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WO2006030099A1 - Procede de production du polysaccharide k5 - Google Patents

Procede de production du polysaccharide k5 Download PDF

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Publication number
WO2006030099A1
WO2006030099A1 PCT/FR2005/002210 FR2005002210W WO2006030099A1 WO 2006030099 A1 WO2006030099 A1 WO 2006030099A1 FR 2005002210 W FR2005002210 W FR 2005002210W WO 2006030099 A1 WO2006030099 A1 WO 2006030099A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
growth
phase
batch
during
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2005/002210
Other languages
English (en)
Inventor
Christian Viskov
Fabien Lux
Régis GERVIER
Gilles Colas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Priority to JP2007530737A priority Critical patent/JP2008512105A/ja
Priority to EP05800678A priority patent/EP1791947A1/fr
Publication of WO2006030099A1 publication Critical patent/WO2006030099A1/fr
Priority to US11/683,659 priority patent/US20080032349A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing K5 polysaccharide, implementing a fermentation step from Escherichia coli and then a purification step.
  • K5 polysaccharide Processes for obtaining K5 polysaccharide are known. It can be obtained from E strains. coli responsible for extra-intestinal infections.
  • the polysaccharide K5 is composed in equimolar amounts of glucuronic acid and N-acetylglucosamine, which constitute the base unit 4-beta-glucuronil-1,4-alpha-N-acetylglucosamine repeated linearly in the K5 polysaccharide chain.
  • This basic unit has a structural analogy with completely desulfated and N-acetylated heparin, which makes it possible to consider a very interesting alternative to obtaining heparin by extraction of animal organs, namely the production of heparin by chemical modification of the K5 polysaccharide produced by fermentation.
  • the heparin obtained by biosynthesis is prepared in the following manner: the E. coli microorganism is cultured to obtain the K5 polysaccharide, which is then chemically treated to obtain heparin. Methods of preparing heparin from K5 polysaccharide are described [Biochem J., 1991, 275 (1): 151-8; WO 92/17507; Semin. Thromb. Hemost. , 2001, 27 (5): 437-43; Nat. Biotech. , 2003, 21 (11): 1343-46). In a way In general, for heparin synthesis from the K5 polysaccharide, steps of deacetylation and N-resulfation, C-5 epimerization and O-sulfation are required.
  • Heparin is used in particular for its anticoagulant and antithrombotic properties. Heparin, however, has drawbacks that limit the conditions of its use. In particular, its important anticoagulant activity (alla) can cause haemorrhages ⁇ Semin. Thromb. Hemost., Sup. 3, 1999).
  • heparins 3000-6500 Da
  • very low molecular weight heparins from heparin (epsynthetic heparin) ( 1500-3000 Da) for which the AntiXa activities are in particular between 140 and 190 IU / mg for anti-IIa activities of less than 5 IU / mg.
  • Biochem, 1988, 117: 112-125 They include a fermentation step ⁇ 'E. coli consisting of a single glucose growth phase at 37 0 C followed by a purification step of the K5 polysaccharide consisting essentially of a passage over an ion exchange column.
  • the fermentation step of the process according to the present invention comprises several growth phases, at least one of which with a feed, and a cooling phase, which make it possible to obtain, in combination with the purification step, yields up to ten times higher than those described in the prior art.
  • the K5 polysaccharide biosynthesis methods described in the prior art by fermentation of E. all have the disadvantage of having a very low yield.
  • the production of K5 polysaccharide in extracellular form according to the prior art makes it possible to obtain an isolated K5 polysaccharide only in yields of 200 to 850 mg / l.
  • the subject of the invention is therefore a new method for preparing the K5 polysaccharide in extracellular form.
  • the process according to the invention essentially comprises two steps: a fermentation step and a purification step. According to the process according to the invention, it is possible to obtain K5 polysaccharide concentrations up to ten times higher than those obtained with the methods described in the prior art. It is thus possible to obtain according to the invention up to 10 g / l of K5 polysaccharide. Obtaining such concentrations is related to the combination of fermentation and purification steps.
  • the subject of the invention is a process for preparing the K5 polysaccharide comprising: a fermentor-fermentation step of an Escherichia coli strain which produces K5 polysaccharide, comprising: - a phase of growth in discontinuous mode,
  • a cooling phase during which the temperature is lowered and the pH of the medium rises to a value which may be at most 9,
  • the subject of the invention is more particularly the process for preparing the K5 polysaccharide as described above, the purification step of which from the culture medium and / or the biomass does not comprise a column exchange step. of ions, but includes in order:
  • E. coli usable for the production of the polysaccharide K5 according to the invention can be obtained from public collections, such as the
  • the fermentation step according to the invention is carried out from the E. coli microorganism in a fermenter, and comprises: a growth phase in batch mode,
  • One or more fed batch growth cycles which may be exponential or constant,
  • a decontamination phase of the biomass culture medium A decontamination phase of the biomass culture medium.
  • growth in discontinuous mode is meant according to the invention a growth of a microorganism in a reactor without feed or withdrawal.
  • Batch mode growth with feed means a growth of a microorganism in a reactor with a controlled supply of substrate and without withdrawal.
  • the fermentation step according to the invention comprises in particular two growth phases in discontinuous mode with exponential feed to the substrate which follow the growth phase in batch mode.
  • the fermentation step according to the invention comprises a batch growth phase with feed substrate constant preceding the cooling phase.
  • the first fed batch phase begins to deplete the carbon source in the medium during the batch growth phase.
  • the first batch-fed growth phase begins with the depletion of the carbon source in the medium during the batch growth phase and, if appropriate, the subsequent growth phases.
  • batch mode with feeding begin when the concentration of dissolved oxygen drops significantly as a consequence of a limitation of oxygen transfer.
  • each of the batch growth phases begins as described above and the cooling phase begins when all of the culture feed medium has been injected into the fermenter, or when a pH change is detected. .
  • the biomass is separated from the medium by centrifugation. After separation, the biomass and the culture medium are decontaminated; in particular, they are inactivated for a time varying between Ih and 3h at a temperature of about 80 ° C. The supernatant and / or the pellet are then used for the purification of the K5 polysaccharide.
  • the pH is maintained at about 6.5 during batch growth and batch growth with NH 4 OH addition or NH 3 , and up to about 8.5 during the last phase.
  • the dissolved oxygen concentration is maintained between about 15 and about 80% of the air saturation by acting on the agitation rate, the air flow rate, the oxygen enrichment of the inlet air or by adding hydrogen peroxide;
  • the growth temperature during the fermentation step according to the invention is between about 10 ° C. and about 40 ° C. It is more particularly about 30 ° C. during the discontinuous growth phase and the first phase of the growth phase. growth in discontinuous mode with feeding and about 25 0 C if necessary during the other growth phases in batch mode with feeding.
  • the passage from 30 ° C. to 25 ° C. is particularly important for obtaining high yields of K5 polysaccharide.
  • the culture medium used is a synthetic culture medium.
  • the carbon source according to the invention is either glucose or glycerol.
  • the preferred carbon source according to the invention is glycerol.
  • the carbon source in the fermentation step according to the invention is glycerol at a concentration of between about 10 and about 90 g / l in the initial culture medium for the discontinuous growth phase, and between about 250 and about 1200 g / l in the feed medium for batch fed growth phases.
  • Experimental Example 1 illustrates the importance of using glycerol as a carbon source and increasing the concentration of glycerol in the feed medium to obtain high concentrations of K5 polysaccharide.
  • the source of nitrogen in the medium during the discontinuous growth phase according to the invention may be yeast extracts, casamino acids, peptones, NH 4 OH, NH 3 or (NH 4) 2 HPO 4 .
  • the nitrogen source in the initial culture medium during the batch growth phase is more particularly NH 4 OH, NH 3 or (NH 4) 2 HPO 4, and is used in particular at a concentration of about about 1 and about 10 g / l.
  • the nitrogen source is supplied by NH 4 OH or NH 3 for the regulation of the pH. Its concentration is preferably about 20%.
  • the source of nitrogen in the medium during the batch growth phase is NH 4 OH, NH 3 or
  • the subject of the invention is the process for preparing the K5 polysaccharide as described above, comprising a fermentation step in which: the carbon source is glycerol at a concentration of: between about 10 and about 90 g / l in the initial culture medium for the batch growth phase, and - between about 250 and about 1200 g / l in the feed medium for the phases in batch mode with feeding, and the growth temperature is:
  • the subject of the invention is also the process for preparing the K5 polysaccharide as described above, comprising a fermentation step in which: the carbon source is glycerol at a concentration of:
  • - is NH 4 OH, NH 3 or (NH 4 ) 2 HPO 4 , at a concentration of between about 1 and about 10 g / l in the initial culture medium and
  • the subject of the invention is also the process for preparing the K5 polysaccharide as described above, comprising a fermentation step in which: the source of nitrogen in the medium during the discontinuous growth phase is NH 4 OH, NH 3 or (NH 4 ) 2 HPO 4 , at a concentration of between about 1 and about 10 g / l in the initial culture medium and - is provided by NH 4 OH or NH 3 at a concentration of about 20% for the pH regulation during growth phases in batch mode and batch mode with feeding; and - the growth temperature is:
  • the subject of the invention is particularly the process for preparing the K5 polysaccharide as described above in which:
  • the fermentation step includes the following steps in order:
  • the carbon source is glycerol:
  • the subject of the invention is also the process for preparing the K5 polysaccharide as described above, comprising a purification step during which the pH of the solution containing the K5 polysaccharide, and which may be the supernatant of the centrifugation of the fermentation must or the pellet of this resuspended centrifugation is adjusted to between about 7 and about 11, and the polysaccharide is precipitated from this solution. The precipitate is then washed, redissolved and filtered and precipitated.
