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WO2006000275A1 - Verfahren zur herstellung von biochips aus porösen substraten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von biochips aus porösen substraten Download PDF

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WO2006000275A1
WO2006000275A1 PCT/EP2005/005056 EP2005005056W WO2006000275A1 WO 2006000275 A1 WO2006000275 A1 WO 2006000275A1 EP 2005005056 W EP2005005056 W EP 2005005056W WO 2006000275 A1 WO2006000275 A1 WO 2006000275A1
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WO
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rod
porous substrate
shaped
pores
mask
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2005/005056
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English (en)
French (fr)
Inventor
Stephan Dertinger
Thomas Haneder
Alfred Martin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Infineon Technologies AG
Original Assignee
Infineon Technologies AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Infineon Technologies AG filed Critical Infineon Technologies AG
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the present invention relates to a method for the production of biochips from porous substrates, wherein the biological-chemical substances used in a corresponding assay as probes or capture molecules are first applied to the pore surfaces of a relatively long, rod-shaped, porous substrate, which subsequently into small finished Biochips is isolated.
  • the homogeneity of the individual chips can be improved and the production speed can be increased.
  • Porous substrates are due to their advantageous optical and fluid properties very well as a substrate for DNA and protein microarrays.
  • biochemical substances > 100
  • DNA, antibodies and proteins The biological substances are usually dissolved in a suitable buffer and applied spot by spot in a sequential process on the surface of the porous substrate by means of dispensing technique. Due to the sequential nature of this process is very time consuming. However, especially for high spot count arrays, it is desirable to parallelize the dispensing process.
  • the biological-chemical substance by various "spotting u such as reservoir needle, pin-and-ring or Piezobacter in which a biochemical substance such as a previously synthesized oligonucleotide as a microdroplets deposited locally on the substrate surface is, applied.
  • a biochemical substance such as a previously synthesized oligonucleotide as a microdroplets deposited locally on the substrate surface is, applied.
  • the spotting can be parallelized by the use of several such needles. However, this places higher demands on the logistics of the substances to be mocked.
  • Another problem is the homogeneity of the spots. For many needles, it can not be ensured that the amounts of liquid deposited are identical for all needles.
  • Another approach to achieving higher throughput is to use a miniaturized dispensing head that can deposit up to 384 spots simultaneously (see WO 01/62377).
  • Each dispensing nozzle is connected to a reservoir via a hose.
  • the technical effort for example, to align the substrate and Dispensierkopf plan-parallel to each other (minimizing the wedge error), however, is extremely high. In case of insufficient adjustment, no reproducible and homogeneous spots are available.
  • the present invention is therefore based on the object to enable a method which overcomes the above problems.
  • methods are provided, which are characterized in that the biological-chemical substances used in a corresponding assay as probes or catcher molecules are first applied to the pore surfaces of a rod-shaped porous substrate, which is then singulated into small, finished biochips. By doing so, the homogeneity of the individual biochips can be improved and the production speed can be increased.
  • a method of manufacturing a plurality of discrete biochips from a rod-shaped, porous substrate comprising the steps of: (i) providing a rod-shaped porous substrate having pores with a diameter in the range of between 1 ⁇ m and 100 microns and has a cross-sectional area which corresponds to the dimensions of a single biochip to be manufactured; (ii) coating the pore surfaces of the rod-shaped porous substrate with chemical molecules acting as catcher molecules, and (iii) slicing the rod-shaped porous substrate so as to obtain singulated, finished biochips having a thickness in the range of 100 to 1,000 ⁇ m.
  • the macroporous substrate used in step (i) preferably has a pore diameter of 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, more preferably 1 to 20 ⁇ m.
  • the distance from the center of the pore to the center of the pore (pitch), ie, two adjacent or adjacent pores, is usually 1 to 100 ⁇ m, preferably 2 to 12 ⁇ m.
  • the pore density is usually in the range of 10 4 to 10 8 / cm 2 .
  • the length of the rod-shaped porous substrate is not subject to any specific limitation, but is usually in the range of about 1 cm to 30 cm for process reasons.
  • the cross-sectional area of the rod-shaped, porous substrate corresponds to the dimensions of a single biochip to be manufactured and is therefore usually 1 cm ⁇ 1 cm.
  • the pores may be in hexagonal or square arrangement. Further, the pores may be designed, for example, substantially round or elliptical.
  • the material of the rod-shaped porous substrate may in particular be selected from silica, alumina, glass or macroporous silicon, the latter being particularly preferred.
  • step (ii) the coating of the pore surfaces of the rod-shaped, porous substrate takes place with chemical-biological compounds or biomolecules acting as catcher molecules.
  • the site-specific attachment of such chemical-biological compounds or biomolecules to the pore surfaces is usually carried out by means of dispensing techniques, possibly assisted by pumping techniques.
  • a solution of biomolecules can be charged or filled by utilizing at least one needle or needle assembly into the pores of the substrate employed by utilizing the capillary force.
  • an excess of liquid may be charged through the pore opening with a needle or instrument having a multiplicity of such needles and liquids so that this pore fills with liquid through the capillary action.
  • the liquid can be removed by applying overpressure to the pore opening.
  • biomolecules which are coupled or bound site-specifically to the pore surfaces in step (ii) in particular DNA, RNA, PNA (in the case of nucleic acids and their chemical derivatives, eg single strands, triplex structures or combinations thereof can be present), saccharides, peptides , Proteins (eg antibodies, antigens, receptors), derivatives of combinatorial chemistry (eg organic molecules), cell components (eg organelles), cells, multicellular cells and cell aggregates. If the finished biochip is to be used in the context of an EIA or ELISA, in particular specific antibodies are used as biomolecules.
