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WO2006011681A1 - 白血球培養用血液の保存方法、輸送方法、末梢血単核球の保存方法、輸送方法及びそれらを用いた白血球の培養方法 - Google Patents

白血球培養用血液の保存方法、輸送方法、末梢血単核球の保存方法、輸送方法及びそれらを用いた白血球の培養方法 Download PDF

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WO2006011681A1
WO2006011681A1 PCT/JP2005/014364 JP2005014364W WO2006011681A1 WO 2006011681 A1 WO2006011681 A1 WO 2006011681A1 JP 2005014364 W JP2005014364 W JP 2005014364W WO 2006011681 A1 WO2006011681 A1 WO 2006011681A1
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WO
WIPO (PCT)
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blood
culture
leukocyte culture
peripheral blood
leukocyte
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2005/014364
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hidemasa Jinguji
Atsutaka Noguchi
Shiho Sato
Kazutoshi Sato
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medinet Co Ltd
Original Assignee
Medinet Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Medinet Co Ltd filed Critical Medinet Co Ltd
Priority to JP2006527901A priority Critical patent/JPWO2006011681A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system

Definitions

  • Leukocyte culture blood storage method Leukocyte culture blood storage method, transport method, peripheral blood mononuclear cell storage method, transport method and leukocyte culture method using them Technical Field
  • the present invention relates to a method for preserving blood for leukocyte culture, a method for transporting blood for leukocyte culture, a method for preserving peripheral blood mononuclear cells, and a method for transporting peripheral blood mononuclear cells. Furthermore, the present invention relates to a method for culturing leukocytes using them.
  • cancer malignant neoplasm
  • immune cell therapy refers to collecting blood from a patient, separating and culturing leukocytes contained in the blood, activating and Z or proliferating the leukocytes, and activating and / or proliferating the leukocytes.
  • This refers to a therapy in which leukocytes (including those prepared by using activated and / or expanded leukocytes as an instillation) are returned to the patient's body.
  • leukocytes including those prepared by using activated and / or expanded leukocytes as an instillation
  • activated autolymphocyte therapy including activated lymphocytes including L AK cells (Lymphophocine Acivated K i 1 1 er cells)
  • dendritic cell vaccines include CTL therapy (Cytoto Xic TL ymphocyte) Therapy).
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for easily separating leukocytes from blood collected from a patient and storing and transporting or transporting them while maintaining high proliferation ability.
  • the purpose is to provide. Furthermore, it aims at providing the culture method using the said white blood cell.
  • the present invention by storing the blood for leukocyte culture at 16 to 22 ° C., it is possible to separate peripheral blood mononuclear cells after blood collection for 10 hours or more, especially 30 hours or more. It is possible to maintain a high proliferation ability.
  • it may be maintained with a normal thermostatic device, and when transported, it may be transported in a state of being placed in the thermostatic device.
  • the cold storage for maintaining the temperature of the present invention may be stored and Z or transported in a normally used cold storage box having excellent heat insulation.
  • blood collected from a patient may be subjected to an operation such as centrifugation in advance before storage to separate peripheral blood mononuclear cells.
  • Leukocytes in the present invention mean granulocytes such as eosinophils, basophils, and neutrophils; monocytes; lymphocytes such as T lymphocytes, B lymphocytes, and natural killer cells.
  • the leukocytes in the blood for culturing leukocytes preserved in this state maintain excellent separation and proliferation ability, including lymphocytes in immune cell therapy such as activated autolymphocyte therapy, dendritic cell vaccine, and CTL therapy. It is useful for the culture of leukocytes.
  • Figure 1 (a) shows the effect on the number of recovered cells at storage temperatures of 2 ° C, 6 ° C, 10 ° C, 14 ° C, 18 ° C, and 25, and Figure 1 (b) shows peripheral blood. Indicates the number of red blood cells mixed in the mononuclear cell fraction.
