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WO2006016595A1 - ラクトフェリン複合体及びその製造方法 - Google Patents

ラクトフェリン複合体及びその製造方法 Download PDF

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WO2006016595A1
WO2006016595A1 PCT/JP2005/014623 JP2005014623W WO2006016595A1 WO 2006016595 A1 WO2006016595 A1 WO 2006016595A1 JP 2005014623 W JP2005014623 W JP 2005014623W WO 2006016595 A1 WO2006016595 A1 WO 2006016595A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
complex
powder
acid
aqueous solution
ratatopherin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/014623
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English (en)
French (fr)
Inventor
Genji Kawano
Isamu Seto
Hirohiko Shimizu
Kozue Fujimura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NRL Pharma Inc
Original Assignee
NRL Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NRL Pharma Inc filed Critical NRL Pharma Inc
Priority to JP2006531672A priority Critical patent/JP4195486B2/ja
Publication of WO2006016595A1 publication Critical patent/WO2006016595A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K38/40—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
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    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Definitions

  • Ratatofu phosphorus complex and method for producing the same
  • the present invention relates to a complex of ratatopherin and a polyelectrolyte, a method for producing the same, and a lactoferrin material composition which can be used for medicine, food, feed, etc. containing this complex, and further, the material Relating to medicine, food, feed etc. More specifically, a ratatopheline complex capable of efficiently exerting a physiological activity, a ratatopheline material composition, having enhanced stability in the presence of water and in gastric juice, entericity, and stability to heat treatment in an aqueous system.
  • the present invention relates to a method for producing them, and medicines, foods and feeds using this composition. Background art
  • Ratatophelin is a glycoprotein with a molecular weight of about 80,000 which is mainly present in the milk of mammals and is also found in neutrophils, tears, saliva, nasal discharge, bile, semen and the like.
  • Ratatoferrin belongs to the transferrin family because it binds iron.
  • Physiological activities of ratatofurin include antibacterial activity, iron absorption control activity, cell proliferation activation activity, hematopoietic activity, anti-inflammatory activity, antioxidative activity, phagocytosis activity, antiviral activity, bifidobacteria growth promotion activity, antifungal activity. It is known to have effects on cancer, cancer metastasis, and translocation.
  • ratatophelin has lipid metabolism improving and analgesic effects.
  • ratatophelin is a multifunctional physiologically active protein that exhibits various functions, and is expected to be used for applications such as medicines and foods for the recovery or improvement of health, and it contains ratatopheline. Food is already commercially available.
  • ratatofu phosphorus used in food and the like is a powder which is mainly separated from milk or dairy products and is spray-dried or freeze-dried. In dry powder form, ratatopherin is stable at room temperature for about 1 to 2 years.
  • ratatophelin is unstable when dissolved in water.
  • ratatoferin is used in medicine, food or feed, etc. in the presence of water, modification due to its three-dimensional structure being broken during storage or modification due to aggregation with a coexistent substance occurs, resulting in ratatopherin It loses its physiological activity. Therefore, ratatohuelin has water Can not be stored for a long time in the existing state.
  • ratatopheline powder is used as it is as a powder in order to enable long-term storage of several months or more. It was limited to any one of whether it was used as a tablet formulated in a dry powder state with the addition of excipients and the like.
  • Patent Document 2 Patent No. 2688098, Non-Patent Document 1
  • Patent Document 2 Patent No. 2688098, Non-Patent Document 1
  • this method can not improve the thermal stability of the ratatopheline-containing solution at near neutral pH.
  • ratatophelin when ratatophelin is orally taken, it is hydrolyzed by the acid protease pepsin, which is present in gastric juice, to be decomposed into a peptide, so that ratatophelin molecules can almost reach the intestinal tract as the ratatopheline molecule.
  • ratatophelin receptor is present in the small intestine mucosa in the digestive tract, and recently, ratatophelin is taken up by intestinal epithelial cells and is involved in gene expression in the nucleus, and inflammatory site is It has been reported that it controls the development. Therefore, the physiological activity of ratatophelin In order to exert it, it is necessary to allow ratatopheline to reach the intestinal tract without undergoing hydrolysis by pepsin in gastric juice.
  • enteric ratatopherin tablets obtained by coating enteric films on uncoated tablets pressed with tablet in dry powder state without using water by adding an excipient etc. to health support It is sold as a food.
  • Ratatofu-phosphorin raw material yarn which is stable to heat treatment near neutral pH while being able to sufficiently exert its physiological activity, and pharmaceuticals, food and feed using it. He was an unknown force.
  • Polyelectrolytes have been used as thickeners, dispersion stabilizers, adhesives, protective colloids, and the like in various technical fields including food, pharmaceuticals, and formulated feeds.
  • gelled ones adsorb ratatopherin, and this property has been utilized for the purification of extranuclear phosphorus.
  • a method of preparing a gel composition of a protein with excellent thermal stability that can be used as a food and drink material by heating a protein such as casein and a gelling agent containing ratatoferin as an active ingredient (patented) Reference 4: JP-A-8-98655), a method for producing a folate-lactophrins complex useful as a food or drink or a pharmaceutical material by mixing folate or the like with ratatophelin (Patent Document 5: JP-A-2001-106) 238640), ratatofurin by adding a polyvalent inorganic acid (phosphoric acid or sulfuric acid) or an organic acid (taenic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, ethylenediamine tetraacetic acid or chondroitin sulfate) to a solution of ratatofurin.
  • a method for stabilizing (Patent Document 6: WO99Z06065) has been reported.
  • Non-patent Document 4 a polyion complex is formed by mixing polymer electrolyte solutions having charges of opposite signs to each other. It is unknown if it is enteric.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-108629
  • Patent Document 2 Patent No. 2688098
  • Patent Document 3 JP-A-61-246198
  • Patent Document 4 Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-098655
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Publication No. 2001-238640
  • Patent Document 6 WO 99 Z 606 6065
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-161050
  • Patent Document 8 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-322088
  • Patent Document 9 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-326950
  • Patent Document 10 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-089629
  • Patent Document 11 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-137808
  • Patent Document 12 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-137809
  • Non Patent Literatures Abe, H “baito, H” iya awa, H “Tamura, Y .: Journal of dairy science (1991) 74 (1), 65-71
  • Non-patent literature 2 New food material effective utilization technology series No. 6 “Ratatofu ⁇ ⁇ ⁇ ”, Inc. (Inc.) Confectionery General Technology Center published, March 2000
  • Non-Patent Document 3 Biochemical Dictionary, Tokyo Chemical Co., Ltd., April 1984
  • Non-patent document 4 Polymer assembly, published by Academic Press Center, January 1983
  • the present invention provides improved stability in the presence of water and in gastric juice, entericity, and thermal stability of ratatofu phosphorus to heat treatment in an aqueous system, resulting in preservation in the presence of water.
  • the stability is excellent, and ratatoferin reaches the intestinal tract and is eluted or released without being (or reduced in degradation) degraded by pepsin in gastric juice, so it is efficiently absorbed by the body and sufficiently bioactive.
  • a ratatopheline material composition having a feature that it can be used to perform a process involving heating such as heat sterilization in food, medicine, feed and the like, and a method for producing the same
  • ratatopherin is mixed with a polyelectrolyte in an aqueous solution to form a water-insoluble complex with the polyelectrolyte.
  • ratatopherin is mixed with a polyelectrolyte in an aqueous solution to form a water-insoluble complex with the polyelectrolyte.
  • the polyelectrolytes are casein, gelatin, acidic egg white proteins, acidic whey proteins, poly L-glutamic acid, carboxymethylcellulose, carrageenan, alginic acid, fucoidan, galactan sulfate, xanthan gum, pectin, gum arabic Lyacrylic acid, polymethacrylic acid, dielan gum, natto bacteria gum, soybean water-soluble polysaccharide, agar, starch, furcellane, tracanth gum, heparin, hyaluronic acid, chondroitin, Heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, carboxymethyl starch, carboxymethyl amylose, buttermilk powder, acid soluble soy proteins, soy milk, chitosan, glycol chitosan, polylysine, polyglutamine, polyarginine, polyethylene
  • the complex according to any one of the
  • An aqueous solution of a polymer base is dispersed in an aqueous solution by dispersing a powder containing a lipid coating coated exoferrin and a powder containing a lipid coating coated polymeric acid in an aqueous solution.
  • a ratatophile material composition comprising the complex according to any one of the items (1) to (8);
  • the basic substance is also selected from soy milk, chitosan, polylysine, polyarginine, polyarginine, polydaltamin, sodium hydrogencarbonate, arginine, glutamine, histidine, lysine, dulcosamine, sodium carbonate, or a group of one or two.
  • the ratatofelin material composition as described in (10) above.
  • the above binder is one or more selected from the group consisting of zein, shellac, water-soluble soybean polysaccharide, carboxymethyl cellulose, alginic acid, guar gum and carboxymethyl cellulose. (10) or the composition of the ratatofelin raw material as described in (11).
  • a pharmaceutical composition comprising the material composition according to any one of the above (9) to (12) in an amount effective to exert the physiological activity of ratatopherin;
  • a feed comprising the material composition according to any one of the above (9) to (12) in an amount effective to exert the physiological activity of ratatopherin;
  • a method for producing a complex of ratatopherin and a polymer electrolyte which is obtained by mixing an aqueous solution containing ratatopherin and an aqueous solution containing a polymer electrolyte at normal temperature or under heating.
  • a method for producing a complex of ratatofuline and a polymer electrolyte which comprises mixing an aqueous solution containing ratatofurin with an aqueous solution containing a polymer electrolyte which is a polymeric acid at room temperature or under heating, Then, an aqueous solution containing a polymer electrolyte which is a polymer base is added to form a complex of ratatopherin, a polymer acid and a polymer base, and the obtained complex is recovered.
  • a method for producing a complex of ratatopherin and a polymer electrolyte which comprises preparing a powder containing ratatopherin and a polymer electrolyte, dispersing the powder in an aqueous solution, and heating at normal temperature or under heating.
  • a method comprising mixing to form a complex, and recovering the obtained complex;
  • a method for producing a complex of ratatopherin and a polymer electrolyte which comprises preparing a powder containing ratatopherin and a polymer electrolyte which is a polymer acid, and dispersing the powder in an aqueous solution to obtain a mixture at room temperature. Alternatively, they are mixed under heating, and then an aqueous solution or powder containing a polymer electrolyte which is a polymer base is added, and mixed under normal temperature or heating to form a complex of ratatophenin, a polymer acid and a polymer base.
  • a powder coating containing a lipid coating and a powder coating containing LaFerrin and a lipid coating Raw material for preparing a complex of ratatofluorine and a polyelectrolyte, which is contained in a container separately or in a mixed state with a powder containing a coated polyelectrolyte.
  • the ratatopherin complex and the raw material composition of the present invention are water insoluble in a normal state, and have good storage stability even in the presence of water.
  • ratatophein contained in the complex and the material composition of the present invention does not elute in gastric juice and does not undergo degradation by pepsin or its degradation is reduced.
  • the complex In the digestive tract containing bile acids such as lipase and deoxycholic acid, that is, in the intestine containing bile etc., the complex can be easily eluted or released, so it is efficiently absorbed by the body. It is possible to exert physiological activity.
  • Bile is classified into hepatobile and gallbladder bile, which generally have the following composition.
  • the term "bile” in the context of the present invention also includes both of these and experimentally used model bile (3 wt.% Bile (Wako Pure Chemical Industries or equivalent bile powder), 50 mM sodium bicarbonate).
  • the composite and material composition of the present invention is stable to heat treatment at around the acidic pH (pH 3.5) to near neutral pH, and therefore, it can be used in the production of food, medicine, feed and the like. It can be advantageously used in carrying out processes involving heating, such as heat sterilization, and as a result of the restriction on production being relaxed, it can be applied to a wide variety of products.
  • the composite and the material composition of the present invention are advantageous in terms of production because they can be easily produced in a simple process.
  • the food, medicament and feed containing the ratatopheline complex or ratatophelin raw material composition of the present invention are not limited to those in a dry state, and even in the form in which water is present, the physiological activity of ratatofurin is obtained. It can be maintained for a long period of time, and even if it is heat-treated, it can sufficiently retain the physiological activity of ratatopheline, so the storage stability and usefulness of food, medicine and feed itself are improved. Significantly improved.
  • FIG. 1 is a view showing the pH dependence of pepsin degradation of ratatophelin.
  • “latatopherin” also includes the natural ratatopherin molecule itself, gene recombinant ratatofurin, and functional equivalents of ratatofurin such as active fragments of ratatofurin. The presence or absence of iron ion or its content, regardless of the species from which it originates.
  • “the ratatophelin raw material composition” is a composition containing ratatopheline, which can be used as a raw material of other products such as food, medicine, feed and the like, and the physiological activity or characteristics of ratatopherin. Means a material composition to be used for at least one purpose of exerting it in the product in which it is used.
  • polyelectrolyte refers to a substance that dissociates in an aqueous solution to form polyions (macroions) and counterions (microions), and is a polymeric acid, a polymeric base or ampholytic polymer.
  • Molecular Electrolyte! /, Misalignment May be Synthetic or Natural! /, Misalignment! / ,.
  • the polymer electrolyte used in the composite, material composition and the like of the present invention includes, among arbitrary polymer electrolytes, physiologically acceptable polymer electrolytes or salts thereof, especially for food and medical use etc. Depending on the application, one or two or more may be selected as appropriate.
  • polyelectrolytes used as food additives are preferred in terms of availability, price and Z or safety.
  • casein gelatin, Acidic egg white proteins (ovalbumin, conalbumin, ovomucoid, ovoglobulin
  • polymer electrolyte used in the present invention when there is one type of polymer electrolyte, a polymer acid which dissociates in an aqueous solution to form polyanion (for example, an acidic protein, Acidic polypeptides and acidic polysaccharides) are preferred.
  • a polymer acid which dissociates in an aqueous solution to form polyanion for example, an acidic protein, Acidic polypeptides and acidic polysaccharides
  • these polyelectrolytes the use of a strongly acidic polyelectrolyte is particularly resistant to acid dissociation and pepsin degradation as compared with a complex with a weakly acidic electrolyte, and the complex is can get.
  • weakly acidic polyelectrolytes are particularly preferred.
  • a polymeric acid that dissociates in an aqueous solution to form polyanion and a polymeric base that dissociates in an aqueous solution to form a polycation (for example, basic protein, base It is preferred to include both a sex polypeptide and a basic polysaccharide).