  • oligonucleotides or DNA molecules to the substrate material can be via linker molecules according to the methods commonly used in the art, for example by treating the porous substrate material when using epoxy silanes as linker molecules by subsequent reaction of the terminal epoxy groups with terminal primary amino groups or thiol groups of oligonucleotides or DNA molecules which act as immobilized or fixed capture molecules for the target molecules present in the analyte of interest in corresponding analysis methods.
  • the oligonucleotides which can be used as catcher molecules can be synthesized using the synthesis strategy as described in Tet. Let. 22, 1981, pages 1859-1862.
  • the oligonucleotides can be derivatized during the preparation process either at the 5 or the 3-terminal position with terminal amino groups.
  • Another way of attaching such capture molecules to the inner wall surfaces of the pores can be carried out by first exposing the substrate to a chlorine source such as Cl 2 , SOCl 2 , COCl 2 or (COCl) 2 , optionally using a free radical initiator such as peroxides, azo compounds or Bu 3 SnH, and then with a corresponding nucleophilic compound, in particular with oligonucleotides or DNA molecules having terminal primary amino groups or thiol groups are reacted (see WO 00/33976).
  • a chlorine source such as Cl 2 , SOCl 2 , COCl 2 or (COCl) 2
  • a free radical initiator such as peroxides, azo compounds or Bu 3 SnH
  • step (iii) the then finished biochips are separated by sawing the rod-shaped, porous substrate so that individual, finished biochips having a thickness in the range from 100 to 1000 .mu.m, preferably 250 to 450 .mu.m are obtained.
  • the thus functionalized, rod-shaped, porous substrate can be placed on a sawing foil stretched in a sawing frame, such as, for example, a MylarO foil commonly used for such purposes, after which the Sawing out the individual chips from the rod-shaped substrate according to conventional techniques.
  • the slicing sawing has the consequence that advantageously no biological molecules are immobilized on the cut edges (top and bottom of the chips) in contrast to "spotted" porous substrates.
  • the sawing process should be compatible with the biological coating. This can be achieved, for example, by filling the pores before sawing with substances which do not attack the surface, can be washed out completely again from the pores after sawing by a solvent, but nevertheless in the sawing process, the surface in the pores before shegewasser and particles protects.
  • Suitable substances for this purpose are, for example, long-chain polyalkylene glycols, in particular polyethylene glycol (PEG) and polyvinyl alcohols.
  • the rod-shaped porous substrate having pores in the range of between 1 .mu.m and 100 .mu.m and a cross-sectional area of, for example, 1 cm x 1 cm, which corresponds to the later biochip dimensions, and a length of, for example, between 1 cm to 30 cm, in step (ii) are fluidly contacted by a fluidic mask at the two permeable end faces of the rod-shaped, porous substrate (see Figure 1).
  • the fluidic mask ensures that areas in array array are sealed against each other. Each area of the face can be covered with different substances.
  • the oligonucleotides provided as catcher molecules are then synthesized directly in the pores, whereby the synthesis takes place simultaneously in the pores of the entire rod and thus on many "chips.”
  • the rod-shaped, porous substrate is then separated again in slices, if only relatively small Spot densities are required, a large number of biochips can be made in parallel with this method, which improves both the cost and the homogeneity of the biochip.
  • the 5 rod-shaped, porous substrates can be connected directly to an oligosynthesizer (eg provided for phosphoramidite synthesis chemistry).
  • Another embodiment of the present invention provides for LO to locally prevent synthesis in the pores by occluding the pore, i. to close the pores locally and in a defined manner, so that no synthesis reagent can enter the pores. At the hidden place then no synthesis takes place.
  • the rod-shaped, porous substrate having pores L5 in the range of between 1 .mu.m and 100 .mu.m and a cross-sectional area of, for example, 1 cm x 1 cm, which corresponds to the later biochip dimensions, and a length of for example between 1 cm to 30 cm, in step (ii) are covered with a suitably configured mask. This -0 mask locally prevents chemical substances from entering the pores.
  • oligonucleotides by sequentially placing masks in locally different regions.
  • a corresponding surface-structured mask 25 made of elastomeric material can be brought into contact with the end face of the rod-shaped, macroporous substrate.
  • the mask may be made of a flexible plastic such as an elastomeric material compatible with synthetic chemistry (deprotecting agent, oxalic acid in water in the Case of phosphoroaraidite chemistry).
  • the elastomeric material is selected from polydialkylsiloxanes, polyurethanes, polyimides and crosslinked novolak resins. More preferably, the elastomeric material is polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PDMS has a low surface energy and is chemically inert.
  • PDMS is homogeneous, isotropic and optically transparent up to 300 nm.
  • the mask can contain holes (shadow mask) (see FIG. 2 a) or have a relief structure (stamp) (see FIG. 2 b), which respectively covers specific pores or pore areas.
  • the substrate-inclined surface of the mask should have a flexible layer that is biocompatible and fluid-tight, which can be achieved, for example, with the use of PDMS as the mask material.
  • the layer must cover the surface in conformity, but must not close the holes.
  • Such a stamp or mold or mask made of elastomeric material having a relief structure for example, by Replica molds can be prepared by casting the liquid polymer precursor of an elastomer over a template (Master) with a correspondingly predetermined surface relief structure, as is known from soft lithography; See, for example, Xia et al., Angewandte Chemie, 1998, 110, pages 568 to 594.
  • a stamp mask with relief structure can be a kind of closed capillary structure or at least parts of channels or capillaries, the at least one inlet and after passing at least a pore, preferably a portion of pores, having an outlet.