  • the first precipitation of the purification step is carried out using a quaternary ammonium salt. This precipitation is more particularly using benzethonium chloride.
  • the first precipitate is redissolved in sodium acetate, used in particular at a concentration of 0.1%.
  • methanol is used to precipitate the filtrate in the purification step according to the invention.
  • the first precipitation of the purification step according to the invention is carried out using benzethonium chloride, the precipitate is dissolved in sodium acetate and then filtered, and the filtrate of the purification step is precipitated with methanol.
  • the purified product as indicated above may optionally undergo one or more hydrogen peroxide decolorization. In particular, it undergoes three hydrogen peroxide treatments after the purification.
  • the purified product as indicated above undergoes after the three bleaches with hydrogen peroxide additional treatment with hydrogen peroxide, to eliminate the remaining contaminations.
  • This treatment makes it possible to improve the purity of the product obtained.
  • the invention therefore also relates to a process for preparing the K5 polysaccharide comprising another hydrogen peroxide discoloration after purification and three hydrogen peroxide treatments.
  • the K5 polysaccharide is treated with a protease after any of the above-mentioned purification steps.
  • protease treatment significantly increases the purity of the produced K5 polysaccharide in almost quantitative yield.
  • the invention therefore relates in particular to a process for preparing the polysaccharide K5 comprising treatment with a protease during the purification step.
  • the protease according to the invention is preferably the alkalase.
  • polysaccharide K5 is precipitated, centrifuged and dried.
  • the subject of the invention is therefore particularly a process for preparing the K5 polysaccharide as described above, comprising a purification step during which the following steps are carried out: centrifugation of the culture to separate the culture medium from the biomass ; from the supernatant of the centrifugation of the fermentation must:
  • the subject of the invention is therefore preferably a process for preparing the K5 polysaccharide comprising: a fermentation step which comprises the following steps in the order: a growth phase in discontinuous mode;
  • the nitrogen source is provided by:
  • the carbon source is glycerol:
  • Centrifugation of the culture to separate the culture medium from the biomass; - from the supernatant of the centrifugation of the fermentation must:
  • the process according to the invention thus makes it possible to obtain yields which can be up to 10 times higher than the yields obtained with the methods described in the prior art.
  • the polysaccharide K5 produced as described above is then used as a substrate for a chemical and / or enzymatic reaction of deacetylation, N-resulfation, C-5 epimerization and / or O-sulfation. It is more particularly used according to the invention as a substrate in one of the abovementioned reactions to obtain a hemi-synthetic heparin (bioheparin).
  • the bioheparin obtained is then used according to the invention as a substrate in a fragmentation reaction to obtain LMWH (low molecular weight heparin), whose molecular weight is between about 1500 and about 6500 Da.
  • LMWH low molecular weight heparin
  • LMWH low molecular weight heparin
  • HTBPM very low molecular weight heparin
  • the fermentation is carried out from the strain ⁇ 'E. ATCC23506 coli in a 20 liter fermenter.
  • a preculture of the strain ⁇ 'E. coli is carried out from 1.8 ml of an ampoule frozen overnight at 30 ° C in a 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of the following medium: glycerol 5 to 60 gl -1 , KH 2 PO 4 0.5 to 3 ⁇ g -1 , (NH 4 ) 2 HPO 4 1 to 10 ⁇ g -1 , MgSO 4 0.5 to 5 ⁇ g -1 , citric acid 0.2 to 4 ⁇ g -1 , as well as trace elements. This growth is carried out at 30 ° C.
  • Table I Composition of media used in batch growth and batch growth modes with controlled substrate feed.
  • the cultures are carried out in TECHFORS fermenters (20 1 total volume, 12 1 of useful volume) under the control of the IRIS (Infors) program based on a self-adaptive control algorithm.
  • the concentration of dissolved oxygen in the medium, the pH, the stirring speed, the temperature, the aeration air flow rate, the pressure as well as the pump flow rates (basic control, feed, antifoam) are measured and monitored. online.
  • the analysis of the exit gases of the fermenters is carried out using a mass spectrometer (PRIMA 600S).
  • Cultures can include up to five steps: batch-grown growth followed by three different batch-wise growth stages with substrate feed, and a final cooling step. 1. Growth phase in discontinuous mode
  • the generation time of the strain is estimated from the measurement of carbon dioxide production and the initial flow of the first part of the batch growth with controlled substrate feed. is calculated:
  • CO 2 P ma ⁇ maximum production of carbon dioxide (mmol.1 " 1hf 1 );
  • Go concentration of glycerol or glucose in the concentrated medium used in batch growth with controlled substrate feed
  • MW C o2 molecular weight of CO 2 (gl -1 ) and Y C o 2 / glycerol: CO 2 yield produced by amount of glycerol consumed.
  • this first batch growth cycle with exponential feed to substrate is stopped
  • Another exponential feed is started on the basis of an initial flow rate of 8.4 ml.h "1 at the start of the first batch growth cycle with Controlled substrate feed.
  • the generation time is multiplied by a new corrective factor of between 4 and 10 (preferably 6) as during the previous growth cycle in batch mode with exponential feed to the substrate.
  • This feed rate imposes a growth rate specific to the microorganism of between 0, OSh -1 and 0.16 h -1 .
  • the temperature set point of the fermenter is lowered between 20 and 25 ° C (preferably 25 ° C) to increase the solubility of oxygen in the medium.
  • the new control algorithm of the feed pump is:
  • the feed pump is then stopped and the temperature of the fermenter is brought to 10 0 C while the pH goes back naturally or can be adjusted to a value between 7.5 and 9 (preferably 8.5), favorable to the activity of the polysaccharide enzyme K5 lyase. These conditions are maintained for a period of 0 to 10 hours.
  • the biomass is harvested under level 2 biological hazard work conditions in an airtight container. The must is centrifuged to separate the biomass from the culture supernatant. After separation, the supernatant is decontaminated with stirring by a heat treatment at 80 ° C. for 1 h 30 min. The biomass is decontaminated by a passage at 80 0 C for 2h30. The supernatant and the biomass can be stored at -2O 0 C.
  • COL5K000 / 001 growth phase in batch mode at 30 ° C. / growth phase in batch mode with exponential substrate feed at 30 ° C. / cooling phase.
  • COL5K002 growth phase in batch mode at 30 ° C. / growth phase in batch mode with exponential substrate feeding at 30 ° C. / second batch growth phase with exponential substrate feed at 30 ° C. / cooling phase .
  • COL5K003 / 04 growth phase in batch mode at 30 ° C. / growth phase in batch mode with exponential substrate feed at 30 ° C. / second batch growth phase with exponential substrate feed at 25 ° C. / phase cooling.
  • COL5K005 / 006 growth phase in batch mode at 30 ° C. / growth phase in discontinuous mode with exponential substrate feeding at 30 ° C. / second growth phase in batch mode with exponential substrate feed at 25 ° C. / phase batch growth with constant substrate supply at 25 ° C / cooling phase.
  • the polysaccharides are first depolymerized into their constituent disaccharides
  • the disaccharide mixture is analyzed by CHLP.
  • solutions of heparinases I, II and III are prepared at 0.5 IU / ml in phosphate buffer (68 mg of potassium dihydrogenphosphate, 10 mg of BSA, demineralized water qs 50 ml, pH adjusted to 7 with potassium hydroxide N). These solutions are then mixed in equal proportions to obtain the final solution of heparinases 123. 25 ⁇ l of the 20 mg / ml sample solution, 25 ⁇ l of acetate buffer and 25 ⁇ l of heparinase solution 123 are then mixed in a 300 ⁇ l tube. The mixture is well homogenized and incubated for 24 hours at room temperature, so as to obtain a total depolymerization.
  • the disaccharide 4-beta-glucuronil-1,4 alpha-N-acetylglucosamine is detected as CHLP.
  • the main changes made to the process between the COL5K000 and COL5K006 operations which made it possible to increase the polysaccharide concentration in the culture medium were: the use of glycerol instead of glucose as carbon source, - the increase of the duration total fermentation rate, by adding substrate feed sequences with a decreased specific growth rate (second and third feed sequence) upon the onset of oxygen transfer limitation, increasing the concentration of glycerol. of the feeding solution (passage from 500 ⁇ l -1 to 750 ⁇ g -1 ), and the increase in pH at the end of the operation, which makes it possible to place under favorable conditions for the activity of the K5 polysaccharide. lyase and increase the amount of polysaccharide available in the culture medium.
