WO2006022092A1

WO2006022092A1 - 細胞電位測定プローブ

Info

Publication number: WO2006022092A1
Application number: PCT/JP2005/013029
Authority: WO
Inventors: Masaya Nakatani; Nobuhiko Ozaki; Hiroaki Oka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2004-08-25
Filing date: 2005-07-14
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2007-02-25
Also published as: JPWO2006022092A1; US20100147682A1; EP1783202A4; US7736477B2; EP1783202A1; US20070105183A1; EP1783202B1

Abstract

　細胞電位測定プローブは、底面を有する第１のキャビティが表面に形成されたプレートと、第１のキャビティ内に配置されたセンサ素子とを備える。第１のキャビティの底面に第２のキャビティが形成される。第２のキャビティに開口する第１の開口部とプレートの外部に開口する第２の開口部とを有する第１の流路がプレート内に形成される。センサ素子は、薄板と、薄板の周囲に設けられてプレートの第１のキャビティに配置された支持基板とを有する。薄板には第１の開口部と、プレートの第２のキャビティに連結する第２の開口部とを貫通する貫通孔が形成される。第１の流路は流体を流すことができ、吸引手段が流路の第２の開口部に接続されて第１の流路内を流れる流体を吸引できる。この細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定できる。

Description

明細書

細胞電位測定プローブ

技術分野

[0001] 本発明は、細胞の活動によって発生する物理ィ匕学的変化を測定するために用いられる、細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電位を測定するための細胞電位測定プローブに関する。背景技術

[0002] 細胞の電気的活動を指標にしながら薬理効果のある薬剤を候補薬剤力スクリーニングする従来の方法としてノツチクランプ法が知られてヽる。ノツチクランプ法は、微細な先端を持つ中空ガラス管を直接、細胞に搾入して細胞内外の電位差を測定する方法で <7ことは、 Single channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle nbers. Nature 260 ： 799— 802、Neh er E & Sakmann B、 1976)、これによつて、細胞膜に存在するイオンチャネルの活動状態を精度よく測定できる。

[0003] また、国際公開第 02Z055653号公報には、細胞の保持手段を有した基板およびこれに設けられた電極によって細胞外電位を測定する細胞外電位測定デバイスと方法が開示されている。この方法では、ノツチクランプ法で得られるデータと同等の高品質なデータが得られ、簡易に高速で大量の試料を測定できる。

[0004] 図 24は上記の細胞外電位測定デバイスの断面図である。容器 50内に培養液 51 が入れられ、被験体細胞 52は基板 53に設けられた保持手段によって捕捉されて保持されている。この保持手段は基板 53に形成された窪み 54、開口部 55、および窪み 54に連絡する貫通孔 56により構成されて、る。容器 50の中には参照電極 58が配置されている。貫通孔 56の周辺にはセンシング手段である測定電極 57が配置されており、測定電極 57は配線を経て外部の信号検出部に連結されている。

[0005] 被験体細胞 52は貫通孔 56を通して外部から吸引ポンプなどの手段により吸引されて窪み 54に密着して保持される。被験体細胞 52の活動により発生する電気信号は容器 50中の培養液 51側に漏れることなぐ貫通孔 56に設けられた測定電極 57と参照電極 58との電位差として検出される。

[0006] 上述の従来のデバイスは、窪み 54および貫通孔 56が形成された基板 53と、この上部に設けられた、培養液および薬液を投入'蓄積するための容器 50を有している。よつて、十分容量の大きい空間内に存在する溶液内の浮遊細胞をそのままの環境で測定することはできない。

[0007] また、従来のデバイスでは、基板 53によって隔てられた 2つの領域、つまり被験体細胞 52側の領域と、測定電極 57側の領域とに互いに異なる種類の培養液や薬液をそれぞれ導入できない。

発明の開示

[0008] 細胞電位測定プローブは、底面を有する第 1のキヤビティが表面に形成されたプレートと、第 1のキヤビティ内に配置されたセンサ素子とを備える。第 1のキヤビティの底面に第 2のキヤビティが形成される。第 2のキヤビティに開口する第 1の開口部とプレートの外部に開口する第 2の開口部とを有する第 1の流路がプレート内に形成される。センサ素子は、薄板と、薄板の周囲に設けられてプレートの第 1のキヤビティに配置された支持基板とを有する。薄板には第 1の開口部と、プレートの第 2のキヤビティに連結する第 2の開口部とを貫通する貫通孔が形成される。第 1の流路は流体を流すことができ、吸引手段が流路の第 2の開口部に接続されて第 1の流路内を流れる流体を吸引できる。

[0009] この細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定できる。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]図 1は本発明の実施の形態 1における細胞電位測定プローブの斜視図である。

[図 2]図 2は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの分解斜視図である。

[図 3]図 3は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの断面斜視図である。

[図 4]図 4は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの拡大断面斜視図である。

[図 5]図 5は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの断面図である。

[図 6]図 6は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの拡大断面図である。

[図 7]図 7は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの斜視図である。 [図 8]図 8は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの使用方法を説明するための斜視図である。