  • the mask can be structured such that the channels formed are straight or meander-shaped and continuous or comb-shaped.
  • oligonucleotides provided as catcher molecules are then synthesized again directly in the now accessible pores, whereby the synthesis takes place simultaneously in the pores of the entire rod and thus on many "chips.” Subsequently, the rod-shaped porous substrate is again separated in slices.
  • a method of making a plurality of discrete biochips from a porous substrate comprising the steps of: (a) adjusting stacking a plurality of porous substrates in the range of 100 to 1000 microns to a rod-shaped macroporous substrate; (b) reversibly connecting the individual substrates by Annealing the rod-shaped macroporous substrate produced at a temperature in the range of 80 0 C to 200 0 C; (c) coating the pore surfaces of the rod-shaped porous substrate formed in step (b) with chemical-biological compounds functioning as catcher molecules, and (d) mechanically dicing the rod-shaped porous substrate such that finished biochips having a thickness in the range of 100 to 1,000 microns are obtained.
  • the substrates or individual chips used in step (a) preferably have a pore diameter of from 1 .mu.m to 50 .mu.m, more preferably from 1 to 20 .mu.m.
  • the distance from the center of the pore to the center of the pore (pitch), ie, two adjacent or adjacent pores, is usually 1 to 100 ⁇ m, preferably 2 to 12 ⁇ m.
  • the pore density is usually in the range of 10 4 to 10 8 / cm 2 .
  • the length of the rod-shaped porous substrate produced therefrom is not specifically limited, but is usually in the range of about 1 cm to 30 cm for process reasons.
  • the cross-sectional area of the individual substrates or chips, and thus also of the rod-shaped porous substrate, corresponds to the dimensions of a single biochip to be manufactured and is therefore usually 1 cm ⁇ 1 cm.
  • the pores may be in hexagonal or square arrangement. Further, the pores may be designed, for example, substantially round or elliptical.
  • the material may for example be selected from silica, alumina, glass or macroporous silicon.
  • steps (a) and (b) polished single chips are reversibly bonded to a bar.
  • the chips are stacked adjusted and connected by a tempering process.
  • the holding forces of the bond connection are low (only Hydrogen bonds, Van der Waals forces), so that the connection can be released again without mechanical damage.
  • the connection of the individual chips achieved by the annealing process must only fluidically seal to ensure that no liquid runs between the individual chips.
  • Fig. 1 shows schematically the contacting of a rod-shaped substrate used according to the invention with a fluidic mask, by which it is achieved that areas of the chip can be addressed separately fluidly.
  • Fig. 2 shows schematically the embodiment according to the invention, wherein the rod-shaped substrate is covered with a mask, 5 in order to achieve that the catcher molecule compounds get locally into the pores determined by the mask, wherein Fig. 2a, the provision of a mask with through holes (shadow mask ) and Fig. 2b show the provision of a stamp mask.
  • FIG. 1 shows how a rod-like porous substrate (10) with pores (11) used according to the invention is in fluidic contact with a fluidic mask (20) at its two end faces (12). Disposed on one of the fluidic masks (20) are separate supply lines (30) for individual, 5 determined pore areas, through which Different biomolecule solutions can be directed. Each region of the end face can be covered by the supply lines (30) with different substances or biomolecules. In addition, the fluidic mask ensures that regions in array arrangement are sealed against each other.
  • the oligonucleotides provided as catcher molecules can also be synthesized directly in the pores, whereby the synthesis takes place simultaneously in the pores of the entire rod and thus on many "chips.”
  • the rod-shaped, porous substrate is then separated again in slices.
  • the rod-shaped, porous substrate (10) via leads (30) to an oligo-synthesizer (not shown) are connected.
  • FIG. 2 a shows the arrangement of a shadow mask (50), while FIG. 2 b) shows the arrangement of a stamp mask with a relief structure (51) on a rod-shaped porous substrate (10) with pores (11) used in accordance with the invention.
  • a stamp mask with a relief structure (51) on a rod-shaped porous substrate (10) with pores (11) used in accordance with the invention depending on the mask pattern thereby locally pores or areas of pores are closed, so that no synthesis reagent or biomolecules (40) can get into these pores or, while other pores or areas of pores site-specific with the surface coating Biomolecules are provided. Subsequently, the rod-shaped, porous substrate is again separated by slices.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Biochips aus porösen Substraten, worin die in einem entsprechenden Assay als Sonden bzw. Fängermoleküle eingesetzten biologisch-chemischen Substanzen zunächst auf die Porenoberflächen eines relativ langen, stabförmigen, porösen Substrats aufgebracht werden, das anschließend in kleine fertige Biochips vereinzelt wird. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann die Homogenität der einzelnen Chips verbessert und die Fertigungsgeschwindigkeit erhöht werden.

Description

Verfahren zur Herstellung von Biochips aus porösen Substraten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Biochips aus porösen Substraten, worin die in einem entsprechenden Assay als Sonden bzw. Fängermoleküle eingesetzten biologisch-chemischen Substanzen zunächst auf die Porenoberflächen eines relativ langen, stabförmigen, porösen Substrats aufgebracht werden, das anschließend in kleine fertige Biochips vereinzelt wird. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann die Homogenität der einzelnen Chips verbessert und die Fertigungsgeschwindigkeit erhöht werden.