  • Example 2 6.5 liters of thermally inactivated supernatant containing 24.7 g of K5 polysaccharide were obtained from the fermenter COL5K001. The pH of this solution was adjusted to 7.2 with 5N sodium hydroxide and 663 ml of a 50 g / l aqueous solution of benzethonium chloride was added by casting (ie 1.2 molar equivalents). benzethonium chloride relative to polysaccharide K5). The reaction medium was stirred at room temperature for 30 minutes and then centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes.
  • the pellet obtained was washed twice with 4 liters of demineralised water and then stirred in 5 liters of a 10% sodium acetate solution.
  • the supernatant obtained in the first precipitation with benzethonium chloride was re-treated: its pH was adjusted to 7.2 using 5N sodium hydroxide, added 663 ml of benzethonium chloride at 50 g / l, and stirred. the mixture 30 minutes before centrifugation.
  • the pellet obtained was washed twice with 4 liters of demineralised water and then stirred in 5 liters of a 10% sodium acetate solution.
  • the solutions containing the two resuspended pellets were combined and filtered on sintered glass equipped with a pre-layer of clarcel.
  • the filtrate was cast over 40 liters of methanol.
  • the resulting mixture was stirred for 25 minutes, after which it decanted overnight. The next day, it was centrifuged at 4000 G for 10 minutes. The pellet was washed with methanol and then dried for 36 hours at 50 ° C. under 20 Torr.
  • Example 2 The crude product obtained in Example 2, which weighs 31.5 g, was resuspended with 1.2 liters of demineralized water in an Erlenmeyer flask with magnetic stirring. After the pH was adjusted to 11 with 5N sodium hydroxide, 15 g of sodium chloride and 6 ml of 30% hydrogen peroxide were added to the solution. The mixture was stirred for 10 minutes and then left overnight at room temperature without stirring. The K5 polysaccharide was precipitated by the addition of 4 volumes of methanol to the solution; the mixture was stirred for 30 minutes and then centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes. The pellet was dried in an oven for 36 hours at 45 ° C under 20 Torr. 23.5 g of K5 polysaccharide were thus obtained with a title which was improved from 54 to 65%.
  • the crude K5 polysaccharide was extracted and purified from the COL5K002 fermenter of Example 1.
  • fermenter COL5K002 The supernatant COL5K002 was treated with benzethonium chloride and the pellets are stirred in an acetate solution and then filtered on sintered glass equipped with a preclayer of clarcel, as explained in Example 2.
  • the polysaccharide K5 contained in the filtrate was precipitated with methanol, as explained in Example 2, then it was discolored with hydrogen peroxide, as detailed in Example 3, followed by a second bleaching with hydrogen peroxide.
  • 25.3 g of K5 polysaccharide were obtained with a titer of 78% and a yield greater than 90%.
  • the crude K5 polysaccharide was extracted and purified from the COL5K003 fermenter of Example 4.
  • Example 1 6 liters of thermally inactivated supernatant containing 45 g of K5 polysaccharide were obtained from the fermenter COL5K003. The supernatant COL5K003 was treated with benzethonium chloride and the pellets are stirred in an acetate solution and then filtered on sintered glass equipped with a preclayer of clarcel, as explained in Example 2.
  • the K5 polysaccharide contained in the filtrate was precipitated with methanol, as explained in Example 2, and then underwent two treatments with hydrogen peroxide, as in Example 4, followed by a third hydrogen peroxide decoloration. .
  • the pellet of the fermenter COL5K002 of Example 1 (5 kg containing 31.9 g of polysaccharide K5) was resuspended in a volume of demineralized water and the pH was adjusted to 7.2 with 5N NaOH. The mixture was then stirred for 2 hours at room temperature, before being centrifuged for 90 minutes at 4700 G. The supernatant was treated with benzethonium chloride and the pellets are stirred in an acetate solution and then filtered on sintered glass equipped with a preclayer of clarcel, as explained in Example 2. The polysaccharide K5 contained in the filtrate was precipitated with methanol, as explained in Example 2, and then it was treated three times with hydrogen peroxide, as in Example 5.
  • the pellet of the fermenter COL5K003 of Example 1 (4.75 kg containing 28.5 g of K5 polysaccharide) was resuspended in 4.75 liters of demineralized water and the pH was adjusted to 1.2 with NaOH. 5N. The mixture was then stirred for 2 hours at room temperature, before being centrifuged for 2 hours at 4700 G.
  • the polysaccharide K5 contained in the filtrate was precipitated with methanol, as explained in Example 2, and then it underwent two treatments with hydrogen peroxide, as in Example 4. 25.9 g of K5 polysaccharide were obtained. with a 69% security and a return of
  • a step of enzymatic deproteinization has been implemented in order to improve the purity of the final product.
  • K5 polysaccharide from Example 7 either hydrogen peroxide or alkaline alkalase, were treated to estimate the relative effectiveness of the two treatments.
  • the deproteinization step thus makes it possible to obtain a better yield as well as a higher purity compared with a third treatment with hydrogen peroxide.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production de polysaccharide K5, mettant en oevre une étape de fermentation à partir d'Escherichia coli puis une étape de purification.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DU POLYSACCHARIDE K5
La présente invention concerne un procédé de production de polysaccharide K5, mettant en œuvre une étape de fermentation à partir d'Escherichia coli puis une étape de purification.
Des procédés d' obtention du polysaccharide K5 sont connus. Il peut être obtenu à partir de souches d'E. coli responsables d'infections extra-intestinales.
Le polysaccharide K5 est composé en quantités équimoléculaires d'acide glucuronique et de N- acétylglucosamine, qui constituent l'unité de base 4- beta-glucuronil-1, 4 alpha-N-acetylglucosamine répétée linéairement dans la chaîne de polysaccharide K5.
Figure imgf000002_0001
Cette unité de base présente une analogie structurale avec l'héparine complètement désulfatée et N-acétylée, ce qui permet d'envisager une alternative très intéressante à l'obtention d'héparine par extraction d'organes animaux, à savoir la production d'héparine par modification chimique du polysaccharide K5 produit par fermentation.
L'héparine obtenue par biosynthèse est préparée de la façon suivante : le microorganisme E. coli est cultivé pour obtenir le polysaccharide K5, qui est ensuite traité chimiquement pour obtenir l'héparine. Des méthodes de préparation de l'héparine à partir de polysaccharide K5 sont décrites [Biochem J. , 1991, 275 (l) :151-8 ; WO 92/17507 ; Semin. Thromb. Hemost. , 2001, 27 (5) : 437- 43 ; Nat. Biotech. , 2003, 21 (11) : 1343-46) . De façon générale, pour une synthèse d'héparine à partir du polysaccharide K5, il faut prévoir des étapes de désacétylation et N-resulfatation, C-5 épimérisation et O-sulfatation. L'héparine est utilisée notamment pour ses propriétés anticoagulantes et antithrombotiques. L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante (alla) peut occasionner des hémorragies {Semin. Thromb. Hemost., 5 sup. 3, 1999) . Selon l'invention, par voie de dépolymérisation enzymatique ou chimique, il est possible par exemple d'obtenir à partir de l'héparine hemisynthétique des héparines de bas poids moléculaire (3000-6500 Da) ou encore des héparines de très bas poids moléculaire (1500- 3000 Da) pour lesquelles les activités AntiXa sont notamment comprises entre 140 et 190 Ul/mg pour des activités anti lia inférieure à 5 Ul/mg.
De nombreuses méthodes de préparation du polysaccharide K5 sont décrites dans l'art antérieur {Eur. J. Biochem,
1981, 116 : 359-364; EP0489 647, WO01/02597, Eur. J.
Biochem, 1988, 117 : 112-125) . Elles comprennent notamment une étape de fermentation ά'E. coli consistant en une seule phase de croissance en glucose à 370C suivie d'une étape de purification du polysaccharide K5 consistant essentiellement en un passage sur colonne échangeuse d'ions.
Quant à elle, l'étape de fermentation du procédé selon la présente invention comprend plusieurs phases de croissance, dont au moins une avec alimentation, et une phase de refroidissement, qui permettent d'obtenir, en combinaison avec l'étape de purification, des rendements jusqu'à dix fois supérieurs à ceux décrits dans l'art antérieur. En effet, les méthodes de biosynthèse de polysaccharide K5 décrites dans l'art antérieur par fermentation d'E. coli présentent toutes l'inconvénient d'avoir un très faible rendement. Par exemple, la production de polysaccharide K5 sous forme extracellulaire selon l'art antérieur ne permet d' obtenir un polysaccharide K5 isolé qu'avec des rendements de 200 à 850 mg/1.
Des rendements si faibles ne permettent pas d'envisager une production industrielle de polysaccharide K5 puis, par hemisynthèse, d'héparine hemi-synthétique. Or il existe un besoin important d'obtenir de l'héparine et également des héparines de bas poids moléculaire ou de très bas poids moléculaire d'origine non animale.
L'invention a donc pour objet une nouvelle méthode de préparation du polysaccharide K5 sous forme extracellulaire.