[図 9]図 9は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの概念図である。

[図 10]図 10は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの断面図である。

[図 11]図 11は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの断面図である。

[図 12]図 12は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの断面図である。

[図 13]図 13は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの断面図である。

[図 14]図 14は実施の形態 1における細胞電位測定プローブの断面図である。

[図 15]図 15は実施の形態 1における他の細胞電位測定プローブの平面図である。

[図 16A]図 16Aは図 15に示す細胞電位測定プローブの拡大断面図である。

[図 16B]図 16Bは実施の形態 1によるさらに他の細胞電位測定プローブの拡大断面図である。

[図 17]図 17は本発明の実施の形態 2における細胞電位測定プローブの断面図である。

[図 18]図 18は実施の形態 2における細胞電位測定プローブの拡大断面図である。

[図 19A]図 19Aは実施の形態 2における細胞電位測定プローブの使用方法を説明するための断面図である。

[図 19B]図 19Bは図 19Aに示す細胞電位測定プローブの拡大断面図である。

[図 20]図 20は本発明の実施の形態 3による細胞電位測定プローブの分解斜視図である。

[図 21]図 21は実施の形態 3による細胞電位測定プローブの断面斜視図である。

[図 22]図 22は実施の形態 3による細胞電位測定プローブの拡大断面図である。

[図 23]図 23は実施の形態 3による細胞電位測定プローブアレイの斜視図である。

[図 24]図 24は従来の細胞外電位測定プローブの断面図である。

符号の説明

1 細胞電位測定プローブ

2 プレート

2A 成型プレート成型プレート

キヤビティ（第 1のキヤビティ) センサ素子

キヤビティ（第 3のキヤビティ) キヤビティ（第 2のキヤビティ) 支持基板

薄板

貫通孔

流路 (第 2の流路）A 開口部（第 1の開口部) 流路 (第 1の流路）A 開口部（第 1の開口部) 開口部 (第 2の開口部）吸引手段

容器 (注入手段）測定溶液

段差

参照電極 (第 1の電極）測定電極 (第 2の電極）被験体細胞

培養液

開口部 (第 2の開口部）弁

支持基板

細胞電位測定プローブプレート

センサ素子

薄板貫通孔

キヤビティ

顕微鏡

パッチプローブ

被験体細胞

培養液

, 37B 窪み

段差

細胞電位測定プローブプレート

キヤビティ（第 1のキヤビティ）センサ素子

キヤビティ（第 3のキヤビティ）キヤビティ（第 2のキヤビティ）薄板

貫通孔

流路 (第 2の流路）流路 (第 1の流路）開口部 (第 2の開口部）支持基板

参照電極 (第 1の電極）測定電極 (第 2の電極）開口部 (第 2の開口部）細胞電位測定プローブアレイゥエルアレイ

A 貫通孔

B 貫通孔

C 貫通孔 522 ウエノレ

523 ウエノレ

524 ウエノレ

発明を実施するための最良の形態

[0012] (実施の形態 1)

図 1は本発明の実施の形態 1における細胞電位測定プローブ 1の斜視図である。図 2は細胞電位測定プローブ 1の分解斜視図である。図 3は細胞電位測定プローブ 1の断面斜視図である。図 4は細胞電位測定プローブ 1の拡大断面斜視図である。図 5 は細胞電位測定プローブ 1の断面図である。図 6は細胞電位測定プローブ 1の要部拡大断面図である。細胞電位測定プローブ 1は榭脂ある!、はガラスなどの絶縁体よりなるプレート 2とセンサ素子 4力も構成されている。プレート 2の上面 2Cにはキヤビティ 3が形成されており、キヤビティ 3の内部にはセンサ素子 4がはめ込まれている。キヤビティ 3の底面 3Aにはキヤビティ 6が形成されている。センサ素子 4の下部にはキヤビティ 6が位置する。

[0013] プレート 2は成型プレート 2Aと成型プレート 2Aに貼り合わされた成型プレート 2Bよりなり、容易に複雑な形状に形成できる。成型プレート 2Bには溝の形状で流路 10、 1 1が形成される。成型プレート 2Aには貫通孔の形状で開口部 12、 22が形成され、貫通孔の形状で互いに連結したキヤビティ 3、 6が形成されて、る。

[0014] キヤビティ 6にはプレート 2の外部に通じる流路 10、 11のそれぞれの一方の開口部 10A、 11Aが連通している。流路 10、 11のそれぞれの他方の開口部 12、 22はプレート 2の上面 2Cに開口する。流路 10、 11の断面積は 0. 01mm²以上であり、この寸法により流路 10、 11は詰まりにくぐ容易に清掃できる。

[0015] キヤビティ 6の下面 6Aには、センサ素子 4に向かってすなわちキヤビティ 6に向かつて上方に突出する段差 17が設けられ、これにより流路 10、 11の断面積とキヤビティ 6 での開口部 10A、 11A近傍の断面積を調整することができ、測定溶液を流路 10、キャビティ 6、流路 11でスムースに移動させることができる。

[0016] センサ素子 4はシリコンあるいはシリコンとシリコン酸ィ匕膜との積層体力もなる支持基板 7を備える。プレート 2の上面 2Cと同じ向きの支持基板 7の上面 7Aにはキヤビティ 5が設けられている。キヤビティ 5の底面 5Aは薄板 8で構成されている。薄板 8には薄板 8の上面 8A (キヤビティ 5の底面 5A)と上面 8Aの反対側の薄板 8の下面 8Bとを連通する微小な孔径を有する貫通孔 9が形成されている。貫通孔 9の一方の開口部 9A はキヤビティ 5に開口し、他方の開口部 9Bはプレート 2内のキヤビティ 6に連通している。