  • Figure 2 shows the effect on cell growth rates at 6 ° C, 10 ° C, 14 ° C, 18 ° C, and 25 ° C at storage temperature 2.
  • the vertical axis shows the magnification when the number of cells before culture is 1.
  • Figure 3 shows the effect on the number of recovered cells at storage temperatures of 16 and 18 ° (: 20 ° C, 22 ° C).
  • Figure 4 shows the effect on cell growth rate at storage temperatures of 16, 18 ° C, 20 ° C, and 22 ° C.
  • the vertical axis shows the magnification when the number of cells before culture is 1.
  • Figure 5 shows a storage temperature of 5 ° C for samples from which peripheral blood mononuclear cells were separated before storage. The number of recovered cells at 10 ° C, 15 ° C and 20 ° C is shown.
  • Figure 6 shows the cell growth rate at storage temperatures of 5 ° C, 10 ° C, 15 and 20 ° C for samples subjected to peripheral blood mononuclear cell separation before storage.
  • the vertical axis shows the magnification when the number of cells before culture is 1.
  • the collection method is not particularly limited, but a commonly used blood collection tube may be used.
  • peripheral blood mononuclear cells may be separated.
  • any method for separating nucleated cells from erythrocytes can be used as a method for separating peripheral blood mononuclear cells.
  • a method using a Ficoll pack (Ficol 1 -Paque) density gradient is generally used.
  • peripheral blood mononuclear cells By separating peripheral blood mononuclear cells, the storage temperature range described above is expanded to 5 to 22 ° C.
  • the isolated peripheral blood mononuclear cells may be suspended in any carrier as long as they are isotonic with cells, but are preferably suspended in autologous plasma.
  • lymphocytes are cultured.
  • the culture method is not particularly limited, and any culture method that is generally used in the field may be used, and when used for activated autolymphocyte therapy, a method using an anti-CD3 antibody and IL-12 is particularly preferable.
  • the anti-CD3 antibody may be added to the medium or immobilized on the culture vessel, but it is preferable to seed the lymphocytes on a culture vessel such as a flask in which the anti-D3 antibody is immobilized. It is preferable to add IL-12 so that the concentration in the medium is 100 to 2000 IU / mL.
  • Culture 34 ⁇ 38 ⁇ preferably at 37, 2-10%, preferably carried out at 5% of C0 2 conditions, the incubation period is from 1 day to 20 days, it is not preferable particularly about 1-2 weeks.
  • the medium that can be used is not particularly limited, but AIM-V medium (Invitrogen), RPM 1-1640 medium (Invitrogen), Dulbecco's modified Eagle medium (Invitrogen), Iskov medium (Invitrogen), KBM medium (Kohjin Bio), Commercially available media used for cell culture such as ALyS medium (Laboratory for Cell Science) can be used. If necessary, 5-20% bovine serum, fetal bovine serum, human serum, human plasma, etc. can be added.
  • the culture vessel is not particularly limited, and is usually for culture used in the field. Plates, petri dishes, flasks, bags, etc. can be used. The concentration for seeding each cell group can be freely set according to the situation.
  • the lymphocytes harvested after separation and culture from the collected blood are prepared as injections using commonly used carriers.
  • the carrier to be used is not particularly limited. For example, when it is prepared as an instillation agent, an isotonic solution such as physiological saline or PBS (phosphate buffered physiological saline) can be used. A serum component such as albumin may be added to the isotonic solution.
  • lymphocytes preserved in this state maintain a high viable cell rate and an IFN-a-producing cell rate, and are useful as an injection for immune cell therapy.
  • it is useful as an injection for use in immune cell therapy for cancer and Z or infection.
  • the separation of peripheral blood mononuclear cells from the collected blood is good and the proliferation is high. Can be maintained in a state.
  • the storage temperature range is expanded to 5 to 22 ° C while maintaining a high proliferative state.