Le procédé selon l'invention comprend essentiellement deux étapes : une étape de fermentation et une étape de purification. Selon le procédé selon l'invention, il est possible d'obtenir des concentrations en polysaccharide K5 jusqu'à dix fois supérieures à celles obtenues avec les méthodes décrites dans l'art antérieur. On peut ainsi obtenir selon l'invention jusqu'à 10 g/1 de polysaccharide K5. L'obtention de telles concentrations est liée à la combinaison des étapes de fermentation et de purification.
L'invention a pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant : — une étape de fermentation, pouvant se faire en fermenteur, d'une souche d'Escherichia coli qui produit du polysaccharide K5, comprenant : — une phase de croissance en mode discontinu,
- une ou plusieurs phases de croissance en mode discontinu avec alimentation, — une phase de refroidissement, pendant laquelle la température est abaissée et le pH du milieu remonte jusqu'à une valeur qui peut être 9 au maximum,
— une phase de séparation du milieu de culture de la biomasse,
- une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse,
— et une étape de purification à partir du milieu de culture et/ou de la biomasse.
L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut, dont l'étape de purification à partir du milieu de culture et/ou de la biomasse ne comprend pas d'étape de passage sur colonne échangeuse d'ions, mais comprend dans l'ordre :
- un ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- une précipitation,
- la dissolution du précipité, — une filtration de la suspension résultante et
- la précipitation dans un alcool.
Fermentation
Les souches d'E. coli utilisables pour la production du polysaccharide K5 suivant l'invention peuvent être obtenues auprès des collections publiques, telles que la
CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, France) ou ATCC (American Type Culture Collection, USA) . Alternativement, ces souches peuvent être obtenues par isolement clinique suivi de la caractérisation du type antigénique de la capsule, tels que décrits dans la littérature (Eur. J. Biochem, 1988 117 : 112-125) .
L'étape de fermentation selon l'invention est réalisée à partir du microorganisme E. coli dans un fermenteur, et comprend : — une phase de croissance en mode discontinu,
— un ou plusieurs cycles de croissance en mode discontinu avec alimentation, qui peut être exponentielle ou constante,
— une phase de refroidissement pendant laquelle la température peut être abaissée aux environs de 10-
12° C et le pH remonte jusqu'à environ 7,5 - 9, une phase de séparation du milieu de culture de la biomasse et
— une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse.
Par croissance en mode discontinu, on entend selon l'invention une croissance d'un microorganisme dans un réacteur sans alimentation ni soutirage.
Par croissance en mode discontinu avec alimentation, on entend selon l'invention une croissance d'un microorganisme dans un réacteur avec apport contrôlé en substrat et sans soutirage.
L'étape de fermentation selon l'invention comprend en particulier deux phases de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat qui succèdent à la phase de croissance en mode discontinu.
L'étape de fermentation selon l'invention comprend une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat précédant la phase de refroidissement.
Dans l'étape de fermentation selon l'invention, la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation commence à l'épuisement de la source de carbone dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu.
Plus particulièrement, selon l'invention, la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation commence à l'épuisement de la source de carbone dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu et, le cas échéant, les phases suivantes de croissance en mode discontinu avec alimentation commencent quand la concentration en oxygène dissout chute significativement par conséquence d'une limitation du transfert d'oxygène.
Selon l'invention, chacune des phases de de croissance en mode discontinu commence ainsi que décrit plus haut et la phase de refroidissement commence quand tout le milieu d'alimentation de culture a été injecté dans le fermenteur, ou quand une variation de pH est détectée.
Selon l'invention, après la phase de croissance en mode discontinu, la ou les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation et la phase de refroidissement, la biomasse est séparée du milieu par centrifugation. Après séparation, la biomasse et le milieu de culture sont décontaminés ; en particulier, ils sont inactivés pendant une durée variant entre Ih et 3h à une température d'environ 800C. Le surnageant et/ou le culot sont ensuite utilisés pour la purification du polysaccharide K5.
Le pH est maintenu à environ 6,5 pendant les phases de croissance en mode discontinu et de croissance en mode discontinu avec alimentation par addition de NH4OH ou de NH3, et remonte jusqu'à environ 8,5 pendant la dernière phase.
La concentration d'oxygène dissout est maintenue entre environ 15 et environ 80% de la saturation en air par action sur la vitesse d'agitation, le débit d'air, l'enrichissement en oxygène de l'air d'entrée ou par ajout de peroxyde d'hydrogène;
La température de croissance durant l'étape de fermentation selon l'invention se situe entre environ 100C et environ 4O0C. Elle est plus particulièrement d'environ 3O0C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation et d'environ 250C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation. Le passage de 3O0C à 25°C est particulièrement important pour obtenir des rendements élevés en polysaccharide K5.
Le milieu de culture utilisé est un milieu de culture synthétique. La source de carbone selon l'invention est soit le glucose, soit le glycérol. La source de carbone préférée selon l'invention est le glycérol.
Plus particulièrement, la source de carbone dans l'étape de fermentation selon l'invention est le glycérol à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation. L'exemple expérimental 1 illustre l'importance de l'utilisation de glycérol comme source de carbone et de l'augmentation de la concentration en glycérol dans le milieu d'alimentation pour l'obtention de concentrations élevées de polysaccharide K5. La source d' azote dans le milieu durant la phase de croissance discontinue selon l'invention peut être des extraits de levure, des acides casaminés, des peptones, NH4OH, NH3 ou (NH4J2HPO4. Selon l'invention, la source d'azote dans le milieu de culture initial durant la phase de croissance en mode discontinu est plus particulièrement NH4OH, NH3 ou (NH4J2HPO4. Elle est en particulier utilisée à une concentration comprise entre environ environ 1 et environ 10 g/1.
Durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation selon l'invention, la source d'azote est fournie par NH4OH ou NH3 pour la régulation du pH. Sa concentration est de préférence d'environ 20%.
Plus particulièrement, dans l'étape de fermentation selon l'invention, la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu est NH4OH, NH3 ou
(NH4J2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ
20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation. L'invention a pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de fermentation dans laquelle : la source de carbone est le glycérol à une concentration comprise : — entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et - entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation, et la température de croissance est :
- d'environ 300C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et
- d'environ 25°C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.
L'invention a aussi pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de fermentation dans laquelle : la source de carbone est le glycérol à une concentration comprise :
- entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et
- entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation ; et la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu : - est NH4OH, NH3 ou (NH4) 2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et
- est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation. L'invention a aussi pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de fermentation dans laquelle : la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu : est NH4OH, NH3 ou (NH4)2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et - est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation ; et - la température de croissance est :
- d'environ 300C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et - d'environ 25°C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.
L'invention a tout particulièrement pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut dans lequel:
• l'étape de fermentation comprend les étapes suivantes dans l'ordre :
— une phase de croissance en mode discontinu, — une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant à l'épuisement complet de la source de carbone durant la phase précédente, — une deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute
5 significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente,
— un cycle de croissance en mode discontinu 10 avec alimentation constante en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture 15 durant la phase précédente, et
— une phase de refroidissement pendant laquelle la température est abaissée à environ 120C et le pH remonte jusqu'à une valeur comprise entre 7,5 environ et 9
20 environ,
— une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse,
• et est effectuée avec les paramètres suivants :
— la température est :
25 - 3O0C environ durant la croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et — 250C environ durant les deux autres
30 phases de croissance en mode discontinu avec alimentation;
— la source d'azote est fournie par:
- (NH4) 2HPO4, NH4OH ou NH3 à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial,
— l'ajout de NH4OH ou NH3 concentré à 20% environ pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation, - la source de carbone est le glycérol :
— à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial durant la première phase de croissance en mode discontinu, et
— à une concentration comprise entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d' alimentation durant les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.
Deuxième étape : purification du polysaccharidβ K5 L'invention a également pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de purification durant laquelle le pH de la solution contenant le polysaccharide K5, et qui peut être le surnageant de la centrifugation du moût de fermentation ou le culot de cette centrifugation remis en suspension, est ajusté entre environ 7 et environ 11, et le polysaccharide est précipité à partir de cette solution. Le précipité est ensuite lavé, remis en solution et filtré, puis précipité. Selon l'invention, la première précipitation de l'étape de purification se fait à l'aide d'un sel d'ammonium quaternaire. Cette précipitation se fait plus particulièrement à l'aide de chlorure de benzéthonium. Dans l'étape de purification selon l'invention, le premier précipité est remis en solution dans l'acétate de sodium, utilisé notamment à une concentration delθ%.
D'autre part, le méthanol est utilisé pour précipiter le filtrat dans l'étape de purification selon l'invention.
Plus particulièrement, la première précipitation de l'étape de purification selon l'invention se fait à l'aide de chlorure de benzéthonium, le précipité est dissout dans l'acétate de sodium puis filtré, et le filtrat de l'étape de purification est précipité au méthanol.
Selon l'invention, le produit purifié ainsi qu'indiqué plus haut peut éventuellement subir une ou plusieurs décoloration au peroxyde d'hydrogène. Il subit en particulier trois traitements au peroxyde d'hydrogène après la purification.
