」とは、具体的には配列番号： 17に記載の塩基配列を含有 するマウス ECAT16遺伝子が例示される力 これに限定されず、前述のように、配列 番号： 17に記載の塩基配列を含有するマウス ECAT16遺伝子と 70%以上の相同性を 有し、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号： 17 に記載の塩基配列を含有するマウス ECAT16遺伝子の相補鎖に対してストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質をコードする 遺伝子も、本発明の ECAT16遺伝子の範疇に含まれる。このような遺伝子として具体 的には、ヒト ECAT16遺伝子 (配列番号: 33)が例示される。
[0157] また、配列番号: 33に記載の塩基配列を含有するヒト ECAT16遺伝子のみならず、 配列番号: 33に記載の塩基配列を含有するヒト ECAT16遺伝子と 70%以上の相同性 を有し、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号: 3 3に記載の塩基配列を含有するヒト ECAT16遺伝子の相補鎖に対してストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質をコードする遺 伝子も、本発明の ECAT16遺伝子の範疇に含まれる。
なお Rnfl7遺伝子、および LOC380905遺伝子は前記「ECAT16遺伝子」の範疇には 含まれない。
[0158] 前記 (c)において「70%以上の相同性を有するポリヌクレオチド」とは、具体的には 前記配列番号で示された塩基配列に対して 70%以上、好ましくは 80%以上、より好 ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する ポリヌクレオチドを指す。また前記 (d)において「ストリンジ ントな条件」とは、前記配 列番号で特定された遺伝子の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 遺伝子が挙げられる。
ここで「ストリンジェントな条件」とは、 Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego C A)や目 ij 己 Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度 (Tm)に基づ いて決定することができる。
[0159] ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、 6 X SSC(20 X SSCは、 333mM Sodiu m citrate, 333mM NaClを示す)、 0.5%SDSおよび 50%ホルムアミドを含む溶液中で 42 °Cにてハイブリダィズさせる条件、または 6 X SSCを含む (50%ホルムアミドは含まな!/、） 溶液中で 65°Cにてハイブリダィズさせる条件などが挙げられる。
またハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件としては、「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程 度の条件を挙げることができる。相補鎖は力かる条件で洗浄しても対象とする正鎖と ノ、イブリダィズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より 厳しいハイブリダィズ条件として「0.5 X SSC、 0.1%SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイ ブリダィズ条件として「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」程度の洗浄条件を挙げることがで きる。
[0160] 前記において「ECAT16の機能を有する」とは、具体的には、 ECAT16の特徴である
ES細胞で特異的に発現するという性質を有すること、あるいは ECAT16の作用である
ES細胞の機能維持作用を有することを意味する。
[0161] ECAT16遺伝子のポリヌクレオチドが 2本鎖の場合、発現ベクターに挿入することに より、 ECAT16タンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができ る。
[0162] ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択するこ とができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。 [0163] 例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 pUC118、 pUC119、 pBR322、 pC R3等のプラスミドベクター、 λ ΖΑΡΠ、 gtllなどのファージベクターが挙げられる。宿 主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆 虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT-Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には 、 pCEP4、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3.1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミド ベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウィルスべク ターなどのウィルスベクターが挙げられる。
[0164] 前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子 、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を含有していても良い。また、 マーカータンパク質をコードする遺伝子 (マーカー遺伝子）を含有していても良い。マ 一力一遺伝子にっ ヽては前記 (3-1)項を参照された ヽ。
[0165] また前記発現ベクターは、前述のようなコンデイショナルな遺伝子発現制御システ ム（Niwa et al. , (2000). Nat Genet 24, 372- 6.)や、リコンビナーゼ Cre- loxPシステム 、リコンビナーゼ FLP-FRTシステムなどに対応した配列を含有しても良い。さらに前 記ベクターは、一定条件下で消失する性質を有するベクター（例えば pCAG-IPベクタ 一）であっても良い。
[0166] また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST (ダルタ チオン S-トランスフェラーゼ)等との融合タンパク質として発現する配列が付加されて いても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（lac、 tac、 trc、 tr p、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクベクター（pGEX4T など）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（pcDNA3.1/Myc-Hisなど）、さら にはチォレドキシンおよび Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（pET32a) などを用いることができる。
[0167] 前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現べクタ 一を含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げら れる。大腸菌としては、 E.coli K- 12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5 α株、 AD494(DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス'セルビジェなど が挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 CHO細 胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞、 293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞と しては sl9などが挙げられる。また前記 (5)項に記載の各種細胞 (ES細胞、体細胞)も 用!/、ることができる。
[0168] 宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の 導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、 エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、 Lipofectin; Gibco- B RL社)を用いる方法、電気パルス法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む 通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された 形質転換細胞を選択することができる。
[0169] 以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより 、 ECAT16を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製 手段により、さらに単離 ·精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、ィォ ン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチォ レドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合 タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離'精製することができる。
[0170] (6- 2) ECAT16タンパク質
また本発明は、以下の (a)〜(c) :
(a)配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(b)前記 (a)のタンパク質と 70%以上の相同性を有し、且つ ECAT16の機能を有するタ ンパク質、