  • a complex of ratatopheline and a polymeric acid may be abbreviated as a binary complex in particular.
  • a complex of ratatopheline, a polymeric acid and a polymeric base may be abbreviated as a ternary complex.
  • a complex of ratatofulin and a polyelectrolyte (herein, simply referred to as The term “complex” or “complex” is sometimes referred to as polyelectrolyte salt of ratatopheline. This is formed, for example, by mixing an aqueous solution containing ratatopherin with an aqueous solution containing polyelectrolyte at normal temperature or under heating.
  • the binary composite is formed by mixing an aqueous solution containing ratatopheline with an aqueous solution containing a polymeric acid at normal temperature or under heating.
  • an aqueous solution containing ratatoferin and an aqueous solution containing a polymeric acid are mixed under normal temperature or heating, and then an aqueous solution containing a polymeric base is added to the mixture. It is formed by mixing.
  • aqueous solution in the context of the present invention also includes water itself, examples being water as well as saline, physiologically acceptable buffers etc. Also, “solution” does not require that the solute be completely dissolved, and does not need to be liquid in a strict sense. Thus, in the context of the present invention, a “solution” may contain dispersed or suspended substances or it may be in the form of a yogurt or sherbet etc.
  • the temperature for heating is generally about 40 ° C. to 120 ° C., preferably 50 ° C. to 90 ° C., and most preferably in the range of 50 ° C. to 65 ° C. is there. Below 40 ° C., certain polyelectrolytes such as agar tend to solidify. On the other hand, when the temperature exceeds 65 ° C., the physiological activity of ratatoferin is easily inactivated for a long period of time when the temperature exceeds 100 ° C., the physiological activity is almost lost.
  • the specific temperature can be appropriately selected according to the selected polymer electrolyte.
  • the time for carrying out the mixing is not particularly limited as long as the outer shell phosphorus and the polymer electrolyte are sufficiently mixed to form a complex. Temperature conditions to be adopted, size of reactor, shape of mixing means It can be selected appropriately according to the situation.
  • the state of the complex thus formed varies depending on the type, concentration, mixing ratio, pH and the like of ratatopherin and polyelectrolyte, and is in the form of a colloidal precipitate, sol or gel.
  • the binary complex is in the form of a hydrophilic hydrogel
  • the ternary complex is in the form of a dewatering precipitate.
  • the two-component complex is formed by binding to the basic group of ratatopheline molecule by a high molecular weight acid bond, and the acidic group of ratatopheline becomes free, so the complex as a whole is considered to be a negative charge.
  • the binary complex hydrogen bonds water molecules It is thought that it takes in to form a hydrogel and does not precipitate at high concentrations.
  • the ternary complex a polymer base is formed by ionic bonding to a free acidic group of the binary complex, charge is lost and water molecules are released. It is considered to be in the form of a well-dehydrated precipitate, so that the precipitate fraction and the supernatant fraction will be separated even by natural sedimentation.
  • These complexes are in the form of a powder, for example, through a drying process such as lyophilization or spray drying.
  • the ternary complex is excellent in separation property and drying efficiency, and is advantageous in production.
  • the complex of the present invention is prepared as a powder containing ratatopherin and a polyelectrolyte, and the powder is dispersed in an aqueous solution to form a complex, and the obtained complex is recovered. It can also be manufactured by collecting.
  • a powder containing ratatofuran and a polymeric acid can be prepared, and this powder can be dispersed in an aqueous solution to form a complex.
  • a powder containing extraferrin and a polymeric acid is prepared, this powder is dispersed in an aqueous solution, mixed at normal temperature or under heating, and then containing a polymeric base. The aqueous solution or powder can be added and mixed at normal temperature or under heating to form a complex.
  • a powder containing ratatopheline and a polyelectrolyte may be prepared, for example, by mixing a powder containing lactoferrin and a powder containing a polyelectrolyte at normal temperature or under heating. Can.
  • the powder containing ratatophenin and the powder containing the polymer electrolyte are each coated with a lipid film in advance.
  • the coating with a lipid film may be separately performed before mixing the ratatopherin-containing powder and the polymer electrolyte-containing powder, or may be performed after mixing both powders.
  • ratatopherin in a powder containing ratatopherin is coated with a film (sometimes referred to as “lipid film”) consisting of a film material containing a lipid as a main component, and a polymer
  • lipid film any of fats and oils, waxes and complex lipids may be acceptable as long as they are acceptable for food and medicine use.
  • naturally occurring animal or vegetable fats or oils or Examples thereof include hydrogenated oils (such as hydrogenated beef tallow oil, hydrogenated fish oil, hydrogenated rapeseed oil, hydrogenated soybean oil, hydrogenated palm oil, olive cured oil, and hydrogenated peanut oil).
  • a lipid having a melting point in the range of 30 to 90 ° C. more preferably a lipid having a melting point of 40 to 80 ° C. is used.
  • lipids having similar melting points more preferably, lipids of the same composition are used.
  • the composite of the present invention is a powder containing ratatofurin and a polymer electrolyte, or a mixture of a powder containing ratatopherin and a powder containing a polymer electrolyte (preferably a lipid film).
  • the powder is stored in the form of a mixture of powder containing extra-ferrin particles coated with a powder and powder containing a polyelectrolyte coated with a lipid film, and the powder is dispersed in an aqueous solution at the time of use.
  • the complexes of the present invention can be prepared at the time of use and used.
  • the step of separately preparing the ratatoferrin aqueous solution and the polymer electrolyte aqueous solution can be omitted, and the formation of dams when Z or the powder is dispersed in the aqueous solution can be prevented, and the operability can be improved. It is advantageous.
  • the ratatofelin-containing powder and the polymer electrolyte-containing powder are separately stored in a container, mixed when necessary, and combined with the aqueous solution.
  • the present invention can be provided as a raw material product for preparing a complex of ratatopherin according to the present invention and a polyelectrolyte.
  • the powder containing ratatopherin and the powder containing the polymer electrolyte may be provided as a raw material product which is contained in a container in an already mixed state and, if necessary, combined with an aqueous solution, .
  • powders containing ratatoferin coated with a lipid coating and powders containing a polyelectrolyte coated with a lipid coating are preferred.
  • Recovery of the formed complex can be performed by conventional means.
  • ratatopheline: polymer electrolyte 4: 1 to 1: 4 (weight ratio)
  • ratatopheline: polymer acid 5: 1 to L: 5 (weight ratio)
  • the complex formed by the method as described above, after being recovered from the reaction vessel, is in the form as it is, ie, in the form of a colloidal precipitate, sol or gel, particularly in the form of hydrogel or precipitate.
  • the complexes formed may be further processed to other forms such as powders, emulsified suspensions and the like.
  • the complex formed in the form of a colloidal precipitate is separated by centrifugation or the like, and this complex is further lyophilized, a sol or
  • the formed complex in the form of a gel can be lyophilized as it is.
  • the precipitate collected by centrifugation etc. is freeze-dried and pulverized to form powder, or the binary complex in the form of hydrogel is freeze-dried as it is, It can be milled into powder form.
  • the ratatoferrin complex of the present invention can be used in the form of a powder and further in the form of being enclosed in a capsule, specifically in the form of being enclosed in a microcapsule, a soft capsule or a hard capsule.
  • the capsule of the material of the present invention can be carried out by known microcapsule technology, soft capsule technology, hard capsule technology and the like.
  • the material composition of the present invention may be a complex of various forms as described above, or may be a tablet or a granule with or without the additional component described later in the complex.
  • the latatopherin material composition of the present invention can be made into any form such as pill and the like. Methods of processing to such forms are known in the art of formulation technology.
  • the material composition of the present invention may contain, in addition to the ratatofelin-polyelectrolyte complex, other additional components generally used in the art, Those skilled in the art may appropriately select the type of the components and the amount to be added according to the form of the specific material composition to be manufactured, the application, etc. and the properties of the product to which the material composition is to be applied. it can.
  • plasticizers for example, plasticizers, excipients, emulsifiers, stabilizers; vitamin A, vitamin B, vitamin B, vitamin
  • Vitamins such as Tamine B, Vitamin B, Vitamin C, and Vitamin E; Cozym Q, ⁇ -li Lipid-soluble or water-soluble general nutritional ingredients such as norenic acid, EPA, DHA; medicinal ingredients with analgesic activity such as morphine, codeine, dihydrocodin, cetylmorphine, other medicinal ingredients; and Z or lactic acid bacteria, La Examples include components for improving intestinal flora such as oligosaccharides.
  • Examples of the raw material composition include a raw material composition in the form of powder or granules containing the binary composite (or ternary composite) of the present invention, a basic substance, and a binder.
  • the basic substance referred to here may be a low molecular weight polymer or a high molecular weight substance as long as it has an effect of neutralizing gastric acid and raising the pH to 3 or more when the complex is brought into contact with gastric juice.
  • Specific examples of the basic substance suitable for use in the present invention include soymilk, chitosan, polylysine, polyarginine, polyglutamine, sodium hydrogencarbonate, arginine, glutamine, histidine, lysine, darcosamine, carbonate Sodium etc. are mentioned.
  • the binder may be one generally used, and examples thereof include Tween, shellac, water-soluble soybean polysaccharide, carboxymethylcellulose, alginic acid, guar gum, carboxymethyl cellulose and the like.
  • the basic substance and the binder can be used by appropriately selecting one or two or more kinds.
  • the ratatofu-phosphorus raw material composition of the present invention can be contained in food, medicine, feed and the like.
  • the appropriate content of lactoflavin when it is contained in medicine, food, feed and the like is known.
  • Example 3 Production of a lactoferrin-one strength raginan complex
  • a solution of 6 g of carrageenan (Ina Foods) in 500 mL of pure water is added to a solution of 10 g of ratatofelin (Tatza 'milk' BIO mouth Zix's) in 1 L of pure water, and mixed for 30 minutes. Formed.
  • the obtained gel-like solution was dried as it was with a lyophilizer (Kowa Vacuum Technology Co., Ltd.) to obtain about 14 g of the extraferrin complex of the present invention.
  • the precipitate was dried as it was with a lyophilizer (Kyowa Vacuum Technology Co., Ltd.) to obtain about 1.7 g of the lactoferrin complex of the present invention.
  • Example 5 Production of a capsule containing a lactoferrin material composition
  • Ratatohurin complex in a dry powder form produced in the same manner as in Examples 1 to 4 is used as a ratatopheline raw material composition as it is, 1 part by weight of ratatopheline raw material composition, 10 parts by weight of microcrystalline cellulose, and rapeseed oil 0.5 parts by weight was mixed, and 150 mg of this powder mixture was filled in a node capsule.
  • the capsule can be used as a pharmaceutical composition or a health supplement.
  • Example 6 Production of an ice cream containing a lactoferrin material composition
  • Each of ratatofutorin complex in the form of a dry powder prepared in the same manner as in Examples 1 to 4 was used. As it is, it was used as ratatohuelin raw material composition. A small amount of butter, emulsion stabilizer and flavor was added to 1 L of milk, 300 g of skimmed milk powder, 300 g of sugar and 1 L of water, and after mixing and dissolving, it was homogenized with a homogenizer. An ice cream was prepared by adding 2 g of any ratatopheline material composition and subjecting it to an ice cream freezer.
  • Example 3 1 L of milk, 100 g of skimmed milk powder, 10 g of sugar, ratatopherin complex in dry powder form prepared as in Example 3 (used as it is as a ratatopherin raw material composition) 2 g of butter, stabilizer and flavor added to a small amount of water Then, the mixture was dissolved and homogenized with a homogenizer. It was cooled after heat sterilization at 78 ° C. for 3 minutes and then at 98 ° C. for 2 seconds. After holding at 39 ° C., a lactic acid bacteria starter was added and fermented to prepare yogurt.
  • Example 8 Lactoferrin material for containing pet ⁇ ! Notice of fees
  • Ratatofurin complex in the form of ratatofurin ingredient composition 3g, corn flour 100g, fish meal 30g, yeast extract 10g, beef tallow 2g, soy flour 25g, Fratatooligosaccharide 20g, dextrin 10g, as dried powder form prepared in Example 3.
  • a small amount of sodium chloride was mixed, sufficiently mixed while adding water little by little using a kneader, and granulated with a twin-screw extrusion granulator. Furthermore, the obtained granules were dried at 40 ° C. overnight to produce a pet food.
  • Test, Test Example ⁇ Heat resistance test
  • ratatophein complex 10 mg prepared in Example 1 was dispersed in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) 1. Om, and heated at 80 ° C. for 30 minutes. After heat treatment with heat, centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes was carried out, the precipitate was dissolved in 1 M NaCl, and ratatopherin in the supernatant liquid was analyzed by high performance liquid chromatography to find that it corresponds to about 6 mg ZmL of ratatopherin. Was detected.
  • naked ratatopherin as a control (lactopherin used as a raw material in Example 1 (Tatza 'milk' Bio-Physics Co., Ltd.)) 10 mg of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) 1. Dissolve in O mL, 80 ° Heated at C for 30 minutes. After the formed precipitate was removed by centrifugation, the supernatant liquid was measured for ratatopherin by high performance liquid chromatography, and the peak for ratatopherin was hardly detected. In addition, the precipitate was extracted with 1 M NaCl, and the rat's extract of ratatopheline was measured by high performance liquid chromatography. Foremost was an undetectable force.
  • Test Example 2 Stabilization with gastric juice PH
  • the ratatofurin complex 1 g prepared in Example 1 is dispersed in 100 mL of a model gastric fluid (0.2% sodium chloride, 70 mM HCl, pH 1.2), and left at 37 ° C. for 2 hours, and then the supernatant liquid is recovered at a high speed. It was measured by liquid chromatography. As a result, almost no peak generated by elution of ratatophein was observed, and it was confirmed that the ratatophelin complex of the present invention was stable in gastric juice pH.
  • a model gastric fluid (0.2% sodium chloride, 70 mM HCl, pH 1.2
  • Test, Test Example 3 Stabilizing needle needle for pepsin treatment
  • Example 3 After 0.15 g of the ratatopheline complex prepared in Example 3 is added to 100 g of commercially available plain yoghurt and thoroughly stirred and mixed in a mixer, 500 mg of the mixture is placed in a 1.5 mL Ezbend Ruf tube to obtain 0.4 mg ZmL pepsin solution ( ⁇ 2 ) Carried out at 500 ° C for 30 minutes at 37 ° C. Thereafter, centrifugation (10, OOO rpm, 10 minutes) was performed to recover the supernatant and the precipitate, respectively. The precipitate was dispersed in 500 L of 40 mM deoxycholic acid. SDS-PAGE was performed using this precipitate and the supernatant as samples, and the presence or absence of degradation of ratatopheline was examined.