[0017] センサ素子 4の支持基板 7の下面 7B、すなわち薄板 8の下面 8B上には白金、金、銀、塩ィ匕銀など力もなる測定電極 19が設けられている。測定電極 19はワイヤ配線、薄膜電極などの引き出し電極を接続することにより、プローブ 1の外部の測定器へ接続されて信号を検出することができる。

[0018] キヤビティ 3にセンサ素子 4を接着剤による接合することにより確実に固定でき、流路 10、 11、キヤビティ 6を満たす測定溶液の漏れを完全に防止できる。なお、センサ素子 4は融着、超音波接合などの方法によってキヤビティ 3内に接合しても良い。

[0019] 図 7は細胞電位測定プローブ 1の斜視図である。流路 10の開口部 12にはチューブ 24Aが接続され、流路 11の開口部 22にはチューブ 24Bが接続されている。チューブ 24Bは吸引手段 13に接続され、チューブ 24Aは容器 15に接続されている。容器 15と開口部 12の間には必要に応じて測定溶液等の流体の流動を止めることができる弁 23が設けられている。吸引手段 13によってキヤビティ 6はキヤビティ 5より圧力を低く減圧雰囲気にできる。吸引手段 13はダイヤフラムポンプ、シリンジポンプなど通常のポンプの他に人の口による吸引などにより実現できる力特にこれらに限定されない。

[0020] 次に、細胞電位測定プローブ 1を用いて細胞電位を測定する方法にっ、て説明する。

[0021] 図 8は細胞電位測定プローブ 1の使用方法を説明するための斜視図であり、細胞電位測定プローブ 1が測定棒 25に設置されている。測定棒 25の一端 25Aには細胞電位測定プローブ 1が固定されている。測定棒 25の内部には、流路 10に接続されたチューブ 24Aと流路 11に接続されたチューブ 24Bと、測定電極 19と電気的に接続されている引き出し電極 19Aが通り、測定棒 25の他端 25B力も外部に引き出されている。引き出し電極 19Aは外部に設けられた測定器に接続され、測定信号を測定器に供給する。

[0022] 図 9は細胞電位測定プローブ 1の使用中の概念図であり、容器 14に充填されている培養液 21中に細胞電位測定プローブ 1を設置された測定棒 25が入れられてヽる。培養液 21中には被験体細胞 20が浮遊している。容器 14内では参照電極 18が培養液 21に接しており、容器 14内の培養液 21の電位を検出できる。細胞電位測定プローブ 1は容器 14内の培養液 21内にセンサ素子 4が位置するように設置されて、る

[0023] 図 10〜図 14は細胞電位測定プローブ 1を用いて細胞電位を測定する方法を説明するための断面図である。

[0024] 図 10では、培養液 21内のセンサ素子 4の上部で被験体細胞 20が浮遊している。

[0025] 次に、図 11に示すように、弁 23が閉じられて流路 10、 11およびキヤビティ 6は容器 15と遮断されている。そして吸引手段 13によってキヤビティ 6を減圧して、キヤビティ 5 より圧力を低くする。これにより、キヤビティ 5に充填されている培養液 21および被験体細胞 20が貫通孔 9へ引き込まれ、培養液 21はキヤビティ 6へ流れ出す。被験体細胞 20はその大きさが貫通孔 9の断面積より大きいので貫通孔 9を通り抜けることができず、貫通孔 9の開口部 9Aで保持される。培養液 21はキヤビティ 6へ流れることにより測定電極 19と接触し、キヤビティ 6内の電位を検出できる。この状態で、参照電極 1 8と測定電極 19との電位差および抵抗値'容量値などの電気的な測定を行うことができる。

[0026] 被験体細胞 20が貫通孔 9の開口部 9Aに保持されると、培養液 21はセンサ素子 4 により遮断されてキヤビティ 5内の部分 21Aとキヤビティ 6内の部分 21Bに分離し、参照電極 18と測定電極 19との間の抵抗値は上昇する。

[0027] その後、さらに吸引手段 13によりキヤビティ 6を減圧すると図 12に示すように被験体細胞 20の表面は貫通孔 9の開口部 9Aにさらに強く押しつけられ、単に保持されるより参照電極 18と測定電極 19との間の抵抗値は高くなる。このときの抵抗値は 100M Ω以上、時には 1G Q以上となり、ギガシール (Giga— Seal)と呼ばれる状態となる。ギガシール状態にぉ、て、被験体細胞 20のイオンチャネル活動によって培養液 21 と被験体細胞 20内との間でイオンの交換が行われると被験体細胞 20の内部電位が変化する。内部電位の変位は参照電極 18と測定電極 19との電位差として検出できる。

[0028] 細胞 20のイオンチャネル活動は培養液 21に含まれる薬剤によって変化し、このィオンチャネル活動を参照電極 18と測定電極 19との電位差によって検出することによつて薬剤が被験体細胞 20に与える影響を知る、つまり、被験体細胞 20に対する薬剤の薬理効果を判定できる。