  • lymphocytes obtained by culturing are stored and transported or transported at 0-6 ° C. This makes it possible to obtain lymphocytes that maintain a high viable cell rate and an IFN-producing cell rate while maintaining a high proliferative state. Therefore, in lymphocyte culture, there is an excellent effect by imposing different treatments on the sample blood before the culture and the lymphocytes obtained after the culture, and a more excellent effect can be obtained by combining these treatments.
  • the culture method used here may be cultured not only under the above-mentioned conditions but also under conditions generally known in lymphocyte culture.
  • lymphocyte LAK cell culture As described above, the case of lymphocyte LAK cell culture has been described in detail. However, other leukocytes may be cultured by a method generally known in the art. Example
  • vacutina CPT Blood was collected by Kuton (Dickinson).
  • the blood that entered the vacuum blood collection tube was stored at each temperature for 30 hours.
  • the number of collected cells was measured using a flow cytometer (Cytomics FC500: Beckman Cole Yuichi).
  • IL-2 is 280 I UZmL added to a cultured (37 ° C, C_ ⁇ 2: 5%) was performed.
  • the number of LAK cells after 7 days of culture was measured with a hemocytometer.
  • Figure la shows the number of T cells collected in peripheral blood mononuclear cell fractions from peripheral blood stored at 2, 6 ° C, 10 ° C, 14, 18 and 25 ° C for 30 hours.
  • b shows the number of red blood cells mixed in the peripheral blood mononuclear cell fraction.
  • Figure 2 shows LAK cells grown from peripheral blood mononuclear cells collected from peripheral blood stored at storage temperatures of 2 ° C, 6 ° C, 10 ° C, 14 ° C, 18 ° C, and 25 ° C for 30 hours. The growth rate was shown.
  • the storage temperature of LAK cells was 50 times at 18 ° C, 34 times at 14 ° C, and 20 times at others. When inducing LAK cells using stored blood, it was found that a storage temperature of around 18 is suitable.
  • Fig. 3 shows the number of T cells recovered from the peripheral blood stored for 30 hours at storage temperatures of 16 ° C, 18 ° C, 20, and 22 in the peripheral blood mononuclear cell fraction.
  • Figure 4 shows the proliferation rate of LA cells proliferated from peripheral blood mononuclear cells collected from peripheral blood stored at storage temperatures of 16 ° C, 18 ° C, 20 and 22 ° C for 30 hours.
  • 7.5 ml of peripheral blood was collected from a healthy donor into a vacuum blood collection tube (Baccutina CPT: Becton 'Dickinson').
  • Peripheral blood mononuclear cells were stored in autologous plasma for 30 hours at each temperature. The number of collected cells was measured using a flow cytometer (Cytomics FC 500: Beckman Cole).
  • IL-2 is 280 IU / was added to a mL culture (37 ° C, C0 2: 5%) was.
  • LAK cells The number of cells (LAK cells) after 8 days of culture was measured with a hemocytometer.
  • Figure 5 shows the number of sputum cells recovered from samples that were isolated from peripheral blood mononuclear cells before storage and stored at storage temperatures of 5 ° C, 10 ° C, 15 ° C, and 2 ° C for 30 hours.
  • Fig. 6 shows the proliferation rate of LAK cells grown from samples that were isolated from peripheral blood mononuclear cells before storage and stored at storage temperatures of 5, 10 ° C, 15, and 20 ° C for 30 hours.
  • LAK cell proliferation in samples from which peripheral blood mononuclear cells were isolated before storage was found to be 5 to 20 ° C, and the dependence on storage temperature was low.
  • the method of the present invention provides a method for easily separating leukocytes from blood and preserving and / or transporting them while maintaining high proliferation ability. It has an excellent effect as a method for storing and / or transporting blood for lymphocyte culture in therapy. In addition, high proliferation can be expected by culturing leukocytes isolated from these lymphocyte culture blood.