  • the ratatopheline complex of the present invention is stable to pepsin.
  • 0.1 mg of naked ratatopherin was subjected to the same treatment as above, and the degradation of ratatoferrin was observed in SDS-PAGE.
  • mice Sixteen 5-week-old ICR male mice were randomly divided into two groups of eight each, and a control group was fed with a standard diet for rat 'mouse (CE, 2 from CLEA Japan), and the experimental group was A feed containing 0.2% of ratatopheline complex prepared in the same manner as in Example 1 or 2 was given to CE-2 and the animals were reared for 4 weeks. Body weight was measured every three days during this breeding period.
  • CE rat 'mouse
  • the blood fat content was 25% (P 0 0. 05) and the blood free fatty acid value was 30% (P 0 0. 05), respectively, as determined by oral administration of ratatopheline complex, as measured for blood components. It has dropped significantly.
  • the experimental group to which the ratatofu phosphate material composition was administered showed a tendency to increase the total blood cholesterol level compared to the control group, but the increase was due to the HDL cholesterol strength 0% It became clear that it was because it rose (P ⁇ 0. 01).
  • the ratatophelin raw material composition of the present invention is safe for the living body, and at least exerts the physiological action of Lafrin, which improves lipid metabolism, sufficiently in a small amount.
  • a solution of 5 g of xanthan gum (Taiyo Engineering Co., Ltd.) in 500 mL of pure water is added to a solution of 10 g of ratatofelin (Tatza 'milk', BIOguchi Zix Co., Ltd.) dissolved in 1 L of pure water, Mix for minutes to allow complex formation.
  • the obtained gel was dried as it was with a lyophilizer (Kowa Vacuum Technology Co., Ltd.) to obtain about 14 g of the La complex of the present invention.
  • Example 12 Fat-coated lactoferrin powder and fat-coated CMC sodium powder Preparation of lactoferrin-CMC complex
  • Example 13 Lipid-coated lactoferrin powder and lipid-coated vectin powder as raw materials
  • Example 15 Production of Lactoferrin Xanthan Gum Chitosan Complex Starting from Fat Coated Lactoferrin Powder, Fat Coated Xanthan Gum Powder and Chitosan Mixed powder (Ratatofuerin 60 weight 0/0, xanthan gum 30 weight 0/0 and 10 wt% rapeseed hardened oil) of Ratatofuerin coated with rapeseed hardened oil (Kawaken Fine Chemicals Co., Ltd.) and hexa Ntangamu a 10 g, 0 of LOOmL. The mixture was charged into a mixer containing a 001N lactic acid solution, and stirred and mixed to form a binary complex. Next, 100 mL of a 0.
  • Example 16 Report of Lactoferrin-Pectin-Chitosan Complex Starting from Fat-Coated Lactoferrin Powder, Fat-Coated Vectin Powder, and Chitosan
  • m Production of a lactoferrin- 1-Pectin-acid-soluble soybean protein complex, which is based on a lipid-coated lactoferrin powder, a lipid-coated ⁇ pectin powder, and a highly acceptable protein.
  • ratatopheline 60% by weight, pectin 30% by weight and rapeseed oil 10% by weight are introduced into a mixer containing 1 L of 0.10 N aqueous solution of 001 N citric acid, and the mixture is stirred to mix to form a binary composite (latatopheline- (Pectin complex) was formed.
  • the resulting precipitate is collected by centrifugation and dried with a lyophilizer (Kyowa Vacuum Technology Co., Ltd.), About 120 g of ratatophelin complex of the present invention was obtained.
  • Example 18 Production of a Lactoferrin-Containing Lactoferrin Powder, a Lipid-Coated Vectin Powder and Soymilk The manufacture of a lactoferrin-containing granule
  • Test Example 5 Enteric dissolution test
  • ratatoferin complex (ratatoferin content: 60%) prepared in Example 10 was dispersed in 10 ml of model bile (3 wt% bile (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 50 mM aqueous sodium hydrogen carbonate solution (pH 8)) at 37 ° C. I processed it for 1 hour. After centrifugation, ratatopherin in the supernatant fluid was measured by high performance liquid chromatography, and a peak corresponding to about 5.9 mg ZmL of ratatopherin was detected. As a control, 100 mg of ratatoferrin complex was dispersed in 10 mL of pH 6. 8 (phosphate buffer), treated in the same manner, and ratatopholine in the supernatant fluid was measured by high performance liquid chromatography. It was a force.
  • model bile 3 wt% bile (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 50 mM aqueous sodium hydrogen carbonate solution (pH 8)
  • ratatopherin of the present invention liberates ratatopheline in bile near neutral pH and exhibits enteric solubility, but does not contain bile! /, Ratatopherin near neutral pH liberates It became clear that it was water insoluble.
  • ratatopheline complex prepared in Example 10 in an Eppendorf tube, 1 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.0) 1. Add OmL, and block heater (IWAKI; THERM 0 A to UMI BATH) It was heated at 75 ° C. for 30 minutes. After heat treatment with heat, centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes was carried out to dissolve the precipitate in model bile, and ratatopherin of the supernatant fluid was measured by high performance liquid chromatography to find that ratatopherin was about 4.8 mg ZmL (recovery: about 80% The peak corresponding to) was detected.
  • Test Example 7 A sputum-dependent test for pepsin degradation of lactoferrin
  • ratatopherin solution was added to 500 ⁇ L of each pepsin solution of ⁇ and treated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • each pH solution not containing pepsin was added and treated in the same manner. After the reaction, centrifugation was performed, and ratatopherin in the supernatant was measured by HPLC.
  • ratatophein-l-pectin-chitosan complex lOOmg prepared in the same manner as in Example 16 had a pH of 2.0, a pH of 3.0, a pH of 3.5, a pH of 4.0, a pH of 4.5, and a pH of 5.0.
  • the solution was dispersed in 5 mL, the pH was measured, and adjusted to each pH.
  • These solutions were covered with 5 mg of 0.4 mg Z mL of pepsin solution of each pH and treated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • pepsin solution instead of pepsin solution, each pH solution not containing pepsin was coated and treated in the same manner.
  • the residual rate of ratatophein in pepsin treatment was determined from the ratio of the concentration of residual ratatofurin after pepsin treatment to the concentration of ratatophein in the control at each pH.
  • ratatofulin complex prepared in Example 10 Fifty mg of the ratatofulin complex prepared in Example 10 was dispersed in 5 mL of a 0.2 mg / mL pepsin solution (pH 3, hydrochloric acid) and treated at 37 ° C. for 30 minutes. After centrifugation, the precipitate was extracted with model bile, and the ratatopherin of the extract was measured by high performance liquid chromatography to obtain a peak corresponding to about 3.6 mg ZmL of ratatopherin (about 60% recovery). On the other hand, 50 mg of naked ratatopherin powder is dissolved in 5 ml of 0.2 mg / mL pepsin solution (pH 3, hydrochloric acid), treated at 37 ° C. for 30 minutes, and centrifuged for the supernatant liquid. The peak corresponding to lactoferrin was almost completely degraded.
  • Test Example 9 Heat resistance test, Test (3) 100 mg of the ratatopheline complex prepared in Example 16 was placed in an Eppendorf tube, 1 mL of a 0. 001 N aqueous solution of citric acid was added, and heat treatment was performed at 75 ° C. for 30 minutes using a block heater. After cooling, centrifugation was performed, and 10 mL of model bile was added to the obtained precipitate, and elution was performed at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, centrifugation was carried out, and the lactoferrin in the supernatant liquid was measured by high performance liquid chromatography to obtain a peak corresponding to about 3.3 mg ZmL (recovery rate: 72%) of ratatopherin.
  • Test Test: In Rats: Intestinal Absorption Kinetics Test in Rats
  • naive lactoferrin was dissolved in physiological saline for intragastric administration (300 mg Z kg) in the control group.
  • the extracellular ferritin-containing granules produced in the above were suspended in physiological saline and administered intragastrically (30 mg Z kg of ratatofelin).
  • thoracic duct lymph fluid and venous blood were collected every hour, and ratatoferin was quantified by ELISA method.
  • ratatopheline in plasma was measured, ratatopheline was detected in the plasma in only 1 case out of 5 in the control group and in 3 cases out of 5 in the experimental group (concentration of about 50 to 200 ng ZmL).
  • the complex of the present invention is resistant to digestion in the stomach and has an effect of improving the absorption efficiency of ratatoferrin from the small intestine.
  • Example 19 Raw material of lactoferrin-Pectin complex soymilk powder
  • Ratatopherin-Pectin complex lOOg prepared in the same manner as in Example 13 and prepared soybean milk powder (Fuji Protein Engineering Co., Ltd.) lOOg is placed in a No-speed mixer (Fukae Powder Tech Co., Ltd.), 25 wt% tween (84% by weight ethanol solution containing Showa Sangyo Co., Ltd. (Kouka Chemical Co., Ltd.) (75 g of 84% by weight ethanol in which 25 g of tween is dissolved) 10 g of 10 g was sprayed and granulated. It was dried at 40 ° C. for 8 hours to obtain about 210 g of a raw material composition in the form of granules.
  • Ratatopherin- xanthan gum complex lOOg prepared in the same manner as in Example 9 and conditioned soybean milk powder (Fuji Protein Engineering Co., Ltd.) lOOg was placed in a No-Speed Mixer (Fukae Bowtech Co., Ltd.), and 25 wt. An 84% by weight ethanol solution (Showa Sangyo Co., Ltd.) was mixed and granulated by spraying 100 g of ethanol solution. It was dried at 40 ° C. for 8 hours to obtain about 215 g of a raw material composition in the form of granules.
  • Example 21 A material in the form of granules obtained from a lactoferrin-one pectin complex chitosan
  • Ratatoferin-Pectin complex lOOg prepared in the same manner as in Example 13 and chitosan (Kyowa Technos Co., Ltd.) lOOg are placed in an i-speed mixer (Fukae Powder Technology Co., Ltd.), 25 wt% tween (Showa Sangyo Co., Ltd.) Granulation was carried out by spraying 100 g of an 84% by weight ethanol solution (Sanka Kagaku Co., Ltd.) containing K.K. Dry at 40 ° C for 8 hours to obtain about 21 lg of material composition in granular form
  • i-speed mixer Frukae Powder Technology Co., Ltd.
  • 25 wt% tween Showa Sangyo Co., Ltd.
  • Granulation was carried out by spraying 100 g of an 84% by weight ethanol solution (Sanka Kagaku Co., Ltd.) containing K.K. Dry at 40 ° C for 8 hours to obtain about 21 lg of material
  • Example 22 Production of a complex of a chew-shaped bear made from La ferella ferin-Xanthan gum complex and chitosan
  • Ratatopheline-Xanthan gum complex lOOg prepared in the same manner as in Example 9 and Kitosan (Kohan Technos Co., Ltd.) lOOg are placed in a speed mixer (Fukae Powder Tech Co., Ltd.), 25 wt% tween (Showa Sangyo The solution was granulated by spraying 1 OOg of an 84 wt% ethanol solution (Sanka Chemical Co., Ltd.) containing Drying at 40 ° C. for 8 hours gave about 210 g of a complex in the form of granules
  • Example 23 Preparation of chewable particulate form using a complex of exo-ferin, 1-pectin-chitosan and chitosan
  • Example 24 Lactoferrin-Pectin-Chitosan Complex ⁇ 3 ⁇ 4, Powder Preparation of Granule Particles 3 ⁇ 4
  • Ratatoferin- 1-Pectin-chitosan complex lOOg prepared in the same manner as in Example 16 and prepared soymilk powder (Fuji Protein Engineering Co., Ltd.) lOOg was placed in a No-Speed Mixer (Fukae Bauttech Co., Ltd.), An 84% by weight ethanol solution containing Twain (Showa Sangyo Co., Ltd.) was granulated by spraying 100 g of a 100 g ethanol solution. It was dried at 40 ° C. for 8 hours to obtain about 210 g of a material composition in the form of granules.
  • Example 25 Powdered powder made from a complex of exo-ferin, pectin-chitosan and chitosan as raw materials
  • Example 26 13 ⁇ 4% of the grain-shaped particles made from the exo-pherin-pectin-chitosan complex and chitosan
  • Ratatopherin- 1-Pectin-chitosan complex lOOg and chitosan 100g prepared in the same manner as in Example 16 were placed in an I-speed mixer (Fukae Powder Technology Co., Ltd.), and 30% by weight shellac ( It was granulated by spraying 100 g of an anhydrous ethanol solution containing Gifu Shellac Co., Ltd.). It was dried at 40 ° C. for 8 hours to obtain about 210 g of a raw material composition in the form of granules.
  • Test Example 12 Stability against pepsin treatment (4)
  • EXAMPLE 1 100 mg of ratatopherin-xanthan gum complex prepared in the same manner as in Example 9 was dispersed in 5 mL of a pH 3.5 solution, and the pH was measured and adjusted to pH 3.5. This solution was covered with 5 mL of 0.4 mg / mL pepsin solution (pH 3.5) and treated at 37 ° C. for 30 minutes. As a control, instead of pepsin solution, pH 3.5 solution was added and treated similarly. After the reaction, centrifugation was performed to recover the supernatant and the precipitate. The precipitate was dissolved in 10 mL of model bile and centrifuged to collect supernatant. The concentration of ratatopherin in the above sample was measured by HPLC.
  • the residual rate of ratatopheline in the ratatopheline complex at pepsin treatment at pH 3.5 was about 80%. Therefore, it has been revealed that the ratatophelin complex of the present invention is pepsin-quenching.