(c)前記 (a)のタンパク質において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び Z又 は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質、 の！、ずれかよりなる ECAT16タンパク質を提供する。
[0171] ここで「ECAT16」とは、具体的には配列番号： 18に記載のアミノ酸配列を含有する マウス ECAT16タンパク質が例示される力 これに限定されず、前述のように、配列番 号： 18に記載のアミノ酸配列を含有するマウス ECAT16タンパク質と 70%以上の相同 性を有し、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質や、配列番号： 18に記載のァミノ 酸配列を含有するマウス ECAT16タンパク質にお ヽて 1若しくは複数個のアミノ酸が 置換、欠失及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つ ECAT16の機能を有 するタンパク質も、本発明の ECAT16の範疇に含まれる。このようなタンパク質として 具体的には、ヒト ECAT16 (ヒト ECAT16タンパク質、配列番号： 34)が例示される。
[0172] また、配列番号: 34に記載のアミノ酸配列を含有するヒト ECAT16タンパク質と 70% 以上の相同性を有し、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質や、配列番号: 34に記 載のアミノ酸配列を含有するヒト ECAT16タンパク質において 1若しくは複数個のァミノ 酸が置換、欠失及び Z又は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つ ECAT16の機能 を有するタンパク質も、本発明の ECAT16の範疇に含まれる。
なお Rnfl7および LOC380905は、前記「ECAT16」の範疇には含まれない。
[0173] 前記 (b)において「70%以上の相同性を有するタンパク質」とは、具体的には前記 配列番号で示されたアミノ酸配列に対して 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ま しくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含有する ポリヌクレオチドを指す。
[0174] 前記 (c)において「1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び Z又は付加された アミノ酸配列を含有するタンパク質」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質 や、生体内に存在するアレル変異対等のタンパク質を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、 ECAT16の活性が保持 される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように 、何個欠失、置換及び Z又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知 のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すことができる。例 えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全アミノ酸の 5 %以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の 極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た 性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, P he及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及び Ginは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Asp及び G1 uは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Arg及び Hisは互いに 塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属す るアミノ酸を適宜選択することができる。
[0175] 前記において「ECAT16の機能を有する」とは、具体的には、 ECAT16の特徴である ES細胞で特異的に発現するという性質を有すること、あるいは ECAT16の作用である ES細胞の機能維持作用を有することを意味する。
以上の ECAT16タンパク質は、前記形質転換体を培養することにより得ることができ る。また例えば PureGeneシステム等を用いて in vitro合成することもできる。
[0176] (6-3) ECAT16タンパクに特異的に結合する抗体
本発明は、 ECAT16に特異的に結合する抗体を提供する。当該抗体については、 前記（1-3)に記載した方法により作製することができる。
[0177] (6-4) ECAT16遺伝子の部分ポリヌクレオチド
本発明は、 ECAT16のポリヌクレオチドに特異的な、連続する少なくとも 15塩基を含 有するポリヌクレオチド及び Z又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを 提供する（ただし Rnfl7遺伝子、および LOC380905遺伝子は含まれない）。当該ポリヌ クレオチドの詳細については、前記（1-1)及び（1-2)に記載した通りである。
[0178] (6- 5) ECAT16の部分ポリペプチド
本発明は、 ECAT16に特異的な、連続する少なくとも 6アミノ酸を含有するポリぺプ チドを提供する（ただし Rnfl7および LOC380905は含まれない）。ここで「少なくとも 6ァ ミノ酸」との定義は、一般に 6アミノ酸あれば 1つのタンパク質を他のタンパク質と区別 して定義するのに充分であるという理由による。好ましくは 8アミノ酸、更に好ましくは 1 0アミノ酸以上のアミノ酸を含有するポリペプチドが提供される。
[0179] (6-6) ECAT16遺伝子の遺伝子改変動物
本発明は、 ECAT16遺伝子を人為的に染色体中に挿入した力 あるいはいずれか をノックアウトさせた遺伝子改変動物を提供する。ここで「ECAT16遺伝子を人為的に 染色体中に挿入した遺伝子改変動物」とは ECAT16遺伝子のトランスジヱニック動物 を指し、また「ECAT16遺伝子をノックアウトさせた遺伝子改変動物」とは ECAT16遺伝 子ノックアウト動物、ノックイン動物を指す。 当該遺伝子改変動物の作製法は当業者に周知であり、例えば前記 (3-1)項に記 載の方法にて作製することができる。
[0180] (6-7) ECAT16遺伝子のアンチセンス核酸または siRNA
本発明は、 ECAT16遺伝子のアンチセンス核酸または siRNAを提供する。ここで「ァ ンチセンス核酸」とはアンチセンスポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドを 指し、具体的には配列番号： 17または配列番号: 33に記載の塩基配列またはその一 部分に相補的なアンチセンス核酸が例示される。
[0181] アンチセンス核酸は通常、 10〜1000個程度、好ましくは 15〜500個程度、更に好ま しくは 16〜30個程度の塩基力 構成される。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による 分解を防ぐために、アンチセンス DNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基 (ホスフ エート）は、例えば、ホスホロチォエート、メチノレホスホネート、ホスホロジチォネートな どの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンス核酸は、公 知の DNA合成装置などを用いて製造することができる。
[0182] 前記アンチセンス核酸は、 ECAT16遺伝子の RNA若しくは転写後プロセッシングに より該 RNAを生じる初期転写産物とハイブリダィズすることができ、 ECAT16遺伝子の RNAの合成または機能を阻害することができる力 ある 、は該 RNAとの相互作用を介 して ECAT16遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。
[0183] 本発明のアンチセンス核酸は、リボゾーム、ミクロスフエアのような特殊な形態で用 いることもできる。このような形態としては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働く ポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを 増大せしめるような脂質 (例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のもの が挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体 (例、 コレステリルクロ口ホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の 3， 端または 5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。その他の基としては、核酸の 3'端または 5'端に特異的に配 置されたキャップ用の基で、ェキソヌクレアーゼ、 RNaseなどのヌクレアーゼによる分 解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレン グリコール、テトラエチレンダリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知ら れた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