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Abstract

本発明方法は、患者から採取した血液より容易に白血球を分離することができ、かつ、高い増殖能を維持したまま保存及び／又は輸送するための方法を提供するものであり、免疫細胞療法における白血球培養用血液の保存及び／又は輸送方法として優れた効果を有する。また、上記方法で保存及び／又は輸送された白血球を用いた培養方法を提供する。本発明によれば、白血球培養用血液を１６～２２℃で保存することにより、採血後、１０時間以上、とりわけ、３０時間以上経過しても末梢血単核球の分離性が良く、かつ、高い増殖能を維持することが可能となる。また、保存前に末梢血単核球を分離した場合には保存及び／または輸送に適当な温度域が５～２２℃となる。

Description

白血球培養用血液の保存方法、 輸送方法、 末梢血単核球の保存方法、 輸送方 法及びそれらを用いた白血球の培養方法 技術分野
本発明は白血球培養用血液の保存方法、 白血球培養用血液の輸送方法、 末梢 血単核球の保存方法及び末梢血単核球の輸送方法に関する。 更には、 それらを 用いた白血球の培養方法に関する。 背景技術
日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物 （以下、 癌という） が挙げられ る。 癌の治療法としては、 三大療法と言われる外科療法、 化学療法、 放射線療 法があるが、 夫々治療の困難性や副作用等といった問題がある。
近年、 上記三大療法の他に癌の新しい治療法として免疫細胞療法が行われて おり、 この免疫細胞療法は、 上記の三大療法のような治療の困難性や副作用と いった問題が少ないため注目されている。 また、 免疫細胞療法は、 感染症、 と りわけ、 ウィルス感染症に対する新たな治療法としても注目されている。
ここで、 免疫細胞療法とは、 患者から血液を採取し、 その血液中に含まれる 白血球を分離して培養し、 その白血球を活性化及び Z又は増殖させ、 その活性 化及び/又は増殖させた白血球 （活性化及び/又は増殖させた白血球を点滴剤 として調製したものも含む） を患者の体内に戻す療法のことをいう。 例えば活 性化自己リンパ球療法 （活性化自己リンパ球には L AK細胞 （L ym p h o k i n e A c t i v a t e d K i 1 1 e r細胞）を含む）、樹状細胞ワクチン、 C T L療法 （C y t o t o X i c T L y m p h o c y t e療法） 等が挙げ られる。
この免疫細胞療法を行うためには、 白血球を埼養する細胞培養施設を備えて いる必要があるが、 全国各地の医療機関 （以下、 病院等という） がその施設を 備えているわけではない。 そこで、 細胞培養施設を備えていない病院等でも免 疫細胞療法を容易に行うためには、 病院等から細胞培養施設まで白血球培養用 血液を輸送し、 白血球の培養を行った後、 点滴剤として調製し細胞培養施設か ら病院等へ輸送する必要がある。
また、 輸送を伴わない場合でも、 患者の体内へ戻すスケジュール等によって は、 予め、 患者から採取した白血球培養用血液を一定時間保存しておくことが 必要となる場合がある。 その場合、 保存及び 又は輸送後の白血球培養用血液からの白血球の分離性 及び培養増殖性を維持させる必要があった。
しかしながら、 一般に、 血液の保存及び Zまたは輸送については、 輸血に用 いられる全血、 赤血球又は血小板の保存温度が知られているのみである。 発明の開示
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、 患者から採取した血液より 容易に白血球を分離することができ、 かつ、 高い増殖能を維持したまま保存及 び Z又は輸送するための方法を提供することを目的とする。 更には、 上記白血 球を用いた培養方法を提供することを目的とする。