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Abstract

　水の存在下及び胃液中での安定性、腸溶性、及び水系における加熱処理に対するラクトフェリンの熱安定性が改善されており、その結果、水の存在する状態での保存安定性が優れており、ラクトフェリンが胃液中のペプシンによる分解を受けることなく腸管に到達して効率よく生体に吸収されて充分に生理活性を発揮することができ、さらに食品、医薬、飼料などの製造において加熱殺菌処理などの加熱を伴う工程を行う上で好都合に利用し得るラクトフェリン複合体、それを含む素材組成物及びその製造方法を提供する。本発明のラクトフェリン複合体は、ラクトフェリンと高分子電解質との複合体である。

Description

明 細 書
ラタトフヱリン複合体及びその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、ラタトフエリンと高分子電解質との複合体及びその製造方法、及びこの 複合体を含有し、医薬、食品、飼料などに使用できるラクトフ リン素材組成物、さら にはこの素材を含む医薬、食品、飼料などに関する。さらに詳しくは、水の存在下及 び胃液中での安定性、腸溶性、及び水系での加熱処理に対する安定性が高められ た、生理活性を効率よく発揮し得るラタトフエリン複合体、ラタトフエリン素材組成物、 それらの製造方法、及びこの組成物を使用した医薬、食品及び飼料に関する。 背景技術
[0002] ラタトフエリンは、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁 、精液などにも見出されている、分子量約 80, 000の糖タンパク質である。ラタトフエリ ンは、鉄を結合することから、トランスフェリンファミリーに属する。ラタトフヱリンの生理 活性としては、抗菌作用、鉄吸収制御作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎 症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウィルス作用、ビフィズス菌生育促進作 用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られて いる。さらに、最近、ラタトフエリンが脂質代謝改善作用ゃ鎮痛作用を有することも報 告されている。このように、ラタトフエリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タン パク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用される ことが期待されており、ラタトフエリンを含む食品は既に市販されている。
[0003] 現在までに、食品などに使用されているラタトフヱリンは、主に乳又は乳製品から分 離され、スプレードライ又は凍結乾燥された粉末である。乾燥粉末状態では、ラタトフ エリンは常温で 1年から 2年程度安定である。
[0004] しかし、ラタトフエリンは、水に溶解した状態では不安定である。ラタトフエリンを水が 共存する状態で医薬品、食品又は飼料などに用いると、保存中にその立体構造が崩 れることによる変性、あるいは共存する物質と結合して凝集することによる変性などが 起こり、ラタトフエリンはその生理活性を喪失する。したがって、ラタトフエリンは、水が 存在する状態で長期間の保存ができない。
[0005] そのため、ラタトフエリンを医薬、食品、飼料、ペットフードなどに使用する場合、数ケ 月以上の長期保存を可能にするためには、ラタトフエリンをそのまま粉末で使用する カゝ、ラタトフエリン粉末に賦形剤などを加えて乾燥粉末状態で製剤した錠剤として使 用するかの 、ずれかに限定されて!ヽた。
[0006] また、ラタトフヱリンを溶液状態で食品 ·医薬品 ·飼料などに使用する場合、加熱処 理による滅菌が不可欠である力 ラタトフエリンは熱に対して不安定であり、 60°C以上 の加熱によって変性し、沈殿する。そこで、ラタトフエリン水溶液を 60°C以上の温度で 加熱殺菌するに際し、水溶液のイオン強度を加熱温度に応じて調整することによりラ タトフェリンの熱安定性を向上させる方法が開発されている (特許文献 1 :特開平 2— 108629)。この方法によれば、たとえば、 80°Cでの加熱殺菌の場合、脱塩してィォ ン強度を 10_3以下 (NaCl換算濃度:約 0. 006%)になるように調整する必要がある 。しかし、一般に、食品、医薬、飼料などにはある程度の塩濃度が不可欠であるため 、この方法は実用的ではない。
[0007] また、ラタトフエリン含有溶液を pHl. 0〜6. 5に調節した後、 60°C以上の温度で加 熱処理を行うことにより、ラタトフエリン含有液の加熱処理に対する熱安定性を向上さ せる方法が開発されている（特許文献 2 :特許第 2688098号、非特許文献 1)。しか し、一般に、食品、医薬、飼料などの溶液は PH7前後の中性付近であり、この方法で は中性 pH付近でのラタトフエリン含有溶液の加熱処理に対する熱安定性を改善する ことができない。
[0008] したがって、食品、医薬、飼料などに適用できる実用的なラタトフエリンの熱安定性 改善技術が望まれていた。
[0009] さらに、ラタトフエリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテア ーゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、ラタトフエリン分 子としてはほとんど腸管まで到達することができない。しかし、ラタトフエリン受容体は 消化管では小腸粘膜に存在することが知られており、また、最近は、ラタトフエリンが 腸管上皮細胞に取り込まれて核内の遺伝子発現に関与し、炎症性サイト力インの発 現を制御していることが報告されている。そのため、ラタトフエリンの持つ生理活性を 発揮させるには、ラタトフエリンを胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態 で腸管まで到達させることが必要である。
[0010] 以上の観点から、ラタトフエリン粉末に賦形剤などを加え、水を使用せずに乾燥粉 末状態で加圧打錠した素錠に腸溶性フィルムをコーティングした腸溶性ラタトフエリン 錠が健康補助食品として販売されている。
[0011] しかし、水の存在する状態において医薬品、食品又は飼料などの用途に使用して も保存安定性が良好であり、また、胃液中ではペプシンによる分解を受けずに腸管 に到達してラタトフエリンが生理活性を充分に発揮し得ると同時に、中性 pH付近にお ける加熱処理に対しても安定であることを実現したラタトフヱリン素材糸且成物、及びそ れを用いた医薬品、食品、飼料は知られていな力つた。
[0012] 高分子電解質は、食品、医薬品、配合飼料を含む多方面の技術分野において、増 粘剤、分散安定剤、粘着剤、保護コロイド剤などとして使用されてきた。一部の高分 子電解質についてはゲルィ匕させたものがラタトフエリンを吸着することが知られており 、この性質はラ外フヱリンの精製などに利用されてきた。
[0013] たとえば、ラタトフエリン、ラクトパーォキシダーゼなどの乳中に存在するタンパク質 を、ゲル化させた酸性多糖類 (アルギネート、カラギーニン）に吸着させ、その後溶出 させる、ラタトフエリンなどのタンパク質の精製方法が報告されている（特許文献 3 :特 開昭 61— 246198)。
[0014] また、カゼインなどのタンパク質とラタトフエリンを有効成分とするゲル化剤とを加熱 して、飲食品素材として使用し得る熱安定性に優れたタンパク質のゲル組成物を調 製する方法 (特許文献 4：特開平 8 - 98655)、葉酸などとラタトフエリン類とを混合す ることにより、飲食品や医薬品素材として有用な葉酸 ラクトフ リン類複合物を製造 する方法 (特許文献 5：特開 2001— 238640)、ラタトフヱリンの溶液に多価の無機酸 (リン酸又は硫酸)又は有機酸 (タエン酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、 エチレンジァミン四酢酸又はコンドロイチン硫酸）を添カ卩してラタトフエリンを安定ィ匕す る方法 (特許文献 6： WO99Z06065)が報告されて 、る。
[0015] しかし、これらの文献に記載された技術は、ラタトフヱリンを精製するための吸着担 体としてゲルィ匕させた酸性多糖類を使用したにすぎなカゝつたり、ラタトフエリンを他の タンパク質のゲル化剤として又は葉酸の光安定性、耐酸性及び溶解性の向上のため に利用したにすぎないものであったり、ラタトフエリン水溶液の安定ィ匕のために多価の 有機酸を添加したにすぎないものであり、いずれの文献にも、これらの高分子電解質 とラタトフヱリンとの複合体について、ラタトフヱリンの生理活性の失活、加熱処理に対 する熱安定性の変化、ならびに胃液耐性及び腸溶性についての記載は一切なぐ不 明である。
[0016] また、互いに反対符号の電荷を有する高分子電解質溶液を混合するとポリイオンコ ンプレックスを形成することが知られている（非特許文献 4)力 これらポリイオンコンプ レックスの加熱安定性、ペプシン耐性や腸溶性にっ ヽては不明である。
[0017] 特許文献 1 :特開平 2— 108629
特許文献 2：特許番号第 2688098号
特許文献 3：特開昭 61 -246198
特許文献 4：特開平 08— 098655
特許文献 5：特開 2001— 238640
特許文献 6 :WO99Z〇6065
特許文献 7:特開 2002— 161050
特許文献 8：特開 2002— 322088
特許文献 9：特開 2002— 326950
特許文献 10：特開 2003— 089629
特許文献 11：特開 2003 - 137808
特許文献 12:特開 2003— 137809
非特許文献丄： Abe, H" baito, H" iya awa, H" Tamura, Y.: Journal of dairy scie nce (1991) 74(1), 65-71
非特許文献 2:食品新素材有効利用技術シリーズ No. 6「ラタトフヱリン」、（社)菓子 総合技術センター発行、平成 12年 3月
非特許文献 3 :生化学辞典、（株)東京化学同人発行、 1984年 4月
非特許文献 4:高分子集合体、学会出版センター発行、 1983年 1月
発明の開示 [0018] 本発明は、水の存在下及び胃液中での安定性、腸溶性、及び水系における加熱 処理に対するラタトフヱリンの熱安定性が改善されており、その結果、水の存在する 状態での保存安定性が優れており、ラタトフエリンが胃液中のペプシンによる分解を 受けることなく（又は分解を低減されて)腸管に到達して溶出又は遊離するため、効 率よく生体に吸収されて充分に生理活性を発揮することができ、さらに食品、医薬、 飼料などの製造において加熱殺菌処理などの加熱を伴う工程を行う上で好都合に 利用し得る、という特徴を兼ね備えたラタトフエリン素材組成物、その製造方法、なら びにこの素材組成物を含む食品、医薬品及び飼料を提供することを目的とする。特 に、乾燥粉末状態以外の形態で安定に長期保存可能なラタトフエリン素材組成物を 提供することを目的とする。
[0019] 本発明者は、上記の課題を解決するために、鋭意研究した結果、ラタトフエリンを、 水性溶液中で高分子電解質と混合して高分子電解質との水不溶性の複合体の形態 とすることにより、水の存在下及び胃液中での安定性、腸溶性、及び水系における加 熱処理に対するラタトフヱリンの安定性が顕著に増大することを見出し、本発明を完 成した。
[0020] すなわち、本発明は、
(1) ラタトフエリンと高分子電解質との複合体；
(2) 前記高分子電解質が、水溶液中で解離してポリア二オンを生成する高分子酸 である、前記（1)記載の複合体；
(3) 前記高分子電解質が、水溶液中で解離してポリカチオンを生成する高分子塩 基をさらに含む、前記 (2)記載の複合体；
(4) 胆汁中でラクトフ リンが遊離しうる、前記（1)〜（3)のいずれか 1項記載の複合 体；
(5) 前記高分子電解質が、カゼイン、ゼラチン、酸性卵白タンパク質類、酸性乳清 タンパク質類、ポリ L—グルタミン酸、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、 アルギン酸、フコィダン、硫酸ガラクタン、キサンタンガム、ぺクチン、アラビアガム、ポ リアクリル酸、ポリメタクリル酸、ジエランガム、納豆菌ガム、大豆水溶性多糖類、寒天 、デンプン、ファーセルラン、トラカントガム、へパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン、 へパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチ ルスターチ、カルボキシメチルアミロース、バターミルクパウダー、酸性可溶大豆タン パク質類、豆乳、キトサン、グリコールキトサン、ポリリジン、ポリグルタミン、ポリアルギ ニン、ポリエチレンィミン、ポリビニルァミン、及びそれらの塩からなる群から選択され る 1種又は 2種以上である、前記（1)〜 (4)のいずれか 1項記載の複合体；
(6) コロイド状沈殿物、ゾル、ゲル、粉末、カプセルに封入されている形態、錠剤、 顆粒、丸薬又は乳化懸濁液の形態である、前記（1)〜（5)のいずれか 1項記載の複 合体；
(7) 脂質被膜でコーティングされたラ外フェリンを含有する粉末と脂質被膜でコー ティングされた高分子電解質を含有する粉末とを水性溶液中に分散させて形成され る、前記（1)〜（5)のいずれか 1項記載の複合体；
(8) 脂質被膜でコーティングされたラ外フェリンを含有する粉末と脂質被膜でコー ティングされた高分子酸を含有する粉末とを水性溶液中に分散させ、混合した後、高 分子塩基の水性溶液を加えて形成される、前記（3)〜（5)の 、ずれか 1項記載の複 合体；
(9) 前記（1)〜（8)の ヽずれか 1項記載の複合体を含むことを特徴とするラタトフエリ ン素材組成物；
(10) 塩基性物質と結合剤とを含む粉末又は顆粒の形態である、前記 (9)記載のラ タトフェリン素材組成物。
(11) 前記塩基性物質が、豆乳、キトサン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリダルタミ ン、炭酸水素ナトリウム、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、ダルコサミン、炭 酸ナトリウム力もなる群力も選択される 1種又は 2種以上である、前記（10)記載のラタ トフエリン素材組成物。
