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WO2006098415A1 - 薬物運搬体 - Google Patents

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WO2006098415A1
WO2006098415A1 PCT/JP2006/305304 JP2006305304W WO2006098415A1 WO 2006098415 A1 WO2006098415 A1 WO 2006098415A1 JP 2006305304 W JP2006305304 W JP 2006305304W WO 2006098415 A1 WO2006098415 A1 WO 2006098415A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydrophilic
binding site
site
binding
drug
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2006/305304
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shinji Takeoka
Yosuke Okamura
Hideo Kanazawa
Shuji Hisamoto
Kohei Kubota
Yosuke Obata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Waseda University
Oxygenix Co Ltd
Original Assignee
Waseda University
Oxygenix Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Waseda University, Oxygenix Co Ltd filed Critical Waseda University
Priority to JP2007508214A priority Critical patent/JP5038128B2/ja
Priority to US11/886,319 priority patent/US8647613B2/en
Publication of WO2006098415A1 publication Critical patent/WO2006098415A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
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    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent

Definitions

  • the present invention relates to a drug carrier preparation that controls a pharmacokinetic by utilizing a phenomenon in which a drug is supported on a molecular assembly and an amphiphilic molecule that is a part of a component of the molecular assembly is released from the molecular assembly. .
  • a drug delivery system incorporating a drug in a molecular assembly is called a drug delivery system.
  • hydrophilic drugs there are bilayer vesicles constructed by assembling phospholipid molecules, so-called drug carriers encapsulated in the inner aqueous phase of ribosomes.
  • drug carriers encapsulated in the inner aqueous phase of ribosomes.
  • hydrophobic drugs it is physically dissolved or chemically dissolved in the hydrophobic part of molecular aggregates such as lipid microspheres that are o / w emulsions, micelles composed of surfactants or amphiphilic polymers.
  • lipid microspheres that are o / w emulsions, micelles composed of surfactants or amphiphilic polymers.
  • a hydrophobic drug may be embedded in the hydrophobic part of the bimolecular membrane of the ribosome.
  • these drug carriers When these drug carriers are administered into blood, for example, they are taken up by phagocytic cells mainly developed in the organs of the reticuloendothelial system (for example, spleen, liver, etc.), so the residence time in blood is extremely short. Limited to drug carriers that target multiple organs. For this reason, measures have been taken to extend the residence time in the blood. For example, ribosomes coated with polyethylene dallicol chains, which are water-soluble and highly biocompatible polymers, are often used as so-called stealth ribosomes.
  • solid cancer tissue is characterized by abnormally developed new blood vessels with many branches and thin and discontinuous blood vessel walls. If the size of PEG-ribosome with high blood retention is reduced to 300 nm or less, it becomes possible to leak from the blood into the stroma via the highly permeable blood vessel wall of cancer tissue. Accumulate with difficulty in returning to the lumen side. Therefore, PEG-ribosome has an effect of higher accumulation in solid cancer tissue than a low molecular weight drug, that is, has an EPR effect, and is one of the important factors in targeting a tumor tissue. is there.
  • the liposome which is a molecular assembly, disperses the amphiphilic molecules constituting it into water by some energy irradiation, and self-assembles by hydrophobic interaction. It is a metastable state in terms of physico-chemistry because it is prepared using the phenomenon. Therefore, aggregation or fusion may occur during storage, and precipitation may occur over time. Therefore, in consideration of the stability in blood, the solution has been achieved by mixing negatively charged lipids or cholesterol with the constituent lipids of the ribosome and modifying the surface of the ribosome with a polyethylene glycol chain or sugar chain.
  • lipids in which polyethylene glycol chains are bound to diacylphosphatidylethanolamine or cholesterol are widely used.
  • This polyethylene glycol-linked diacyl-type lipid has been reported to be released from phospholipid bilayer vesicles (JRSilvius and MJZuckermann, Biochemistry, 32, 3153, 1993, K. Sou, et al, Bioconjugate, 11, 372, 2000).
  • the release rate of this lipid depends on the molecular weight of the polyethylene glycol chain and the size of the hydrophobic part (the number of carbons constituting the acyl chain), that is, the hydrophilic-hydrophobic balance, and the hydrophilic part is relatively large. Easy to release lipids. Therefore, we have developed a lipid that combines a single polyethylene glycol chain and a number of alkyl chains using the monodendron structure, and a series that is difficult to desorb even when a polyethylene molecular chain with a large molecular weight is bound. Of amphipathic molecules (Patent No. 3181276). Disclosure of the invention
  • the present inventors have used a series of polyethylene glycol-binding lipids synthesized so far, and have used hydrophilic recognition sites such as proteins at the end of the polyethylene glycol chain of the polyethylene glycol-binding lipid. It has been clarified that liberation occurs because the hydrophilic-hydrophobic balance tends to become more hydrophilic. For this reason, it has been studied to increase the hydrophobic part of the binding lipid in order to stably carry the recognition part on the surface of the ribosome so that the hydrophilic recognition part is not released. However, as a result, liberation still occurred and it was difficult to completely control the liberation.
  • the present inventors have the drug carried on a molecular assembly composed of amphiphilic molecules, and controlled the pharmacokinetics of the drug carrier by utilizing the release phenomenon of the lipid (for example, polyethylene glycol-binding lipid) constituting the molecular assembly.
  • An object of the present invention is to provide a drug carrier preparation to be used. If it is further expanded and released by various external stimuli such as dilution effect (concentration change), temperature change, pH change, chemical reaction, etc., it can be used as an active control method for the pharmacokinetics of drug carriers. This is another issue It was. We also examined expanding this issue to include not only ribosomes, which are phospholipid molecular assemblies, but also the entire drug delivery system based on molecular assemblies such as emulsions or micelles. ⁇
  • amphiphilic molecules of amphiphilic molecules by changing the external environment of the molecular aggregates to a predetermined molecular structure.
  • the inventors have found that release can be adjusted arbitrarily, and have completed the present invention.
  • the present invention is a drug carrier including a molecular assembly carrying a drug, and a part of the amphiphilic molecules constituting the molecular assembly is released from the molecular assembly by a change in the external environment. By doing so, it is a drug carrier whose pharmacokinetics in the living body are controlled. More specifically, the present invention provides the following drug carriers and the like.
  • a drug carrier including a molecular assembly on which a drug is supported, and a part of the amphiphilic molecules constituting the molecular assembly is released from the molecular assembly due to a change in the external environment.
  • a drug carrier whose pharmacokinetics are controlled in vivo.
  • binding site A is the site that binds the hydrophilic part and drug
  • binding site B is the site that binds the hydrophilic part and hydrophobic part
  • binding site C is the part that binds the hydrophobic part and drug.
  • binding site B is the site that binds the hydrophilic part and hydrophobic part
  • binding site D is the site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic part
  • binding site E is the recognition site and highly hydrophilic. The pharmacokinetics in the living body is controlled by the release of the amphipathic molecule.
  • binding site B is the site that binds the hydrophilic part and the hydrophobic part
  • binding site E is the part that binds the recognition site and the hydrophilic part.
  • the binding site B is the part that binds the hydrophilic part and the hydrophobic part
  • the binding site D is a site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic part.
  • the amphiphilic molecule 3 represented by The drug carrier according to (1), wherein pharmacokinetics in the living body is controlled by expressing the recognition ability of the amphipathic molecule 5 by release.
  • binding site A is a site that binds the drug to the hydrophilic portion
  • binding site B is a site that binds the hydrophilic portion to the hydrophobic portion
  • binding site B is the site that binds the hydrophilic part and hydrophobic part
  • binding site D is the site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic part
  • binding site E is the recognition site and highly hydrophilic.
  • the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is due to a concentration change of at least one selected from the group consisting of protons, alkali metal ions and alkaline earth metal ions ( The drug carrier according to any one of 1) to (1 1).
  • a disulfide bond is contained at the site where the hydrophilic part and hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule or hydrophobic part are bonded, and the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly reduces the disulfide bond.
  • the drug carrier according to any one of (1) to (1 3). is
  • the drug retained in the molecular assembly is released by partial or total destruction of the molecular assembly structure due to the release of the amphiphilic molecule (1) to (1 4)
  • the drug carrier according to any of the above.
  • a drug carrier capable of controlling the pharmacokinetics of a drug to be transported according to the purpose.
  • FIG. 1A ′ is a diagram showing a model structure of an amphiphilic molecule used in the drug carrier of the present invention.
  • FIG. 1B is a diagram showing a model structure of an amphiphilic molecule used in the drug carrier of the present invention.
  • Figure 2 is a graph comparing the release behavior of PEG lipids from the endoplasmic reticulum.
  • Figure 3 is a graph comparing the desorption behavior of protein-bound transmembrane lipids from protein-loaded ribosomes.
  • Figure 4 is a graph comparing the detachment behavior of proteins from protein-bound ribosomes with the addition of a reducing agent.
  • Fig. 5 is a graph showing the results of CMC measurement of glycolipids due to differences in the number of alkyl chains of glycolipids.
  • Fig. 6 is a graph comparing the desorption rates of protein-bound membrane lipids from protein-bound ribosomes due to protein differences.
  • Figure 7 is a graph comparing the desorption rates of protein-bound glycolipids from protein-bound ribosomes due to differences in protein molecular weight. .
  • Fig. 8 shows the results of detection of thin-layer chromatography after hydrolysis of pH-responsive ribosomes at low pH.
  • Fig. 9 is a graph showing the release behavior of fluorescent molecules encapsulated in pH-responsive ribosomes due to pH changes.
  • FIG. 10 is a graph showing the temporal release behavior of fluorescent molecules encapsulated in pH-responsive ribosomes at each pH.
  • Fig. 11 is a graph showing the release behavior of fluorescent molecules encapsulated in pH-responsive ribosomes due to pH changes.
  • Fig. 12 is a graph showing the release behavior of lucanin encapsulated in ribosomes containing disulfide lipids when a reducing agent is added.
  • Fig. 16 is a graph showing that H12-vesicle specifically binds to activated platelets and that binding is suppressed by introducing PEG into H12-vesicle.