本発明によれば、 白血球培養用血液を 1 6〜2 2 °Cで保存することにより、 採血後、 1 0時間以上、 とりわけ、 3 0時間以上経過しても末梢血単核球の分 離が良く、 かつ、 高い増殖能を維持することが可能となる。 上記温度を保つに は、 通常の恒温機器で維持すれば良く、 また、 輸送する場合は、 前記恒温機器 に入れた状態で輸送すれば良い。 簡単な方法としては、 断熱性の優れた通常使 用されている保冷箱に本発明の温度を維持するための保冷剤を入れて保存及び Z又は輸送すれば良い。 また、 患者から採取した血液は、 保存前に、 予め、 遠 心分離等の操作に付し、 末梢血単核球を分離しておいても良い。
本発明における白血球とは、 好酸球、 好塩基球、 好中球等の顆粒球；単球； Tリンパ球、 Bリンパ球、 ナチュラルキラー細胞等のリンパ球等を意味する。 この状態で保存した白血球培養用血液中の白血球は優れた分離性と増殖能を 維持しており、 活性化自己リンパ球療法、 樹状細胞ワクチン、 C T L療法等の 免疫細胞療法におけるリンパ球をはじめとする白血球の培養に有用である。 図面の簡単な説明'
図 1 ( a ) は保存温度 2 °C、 6 °C、 1 0 °C、 1 4 °C、 1 8 °C、 2 5 の回収 細胞数に対する影響を示し、 図 1 ( b ) は末梢血単核球画分に混入した赤血球 数を示す。
図 2は保存温度 2で、 6 °C、 1 0 °C、 1 4 °C、 1 8 °C、 2 5 °Cの細胞増殖率 に対する影響について示す。 縦軸は培養前の細胞数を 1としたときの倍率を示 す。
図 3に保存温度 1 6で、 1 8 ° (：、 2 0 °C、 2 2 °Cの回収細胞数に対する影響 について示す。
図 4に保存温度 1 6 、 1 8 °C、 2 0 °C、 2 2 °Cの細胞増殖率に対する影響 について示す。 縦軸は培養前の細胞数を 1としたときの倍率を示す。
図 5に保存前に末梢血単核球分離を行ったサンプルに対する保存温度 5 °C、 10°C、 15°C, 20°Cにおける回収細胞数を示す。
図 6に保存前に末梢血単核球分離を行つたサンプルに対する保存温度 5 °C、 10°C、 15 、 20°Cにおける細胞増殖率を示す。 縦軸は培養前の細胞数を 1としたときの倍率を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施形態について説明する。
癌及び/又は感染症等の患者から血液を採取する。 採取方法は特に限定され ないが、 通常使用される採血管で良い。
ここで末梢血単核球分離を行つても良い。 末梢血単核球分離を行う方法とし ては一般的に有核細胞を赤血球から分離するいかなる方法を用いることもでき る。 例えばフィコールパック （F i c o l 1 -P a q u e) 密度勾配を利用す る方法等が一般的に使用される。
末梢血単核球を分離しておくことにより、 先に述べた保存温度範囲が 5〜 2 2°Cに広がる。 分離した末梢血単核球は細胞と等張である担体であればいずれ の担体に懸濁しても良いが、 自己血漿に懸濁することが好ましい。
次いで、 保冷箱に 16〜22t:が担保できるよう保冷剤と共に血液の入った 採血管を入れ、 保存及び Z又は輸送する。
その後、 血液を分離し （予め、 末梢血単核球を分離している場合は、 この操 作は不要） リンパ球を培養する。 培養方法は特に限定されないが、 通常当該分 野で汎用されている培養方法であればよく、 活性化自己リンパ球療法に用いる 場合、 とりわけ、 抗 CD3抗体及び I L一 2を用いた方法が好ましい。
抗 CD 3抗体は培地中に添加しても、 培養容器に固相化してもよいが、 抗 D 3抗体を固相化したフラスコ等の培養容器にリンパ球を播種することが好ま しい。 I L一 2の濃度は培地中に 100〜2000 I U/mLの濃度となるよ うに添加することが好ましい。