[0029] なお、参照電極 18、測定電極 19をそれぞれ貫通孔 9の開口部 9A、 9B付近に設けることにより被験体細胞 20の近傍で電位差を高精度に測定できる。

[0030] 細胞電位測定プローブ 1は、培養液 21に浮遊してヽる細胞 20を容易に捕捉しギガシール状態を形成できる。

[0031] プレート 2の上面 2Cとセンサ素子 4の支持基板 7の上面 7Aとを同一面とすることにより、図 13に示すように、被験体細胞 20を含む培養液 21をセンサ素子 4の支持基板 7の上面 7A上やキヤビティ 5内にプレートピペット等で直接供給できる。これにより、プレート 2の上面 2Cの上部より顕微鏡により細胞 20を容易に観測できる。さらに、細胞 20の周辺で発生する気泡を容易に除去でき、薬剤を確実に細胞 20に投与できる

[0032] 図 12に示したギガシール状態で弁 23を開くと、図 14に示すように、容器 15内にある測定溶液 16が流路 10およびキヤビティ 6へ引き込まれ、容器 15は測定溶液 16を流路 10に注入する注入手段として機能する。流路 11を吸引手段 13により減圧することでキヤビティ 6の内部の培養液 21の部分 21Bは測定溶液 16に置換えられる。測定溶液 16として高、K+濃度の溶液を用いることで、被験体細胞 20の電位変化をより正確に検出できる。

[0033] 貫通孔 9の開口部 9Α、 9Βの近傍に参照電極 18および測定電極 19を薄膜技術などによってそれぞれ形成することにより、被験体細胞 20の電位変化を検出できる。

[0034] 図 15は実施の形態 1による他の細胞電位測定プローブ 1Aの平面図である。流路 1 10、 111の少なくとも一部が曲がっている。これにより、流路 110、 111を流体が流れる際の抵抗が大きくなるので、一度キヤビティ 6内に進入した培養液 21や測定溶液 1 6が外部に漏れ出したり、外部より気泡が混入したりすることを防止できる。 [0035] 図 16Aは細胞電位測定プローブ 1Aの線 16— 16における拡大断面図である。貫通孔 9のキヤビティ 5に開口する開口部 9Aには貫通孔 9の孔径より大きい径の窪み 3 7Aが設けられており、被験体細胞 20をより確実に捕捉できる。

[0036] 図 16Bは実施の形態 1によるさらに他の細胞電位測定プローブ 1Bの拡大断面図である。細胞電位測定プローブ 1Bでは、貫通孔 9のキヤビティ 6に開口する開口部 9 Bに貫通孔 9の孔径より大きな径の窪み 37Bが設けられている。これにより、キヤビティ 6内の培養液 21や測定溶液 16の貫通孔 9の開口部 9B付近での流動性を安定させることができる。

[0037] 図 16A、図 16Bに示すように、段差 117およびキヤビティ 6のエッジ部 117A、 6Bを曲面状に面取りすることにより測定溶液 16をスムースに流すことができる。

[0038] プレート 2の材料である榭脂ゃガラスなどの絶縁性材料は可視光を透過させる透明性を有してもよい。これによりキヤビティ 6から貫通孔 9の開口部 9Bを顕微鏡で容易に観測でき、培養液 21や測定溶液 16のキヤビティ 6への進入状態や気泡の有無などを観察しながら細胞電位を測定できる。

[0039] さらに、センサ素子 4の薄板 8も榭脂ゃガラスなどの可視光を透過させる透明な材料で形成してもよい、これにより、プレート 2の下面力も顕微鏡で被験体細胞 20を観察できる。

[0040] (実施の形態 2)

図 17は本発明の実施の形態 2における細胞電位測定プローブ 27の断面図である。図 18は細胞電位測定プローブ 27のセンサ素子 29の拡大断面図である。実施の形態 1と同じ部分は同じ参照符号を付して説明を省略する。

[0041] 細胞電位測定プローブ 27はプレート 28とセンサ素子 29により構成されている。プレート 28の上面 28Cにはキヤビティ 83が形成され、キヤビティ 83の底面 83Aにはキャビティ 6が形成されている。キヤビティ 83にはセンサ素子 29がはめ込まれている。センサ素子 29は支持基板 26を備える。支持基板 26の下面 26Bにキヤビティ 32が形成され、キヤビティ 32の底面 32Aには薄板 30が形成されている。薄板 30には薄板 3 0の上面 30Aと下面 30B (キヤビティ 32の底面 32A)とを連通する貫通孔 31が形成されている。貫通孔 31の開口部 31Aは薄板 30の上面 30A (支持基板 26の上面 26A )で開口して外方に通じている。貫通孔 31の開口部 31Bは薄板 30の下面 30Bで開口してキヤビティ 32およびキヤビティ 6に通じている。これにより貫通孔 31はプレート 2 8内に設けられたキヤビティ 6を介して流路 10、 11に通じている。必要に応じて薄板 3 0の下面 30B上に測定電極 19が形成される。