  • FIG. 17 is a graph comparing the binding rate of PEG (H12) -vesicle to activated platelets accompanying PEG elimination.
  • the flats of amphiphilic molecules that are desired to be released are inclined to the aggregates.
  • the equilibrium state is inclined to the free state into the aqueous phase, and the amphiphilic molecules to be released are released to reach a new equilibrium state.
  • the equilibrium state is a function of temperature, when the temperature is raised, the amphiphilic molecules are released and reach a new equilibrium state. Release can be controlled by such physical factors.
  • the hydrophilic part of hydrophilic / hydrophobic water is made hydrophilic by chemically cutting the hydrophobic part of the amphiphilic molecule or the binding part between the hydrophobic part and the hydrophilic part to make the hydrophobic part small. Tilt to the sexual side and promote release.
  • a hydrolyzable ester bond, an amide bond, a urethane bond, a Schiff base or the like, or a disulfide bond cleaved by a reducing agent can be used as the chemical bond to be cleaved.
  • amphiphilic molecule capable of adjusting the hydrophilic-hydrophobic balance is polyethylene glycol having a large hydrophilic portion, recall type lipid, such as polyethylene glycol on the amino group of diacylphosphatidylethanolamine.
  • Lipids covalently bonded to polyethylene lipids obtained by covalently bonding polyethylene glycol to hydroxyl groups of diacyl derivatives of glycerol, lipids obtained by covalently bonding polyethylene glycol to carboxyl groups of dialkyl derivatives of trifunctional amino acids (glutamic acid lysine)
  • the molecular design is based on the necessity of having a large hydrophobic part to stabilize the bimolecular membrane for the so-called large hydrophilic part, and the inventors have led to the invention of multi-acyl lipids (Patent No. 3181276). issue).
  • the present inventors analyzed the effect of hydrophilic monohydrophobic balance on the release rate of the amphiphilic molecule using these amphiphilic molecules, and the ribosome of the two amphiphilic molecules having a large hydrophobic part.
  • the immobilization and release to the body a lot of knowledge that is the basis of the present invention was accumulated, and further, physical factors and chemical factors that promote the release were arranged.
  • the present inventor has come up with the idea that the release of this lipid can effectively control the pharmacokinetics of a drug in response to an external stimulus, contrary to the fixation of polyethylene glycol-type lipids.
  • the molecular assembly used in the drug carrier of the present invention is not particularly limited as long as it can carry a drug.
  • examples of such molecular assemblies include polymer assemblies, polymer micelles, emulsions, lipid microspheres, bilayer vesicles (liposomes), and other molecular assemblies (tubes, fibers, ribbons, sheets) Etc.) can be used.
  • the components of this molecular assembly include amphiphilic molecules that can be released from the molecular assembly due to changes in the external environment and polymers that have the property of forming molecular assemblies with this free amphiphilic molecule. It is.
  • the polymer that forms a molecular assembly has the property of forming a molecular assembly with a free amphiphilic molecule, and is not particularly limited as long as it uses a synthetic or natural polymer. Can do.
  • the synthetic polymer include an amphiphilic block copolymer or a comb polymer having a hydrophobic substituent in a hydrophilic main chain such as a polysaccharide, or an amphiphilic membrane protein.
  • the shape of the molecular aggregate formed by these polymers is generally polymeric micelles, but they may be in the shape of endoplasmic reticulums, fibers, tubes, or sheets.
  • aggregates formed by temperature-responsive vinyl polymers such as poly [N-2 (hydroxypropyl) methacrylamide] (PHPMA) or poly [-(isopropyl) acrylamide] (PNIPAM) above the transition temperature
  • PPMA poly [N-2 (hydroxypropyl) methacrylamide]
  • PNIPAM poly [-(isopropyl) acrylamide]
  • O / w emulsion gel lipid microspheres which are oil droplets such as triglycerides that do not mix with water and stabilized with phospholipids and other surfactants, are frequently used for the stable dispersion of fat-soluble drugs.
  • the drug is not particularly limited, and for example, doxorubicin derivative, paclitaxel or methotrexate can be used.
  • Phospholipid vesicles or ribosomes which are widely used as drug carriers, are intermolecular interactions (hydrophobic interactions, It is a molecular assembly of a vesicle structure that has a membrane that is constructed without a covalent bond by electrostatic interaction, hydrogen bonding, etc., and the membrane is a monolayer (a single bilayer membrane) Or, a multi-layer (lamellar) film is formed.
  • the size ranges from several tens of nanometers to several tens of micrometers, but is preferably 10 nanometers to 1 micrometer, and more preferably 30 nanometers to 300 nanometers.
  • there are aggregate forms such as a bilayer sheet, ribbon, tube or fiber, and these are also included in the molecular assembly referred to in the present invention.
  • Molecular assemblies with an endoplasmic reticulum structure can retain water-soluble or lipophilic drugs in the inner aqueous phase or bilayer membrane of the endoplasmic reticulum, thereby extending the residence time in the blood. Therefore, it is preferable.
  • phospholipid endoplasmic reticulum or ribosome is particularly preferable.
  • Phospholipid vesicles or ribosomes are under development in the area of drug carriers and are composed of phospholipids alone or a mixture of phospholipids and cholesterol and / or fatty acids.
  • phospholipids examples include egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated egg yolk lecithin, hydrogenated soybean lecithin, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, sfungomyelin, and various glycolipids. These phospholipids may contain unsaturated parts such as phen (double bond), in (triple bond), gen, diyne, and triene, and may contain a polymerizable group such as a vinyl group, such as a styryl group. May be included.
  • polymerizable phospholipids include 1,2-di (octadeca-trans-2, trans-4-dienoyl) phosphatidylcholine, 1,2-di (octadeca-2,4-dienoyl) phosphatidic acid, 1,2-biseleostaroylphosphatidylcholine and the like.
  • the phospholipid content is preferably 5 to 70 mol%, more preferably 20 to 50 mol%, based on the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly.
  • fatty acid constituting the acyl chain a saturated or unsaturated fatty acid having 12 to 20 carbon atoms is used.
  • trifunctional amino acids such as amphoteric lipids such as glutamic acid and lysine skeleton can be used.
  • Fatty acid content Yuryou is the total number of moles of constituent lipids of the molecular assembly, lay preferred that 1 to 70 mol%, more preferably 5 to 30 mol 0/0.
  • a negatively charged lipid can also be added as a component to the molecular assembly. This is because mixing of negatively charged lipids in the membrane component suppresses aggregation of the endoplasmic reticulum, reduces the number of coating layers, and increases the encapsulation efficiency.
  • the negatively charged lipid include diacyl phosphatidyl glycerol, diacyl phosphatidic acid, diacyl phosphatidyl inositol, diacyl phosphatidyl serine, and anionic amino acid type fats.
  • the content of the negatively charged lipid is preferably 1 to 70 mol%, particularly preferably 5 to 30 mol%, based on the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly.
  • sterols may be added to the molecular assembly as stabilizers as membrane components of the lipid vesicles.
  • examples of such sterols include all steroloids having perhydrocyclopentanophenanthrene such as ergosterol and cholesterol, and preferably cholesterol.
  • Taire the total number of moles of constituent lipids of the molecular assembly, 5 to 50 mol 0 /. It is preferably, more preferably 15 to 40 mole 0/0.
  • the molecular assembly includes amphiphilic molecules that can be released from the molecular assembly due to a change in external environment.
  • the content of the amphipathic molecule is appropriately determined according to the target organ / tissue, the type of drug, the drug loading site, the loading method, the form of the molecular assembly, etc. no. for example, based on the total molarity of the constituent lipid of the molecular assembly, it forces S preferably 0.01 to 100 mol%, more preferably from 0.05 to 50 mol 0/0, 0.1 to 30 moles 0 / 0 is particularly preferred.
  • ribosome production methods include single or mixed lipid powders or thin films that are hydrated and dispersed, followed by high pressure extrusion (extrusion) method, ultrasonic irradiation method, stirring (portex mixing, homogenizer) method , Freeze-thaw method, microfluidizer method, etc., or a solution of a single or 'mixed fat dissolved in an organic solvent is injected into the aqueous phase, followed by ethanol, ether, etc.
  • a method for loading a drug on such a molecular assembly may be appropriately selected according to the type of drug.
  • a water-soluble drug for example, it can be prepared by dissolving the drug in an aqueous phase at the time of ribosome production.
  • a water-soluble drug can be added to the outer aqueous phase, and the drug can be introduced into the inner aqueous phase using the permeability of the ribosome membrane.
  • the water-soluble drug not encapsulated can be separated from the encapsulated endoplasmic reticulum by gel filtration, ultracentrifugation, or ultrafiltration membrane treatment.
  • the drug is introduced into the hydrophobic part of the bilayer by mixing the drug in a state where a single or mixed lipid is dissolved in an organic solvent and forming a ribosome by the method described above. can do. It is also possible to form a liposome containing an amphiphilic molecule having a functional group and then carry the drug on the functional group exposed on the surface of the ribosome using a chemical reaction in the aqueous phase. it can. Alternatively, after the ribosome is produced in advance, the drug can be dissolved in an organic solvent mixed with water and added to the outer aqueous phase to introduce the drug into the hydrophobic part of the bilayer membrane.
  • a phenomenon in which some amphiphilic molecules constituting the molecular assembly are released from the molecular assembly due to a change in the external environment of the molecular assembly is used.
  • the drug carrier of the present invention controls pharmacokinetics in a living body by the release phenomenon of the amphiphilic molecule.
  • “External environment” means the environment surrounding the molecular assembly, and includes temperature, pH, dilution of molecular assembly, ionic environment, reducing atmosphere, and the like.
  • Amphiphilic molecules released from a molecular assembly can control the release rate from the molecular assembly by the hydrophilic part-hydrophobic part balance in the molecule.
  • the release rate can be appropriately adjusted according to the target organ / tissue, type of drug, drug loading site, loading method, morphology of the molecular assembly, and the like.
  • the release rate can be reduced by designing the ratio of the hydrophobic part to the hydrophilic part to be large.
  • the release rate can be increased by increasing the ratio of the hydrophilic part to the hydrophobic part.