Le cas échéant, le produit purifié ainsi qu'indiqué plus haut subit après les trois décolorations au peroxyde d'hydrogène un traitement supplémentaire au peroxyde d'hydrogène, pour éliminer les contaminations restantes. Ce traitement permet une amélioration de la pureté du produit obtenu. L'invention a donc aussi pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant une autre décoloration au peroxyde d'hydrogène après purification et trois traitements au peroxyde d'hydrogène.
Le cas échéant, le polysaccharide K5 est traité avec une protéase après l'une quelconque des étapes de purification sus-mentionnées. Comme indiqué plus bas dans l'exemple expérimental 8, le traitement à la protéase permet d' augmenter significativement la pureté du polysaccharide K5 produit avec un rendement presque quantitatif. L'invention a donc pour objet en particulier un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant un traitement avec une protéase durant l'étape de purification. La protéase selon l'invention est de préférence l'alcalase.
Finalement, le polysaccharide K5 est précipité, centrifugé et séché.
L'invention a donc tout particulièrement pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de purification durant laquelle on met en œuvre les étapes suivantes : - centrifugation de la culture pour séparer le milieu de culture de la biomasse ; à partir du surnageant de la centrifugation du moût de fermentation :
- ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium,
- lavage du précipité,
- dissolution du précipité dans l'acétate de sodium 10%, - filtration de la solution d'acétate de sodium 10%,
- précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat, - un traitement à l'alcalase ; en parallèle, à partir du culot résultant de la centrifugation du moût de fermentation :
- remise en suspension du culot,
- ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium,
- lavage du précipité,
- remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%, - filtration de la solution d'acétate de sodium 10%,
- précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat,
- un traitement à l'alcalase ; réunion des deux préparations à l'une quelconque des étapes de la purification ;
- précipitation, centrifugation et séchage du polysaccharide K5.
L'invention a donc de préférence pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant : • une étape de fermentation qui: comprend les étapes suivantes dans l'ordre : - une phase de croissance en mode discontinu,
- une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant à l'épuisement complet de la source de carbone durant la phase précédente,
- une deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente, - un cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente, et
— une phase de refroidissement pendant laquelle la température est abaissée à
5 environ 120C et le pH remonte jusqu'à une valeur comprise entre 7,5 environ et 9 environ,
— une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse,
10 - et est effectuée avec les paramètres suivants :
— la température est :
— 3O0C environ durant la croissance en mode discontinu et la première phase
15 de croissance en mode discontinu avec alimentation, et
— 250C environ durant les deux autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation;
20 - la source d'azote est fournie par:
— (NH4)2HPO4, NH4OH ou NH3 à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial,
25 - l'ajout de NH4OH ou NH3 concentré à
20% environ pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation,
30 - la source de carbone est le glycérol :
— à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial durant la première phase de croissance en mode
35 discontinu, et - à une concentration comprise entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation durant les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation ;
• une étape de purification durant laquelle les étapes suivantes sont réalisées :
— centrifugation de la culture pour séparer le milieu de culture de la biomasse ; - à partir du surnageant de la centrifugation du moût de fermentation :
- ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium,
- lavage du précipité,
- remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%,
- filtration de la solution d'acétate de sodium 10%,
- précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat,
- un traitement à l'alcalase ; — en parallèle, à partir du culot résultant de la centrifugation du moût de fermentation :
- remise en suspension du culot,
- ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium,
- lavage du précipité,
- remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%, — filtration de la solution d' acétate de sodium 10%,
— précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat,
- un traitement à l'alcalase ;
— réunion des deux préparations à l'une quelconque des étapes de la purification ;
— précipitation, centrifugation et séchage du polysaccharide K5.
Le procédé selon l'invention permet ainsi d'obtenir des rendements qui peuvent être jusqu'à 10 fois supérieurs aux rendements obtenus avec les méthodes décrites dans l'art antérieur. Selon l'invention le polysaccharide K5 produit ainsi que décrit plus haut est alors utilisé comme substrat pour une réaction chimique et/ou enzymatique de désacétylation, N-resulfatation, C-5 épimérisation et/ou O-sulfatation. Il est plus particulièrement utilisé selon l'invention comme substrat dans une des réactions susmentionnées pour obtenir une héparine hemi-synthétique (biohéparine) .
La biohéparine obtenue est ensuite utilisée selon l'invention comme substrat dans une réaction de fragmentation pour obtenir une HBPM (héparine de bas poids moléculaire) , dont le poids moléculaire est compris entre environ 1500 et environ 6500 Da.
Il est aussi possible selon l'invention d'utiliser la biohéparine obtenue comme substrat dans une réaction de fragmentation pour obtenir une HBPM (héparine de bas poids moléculaire) , dont le poids moléculaire est compris plus particulièrement entre environ 3500 et environ 5500 Da ou une HTBPM (héparine de très bas poids moléculaire) , dont le poids moléculaire est compris plus particulièrement entre environ 1500 et environ 3000 Da.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Exemples d'application
Exemple 1
1) Mode opératoire a) Fermentation
La fermentation est réalisée à partir de la souche ά'E. coli ATCC23506 dans un fermenteur 20 litres.
Une préculture de la souche ά'E. coli est réalisée à partir de 1,8 ml d'une ampoule congelée sur la nuit à 30° C dans un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du milieu suivant : glycérol 5 à 60 g.l"1, KH2PO4 0,5 à 3 g.l'1, (NH4) 2HPO4 1 à 10 g.l"1, MgSO40,5 à 5 g.l"1, acide citrique 0,2 à 4 g.l'1, ainsi que des oligo-éléments. La croissance est réalisée à 3O0C sous agitation à 200 tours/minute. Cette préculture est utilisée pour ensemencer le fermenteur de production. Celui-ci peut aussi être directement ensemencé à partir de l'ampoule glycérolée, l'objectif de la préculture n'étant que de réduire la durée de la phase de croissance en mode discontinu dans le fermenteur. Les milieux utilisés sont des variantes du milieu RFB MIL 11/04 (J. of Biotechnology, 1995, 39 : 59-65) et leurs compositions sont données dans le tableau I.
Tableau I : Composition des milieux utilisés en modes de croissance en mode discontinu et de croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat.
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Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs de type TECHFORS (20 1 volume total, 12 1 de volume utile) sous le contrôle du programme IRIS (Infors) basé sur un algorithme de contrôle auto-adaptatif. La concentration en oxygène dissout dans le milieu, le pH, la vitesse d'agitation, la température, le débit d'air d'aération, la pression ainsi que les débits de pompe (régulation basique, alimentation, antimousse) sont mesurés et contrôlés en ligne. L'analyse des gaz de sortie des fermenteurs est réalisée à l'aide d'un spectromètre de masse (PRIMA 600S) .
La fermentation est réalisée en mode discontinu avec les caractéristiques suivantes :
- Volume utile de 12 1,
- Volume initial de 8 1,
- Volume ajouté de 4 1, - Volume final de 12 1 plus le volume de base, Oxygène dissout maintenu entre 15 et 80% de la saturation en air (préférentiellement maintenu à 30%), - Température entre 20 et 4O0C (préférentiellement 3O0C), pH régulé entre 6,0 et 7,5 (préférentiellement maintenu à 6,5) par addition de NH4OH ou de NH3 concentrés, - Pression de 0,3 bar, 0,5 bar et 0,8 bar,
- Aération initiale de 4 l.min"1 (0.5 VVM) (régulée entre 4 et 20 l.min"1), et
- Vitesse d'agitation initiale de 200 tours/minute
(régulée entre 200 et 1500 tours/minute) . Les cultures peuvent comprendre jusqu'à cinq étapes : une croissance en de croissance en mode discontinu suivie de trois étapes différentes de croissance en mode discontinu avec alimentation en substrat, et une étape finale de refroidissement. 1. Phase de croissance en mode discontinu
Au cours de la phase de culture en mode discontinu, le temps de génération de la souche est estimé à partir de la mesure de production de dioxyde de carbone et le débit initial de la première partie de la croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat est calculé :
Qθ = ( CO2pmax X VθlFer) / ( 1000 X MWC02 X Ycθ2/glycérol X G0 )
Qo: débit initial d'alimentation en milieu concentré (l.h~
1) ; Cθ2Pmaχ: production maximale de dioxyde de carbone (mmol. l"1.hf1) ; Go: concentration en glycérol ou en glucose dans le milieu concentré utilisé lors de la croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat
(750 g.l"1);
Figure imgf000024_0001
volume de liquide dans le fermenteur ;
MWCo2 : poids moléculaire du CO2 (g.l"1) et YCo2/giycéroi : rendement du CO2 produit par quantité de glycérol consommé.