[0184] 前記において「siRNA」とは短い干渉 RNAのことであり、具体的には ECAT16遺伝子 の mRNAまたはその初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場 合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴ RNAを指す。短い二本鎖 RNAを 細胞内に導入するとその RNAに相補的な mRNAが分解される、いわゆる RNA干渉（R NAi)と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていた力 最近、この 現象が動物細胞でも起こることが確認されて 、る (Nature,411(6836):p494-498(2001) ；)。当該 RNAi活性を有する二本鎖オリゴ RNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を DNA /RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中でアニーリングさ せること〖こより調製することができる。
[0185] 以上の (6- 1)〜(6- 7)に記載した各物質は、 ES細胞に関連するメカニズム解析や再 生医療に関連する研究用試薬として、有効に用いられる。
[0186] (7) 129マゥスES細胞由来のECAT15
本発明は、配列番号： 1に記載の塩基配列を含有するマウス ECAT15-1遺伝子 (ポ リヌタレチド）、および配列番号： 5に記載の塩基配列を含有するマウス ECAT15-2遺 伝子 (ポリヌクレチド）を提供する。また本発明は、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列 を含有するマウス ECAT15- 1、および 6に記載のアミノ酸配列を含有するマウス ECAT 15-2を提供する。これら 129マウス ES細胞由来の ECAT15の塩基配列およびアミノ酸 配列は、公共ジーンバンク（GenBak等）に登録されている遺伝子と、アミノ酸残基で 数アミノ酸異なる新規な遺伝子である。
当該 ECAT15-1遺伝子および ECAT15-2遺伝子についても、前記（6-1)〜（6-7)に 基づき、遺伝子、タンパク質、発現ベクター、形質転換細胞、抗体、部分ポリヌクォチ ド、部分ペプチド、および遺伝子改変動物を作製することができる。
[0187] (8) ECAT15-1及び ECAT15-2の複合体
本発明は、 ECAT15- 1および ECAT15- 2の複合体を提供する。当該 ECAT15- 1およ び ECAT15-2の複合体を形成している限り、さらなる ECAT15-1が結合して複合体を 形成していても良ぐまた、さらなる ECAT15-2が結合して複合体を形成していても良 い。また当該複合体は、細胞内への取り込みを促進する物質との結合体の形にする こともできる (前記 (4)項参照)。
これら ECAT15-1および ECAT15-2の複合体、または当該複合体の細胞内への取 り込みを促進する物質との結合体は、前記 (5)項に示した ES細胞の機能維持剤の有 効成分とすることができる。より具体的には、 ES細胞の未分化能維持剤、および ES細 胞の増殖能維持剤の有効成分とすることができる。 ECAT15-1および ECAT15-2は複 合体を形成するため、 ES細胞の機能維持剤にぉ 、て同時に用いることが好ま 、。
[0188] さらに本発明は、以下の (a)および (b) :
(a) ECAT15-l遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター
(b) ECAT15-2遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現ベクター を有効成分として含有する ES細胞の機能維持剤も提供する。両者は発現して複合体 を形成するため、 ES細胞の機能維持剤にぉ 、て同時に用いることが好ま 、。
なお、前記において「ECAT15-1」、 「ECAT15-2」、 「ECAT15-1遺伝子」および「EC AT15-2遺伝子」は、前述のように特定の配列に限定されるものではなぐ特定配列に 類似のアミノ酸配列または塩基配列を含有するものも含まれる。
[0189] 以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではな 、。
実施例 1
[0190] ES細朐特異的発現遺伝子の同定
ES細胞特異的発現遺伝子を同定するために、 Expressed Sequence Tag(EST)デー タベースを Digital Differential Display法で解析した。すなわち、 Digital differential dis play法により次に示す 5つの細胞や臓器由来のライブラリ一群における遺伝子発現 頻度解析を行った。各群の括弧内の数字は解析したクローン数を示している。 1群か ら 5群までは該当するライブラリーをすベて解析した。 6群はデーター数が膨大である ため、全身の臓器、細胞を可及的に含むように抽出した 23ライブラリーを解析した。
[0191] 1群 1細胞期よりブラストシストまでの受精卵（49050クローン）
2群 ES細胞または Embryonic carcinoma細胞（32277クローン） 3群 受精後 8.5日までの胎児（46728クローン）
4群 受精後 9日以降の胎児（128882クローン）
5群 精巣（65685クローン）
6群 その他の細胞、糸且織（272460クローン）
Digital differential display法により受精卵と ES細胞等の多能性細胞で特異的に発 現することが予想されたセットについては、マウス由来の ESTデータベースを BlastNに て検索し、多能性細胞由来のライブラリーでのみ ESTが存在するかどうかを検討した
[0192] 使用したデータベースおよび解析プログラムの URLは以下の通りである。
Unigene Mouse Sequenceし ollection
http://www.ncbi.nim.nin.gov/Uniuene/Mm.Home.html
Digital differential display
http : // www.ncbi . nlm . nih . gov/ UniGene/ info— ddd . html
Blast search
http:// www.ncbi . nlm . nih . gov/BL AST/
[0193] Digital differential display法による解析と BlastNによる ESTデータベース検索により 選択された ECATの候補遺伝子のうち、 DNA結合ドメインである SAP (SAF-A/B, Acin us, and PIAS) motif^含有するECAT15-l、および癌遺伝子 mycへの結合が示唆され ている Rnfl7に着目した。これら 2つの遺伝子の ES細胞および 13種類の臓器における 発現を、 RT-PCRにより解析した。即ち ES細胞 (未分化 Z分化）と成体マウスの 13種 類の臓器における ECAT15-1遺伝子および RNF17 (RNF17,long form)遺伝子の発現 を、 RT-PCRにより解析した。用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
[0194] [ECAT15-1]
ECAT15- 1- gw- s: CACCATGGAGACTGCTGGAGACAAGAAG (配列番号： 19) ECAT15-l-gw-as2: GGACCTATTCCAGAGGAACTGTCAC (配列番号： 20)
[RNF17]
Rnfl7-RT-S： GACCGGGCTGGCTTCCTGTCACCTAGT (配列番号： 27)
Rnfl 7-RT-AS： TTTACCATTTTCGGTGGCAAGGCTTCC (配列番号： 28) ECAT15-1遺伝子の解析結果を図 1に、また Rnfl 7遺伝子の解析結果を図 2に示す
[0195] ECAT15-1遺伝子は未分化 ES細胞（MG1.19 ES細胞および RF8 ES細胞）で発現し ており、その発現は ES細胞をレチノイン酸で分化誘導すると著しく低下した。成体マ ウスの 13種類の臓器においては発現が認められな力つた。また Rnfl 7遺伝子（図中 Rn fl7L)は未分化 ES細胞（MG1.19 ES細胞および RF8 ES細胞）及び精巣でのみ発現が 認められた。精巣での発現は Oct3/4遺伝子と同様に始原生殖細胞や精母細胞に由 来する可能性が高い。これらの結果から、 5じ 丁15-1遺伝子ぉょび1¾117遺伝子は、 いずれも ES細胞特異的発現遺伝子であることが明らかとなった。
[0196] ECAT15-1遺伝子と配列上及び構造上類似の遺伝子として ECAT15-2遺伝子が存 在しており、この ECAT15-2についても同様の RT-PCR解析を行った（図 1)。用いた プライマーの配列は以下の通りである。
[ECAT15-2]
ECAT15- 2- gw- s: CACCATGTCATACTTCGGCCTGGAGACT (配列番号：21) ECAT15-2-gw-as2: ACTCTACTCTTTTCTCCTTTGGCACCC (配列番号： 22) その結果、 ECAT15-1と同様の発現パターンを示し、 ES細胞特異的発現遺伝子で あることが示された。
[0197] また Rnfl7につ!/、てはゲノム上重複するもう 1つの遺伝子 LOC380905が存在して!/ヽ る。この LOC380905についても同様の RT-PCR解析を行った（図 2)。用いたプライマ 一の配列は以下の通りである。
[LOC380905]
LOC380905-RT-S： AAGCTGGCATATGTTGAACCAAGTAAA (配列番号： 29) LOC380905-RT-AS： TTCATAAGATGCTAGGCCCTCTTTCAC (配列番号： 30) その結果、 Rnfl 7と同様の発現パターンを示し、 ES細胞特異的発現遺伝子であるこ とが示された。
以上のように ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 1¾117遺伝子ぉょびし0じ3809 05遺伝子は、いずれも ES細胞特異的に発現する ECAT遺伝子であり、 ES細胞を特徴 付けるマーカー遺伝子であることが明ら力となった。 実施例 2
[0198] 各遣伝子の塩某西 R列及びアミノ酸西 R列の同定
次に、前記 ECAT15-1遺伝子、 ECAT15-2遺伝子、 Rnfl7遺伝子および LOC38090 5遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を同定した。
[0199] ECAT15- 1遺伝子および ECAT15- 2遺伝子について、 RF8 ES細胞の mRNAより RT- PCR法により cDNAを増幅し、その塩基配列を決定した。決定したマウス ECAT15-l(m ECAT15-1)の塩基配列を配列番号： 1に、アミノ酸配列を配列番号： 2に示す。またマ ウス ECAT15-2(mECAT15-2)の塩基配列を配列番号： 5に、アミノ酸配列を配列番号 : 6に示す。これら塩基配列およびアミノ酸配列は、公共ジーンバンク（GenBak等）に 登録されて!ヽる遺伝子のそれと、アミノ酸残基で数アミノ酸異なる新規な遺伝子であ つた o