  • the drug carrier of the present invention is not particularly limited as long as pharmacokinetics can be controlled by releasing some amphiphilic molecules from the molecular assembly.
  • the drug carrier of the present invention includes, for example, the following four modes depending on the hydrophilic part, hydrophobic part, combination of drug and hydrophilic polymer and control method of the amphiphilic molecule to be released.
  • the first aspect of the present invention is an aspect in which the pharmacokinetics is controlled by loading a drug in the hydrophilic or hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule (FIG. 1A (a)).
  • the pharmacokinetics is controlled by supporting a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer having a recognition site bonded to the hydrophilic part of the liberated amphiphilic molecule.
  • Figure l A (b) the pharmacokinetics is controlled by releasing the amphiphilic molecule from the molecular assembly and expressing the recognition site on the surface of the carrier such as a liposome (active targeting, Fig. L A ( c)).
  • the fourth aspect of the present invention is an aspect in which the pharmacokinetics is controlled by the liberated amphiphilic molecule having a transmembrane structure (FIG. 1B (d)). Each aspect will be described below.
  • the amphiphilic molecule to be separated is composed of a drug, a hydrophilic part and a hydrophobic part, and the drug is carried by supporting the drug on the liberated amphiphilic molecule. It controls the dynamics (Fig. L A (a)).
  • the structure of the amphiphilic molecule (hereinafter sometimes referred to as “drug-binding amphiphilic molecule”) to which the drug released from the molecular assembly is bound is the amphiphilic molecule 1 and 2: ) — (Binding site A) — (Hydrophilic part) One (Binding part B) — (Hydrophobic part) 1
  • binding site A is a site that binds a hydrophilic part and a drug
  • binding site B is a part that binds a hydrophilic part and a hydrophobic part
  • binding site C is a part that binds a hydrophobic part and a drug. Is].
  • the (hydrophilic part) -one (binding site B)-(hydrophobic part) can target all known amphiphilic molecules known as phospholipids, sphingolipids, amino acid-type lipids, and the like.
  • the hydrophilic part is made of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol, polysaccharides, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyglutamic acid, and polypeptides. May be included. '
  • the binding site B is a site that binds the hydrophilic part and the hydrophobic part, and is not particularly limited as long as it is generally known to have such a function in an amphiphilic molecule.
  • the binding site B is defined as glycerol, oligosaccharide, oligopeptide, polyester, bull oligomer, amino acid such as glutamic acid or lysine, or a multi-branched structure composed of these, for example, a dendron structure. Two hydrophilic portions and one or more hydrophobic portions are bonded.
  • the binding site B is preferably at least one selected from the group consisting of an oligosaccharide chain, an oligopeptide chain, a polyester chain, and a vinyl-based oligomeric dendron structure.
  • an oligopeptide chain consisting of repeating glutamic acid with glycine unit as a spacer has an arbitrary number of carboxylic acid groups in the side chain
  • the hydrophobic part can be arbitrarily defined by an amide bond or an ester bond.
  • the hydrophilic part can be bound to the N-terminus of the oligopeptide chain.
  • the hydrophobic part can be bonded to the carboxylic acid group or the hydroxyl group of oligoacrylic acid or vinyl alcohol by a polymer reaction.
  • molecular faeces can be controlled and a functional group can be introduced at the terminal, so that a hydrophilic part can be bonded to this terminal.
  • the number of terminal functional groups can be controlled by the number of generations. 2 in the 1st generation, 4 in the 2nd generation, 8 in the 3rd generation.
  • the number of hydrophobic parts can be controlled by bonding hydrophobic parts here.
  • the hydrophilic part can be bonded to one functional group on the opposite side of the monodendron.
  • the hydrophobic part is not particularly limited as long as it can impart sufficient hydrophobicity to the amphiphilic molecule.
  • saturated fatty acids, unsaturated fatty acids, saturated higher alcohols, unsaturated higher alcohols, and sterolides are used as the hydrophobic part. These may be linear or branched.
  • the hydrophobic part of the liberated amphiphilic molecule preferably has two or more hydrocarbon chains.
  • “the hydrophobic part has two or more hydrocarbon chains” means that two or more hydrocarbon chains are bonded to the binding site B.
  • the hydrocarbon chain may be a branched chain, and examples of the branched chain include those having a long chain having an isoprenoid structure.
  • the number of hydrocarbon chains is not particularly limited, but is preferably 2 or more. There is no particular upper limit to the number of hydrocarbon chains, but it is usually preferably 18 or less in view of easy synthesis.
  • the hydrocarbon chain introduced into the hydrophobic part is preferably an alkyl chain, an alkenyl chain or an alkynyl chain, and an alkyl chain is particularly preferred because steric hindrance can be minimized and it can be easily introduced into a molecular assembly.
  • These hydrocarbon chains may have a substituent as long as they are sufficiently hydrophobic as the hydrophobic part of the amphiphilic molecule and do not inhibit introduction into the molecular assembly.
  • the hydrocarbon chain is interrupted by an oxygen atom, a sulfur atom, one NR— (wherein R represents an alkyl group, an alkenyl group, or an alkynyl group which may have a substituent). May be.
  • the number of carbon atoms in the hydrocarbon chain is not particularly limited, but is preferably 4 to 24, more preferably 10 to 20 and particularly preferably 12 to 18.
  • glutamic acid or lysine is included as the binding site B, the above-mentioned hydrophobic part can be bonded to two carboxylic acid groups or two amino groups possessed by these.
  • amphiphilic molecules represented by (hydrophilic part) (binding site B)-(hydrophobic part) include polyethylene glycol lipids, glycolipids, peptide-binding lipids, protein (antibodies, enzymes, etc.) binding lipids
  • Drug-binding amphiphilic molecules such as nucleic acids, multi-acyl chain lipids, transmembrane lipids, etc. can be employed.
  • polyethylene glycol lipids are those having a molecular weight of about 200 Da to 12500 Da, preferably about 1000 Da to 5000 Da, or a substituent such as an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, or a maleimide group at both ends.
  • the glycolipid has a reducing end group, and may be an oligosaccharide polysaccharide having a branched or almost linear sugar polymerization degree of 2 to 400, and may be either natural sugar or synthetic sugar.
  • An oligosaccharide is a sugar in which one or more of, for example, gnolecose, funolectose, xylose, galactose, mannose, darcosamine, etc. are ⁇ -bonded or iS-bonded.
  • Gentio-oligosaccharides nigg mouth oligosaccharides, lacto-oligosaccharides, merigo-oligosaccharides, inuro-oligosaccharides and the like.
  • polysaccharides starch, cellulose, mucopolysaccharide (hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate, dermantan sulfate, ketalan sulfate, beparin, etc.), chitin, chitosan, other polysaccharide degradation products, cells, and complex sugars derived from bacteria Quality and so on.
  • the drug is an amphiphilic molecule 1 represented by Formula 1 bound to the hydrophilic part by a binding site A, or an amphiphile represented by Formula 2 bound to the end of a hydrophobic part by a binding site C. It is introduced by co-assembly into the molecular assembly by sex molecule 2.
  • Binding sites A and C are sites that bind the drug to the hydrophilic or hydrophobic part, respectively. Examples of the binding sites A and C include an amide bond, an ester bond, an ether bond, a urethane bond, a disulfide bond, and a bond in which a mercapto group and a maleimide group are added. '
  • the drug that can be carried on the drug carrier of the present invention is not particularly limited as long as it acts on at least one target organ or tissue.
  • examples of such drugs include enzymes, peptides or proteins, various antibiotics, various peptide hormones, DNA, RNA, siRNA, plasmids, various anticancer agents, drugs for central nervous system, Peripheral nerve agent, Sensory organ agent, Cardiovascular agent, Respiratory agent agent, Gastrointestinal agent, Hormonal agent, Urogenital and anal drug, Skin agent, Oral dental agent, Vitamin agent, Nutrition Tonics, blood and body fluids, artificial dialysis drugs, other metabolic drugs, cell rejuvenation drugs, oncology drugs, radiopharmaceuticals allergy drugs, herbal medicines and herbal medicines, antibiotics, chemotherapy Drugs, biologics, diagnostics.
  • Examples of peptides or proteins include various sites such as interleukins, cell transmission factors, fibrinogen, collagen, keratin, pro
  • Examples include polypeptides as extracellular matrix agents such as theoglucan or oligo bodies as a part of the structure, or functional polypeptides such as oxytocin, bradykinin, thyrotropin releasing factor, enkephalin and the like.
  • Examples of the enzyme include force talase, chymotrypsin, cytochrome, and amylase, but are not limited thereto. These drugs may be used alone or in combination of two or more.
  • the hydrophilic-hydrophobic balance of the amphiphilic molecule 1 or 2 may be appropriately designed according to the type of drug, target organ or tissue, pathology, kinetics of the amphiphilic molecule 1 or 2 itself, etc. .
  • Such an amphiphilic molecule 1 or 2 can be introduced into a bilayer membrane of a liposome composed of a molecular assembly, for example, a phospholipid, by the method described above.
  • the content of amphiphilic molecules 1 and 2 is appropriately determined according to the type of drug, target organ or tissue, pathology, etc. It is preferably 0.01 to 30 mol%, particularly preferably 0.1 to 10 mol%, based on the total number of moles of the constituent lipid.
  • the drug carrier according to the second aspect of the present invention controls pharmacokinetics by supporting a hydrophilic polymer or a hydrophilic polymer having a recognition site bonded to a hydrophilic part of a liberated amphiphilic molecule.
  • the “drug” part of the first aspect is a “hydrophilic polymer”, and basically the hydrophilic polymer, the hydrophilic part and the hydrophobic part. Is included.
  • this embodiment includes those in which a recognition site is further bound to a hydrophilic polymer.
  • binding site B is the site that binds the hydrophilic part and hydrophobic part
  • binding site D is the site that binds the hydrophilic polymer and the hydrophilic part
  • binding site E is the recognition site and highly hydrophilic. It is a site that binds to a molecule.