[0042] 図 19Aは細胞電位測定プローブ 27の使用方法を説明するための断面図である。

図 19Bは図 19Aに示す細胞電位測定プローブ 27の拡大断面図である。図 1に示す実施の形態 1による細胞電位測定プローブ 1と同様に、センサ素子 29の支持基板 26 の上面 26Aはプレート 28の上面 28Cと同一平面であり、凸凹がない。これにより、顕微鏡 33で被験体細胞 35をより接近して観察できる。顕微鏡 33により観測しながらパツチプローブ 34を被験体細胞 35にアタッチさせることができる。これにより、一つの被験体細胞 35から複数の部分におけるイオンチャネル活動を測定できる。例えば、薬剤を培養液 36の中に投与したとき、細胞 35の投与位置に近、部分 35Aにアタッチさせたパッチプローブ 34の電位と、細胞 35の部分 35Aより投与位置力も遠、貫通孔 31に捕捉された細胞 35の部分 35Bに近い測定電極 19の電位が同時に得られ、細胞 35でのイオンチャネル活動の部分 35Aから部分 35Bへの伝達状態を検出できる

[0043] なお、実施の形態 1による細胞電位測定プローブ 1のプレート 2や支持基板 7と同様に、細胞電位測定プローブ 27のプレート 28や薄板 30を、可視光を透過させる透明性を有する材料で形成することで同様の効果が得られる。

[0044] (実施の形態 3)

図 20は本発明の実施の形態 3における細胞電位測定プローブ 501の分解斜視図である。図 21は細胞電位測定プローブ 501の断面斜視図である。図 22は細胞電位測定プローブ 501の要部拡大断面図である。細胞電位測定プローブ 501は榭脂あるいはガラスなどの絶縁体よりなるプレート 502とセンサ素子 504とゥエルアレイ 520から構成している。プレート 502の上面 502Cにはキヤビティ 503が形成され、キヤビティ 503の底面 503Aにはキヤビティ 506が形成されている。キヤビティ 503にはセンサ素子 504がはめ込まれている。キヤビティ 506はセンサ素子 504の下部に位置している。 [0045] キヤビティ 506には外方へ通じる流路 509、 510が設けられている。流路 509はプレート 502の上面 502Cに設けた開口部 511を有し、流路 510はプレート 502の上面 502Cに設けた開口部 518を有する。流路 509、 510はプレート 502の外部と接続されている。予め成形された成型プレート 502Aに、予め成型された成型プレート 502 Bを貼り合わせることで複雑な形状を有するプレート 502が得られる。成型プレート 50 2Bには溝の形状で流路 509、 510が形成される。成型プレート 502Aには貫通孔の形状で開口部 511、 518が形成され、貫通孔の形状で互いに連結したキヤビティ 50 3、 506力形成されて!/、る。

[0046] センサ素子 504は支持基板 512と薄板 507よりなり、図 22に示すように、薄板 507 の下方（プレート 502の上面 502Cと反対側の下面 512B側）にキヤビティ 505が設けられている。つまり、キヤビティ 505の底面 505Aは薄板 507で形成される。薄板 507 には上面 507A (支持基板 512の上面 512A)と下面 507Bを貫通する微小貫通孔 5 08が設けられている。貫通孔 508の、薄板 507の上面 507A (支持基板 512の上面 512A)に開口する開口部 508Aに被験体細胞が保持される。貫通孔 508の孔径は被験体細胞の大きさよりも小さいことが必要である。図 16Aと同様に、貫通孔 508の開口部 508Aに貫通孔 508の孔径より大きな径の窪みを設けることにより被験体細胞を安定して確実に保持できる。貫通孔 508は薄板 507の下面 507B (キヤビティ 505 の底面 505A)でキヤビティ 505に開口する開口部 508Bを有する。貫通孔 508の開口部 508Aはセンサ素子 504の支持基板 512の上面 512Aに通じ、開口部 508Bはキヤビティ 505を介してキヤビティ 506と連結している。この構造により、貫通孔 508、キヤビティ 505、 506を通って培養液、薬液などの液体が流動できる。

[0047] センサ素子 504では、薄板 507が上部に位置する、すなわち支持基板 512の上面 512Aがプレート 502の上面 502Cと同一平面内に位置する。これに対し、図 6に示す実施の形態 1による細胞電位測定プローブと同様に、キヤビティ 505が支持基板 5 12の上面 512Aに形成されてもよ!、。

[0048] プレート 502の上面 502A上には所定の容量を有し、培養液、薬液などの液体を投入したり、蓄えたり、循環させることができるゥエルアレイ 520が配置されている。ゥェノレアレイ 520ίまウエノレ 522、 523、 524力 ^形成されて!ヽる。ウエノレ 522の下面 522Αには流路 509の開口部 511に連結した貫通孔 521Aが形成されている。ゥエル 523の下面 523Aには、センサ素子 504の薄板 507に形成された貫通孔 508に連結した貫通孔 521Bが形成されている。ゥエル 524の下面 524Aには、流路 510の開口部 51 8に連結した貫通孔 521Cが形成されている。ゥエル 522、 523、 524の上面には培養液、薬液などの液体を投入する開口部 522B、 523B、 524Bが設けられている。ゥエル 523には参照電極 514が設けられている。流路 510内にはプレート 502の外部に繋がる測定電極 515が設けられて、る。