(12) 前記結合剤が、ツエイン、シェラック、水溶性大豆多糖類、カルボキシメチルセ ルロース、アルギン酸、グァーガム、カルボキシメチルェチルセルロースからなる群か ら選択される 1種又は 2種以上である、前記（10)又は（11)記載のラタトフエリン素材 組成物。
(13) 前記（9)〜（12)のいずれか 1項記載の素材組成物を、ラタトフエリンの生理活 性が発揮されるのに有効な量で含有する食品；
(14) 前記（9)〜（12)のいずれか 1項記載の素材組成物を、ラタトフエリンの生理活 性が発揮されるのに有効な量で含有する医薬組成物；
(15) 前記（9)〜（12)のいずれか 1項記載の素材組成物を、ラタトフエリンの生理活 性が発揮されるのに有効な量で含有する飼料；
(16) ラタトフエリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフエリンを 含有する水性溶液と高分子電解質を含有する水性溶液とを、常温又は加熱下で混 合し、得られた複合体を回収することを特徴とする方法；
(17) ラタトフヱリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフヱリンを 含有する水性溶液と高分子酸である高分子電解質を含有する水性溶液とを、常温 又は加熱下で混合し、次いで、高分子塩基である高分子電解質を含有する水性溶 液を加えて、ラタトフエリンと高分子酸と高分子塩基との複合体を形成させ、得られた 複合体を回収することを特徴とする方法；
(18) ラタトフエリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフエリンと 高分子電解質とを含有する粉末を用意し、この粉末を水性溶液中に分散させて、常 温又は加熱下で混合して複合体を形成させ、得られた複合体を回収することを特徴 とする方法；
(19) ラタトフエリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフエリンと 高分子酸である高分子電解質とを含有する粉末を用意し、この粉末を水性溶液中に 分散させて、常温又は加熱下で混合し、次いで、高分子塩基である高分子電解質を 含有する水性溶液又は粉末を加え、常温又は加熱下で混合して、ラタトフエリンと高 分子酸と高分子塩基との複合体を形成させ、得られた複合体を回収することを特徴と する方法；
(20) 前記ラタトフエリンと高分子電解質とを含有する粉末を、常温又は加熱下で混 合することにより用意する、前記（18)又は（19)記載の方法；
(21) 前記ラ外フェリンと高分子電解質とが、いずれも予め脂質被膜でコーティング されている、前記（18)又は（19)記載の方法；
(22) 脂質被膜でコーティングされたラ外フェリンを含有する粉末と脂質被膜でコー ティングされた高分子電解質を含有する粉末とが、別々に又は混合された状態で容 器に含まれている、ラタトフヱリンと高分子電解質との複合体を調製するための原料 製品、
を提供する。
[0021] 本発明のラタトフエリン複合体及び素材組成物は、通常の状態では水不溶性であり 、水の存在する状態においても保存安定性が良好である。また、本発明の複合体及 び素材組成物に含有されるラタトフエリンは、胃液中では溶出せず、ペプシンによる 分解を受けないか、分解が低減されているので、生理活性を維持したまま腸管に到 達することができ、リパーゼ、デォキシコール酸等の胆汁酸等を含有する消化液、す なわち胆汁等を含む腸管においては複合体力 容易に溶出又は遊離することができ るため、効率よく生体に吸収されて生理活性を発揮することができる。
[0022] なお、胆汁は、肝胆汁及び胆嚢胆汁に区別され、これらは一般に以下のような組成 を有する。本発明に関して胆汁という場合、これらの両方及び実験的に使用されるモ デル胆汁（3重量％胆汁 (和光純薬製又は同等の胆汁粉末)、 50mM炭酸水素ナト リウム）をも含む。
[0023] [表 1] 胆汁の一般的な組成
Figure imgf000009_0001
さらに、本発明の複合体及び素材組成物は、酸性 pH付近 (pH3. 5)〜中性 pH付 近での加熱処理に対して安定であるので、食品、医薬、飼料などの製造においてカロ 熱殺菌処理などの加熱を伴う工程を行う上で好都合に利用することができ、製造上 の制限が緩和される結果、多種多様な製品に応用することができる。また、本発明の 複合体及び素材組成物は、シンプルな工程で簡便に製造することができる点におい て、製造上も有利である。
[0025] したがって、本発明のラタトフエリン複合体又はラタトフエリン素材組成物を含む食品 、医薬品及び飼料は、乾燥状態のものに限らず、水が存在する形態のものであって も、ラタトフヱリンの生理活性を長期間維持することができ、さらには加熱処理を施さ れたものであってもラタトフエリンの生理活性を充分に保持することができるため、食 品、医薬品及び飼料自体の保存安定性及び有用性が著しく改善される。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]は、ラタトフエリンのペプシン分解における pH依存性を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0027] 本発明にお 、て、「ラタトフエリン」とは、天然のラタトフエリン分子そのもののほ力、遺 伝子組換え型ラタトフヱリン、及びラタトフヱリンの活性フラグメントなどのラタトフヱリン の機能的等価物をも包含し、鉄イオンの有無又はその含有量、由来する生物種を問 わない。また、本発明において「ラタトフエリン素材組成物」は、ラタトフエリンを含有す る組成物であって、食品、医薬、飼料などの他の製品の素材として使用され得るもの であり、ラタトフエリンの生理活性又は特徴をそれが使用された製品において発揮さ せることを少なくとも 1つの目的として使用されるべき素材組成物を意味する。
[0028] 本発明において、「高分子電解質」とは、水溶液中で解離してポリイオン (マクロイォ ン)及び対イオン (ミクロイオン)を生成する物質を指し、高分子酸、高分子塩基又は 両性高分子電解質の!/、ずれであってもよぐ合成又は天然の!/、ずれであってもよ!/、。 本発明の複合体、素材組成物等において使用される高分子電解質としては、任意の 高分子電解質の中から、生理的に許容され得る高分子電解質又はその塩、特に食 用 ·医療用などの用途に応じて許容されるものを 1種又は 2種以上適宜選択すること ができる。
[0029] 一般に、食品用添加物として使用されている高分子電解質は、入手の容易性、価 格及び Z又は安全性の面から好ましい。具体的には、例えば、カゼイン、ゼラチン、 酸性卵白タンパク質類 (オボアルブミン、コンアルブミン、オボムコイド、オボグロブリン
、オボムシンなど）、酸性乳清タンパク質類（|8—ラクトグロブリン、 α—ラクトアルブミ ンなど）、ポリ—L—グルタミン酸、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、アルギ ン酸、フコィダン、硫酸ガラクタン、キサンタンガム、ぺクチン、アラビアガム、ポリアタリ ル酸、ポリメタクリル酸、ジエランガム、納豆菌ガム、大豆水溶性多糖類、寒天、デン プン、ファーセルラン、トラカントガム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルァ ミロース、バターミルクパウダー、酸性大豆タンパク質類 (特に酸性可溶大豆タンパク 質）、キトサン、グリコールキトサン、ポリリジン、及びそれらの塩 (ナトリウム塩、カリウム 塩、塩酸塩などの生理的に許容され得る塩）；ならびに医療用途で使用される酸性ム コ多糖、例えば、へパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン、へパラン硫酸、デルマタン 硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ポリグルタミン、ポリアルギニン、ポリエチレ ンィミン、ポリビュルァミン、及びそれらの塩 (ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの 生理的に許容され得る塩)からなる群から 1種又は 2種以上を選択して用いることがで きる。
[0030] 一般に、本発明において使用される高分子電解質としては、高分子電解質が 1種 である場合は、水溶液中で解離してポリア二オンを生成する高分子酸 (たとえば、酸 性タンパク質、酸性ポリペプチド及び酸性多糖類)が好ましい。これらの高分子電解 質のうち、強酸性高分子電解質を用いると、弱酸性電解質との複合体と比較して酸 性での解離やペプシンによる分解に対して特に耐性が高!、複合体が得られる。一方 、弱酸性高分子電解質は特に好ましい。これは、弱酸性電解質との複合体は、強酸 性電解質との複合体と比較して、胆汁での複合体力 のラタトフヱリンの溶出又は遊 離が良好なためである。高分子電解質が 2種以上である場合は、水溶液中で解離し てポリア二オンを生成する高分子酸及び水溶液中で解離してポリカチオンを生成す る高分子塩基 (たとえば塩基性タンパク質、塩基性ポリペプチド及び塩基性多糖類） の両方を含むことが好ましい。本発明において、ラタトフエリンと高分子酸との複合体 を、特に二成分複合体と略称することがある。また、ラタトフエリンと高分子酸と高分子 塩基との複合体を、三成分複合体と略称することがある。
[0031] ラタトフヱリンと高分子電解質との複合体 (本明細書にぉ 、て、単に「ラタトフヱリン（ の）複合体」又は「複合体」と 、うことがある）は、言 、換えればラタトフエリンの高分子 電解質塩である。これは、たとえば、ラタトフエリンを含有する水性溶液と高分子電解 質を含有する水性溶液とを、常温又は加熱下で混合することによって形成される。二 成分複合体にっ ヽては、ラタトフエリンを含有する水性溶液と高分子酸を含有する水 性溶液とを、常温又は加熱下で混合することによって形成される。三成分複合体に っ ヽては、ラタトフエリンを含有する水性溶液と高分子酸を含有する水性溶液とを常 温又は加熱下で混合し、次!ヽで高分子塩基を含有する水性溶液を加えて混合する こと〖こよって形成される。
本発明に関して「水性溶液」は、水そのものも包含し、例としては、水のほか、生理 食塩水、生理的に許容され得る緩衝液などが挙げられる。また、「溶液」は、溶質が 完全に溶解していることを必要とせず、厳密な意味で液体であることを要しない。した がって、本発明に関して「溶液」は、分散又は懸濁している物質を含んでいてもよぐ また、ヨーグルト状又はシャーベット状などの形状でもよ 、。
[0032] ここで、加熱する場合の温度は、一般に 40°C〜120°C程度が適当であり、好ましく は 50°C〜90°C、最も好ましくは 50°C〜65°Cの範囲である。 40°C未満であると寒天 のようなある種の高分子電解質は固まる傾向がある。一方、 65°Cを超えると、ラタトフ エリンの生理活性が失活し易ぐ長い時間 100°Cを超えると生理活性がほとんどなく なる。具体的な温度は、選択した高分子電解質に応じて適宜選択することができる。
[0033] 混合を行う時間は、ラ外フヱリンと高分子電解質とが充分に混ざって複合体が形成 される限りにおいて特に制限はなぐ採用する温度条件、反応槽の大きさ'形態、混 合手段などに応じて適宜選択することができる。
[0034] こうして形成される複合体の状態は、ラタトフエリンと高分子電解質の種類、濃度、 混合比、 pHなどにより異なり、コロイド状の沈澱物、ゾル又はゲルの形態となる。一般 に、二成分複合体は親水性のヒドロゲルの形態、三成分複合体は脱水性の沈殿物 の形態となる。
二成分複合体は、ラタトフエリン分子の塩基性基に高分子酸力 オン結合により結 合して形成され、ラタトフエリンの酸性基がフリーとなるため、複合体全体としてはマイ ナスチャージとなると考えられている。そのため、二成分複合体は水分子を水素結合 により取り込んでヒドロゲルを形成し、高濃度になると沈殿しないと考えられる。一方、 三成分複合体は、二成分複合体のフリーの酸性基に高分子塩基がイオン結合して 形成され、チャージが消失して水分子が放出されるため、高濃度でも非常に沈降性 のよい脱水状態の沈殿の形態となり、自然沈降でも沈殿画分と上清画分とが分離す るようになると考えられる。これらの複合体は、たとえば凍結乾燥又は噴霧乾燥などの 乾燥工程を経ることにより粉末の形態になる。三成分複合体は、分離性及び乾燥効 率の点で優れており、製造上有利である。
[0035] 複合体の回収については後述する。
[0036] あるいは、本発明の複合体は、ラタトフエリンと高分子電解質とを含有する粉末を用 意し、この粉末を水性溶液中に分散させて複合体を形成させ、得られた複合体を回 収すること〖こよっても製造することができる。たとえば二成分複合体の場合は、ラタトフ リンと高分子酸とを含有する粉末を用意し、この粉末を水性溶液中に分散させて複 合体を形成させることができる。また、三成分複合体の場合は、ラ外フェリンと高分子 酸とを含有する粉末を用意し、この粉末を水性溶液中に分散させて常温又は加熱下 で混合し、次いで高分子塩基を含有する水性溶液又は粉末を加え、常温又は加熱 下で混合して複合体を形成させることができる。
ラタトフエリンと高分子電解質とを含有する粉末は、具体的には、たとえばラクトフエ リンを含有する粉末と高分子電解質を含有する粉末とを、常温又は加熱下で混合す ること〖こよって用意することができる。この場合、ラタトフエリンを含有する粉末と高分 子電解質を含有する粉末とがそれぞれ予め脂質被膜でコーティングされていることが 好ましい。脂質被膜でのコーティングは、ラタトフエリンを含有する粉末と高分子電解 質を含有する粉末とを混合する前に各々別途に行ってもよぐまた、両方の粉末を混 合した後に行ってもよい。