  • the amphiphilic molecule represented by the formula 3 or 4 can modify the surface of the liposome with a hydrophilic polymer, for example, by co-assembling with a phospholipid.
  • a hydrophilic polymer the same polymer as described in the description of the hydrophilic portion of the first embodiment can be used.
  • the molecular weight of the hydrophilic polymer is preferably about 200 Da to 20000 Da, and particularly preferably about 2000 Da to 12500 Da. If the hydrophilic polymer is a polyethylene glycol chain, it has the effect of greatly extending the residence time of the ribosome in the blood compared to the unmodified ribosome.
  • the hydrophilic polymer itself a polysaccharide that is easily recognized by cells constituting the organ or tissue, the specificity to the organ or tissue can be increased.
  • the amphiphilic molecule 4 has a recognition site such as an oligopeptide chain or sugar chain at the end of a hydrophilic polymer such as a surface-modified polyethylene glycol chain, and controls the pharmacokinetics of the drug carrier. Can do.
  • the pharmacokinetics of the drug carrier can be more accurately controlled by releasing the amphiphilic molecule 3 or 4 due to a change in the external environment.
  • polyethylene glycol-binding lipids that modify liposomes increase the residence time of ribosomes in the blood, but release from ribosomes can shorten the residence time in blood.
  • the release rate can be adjusted by the molecular weight of polyethylene glycol or the size of the hydrophobic part.
  • amphiphilic molecule 4 • Ribosomes can increase specific accumulation in cells that make up organs or tissues that recognize amphipathic molecules 4, but the release of amphipathic molecules 4 reduces the specificity, and The liberated amphiphilic molecule 4 binds to the site to be recognized and inhibits the recognition of liposomes in which both amphiphilic molecules 4 are modified, resulting in lower specificity. Furthermore, the internal kinetics of the drug carrier can be controlled with higher accuracy by mixing the amphiphilic molecules 3 and 4 and introducing them onto the ribosome surface and further controlling their release rates.
  • the binding site D or E is not particularly limited as long as it is a bond between a hydrophilic polymer and a hydrophilic moiety, or a bond between a hydrophilic polymer and a recognition site.
  • Such binding sites D or E include, for example, amide bonds, ester bonds, ether bonds, urethane bonds, disulfide bonds, condensation bonds of mercapto groups and maleimide groups, and Schiffs of aldehyde groups and amino groups. Examples include bases.
  • the recognition site is not particularly limited as long as it specifically recognizes a target organ or tissue.
  • Examples of recognition sites include, but are not limited to, the oligosaccharides, antibodies, peptide hormones, lectins, .glycoproteins described above.
  • the content of the amphiphilic molecules 3 and 4 is appropriately determined according to the desired blood convection time and recognition ability, but each of the constituent lipids of the molecular assembly.
  • the amount is preferably 0.01 to 50 mol%, particularly preferably 0.1 to 20 mol%, based on the total number of moles.
  • the recognition site on the surface of the molecular assembly is expressed by the release of a part of the amphiphilic molecules constituting the molecular assembly, and thereby the pharmacokinetics is improved. It is to control (Fig. L A (c)).
  • the drug carrier of this embodiment is, for example, a molecular assembly in which an amphiphilic molecule 5 is supported, and the amphiphilic molecule 3 introduced into the molecular assembly is recognized by the amphiphilic molecule 5. And a drug carrier whose pharmacokinetics is controlled by the release of the amphiphilic molecule 3 and the recognition ability of the amphiphilic molecule 5 being expressed by the release of the amphiphilic molecule 3.
  • amphiphilic molecules 5 and 3 (Recognition site) One (Binding site E) One (Hydrophilic part) One (Binding part B) One (Hydrophobic part) 5
  • the binding site B and the binding site D have the same meaning as described above, and the binding site E is a site that binds the recognition site and the hydrophilic portion.
  • the hydrophilic polymer of the amphiphilic molecule 3 is preferably a hydrophilic polymer having a molecular weight larger than the recognition site of the amphiphilic molecule 5.
  • the amphiphilic molecule 3 When the molecular assembly is administered into the blood in this state, the amphiphilic molecule 3 is released due to a change in the external environment such as a dilution effect.
  • the recognition site of the amphipathic molecule 5 when the recognition site of the amphipathic molecule 5 is exposed on the surface of the liposome ⁇ , the recognition site increases the specific accumulation in the cells constituting the organ or tissue. The pharmacokinetics can be controlled. Furthermore, the release of the amphiphilic molecule 5 reduces the specific accumulation property, which can also control the pharmacokinetics of the drug carrier.
  • the recognition site possessed by the amphipathic molecule 5 the same recognition site as described in the embodiment of Clay 2 can be shown.
  • examples of the amphiphilic molecule 5 include those having a recognition site such as an oligopeptide chain or a sugar chain at the end of a hydrophilic portion such as glutamic acid or lysine.
  • a recognition site such as an oligopeptide chain or a sugar chain at the end of a hydrophilic portion such as glutamic acid or lysine.
  • sugar chains are recognized in a structure-specific manner by lectins, which are sugar-binding proteins, molecular aggregates containing amphipathic molecules having sugar chains as recognition sites are used for proteins and sugars on the cell membrane surface. It can be used as a carrier that specifically recognizes a ligand such as a chain and is highly useful.
  • amphiphilic molecule 3 can be the same as those described in the second embodiment.
  • the recognition ability of the amphiphilic molecule 5 is inhibited by the hydrophilic polymer such as the polyethylene glycol chain of the amphiphilic molecule 3.
  • the hydrophilic polymer in the amphiphilic molecule 3 is not particularly limited as long as it can inhibit the recognition ability of the amphiphilic molecule 5, but preferably has a molecular weight of about 200 Da to 20000 Da. It is particularly preferable that it is about 2000 Da to 12500 Da.
  • the content of the amphiphilic molecule 5 is appropriately determined according to the desired recognition ability, but is 0.01 to 50 mol% with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly. It is preferable that it is 0.1-30 mol%.
  • the content of the amphiphilic molecule 3 is not limited as long as the recognition ability of the amphiphilic molecule 5 can be inhibited, but is 0.01 to 30 mol% with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly. It is preferable that it is 0.05 to 10 mol%.
  • the release rate of the amphiphilic molecule 3 can be controlled by the molecular weight or charge amount of the hydrophilic polymer or the size of the hydrophobic part.
  • the release rate of the amphiphilic molecule 5 can be controlled by the same method. Therefore, the relative release rate of these amphiphilic molecules can be appropriately designed according to the purpose.
  • the fourth aspect of the present invention is to control the pharmacokinetics of the drug transporter by releasing transmembrane amphipathic molecules that penetrate the membrane of the molecular assembly (FIG. 1B (d )).
  • the structures of the amphiphilic molecules exemplified in the first to third embodiments described above are those in which the liberated amphiphilic molecules are simply classified into structures represented by a hydrophilic part and a hydrophobic part.
  • the amphiphilic molecules used in the invention may be classified according to the structure represented by hydrophilic part-hydrophobic part-hydrophilic part. In the present embodiment, an amphiphilic molecule having such a structure is preferable.
  • amphiphilic molecule used in this embodiment, specifically,
  • Amphiphilic molecules represented by -These amphiphilic molecules are introduced into the assembly in a structure that penetrates the bilayer in the ribosome bilayer.
  • the hydrophobic part may be single-stranded or double-stranded, but this depends on the binding site B.
  • the length of the hydrophobic portion may be any length that can penetrate the bimolecular membrane, but is 20 to 5.0, preferably 28 to 36 in terms of carbon number.
  • Symmetrical structures such as amphipathic molecules 7 or 9 are forces that are easy to synthesize.
  • a hydrophilic polymer or drug is oriented on the inner aqueous phase side of the ribosome. This may be convenient for controlling the release rate, that is, controlling pharmacokinetics, but because the hydrophilic polymer or drug is not exposed to the ribosome surface, these cannot function effectively and are wasted. There is. In the latter case, after introducing an amphiphilic molecule into the ribosome, the drug or hydrophilic polymer is bound only to the end of the amphiphilic molecule exposed on the surface via binding site A or binding site D. It can also be made.
  • the control of the release rate is not only a hydrophilic / hydrophobic balance, but also the size and charge amount of the hydrophilic part facing the inner aqueous phase. That is, even if the transmembrane amphiphilic molecule is low in hydrophobicity, the transmembrane amphiphilic molecule is difficult to be released from the ribosome if the hydrophilicity facing the inner aqueous phase is strong.
  • the content of the amphiphilic molecule 6-1 1 is not particularly limited, respectively, based on the total molarity of the constituent lipids of the molecular assembly is preferably a Dearuko 0.01 to 100 mole 0/0 0.1 to 25 mol% is particularly preferable.
  • the release of amphiphilic molecules from the molecular assembly is caused by changes in the external environment.
  • “External environment” means the environment surrounding the molecular assembly as described above.
  • Examples of the external environment include a diluting solution for diluting the molecular assembly and an ambient temperature for changing the temperature of the molecular assembly. , Ambient hydrogen ion concentration to change the pH of the molecular assembly.
  • the change in the external environment is not limited to the shift from the equilibrium state to the non-equilibrium state due to dilution when administered in blood.
  • the equilibrium state also shifts with temperature. For example, when the temperature rises, the equilibrium state shifts to the free side, which can promote the release. It is also affected by the mobility of the molecular assembly.
  • the gel-liquid crystal phase transition temperature is at 42 ° C, but it is 40 ° C near the phase transition temperature or higher than the phase transition temperature than 35 ° C below the phase transition temperature.
  • the molecular packing state of the membrane is more disturbed and is more likely to be released. Therefore, amphipathic molecules can be locally released from the molecular assembly by local heating with a warmer, infrared, microwave, or catheter.
  • the temperature of the ribosome can be locally controlled by encapsulating iron oxide fine particles in a ribosome and heating it with a microwave.
  • the phase transition temperature can be changed by changing the combination of lipids having different phase transition temperatures and their composition, for example, dimyristoyl phosphatidylcholine and dipalmitoyl phosphatidylcholine.