マウス ECAT15のヒト相同遺伝子として、 hECAT15- 1 (配列番号： 3、 4)および hECA T15- 2 (配列番号 : 7、 8)を、それぞれ遺伝子データベースより同定した。
[0200] マウス Rnfl7(mRnfl7)として配列番号： 9及び 10を、そのヒト相同遺伝子として hRnfl7
(配列番号： 11、 12)を同定した。またマウス LOC380905 (mLOC380905)として配列番 号： 13及び 14を、そのヒト相同遺伝子として hTDRD4 (配列番号： 15、 16)を、それぞれ 遺伝子データベースより同定した。
実施例 3
[0201] EC AT 16遣伝子の同定
RF8 ES細胞における Rnfl7遺伝子および LOC380905遺伝子の発現を、ノーザンブ ロット解析により調べた。その結果 Rnfl 7特異的プローブ、 LOC380905特異的プロ一 ブのどちらを用 ヽた場合も、 Rnfl 7や LOC380905に相当する約 2kbのバンドは確認さ れず、変わりに約 4kbの新規なバンドのみが確認された。この新規なバンドに相当す る遺伝子を ECAT16遺伝子と命名した。
次にこれらの遺伝子発現を RT-PCRにより解析した。用いたプライマーの配列は以 下の通りである。
[0202] 〔RnH7Lの ORF増幅用プライマー〕
Rnfl 7-S： CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGTCGACCGG (配列番号：23) Rnfl 7L-AS： CTAAAACTCCACAGCCTTTGAGGGAGAATC (配列番号： 24) 〔LOC380905の ORF増幅用プライマー〕
LOC380905-ORF-S： CACCATGAAGTCTGAACCATACAGTGA (配列番号： 25) LOC380905-ORF-AS： TTAGGAGGAGGAGGCCCTTCTCTCTCT (配列番号： 26 )
〔ECAT16の ORF増幅用プライマー〕
Rnfl 7-S： CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGTCGACCGG (配列番号：23) LOC380905-ORF-AS： TTAGGAGGAGGAGGCCCTTCTCTCTCT (配列番号： 26)
[0203] その結果、 Vヽずれの遺伝子（ECAT16遺伝子、 1¾117遺伝子ぉょびし0じ380905遺 伝子）についても発現が認められた力 ECAT16遺伝子の発現量が格段に多力つた 。従って図 2における Rnfl7(Rnfl7L)遺伝子および LOC380905遺伝子の発現は、その 殆どが ECAT16遺伝子の発現であったこと、すなわち ECAT16遺伝子が ES細胞特異 的発現遺伝子の主体であることが明ら力となった。
[0204] ECAT16遺伝子について、 RF8 ES細胞の mRNAより RT- PCR法により cDNAを増幅し 、その塩基配列を決定した。決定されたマウス ECAT16遺伝子の塩基配列を配列番 号： 17に、またアミノ酸配列を配列番号： 18に示す。 5じ 丁16遺伝子は1¾117遺伝子と LOC380905遺伝子とがー部オーバーラップして連結した長い転写産物であり、新規 な遺伝子であることが明ら力となった。
[0205] 次に、ヒト ECAT16遺伝子の同定を行った。ヒト由来 testisの mRNAより、 RT-PCR法 によりヒト ECAT16遺伝子の cDNAを増幅し、その塩基配列を決定した。増幅に用いた プライマーの配列は以下の通りである。
〔hECAT16〕
hRnfl7-S： CACCATGGCGGCAGAGGCTTCGAAGAC (配列番号：31) hLOC380905-AS： TTATTCATCTTTATCTGCAAGCCCCATTT (配列番号： 32) [0206] 決定されたヒト ECAT16遺伝子の塩基配列を配列番号: 33に、またアミノ酸配列を配 列番号： 34に示す。 blastp、 blastn、 BLAT、 blast(genome)検索の結果、マウス ECATl 6遺伝子同様、ヒト ECAT16遺伝子についても塩基配列、アミノ酸配列共に公開され て ヽな 、新規な遺伝子であった。マウス ECAT16とヒト ECAT16の遺伝子レベルでの 相同性は 71%、タンパクレベルでの相同性は 72.5%であった。
実施例 4
[0207] (参 ) 遣伝^ 禾 II用した ：細 淑 の;巽 システム
ECAT3遺伝子のコーディング領域を /3ガラクトシダーゼとネオマイシン耐性遺伝子 の融合遺伝子（ j8 geo)に置き換え、 ECAT3遺伝子をノックアウトするとともに、 ECAT3 遺伝子の発現を X-Gal染色や薬剤耐性でモニターできるようにしたホモ変異ノックィ ンマウス (以下、 ECATS^^ ge。マウス)を作製した。この ECATS^^ ge。マウスの作製 は文献（Tokuzawa, Y., et al, Molecular and Cellular Biology, 23(8): 2699-2708(200 3))の記載に基づき行った。
[0208] 次に、 ECATS^^ ge。マウスの胸腺力も常法によりリンパ球を採取した。この細胞を 文献（Meiner, V丄.， et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 93(24): pl4041- 14046(1996 ))に記載の ES細胞の培養条件で 2日間培養し、 G418 (0.25mg/ml)で選択した。その 結果、これらリンパ球はすべて死滅し、薬剤耐性コロニーは一つも得られな力つた。 またこの G418濃度では正常 ES細胞はすべて死滅することも確認された。
[0209] 次に、 ECATS13 ^。マウス由来のリンパ球と RF8細胞とを、多田らの方法 (Tada, M ., et al., Curr. Biol, 11(19): pl553- 1558(2001》に従って電気的に融合し、前記 ES 細胞の培養条件でフィーダ一細胞 (STO細胞）上で 2日間培養し、 G418 (0.25mg/ml) で選択したところ、多数の ES細胞様コロニーが得られた。これらのコロニーを単離、培 養し、 RNAを回収した。ノザンブロットによりこれらの細胞は全クローンにおいて Oct3/ 4や ECAT4 (Nanog)を発現しており、またこのクローンをマウスブラストシストに移植し たところキメラマウスが形成されたことから、 G418で選択された細胞は確かに ES細胞 としての性質を有する ES様細胞であることが明ら力となった。これらの細胞をフローサ ィトメトリー（FACS)で解析したところ、大きさ（Forward scatter)は約 2倍となり、 DNA量 も 4倍体となっていた。以上のことから、これらのコロニーは ECATS13 13^マウス由来 のリンパ球と正常 ES細胞との融合により、リンパ球核の初期化 (ES細胞化）が起こった ために G418耐性になったことが分力つた。このように Ε。ΑΤ3 ∞/^。マウス由来の体 細胞は、 ES様細胞に変換された時のみ薬剤耐性となる。従ってこの性質を利用すれ ば、 ES様細胞の選択や、 ES様細胞への変換を誘導する核初期化因子を容易にスク リー-ングできることが明ら力となった。
実施例 5
[0210] ECAT15-1および ECAT15-2のターゲティング 機能解析
1.実験方法
1)BACのスクリーニング
ECAT15の BACクローンを得るためにマウス BACライブラリー (Research Genetics Co., Catalog No.96021)の DNAプールを、マニュアルに従って PCRによりスクリー-ン グを行った。プライマーは ECAT15-1の第 1ェクソンより約 2 kbp上流に設計したプ ライマー (5，：ECAT15— BAC— S2:AGATTCATTTACTTCACCGCTCCATCATAC/3，： ECAT15-BAC -AS2:TCCTGGTAATAAAATTCCGTCGCTGTTG) (それぞれ配列 番号: 35、 36)を用いた。反応条件は以下に記した。
[0211] 反応溶液 (25 μ L):dNTP 2 mM, 5，及び 3 ' primer 5 pmol, rTaq polymerase lunit, template DNA 100 ng。温度条件： 94°C , 5 sec. (94°C , 2 sec. 55°C , 2 sec. 72°C , 5 min.) X 55 cycle, 68 °C , 5 min. 4°C。 PCR反応後、 EtBrを含む 2.0 %ァガロースゲ ルで電気泳動し、約 560 bpのバンド増幅したクローンをスクリーニングした。その結果 、同定できた #290プレートを新たに入手した。 # 290プレートは 384穴プレートであつ たため、まず 4穴分を 1穴にまとめた DNAプールを作成した。このプールを铸型にし 、同様の条件で PCRを行って、 目的のクローンを含むプールを決定した。最後に、こ のプールに含まれた各 DNAを铸型に PCRを行って、最終的に ECAT15遺伝子の 15-1、 15-2の両方を含むクローンを得た。得られた BACクローンは 500 mLの LB 培地（12.5 μ g/mLクロラムフエ-コール)で 37°Cでー晚振とう培養し、集菌した後に nucleobond kit (MACHEREY- NAGEL Co.)を用いて BACクローンの精製を行った。 精製の際、ボルテックス等での激しい攪拌は避け、シェーカーでゆっくり振とうするこ とによって懸濁した。また、 S 1溶液 23 mLをカ卩えて振とうし、細胞の沈殿が完全に懸 濁された後に塩化リゾチーム (50 mg/mL)を lmLカ卩え、さらに室温で 5分間振とうする ことで細胞を溶菌しゃすくした。その後、 S2、 S3溶液をピペットで均一に懸濁するま で混ぜた後、氷上で 5分間振とうした。カラム精製後、 DNAをイソプロ沈殿し、 70 % エタノールで洗浄した後、 3-5分風乾し、 lOmM Tris-HCl (PH8.0)に溶かして、 4°Cで 保存した。
[0212] 2)BACターゲティングベクターの作成
ECAT15-1及び 15-2を含み、全長約 140 kbpの BACクローンを大腸菌の組み換 え酵素である Rec/ETを用いて BACターゲテイングベクターの作成を以下の様に行 つた o
[0213] (l)Rec/ETによる相同組み換えのためのオリゴ設計
15-1部位をネオマイシン耐性遺伝子カセットに、 15-2部位にハイグロマイシン耐 性遺伝子カセットを導入したターゲテイングベクターを作成する。このためのセレクシ ヨンマーカー（ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子）を铸型にして PCRにより BACに導入する部位を作成した。この PCRのプライマーとして铸型に相 同な部位 24 bp、 BACに相同な部位 50 bpを含む、計 74 bpのオリゴを用いた。 BA Cに相同な部位に関しては繰り返し配列がな 、ことを確認して設計した (RepeatMask er2： http :/ 1 ftp . genome .Washington. edu/)G