[0049] 被験体細胞を含有した培養液をゥエル 523の開口部 523Bから投入し、ゥエル 524 の開口部 524Bから吸引ポンプなどの吸引手段によって吸引する。これによつて培養液は貫通孔 508を通過し、その後キヤビティ 505、 506、流路 510および開口部 518 を通過することによりゥエル 524へ吸引される。または、ゥエル 522へ測定液または培養液を投入後、ゥエル 524から吸引することによって、流路 509、 510およびキヤビティ 505、 506には十分な測定液または培養液が行き渡り、気泡が混入することが少なくなるため、測定をより正確に行いやすい。なお、この場合は、ゥエル 523に被験体細胞を投入する前に測定液を投入し、流路 509, 510内に測定液を十分行き渡らせたのちにゥエル 522の開口部 522Bを閉じ、この後、被検体細胞をゥエル 523に投入してゥエル 524から測定液の吸引を行うことが望ましい。

[0050] センサ素子 504の貫通孔 508が被験体細胞を通過させな、孔径を有することで、被験体細胞は貫通孔 508の開口部 508Aで保持され、貫通孔 508で保持された被験体細胞の電位を測定できる。実施の形態 3では、薄板 507には複数の貫通孔 508 が形成されており、これにより一度に複数の被験体細胞の電位を一括して測定できる。被験体細胞が全ての貫通孔 508を塞ぐと、それ以外の被験体細胞はゥエル 523中にとどまる。これにより、培養液がキヤビティ 505に流入する量が少なくなり、貫通孔 5 08の開口部 508Aに被験体細胞が保持されたことを検知できる。この作業は培養液の流量を測定しながらゥエル 524での吸引力を制御することによって行うことができる。なお、この吸引動作はゥエル 522から行っても同じである。

[0051] ゥエル 523の開口部 523Bを閉じた後、ゥエル 522から薬液を投入してゥエル 524 力も吸引手段により吸引することによって薬液が貫通孔 521Aを通過し、開口部 511 、流路 509、キヤビティ 506、キヤビティ 505、流路 510および開口部 518を通過して、ゥエル 524へ吸引される。このとき、貫通孔 508の開口部 508Aでトラップされている被験体細胞に貫通孔 508の開口部 508B力も薬液が接触して、被験体細胞が薬液に反応する。反応したとき被験体細胞の電位を、ゥエル 523内の培養液に接触している参照電極 514と、流路 510内の薬液に接触している測定電極 515とを介して測定できる。

[0052] 細胞電位測定プローブ 501では、被験体細胞が存在する領域すなわちゥエル 523 と測定電極 515が存在する領域すなわち流路 510にそれぞれ、培養液や薬液などの別の液体を導入できる。また、ゥエル 522とゥエル 524間で溶液を吸引させれば、キヤビティ 505, 506内の溶液の種類を置換することが容易にできる。

[0053] なお、ゥエル 520は三個のゥエル 522、 523、 524よりなり、これらを用いる方法を説明してきたが、被験体細胞を微小貫通孔 508に保持した後、培養液の代わりにゥェル 523より薬液を投入して、細胞電位の測定を行うだけでよい場合は、 2個のゥエル（例えばゥエル 523とゥエル 524)だけで測定することができる。

[0054] プレート 502の上面 502Cとゥエルアレイ 520の底面 520Aに密着させることでプレート 502をゥエルアレイ 520で確実に封止できるので、液漏れなどを確実に防止できる。

[0055] ウェイアレイ 520をプレート 502と同じ材質で形成することでウェイアレイ 520とプレート 502の膨張係数の違いによる変形を防止でき、プレート 502をゥエルアレイ 520 でより確実に封止できる。

[0056] ゥエルアレイ 520とプレート 502をポリスチレン、シクロォレフインポリマー、シクロォレフィンコポリマーなどの熱可塑性榭脂で形成することにより、超音波融着ゃレーザ溶着によって確実な封止と高い生産性で細胞電位測定プローブ 501を製造できる。

[0057] ゥエルアレイ 520とプレート 502をガラス、石英の材料で形成してもよい。これらの材料は鏡面研磨した表面同士であれば、接着剤を使わずに直接接合できる。あるいは、これら材料は耐熱性が高いため、ガラス接着剤やセラミック接着剤などの無機系接着材料で接合することができる。このように構成されたゥエルアレイ 520とプレート 50 2は耐熱性に優れて、るため加熱洗浄による再利用が可能な細胞電位測定プロ一ブ 501が得られる。

[0058] 図 21【こ示すよう【こ、ウエノレ 522、 523、 524の下面 522A、 523A, 524A【こそれぞれ形成された貫通孔 521A、 521B、 521Cのうちの少なくとも貫通孔 521Bを、ゥエル 523の開口部 523Bに向かって広がる形状、すなわちセンサ素子 504の貫通孔 508 に向カゝつて狭まる形状に形成しても良い。これにより、ゥエル 523に投入する培養液や薬液などを速やかにセンサ素子 504の貫通孔 508へ浸透させることができる。

[0059] 図 21に示すように、貫通孔 521Bの大きさを、貫通孔 508を形成した薄板 507よりも大きくすることにより、貫通孔 508へ被験体細胞を効率よく引き込むことができる。

[0060] また、ゥエルアレイ 520には、被験体細胞を含む培養液を投入するゥエル 523と、薬液を投入するゥエル 522と、吸引手段に接続されたゥエル 524とが形成されている。これにより、プレート 502の上面 502Cに被験体細胞を容易に保持でき、薬液などを投入することが全てゥエルアレイ 520の上部より独立して行うことができるので測定の際に容易にプローブ 501を操作できる。