培養は、 34〜38Τλ 好ましくは 37でで、 2〜10%、 好ましくは 5% の C02条件下で行い、 培養期間は 1日〜 20日、 特に 1〜2週間程度が好まし い。
使用できる培地は特に限定されないが、 AIM— V培地（インビ卜ロジェン）、 RPM 1 - 1640培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（ィ ンビトロジェン）、 イスコフ培地 （インビトロジェン）、 KBM培地 （コージン バイオ)、 ALyS培地 （細胞科学研究所） 等細胞培養に使用されている市販の 培地を使用することができる。 また、 必要に応じて 5〜20 %の牛血清、 牛胎 児血清、 ヒト血清、 ヒト血漿等を添加することができる。
培養容器は特に限定されるものではなく、 通常当該分野で使用される培養用 プレート、 シャーレ、 フラスコ、 バッグ等を利用することができる。 各々の細 胞群を播種する濃度は実施する状況に応じて自由に設定することができる。 このように採取した血液から分離 ·培養後ハーべストされたリンパ球を、 通 常使用される担体を用いて、 注射剤として調製する。 用いられる担体としては 特に限定されないが、 例えば、 点滴剤として調製する場合、 生理食塩水、 P B S (リン酸緩衝生理食塩水） 等の等張化液が挙げられる。 なお、 等張化液に血 清成分例えばアルブミン等を添加してもよい。
次いで、 保冷箱に 0〜 6 °Cが担保できるよう保冷剤と共に点滴剤等の注射剤 を入れ、 保存及び Z又は輸送する。
この状態で保存したリンパ球は高い生細胞率及び I F N—ァ産生細胞率を維 持しており、 免疫細胞療法に用いる注射剤として有用である。 とりわけ、 癌及 び Z又は感染症に対する免疫細胞療法に用いる注射剤として有用である。
本発明では、 上記した通り、 採取した血液を 1 6〜2 2 °Cで保存及び/又は 輸送することにより、 採取した血液からの末梢血単核球の分離性が良く、 かつ 増殖性が高い状態で維持することができる。 一方、 採取した血液から予め末梢 血単核球を分離すると、 増殖性が高い状態で維持しながら保存温度範囲が 5〜 2 2 °Cに広がる。
このような増殖性が高い状態で維持される末梢血単核球を用い、 培養して得 られたリンパ球を 0〜6 °Cで保存及び Z又は輸送する。 これによつて、 増殖性 が高い状態で維持されたまま、 高い生細胞率及び I F N—ァ産生細胞率を維持 するリンパ球を得ることができる。 従って、 リンパ球培養において、 培養前の 試料血液と培養後に得られるリンパ球に異なる取扱いを課すことによって優れ た効果があり、 更に、 これらの取扱いの組み合わせによってより優れた効果を あげることができる。
なお、 ここで用いられる培養方法は、 上記した条件のみならず、 リンパ球培 養で通常知られた条件で培養すれば良い。
以上、 リンパ球の L AK細胞培養の場合について詳説したが、 他の白血球に ついても、 通常、 当該分野で知られている方法で培養すれば良い。 実施例
以下、 実施例を用いて本発明を詳細に説明する。 ただし、 本発明がこれに限 定されるものでないことはいうまでもない。 実施例 1
<回収細胞数、 細胞増殖率に対する保存温度の影響 >
健常人ドナーより末梢血 7 . 5 m lを真空採血管 （バキュティナ C P T :ベ クトン 'ディッキンソン) に採血した。
真空採血管に入った血液を各温度にて 30時間保存した。
その後、 1時間室温に放置し、 遠心分離 （1710Xg、 20m i n.) によ りヒ卜末梢血単核球を分離した。
回収された細胞数をフローサイトメ一ター （Cy t om i c s FC 50 0 ：ベックマンコール夕一） を用いて測定した。
上記の末梢血単核球を抗 CD 3抗体 （オルソクローン：ヤンセンファーマ） 固相化フラスコ （住友べ一クライト） 中にて培地 （KBM400 ：コージンバ ィォ） を用い、 I L— 2が 280 I UZmLとなるように添加し培養（37°C、 C〇2： 5%) を行った。