[0214] 15-1部位に用いたプライマー
15- lrecomb5し s
GTTGGCAGAACATATCCATCGC - 3') (配列番号： 37)
15- lrecomb - as
ACTATCAACAGGTTGAACTGATGGC - 3') (配列番号： 38)
15-2部位に用いたプライマー
15- 2- 5'Recomb- s
GCCCTATGCTACTCCGTCGAAGTTC - 3') (配列番号： 39)
15— 2recomb3—as
AGCTGGCAGTTT ATGGCGGGCGTCCT - 3，）（配列番号： 40)
[0215] (2)PCRの条件 下記の条件で KOD +により反応を行った。
94°C 1分
20サイクル； 94°C 2秒； 68°C 2分
68°C 5分後， 4°Cで維持
[0216] (3)Rec/ET発現プラスミドのトランスフォーメーション
ECAT15 BACを含有する DH10Bを 12.5 μ g/mLのクロラムフエ-コールを含む 1.0 mL LB培地で 37 °Cオーバーナイトで培養する。そして、そこから 30 μ Lを先程と 同様の新しい培地 1.4 mL〖こカロえ、 37°C 2時間培養する。 11000 rpm、 30秒遠心し、 上清を捨てる。ペレットをミリ Q水で再懸濁し再度遠心し、上清を捨てる。 40 Lのミ リ Q水に懸濁し、 pSC-101-BAD-gbaAベクターを 200 ng加え、 1 mmキュベットに移 し、エレクト口ポレーシヨン（BioRad Electroporator: 1350 V, 10 μ F, 600 Ohms)を行 つた。 1 mL LB培地でエツペンに移し、 30°C、 70分培養した。導入した Rec/ET発現 プラスミドは 37 °Cで培養すると消失する。 12.5 μ g/mLのクロラムフエ-コール、 10 μ g/mLのテトラサイクリンを含む LBプレートで 30 °Cオーバーナイト、遮光下で培養 した。
[0217] (4)Rec/ETによる組み換え反応
生えてきたコロニーを 12.5 μ g/mLのクロラムフエ-コール、 10 μ g/mLのテトラサイ クリンを含む 1 mL LB培地で 30 °Cオーバーナイト、遮光下で培養した。そして、そ こから 30 Lを先程と同様の新しい培地 1.4 mLに加え、 30 °C 2時間培養する。 最終濃度が 0.2%となるように L-ァラビノースをカ卩え、 30 °C 1時間培養する。 11000 rpm、 30秒遠心し、上清を捨てる。ペレットをミリ Q水で再懸濁し再度遠心し、上清を 捨てる。 40 μ Lのミリ Q水に懸濁し、上で作成したオリゴ（PCR産物)を 0.3 g加え、 1 mmキュベットに移し、エレクト口ポレーシヨン（BioRad Electroporator: 1350 V、 10 μ F、 600 Ohms)を行った。 lmL LB培地でエツペンに移し、 37°C、 70分培養した。 12 .5 μ g/mLのクロラムフエ-コール、及びセレクションマーカーによる抗生物質（15-1 部位： 50 μ g/mLのカナマイシン、 15-2部位： 50 μ g/mLのハイグロマイシン）を含 む LBプレートで 30 °Cオーバーナイト、培養した。生えてきたコロニーより BACター ゲティングベクターを得た。 [0218] (5)BACジーンターゲティング
作製した BACターゲテイングベクターを Sail (NEB)でー晚処理して直線ィ匕し、フエ ノールクロ口ホルム抽出後にエタノール沈殿を行い PBSに溶力した。前日に 10 cmの 細胞培養用プレートにコンフルェントな状態の RF8細胞を 1:2で継代し、当日 PBSで 洗浄した後、トリプシン処理を行い 15mlチューブに回収した。これを 800 rpmで 5分 間遠心分離して上清を除去し、 800 /z Lの PBSに再懸濁した。この細胞懸濁液に直 線化したターゲテイングベクター 20 gを加え、エレクト口ポレーシヨン用キュベット（B M Equipment.Co.)に移した。 Gene pullser II (BIO- RAD. Co.)を 0.25kV、 500 ^ F、抵 抗無限に設定してエレクト口ポレーシヨンを行った。室温で 15分放置し、これを 100m m細胞培養用プレートで培養している MSTOに 1:2で播種し、インキュベーターで培 養した。エレクト口ポレーシヨンの翌日は ES mediumで培地交換を行い、 2 日後からは 250 μ g/mLの G418(SIGMA. Co.),及び 100 μ g/mLのハイグロマイシン（SIGMA. Co .)をカ卩えて選択を行った。 10日後にマイクロピペットでコロニーを拾い、トリプシン 20 Lが入った 96wellプレートに移してトリプシン処理を行い、 ES medium 180 Lを加え て中和してから 24wellプレートの MSTO上に継代した。コンフノレェントになった細胞は トリプシン処理して、一部は 0.1%ゼラチンコートした 24wellプレートにゲノム抽出用に 継代し、残りは細胞凍結用培地を加えてプレートごと凍結した。ゲノム抽出用に継代 した細胞がコンフルェントになったら、 PBSで 2回洗浄してゲノムを抽出した。
[0219] (6)サザンブロット
抽出したゲノム DNA 10 gを Bel I(NEB)でー晚処理したものを 0.7 %ァガロースゲル で電気泳動した。泳動後のゲルを denaturingbuffer (0.5M NaOH, 1.5MNaCl)に浸し 、 50rpmで 30分間、室温で振とうした。ゲルを蒸留水ですすぎ、 neutralizing buffer (0 .5M Tris-HCl pH7.0、 1.5M NaCl)に浸して 50rpmで 30分間、室温で振とうした。ゲ ルを蒸留水ですすぎ、 20 X SSC (3M NaCl、 0.3M Na citratepH7.0)に浸して 50rpmで 30分間、室温で振とうした後、 TURBOBLOTTER Rapid Downward Transfer System/ Stack Tray (Schleicher &Schuell)のマニュアルに従ってナイロンメンブレン（Hybond N.Amersham Biosciences)にー晚かけてブロットした。翌日、ナイロンメンブレンに DN Aが移っていることを確認した。ナイロンメンブレンを 2 X SSCで洗浄し、 UV照射を 行いナイロンメンブレンに DNAを固定した。このメンブレンをハイブリダィゼーシヨン ボトルに移し, PerfectHyb Plus HYBRIDIZATION Buffer (SIGMA. Co.)を 7mlカロえて 6 8°Cで 1時間プレハイブリダィゼーシヨンした。 ECAT 15の遺伝子型を確認する際の プローブは、 ECAT15 BACを铸型にして ECAT15- 3' probe- s (5， - GCTCCAAATG ACCACAAGACTAACAGGC - 3，) (配列番号： 41)と ECAT15- 3 ' probe-as (5，- GTG CACATTCCTCCAAGTAGGTAT GAA A - 3') (配列番号： 42)を用いて PCRを行って 得りれた断ハ'を、 Rediprime II Random Prime Labelling system (AmershamBioscience s. Co.)を用いて [32P]-dCTPでラベリングしたものを用いた。ラベリングしたプローブ を液体シンチレーシヨンにより放射線強度を測定した。 1.2 X 107 dpmのプローブを 1 00°Cで 5分間処理したものを、プレハイブリダィゼーシヨンを行なったメンブレンの入 つたボトルに加え、 68°Cで 3時間ハイブリダィゼーシヨンを行なった。 3時間後、 first wash buffer(2 X SSC, 10%SDS)を適量カ卩えて室温で 5分間洗浄した。次に second wash buffer (0.2 X SSC, 10%SDS)を適量カ卩え、 68°Cで 20分間の洗浄を 2回行なった。洗 浄後のメンブレンをラップで包み、イメージングプレート（Fuji. Co.)でー晚露光し、翌 日 BAS 5000 (Fuji. Co.)を用いて解析を行った。
[0220] (7)定量 PCR
定量 PCR用プライマー、 taq manプローブの設計
Taq manプローブは長さが 20〜 30塩基で 5 '末端の Gは避けた。 4つ以上の Gの 連続はさけた。このプローブを挟む形でプライマーを設計した。以上の部位は繰り返 し配列がないことを確認して設計した (RepeatMasker2)。 15-1、 15-2、及びコントロー ルとして Nanog遺伝子をターゲテイングした部位 (Cell, 113,p631-642(2003》で設計し た。これらを用いて以下の様に定量 PCRを行った。
[0221] 定量 PCR反応条件：
2 X buffer 6.25 ; primer 1.25, 1.25 ; taq man probe 1.25 ; template 0.5 ; DDW 2 ; Total 1
94°C 3分； 94°C 2秒 50 °C 15秒 72°C 1分（40 cycle) ; 72°Cで維持
[0222] 用いたプライマー：
Q 15-l-s2 (5 ' -AGAAGAGAAGAATGAGCGTTACAA T -3，) (配列番号： 43), Q15-l-as2 (5' -GGATTCTAAATTCCTTCCTAACAA A- 3') (配列番号： 44), Q15-2-S (5 -ATG AATACAGTGTATTTACCAGTGT - 3') (配列番号： 45), Q15-2-as (5，- GAGCTACTACTGCCAGTTGATGACT - 3，）（配列番号： 46), Qnanog-s (5 ' -GTCCTTAGAAGTTGCTGTAATGTA A - 3') (配列番号： 47), Qnanog-as (5， - TCACATAATTATGATTTTAACAGGC - 3，）（配列番号： 48) バッファー： QuickGoldSt ar Mastermix Plus (NIPPON GENE Co.)
[0223] Taq man Probe (NIPPON EGT Co.)
15-lTaq (5， - CGGGTGTAGATGTGTTAGGAGAGGA - 3，）（配列番号： 49), 15-2Taq (5， - CCTGCAGCTGAACTGACTGCTG -3，）（配列番号： 50),
nanogTaq (5 ' -TGAATCGAACTAACGTCTGGACGTC -3，）（配列番号： 51) ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems Co.)