[0061] ゥエル 522の貫通孔 521Aの大きさを流路 509の開口部 511より大きくし、ゥエル 5 24の貫通孔 521Cの大きさを流路 510の開口部 518よりも大きくする。これにより、薬液などの液体を速やかに流路に導入することができ、高精度でばらつきの少な、細胞電位を測定できる細胞電位測定プローブ 501が得られる。

[0062] 参照電極 514がゥエル 523内の培養液に接する所定の位置に配置される。測定電極 515が流路 510内に設けられて流路 510内の培養液あるいは薬液などの液体に接触する。これにより、培養液中における被験体細胞の細胞電位と薬液などの液体をゥエル 522またはゥエル 523より投入した後の被験体細胞の細胞電位の変化を測定できる。測定電極 515はキヤビティ 505またはキヤビティ 506の近傍に設けても良い。

[0063] 参照電極 514と測定電極 515はワイヤ配線や薄膜電極などで形成でき、プローブ 5

01の外部の測定器に接続されて電極からの信号を検出できる。

[0064] 次に、細胞電位測定プローブ 501を用いて、細胞電位を測定する方法を説明する

[0065] まず、ゥエル 523には被験体細胞を含む培養液を投入し、次にゥエル 522またはゥエル 524から吸引手段により吸引することで被験体細胞はセンサ素子 504の貫通孔 508に保持される。ゥエル 523内に設けられて培養液に接触する参照電極 514と、流路 510内に設けられた測定電極 515との間の抵抗値を測定する。電極 514、 515 間の抵抗値は、吸引手段の吸引圧力を制御することにより、ゥエル 523に貯留された培養液と流路 510内に貯留された培養液の間の抵抗値が 100M Ω以上となる。参照電極 514および測定電極 515は Au、 Ag、 AgClなどの導電材料で構成することができ、培養液に接触させることで電気的接続が得られる。したがって、電極 514、 515が配置される位置は上記の位置に限定されな、。

[0066] 次に、ゥエル 522内に薬液等の測定溶液を貯留してゥエル 524から吸引すると、流路 509、キヤビティ 505、キヤビティ 506、流路 510内の培養液を測定溶液で置換させることができる。これにより、細胞が存在するゥエル 523の領域と測定電極 515が存在するキヤビティ 506の領域に、それぞれ別種類の培養液や測定溶液を容易に導入でき、より速く細胞電位を測定できる。

[0067] ゥエル 522とゥエル 524の機能を逆にしても同様に細胞の電位が測定できる。

[0068] ゥエル 522、 523、 524にバルブあるいは蓋を設けることにより、プローブ 501での測定をより容易に制御できる。

[0069] 実施の形態 3による他の細胞電位測定プローブ 519である、複数の細胞電位測定プローブ 501を用いた細胞電位測定プローブアレイ 519について説明する。図 23は実施の形態 3による他の細胞電位測定プローブ 519 (細胞電位測定プローブアレイ 5 19)の分解斜視図である。細胞電位測定プローブ 501が 4列 X 8列のマトリックス状に配置されている。ゥエル 522、 523、 524が複数のプレート 520に対応する位置でそれぞれ形成された複数のゥエルアレイ 520は一括してゥヱルアレイユニット 520Aとして作製でさる。

[0070] このように複数の細胞電位測定プローブ 501が所定のフォーマットで並べられた細胞電位測定プローブアレイ 519は、薬液注入'細胞投入'吸引などにロボットなどを利用することができるので、短時間で多数の被験体細胞の電位を測定でき、薬理効果を判断して候補薬剤を迅速にスクリーニングできる。

産業上の利用可能性本発明による細胞電位測定プローブは、溶液内に浮遊する細胞の電位をそのままの環境で測定でき、細胞への薬理効果を判定して薬剤のスクリーニングに用いることができる。

Claims

請求の範囲

[1] 吸引手段と共に用いられる細胞電位測定プローブであって、

表面を有するプレートであり、底面を有する第 1のキヤビティが前記表面に形成され、前記第 1のキヤビティの前記底面に第 2のキヤビティが形成され、前記第 2のキヤビティに開口する第 1の開口部と前記プレートの外部に開口する第 2の開口部とを有する第 1の流路が内部に形成された前記プレートと、

前記第 1のキヤビティ内に配置されたセンサ素子と、

を備え、

前記センサ素子は

第 1面と前記第 1面の反対側の第 2面とを有し、前記第 1面に開口する第 1の開口部と、前記第 2面に開口して前記プレートの前記第 2のキヤビティに連結する第 2の開口部とを有する貫通孔が形成された薄板と、

前記薄板の周囲に設けられて前記プレートの前記第 1のキヤビティに配置された支持基板と、

を有し、

前記第 1の流路は流体を流すことができ、前記吸引手段は前記第 1の流路の前記第 2の開口部に接続されて前記第 1の流路内を流れる流体を吸弓 Iできる細胞電位測定プローブ。

[2] 前記第 1のキヤビティの前記底面と前記センサ素子の前記薄板の前記第 2面は同一面内にある、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[3] 前記センサ素子の前記支持基板は前記プレートの前記表面と同じ向きの第 1面と前記プレートの前記第 1のキヤビティの前記底面上に配置された第 2面とを有し、前記薄板の前記第 1面上に第 3のキヤビティが形成される、請求項 2に記載の細胞電位測定プローブ。