[0037] すなわち、好ましくは、ラタトフエリンを含有する粉末中のラタトフエリンは、脂質を主 成分とする被膜材からなる被膜 (「脂質被膜」と ヽぅことがある)でコーティングされてお り、高分子電解質を含有する粉末中の高分子電解質もまた脂質被膜でコーティング されている。脂質としては、油脂、ロウ及び複合脂質の中で食用'医薬用などの用途 に応じて許容されるものであればよい。たとえば、天然に得られる動植物性油脂又は これらの油脂を原料にした硬化油（牛脂硬化油、魚油硬化油、ナタネ硬化油、ダイズ 硬化油、パーム硬化油、ォリーブ硬化油、ラッカセィ硬化油など）が挙げられる。好ま しくは、 30〜90°Cの範囲内の融点を有する脂質、さらに好ましくは、 40〜80°Cの融 点を有する脂質が用いられる。また、ラタトフエリン粉末の脂質と高分子電解質粉末 の脂質として、好ましくは同程度の融点を有する脂質、さらに好ましくは同じ組成の脂 質を使用する。
[0038] したがって、この方法によれば、本発明の複合体は、ラタトフヱリンと高分子電解質 とを含有する粉末又はラタトフエリンを含有する粉末と高分子電解質を含有する粉末 との混合物 (好ましくは脂質被膜でコーティングされたラ外フェリン粒子を含有する粉 末と脂質被膜でコーティングされた高分子電解質を含有する粉末との混合物)の形 で保存しておき、使用時にこの粉末を水性溶液に分散させて本発明の複合体を用 時調製して使用するようにすることができる。このようにすると、ラタトフエリン水性溶液 及び高分子電解質水性溶液を別途調製する工程の省略及び Z又は粉末を水性溶 液に分散させたときのダマの形成の防止が可能となり、操作性が向上するので有利 である。
[0039] この方法によれば、ラタトフエリンを含有する粉末と高分子電解質を含有する粉末と を、それぞれ別々に容器に収容しておき、必要な時にこれらを混合し、水性溶液と一 緒にすることができる、本発明のラタトフエリンと高分子電解質との複合体を調製する ための原料製品として提供することができる。あるいは、ラタトフエリンを含有する粉末 と高分子電解質を含有する粉末とを、既に混合された状態で容器に収容しておき、 必要時には水性溶液と一緒にするだけの原料製品として提供してもよ 、。これらの原 料製品に関しては、特に、脂質被膜でコーティングされたラタトフエリンを含有する粉 末及び脂質被膜でコーティングされた高分子電解質を含有する粉末が好ましい。
[0040] 形成された複合体の回収は、通常の手段によって行うことができる。
[0041] 本発明のラタトフエリン複合体の製造に際しては、たとえばラタトフエリン:高分子電 解質 =4: 1〜1 :4程度 (重量比)を使用することができる。二成分複合体の製造に際 しては、たとえばラタトフエリン：高分子酸 = 5： 1〜： L： 5程度 (重量比）とすることができ る。また、三成分複合体の製造に際しては、二成分複合体:高分子塩基 =20: 1〜3 : 1程度 (重量比）となるようなラクトフ リン、高分子酸、高分子塩基を使用することが できる。
[0042] 上記のような方法によって形成された複合体は、反応槽から回収した後、そのまま の形態で、すなわちコロイド状の沈殿物、ゾル又はゲルなどの形態、特にヒドロゲル 又は沈殿物の形態でも、使用することができるが、形成された複合体をさらに処理し て、粉末、乳化懸濁液などの別の形態にしてもよい。たとえば、上記のようにして複合 体を形成させた後、コロイド状の沈殿物の形態の形成された複合体を、遠心分離な どで分離し、この複合体をさらに凍結乾燥したり、ゾル又はゲルの形態の形成された 複合体をそのまま凍結乾燥することができる。また、たとえば三成分複合体を形成さ せた後、遠心分離などで回収した沈殿を、凍結乾燥し、粉砕加工して粉末状にしたり 、ヒドロゲルの形態の二成分複合体をそのまま凍結乾燥し、粉砕加工して粉末状に することができる。
さらに、本発明のラタトフエリン複合体は、粉末状にした後、さらにこれをカプセルに 封入された形態、具体的にはマイクロカプセル、ソフトカプセル又はハードカプセル に封入された形態にして用いることができる。本発明の素材のカプセルィ匕は、公知の マイクロカプセルィ匕技術、ソフトカプセル化技術、ハードカプセルィ匕技術などによって ち行うことがでさる。
[0043] 本発明の素材組成物は、上記のような各種の形態の複合体そのままであってもよく 、また、複合体に後述する付加的な成分を加えて又は加えずに、錠剤、顆粒、丸薬 などの任意の形態にして、本発明のラタトフエリン素材組成物とすることができる。この ような形態への加工の方法は、製剤技術の分野にお!、て公知である。
[0044] 本発明の素材組成物には、ラタトフエリンと高分子電解質との複合体に加えて、当 該技術分野において一般的に使用されるその他の付加的な成分を含むことができ、 そのような成分の種類、添加量の選択は、製造しょうとする具体的な素材組成物の形 態、用途など及び素材組成物を適用しょうとする製品の性質などに応じて当業者が 適宜行うことができる。
[0045] たとえば、可塑剤、賦形剤、乳化剤、安定剤；ビタミン A、ビタミン B、ビタミン B、ビ
1 2 タミン B、ビタミン B 、ビタミン C、ビタミン Eなどのビタミン類；コェンザィム Q 、 α—リ ノレン酸、 EPA、 DHAなどの脂溶性又は水溶性の一般的栄養成分;モルヒネ、コデ イン、ジヒドロコディン、ェチルモルヒネなどの鎮痛作用を有する薬効成分、その他の 薬効成分;及び Z又は乳酸菌、ラ外オリゴ糖などの腸内菌叢改善成分などが挙げら れる。
[0046] 素材組成物の例としては、本発明の二成分複合体 (又は三成分複合体)、塩基性 物質、及び結合剤を含む、粉末又は顆粒の形態の素材組成物が挙げられる。ここで いう塩基性物質は、複合体と胃液とを接触させたときに胃酸を中和し、 pHを 3以上に 上昇させる作用を有する物質であればよぐ低分子でも高分子でもよい。このような本 発明における使用に適した塩基性物質としては、具体的には、豆乳、キトサン、ポリリ ジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、炭酸水素ナトリウム、アルギニン、グルタミン、ヒ スチジン、リジン、ダルコサミン、炭酸ナトリウムなどが挙げられる。また、結合剤は、一 般的に使用されているものでよいが、例としては、ツエイン、シェラック、水溶性大豆多 糖類、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、グァーガム、カルボキシメチルェチ ルセルロースなどが挙げられる。塩基性物質及び結合剤は、いずれも 1種又は 2種以 上を適宜選択して用いることができる。
[0047] 本発明のラタトフヱリン素材組成物は、食品、医薬品、飼料などに含有させることが できる。医薬、食品、飼料などに含有させる場合のラクトフ リンの適当な含有量はそ れぞれ公知である。
[0048] 以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に限定される ものではない。
実施例
[0049] 実施例 1：ラクトフエリンーぺクチン複合体の製造
ラタトフエリン (タツァ'ミルク'バイオ口ジクス社） 10gを 1Lの純水に溶解させた溶液 に、ぺクチン (八宝商会） 5gを 1Lの純水に溶解させた溶液を加え、 30分間混合し、 複合体を形成させた。得られたゲル状の溶液をそのまま凍結乾燥機 (共和真空技術 )で乾燥させ、ラ外フヱリン複合体 14gを得た。
[0050] ¾施例 2 :ラクトフエリン— CMC 合体の観告
ラタトフエリン（タツァ ·ミルク ·バイオ口ジクス社） 12gを 500mLの純水に溶解させた 溶液に、 CMCナトリウム (和光純薬工業 (株)） 6gを 500mLの純水に溶解させた溶 液を加え、 30分間混合し、複合体を形成させた。得られたゲル状の溶液をそのまま 凍結乾燥機 (共和真空技術 (株) )で乾燥させ、本発明のラ外フェリン複合体約 14g を得た。
[0051] 実施例 3 :ラクトフエリン一力ラギーナン複合体の製造
ラタトフエリン (タツァ'ミルク'バイオ口ジクス社） 10gを 1Lの純水に溶解させた溶液 に、カラギーナン (伊那食品） 6gを 500mLの純水に溶解させた溶液を加え、 30分間 混合し、複合体を形成させた。得られたゲル状の溶液をそのまま凍結乾燥機 (共和 真空技術 (株) )で乾燥させ、本発明のラ外フェリン複合体約 14gを得た。
[0052] ¾施例 4：脂皙被蹬ラクトフエリン粉末及び脂皙被膽高 >早雷解皙粉末 原料 する ラクトフエリン—カラギーナン複合体の観告
ナタネ硬化油でコーティングしたラタトフエリン及びカラギーナンの混合粉末 (ラタト フェリン 60重量％、カラギーナン 30重量％及びナタネ硬化油 10重量％) 2gを、 100 mLの RO水を入れたミキサーに投入し、攪拌'混合して、ラタトフエリン一カラギーナ ン複合体を形成させた。
この段階（中性 pH)では、複合体は水不溶性の親水性ゲルを形成しているので、 1 N塩酸 lmLを添加して酸性 pH (約 pH2)とした。複合体は、直ちにほとんど水不溶 性に変化し、沈殿を形成した。
この沈殿をそのまま凍結乾燥機 (共和真空技術 (株) )で乾燥させ、本発明のラクト フェリン複合体約 1. 7gを得た。
[0053] 実施例 5：ラクトフエリン素材組成物を含有するカプセルの製造
実施例 1〜4と同様にして製造した乾燥粉末形態のラタトフヱリン複合体を各々その ままラタトフエリン素材組成物として使用して、ラタトフエリン素材組成物 1重量部、微 結晶セルロース 10重量部、及びナタネ硬化油 0. 5重量部を混合し、この粉末混合 物 150mgをノヽードカプセルに充填した。本カプセル剤は医薬組成物又は健康補助 食品として用いることができる。
[0054] 実施例 6：ラクトフエリン素材組成物を含有するアイスクリームの製造
実施例 1〜4と同様にして製造した乾燥粉末形態のラタトフヱリン複合体を各々その ままラタトフエリン素材組成物として使用した。牛乳 1L、脱脂粉乳 300g、砂糖 300g、 水 1Lに、バター、乳化安定剤及び香料を少量添加して、混合'溶解した後、ホモジ ナイザーで均質ィ匕した。いずれかのラタトフエリン素材組成物 2gを添加し、アイスタリ ームフリーザーにかけて、アイスクリームを調製した。
[0055] 実施例 7：ラクトフエリン素材組成物を含有するヨーグルトの製造
牛乳 1L、脱脂粉乳 100g、砂糖 10g、実施例 3と同様にして製造した乾燥粉末形態 のラタトフエリン複合体 (そのままラタトフエリン素材組成物として使用） 2g、水 500mL に、バター、安定剤、香料を少量添加して、混合'溶解した後、ホモジナイザーで均 質化した。これを 78°Cで 3分間、次いで 98°Cで 2秒間の加熱殺菌処理後、冷却した 。 39°Cに保持した後、乳酸菌スターターを加えて発酵させ、ヨーグルトを調製した。
[0056] ¾施例 8 :ラクトフエリン素材 成物 含有するペット用^！料の観告
実施例 3で製造した乾燥粉末形態のラタトフヱリン複合体 (そのままラタトフヱリン素 材組成物として使用） 3g、トウモロコシ粉 100g、魚粉 30g、酵母エキス 10g、牛脂 2g 、大豆粉 25g、フラタトオリゴ糖 20g、デキストリン 10g、食塩少量を混合し、混練機を 用いて水を少しずつ加えながら充分に練り合わせて、二軸式押し出し造粒機で造粒 した。さらに、得られた顆粒を 40°Cで一晩乾燥し、ペット用飼料を製造した。
[0057] 試,験例 ί :耐熱件試,験
実施例 1で製造したラタトフエリン複合体 lOmgを 10mM トリス塩酸緩衝液 (pH7. 0) 1. Om に分散させ、 80oCで 30分間カロ熱した。カロ熱処理後、 10, 000rpm、 10分 間の遠心分離を行い、沈殿物を 1M NaClに溶解させ、上清液のラタトフエリンを高 速液体クロマトグラフィにより分析したところ、ラタトフエリン約 6mgZmLに相当するピ ークが検出された。
一方、対照として裸のラタトフエリン (実施例 1において原料として使用したラクトフエ リン（タツァ'ミルク'バイオ口ジクス社）） lOmgを 10mM トリス塩酸緩衝液（pH7. 0) 1. OmLに溶解させ、 80°Cで 30分間加熱した。形成された沈澱を遠心分離で除去し た後、上清液のラタトフエリンを高速液体クロマトグラフィにより測定したところ、ラタトフ エリンのピークは殆ど検出されな力つた。また、沈殿物を 1M NaClで抽出して、抽出 液のラタトフエリンを高速液体クロマトグラフィにより測定したところ、ラタトフエリンのピ ークはほとんど検出されな力つた。
したがって、本発明のラタトフエリンと高分子電解質との複合体は、中性 PH付近で の加熱処理に対して安定であることが明らかになった。
[0058] 試験例 2 :胃液 PHでの安定件
実施例 1で製造したラタトフヱリン複合体 lgをモデル胃液 (0. 2%食塩、 70mM H Cl、 pHl. 2) lOOmLに分散させ、 37°Cで 2時間放置した後、上清液のラタトフエリン を高速液体クロマトグラフィにより測定した。その結果、ラタトフエリンの溶出によって 生じるピークは殆ど認められず、本発明のラタトフエリン複合体が胃液 pH中で安定で あることが確認された。
[0059] 試,験例 3 :ペプシン処理に針する安定件
実施例 3で製造したラタトフエリン複合体 0. 15gを市販のプレーンヨーグルト lOOg に添加し、ミキサー中で充分に攪拌混合した後、その 500mgを 1. 5mL容エツベンド ルフチューブにとり、 0. 4mgZmLペプシン溶液（ρΗ2) 500 /ζ Ι^をカ卩え、 37°Cで 30 分間処理した。その後、遠心分離（10, OOOrpm, 10分間）を行い、上清及び沈殿を それぞれ回収した。沈殿は 40mMデォキシコール酸 500 Lに分散させた。この沈 殿と上清とをサンプルとして SDS— PAGEを行い、ラタトフエリンの分解の有無を調 ベた。
その結果、本発明のラタトフエリン複合体はペプシンに対して安定であることが判明 した。対照として裸のラタトフエリン 0. lgに上記と同様の処理を行ったところ、 SDS- PAGEにお!/、てラタトフエリンの分解が認められた。
[0060] 試験例 4：ラクトフエリンの有効性及び安全性
5週齢の ICR系雄性マウス 16頭を無作為に 8頭ずつの 2群に分け、対照群にはラッ ト 'マウス用標準飼料（日本クレア製、 CE— 2)を与え、実験群には CE— 2に実施例 1 又は 2と同様にして製造したラタトフエリン複合体を 0. 2%添加した飼料を与え、それ ぞれ 4週間飼育した。この飼育期間中、 3日ごとに体重を測定した。
体重については、両群の間に有意差はな力つた。また、 4週間後の剖検時に秤量し た肝臓、脾臓、脾臓、小腸、盲腸、内臓脂肪及び副睾丸脂肪組織などの重量につい ても有意差はな力つた。さらに、単位体重あたりの体長及び腸の長さについても両群 の間に有意差はなかった。