[0224] 2.結果
BAC (Bacterial artificial chromosome)のスクリーニングの結果、 ECAT15— 1、 15—2 の全長を含み、全長が約 140 kbpの ECAT15 BACクローンが得られた。この BAC を Rec/ETの組み換え酵素を用いて、 ECAT15 BACターゲティングベクターを作成 した。このベクターは 15-1の第 2ェキソンから第 7ェキソンまでをネオマイシン耐性遺 伝子で置換し、 15-2の第 2ェキソン力 第 7ェキソンまでをノヽィグロマイシン耐性遺伝 子で置換している (図 3)。
[0225] このターゲテイングベクターを ES細胞 (RF8)に導入し、 PCRにより耐性マーカーが 導入されているか調べた結果、 15-1部位でその導入が確認できた（18/18クローン) 。さらに、 15-2部位でも同様に確認できた。このクローンを用いてサザンブロットによ る相同組み換えの確認を行ったところ、相同組み換え体にのみ存在する 19.5 kbの バンドを検出するクローンを得た (3/18クローン）（図 4)。
サザンブロットでは 5'側で相同組み換えが起こる部位が 40 kb以上あり、確認が 困難だったので、定量 PCRによる確認を行った。相同組み換え体のゲノムは、通常 のゲノムに比べ、組み変わった部位の PCR増幅量が半減していると考えた。 15-1部 位でスクリーニングを行った結果 3クローン値が半減しているクローンが得られた。こ の際、コントロールとして、すでに相同組み換えの確認がなされている Nanog (+ /-) クローン (Cell,113,p631-642(2003》のゲノムを用いた結果、予想通り値が半減してい た。また、これら 3クローンは 15-2部位でも同様の結果が得られた。
[0226] 上記で定量 PCR及びサザンブロットでともに確認できたクローンを ECAT15-1、 2 ダブルへテロ変異細胞とした。 15-1および 15-2ヘテロ変異 ES細胞はコントロール細 胞湘同組換えを起こさな力つた細胞）に比べて増殖が遅ぐ分化しやすい傾向にあ つた。以上の結果より、 ECAT15が ES細胞の増殖と未分ィ匕維持において重要な役割 を果たして!/ヽることが確認された。
実施例 6
[0227] ECAT15-1及び ECAT15-2のタンパク複合体解析
1.実験方法
1)ベクターの構築
本研究でのベクター構築の多くは GATEWAY Cloning Technology(Invitrogen. Co. )を利用した。この手法は目的遺伝子をもつエントリーベクターと、大腸菌や動物細胞 での発現をもたらすデスティネーションベクターとの間で組み換え反応を起こし、 目的 の遺伝子をもつ発現ベクターを迅速に作成できる。 RF8 cDNA産物より、以下のブラ イマ一：
ECAT15- gw- s (5， -CACCATGGAGACTGCTGGAGACAAGAAG-3，）(配列番号： 52 ),
ECAT15- 1- gw- as (5， - TTATCCTTCGAGGCTCTTAGTCAA- 3，）(配列番号： 53), ECAT15- 2- gw- s (5，- CACCATGTCATACTTCGGCCTGGAGACT -3，）(配列番号 : 54),
ECAT15- 2- gw- as (5， - TGTCTACGGCGGCATATTTGGGGG- 3，）(配列番号： 55), を用いて PCR反応を行い、 pENTR - D-TOPOに TOPOクロー-ング (Invitrogen. C
0. )により導入し、 pENTR- ECAT15 -1, 2を得た。これらと pCAG- Myc- gw- IPおよび p CAG- Flag- gw- IPベクターを用いて、 GETEWAY Cloning Technology (Invitrogen Co. )により pCAG— Myc— ECAT15— 1、 pCAG—Myc— EC AT 15—2、 pCAG— Flag— ECAT15—
1、 pCAG - Flag-ECAT15-2を作成した。また抗体作製のために、大腸菌での発現べ クタ一である PDEST17と、 pENTR— ECAT15—1, 2を反応させ、 pDEST17— ECAT15— 1, 2を作製した。
[0228] 2)組み換えタンパク質精製及び抗体作成
PDEST17-ECAT15-1 , 2を組み換えタンパク質発現用大腸菌 BL21-AIに導入し、 カルべ-シリン含有（100 μ g/mL) LBプレートに撒いた。翌日、シングルコロニーを 拾い 5 mLのカルべ-シリン含有 (100 μ g/mL) LB液体培地において 37°Cにおい て O.D. = 0.6まで培養した。これに L-ァラビノースを最終濃度が 0.2 %となるように 加え、 4時間培養した。菌体を回収し、菌体重量 lgに対して 3 mlの Buffer A ( 0.01 M Tris - HCl pH8.0、 6M Guanidine Hydrochlorideゝ 0.1 M NaH PO /Na HPO )をカロ
2 4 2 4 え、室温で 1時間攪拌した。これを 10000Gで 30分間遠心し、上清を回収した。これ に Buffer Aで洗浄した 1 mlの Ni- NTA agarose ( QIAGEN )を加え、 1時間以上室温 で撹拌した。 2 ml容量のポリスチレン製カラム（PIERCE)にこの混合溶液を入れ、余 分な Bufferを自然落下させた。 4 mlの Buffer C( 0.01 M Tris- HCl pH6.3、 8 MUrea 、 0.1 M NaH PO )で 2回洗浄後、 0.5 mlの Buffer E( 0.01 M Tris— HCl pH4.5、 8 M U
2 4
rea、 0.1 M NaH PO )で組換えタンパク質を溶出させた。溶出は 4回行い、回収した
2 4
組み換えタンパク質を Slide- A- Lyzer Cassette(PIERCE)を用いて 6 M Urea/PBSに ー晚透析した。
[0229] その後、一部に等容量の 2 X sample buffer(100 mM Tris- HCl pH6.8、 4% SDS、 10 % 2- ME, 14% glycerol, 0.0 2% BPB)を加え、 100 °Cで 5分間熱処理した。 SDS-ゲル 電気泳動および CBB染色により組み換えタンパク質の存在および量を確認した。 抗 体作製用動物として、ニュージーランドホワイト種（ 10週齢、雌）を用いた。初回免疫 は、約 200 μ gの抗原タンパク質（0.5 ml)と等容量の ADJUVANT COMPLETE FREU ND (DIFCO Co.)を混合しェマルジヨンを形成したものを 5力所程度背中に皮下注 射した。 初回免疫から 4週間後、 2回目の免疫からは約 200 μ gの抗原タンパク質と 等容量の ADJUVANT INCOMPLETE FREUNDを混合しェマルジヨンを形成したも のを同様に 5力所程度皮下注射した。 2回目の免疫以降は 2週間に 1回、 5回目ま で免疫注射を行った。 2回目の免疫注射から 1週間後、 2週間おきにラビットの耳の 動脈より約 20 mlの血液を採取した。採取した血液は 37°Cで 1時間温め、 4 °Cで一 晚静置後、 3000 rpmで 10分間遠心し、上清を回収した。これをさらに 15000 rpmで 1 0分間遠心し、上清を回収した。この血清を用いて、作成した抗体の力価を western blottingによって確認した。 5回目免疫の翌週に耳動脈より可能な限り採血した後、 心窄刺による全採血を行った。これを上記と同様に処理し、抗 ECAT15-1および 15-2 血清とした。
[0230] 3)—過性過剰発現細胞を用いた免疫沈降法
Myc- tagged ECAT15- 2 (以下 Mycl5- 2)と Flag- tagged ECAT15 -1 (以下 Flagl5- 1) 、 Myc- tagged ECAT15- 1(以下 Mycl5- 1)と Flagl5- 1、または Mycl5 -2と Flag- tagged ECAT15 - 2(以下 Flagl5- 2)の組み合わせで、上記の pCAG -Myc- EC ATI 5-1、 pCA G—Myc— EC AT 15—2、 pCAG—Flag— EC ATI 5—1、 pCAG—Flag— EC AT 15—2を MG1.19 ES細胞へリポフエクタミン 2000でトランスフエクシヨンした。まず DMEM 250 μ ΐへべ クタ一を 4 /z gカロえる。また、別に DMEM 250 μ Lにリポフエクタミン 2000を 8 1カロ える。 両者を混ぜ、 20分後静置。 6 wellプレート上の細胞を PBSで洗った後に上記 混合液をカ卩える。 4時間後、培養液を 2ml加える。 24h後にタンパクを回収した。コン トロールとして Flagl5- 1、 2,pCAG-IP (Mock)を発現させたものも同時に用意した。 Bu fferに NP40 0.05 %になるよう加えソ-ケーシヨンを行い、上清を回収した。ここに No rmal mouse IgG Acを 5 L加え、 4°C 30分ローテートした。上清に cMyc (9E10)Acを 15 μ 1加え、 4°C 2時間ローテートした。 12000 rpm 10秒遠心し、 bufferに Nacl(final 1 50 mM)、 NP40 (final 0.05 %)をカ卩えたもので 4回洗った。ビーズに SDSサンプルバッ ファーを加え 100°C 5分間処理し、ウェスタンブロットを行った。
[0231] 4)内在性タンパク質での免疫沈降法
MG1.19 ES細胞よりタンパクを回収し、上記 bufferで洗った。 Bufferに NP40を 0.05 %になるよう加えソ-ケーシヨンを行い、上清を回収した。ここに Normal mouse IgG A cを 5 μ 1カ卩ぇ 4°Cで 30分ローテートした。上清に抗 15-1 , 2、ノーマル血清を 7.5 μ 1 加え、 4°C 2時間ローテートした。 ProteinA- Sepharoseを 10 μ 1加え、 1時間ローテ一 トした。 12000 rpm 10秒遠心し、 bufferに Nacl (final 150 mM)、 NP40 (final 0.05 %)を 加えたもので 4回洗った。 ビーズに SDSサンプルバッファーをカ卩ぇ 100°C 5分処理 し、ウェスタンブロットにより解析した。