  • a temperature-responsive polymer such as poly- (N-isopropyl acrylamide) (PNIPAM) is a hydrophilic polymer of a free amphiphilic molecule, the hydrophilicity increases and is released below the phase transition temperature. It becomes easy.
  • the release rate of the amphiphilic molecules from the molecular assembly can be adjusted, for example, by utilizing changes in the concentrations of protons, alkali metal ions, and alkaline earth metal ions. For example, if an amino group is provided in the hydrophilic part, the hydrophilicity is improved by the protonation of the amino group at a low pH, and the release rate is increased. Also, if a hydrophilic rubonic acid group is added to the hydrophilic part, the hydrophilicity is improved by dissociation of the carboxylic acid group at high pH The release rate increases.
  • the binding site B is lysine
  • a long chain alcohol is ester-bonded to the strong lpoxyl group to introduce a hydrophobic part
  • a long-chain fatty acid is amide-bonded to the amino group to introduce a hydrophobic part.
  • This release greatly disturbs the molecular packing state of the bilayer membrane of the ribosome and promotes the release of the encapsulated drug, so that the pharmacokinetics of the drug carrier can be controlled.
  • This pharmacokinetics can include not only blood flow, organs, and tissues but also intracellular cells, and a system that releases amphipathic molecules in response to pH changes is also used to control intracellular kinetics.
  • amphiphilic molecules having a phosphate group in the hydrophilic part bind to divalent cations such as calcium ions, and the hydrophilic monohydrophobic balance tilts toward the hydrophobic side, reducing the release rate.
  • This phenomenon can also be used in the present invention.
  • the suppressed release rate can be promoted by capturing this calcium ion with a chelating agent such as taenoic acid.
  • charge shielding occurs as the ionic strength of the aqueous phase increases. Movement to the hydrophobic side decreases the release rate.
  • the binding site B of the liberated amphiphilic molecule contains a disulfide bond at the hydrophobic part, and that the release of the amphiphilic molecule from the molecular assembly is a cleavage by disulfide bond reduction.
  • an amphiphilic molecule for example, a fatty acid is introduced into the amino group of cystine through an amide bond, and the other hydrophobic part is an alkane- Examples include those introduced into the mercapto group of cysteine via a disulfide bond of Honore, and having a hydrophilic moiety introduced into the carboxylic acid group.
  • a method of introducing a disulfide group into the hydrophobic alkyl chain is also effective. This includes the case of introduction into the hydrophobic part of the transmembrane amphiphilic molecule from 6 to 11 described above. Multiple disulfide groups can be introduced. When introduced into the binding site, it is preferably introduced into binding site B.
  • lysine was used as a spacer (corresponding to the binding site B), and a compound having polyethylene glycol (PEG) in the hydrophilic part and two alkyl groups in the hydrophobic part was synthesized.
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG lipid the introduction stability of the lysine-type PEG lipid obtained by the method of Example 1 (hereinafter referred to as “PEG lipid”) into the endoplasmic reticulum and the inhibitory effect on the endoplasmic reticulum aggregation were correlated with the PEG lipid structure. Revealed.
  • a PEG lipid aqueous solution (17.0 ⁇ M, 22.6 mL) was mixed with the endoplasmic reticulum dispersion (17.0 mM, 15.0 mL) and stirred at 37 ° C. to obtain a PEG lipid-introduced endoplasmic reticulum dispersion.
  • This PEG lipid-introduced endoplasmic reticulum dispersion was diluted 6-fold with phosphate buffer (PBS, pH 7.0), and the amount introduced was measured over time until 12 hours later. The amount introduced can be calculated as follows (Yoshioka, H. Biomaterials 1991, 12, 861). ,
  • [PEG-lipid] AX (Hp EG + / H PEG- ) (mol%)
  • Fig. 2 shows the observation results (1H-NMR) of PEG lipid desorption from the endoplasmic reticulum after 6-fold dilution with PBS (pH 7.0).
  • the symbols in Figure 2 are ( ⁇ ) P50-2C14, ( ⁇ ) P125-2C14, ( ⁇ ) P50-2C16, ( ⁇ ) P125-2C16, ( ⁇ ) P125-2C18, ( ⁇ ) P125-4C16, ( ⁇ ) P50-DPPE, (PE) P125-DSPE.
  • P125-2C18 PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (-(CH 2 ) 16 CH 3 X 2)
  • P125-4C16 PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (-( CH 2 ) 14 CH 3 X 4)
  • P50-2C16 PEG molecular weight (5000) and hydrophobic groups (-(CH 2 ) 14 CH 3 X 2)) were not desorbed, but P125- DSPE (PEG lipid with PEG molecular weight (12500) bound to distearoylphosphatidylethanolamine DSPE) or P125-2C16 (PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (-(CH 2 ) 14 CH 3 X 2)) for 3 hours Later, about 8% and about 10% were detached from the endoplasmic reticulum, respectively.
  • P50-2C14 PEG molecular weight (5000), hydrophobic group (-(CH 2 ) 12 CH 3 X 2)
  • P125-2C14 PEG molecular weight (12500), hydrophobic group (-(C3 ⁇ 4) 12 CH 3 X 2 In)
  • about 20 and 30% were detached from the endoplasmic reticulum after 12 hours, respectively. Therefore, by increasing the molecular weight of the PEG chain or shortening the alkyl chain length, the PEG chain on the surface of the ribosome can be easily detached, and the directivity can be increased while controlling the blood retention.
  • P50-2C16 showed no detachment
  • P50-DPPE PEG molecular weight (5000) hydrophobic group (-(CH 2 ) 16 CH 3 X 2)
  • P50-DPPE is a PEG lipid with a PEG molecular weight (5000) bound to dipalmitoylphosphatidylethanolamine.
  • the hydrophilicity of the whole lipid can be affected by the hydrophilicity of the phospholipid head, while the lysine-type PEG lipid does not have that effect, but also has an amide binding site and endoplasmic reticulum in the lysine backbone. It is thought that hydrogen bonds in the phospholipid ester part contribute to stable introduction.
  • the disulfide in the hydrophobic part may be cleaved by (catalytic reduction or strong acid)
  • the Boc group that can be deprotected with a weak acid was selected. In order to prevent cleavage of the Boc group, acid mixing and heating were avoided as much as possible.
  • 2,2'-dipyridyl disulfide (2-PD, 4.3 g, 19.2 mmol) was stirred in 20 mL distilled THF for 1 hour in a nitrogen atmosphere and deoxygenated, then 1,10-decanedithiol (1.0 g, 4.8 mmol) was added.
  • PD groups were introduced at both ends of 1,10-decanedithiol by the conversion reaction (0.82 g, yield 40%).
  • the amount introduced was fluorescently labeled with fluorescamine on both terminal amino groups of the transmembrane lipid and quantified by fluorescence measurement.
  • fluorescamine on both terminal amino groups of the transmembrane lipid and quantified by fluorescence measurement.
  • Thvrogrobulin 670 4.5 [Preparation of protein].
  • the ⁇ -Lactalbumin-bound ribosome with the least detachment from the above detachment evaluation was evaluated by allowing L-cysteine (Cys), a membrane-permeable reducing agent, to coexist in the outer aqueous phase.
  • Cys L-cysteine
  • Fig. 4 The symbols in Fig. 4 represent ( ⁇ ) ⁇ ; -Lactalbumin (Cys-free system) and ( ⁇ ) a -Lactalbumin + Cys solution (Cys-added system), respectively. .
  • a benzene solution (100 mL) of p_toluesulfonic acid monohydrate (4.56 g, 24 mmol) was refluxed at 85 ° C., and water was removed using Ginster before the reaction.
  • Glutamic acid (2.96 g, 20 mmol) and hexadecyl alcohol (10.7 g, 44 mmol), or octadecyl alcohol (10.7 g, 44 mmol) were added to the reaction solution, and the generated water was removed for 10 hours. The boiling point was refluxed. As the reaction progressed, the suspension gradually dissolved and turned yellow and transparent.
  • the CMC of compound 21 was 20 ⁇ ⁇ ⁇ , whereas that of compound 22 was 18 ⁇ , and the CMC decreased slightly by changing the alkyl chain length from C16 to C18.
  • the CMC of Compound 23 was 8.0 ⁇ and that of Compound 24 was 7.0 ⁇ , and a significant decrease in CMC was observed when the number of alkyl chains was increased from 2 to 4. From this, it was confirmed that increasing the number of alkyl chains is effective in increasing hydrophobic interaction.
  • the results are shown in FIG.
  • the symbols in FIG. 5 represent (b) 21 (2C16), (concealed) 22 (2C18), (0) 23 (4C16), ( ⁇ ) 24 (4C18), respectively.
  • granulation (000 ⁇ 8QO ⁇ 650 ⁇ 450 ⁇ 300 ⁇ 220 nm X 2) was performed using an extractor, and the particle size was controlled.
  • the outer aqueous phase was removed by centrifugation (10,000 rpm, 5 min ⁇ 3) and redispersed in PBS to prepare a glycolipid-containing ribosome dispersion.
  • Catalase (from bovie liver) 232 5.5
  • Thyroglobulin ffrom bovie thvroid 670 4.5
  • SPDP-introduced protein solution 0.4 g / dL
  • Figure 7 shows the relationship between protein molecular weight and desorption rate.
  • the symbols in Fig. 7 represent (D) 21 (2C16), (Re) 22 (2C18), (0) 23 (4C16), (Reference) 24 (4C18), respectively.
  • the desorption rate was accelerated by 10.7 times (1.0% / hr to 10.7% / hr) with respect to an increase in protein molecular weight of 31 times (14 kDa to 440 kDa).
  • the desorption rate was 5.0 times (0.7% / hr to 3.9% / hr), and the desorption rate was hardly accelerated even when the molecular weight increased to a protein molecular weight of 440 kDa.
  • Nt-Boc-L-glutamic acid-g-butyl ester (764 mg, 2.52 mmol) and DCC (513 mg, 2.52 mmol) were dissolved in dichloromethane and stirred at 4 ° C for 30 minutes, then Glu2C16 (lg, 1.68 mmol) was added dropwise to the dissolved dichloromethane solution. The reaction solution was stirred at room temperature for 5 hours, and then the reaction solution was filtered and the solvent was removed under reduced pressure.