血中成分について測定したところ、ラタトフエリン複合体の経口投与により、血中中 性脂肪値は 25% (Pく 0. 05)、血中遊離脂肪酸値は 30% (Pく 0. 05)、それぞれ 有意に低下していた。次に、血中コレステロール値を測定したところ、ラタトフヱリン素 材組成物を投与した実験群は、対照群と比べ血中総コレステロール値の上昇傾向が 認められたが、その上昇は HDLコレステロール力 0%上昇した（P< 0. 01)ためで あることが明らかになった。
以上の結果から、本発明のラタトフエリン素材組成物は生体に安全であり、少なくと も脂質代謝を改善するラ外フ リンの生理作用を少量で充分に発揮することが判明 した。
[0061] ¾施例 9 :ラ外フェリン—キサンタンガム複合体の製诰
ラタトフエリン (タツァ'ミルク'バイオ口ジクス社） 10gを 1Lの純水に溶解させた溶液 に、キサンタンガム（太陽ィ匕学 (株）） 5gを 500mLの純水に溶解させた溶液を加え、 3 0分間混合し、複合体を形成させた。得られたゲルをそのまま凍結乾燥機 (共和真空 技術 (株)）で乾燥させ、本発明のラ外フ リン複合体約 14gを得た。
[0062] mio 脂皙被蹬ラクトフエリン粉末及び脂皙被蹬キサンタンガム粉末 原料 す るラクトフエリン一キサンタンガム複合体の觀告
ナタネ硬化油（川研ファインケミカル (株)）でコーティングしたラタトフエリン及びキサ ンタンガムの混合粉末 (ラタトフエリン 60重量0 /0、キサンタンガム 30重量0 /0及びナタネ 硬化油 10重量％) 100gを、 0. 001Nクェン酸溶液 1Lを入れたミキサーに投入し、 攪拌'混合して、複合体を形成させた。得られたゲルをそのまま凍結乾燥機 (共和真 空技術 (株)）で乾燥させ、本発明のラ外フ リン複合体約 86gを得た。
[0063] 実施例 11：脂皙被膜ラクトフエリン粉末及び脂皙被膜アルギン酸ナトリウム粉末を原 料 するラクトフエリン—アルギン酸複合体の製造
ナタネ硬化油でコーティングしたラタトフエリン及びアルギン酸ナトリウム（ (株)キミ力 )の混合粉末 (ラタトフエリン 60重量0 /0、アルギン酸ナトリウム 30重量％及びナタネ硬 化油 10重量0 /0) 100gを、 0. 001Nクェン酸溶液 1Lを入れたミキサーに投入し、攪 拌 '混合して、複合体を形成させた。得られたゲルをそのまま凍結乾燥機 (共和真空 技術 (株)）で乾燥させ、本発明のラ外フ リン複合体約 87gを得た。
[0064] 実施例 12：脂皙被膜ラクトフエリン粉末及び脂皙被膜 CMCナトリウム粉末を原料 す るラクトフヱリン CMC複合体の製造
ナタネ硬化油でコーティングしたラタトフエリン及び CMCナトリウム (第一工業製薬 ( 株)）の混合粉末 (ラタトフヱリン 60重量％、 CMCナトリウム 30重量％及びナタネ硬化 油 10重量0 /0) 100gを、 0. 001Nクェン酸溶液 1Lを入れたミキサーに投入し、攪拌' 混合して、複合体を形成させた。得られたゲルをそのまま凍結乾燥機 (共和真空技 術 (株)）で乾燥させ、本発明のラ外フ リン複合体約 87gを得た。
[0065] 実施例 13 :脂皙被膜ラクトフェリン粉末及び脂皙被膜べクチン粉末を原料 するラク 卜フェリン ぺクチン複 ：の ¾告
ナタネ硬化油でコーティングしたラタトフエリン及びべクチン（ (株）三晶）の混合粉末 (ラタトフエリン 60重量％、ぺクチン 30重量％及びナタネ硬化油 10重量％) 100gを、 0. 001Nクェン酸溶液 1Lを入れたミキサーに投入し、攪拌'混合して、複合体を形 成させた。得られたゲルをそのまま凍結乾燥機 (共和真空技術 (株)）で乾燥させ、本 発明のラタトフエリン複合体約 87gを得た。
[0066] mi4 脂皙被蹬ラクトフエリン粉末、脂皙被蹬キサンタンガム粉末及び酴件可溶 大^タンパク皙 原料 するラクトフエリン—キサンタンガム—酸件可 大 ^タンパク 皙複 ：の ¾¾告
ナタネ硬化油（川研ファインケミカル (株)）でコーティングしたラタトフエリン及びキサ ンタンガムの混合粉末 (ラタトフエリン 60重量0 /0、キサンタンガム 30重量0 /0及びナタネ 硬化油 10重量％) 10gを、 lOOmLの 0. 001N乳酸溶液を入れたミキサーに投入し 、攪拌'混合して、二成分複合体を形成させた。次に、 5重量％酸性可溶大豆タンパ ク質 (不二製油 (株)）を含む 0. 001Nクェン酸溶液 lOOmLを加え、攪拌'混合して 三成分複合体 (ラタトフエリン—キサンタンガム—酸性可溶大豆タンパク質複合体)を 形成させた。得られた沈澱を遠心分離で回収し、凍結乾燥機 (共和真空技術 (株)） で乾燥させ、本発明のラタトフエリン複合体約 l lgを得た。
[0067] 実施例 15 :脂皙被膜ラクトフェリン粉末、脂皙被膜キサンタンガム粉末及びキトサンを 原料とするラクトフエリン キサンタンガム キトサン複合体の製造 ナタネ硬化油（川研ファインケミカル (株)）でコーティングしたラタトフエリン及びキサ ンタンガムの混合粉末 (ラタトフエリン 60重量0 /0、キサンタンガム 30重量0 /0及びナタネ 硬化油 10重量％) 10gを、 lOOmLの 0. 001N乳酸溶液を入れたミキサーに投入し 、攪拌'混合して、二成分複合体を形成させた。次に、 1重量％キトサン（(株)共和テ クノス）を含む 0. 001Nクェン酸溶液 lOOmLを加え、攪拌'混合して三成分複合体（ ラタトフエリン一キサンタンガム一キトサン複合体)を形成させた。得られた沈澱を遠心 分離で回収し、凍結乾燥機 (共和真空技術 (株)）で乾燥させ、本発明のラタトフ リン 複合体約 9gを得た。
[0068] 実施例 16 :脂皙被膜ラクトフェリン粉末、脂皙被膜べクチン粉末及びキトサンを原料 するラクトフエリン—ぺクチン—キトサン複合体の觀告
ナタネ硬化油でコーティングしたラタトフエリン及びべクチン（ (株）三晶）の混合粉末 (ラタトフエリン 60重量％、ぺクチン 30重量％及びナタネ硬化油 10重量％) 100gを、 0. 001Nクェン酸水溶液 1Lを入れたミキサーに投入し、攪拌'混合して、二成分複 合体 (ラタトフエリン—ぺクチン複合体)を形成させた。次に、 3重量％キトサン（(株） 共和テクノス）を含む 0. 001Nクェン酸溶液 1Lを加え、攪拌'混合して三成分複合体 (ラ外フェリン—ぺクチン—キトサン複合体)を形成させた。得られた沈澱を遠心分離 で回収し、凍結乾燥機 (共和真空技術 (株)）で乾燥させ、本発明のラタトフ リン複合 体約 90gを得た。
[0069] m :脂皙被蹬ラクトフエリン粉末、脂皙被蹬ぺクチン粉末及び酴件可嫁大^ タンパク質を原料とするラクトフエリン一ぺクチン一酸性可溶大豆タンパク質複合体の 製诰
ナタネ硬化油でコーティングしたラタトフエリン及びべクチン（ (株）三晶）の混合粉末
(ラタトフエリン 60重量％、ぺクチン 30重量％及びナタネ硬化油 10重量％) 100gを、 0. 001Nクェン酸水溶液 1Lを入れたミキサーに投入し、攪拌'混合して、二成分複 合体 (ラタトフエリン—ぺクチン複合体)を形成させた。次に、 5重量％酸性可溶大豆 タンパク質 (不二製油 (株)）を含む 0. 001Nクェン酸溶液 1Lを加え、攪拌'混合して 三成分複合体 (ラタトフエリン—ぺクチン—酸性可溶大豆タンパク質)を形成させた。 得られた沈澱を遠心分離で回収し、凍結乾燥機 (共和真空技術 (株) )で乾燥させ、 本発明のラタトフエリン複合体約 120gを得た。
[0070] 実施例 18 :脂皙被膜ラクトフェリン粉末、脂皙被膜べクチン粉末及び豆乳を原料 す るラクトフエリン含有顆粒の製造
ナタネ硬化油でコーティングしたラタトフエリン及びべクチン（ (株）三晶）の混合粉末 (ラタトフエリン 67重量％、ぺクチン 17重量％及びナタネ硬化油 16重量％) 450g、調 製豆乳粉末 (不二製油 (株)） 1, 560g、デキストリン 940g、及び賦形剤 50gを混合し 、流動層造粒装置 (フロイント産業 (株)）で造粒し、ラ外フェリン含有顆粒約 2, 700g を得た。
[0071] 試,験例 5 :腸溶件試,験
実施例 10で製造したラタトフエリン複合体 (ラタトフエリン含量: 60%) lOOmgをモデ ル胆汁（3重量％胆汁（和光純薬）、 50mM炭酸水素ナトリウム水溶液 (pH8) ) 10m Lに分散させ、 37°C、 1時間、処理を行った。遠心分離後、上清液のラタトフエリンを 高速液体クロマトグラフィで測定したところ、ラタトフエリン約 5. 9mgZmLに相当する ピークが検出された。対照として、ラタトフエリン複合体 lOOmgを pH6. 8 (リン酸緩衝 液） 10mLに分散させ、同様に処理を行い、上清液のラタトフヱリンを高速液体クロマ トグラフィで測定したところ、ラタトフエリンのピークは殆ど検出されな力つた。
したがって、本発明のラタトフエリンと高分子電解質との複合体は、中性 pH付近の 胆汁中ではラタトフエリンを遊離して腸溶性を示すが、胆汁を含まな!/、中性 pH付近 ではラタトフエリンを遊離せず、水不溶性であることが明らかになった。
[0072] 試験例 6 :耐熱件試験 (2)
実施例 10で製造したラタトフエリン複合体 lOmgをエツペンドルフチューブに取り、 1 OmM トリス塩酸緩衝液（pH7. 0) 1. OmLをカ卩え、ブロックヒーター（イワキ； THERM 0 Aし UMI BATH)を用いて、 75°Cで 30分間カロ熱した。カロ熱処理後、 10, 000rpm、 10分間の遠心分離を行い、沈澱をモデル胆汁に溶解させ、上清液のラタトフエリンを 高速液体クロマトグラフィにより測定したところ、ラタトフエリン約 4. 8mgZmL (回収率 ：約 80%)に相当するピークが検出された。
一方、対照として裸のラタトフエリン (実施例 9において原料として使用したラクトフエ リン（タツァ'ミルク'バイオ口ジクス社） 10mgを 1 OmM トリス塩酸緩衝液（pH7. 0) 1 . OmLに溶解させ、 75°C、 30分間加熱した。形成された沈澱を遠心分離で除去した 後、上清液のラタトフエリンを高速液体クロマトグラフィにより測定したところ、ラクトフエ リンのピークは殆ど検出されな力つた。また、沈澱をモデル胆汁で抽出し、抽出液の ラタトフエリンを高速液体クロマトグラフィにより測定したところ、ラタトフエリンのピーク は殆ど検出されな力つた。
したがって、本発明のラタトフエリンと高分子電解質との複合体は、中性 PH付近で の加熱処理に対して安定であり、腸溶性も維持されることが明らかになった。
[0073] 試験例 7：ラクトフエリンのペプシン分解における ΌΗ依存性試験
ラタトフエリン（タツァ'ミルク'バイオ口ジクス社） lOmgZmL又はペプシン 0. 4mg/ mLを含有する、 pH2. 0、 pH3. 0、 pH3. 5、 pH4. 0、 pH4. 5、 pH5. 0の溶液を 調製した。
各 pH毎に、ラタトフエリン溶液 500 μ Lにそれぞれの ρΗのペプシン溶液 500 μ Lを 加え、 37°C、 30分間、処理した。対照として、ペプシン溶液の代わりにペプシンを含 まない各 pH溶液を加え、同様に処理した。反応後、遠心分離を行い、上清中のラタ トフエリンを HPLCで測定した。
[0074] 同様に、実施例 16と同様にして製造したラタトフエリン一ぺクチン一キトサン複合体 lOOmgを、 pH2. 0、 pH3. 0、 pH3. 5、 pH4. 0、 pH4. 5、 pH5. 0の溶液 5mLに 分散させ、 pHを測定し、各 pHに調整した。これらの溶液に、 0. 4mgZmLのそれぞ れの pHのペプシン溶液 5mLをカ卩え、 37°C、 30分間、処理した。対照として、ぺプシ ン溶液の代わりに、ペプシンを含まない各 pH溶液をカ卩え、同様に処理した。反応後 、遠心分離を行い、上清液と沈澱を回収した。沈澱をモデル胆汁 10mLに溶解した 後、遠心分離を行い、上清液を回収した。上記試料中のラタトフエリン濃度を HPLC で測定した。
[0075] ペプシン処理におけるラタトフエリン残存率は、各 pHにおける対照のラタトフエリン 濃度に対するペプシン処理後の残存ラタトフヱリン濃度の比率から求めた。
結果を表 2及び図 1に示す。表 2及び図 1からわ力るように、裸のラタトフエリンは、 p H4以下ではペプシンによりほぼ完全に分解されるが、 pH4以上では分解が低減し、 pH5以上では殆どペプシンの作用を受けない。それに対し、本発明のラタトフエリン 複合体は、 pH3以下ではペプシンにより分解を受けるものの、 pH3以上においてべ プシンの作用を受け難ぐ特に、 pH3. 5以上では、ほとんどペプシン分解されないこ とが明らかになった。したがって、本発明のラタトフエリン複合体がペプシン耐性であ ることは明らかである。
[表 2] ラクトフエリン及びラクトフエリン複合体の
ペプシン分解における p H依存性試験
Figure imgf000025_0001
[0077] 試験例 8：ペプシン処理に対する安定性（2)
実施例 10で製造したラタトフヱリン複合体 50mgを 0. 2mg/mLペプシン溶液 (pH 3、塩酸） 5mLに分散させ、 37°C、 30分間、処理を行った。遠心分離後、沈澱をモデ ル胆汁で抽出し、抽出液のラタトフエリンを高速液体クロマトグラフィにより測定したと ころ、ラタトフエリン約 3. 6mgZmL (回収率約 60%)に相当するピークが得られた。 一方、裸のラタトフエリン粉末 50mgを 0. 2mg/mLペプシン溶液（pH3、塩酸） 5m Lに溶解させ、 37°C、 30分間、処理を行い、遠心分離後の上清液のラタトフエリンを 高速液体クロマトグラフィにより測定したところ、ラクトフエリンに相当するピークはほと んどなぐラタトフエリンはほとんど分解されていた。
したがって、本発明のラタトフエリンと高分子電解質との複合体に対しては、ぺプシ ンによるラタトフヱリンの分解が低減されること、及び複合体中のラタトフヱリンが胆汁 中で遊離することが明らかになった。
[0078] 試,験例 9 :耐熱件試,験 (3) 実施例 16で製造したラタトフエリン複合体 lOOmgをエツペンドルフチューブにとり、 0. 001Nクェン酸水溶液 lmLをカ卩え、ブロックヒーターを用いて、 75°C、 30分間、加 熱処理を行った。冷却後、遠心分離を行い、得られた沈澱にモデル胆汁 10mLを加 え、 37°C、 1時間、溶出を行った。その後、遠心分離を行い、上清液のラクトフ リン を高速液体クロマトグラフィにより測定したところ、ラタトフエリン約 3. 3mgZmL (回収 率： 72%)に相当するピークが得られた。