[0232] 2.結果 Flagl5-1及び Mycl5-2を強制発現させ、抗 Myc抗体により免疫沈降をおこなった結 果、 Flagl5-1の共沈降が検出された（図 5左）。さらに、 Mycl5 -1及び Flagl5 -1を強 制発現させ、 Mycにより免疫沈降をおこなった結果、 Flagl5_lの共沈降が検出され た（図 5中央)。また、 Mycl5-2及び Flagl5-2を強制発現させ、 Mycにより免疫沈 降をおこなった結果、 Flagl5_2の共沈降が検出された（図 5右)。以上の結果から、 E CAT15-1同士、 ECAT15-2同士、および ECAT15-1と ECAT15-2が細胞内で結合し ていると考えられた。
[0233] 前記の結果が内在性タンパク質ではどうかを調べるため、抗血清を用いて免疫沈 降を行った。その結果、抗 15-1抗血清で免疫沈降したものでは 15-1, 15-2が検出 された。また抗 15-2抗血清で免疫沈降したものでも同様に 15-1, 15 -2が検出でき た (図 6)。以上により ECAT15-1と ECAT15-2が細胞内で結合していることが示された 産業上の利用可能性
[0234] 本発明により、 ES細胞において特異的に発現している ECAT遺伝子 5種 (ECAT15- 1遺伝子、 ECAT15- 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 RnH7遺伝子、 LOC380905遺伝子） を、新たに提供する。本発明の ES細胞特異的発現遺伝子およびそれがコードするタ ンパク質は、 ES細胞の検出、体細胞核初期化物質のスクリーニング、または ES細胞 維持物質のスクリ一ユング等にお 、て有効に用いられる。
図面の簡単な説明
[0235] [図 1]ES細胞と成体マウスの 13種類の臓器における mECAT15- 1及び mECAT15- 2の 発現を RT-PCTにより解析した結果を示す図である。陽性コントロールとして mNATl の発現も解析した。レーン 1 :未分化 MG1.19 ES細胞、レーン 2 :分化 MG1.19 ES細胞 、レーン 3 :未分化 RF8 ES細胞（RTマイナスコントロール）、レーン 4:未分化 RF8 ES細 胞、レーン 5 :分ィ匕 RF8 ES細胞、レーン 6 :脳、レーン 7 :心臓、レーン 8 :腎臓、レーン 9 : 精巣、レーン 10 :脾臓、レーン 11 :筋肉、レーン 12 :肺、レーン 13 :胃、レーン 14:卵巣、 レーン 15 :胸腺、レーン 16 :肝臓、レーン 17 :皮膚、レーン 18 :腸。
[図 2]ES細胞と成体マウスの 13種類の臓器における ECAT16 (mRnH7、 LOC380905) の発現を RT-PCTにより解析した結果を示す図である。陽性コントロールとして mNAT 1の発現も解析した。レーン 1 :未分化 MG1.19 ES細胞、レーン 2 :分化 MG1.19 ES細 胞、レーン 3 :未分化 RF8 ES細胞（RTマイナスコントロール）、レーン 4:未分化 RF8 ES 細胞、レーン 5 :分ィ匕 RF8 ES細胞、レーン 6 :脳、レーン 7 :心臓、レーン 8 :腎臓、レーン 9 :精巣、レーン 10 :脾臓、レーン 11 :筋肉、レーン 12 :肺、レーン 13 :胃、レーン 14:卵 巣、レーン 15 :胸腺、レーン 16 :肝臓、レーン 17 :皮膚、レーン 18 :腸、レーン 19 :水（ 陰性コントロール)。
[図 3]ECAT15遺伝子のターゲッティングベクターと、それを用いた ECAT15遺伝子破 壊の概念を示した図である。図中、上段は野生型ゲノム上の ECAT15-1及び ECAT1 5-2遺伝子の位置を、中断は BACターゲッティングベクターの概念図を、下段は相同 糸且換え後のゲノムの概念図を、それぞれ示す。また図中、白抜き四角はネオマイシン 耐性遺伝子を、また黒四角はハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。
[図 4]ECAT15遺伝子の相同組換えが行われたことをサザンブロットで確認した結果 を示す図である。図中 +/+は正常 ES細胞の結果を、また +/-は ECAT15遺伝子へテ 口変異 ES細胞の結果を示す。
[図 5]ECAT15蛋白質の複合体形成を示した図である。図中、左段は ECAT15-1と E CAT15-2の結合を、中段は ECAT15-1同士の結合を、右段は ECAT15-2同士の結 合を示す。また図中、 IPは免疫沈降 (Immunoprecipitation)を、 WBはウェスタンブロット (Western blot)を示す。
[図 6]ECAT15蛋白質（内在性)の複合体形成を示した図である。図中、左段は抗 E CAT15-1抗体で免疫沈降を行った結果を、右段は抗 ECAT15-2抗体で免疫沈降を 行った結果を示す。また図中、 Inputは免疫沈降前の細胞抽出液の結果を示す。 配列表フリーテキスト
配列番号： 19〜配列番号： 32に記載の塩基配列はプライマーである。
配列番号： 35〜配列番号： 48に記載の塩基配列はプライマーである。
配列番号： 49〜配列番号： 51に記載の塩基配列はプローブである。
配列番号： 52〜配列番号： 55に記載の塩基配列はプライマーである。

Claims

請求の範囲
[I] ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝子ま たは LOC380905 (TDRD4)遺伝子の!/ヽずれかに由来するポリヌクレオチドを含有 する、 ES細胞検出用マーカー。
[2] ECAT15— 1遺伝子が配列番号： 1または 3に記載の塩基配列を含有する遺伝子 である、請求項 1記載のマーカー。
[3] ECAT15 2遺伝子が配列番号： 5または 7に記載の塩基配列を含有する遺伝子 である、請求項 1記載のマーカー。
[4] ECAT16遺伝子が配列番号： 17または 33に記載の塩基配列を含有する遺伝子 である、請求項 1記載のマーカー。
[5] Rnf 17遺伝子が配列番号： 9または 11に記載の塩基配列を含有する遺伝子である
、請求項 1記載のマーカー。
[6] LOC380905 (TDRD4)遺伝子が配列番号： 13または 15に記載の塩基配列を含 有する遺伝子である、請求項 1記載のマーカー。
[7] 連続する少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び Z又は該ポリヌクレオチ ドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、請求項 1〜6いずれか記載のマーカー。
[8] 酉己歹 IJ番号： 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17また ίま 33の!/、ずれ力に記載の塩基酉己 列にお 、て、連続する少なくとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び Ζ又は該ポ リヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、 ES細胞検出用マーカー。
[9] ES細胞の検出においてプローブまたはプライマーとして使用される、請求項 1〜8
V、ずれか記載のマーカー。
[10] ECAT15— 1、 ECAT15— 2、 ECAT16、 Rnf 17または LOC380905 (TDRD4
)のいずれかを認識する抗体を含有する、 ES細胞検出用マーカー。
[I I] ECAT15 1が配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質 である、請求項 10記載のマーカー。
[12] ECAT15 2が配列番号： 6または 8に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質 である、請求項 10記載のマーカー。
[13] ECAT16が配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質で ある、請求項 10記載のマーカー。
[14] Rnfl7が配列番号： 10または 12に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質であ る、請求項 10記載のマーカー。
[15] LOC380905 (TDRD4)が配列番号： 14または 16に記載のアミノ酸配列を含有す るタンパク質である、請求項 10記載のマーカー。
[16] 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、 ES細胞の検出方法：
(a)被験細胞に由来する RNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、 請求項 1〜9いずれか記載のマーカーとを結合させる工程、
(b)該マーカーに結合した被験細胞由来の RNAまたは該 RNAから転写された相補 的ポリヌクレオチドを、上記マーカーを指標として測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ!/、て、被験細胞力 ¾S細胞であるか否かを判断する 工程。
[17] 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、 ES細胞の検出方法：
(a)被験細胞に由来するタンパク質と、請求項 10〜 15いずれか記載のマーカーとを 結合させる工程、
(b)該マーカーに結合した被験細胞由来のタンパク質を、上記マーカーを指標として 測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づ!/、て、被験細胞力 ¾S細胞であるか否かを判断する 工程。
[18] 以下の（a)および (b)の工程を含む、体細胞の核初期化物質のスクリーニング方法
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触さ せる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の出現の有無を調べ、該細胞を 出現させた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程。
[19] マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、 発色酵素遺伝子またはこれらの組み合わせに係る遺伝子である、請求項 18記載の スクリーニング方法。