2. Première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat A l'épuisement de la source de carbone, un cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat est initié par alimentation en milieu concentré, afin d'augmenter la concentration en biomasse. La pompe d'alimentation en milieu frais est activée. Son débit suit une augmentation exponentielle au cours du temps:
Q(t) = Q0 x 2 ct ' <τ x 2-4>l
Qo : débit d'alimentation initial (l.h"1) de la pompe d'alimentation ; t : temps écoulé depuis le démarrage du cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat ; τ : temps de génération de la souche mesuré au cours de la croissance en mode discontinu. Ce débit d'alimentation prend en compte le temps de génération précédemment mesuré multiplié par un facteur correctif pouvant varier de 1 à 10 (préférentiellement 2,4) . Ce débit d'alimentation impose un taux de croissance spécifique au microorganisme compris entre 0,05 h"1 et 0,65 h"1. 3. Deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat
A la première limitation de transfert d'oxygène (oxygène dissout < 20%, vitesse d'agitation > 1350 tours/minute, débit d'air > 19,5 l.min"1, pression = 0,5 bars), ce premier cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat est stoppé. Une autre alimentation exponentiellele est démarrée sur la base d'un débit initial de 8,4 ml.h"1 au démarrage du premier cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat. Le temps de génération est multiplié par un nouveau facteur correctif compris entre 4 et 10 (préférentiellement 6) comme durant le précédent cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat. Ce débit d'alimentation impose un taux de croissance spécifique au microorganisme compris entre 0,OSh"1 et 0,16 h " 1. Au même instant, la consigne de température du fermenteur est rabaissée entre 20 et 25°C (préférentiellement 25°C) afin d'augmenter la solubilité de l'oxygène dans le milieu. Le nouvel algorithme de commande de la pompe d'alimentation est:
Q' (t) = 0,0084 x 2 tfc / <τ* 6)] t : temps écoulé depuis le démarrage du cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat ; τ : temps de génération de la souche mesuré au cours de la croissance en mode discontinu. Alors que cette limitation de transfert d'oxygène apparaît vers 30 h de croissance (incluant les 10 h du premier cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat) le débit initial réel de la pompe d'alimentation en milieu est d'environ 15 ml.h"1 (t = 1Oh) . Ce débit d'alimentation plus faible permet à nouveau au système de réguler l'oxygène dissout à 30% de la saturation tout en conservant la croissance du microorganisme. Cette alimentation va continuer jusqu'à l'apparition d'une seconde limitation en transfert d'oxygène. 4. Phase d'alimentation constantee en substrat
A l'apparition de la seconde limitation en transfert d'oxygène (oxygène dissout < 20%, vitesse d'agitation > 1350 tours/minute, débit d'air > 19,5 l.min"1, pression = 0,5 bar), l'alimentation exponentiellele du milieu est transformée en un débit constant compris entre 1 et 20 ml.1"^h"1 (préférentiellement 4,2 ml.l^.h"1) . Cette alimentation continue jusqu'à ce que les 4 1 de milieu d'alimentation aient été injectés ou jusqu'à ce qu'une chute significative du pH soit détectée (consommation totale du NH4OH indiquant une forte limitation en oxygène) .
5. Phase de refroidissement
La pompe d' alimentation est alors arrêtée et la température du fermenteur est amenée à 100C tandis que le pH remonte naturellement ou peut être ajusté à une valeur comprise entre 7,5 et 9 (préférentiellement 8,5), favorable à l'activité de l'enzyme polysaccharide K5 lyase. Ces conditions sont maintenues pendant une durée de 0 à 1Oh. Après que le fermenteur a été réfrigéré à 100C, la biomasse est récoltée en conditions de travail de risque biologique de niveau 2 dans un container hermétique. Le moût est centrifugé pour séparer la biomasse du surnageant de culture. Après séparation, le surnageant est décontaminé sous agitation par un traitement thermique à 800C pendant lh.30. La biomasse est quant à elle décontaminée par un passage à 800C durant 2h30. Le surnageant et la biomasse peuvent être stockés à -2O0C.
Les conditions utilisées dans ces essais sont : - COL5K000/ 001: phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 300C / phase de refroidissement. - COL5K002 : phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 3O0C / deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 300C / phase de refroidissement. - COL5K003/04 : phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 300C / deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 25°C / phase de refroidissement.
- COL5K005/ 006 : phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 3O0C / deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 250C / phase de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat à 25°C / phase de refroidissement. b) Analyse des polysaccharides
L'analyse des polysaccharides se déroule en deux temps :
1. les polysaccharides sont d'abord dépolymérisés en leurs disaccharides constitutifs,
2. le mélange de disaccharides est analysé par CHLP.
1. Dépolymérisation des polysaccharides
On remet en suspension environ 40 mg d'échantillon à analyser dans 2 ml de tampon acétate pH = 7 (0,29 ml d'acide acétique, 5 mg de BSA, 15,8 mg d'acétate de calcium, eau déminéralisée qsp 50 ml, pH ajusté à 7 avec de l'hydroxyde de sodium 2N) afin d'obtenir une solution à 20 mg/ml.
Dans le même temps, on prépare des solutions d'héparinases I, II et III à 0,5 Ul/ml en tampon phosphate (68 mg de dihydrogénophosphate de potassium, 10 mg de BSA, eau déminéralisée qsp 50 ml, pH ajusté à 7 avec de l'hydroxyde de potassium N) . Ces solutions sont ensuite mélangées dans des proportions égales pour obtenir la solution finale d'héparinases 123. On mélange ensuite 25 μl de la solution d'échantillon à 20 mg/ml, 25 μl de tampon acétate et 25 μl de solution d'héparinases 123 dans un tube de 300 μl. Le mélange est bien homogénéisé et incubé pendant 24 heures à température ambiante, de façon à obtenir une dépolymérisation totale.
2. Analyse des polysaccharides par CHLP Le mélange précédent est analysé par CLHP en gradient suivant la méthode bien connue de l'homme de métier. Les conditions d'analyse sont :
- Colonne : Spherisorb SAX 5 μm, 250 x 3 mm, Waters Température de la colonne : 400C
Débit : 0,5 ml/min
Volume d'injection : 10 μl
- Détection UV à 234 nm Phase mobile : o Solvant A : NaH2PO4 2,5 mM pH = 2,9 o Solvant B : NaClO4 M, NaH2PO4 2,5 mM pH = 3 Gradient :
Figure imgf000029_0002
On détecte en CHLP le disaccharide 4-beta-glucuronil-l, 4 alpha-N-acetylglucosamine.
Figure imgf000029_0001
2) Résultats Six essais différents de fermentation (COL5K001 à 006) ont été réalisés, en sus du témoin, COL5K000.
Les concentrations en polysaccharide K5 obtenues lors de ces essais sont résumées dans le tableau 2.
Tableau 2 :
Figure imgf000030_0001
Les résultats (figure 1, annexe 1) montrent clairement que chacun des modes opératoires utilisés a permis de produire entre 2 et 10 fois plus de polysaccharide K5 que le témoin COL5K000. Le profil des principaux paramètres de COLK006 montre que l'augmentation de la concentration du polysaccharide K5 dans le milieu est liée à l'entrée dans la seconde phase de croissance en mode discontinu avec alimentation (figure 2, annexe 1) .
L'étude réalisée a permis décupler la concentration maximale en polysaccharide produit dans le milieu par rapport à ce qui était décrit dans la littérature : celle-ci était de 900 mg.l"1, alors que nous avons obtenu une concentration supérieure à 10 g.l"1.
Les principales modifications apportées au procédé entre les opérations COL5K000 et COL5K006 ayant permis d' augmenter la concentration en polysaccharide dans le milieu de culture ont été : l'utilisation de glycérol au lieu de glucose comme source de carbone, - l'augmentation de la durée totale de fermentation, en ajoutant des séquences d'alimentation en substrat à taux de croissance spécifique diminué (deuxième et troisième séquence d'alimentation) lors de l'apparition de la limitation de transfert d'oxygène, l'augmentation de la concentration en glycérol de la solution de feeding (passage de 500 g.l"1 à 750 g.1"1), et l'augmentation de pH en fin d'opération, qui permet de se placer dans des conditions favorables à l'activité de la polysaccharide K5 lyase et d' augmenter la quantité de polysaccharide disponible dans le milieu de culture. Exemple 2
Procédé d'extraction
Les étapes d'extraction décrites ci-dessous ont été mises en œuvre afin d'isoler le polysaccharide K5 à partir du surnageant de fermentation obtenu précédemment. On a obtenu dans l'exemple 1 6,5 litres de surnageant inactivé thermiquement, qui contiennent 24,7 g de polysaccharide K5, à partir du fermenteur COL5K001. Le pH de cette solution a été ajusté à 7,2 à l'aide de soude 5 N et 663 ml d'une solution aqueuse à 50 g/1 de chlorure de benzéthonium ont été ajoutés par coulée (soit 1,2 équivalent molaire de chlorure de benzéthonium par rapport au polysaccharide K5) . Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 30 minutes puis centrifugé à 4 000 tours/minutes pendant 10 minutes.