培養 7日後の LAK細胞数を血球計算盤にて測定した。
1 ) 保存温度 2 、 6 °C、 10 °C、 14 °C、 18 °C、 25°Cの影響
図 l aに保存温度 2 、 6°C、 10°C, 14で、 18で、 25 °Cで 30時間 保存した末梢血から末梢血単核球画分に回収された T細胞数を、 図 1 bに末梢 血単核球画分に混入した赤血球数をそれぞれ示した。
保存温度 2 、 6°C、 25°Cでは回収 T細胞数は多かったが、 赤血球の混入 率が高い結果であった。 赤血球の混入を少なく T細胞を回収するには 10°C〜 18 °C程度での保存が適していることが明らかとなつた。
図 2に保存温度 2 °C、 6 °C、 10 °C、 14 °C、 18 °C、 25 °Cで 30時間保 存した末梢血から回収した末梢血単核球より増殖させた L A K細胞の増殖率を 示した。
7日間の培養によって LAK細胞は保存温度 18°Cが 50倍、 14°Cが 34 倍、 他は 20倍程度となった。 保存血液を用いて LAK細胞を誘導する場合、 保存温度 18 付近が適していることが明らかとなつた。
2) 保存温度 16 、 18°C、 20t、 22°C、 の影響
図 3に保存温度 16 °C、 18°C、 20 、 22 で 30時間保存した末梢血 から末梢血単核球画分に回収された T細胞数を示した。
回収細胞数は保存温度 20°Cが多く、 赤血球の混入については各条件ともに 少ないことが明らかとなつた。
図 4に保存温度 16°C、 18°C, 20 、 22°Cで 30時間保存した末梢血 から回収した末梢血単核球より増殖させた L A K細胞の増殖率を示した。
いずれの条件においても培養 7日後の LAK細胞増殖率に大きな差はないこ とが明らかとなった。
このように、 末梢血単核球の分離 ·回収性及び LAK細胞の増殖率を考慮す ると、 保存血液を用いて LAK細胞を誘導する場合、 16°C〜22°Cの温度域 でのリンパ球培養用血液の保存が最も効果的であることが明らかとなった。 実施例 2
ぐ保存前に末梢血単核球分離を行った場合の回収細胞数、 細胞増殖率に対する 保存温度の影響 >
健常人ドナーより末梢血 7. 5mlを真空採血管 （バキュティナ CPT :ベ クトン 'ディッキンソン） に採血した。
その後、 遠心分離 （1710 Xg、 20m i n.) によりヒト末梢血単核球を 分離した。
末梢血単核球を自己血漿に浮遊させた状態で各温度にて 30時間保存した。 回収された細胞数をフローサイトメ一夕一 （Cy t om i c s FC 50 0 ：ベックマンコール夕一） を用いて測定した。
上記の末梢血単核球を抗 CD 3抗体 （オルソクローン：ヤンセンファーマ） 固相化フラスコ （住友べ一クライト） 中にて培地 （KBM400 ：コージンバ ィォ）を用い、 I L— 2が 280 I U/mLとなるように添加し培養（37°C、 C02： 5%) を行った。
培養 8日後の細胞 （LAK細胞） 数を血球計算盤にて測定した。
図 5に保存前に末梢血単核球分離を行い、 保存温度 5 °C、 10°C、 15°C、 2 ΟΤで 30時間保存したサンプルから回収された Τ細胞数を示した。
保存前に末梢血単核球分離を行ったサンプルにおける回収 Τ細胞数は、 5〜 20 で保存温度の依存性が低いことが明らかとなつた。
図 6に保存前に末梢血単核球分離を行い保存温度 5 、 10°C、 15 、 2 0°Cで 30時間保存したサンプルより増殖させた LAK細胞の増殖率を示した。 保存前に末梢血単核球分離を行つたサンプルにおける L AK細胞増殖性は 5 〜 20 °Cで保存温度の依存性が低いことが明らかとなつた。
このように、 保存前に末梢血単核球を分離しておくと、 保存に適当な温度域 が 5〜22°Cに広がることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