Poröse Substrate eignen sich aufgrund ihrer vorteilhaften optischen und fluidischen Eigenschaften sehr gut als Substrat für DNA- und Protein-Mikroarrays. Technisch aufwendig ist dabei aber das Aufbringen einer großen Anzahl von biologisch- chemischen Substanzen (> 100) wie z.B. DNA, Antikörper und Proteine. Die biologischen Substanzen werden in der Regel in einem geeigneten Puffer gelöst und Spot für Spot in einem sequentiellen Prozeß auf die Oberfläche des porösen Substrats mittels Dispensiertechnik aufgebracht. Durch die sequentielle Natur ist dieser Prozeß sehr zeitintensiv. Besonders für Arrays mit hoher Spotanzahl ist es jedoch wünschenswert, den Dispensierprozeß zu parallelisieren.
Bisher wird die biologisch-chemische Substanz durch verschiedene „Spotting-Verfahrenu wie z.B. Reservoir-Nadel-, Pin-and-Ring- oder Piezoverfahren, bei der eine biologisch¬ chemische Substanz wie z.B. ein zuvor synthetisiertes Oligonukleotid als Mikrotropfen lokal auf der Substratfläche abgesetzt wird, aufgebracht. Auf jedem Chip werden nacheinander verschiedene Spots abgesetzt. Das Spotten kann durch die Verwendung von mehreren solcher Nadeln parallelisiert werden. Dies stellt aber an die Logistik der zu spottenden Substanzen höhere Anforderungen. Ein weiteres Problem ist die Homogenität der Spots. Bei vielen Nadeln kann nicht sichergestellt werden, daß die abgesetzten Flüssigkeitsmengen bei allen Nadeln identisch sind.
Ein weiterer Ansatz, zu höherem Durchsatz zu gelangen, ist die Verwendung eines miniaturisierten Dispensierkopfes, der bis zu 384 Spots gleichzeitig absetzen kann (siehe WO 01/62377) . Jede einzelne Dispensierdüse ist über einen Schlauch mit einem Reservoir verbunden. Der technische Aufwand, um beispielsweise Substrat und Dispensierkopf plan-parallel zueinander auszurichten (Minimierung des Keilfehlers) , ist jedoch außerordentlich hoch. Bei nur unzureichender Justierung sind keine reproduzierbaren und homogenen Spots erhältlich.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu ermöglichen, welches die vorstehenden Probleme überwindet.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die in einem entsprechenden Assay als Sonden bzw. Fängermoleküle eingesetzten biologisch-chemischen Substanzen zunächst auf die Porenoberflächen eines stabförmigen porösen Substrats aufgebracht werden, das anschließend in kleine, fertige Biochips vereinzelt wird. Durch diese Vorgehensweise kann die Homogenität der einzelnen Biochips verbessert und die Fertigungsgeschwindigkeit erhöht werden. In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von einzelnen Biochips aus einem stabförmigen, porösen Substrat bereitgestellt, umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen eines stabförmigen porösen Substrats, das Poren mit einem Durchmesser im Bereich von zwischen 1 μm und 100 μm und eine Querschnittsfläche aufweist, welche den Abmessungen eines zu fertigenden, einzelnen Biochips entspricht; (ii) Beschichten der Porenoberflächen des stabförmigen porösen Substrats mit als Fängermoleküle fungierenden chemisch¬ biologischen Verbindungen, und (iii) scheibenweise Sägen des stabförmigen porösen Substrats derart, daß vereinzelte, fertige Biochips mit einer Dicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm erhalten werden.
Das in Schritt (i) eingesetzte makroporöse Substrat weist vorzugsweise einen Porendurchmesser von 1 μm bis 50 μm, mehr bevorzugt 1 bis 20 μm auf. Der Abstand von Porenmitte zu Porenmitte (Pitch) , d.h. zweier zueinander benachbarter bzw. angrenzender Poren beträgt üblicherweise 1 bis 100 μm, vorzugsweise 2 bis 12 μm. Die Porendichte liegt üblicherweise im Bereich von 104 bis 108/cm2. Die Länge des stabförmigen porösen Substrats unterliegt keiner spezifischen Beschränkung, liegt aber aus Prozeßgründen üblicherweise im Bereich von ca. 1 cm bis 30 cm. Die Querschnittsfläche des stabförmigen, porösen Substrats entspricht den Abmessungen eines zu fertigenden, einzelnen Biochips und beträgt insofern üblicherweise 1 cm x 1 cm. Die Poren können in hexagonaler oder quadratischer Anordnung vorliegen. Ferner können die Poren beispielsweise im wesentlichen rund oder ellipsenförmig gestaltet sein. Das Material des stabförmigen porösen Substrats kann insbesondere aus Siliziumoxid, Aluminiumoxid, Glas oder makroporösem Silizium ausgewählt werden, wobei letzteres besonders bevorzugt ist.
In Schritt (ii) erfolgt das Beschichten der Porenoberflächen des stabförmigen, porösen Substrats mit als Fängermoleküle fungierenden chemisch-biologischen Verbindungen bzw. Biomolekülen. Das ortsspezifische Anbinden von solchen chemisch-biologischen Verbindungen bzw. Biomolekülen an die Porenoberflächen erfolgt üblicherweise mittels Dispensiertechniken, gegebenenfalls durch Pumptechniken unterstützt. So kann in Schritt (ii) eine Lösung von Biomolekülen unter Ausnutzen der Kapillarkraft mittels mindestens einer Nadel oder Nadelanordnung in die Poren des eingesetzten Substrats beschickt bzw. gefüllt werden. Beispielsweise kann ein Überschuss an Flüssigkeit mit einer Nadel oder einem Instrument, welches eine Multiplizität solcher Nadeln und Flüssigkeiten aufweist, über die Porenöffnung so beschickt werden, dass sich diese Pore durch die Kapillarwirkung mit Flüssigkeit füllt. Nach der gewünschten Reaktionszeit kann die Flüssigkeit durch Anlegen von Überdruck an die Porenöffnung entfernt werden.