Le culot obtenu a été lavé deux fois avec 4 litres d'eau déminéralisée, puis il a été agité dans 5 litres d'une solution d'acétate de sodium à 10%. Le surnageant obtenu dans la première précipitation au chlorure de benzéthonium a été re-traité : on a ajusté son pH à 7,2 à l'aide de soude 5 N, ajouté 663 ml de chlorure de benzéthonium à 50 g/1, et agité le mélange 30 minutes avant de le centrifuger. Le culot obtenu a été lavé deux fois avec 4 litres d' eau déminéralisée, puis il a été agité dans 5 litres d'une solution d'acétate de sodium à 10%. Les solutions contenant les deux culots resuspendus ont été réunies puis filtrées sur verre fritte muni d'une pré-couche de clarcel. Le filtrat a été coulé sur 40 litres de méthanol. Le mélange résultant a été agité pendant 25 minutes, après quoi il a décanté une nuit. Le lendemain, il a été centrifugé à 4000 G pendant 10 minutes. Le culot a été lavé au méthanol, puis séché 36 heures à 5O0C sous 20 Torrs.
On a ainsi obtenu 31,5 g de polysaccharide K5 avec un titre de 54% ; le rendement était de 68,8%. Exemple 3
Purification
Le titre du produit isolé dans l'exemple 2 étant faible (seulement 54%) , des étapes de purification supplémentaires ont été réalisées.
Le produit brut obtenu dans l'exemple 2, qui pèse 31,5 g, a été remis en suspension avec 1,2 litre d'eau déminéralisée dans un erlenmeyer sous agitation magnétique. Après que le pH a été ajusté à 11 à l'aide de soude 5N, 15 g de chlorure de sodium et 6 ml de peroxyde d'hydrogène à 30% ont été ajoutés à la solution. Le mélange a été agité 10 minutes puis laissé la nuit à température ambiante sans agitation. On a précipité le polysaccharide K5 par addition de 4 volumes de méthanol dans la solution ; le mélange a été agité 30 minutes puis centrifugé à 4000 tours/minutes pendant 15 minutes. Le culot a été séché à l'étuve 36 heures à 45°C sous 20 Torrs. On a ainsi obtenu 23,5 g de polysaccharide K5 avec un titre qui a été amélioré de 54 à 65%.
Exemple 4
Extraction et Purification
Le polysaccharide K5 brut a été extrait et purifié à partir du fermenteur COL5K002 de l'exemple 1. On a obtenu dans l'exemple 1 5,4 litres de surnageant inactivé thermiquement, qui contiennent 21,1 g de polysaccharide K5, à partir du fermenteur COL5K002. Le surnageant COL5K002 a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d'acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré¬ couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2. Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis il a subi une décoloration au peroxyde d'hydrogène, ainsi que détaillé dans l'exemple 3, suivie d'une deuxième décoloration au peroxyde d'hydrogène. On a finalement obtenu 25,3 g de polysaccharide K5 avec un titre de 78% et un rendement supérieur à 90%. Exemple 5
Extraction et purification
Le polysaccharide K5 brut a été extrait et purifié à partir du fermenteur COL5K003 de l'exemple 4.
On a obtenu dans l'exemple 1 6 litres de surnageant inactivé thermiquement, qui contiennent 45 g de polysaccharide K5, à partir du fermenteur COL5K003. Le surnageant COL5K003 a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d'acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré- couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2.
Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis a subi deux traitements au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 4, suivis d'une troisième décoloration au peroxyde d'hydrogène.
Finalement, on a obtenu 39,5 g de polysaccharide K5 avec un titre de 81% et un rendement de 71%
Exemple 6
Traitement du culot et amélioration de la purification Seuls les surnageants ont été extraits et purifiés dans les essais précédents. Afin de récupérer le polysaccharide K5 présent dans les sédiments de centrifugation, le culot du fermenteur COL5K002 de l'exemple 1 (5 kg contenant 31,9 g de polysaccharide K5) a été remis en suspension dans un volume d'eau déminéralisée et le pH a été ajusté à 7,2 avec NaOH 5N. Le mélange a ensuite été agité 2 heures à température ambiante, avant d'être centrifugé 90 minutes à 4700 G. Le surnageant a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d'acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré-couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2. Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis il a été traité trois fois au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 5.
On a obtenu 29,6 g de polysaccharide K5 avec un titre de 73% et un rendement final de 68%.
Exemple 7
Traitement du culot et amélioration de la purification
Le culot du fermenteur COL5K003 de l'exemple 1 (4,75 kg contenant 28,5 g de polysaccharide K5) a été remis en suspension dans 4,75 litres d'eau déminéralisée et le pH a été ajusté à 1,2 avec NaOH 5N. Le mélange a ensuite été agité 2 heures à température ambiante, avant d'être centrifugé 2 heures à 4700 G.
Le surnageant a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d' acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré-couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2.
Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis il a subi deux traitements au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 4. On a obtenu 25,9 g de polysaccharide K5 avec un titre de 69% et un rendement de
63%.
Exemple 8 Purification comprenant une étape de déprotéinisation enzymatique
Une étape de déprotéinisation enzymatique a été mise en œuvre afin d'améliorer la pureté du produit final. On a remis en suspension 45,5 g de polysaccharide K5, dont 15,9 g provenant de l'exemple 7 et 29,6 g provenant de l'exemple 6, dans 1,8 litre d'eau déminéralisée. Après que le pH a été ajusté à 7,0, 910 μl d' alcalase liquide sont ajoutés et le mélange est incubé 5 heures à 60°C avec agitation.
On a ensuite ajouté 23 g de sel et 7,2 litres de méthanol, agité le mélange 30 minutes, avant de le centrifuger pendant 15 minutes à 4000 G. Le culot a été remis en suspension dans 1,8 litre d'eau déminéralisée et traité au peroxyde d'hydrogène, comme expliqué dans l'exemple 3.
On a obtenu 36,4 g de polysaccharide K5 avec un titre de 89% et un rendement de 98%. Exemple 9
Comparaison de l'efficacité de la déprotéinisation enzymatique par rapport à la décoloration.
On a traité 5 g de polysaccharide K5 provenant de l'exemple 7 soit au peroxyde d'hydrogène, soit à 1' alcalase alcaline, afin d'estimer l'efficacité relative des deux traitements.
On a ainsi remis en suspension 5 g de polysaccharide K5 provenant de l'exemple 7 dans 200 ml d'eau déminéralisée et traité la solution au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 3.
On a obtenu 3,75 g de polysaccharide K5 avec un titre de 76,9% et un rendement de 83%.
De la même façon, on a remis en suspension 5 g de polysaccharide K5 provenant de l'exemple 7 dans 200 ml d'eau déminéralisée. Cependant, au lieu d'être traitée au peroxyde d'hydrogène, cette solution a été chauffée à 6O0C et son pH ajusté à 7. On a ensuite ajouté 100 μl d' alcalase et incubé le mélange 5 heures à 600C. Celui-ci a ensuite été précipité au méthanol, comme détaillé dans l'exemple 2.
On a obtenu 3,62 g de polysaccharide K5 avec un titre de 83% et un rendement de 87%, à comparer au titre de 76,9% et au rendement de 83% obtenus avec le traitement au peroxyde d'hydrogène.
L'étape de déprotéinisation permet donc d'obtenir un meilleur rendement ainsi qu'une plus grande pureté par rapport à un troisième traitement avec le peroxyde d'hydrogène.
En fin de fermentation telle que décrite dans l'exemple 1, les pertes dans le culot ont atteint 60% dans COL5K002 et 40% dans COL5K003. Le procédé de retraitement de ce culot mis au point et décrit dans les exemples 6 et 7 a permis d'augmenter le rendement global d'extraction du polysaccharide K5 de 37 à 78% pour COL5K002 et de 43 à 68% pour COL5K003.
L'étape de déprotéinisation finale décrite dans l'exemple 8 permet d'amener la pureté du polysaccharide K5 à 89% avec un rendement quantitatif (98%) .
Figure 1 :
Quantité de polysaccharide exploitable pour les opérations COL5K000 à COL5K006. Les barres pleines représentent la quantité exploitable de polysaccharide estimée (en g) ; les barres hachurées la concentration finale de polysaccharide dans le surnageant (x 20, en g/1) ; les triangles les DOδOOnm atteintes par les cultures. Figure 2 : Profil des principaux paramètres de l'opération COL5K006. La courbe 1 représente le pourcentage d'oxygène dissout dans le milieu, la courbe 2 la vitesse de production de CO2 dans la culture COLK006 (en nmol.l"1^1) , la courbe 3 le volume apporté/20 en g.l x, et la courbe 4 la concentration de polysaccharide K5 dans le surnageant (en g.1"1) .

Claims

Revendications
1/ Procédé de préparation de polysaccharide K5 comprenant : a) une étape de fermentation, pouvant se faire en fermenteur, d'une souche d'Escherichia colï qui produit du polysaccharide K5, comprenant : une phase de croissance en mode discontinu, une ou plusieurs phases de croissance en mode discontinu avec alimentation, - une phase de refroidissement, pendant laquelle la température est abaissée et le pH du milieu remonte jusqu'à une valeur qui peut être 9 au maximum, une phase de séparation du milieu de culture de la biomasse, une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse, b) une étape de purification à partir du milieu de culture et/ou de la biomasse. 2/ Procédé de préparation de polysaccharide K5 selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de purification à partir du milieu de culture et/ou de la biomasse comprend :
- un ajustement du pH entre environ 7 et environ 11 - une première précipitation, la dissolution du précipité,
- une filtration de la suspension résultante,
- puis la précipitation dans un alcool.