したがって、本発明のラタトフエリンと高分子電解質との複合体は、酸性領域での加 熱処理に対して安定であり、腸溶性も維持されることが明らかになった。
[0079] 試験例 10：ペプシン処理に対する安定性（3)
実施例 18で製造したラタトフエリン含有顆粒 lgに純水 4mLをカ卩え、懸濁させた後、 30分間放置し、 0. 4mgZmLペプシン溶液 (pH2、塩酸) 4mLをカ卩え、 37°C、 30分 間、処理を行った。遠心分離後、得られた沈澱にモデル胆汁 10mLを加え、 37°C、 1 時間、溶出を行った。その後、遠心分離を行い、上清液のラクトフ リンを高速液体ク 口マトグラフィにより測定したところ、ラタトフエリン 1. 8mgZmL (回収率： 72%)に相 当するピークが得られた。
したがって、本発明のラタトフエリン複合体を含有する顆粒に対しては、ペプシンに よるラタトフエリンの分解が低減されること、及び顆粒中のラタトフエリンが胆汁中で遊 離することが明らかになった。
[0080] 試,験 :ラットに: ける腸管吸収動能試験
8週齢の Wistar系雄性ラット 10頭を 5頭ずつ 2群に分け、対照群には裸のラクトフエ リンを生理食塩水に溶解して胃内投与し（300mgZkg)、実験群には実施例 18で製 造したラ外フェリン含有顆粒を生理食塩水に懸濁して胃内投与した (ラタトフエリンと して 30mgZkg)。投与 1時間前力も投与 4時間後まで 1時間ごとに胸管リンパ液及び 静脈血を採取し、 ELISA法にてラタトフエリンを定量した。
胸管リンパ液中に移行したラタトフヱリン総量を比較すると、対照群では、投与 1時 間後をピークに、その後暫時減少するのに対して、実験群では 4時間後まで高レべ ルを維持した。その結果、実験群における投与直後から 4時間後までの総量は、対 照群の約 2倍の値となった。ラタトフエリン含有顆粒の投与量が裸のラタトフエリンの 1 0分の 1であることから、ラタトフエリン含有顆粒は裸のラタトフエリンの約 20倍多ぐ腸 管から吸収されたことが明らかになった。
血漿中のラタトフエリンを測定したところ、対照群では 5例中 1例のみ、実験群では 5 例中 3例にぉ 、て、血漿中にラタトフエリンが検出された (約 50〜200ngZmLの濃 度)。
以上の結果から、本発明の複合体は、胃内での消化に抵抗性であり、小腸からのラ タトフェリンの吸収効率を向上させる効果があることが判明した。
[0081] 実施例 19 :ラクトフエリン一ぺクチン複合体 豆乳粉末 を原料 する萌粒形態の素 木ォ糸且 の 1¾告
実施例 13と同様にして製造したラタトフエリン一ぺクチン複合体 lOOg及び調整豆 乳粉末 (フジプロテインエンジニアリング (株)） lOOgをノヽィスピードミキサー (深江パ ゥテック (株)）に入れ、 25重量％ツエイン (昭和産業 (株)）を含む 84重量％エタノー ル溶液 (甘槽化学 (株)）（84重量％エタノール 75gにツエイン 25gを溶解したもの） 10 Ogを噴霧して造粒した。 40°C、 8時間、乾燥し、顆粒形態の素材組成物約 210gを得 た。
[0082] ¾ 列 20 :ラクトフエリンーキサンタンガム^!合体 ^ ¾,粉末 原料 する萌粒形能 のま の ¾告
実施例 9と同様にして製造したラタトフエリン一キサンタンガム複合体 lOOg及び調 整豆乳粉末 (フジプロテインエンジニアリング (株)） lOOgをノヽィスピードミキサー (深 江バウテック (株)）に入れ、 25重量％ツエイン (昭和産業 (株)）を含む 84重量％エタ ノール溶液 (甘槽ィ匕学 (株)） lOOgを噴霧して造粒した。 40°C、 8時間、乾燥し、顆粒 形態の素材組成物約 215gを得た。
[0083] 実施例 21 :ラクトフエリン一ぺクチン複合体 キトサン を原料 する萌粒形態の素材 糸且 の 1¾告
実施例 13と同様にして製造したラタトフエリン一ぺクチン複合体 lOOg及びキトサン（ (株）共和テクノス） lOOgをノ、イスピードミキサー (深江パゥテック (株)）に入れ、 25重 量％ツエイン (昭和産業 (株)）を含む 84重量％エタノール溶液 (甘槽化学 (株)） 100 gを噴霧して造粒した。 40°C、 8時間、乾燥し、顆粒形態の素材組成物約 21 lgを得 た。
[0084] 実施例 22 :ラ外フエリン一キサンタンガム複合体とキトサンとを原料とする廠粒形熊 の複合体の製诰
実施例 9と同様にして製造したラタトフエリン一キサンタンガム複合体 lOOgとキトサ ン（ (株）共和テクノス） lOOgをノ、イスピードミキサー (深江パゥテック (株)）に入れ、 25 重量％ツエイン (昭和産業 (株)）を含む 84重量％エタノール溶液 (甘槽化学 (株)） 1 OOgを噴霧して造粒した。 40°C、 8時間、乾燥し、顆粒形態の複合体約 210gを得た
[0085] 実施例 23 :ラ外フエリン一ぺクチン一キトサン複合体とキトサンとを原料とする廠粒形 のま の ¾告
実施例 16と同様にして製造したラタトフエリン一ぺクチン一キトサン複合体 lOOg及 びキトサン（ (株）共和テクノス） 1 OOgをノ、イスピードミキサー (深江パゥテック (株)）に 入れ、 25重量％ツエイン（昭和産業 (株)）を含む 84重量％エタノール溶液 (甘槽ィ匕 学 (株)） lOOgを噴霧して造粒した。 40°C、 8時間、乾燥し、顆粒形態の素材組成物 約 21 Ogを得た。
[0086] ¾施例 24 :ラクトフエリンーぺクチン キトサン複合体 ^ ¾,粉末 原料 する萌粒 のま の ¾告
実施例 16と同様にして製造したラタトフエリン一ぺクチン一キトサン複合体 lOOg及 び調製豆乳粉末 (フジプロテインエンジニアリング (株)） lOOgをノヽィスピードミキサー (深江バウテック (株)）に入れ、 25重量％ツエイン (昭和産業 (株)）を含む 84重量％ エタノール溶液 (甘槽ィ匕学 (株)） lOOgを噴霧して造粒した。 40°C、 8時間、乾燥し、 顆粒形態の素材組成物約 210gを得た。
[0087] 実施例 25 :ラ外フエリン一ぺクチン一キトサン複合体とキトサンとを原料とする粉末形 の 木ォ糸且 の 1¾告
実施例 16と同様にして製造したラタトフエリン一ぺクチン一キトサン複合体 lOOg及 びキトサン（ (株）共和テクノス） 1 OOgをノ、イスピードミキサー (深江パゥテック (株)）に 入れ、 30重量％シェラック（岐阜シェラック (株)）を含む無水エタノール溶液 (無水ェ タノール 70gにシェラック 30gを溶解したもの） 50gを噴霧して造粒した。 40°C、 8時間 、乾燥し、粉末形態の素材組成物約 210gを得た。
[0088] 実施例 26 :ラ外フエリン—ぺクチン—キトサン複合体とキトサンとを原料とする廠粒形 の 木ォ糸且 の 1¾告
実施例 16と同様にして製造したラタトフエリン一ぺクチン一キトサン複合体 lOOg及 びキトサン（ (株）共和テクノス） lOOgをノ、イスピードミキサー (深江パゥテック (株)）に 入れ、 30重量％シェラック（岐阜シェラック (株)）を含む無水エタノール溶液 lOOgを 噴霧して造粒した。 40°C、 8時間、乾燥し、顆粒形態の素材組成物約 210gを得た。
[0089] 試験例 12：ペプシン処理に対する安定性 (4)
実施例 9と同様にして製造したラタトフエリン一キサンタンガム複合体 lOOmgを pH3 . 5の溶液 5mLに分散させ、 pHを測定し、 pH3. 5に調整した。この溶液に 0. 4mg /mLペプシン溶液 (pH3. 5) 5mLをカ卩え、 37°C、 30分間、処理した。対照として、 ペプシン溶液の代わりに、 pH3. 5溶液を加え、同様に処理した。反応後、遠心分離 を行い、上清液と沈澱を回収した。沈澱をモデル胆汁 10mLに溶解した後、遠心分 離を行い、上清液を回収した。上記試料中のラタトフエリン濃度を HPLCで測定した。 その結果、 pH3. 5におけるペプシン処理に対するラタトフエリン複合体中のラタトフ エリン残存率は、約 80%であった。したがって、本発明のラタトフエリン複合体がぺプ シン而性であることが明らかになった。
[0090] この出願は、平成 16年 8月 10日出願の日本特許出願、特願 2004— 233347に基 づくものであり、特願 2004— 233347の明細書及び特許請求の範囲に記載された 内容は、すべてこの出願明細書に包含される。

Claims

請求の範囲
[1] ラタトフエリンと高分子電解質との複合体。
[2] 前記高分子電解質が、水溶液中で解離してポリア二オンを生成する高分子酸であ る、請求の範囲 1記載の複合体。
[3] 前記高分子電解質が、水溶液中で解離してポリカチオンを生成する高分子塩基を さらに含む、請求の範囲 2記載の複合体。
[4] 胆汁中でラクトフ リンが遊離しうる、請求の範囲 1〜3のいずれか 1項記載の複合体
[5] 前記高分子電解質が、カゼイン、ゼラチン、酸性卵白タンパク質類、酸性乳清タン パク質類、ポリ—L—グルタミン酸、カルボキシメチルセルロース、カラギーナン、アル ギン酸、フコィダン、硫酸ガラクタン、キサンタンガム、ぺクチン、アラビアガム、ポリア クリル酸、ポリメタクリル酸、ジエランガム、納豆菌ガム、大豆水溶性多糖類、寒天、デ ンプン、ファーセルラン、トラカントガム、へパリン、ヒアルロン酸、コンドロイチン、へパ ラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルスタ ーチ、カルボキシメチルアミロース、バターミルクパウダー、酸性可溶大豆タンパク質 類、豆乳、キトサン、グリコールキトサン、ポリリジン、ポリグルタミン、ポリアルギニン、 ポリエチレンィミン、ポリビニルァミン、及びそれらの塩力 なる群力 選択される 1種 又は 2種以上である、請求の範囲 1〜4のいずれか 1項記載の複合体。
[6] コロイド状沈殿物、ゾル、ゲル、粉末、カプセルに封入されて ヽる形態、錠剤、顆粒 、丸薬又は乳化懸濁液の形態である、請求の範囲 1〜5のいずれか 1項記載の複合 体。
[7] 脂質被膜でコーティングされたラタトフエリンを含有する粉末と脂質被膜でコーティ ングされた高分子電解質を含有する粉末とを水性溶液中に分散させて形成される、 請求の範囲 1〜5のいずれか 1項記載の複合体。
[8] 脂質被膜でコーティングされたラタトフエリンを含有する粉末と脂質被膜でコーティ ングされた高分子酸を含有する粉末とを水性溶液中に分散させ、混合した後、高分 子塩基の水性溶液を加えて形成される、請求の範囲 3〜5のいずれか 1項記載の複 合体。
[9] 請求の範囲 1〜8のいずれ力 1項記載の複合体を含むことを特徴とするラタトフエリ ン素材組成物。
[10] 塩基性物質と結合剤とを含む粉末又は顆粒の形態である、請求の範囲 9記載のラ タトフェリン素材組成物。
[11] 前記塩基性物質が、豆乳、キトサン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、炭 酸水素ナトリウム、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リジン、ダルコサミン、炭酸ナト リウムカもなる群力も選択される 1種又は 2種以上である、請求の範囲 10記載のラクト フェリン素材組成物。
[12] 前記結合剤が、ツエイン、シヱラック、水溶性大豆多糖類、カルボキシメチルセル口 ース、アルギン酸、グァーガム、カルボキシメチルェチルセルロースからなる群から選 択される 1種又は 2種以上である、請求の範囲 10又は 11記載のラタトフエリン素材組 成物。
[13] 請求の範囲 9〜 12のいずれ力 1項記載の素材組成物を、ラタトフエリンの生理活性 が発揮されるのに有効な量で含有する食品。
[14] 請求の範囲 9〜 12のいずれ力 1項記載の素材組成物を、ラタトフエリンの生理活性 が発揮されるのに有効な量で含有する医薬組成物。
[15] 請求の範囲 9〜 12のいずれ力 1項記載の素材組成物を、ラタトフエリンの生理活性 が発揮されるのに有効な量で含有する飼料。
[16] ラタトフヱリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフエリンを含有 する水性溶液と高分子電解質を含有する水性溶液とを、常温又は加熱下で混合し、 得られた複合体を回収することを特徴とする方法。
[17] ラタトフヱリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフエリンを含有 する水性溶液と高分子酸である高分子電解質を含有する水性溶液とを、常温又は加 熱下で混合し、次いで、高分子塩基である高分子電解質を含有する水性溶液を加え て、ラタトフエリンと高分子酸と高分子塩基との複合体を形成させ、得られた複合体を 回収することを特徴とする方法。
[18] ラタトフエリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフエリンと高分 子電解質とを含有する粉末を用意し、この粉末を水性溶液中に分散させて、常温又 は加熱下で混合して複合体を形成させ、得られた複合体を回収することを特徴とす る方法。
[19] ラタトフエリンと高分子電解質との複合体の製造方法であって、ラタトフエリンと高分 子酸である高分子電解質とを含有する粉末を用意し、この粉末を水性溶液中に分散 させて、常温又は加熱下で混合し、次いで、高分子塩基である高分子電解質を含有 する水性溶液又は粉末を加え、常温又は加熱下で混合して、ラタトフエリンと高分子 酸と高分子塩基との複合体を形成させ、得られた複合体を回収することを特徴とする 方法。
[20] 前記ラタトフエリンと高分子電解質とを含有する粉末を、常温又は加熱下で混合す ることにより用意する、請求の範囲 18又は 19記載の方法。
[21] 前記ラ外フェリンと高分子電解質とが、いずれも予め脂質被膜でコーティングされ ている、請求の範囲 18又は 19記載の方法。
[22] 脂質被膜でコーティングされたラタトフエリンを含有する粉末と脂質被膜でコーティ ングされた高分子電解質を含有する粉末とが、別々に又は混合された状態で容器に 含まれている、ラ外フェリンと高分子電解質との複合体を調製するための原料製品。
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