  • Compound 29 was prepared in the same manner as Compound 27, except that myristic acid was used instead of lauric acid.
  • the stability of the prepared ribosome was determined by particle size measurement using light scattering. As a result, the particle size of ribosome did not change with the membrane content of compound 28 (Table 7),
  • the dried mixed lipid powder was dissolved in black mouth form and detected by thin layer chromatography (silica gel plate, black mouth form / methanol (8/1) (volume / volume), detection: iodine). The detection results are as shown in Fig. 8.
  • FIG. Fig. 10 shows the results of measuring the release of encapsulated molecules over time at each pH.
  • the symbols in Fig. 10 indicate the measurement results at (country) ⁇ 3.5, ( ⁇ ) pH 4.5, ( ⁇ ) pH 5.5, ( ⁇ ) pH 6.5, (mouth) pH 7.3, ( ⁇ ) pH 11, respectively. .
  • Approximately 20% of the encapsulated fluorescent molecules were released at pH 3.5, but were hardly released at pH 6 or higher.
  • the ribosome with Compound 28 as a membrane component hydrolyzes Compound 28 at low pH, and the hydrolyzed lyso form of Compound 28 is more hydrophilic and is released from the endoplasmic reticulum. It is considered that the molecular packing state of the molecular film was disturbed and the release rate of the encapsulated fluorescent molecules was increased.
  • ribosomes containing 10 mol% of each of compounds 28 and 29 as membrane components were prepared and their pH responsiveness was verified.
  • the release of the encapsulated molecule was calculated from the above formula 1.1 based on the measurement result by measuring the fluorescence intensity in the same manner as described above.
  • the release rate after 10 minutes at each pH is shown in FIG.
  • Ribosomes containing Compound 28 or 29 as membrane components (10 mol%) released encapsulated molecules rapidly at pH 4.
  • Degradability due to increased release rate due to low pH The hydrolysis of lipid (compound 28 or 29) liberates the resulting lyso form, which disrupts the molecular packing state of the liposomal membrane and promotes the release of the encapsulated molecules.
  • a disulfide lipid having a disulfide group in the hydrophobic part was synthesized.
  • F 100 fluorescence intensity after complete solubility of liposomes
  • Figure 12 shows the results.
  • Fig. 12 - ⁇ -indicates a cysteine-added system, and -mouth- indicates a gluta-thione-added system.
  • the release of force lucein was promoted in the ribosome mixed with Glu-Cys-SC 16 as a membrane component due to the presence of the reducing agent.
  • the cysteine-added system showed a high release rate at each concentration, while the glutathione-added system increased the release rate in a concentration-dependent manner. This is because cystine is opposite to the endoplasmic reticulum membrane.
  • ⁇ the MP-Glu2C18 introduction rate 0 mol%
  • ⁇ is MP-Glu2C18 introduction rate 1 mole 0 /.
  • ⁇ indicates change over time at MP-Glu2C18 introduction rate of 2 mol%
  • mouth indicates MP-Glu2C18 introduction rate of 10 mol%.
  • An increase in solution turbidity was observed immediately after the addition of the Con A aqueous solution. This is thought to be because the added Con.
  • ⁇ indicates turbidity change after 0.5 minutes
  • ⁇ indicates turbidity change after 5 minutes.
  • An increase in turbidity was observed depending on the amount of MP-Glu2C18 introduced on the ribosome surface, and a sharp increase in turbidity was observed at an introduced amount of 2 mol% or more.
  • MAL-vesicle Removal of maleimide-introduced phospholipid endoplasmic reticulum (MAL-vesicle) was obtained (4 wt%, 6 mL).
  • Dodecapeptide (H12, 100 mM, lOO L) into which cysteine was introduced in advance at the N-terminal was added to MAL-vesicle and shaken (r ⁇ , 12 hours). Unbound H12 was removed by centrifugation (100,000 g, 30 min) to obtain H12-vesicle. ,
  • the amount of H12 bound on the surface of the endoplasmic reticulum was determined using HPLC (TSK-GEL G3000PW XL column, 7.8 mm od x 300 mm h, 1 mL / min, 36% (v / v) acetonito linole, 0.1% ( v / v) Quantified with trifluoroacetic acid) and back-calculated.
  • the H12-vesicle dispersion (17 mM, 5 mL) was mixed with an aqueous PEG lipid (P125-2C14) solution (17.0 ⁇ ,, 15.8 mL) and stirred at 37 ° C for 2 hours. Ultracentrifugation (33,000 rpm, 30 After removal of unintroduced PEG lipid at min), PEG lipid-introduced vesicles (PEG (H12) vesicle) were obtained.
  • the binding rate of PEG (H12) -vesicle (PEG (H12) -vesicle in FIG. 17) to activated platelets was 11.0%.
  • the binding rate increased with increasing dilution ratio of PEG (H12) -vesicle, and was almost equivalent to that of H12-vesicle after 300-fold dilution. This suggests that the detachment of PEG lipids by dilution was promoted and the function of H12 was expressed.
  • the drug carrier of the present invention can control the pharmacokinetics according to changes in the external environment, it is extremely useful as a preparation for the prevention / treatment of various diseases.

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Abstract

本発明は、生体内における薬物動態を制御することのできる薬物運搬体を提供することを課題とする。本発明は、薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であって、その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離することによって、上記課題を解決することができる。本発明においては、両親媒性分子が外部環境の変化によって親水性−疎水性バランスが親水性に傾くために分子集合体から遊離する現象を利用する。

Description

薬物運搬体 技術分野
本発明は、 分子集合体に薬物を担持させ、 分子集合体の構成成分の一部である 両親媒性分子が分子集合体から遊離する現象を利用して薬物動態を制御する薬物 運搬体製剤に関する。
明 背景技術 田
現在、 薬物を分子集合体中に組み込んだ薬物運搬体をドラッグデリバリーシス 書
テムとして利用する試みが盛んに研究され、 一部は既に臨床応用されている。 例 えば、 親水性の薬物に関しては、 リン脂質分子が集合して構築する二分子膜小胞 体、 いわゆるリボソームの内水相に内包させた薬物運搬体がある。 また、 疎水性 の薬物に関しては、 o/wェマルジヨンであるリピッドマイクロスフェア、 界面活 性剤または両親媒性高分子が構築するミセルなどの分子集合体の疎水部に物理的 に溶解あるいは化学的に担持させた薬物運搬体がある。 あるいはリボソームの二 - 分子膜疎水部に疎水性薬物を包埋させる場合もある。
これらの薬物運搬体を例えば血中に投与すると、 主に細網内皮系の発達した臓 器 (例えば脾臓、 肝臓など)の貪食細胞に取り込まれるため、 血中滞留時間は著し く短く、 これらの臓器を標的にする薬物運搬体に適用が限られる。 そのため、 血 中滞留時間を延長させる方策が採られている。 例え 水溶性で生体適合性の高い 高分子であるポリエチレンダリコール鎖などを被覆したリボソームが、 いわゆる ステルスリボソームとして多用されている。 この技術は、 Abuchowski らの血清 アルブミンをポリエチレングリコール鎖で修飾する研究からはじまり、 すでに 1990 年代前半にアデノシンデァミナーゼ、 ァスパラギナーゼを修飾したものが 臨床認可されている。 ポリエチレングリコール鎖にて蛋白質を修飾することで、 抗原性の減少、 血中滞留性の増大などの効果が得られることが報告されている。 ポリエチレングリコール鎖の表面修飾リボソーム 0 EG-リボソーム）は、 細網内 皮系の取り込みを回避し、 長時間血中に滞留することができる。 この特性を生か した、 固形癌組織へのパッシブターゲテイングがドラッグデリバリーシステムの 戦略の一つになっている。