3/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé en ce qu'il comprend deux phases de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat succédant à la phase de croissance en mode discontinu. 4/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
3 caractérisé en ce que la phase de refroidissement est précédée d'une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat. 5/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
4 caractérisé en ce que la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation commence à l'épuisement de la source de carbone dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu. 6/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que : la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation commence à l'épuisement de la source de carbone dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu, le cas échéant, les phases suivantes de croissance en mode discontinu avec alimentation commencent quand la concentration en oxygène dissout chute significativement par conséquence d'une limitation du transfert d'oxygène.
7/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que : la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation commence à l'épuisement de la source de carbone dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu, le cas échéant, les phases suivantes de croissance en mode discontinu avec alimentation commencent quand la concentration en oxygène dissout chute significativement par conséquence d'une limitation du transfert d'oxygène, la phase de refroidissement commence quand tout le milieu d'alimentation de culture a été injecté dans le fermenteur, ou quand une variation de pH est détectée. 8/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la source de carbone est soit le glucose, soit le glycérol.
9/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la source de carbone est le glycérol.
10/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la source de carbone est le glycérol et que sa concentration est comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.
11/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu consiste en extraits de levure, acides casaminés, peptones, NH4OH, NH3 ou (NH4) 2HPO4.
12/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la source d'azote dans le milieu de culture initial durant la phase de croissance en mode discontinu est NH4OH, NH3 ou
(NH4) 2HPO4.
13/ Procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce que la concentration de la source d'azote dans le milieu de culture initial durant la phase de croissance en mode discontinu est comprise entre environ 1 et environ 10 g/1. 14/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la source d'azote est fournie par NH4OH ou NH3 pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation.
15/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la source d'azote est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation.
16/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu est NH4OH, NH3 ou (NH4J2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation.
17/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la température de croissance est comprise entre environ 10° C et environ 40° C.
18/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la température de croissance est de 30°C environ durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et que, le cas échéant, elle est de 25°C environ durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation. 19/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que : la source de carbone est le glycérol à une concentration comprise : - entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et
- entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation, et la température de croissance est :
— d'environ 300C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et
- d'environ 25°C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation. 20/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que la source de carbone est le glycérol à une concentration comprise :
— entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et
— entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation ; et la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu :
- est NH4OH, NH3 ou (NH4) 2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et l'
environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et
- est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation.
21/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que - la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu : est NH4OH, NH3 ou (NH4)2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et
- est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation ; et la température de croissance est :
- d'environ 3O0C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et
- d'environ 25°C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.
22/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que :
• étape de fermentation comprend les étapes suivantes dans l'ordre :
- une phase de croissance en mode discontinu, - une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant à l'épuisement complet de la source de carbone durant la phase
5 précédente,
- une deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute
10 significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente,
- un cycle de croissance en mode discontinu 15 avec alimentation constante en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture 20 durant la phase précédente, et
- une phase de refroidissement pendant laquelle la température est abaissée à environ 120C et le pH remonte jusqu'à une valeur comprise entre 7,5 environ et 9
25 environ,
- une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse,
• et est effectuée avec les paramètres suivants :
- la température est :
30 - 300C environ durant la croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et — 250C environ durant les deux autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation;
- la source d'azote est fournie par: - (NH4) 2HPO4, NH4OH ou NH3 à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial,
- l'ajout de NH4OH ou NH3 concentré à 20% environ pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation,
- la source de carbone est le glycérol : - à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial durant la première phase de croissance en mode discontinu, et — à une concentration comprise entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d' alimentation durant les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation. 23/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 22 caractérisé en ce qu'après la phase de croissance en mode discontinu, les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation et la phase de refroidissement, la biomasse est séparée du milieu de culture par centrifugation.
24/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 23 caractérisé en ce qu'après séparation, la biomasse et le milieu de culture sont inactivés pendant une durée variant entre environ Ih et environ 3h à une température d'environ 8O0C. 25/ Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que la première précipitation de l'étape de purification se fait à l'aide d'un sel d'ammonium quaternaire. 26/ Procédé selon la revendication 25 caractérisé en ce que le sel d' ammonium quaternaire est le chlorure de benzéthonium.
27/ Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le premier précipité de l'étape de purification est remis en solution dans l'acétate de sodium, utilisé notamment à une concentration de 10%.
28/ Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que le filtrat de l'étape de purification est précipité au méthanol.
29/ Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que la première précipitation de l'étape de purification se fait à l'aide de chlorure de benzéthonium, que ce précipité est remis en solution dans l'acétate de sodium, qu'il est filtré, et que le filtrat de l'étape de purification est précipité au méthanol.
30/ Procédé selon l'une quelconque des revendications
1 à 29 caractérisé en ce que le produit après purification est décoloré une ou plusieurs fois au peroxyde d'hydrogène.
31/ Procédé selon la revendication 30 caractérisé en ce que le produit après purification est décoloré trois fois au peroxyde d'hydrogène. 32/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 31 caractérisé en ce que le produit après purification et trois décolorations au peroxyde d'hydrogène subit une autre décoloration au peroxyde d'hydrogène.
33/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 31 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de traitement avec une protéase.
34/ Procédé selon la revendication 33 caractérisé en ce que la protéase utilisée est l'alcalase.
35/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 caractérisé en ce que l'étape de purification comprend les étapes suivantes : centrifugation de la culture pour séparer le milieu de culture de la biomasse ; à partir du surnageant de la centrifugation du moût de fermentation : - ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium,
- lavage du précipité,
- remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%,
- filtration de la solution d' acétate de sodium 10%,
- précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat,
- un traitement à l'alcalase ; en parallèle, à partir du culot résultant de la centrifugation du moût de fermentation :
- remise en suspension du culot, - ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium,
- lavage du précipité, l'
- remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%,
- filtration de la solution d'acétate de sodium 10%, - précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat,
- un traitement à l'alcalase ; réunion des deux préparations à l'une quelconque des étapes de la purification ;
- précipitation, centrifugation et séchage du polysaccharide K5. / Procédé selon l'une quelconque des revendications et 2 caractérisé en ce que : • étape de fermentation: comprend les étapes suivantes dans l'ordre :
- une phase de croissance en mode discontinu,
- une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant à l'épuisement complet de la source de carbone durant la phase précédente,
- une deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente,
- un cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente, et
— une phase de refroidissement pendant laquelle la température est abaissée à environ 120C et le pH remonte jusqu'à une valeur comprise entre 7,5 environ et 9 environ,
— une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse, et est effectuée avec les paramètres suivants :
— la température est :
- 300C environ durant la croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et
- 25°C environ durant les deux autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation;
— la source d'azote est fournie par:
- (NH4)2HPO4, NH4OH ou NH3 à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial,
- l'ajout de NH4OH ou NH3 concentré à 20% environ pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation,
— la source de carbone est le glycérol :
- à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial durant la première phase de croissance en mode discontinu, et
- à une concentration comprise entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation durant les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation ; et l'étape de purification comprend les étapes suivantes : - centrifugation de la culture pour séparer le milieu de culture de la biomasse ;
— à partir du surnageant de la centrifugation du moût de fermentation :
- ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium,
- lavage du précipité,
- remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%,
- filtration de la solution d'acétate de sodium 10%,
- précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat,
- un traitement à l'alcalase ;
— en parallèle, à partir du culot résultant de la centrifugation du moût de fermentation : - remise en suspension du culot,
- ajustement du pH entre environ 7 et environ 11,
- précipitation au chlorure de benzéthonium, - lavage du précipité, - remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%,
- filtration de la solution d'acétate de sodium 10%, - précipitation du filtrat au méthanol,
- trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat,
- un traitement à l'alcalase ;
— réunion des deux préparations à l'une quelconque des étapes de la purification ;
- précipitation, centrifugation et séchage du polysaccharide K5.
37/ Procédé caractérisé en ce que le polysaccharide produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 36 est utilisé comme substrat pour une réaction enzymatique et/ou chimique de désacétylation, N- resulfatation, C-5 épimérisation et/ou O-sulfatation.
38/ Procédé selon la revendication 37 caractérisé en ce que le polysaccharide produit selon l'une quelconque des revendications 1 à 36 est utilisé comme substrat pour obtenir une héparine hemi-synthétique (biohéparine) .
39/ Procédé selon la revendication 38 caractérisé en ce que la biohéparine obtenue est ensuite utilisée comme substrat dans une réaction de fragmentation pour obtenir une HBPM (héparine de bas poids moléculaire) , dont le poids moléculaire est compris entre environ 1500 et environ 6500 Da.
40/ Procédé selon la revendication 39 caractérisé en ce que la HBPM est une héparine de bas poids moléculaire, avec un poids moléculaire compris plus particulièrement entre environ 3500 et environ 5500 Da ou une héparine de très bas poids moléculaire, avec un poids moléculaire compris plus particulièrement entre environ 1500 et environ 3000 Da.
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