以上説明したように、 本発明方法は、 血液から容易に白血球を分離すること ができ、 かつ、 高い増殖能を維持したまま保存及び/又は輸送するための方法 を提供するものであり、 免疫細胞療法におけるリンパ球培養用血液の保存及び /又は輸送方法として優れた効果を有するものである。 また、 これらのリンパ 球培養用血液から分離された白血球を培養することにより、 高い増殖が期待で きる。

Claims

請求の範囲
I . 白血球培養用血液を 1 6〜2 2 °Cで保存することを特徴とする白血球培養 用血液の保存方法。
2 . 前記白血球培養用血液が、 癌及び/又は感染症患者由来の血液であること を特徴とする請求項 1記載の白血球培養用血液の保存方法。
3 . 前記白血球培養用血液が、 リンパ球培養用血液であることを特徴とする請 求項 1又は請求項 2記載の白血球培養用血液の保存方法。
4. 白血球培養用血液を 1 6〜2 2 °Cで輸送することを特徴とする白血球培養 用血液の輸送方法。
5 . 前記白血球培養用血液が、 癌及び Z又は感染症患者由来の血液であること を特徴とする請求項 4記載の白血球培養用血液の輸送方法。
6 . 前記白血球培養用血液が、 リンパ球培養用血液であることを特徴とする請 求項 4又は請求項 5記載の白血球培養用血液の輸送方法。
7 . 白血球培養用血液に対し末梢血単核球分離を行い、 分離した末梢血単核球 を 5〜2 2 °Cで保存することを特徴とする白血球培養用末梢血単核球の保 存方法。
8 . 前記白血球培養用血液が、 癌及び/又は感染症患者由来の血液であること を特徴とする請求項 7記載の白血球培養用末梢血単核球の保存方法。
9 . 前記白血球培養用血液が、 リンパ球培養用血液であることを特徴とする請 求項 7又は請求項 8記載の白血球培養用末梢血単核球の保存方法。
1 0 . 白血球培養用血液に対し末梢血単核球分離を行い、 分離した末梢血単核 球を 5〜 2 2 °Cで輸送することを特徴とする白血球培養用末梢血単核球 の輸送方法。
I I . 前記白血球培養用血液が、 癌及び/又は感染症患者由来の血液であるこ とを特徴とする請求項 1 0記載の白血球培養用末梢血単核球の輸送方法。
1 2 . 前記白血球培養用血液が、 リンパ球培養用血液であることを特徴とする 請求項 1 0又は請求項 1 1記載の白血球培養用末梢血単核球の輸送方法。
1 3 . 白血球培養において、 使用する末梢血単核球が、 1 6〜2 2 °Cで保存及 び/又は輸送された白血球培養用血液から分離された末梢血単核球であ るか、 若しくは白血球培養用血液から末梢血単核球分離した後、 5〜2 2 で保存及び Z又は輸送された末梢血単核球であることを特徴とする 白血球培養方法。
1 4. 白血球培養において、 1 6〜2 2 で保存及び Z又は輸送された白血球 培養用血液から分離された末梢血単核球、 又は白血球培養用血液から予 め末梢血単核球を分離した後 5〜 2 2 で保存及び Z又は輸送された末 梢血単核球を抗 C D 3抗体及び 1 0 0〜 2 0 0 0 1 UZmLの I L一 2 存在下に、 34〜38°Cで 2〜10 %の C02条件下で 1〜20日培養す ることを特徴とする請求項 13記載の白血球培養方法。
15. 前記末梢血単核球を用いてリンパ球培養を行った後、 得られたリンパ球 を 0〜 6でで保存及び Z又は輸送することを特徴とする請求項 13又は 請求項 14に記載の白血球培養方法。 ' .
16. 前記白血球培養用血液が、 癌及び Z又は感染症患者由来の血液であるこ とを特徴とする請求項 13〜請求項 15いずれかの項記載の白血球培養 方法。
17. 前記白血球が、 リンパ球であることを特徴とする請求項 13〜請求項 1 6いずれかの項記載の白血球培養方法。
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