一般的に固形癌組織は、 分岐の多い新生血管が異常に発達し、 その血管壁は薄 く不連続という特徴を有している。 血中滞留性の高い PEG-リボソームは、 その サイズを 300 nm以下にすると、 癌組織の透過性の高い血管壁を介して血中から 間質へ漏出することが可能となり、 一旦出たものは管腔側に戻りにくく蓄積する ようになる。 そのため、 PEG-リボソームは、 低分子の薬物よりも固形癌組織に 高い集積性が得られるという効果、 すなわち、 EPR効果を持っており、 腫瘍組 織へのターゲテイングにおいては重要な要素のひとつである。
最近では、 リボソーム表面に組織や臓器を特異的に認識する抗体、 インテグリ ンの一部、 またはリガンド分子を担持して、 積極的な認識によって組織または臓 器をターゲティングする試みが検討されている。 これをアクティブターグティン グと呼んでいる。 血中滞留時間を延長させる目的でポリエチレンダリコール鎖に て表面修飾されたリボソームでは、 この認識部位がポリエチレングリコール鎖で 隠されているとアクティブターゲティングが阻害されるため、 ポリエチレングリ コール鎖の末端め一部に認識部位を結合させる方法が採用されている。
一方、 別の側面であるリボソームの安定性から考えると、 分子集合体であるリ ポソームはそれを構成する両親媒性分子を何らかのエネルギー照射にて水中に分 散させ、 疎水性相互作用により自己集合する現象を利用して調製するため、 物理 化学的には準安定状態である。 従って、 保存時に凝集または融合が起こり、 やが て沈殿が起こる場合がある。 そのため、 血中安定性,も考慮してリボソームの構成 脂質には負電荷脂質またはコレステロールを混合させ、 ポリエチレングリコール 鎖または糖鎖でリボソームの表面を修飾することにより、 その解決が図られてき た。 そのため、 ポリエチレングリコール鎖によるリボソームの表面修飾の方法が 重要であり、 ポリエチレングリコール鎖をジァシルホスファチジルェタノールァ ミンまたはコレステロールに結合させた脂質が広く使用されている。 このポリェ チレングリコール結合ジァシル型脂質はリン脂質二分子膜小胞体から遊離するこ とが報告されている（J.R.Silvius and M.J.Zuckermann, Biochemistry, 32, 3153, 1993、 K.Sou, et al, Bioconjugate, 11, 372, 2000)。 この脂質の遊離速度は、 ポリエチレン グリコール鎖の分子量と疎水部の大きさ （ァシル鎖を構成する炭素数） 、 すなわ ち親水性一疎水性パランスによつて左右され、 親水部が相対的に大きい脂質が遊 離し易い。 そこで、 我々は、 モノデンドロン構造を利用して、 一本のポリエチレ ングリコール鎖と多数のアルキル鎖を結合させた脂質を開発し、 分子量の大きな ポリエチレンダリコール鎖を結合させても脱離し難い一連の両親媒性分子を手に することができた (特許第 3181276号公報)。 発明の開示
上述した研究背景の中で、 本発明者らは、 これまで合成した一連のポリェチレ ングリコール結合脂質を用いて、 ポリエチレングリコール結合脂質のポリエチレ ングリコール鎖の末端に更に親水性の認識部位、 例えば蛋白質などを結合させた 場合、 親水性一疎水性バランスがより親水性に傾くために遊離が起きてしまうこ とを明らかにした。 このため、 親水性の認識部位が遊離しないように当該認識部 位をリボソームの表面に安定担持させる目的で、 結合脂質の疎水部を大きくさせ ることを検討してきた。 しかし、 結果的には依然として遊離が起こり、 完全に遊 離を抑えることは困難であった。 そして、 完全に遊離を抑制する分子設計として は、 例えば膜貫通蛋白質のようにべプチド鎖を複数回膜に貫通させた分子構造が 必要であると思われた。 これに対し、 本発明者らは蛋白質結合ポリエチレンダリ コール鎖結合脂質の遊離現象を好ましく'ないものと考えずに、 むしろ遊離速度を 制御することによって、 リボソームの血中滞留性の制御や薬物の徐放性の制御に つながるとの発想の転換から、 遊離現象を積極的に利用する方針への変更を検討 するに至った。
本発明者らは、 両親媒性分子からなる分子集合体に薬物を担持させ、 分子集合 体を構成する脂質 （例えばポリエチレングリコール結合脂質） の遊離現象を利用 し、 薬物運搬体の体内動態が制御される薬物運搬体製剤を提供することを本発明 の課題のひとつとした。 さらに拡張して、 希釈効果 （濃度変化） 、 温度変化、 pH変化、 化学反応など様々な外部刺激によってその遊離が促進されれば、 薬物 運搬体の体内動態の積極的な制御法として利用できるので、 これも課題のひとつ とした。 そして、 本課題をリン脂質の分子集合体であるリボソームのみならず、 ェマルジヨンまたはミセルなどの分子集合系を基盤とした薬物運搬体全体への適 応に拡大させることも検討した。 ·
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意検討した結果、 分子集合体を構成す る両親媒性分子を所定の分子構造とし、 当該分子集合体の外部環境を変えること で両親媒性分子の遊離を任意に調節し得ることを見出し、 本発明を完成させるに 至った。
.すなわち、 本発明は、 薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であ つて、 その分子集合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって 分子集合体から遊離することによって、 生体内における薬物動態が制御される薬 物運搬体である。 より具体的に、 本発明は、 以下に示した薬物運搬体等を提供す るものである。
( 1 ) 薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であって、 その分子集 合体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊 離することによって、 生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体。
( 2 ) 遊離する両親媒性分子が、
(薬物)一 (結合部位 A )— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 1
または
(親水部)一 (結合部位 B )一 (疎水部)一 (結合部位 C )一 (薬物） 2
[式中、 結合部位 Aは親水部と薬物とを結合する部位であり、 結合部位 Bは親水 部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Cは疎水部と薬物とを結合する部 位である] で表されるものである （1 ) 記載の薬物 ¾搬体。
( 3 ) 遊離する両親媒性分子が、
(親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 3 または
(認識部位)一 (結合部位 E)— (親水性高分子)一 (結合部位 D )— (親水部）一 (結合部 位 B )— (疎水部） 4
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Dは親 水性高分子と親水部とを結合する部位であり、 結合部位 Eは認識部位と親水性高 分子とを結合する部位である] で表され、 この両親媒性分子の遊離によって生体 内における薬物動態が制御される （1) 記載の薬物運""搬体。
(4) (認識部位)一 (結合部位 E)— (親水部)一 (結合部位 B)— (疎水部） 5
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Eは認 識部位と親水部とを結合する部位である] で表される両親媒性分子 5が担持され ている分子集合体であって、 該分子集合体に導入されている
(親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B)— (疎水部） 3 t式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Dは親 水性高分子と親水部とを結合する部位である] で表される両親媒性分子 3が両親 媒性分子 5の認識を阻害する状態にあって、 両親媒性分子 3の遊離によって両親 媒性分子 5の認識能が発現されることで生体内における薬物動態が制御されるも のである （1) 記載の薬物運搬体。
(5) 遊離する両親媒性分子の疎水部が 2本以上 18本以下の炭化水素鎖を含有 するものである （1) から （4) までのいずれかに記載の薬物運搬体。 .
(6) 遊離する両親媒性分子の結合部位 Bにオリゴ糖鎖、 オリゴペプチド鎖、 ポ リエステル鎖、 ビュル系オリゴマーまたはデンドロン構造を含む （5) 記載の薬 物運搬体。
(7) 遊離する両親媒性分子が、
(薬物)一 (結合部位 A)— (親水部)— (結合部位 B)— (疎水部)一 (結合部位 B)— (親水 部） 6
または
(薬物)一 (結合部位 A)— (親水部)— (結合部位 B )一 (啤水部)一 (結合部位 B )— (親水 部)一 (結合部位 A)— (薬物） 7
[式中、 結合部位 Aは薬物と親水部とを結合する部位であり、 結合部位 Bは親水 部と疎水部とを結合する部位である] で表されるものである （1) 記載の薬物運 搬体。 '
(8) 遊離する両親某性分子が、
(親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B)— (疎水部)一 (結合部位 B)— (親水部） 8 または
(親水性高分子)— (結合部位 D)— (親水部)— (結合部位 B)— (疎水部)一 (結合部位 B)— (親水部)一 (結合部位 D)— (親水性高分子） 9
または
(認識部位)一 (結合部位 E)— (親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部）一 (結合部 位 B)—（疎水部）一（結合部位 B)—（親水部)一 (結合部位 D)— (親水性高分子） 10
または
(認識部位)一（結合部位 E )一 (親水性高分子）一 (結合部位 D ) - (親水部） - (結合部 位 B)— (疎水部）一（結合部位 B)— (親水部)一 (結合部位 D)— (親水性高分子）一 (結 合部位 E)— (認識部位） 1 1
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Dは親 水性高分子と親水部とを結合する部位であり、 結合部位 Eは認識部位と親水性高 分子とを結合する部位である] で表され、 この両親媒性分子の遊離によって生体 内における薬物動態が制御されるものである （1) 記載の薬物運搬体。
(9) 遊離する両親媒性分子の親水部または親水性高分子がポリエチレンダリコ ールを含有するものである （1) から （8) までのいずれかに記載の薬物運搬体。
(10) 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 この分子集合体の分散液の希 釈によるものである （1) から （9) までのいずれかに記載の薬物運搬体。
(1 1) 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 温度変化によるものである (1) から （10) までのいずれかに記載の薬物運搬体。
(12) 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 プロトン、 アルカリ金属ィォ ンおよびアル力リ土類金属イオンからなる群から選択される少なくとも 1種の濃 度変化によるものである （1) から （1 1) までのいずれかに記載の薬物運搬体。
(13) 遊離する両親媒性分子の親水部ど疎水部とを結合する部位または疎水部 に、 エステル結合、 アミ ド結合、 ウレタン結合及ぴシップ塩基からなる群から選 択される少なくとも 1種の結合を含有し、 かつ分子集合体からの両親媒性分子の 遊離がこれらの結合の加水分解によるものである （1) から （12) までのいず れかに記載の薬物運搬体。 (14) 遊離する両親媒性分子の親水部と疎水部とを結合する部位または疎水部 にジスルフイ ド結合を含有し、 かつ分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 ジ スルフイド結合の還元によるものである （1) から （1 3) までのいずれかに記 載の薬物運搬体。 .
(15) 両親媒性分子の遊離に伴う分子集合構造の一部または全体的な破壊によ つて、 分子集合体に保持されていた薬物が放出されるものである （1) から （1 4) までのいずれかに記載の薬物運搬体。
.(16) 分子集合体が小胞体構造を有するものである （1) から （1 5) までの いずれかに記載の薬物運搬体。
(17) 両親媒性分子の遊離に伴う小胞体構造の一部またば全体的な破壊によつ て、 小胞体内水相に保持されていた薬物が放出されるものである （1 6) 記載の 薬物運搬体。
本発明によれば、 その目的に応じて運搬する薬物の体内動態を制御することが できる薬物運搬体が提供される。 図面の簡単な説明
図 1 A'は、 本発明の薬物運搬体に用いる両親媒性分子のモデル構造を示した図 である。
図 1 Bは、 本発明の薬物運搬体に用いる両親媒性分子のモデル構造を示した図 である。
図 2は、 PEG脂質の小胞体からの脱離挙動を比較したグラフである。
図 3は、 蛋白質担持リボソームからの蛋白質結合膜貫通型脂質の脱離挙動を比 較したグラフである。
図 4は、 還元剤添加による蛋白質結合リボソームからの蛋白質の脱離挙動を比 較したグラフである。
図 5は、 糖脂質のアルキル鎖数の相違による糖脂質の CMC測定結果を示した グラフである。
図 6は、 蛋白質の相違による蛋白質結合リボソームからの蛋白質結合膜脂質の 脱離速度を比較したグラフである。 図 7は、 蛋白質分子量の相違による蛋白質結合リボソームからの蛋白質結合糖 脂質の脱離速度を比較したグラフである。 .