Als Biomoleküle, die in Schritt (ii) ortsspezifisch an die Porenoberflächen gekoppelt bzw. gebunden werden, kommen insbesondere DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z.B. Einzelstränge, Triplex- Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen) , Saccharide, Peptide, Proteine (z.B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren) , Derivate der kombinatorischen Chemie (z.B. organische Moleküle) , Zellbestandteile (z.B. Organellen) , Zellen, Mehrzeller sowie Zellverbände in Frage. Soll der fertige Biochip im Rahmen eines EIA oder ELISA verwendet werden, so werden als Biomoleküle insbesondere spezifische Antikörper verwendet. Das Anbinden bzw. Koppeln der Fängermoleküle wie insbesondere Oligonukleotide bzw. DNA-Moleküle an das Substratmaterial kann über Linkermoleküle nach den im Stand der Technik üblichen Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels Behandeln des porösen Substratmaterials bei Verwendung von Epoxysilanen als Linkermoleküle durch anschließende Reaktion der terminalen Epoxidgruppen mit terminalen primären Aminogruppen oder Thiolgruppen von Oligonukleotiden bzw. DNA- Molekülen, die in entsprechenden Analyseverfahren als immobilisierte bzw. fixierte Fängermoleküle für die im zu untersuchenden Analyten vorliegenden Zielmoleküle fungieren. Dabei können beispielsweise die als Fängermoleküle verwendbaren Oligonukleotide unter Verwendung der Synthesestrategie, wie in Tet. Let. 22, 1981, Seiten 1859 bis 1862, beschrieben, hergestellt werden. Die Oligonukleotide können dabei während des Herstellungsverfahrens entweder an der 5-oder der 3- Endstellung mit terminalen Aminogruppen derivatisiert werden. Eine weitere Möglichkeit der Anbindung solcher Fängermoleküle an die Innenwandoberflächen der Poren kann durchgeführt werden, indem das Substrat zunächst mit einer Chlorquelle, wie Cl2, SOCl2, COCl2 oder (COCl)2, gegebenfalls unter Verwendung eines Radikalinitiators wie Peroxide, Azoverbindungen oder Bu3SnH, behandelt wird und anschließend mit einer entsprechenden nucleophilen Verbindung, wie insbesondere mit Oligonukleotiden bzw. DNA-Molekülen, die terminale primäre Aminogruppen oder Thiolgruppen aufweisen, umgesetzt werden (siehe WO 00/33976) .
In Schritt (iii) erfolgt die Vereinzelung der dann fertigen Biochips durch scheibenweise Sägen des stabförmigen, porösen Substrats, so daß vereinzelte, fertige Biochips mit einer Dicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm, vorzugsweise 250 bis 450 μm erhalten werden. Das derart funktionalisierte, stabförmige, poröse Substrat kann auf eine in einem Sägerahmen gespannte Sägefolie, wie z.B. eine für derartige Zwecke üblicherweise verwendete MylarO-Folie, angeordnet werden, wonach das Aussägen der einzelnen Chips aus dem stabförmigen Substrat gemäß üblichen Techniken erfolgt. Das scheibenweise Sägen hat zur Folge, daß auf den Schnittkanten (Ober- und Unterseite der Chips) im Gegensatz zu „gespotteten" porösen Substraten vorteilhafterweise keine biologischen Moleküle immobilisiert sind.
Der Sägeprozeß sollte kompatibel zu der biologischen Beschichtung sein. Dies kann beispielsweise durch das Füllen der Poren vor dem Sägen mit Substanzen erreicht werden, welche die Oberfläche nicht angreifen, nach dem Sägen durch ein Lösungsmittel wieder vollständig aus den Poren ausgewaschen werden können, aber dennoch im Sägeprozeß die Oberfläche in den Poren vor Sägewasser und Partikeln schützt. Geeignete Substanzen hierfür sind beispielsweise langkettige Polyalkylenglykole wie insbesondere Polyethylenglykol (PEG) und Polyvinylalkohole.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das stabförmige poröse Substrat mit Poren im Bereich von zwischen 1 μm und 100 μm und einer Querschnittsfläche von beispielsweise 1 cm x 1 cm, welche den späteren Biochip-Abmessungen entspricht, und einer Länge von beispielsweise zwischen 1 cm bis 30 cm, in Schritt (ii) durch eine fluidische Maske an den beiden durchlässigen Stirnflächen des stabförmigen, porösen Substrats fluidisch kontaktiert werden (siehe Figur 1) . Die fluidische Maske stellt sicher, daß Bereiche in Array-Anordnung gegeneinander abgedichtet werden. Jeder Bereich der Stirnfläche kann mit unterschiedlichen Substanzen belegt werden. Die als Fängermoleküle vorgesehenen Oligonukleotide werden dann direkt in den Poren synthetisiert, wobei die Synthese in den Poren des ganzen Stabs und damit auf vielen „Chips" gleichzeitig stattfindet. Anschließend wird das stabförmige, poröse Substrat wieder scheibenweise getrennt. Wenn nur eher relativ geringe Spotdichten erforderlich sind, kann mit dieser Methode eine große Anzahl von Biochips parallel hergestellt werden, was sowohl die Kosten als auch die Homogenität der Biochips verbessert. In besonders vorteilhafter Weise können die 5 stabförmigen, porösen Substrate direkt an einen Oligo- Synthesizer (z.B. vorgesehen für Phosphoramidit-Synthesechemie) angeschlossen werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht LO vor, in den Poren lokal die Synthese zu verhindern, indem die Pore verschlossen wird, d.h. die Poren lokal und definiert zu verschließen, so daß kein Synthesereagenz in die Poren gelangen kann. An der verdeckten Stelle findet dann keine Synthese statt. Hierzu kann das stabförmige, poröse Substrat mit Poren L5 im Bereich von zwischen 1 μm und 100 μm und einer Querschnittsfläche von beispielsweise 1 cm x 1 cm, welche den späteren Biochip-Abmessungen entspricht, und einer Länge von beispielsweise zwischen 1 cm bis 30 cm, in Schritt (ii) mit einer entsprechend konfigurierten Maske bedeckt werden. Diese -0 Maske verhindert lokal, daß chemische Substanzen in die Poren gelangen. Damit ist es beispielsweise auch möglich, durch sequenzielles Auflegen von Masken in lokal unterschiedlichen Bereichen unterschiedliche Oligonukleotide zu synthetisieren. Hierzu kann eine entsprechend oberflächenstrukturierte Maske 25 aus elastomerem Material in Kontakt mit der Stirnfläche des stabförmigen, makroporösen Substrats gebracht werden. Bei einseitiger Aufbringung eines Flüssigkeitstropfens einer Lösung von Biomolekülen breitet sich die Flüssigkeit durch Kapillarkräfte in den durch die Maskenstruktur determinierten i0 Poren aus.