[4] 前記センサ素子の前記支持基板と前記プレートとは接合されて！ヽる、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[5] 前記プレート内に、前記第 2のキヤビティに開口する第 1の開口部と前記プレートの外部に開口する第 2の開口部とを有する第 2の流路がさらに形成された、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[6] 前記プレートの前記第 2の流路の前記第 2の開口部には前記第 2の流路の前記第 2 の開口部力流体を注入する注入手段が接続される、請求項 5に記載の細胞電位測定プローブ。

[7] 前記注入手段と前記第 2の流路との間に弁が設けられる、請求項 6に記載の細胞電位測定プローブ。

[8] 前記第 2の流路の断面積は 0. 01mm²以上である、請求項 5に記載の細胞電位測定プローブ。

[9] 前記第 2の流路の、少なくとも一部が曲がっている、請求項 5に記載の細胞電位測定プローブ。

[10] 前記プレートは、前記第 1の流路と前記第 2の流路との間に設けられて前記第 2のキャビティに向かって突出する段差を有する、請求項 5に記載の細胞電位測定プロ一ブ。

[11] 前記第 1の流路の断面積は 0. 01mm²以上である、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[12] 前記第 1の流路の少なくとも一部が曲がっている、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[13] 前記センサ素子の前記貫通孔の前記第 1の開口部と前記第 2の開口部の両側の領域にそれぞれ電極を設けた請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[14] 前記センサ素子の前記薄板には、前記薄板の前記貫通孔の前記第 1の開口部と前記第 2の開口部のうちの少なくとも 1つに前記薄板の前記貫通孔の径より大きな径を有する窪みが形成された、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[15] 前記プレートは可視光を透過する材料で形成された、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[16] 前記センサ素子の前記薄板は可視光を透過する材料で形成された、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[17] 前記プレートは前記第 2のキヤビティに向力つて突出する段差を有する、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[18] 前記プレートの前記表面と前記センサ素子の前記薄板の前記第 1面は同一面内にある、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[19] 前記センサ素子の前記支持基板は前記プレートの前記表面と同じ向きの第 1面と前記プレートの前記第 1のキヤビティの前記底面上に配置された第 2面とを有し、前記薄板の前記第 2面上に第 3のキヤビティが形成される、請求項 18に記載の細胞電位測定プローブ。

[20] 開口部と底面とをそれぞれ有する第 1のゥエルと第 2のゥエルと第 3のゥエルが形成されたゥエルアレイをさらに備え、

前記第 1のゥエルの前記底面には前記第 1の流路の前記第 2の開口部に連結した貫通孔が形成され、

前記第 2のゥエルの前記底面には前記センサ素子の前記薄板の前記貫通孔に連結した貫通孔が形成され、

前記第 3のゥエルの前記底面には前記第 2の流路の前記第 2の開口部に連結した貫通孔が形成された、請求項 1に記載の細胞電位測定プローブ。

[21] 前記第 2のゥエルの前記貫通孔は前記センサ素子の前記薄板の前記貫通孔に向かつて狭まる形状を有する、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[22] 前記第 2のゥエル内に配置された第 1の電極と、

前記第 3のゥエル内と前記第 1の流路内のうちの一方に配置された第 2の電極と、をさらに備えた、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[23] 前記第 2のゥエルに被験体細胞を含む流体が投入され、

前記第 3のゥエルには前記被験体細胞との反応を検査する流体が投入され、前記第 1のゥエルには前記吸引手段が接続される、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[24] 前記第 2のゥエルは前記センサ素子の前記薄板の前記第 1面上に配置された、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[25] 前記第 2のゥエルの前記貫通孔は前記薄板の外形より大きい、請求項 24に記載の細胞電位測定プローブ。

[26] 前記第 1のゥエルの前記貫通孔は前記第 1の流路の前記第 2の開口部より大きい、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[27] 前記第 3のゥエルの前記貫通孔は前記第 2の流路の前記第 2の開口部より大きい、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[28] 前記ゥエルアレイは、前記第 1のゥエルの前記貫通孔と前記第 2のゥエルの前記貫通孔と前記第 3のゥエルの前記貫通孔とが開口し、前記プレートの前記表面と同一面内にある底面を有する、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[29] 前記ゥエルアレイは前記プレートと同じ材質で形成された、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[30] 前記プレートと前記ゥエルアレイはガラスまたは石英で形成された、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[31] 前記プレートと前記ゥエルアレイはポリスチレン、シクロォレフインポリマー、またはシクロォレフィンコポリマーで形成された、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[32] 前記プレートと前記ゥエルアレイは熱可塑性榭脂で形成された、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ。

[33] 複数の開口部が形成された別のプレートと、

前記別のプレートの前記複数の開口部と同じ方向に開口する貫通孔が形成された別の薄板を有する別のセンサ素子と、

をさらに備え、

前記ゥエルアレイには、前記別のプレートの前記複数の開口部と前記センサ素子の前記貫通孔とにそれぞれ連結する貫通孔が形成された底面をそれぞれ有する複数の別のゥエルアレイがさらに形成された、請求項 20に記載の細胞電位測定プローブ