[20] 以下の（a)および (b)の工程を含む、請求項 18または 19記載のスクリーニング方法
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックイン した遺伝子を含有する体細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を生 じさせた被験物質を体細胞の核初期化候補物質として選択する工程。
[21] ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝子ま たは LOC380905 (TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含 有するノックインマウス。
[22] 請求項 21記載のノックインマウスの、請求項 18〜20いずれか記載のスクリーニン グ方法にぉ 、て用いる体細胞の供給源としての使用。
[23] ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝子ま たは LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置 にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞。
[24] ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝子ま たは LOC380905 (TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含 有する、請求項 23記載の体細胞。
[25] 以下の（a)および (b)の工程を含む、 ES様細胞の選択方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化 物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞を ES様細胞として選択する工程
[26] 以下の（a)および (b)の工程を含む、請求項 25記載の選択方法: (a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置に薬剤耐性遺伝子を存在させた遺伝子を含有する体細胞と、体細胞の核初期化 物質とを接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、選択培地中での生存細胞を ES様細胞として選択するェ 程。
[27] 請求項 23または 24記載の体細胞の、請求項 18〜20いずれか記載のスクリーニン グ方法または請求項 25〜26いずれか記載の選択方法における使用。
[28] 以下の（a)および (b)の工程を含む、 ES細胞の未分化 ·多能性維持物質のスクリー ユング方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位 置にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する ES細胞を、 ES細胞の未分化' 多能性を維持できない培地中で被験物質と接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、マーカー遺伝子発現細胞の存在の有無を調べ、該細胞を 存在させた被験物質を ES細胞未分化 ·多能性維持の候補物質として選択する工程
[29] 以下の（a)および (b)の工程を含む、請求項 28記載のスクリーニング方法：
(a) ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnfl7遺伝子 または LOC380905 (TDRD4)遺伝子に薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子をノックイン した遺伝子を含有する ES細胞を、 ES細胞の未分化 ·多能性を維持できな!/ヽ培地中 で被験物質と接触させる工程、
(b)前記 (a)の工程の後、選択培地中での生存細胞の有無を調べ、該生存細胞を存 在させた被験物質を ES細胞未分化 ·多能性維持の候補物質として選択する工程。
[30] ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝子ま たは LOC380905 (TDRD4)遺伝子の発現調節領域により発現調節を受ける位置 にマーカー遺伝子を存在させた遺伝子を含有する ES細胞。
[31] ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝子ま たは LOC380905 (TDRD4)遺伝子にマーカー遺伝子をノックインした遺伝子を含 有する、請求項 30記載の ES細胞。
[32] 請求項 30または 31記載の ES細胞の、請求項 28または 29記載のスクリーニング方 法における使用。
[33] ECAT15— 1、 ECAT15— 2、 ECAT16、 Rnf 17または LOC380905 (TDRD4
)のいずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進 する物質との結合体。
[34] ECAT15— 1、 ECAT15— 2、 ECAT16、 Rnf 17または LOC380905 (TDRD4
)のいずれかを含有するタンパク質と、当該タンパク質の細胞内への取り込みを促進 するタンパク質との融合タンパク質である、請求項 33記載の結合体。
[35] 請求項 34記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド
[36] 請求項 35記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
[37] 請求項 36記載の発現ベクターを導入した細胞。
[38] ECAT15— 1、 ECAT15— 2、 ECAT16、 Rnf 17または LOC380905 (TDRD4 )のいずれかを含有するタンパク質、若しくは請求項 33または 34記載の結合体を有 効成分として含有する ES細胞の機能維持剤。
[39] ECAT15— 1遺伝子、 ECAT15— 2遺伝子、 ECAT16遺伝子、 Rnf 17遺伝子ま たは LOC380905 (TDRD4)遺伝子の!/、ずれかを含有するポリヌクレオチド、または これらを含有する発現ベクターを有効成分として含有する ES細胞の機能維持剤。
[40] 以下の (a)〜（d)のいずれかよりなる ECAT16遺伝子のポリヌクレチド：
(a)配列番号： 17または 33に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
(b)配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する ポリヌクレオチド、
(c)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチドと 70%以上の相同性を有し、且つ ECAT1 6の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d)前記 (a)または (b)のポリヌクレオチド (相補鎖）に対してストリンジェントな条件下 でハイブリダィズし、且つ EC ATI 6の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレ ォチド。
[41] 以下の（a)〜（c)の!、ずれかよりなる ECAT16タンパク質：
(a)配列番号： 18または 34に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質、
(b)前記 (a)のタンパク質と 70%以上の相同性を有し、且つ ECAT16の機能を有す るタンノ ク質、
(c)前記 (a)のタンパク質において 1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失及び Z又 は付加されたアミノ酸配列を含有し、且つ ECAT16の機能を有するタンパク質。
[42] 配列番号： 1または 5に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチド。
[43] 配列番号： 2または 6に記載のアミノ酸配列を含有するタンパク質。
[44] 請求項 40または 42記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
[45] 請求項 44記載の発現ベクターを導入した細胞。
[46] 請求項 45記載の細胞を、請求項 44記載の発現ベクターの発現可能な条件下で培 養することを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。
[47] 請求項 41または 43記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
[48] 請求項 40または 42記載のポリヌクレオチドのいずれかに特異的な、連続する少な くとも 15塩基を含有するポリヌクレオチド及び Z又は該ポリヌクレオチドに相補的なポ リヌクレ才チド。
[49] 請求項 41または 43記載のタンパク質のいずれかに特異的な、連続する少なくとも 6 アミノ酸を含有するポリペプチド。
[50] 請求項 40または 42記載のポリヌクレオチドの 、ずれかを人為的に染色体中に挿入 したか、あるいは 、ずれかをノックアウトさせた遺伝子改変動物。
[51] 請求項 40または 42記載のポリヌクレオチドの 、ずれかに相補的なアンチセンス核 酸または短! ヽ干渉 RNA (siRNA)。
[52] ECAT15— 1および ECAT15— 2の複合体。
[53] 請求項 52記載の複合体、または当該複合体の細胞内への取り込みを促進する物 質との結合体を有効成分として含有する、請求項 38記載の ES細胞の機能維持剤。
[54] 以下の（a)および (b) :
(a) ECAT15— 1遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現べク ター、
(b) ECAT15 2遺伝子を含有するポリヌクレオチドまたはこれを含有する発現べク ター、
を有効成分として含有する、請求項 39記載の ES細胞の機能維持剤。
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