Die Maske kann zum Beispiel aus einem flexiblen Kunststoff wie einem elastomeren Material sein, das kompatibel zu der Synthesechemie (Entschützungsreagenz, Oxalsäure in Wasser im Fall der Phosphoraraidit-Chemie) ist. Vorzugsweise ist das elastomere Material aus Polydialkylsiloxanen, Polyurethanen, Polyimiden und vernetzten Novolak-Harzen ausgewählt. Mehr bevorzugt ist das elastomere Material Polydimethylsiloxan (PDMS) . PDMS weist eine geringe Oberflächenenergie auf und ist chemisch inert. Zudem ist PDMS homogen, isotrop und bis 300 nm optisch transparent.
Es sind verschiedene Ausführungsformen unter Variierung der Maskenfläche und der Chipfläche anwendbar. So kann die Maske Löcher enthalten (Lochmaske) (siehe Fig. 2a) oder eine Reliefstruktur (Stempel) (siehe Fig. 2b) aufweisen, welche jeweils bestimmte Poren bzw. Porenbereiche abdeckt. Bei der Löchervariante sollte die dem Substrat zugeneigte Oberfläche der Maske eine flexible Schicht besitzen, die biokompatibel ist und fluidisch abdichtet, was beispielsweise bei der Verwendung von PDMS als Maskenmaterial erreicht werden kann. Die Schicht muß die Oberfläche konform abdecken, darf aber die Löcher nicht verschließen. Ein Vorteil besteht darin, daß die Maskenfläche relativ klein ist, und somit ein kompletter Maskensatz für ein 30mer (ca. 100 verschiedene Masken) auf einem einzigen 150 mm Substrat untergebracht werden kann.
Werden nämlich beispielsweise 100 Chips pro stabförmigen Substrat vorgesehen, so können, insofern die Fluidikmasken die Dimension eines Chips aufweisen, leicht 100 Masken, die für die Synthese notwendig sind, auf einem „Maskenwafer" untergebracht werden. Anders sieht es bei planaren Substraten aus. Um 100 Chips herzustellen, die sich auf einem einzigen 6" Wafer befinden, sind 100 Stück 6" Masken notwendig. Die Herstellung solcher Masken ist jedoch teuer, da jeder Fluidikmaske eine lithographische Maske zugrunde liegt.
Ein solcher Stempel bzw. Gußform bzw. Maske aus elastomerem Material mit einer ReliefStruktur kann beispielsweise durch Replikatformen hergestellt werden, indem der flüssige Polymervorläufer eines Elastomers über eine Vorlage (Master) mit einer entsprechend vorbestimmten Oberflächenreliefstruktur gegossen wird, wie es aus der Softlithographie bekannt ist; siehe z.B. Xia et al., Angewandte Chemie, 1998, 110, Seiten 568 bis 594. Durch das Aufbringen einer solchen Stempelmaske mit ReliefStruktur kann eine Art geschlossener Kapillarstruktur bzw. mindestens Teile von Kanälen bzw. Kapillaren, die mindestens einen Einlass und nach Durchlaufen mindestens einer Pore, vorzugsweise eines Bereichs von Poren, einen Auslass aufweisen, erzeugt werden. Die Maske kann so strukturiert sein, daß die gebildeten Kanäle dabei gerade oder mäanderförmig sowie durchgehend oder kammartig geformt sind.
Es ist auch möglich, auf die Stirnflächen des stabförmigen Substrates eine strukturierte Dichtung aufzubringen, die benachbarte Bereiche des Substrats fluidisch entkoppelt. Die Maske wird dann auf die Dichtung gepresst und verhindert, daß chemische Substanzen lokal nicht in die Poren gelangen können.
Die als Fängermoleküle vorgesehenen Oligonukleotide werden dann wieder direkt in den nunmehr zugänglichen Poren synthetisiert, wobei die Synthese in den Poren des ganzen Stabs und damit auf vielen „Chips" gleichzeitig stattfindet. Anschließend wird das stabförmige poröse Substrat wieder scheibenweise getrennt.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von einzelnen Biochips aus einem porösen Substrat bereitgestellt, umfassend die Schritte: (a) justiertes Aneinanderstapeln einer Vielzahl von porösen Substraten bzw. Chips mit einer Einzeldicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm zu einem stabförmigen makroporösen Substrat; (b) reversibles Verbinden der einzelnen Substrate durch Tempern des erzeugten stabförmigen makroporösen Substrats bei einer Temperatur im Bereich von 80 0C bis 2000C; (c) Beschichten der Porenoberflächen des in Schritt (b) erzeugten stabförmigen, porösen Substrats mit als Fängermoleküle fungierenden chemisch-biologischen Verbindungen, und (d) mechanisches Vereinzeln des stabförmigen, porösen Substrats derart, daß fertige Biochips mit einer Dicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm erhalten werden.
Die in Schritt (a) eingesetzten Substrate bzw. vereinzelten Chips weisen vorzugsweise einen Porendurchmesser von 1 μm bis 50 μm, mehr bevorzugt 1 bis 20 μm auf. Der Abstand von Porenmitte zu Porenmitte (Pitch) , d.h. zweier zueinander benachbarter bzw. angrenzender Poren beträgt üblicherweise 1 bis 100 μm, vorzugsweise 2 bis 12 μm. Die Porendichte liegt üblicherweise im Bereich von 104 bis 108/cm2. Die Länge des daraus erzeugten stabförmigen porösen Substrats unterliegt keiner spezifischen Beschränkung, liegt aber üblicherweise aus Prozeßgründen im Bereich von ca. 1 cm bis 30 cm. Die Querschnittsfläche der einzelnen Substrate bzw. Chips und damit auch des stabförmigen porösen Substrats entspricht den Abmessungen eines zu fertigenden, einzelnen Biochips und beträgt insofern üblicherweise 1 cm x 1 cm. Die Poren können in hexagonaler oder quadratischer Anordnung vorliegen. Ferner können die Poren beispielsweise im wesentlichen rund oder ellipsenförmig gestaltet sein. Das Material kann beispielsweise aus Siliziumoxid, Aluminiumoxid, Glas oder makroporösem Silizium ausgewählt sein.
In den Schritten (a) und (b) werden somit polierte Einzelchips reversibel zu einem Stab gebondet . Dazu werden die Chips justiert gestapelt und durch einen Temperprozeß verbunden. Die Haltekräfte der Bondverbindung sind gering (nur Wasserstoffbrücken, Van der Waals Kräfte) , so daß die Verbindung ohne mechanische Beschädigung wieder gelöst werden kann. Die durch den Temperprozeß erreichte Verbindung der einzelnen Chips muß nur fluidisch abdichten, um 5 sicherzustellen, daß keine Flüssigkeit zwischen die einzelnen Chips läuft.
Nach der Synthese oder Beschichtung mit Biomolekülen, wie oben beschrieben, erfolgt dann die mechanische Vereinzelung des LO Stapels in Einzelchips.
Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß nach der biologischen Beschichtung bzw. der Immobilisierung der Fängermoleküle der Sägeprozeß entfallen kann. L5 Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt schematisch das Kontaktieren eines erfindungsgemäß eingesetzten stabförmigen Substrats mit einer fluidischen 20 Maske, durch welche erreicht wird, daß Bereiche des Chips getrennt fluidisch adressiert werden können.
Fig. 2 zeigt schematisch die erfindungsgemäße Ausführungsform, worin das stabförmige Substrat mit einer Masken abgedeckt wird, 5 um zu erreichen, daß die Fängermolekülverbindungen lokal in die durch die Maske determinierten Poren gelangen, wobei Fig. 2a das Vorsehen einer Maske mit durchgehenden Löchern (Lochmaske) und Fig. 2b das Vorsehen einer Stempelmaske zeigen.
0 In Figur 1 ist gezeigt, wie ein erfindungsgemäß eingesetztes stabfδrmiges poröses Substrat (10) mit Poren (11) mit einer fluidischen Maske (20) jeweils an dessen beiden Stirnflächen (12) fluidisch kontaktiert ist. An einer der fluidischen Masken (20) sind getrennte Zuleitungen (30) für einzelne, 5 determinierte Porenbereiche vorgesehen, durch welche unterschiedliche Biomolekül.Lösungen geleitet werden können. Jeder Bereich der Stirnfläche kann über die Zuleitungen (30) mit unterschiedlichen Substanzen bzw. Biomolekülen belegt werden. Zudem stellt die fluidische Maske sicher, daß Bereiche in Array-Anordnung gegeneinander abgedichtet sind. Beispielsweise können mit einer solchen Anordnung dann auch die als Fängermoleküle vorgesehenen Oligonukleotide direkt in den Poren synthetisiert werden, wobei die Synthese in den Poren des ganzen Stabs und damit auf vielen „Chips" gleichzeitig stattfindet. Anschließend wird das stabförmige, poröse Substrat wieder scheibenweise getrennt. In besonders vorteilhafter Weise kann das stabförmige, poröse Substrat (10) über Zuleitungen (30) an einen Oligo-Synthesizer (nicht gezeigt) angeschlossen werden.
In Fig. 2a) ist das Anordnen einer Lochmaske (50) gezeigt, während in Fig. 2b) das Anordnen einer Stempelmaske mit Reliefstruktur (51) auf einem erfindungsgemäß eingesetzten stabförmigen porösen Substrat (10) mit Poren (11) dargestellt ist. In beiden Ausführungsformen werden in Abhängigkeit von dem Maskenmuster dadurch lokal Poren bzw. Bereiche von Poren verschlossen, so daß kein Synthesereagenz bzw. Biomoleküle (40) in diese Poren gelangen kann bzw. können, während andere Poren bzw. Bereiche von Poren ortsspezifisch zur Oberflächenbeschichtung mit Biomolekülen vorgesehen werden. Anschließend wird das stabförmige, poröse Substrat wieder scheibenweise getrennt.
Bezugszeichen
10 stabförmiges, poröses Substrat 11 Pore 12 Stirnflächen des Substrats fluidische Maske Zuleitungen für die einzelnen Bereiche auf dem Chip Biomoleküle Lochmaske Stempelmaske

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von einzelnen Biochips aus einem stabförmigen, porösen Substrat bereitgestellt, umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen eines stabförmigen porösen Substrats, das Poren mit einem Durchmesser im Bereich von zwischen 1 μm und 100 μm und eine Querschnittsfläche aufweist, welche den Abmessungen eines zu fertigenden, einzelnen Biochips entspricht; (ii) Beschichten der Porenoberflächen des stabförmigen porösen Substrats mit als Fängermoleküle fungierenden chemisch-biologischen Verbindungen, und (iii) scheibenweise Sägen des stabförmigen porösen Substrats derart, daß vereinzelte, fertige Biochips mit einer Dicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm erhalten werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Länge des stabförmigen porösen Substrats im Bereich von 1 cm bis 30 cm liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Material des stabförmigen porösen Substrats aus Siliziumoxid, Aluminiumoxid, Glas oder makroporösem Silizium ausgewählt ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt (ii) das Beschichten der Porenoberflächen mit den chemisch-biologischen Verbindungen mittels Dispensiertechniken, gegebenenfalls durch Pumptechniken, erfolgt .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei vor dem Schritt (iii) die funktionalisierten Poren zum Schutz mit langkettigen Polyalkylenglykolen und/oder Polyvinylalkoholen gefüllt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in Schritt (ii) an mindestens einer der beiden Stirnflächen des stabförmigen, porösen Substrats eine fluidische Maske vorgesehen wird, so daß Bereiche in Array-Anordnung gegeneinander abgedichtet werden und Bereiche der Stirnfläche mit unterschiedlichen chemisch-biologischen Verbindungen belegt werden können.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die als Fängermoleküle vorgesehenen Oligonukleotide direkt in den Poren synthetisiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das stabförmige, poröse Substrat über an die mindestens eine fluidische Maske angeschlossene Zuleitungen mit einem Oligo-Synthesizer verbunden ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in Schritt (ii) an mindestens einer der beiden Stirnflächen des stabförmigen, porösen Substrats eine Lochmaske oder eine Stempelmaske vorgesehen wird, so daß bereichsweise Porenöffnungen derart bedeckt sind, daß keine chemisch¬ biologischen Verbindungen in diese Poren gelangen.
10. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von einzelnen Biochips aus einem porösen Substrat, umfassend die Schritte: (a) justiertes Aneinanderstapeln einer Vielzahl von porösen Substraten mit einer Einzeldicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm zu einem stabförmigen makroporösen Substrat; (b) reversibles Verbinden der einzelnen Substrate durch Tempern des erzeugten stabförmigen makroporösen Substrats bei einer Temperatur im Bereich von 80 0C bis 2000C; (c) Beschichten der Porenoberflächen des in Schritt (b) erzeugten stabförmigen, porösen Substrats mit als Fängermoleküle fungierenden chemisch-biologischen Verbindungen, und (d) mechanisches Vereinzeln des stabfδrmigen, porösen Substrats derart, daß fertige Biochips mit einer Dicke im Bereich von 100 bis 1.000 μm erhalten werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Länge des stabförmigen porösen Substrats im Bereich von 1 cm bis 30 cm liegt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Material des stabfδrmigen porösen Substrats aus Siliziumoxid,. Aluminiumoxid, Glas oder makroporösem Silizium ausgewählt ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei in Schritt (c) das Beschichten der Porenoberflächen mit den chemisch-biologischen Verbindungen mittels Dispensiertechniken, gegebenenfalls durch Pumptechniken, erfolgt.
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999003341A1 (en) * 1997-07-16 1999-01-28 Don Stimpson Parallel production of high density arrays
WO1999013313A1 (en) * 1997-09-11 1999-03-18 Genovations, Inc. Method of making high density arrays
WO1999055460A1 (en) * 1998-04-27 1999-11-04 Corning Incorporated Redrawn capillary imaging reservoir
WO2002016651A2 (en) * 2000-08-25 2002-02-28 Genospectra, Inc. Three-dimensional probe carriers
US20020086325A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-04 Ebara Corporation Affinity detecting/analytical chip, method for production thereof, detection method and detection system using same
US20030124716A1 (en) * 2000-10-10 2003-07-03 Biotrove, Inc., A Delaware Corporation Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10142691B4 (de) * 2001-08-31 2006-04-20 Infineon Technologies Ag Verfahren zum Nachweis biochemischer Reaktionen sowie eine Vorrichtung hierfür
DE10164800B4 (de) * 2001-11-02 2005-03-31 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung eines elektronischen Bauelements mit mehreren übereinander gestapelten und miteinander kontaktierten Chips

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999003341A1 (en) * 1997-07-16 1999-01-28 Don Stimpson Parallel production of high density arrays
WO1999013313A1 (en) * 1997-09-11 1999-03-18 Genovations, Inc. Method of making high density arrays
WO1999055460A1 (en) * 1998-04-27 1999-11-04 Corning Incorporated Redrawn capillary imaging reservoir
WO2002016651A2 (en) * 2000-08-25 2002-02-28 Genospectra, Inc. Three-dimensional probe carriers
US20030124716A1 (en) * 2000-10-10 2003-07-03 Biotrove, Inc., A Delaware Corporation Apparatus for assay, synthesis and storage, and methods of manufacture, use, and manipulation thereof
US20020086325A1 (en) * 2000-12-28 2002-07-04 Ebara Corporation Affinity detecting/analytical chip, method for production thereof, detection method and detection system using same

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