図 8は、 pH応答性リボソームの低 pH による加水分解後の薄層クロマトダラ フィ検出結果を示した図である。
図 9は、 pH応答性リボソーム中に内包された蛍光分子の pH変化による放出 動を示したグラフである。
図 1 0は、 pH応答性リボソーム中に内包された蛍光分子の各 pH における経 時的な放出挙動を示したグラフである。
図 1 1は、 pH応答性リボソーム中に内包された蛍光分子の pH 変化による放 出挙動を示したグラフである。
図 1 2は、 ジスルフィ ド脂質を含むリボソーム中に内包された力ルセインの還 元剤添加による放出挙動を示したグラフである。
図 1 3は、 種々の MP-Glu2C18導入率のリボソーム分散液に対して Con A溶 液を添加した際の分散液の濁度 (O.R値、 λ =600 nm)の経時変化を示したグラフで ある。
図 1 4は、 図 1 3の 0.5 分後、 5 分後の濁度 (O.R値、 λ =600 nm)変化を MP- Glu2C18導入率に対してプロットしたグラフである。
図 1 5は、 2mol%MP-Glu2C18導入リボソームに 1 mol%PEG脂質 (P125-2C14) を導入した系を、 希釈倍率を変化させて希釈し、 この系に Con A溶液を添加し た際の分散液の濁度 (O.R値、 λ =600 nm)の経時変化を示したグラフである。
図 1 6は、 H12-vesicle が活性化血小板と特異的に結合すること、 並びに H12- vesicle に PEG を導入することにより結合が抑制されることを示したグラフであ る。
図 1 7は、 PEG(H12)-vesicleの PEG脱離に伴う活性化血小板への結合率を比 較したグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明者らの分子集合科学に基づいた研究知見によれば、 すべての分子集合体 の構成分子は集合体と水相との間で平衡状態をとつており、 リン脂質の場合には その平衡は極めて集合体側に傾いている。 しかし、 親水性の高いポリエチレング リコール結合脂質、 疎水性の低い一本鎖の脂肪酸、 あるいはリン脂質のリゾ体な どはより多くの分子が水相に遊離している状態で平衡となっている。 そして、 両 親媒性分子の親水性一疎水性パランスの変化によってその両親媒性分子の遊離状 態が制御される現象は、 この平衡論に基づいて理解されている。 例えば、 分子集 合体の水性分散液において、 分子集合体が濃厚な状態では、 遊離させたい両親媒 性分子の平街は集合体に傾いている。 これを希釈すると、 平衡状態は水相への遊 離状態に傾き、 遊離させたい両親媒性分子は遊離して新たな平衡状態に達する。 また、 平衡状態は温度の関数であるため、 温度を上昇させると両親媒性分子は遊 離して新たな平衡状態に達する。 この様な物理的な因子で遊離を制御することが できる。 また、 化学的な因子としては、 両親媒性分子の疎水部や疎水部と親水部 との結合部位を化学的に切断して疎水部も小さくすることによって、 親水性一疎 水性のパランスが親水性側に傾き、 遊離を促進させることができる。 切断される 化学結合としては、 加水分解性のエステル結合、 アミ ド結合、 ウレタン結合また はシッフ塩基等、. または還元剤にて切断されるジスルフイド結合などが利用でき る。
具体的に、 本発明者らは、 親水性一疎水性バランスを調節できる両親媒性分子 として、 大きな親水部を持つポリエチレング、リコール型脂質、 例えばジァシルホ スファチジルエタノールアミンのァミノ基にポリエチレングリコールを共有結合 させた脂質、 グリセロールのジァシル誘導体の水酸基にポリエチレングリコール を共有結合させた脂質、 三官能性アミノ酸 (グルタミン酸ゃリジン)のジアルキル 誘導体のカルボキシル基ゃァミノ基にポリエチレングリコールを共有結合させた 脂質などの、 いわゆる大きな親水部に対してそれを二分子膜に安定周定させるた めの大きな疎水部を持つ必要性から分子設計を行い、 多ァシル型脂質の発明に至 つている （特許第 3181276 号)。 本発明者らは、 これらの両親媒性分子を用いて、 親水性一疎水性パランスが両親媒性分子の遊離速度に及ぼす影響を解析し、 大き な疎水部を有する两親媒性分子のリボソームへの固定と遊離に関して、 本発明の 基礎となる多くの知見を集積し、 さらに遊離を促進する物理的因子、 化学的因子. を整理した。 また、 本発明者は、 ポリエチレングリコール型脂質の固定とは逆の 想で、 こ の脂質の遊離によって、 むしろ効果的に外部刺激に応じた薬物の体内動態が制御 できるという発想に至った。
以下、 本発明の薬物運搬体についてより具体的に説明する。
まず、 本発明の薬物運搬体に用いられる分子集合体について述べる。 本発明の 薬物運搬体に用いられる分子集合体は、 薬物を担持させることができるものであ れば特に限定されない。 そのような分子集合体としては、 例えば、 高分子集合体、 高分子ミセル、 ェマルジヨン、 リ ピドマイクロスフィァ、 二分子膜小胞体（リポ ソーム）、 その他分子集合体 (チューブ、 ファイバー、 リボン、 シート等）を用い ることができる。 この分子集合体の構成成分としては、 外部環境の変化によって 分子集合体から遊離しうる両親媒性分子と、 この遊離性両親媒性分子と分子集合 体を形成する性質がある高分子とが含まれる。 分子集合体を形成する高分子とし ては、 遊離性の両親媒性分子と分子集合体を形成する性質があるもので.あれば特 に限定されず、 合成または天然の高分子を使用することができる。 合成高分子と しては、 例えば、 両親媒性のブロック共重合体または多糖類などの親水性の主鎖 に疎水性の置換基を持つくし型高分子、 あるいは両親媒性の膜タンパク質などが 挙げられる。 これらの高分子が形成する分子集合体 形状は高分子ミセルが一般 的であるが、 小胞体状またはファイバー状、 チューブ状、 シート状のものであつ てもよい。 あるいは、 ポリ [N-2(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミ ド] (PHPMA) またはポリ [ - (ィソプロピル)ァクリルアミ ド] (PNIPAM) などの温度応答性の ビニル系ポリマーなどが転移温度以上で形成する凝集体も分子集合体の構成成分 として使用できる。 ,
水と混じり合わないトリグリセリ ドなどの油滴をリン脂質などの界面活性剤な どで安定化させた o/wェマルジヨンゃリピドマイクロスフェアは、 脂溶性の薬物 の安定分散に多用される。 この場合、 薬物としては、 特に限定されるものではな いが、 例えばドキソルビシン誘導体またはパクリタキセルまたはメ トトレキセー トなどを用いることができる。
薬物運搬体として汎用されるリン脂質小胞体あるいはリボソームは、 脂質及び /又はリポタンパク質によって、 水性媒質中で分子間相互作用 (疎水性相互作用、 静電的相互作用、 水素結合など)することにより、 共有結合を介さ-ずに構成され た膜を持つ小胞構造の分子集合体であり、 その膜は単層 （一枚の二分子膜） 又は 多重層（ラメラ）膜を形成するものである。 そのサイズは数十ナノメートルから数 十マイクロメートルのものがあるが、 好ましくは 10 ナノメートルから 1マイク 口メートル、 より好ましくは 30ナノメートルから 300ナノメートルである。 そ の他、 二分子膜のシート状、 リポン状、 チューブ状またはファイバー状などの集 合形態があり、 これらも本発明でいう分子集合体に含まれる。
,小胞体構造を有する分子集合体は、 小胞体の内水相または二分子膜に水溶性や 脂^性の薬物を保持させることができ、 これにより血中滞留時間を延長させるこ とができるので好ましい。 小胞体構造を有するものの中でも、 特にリン脂質小胞 体あるいはリボソームが好ましい。
リン脂質小胞体あるいはリボソームは薬物運搬体の領域で.開発が進んでおり、 リン脂質単独、 あるいはリン脂質とコレステロール及び/又は脂肪酸との混合脂 質によって構成される。
リン脂質としては、 卵黄レシチン、 大豆レシチン、 水添卵黄レシチン、 水添大 豆レシチン、 ジァシルホスファチジルコリン、 ジァシルホスファチジルエタノー ルァミン、 スフ ンゴミエリン、 多種の糖脂質などが挙げられる。 これらのリン 脂質は、 ェン (二重結合)、 イン (三重結合)、 ジェン、 ジイン、 トリェンなどの不 飽和部を含有しても良いし、 ビニル基などの重合性基、 例えばスチリル基を含有 しても良い。.重合性リン脂質の具体例としては、 1,2-ジ (ォクタデカ -trans-2,trans- 4-ジエノィル）ホスファチジルコリン、 1,2-ジ（ォクタデ力- 2,4-ジエノィル）ホスフ ァチジン酸、 1,2-ビスエレォステアロイルホスファチジルコリンなどが挙げられ る。 リン脂質の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 5〜70 モル％ であることが好ましく、 20〜50モル％であることがより好ましい。
ァシル鎖を構成する脂肪酸としては、 炭素数 12〜20 の飽和孝たは不飽和脂肪 酸が用いられる。 例えば、 ミ リスチン酸、 パルミチン酸、 ステアリン酸、 ォレイ ン酸、 リノール酸、 リノレン酸、 ォクタデ力- 2，4-ジェン酸などがある。 更には、 グリセロール骨格ではなく、 3 官能性アミノ酸、 例えばグルタミン酸やリジン骨 格を持つ両イオン性などのァミノ酸型脂質も使用することができる。 脂肪酸の含 有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 1〜70 モル％であることが好ま しく、 5〜30モル0 /0であることがより好ましい。
分子集合体には、 負電荷脂質を成分として添加することもできる。 膜成分中に 負電荷脂質を混合させることで小胞体同士の凝集が抑制され、 被覆層数が減少し て内包効率を増大させることができるからである。 負電荷脂質としては、 ジァシ ルホスファチジルグリセロール、 ジァシルホスファチジン酸、 ジァシルホスファ チジルイノシトール、 ジァシルホスファチジルセリン、 ァニオン性アミノ酸型脂 質などが使用できる。 負電荷脂質の含有量は分子集合体の構成脂質の全モル数に. 対し、 1〜70 モル％であることが好ましく、 5〜30 モル％であることが特に好ま しい。
また、 分子集合体には、 脂質小胞体の膜成分としてステロール類を安定化剤と して添加してもよい。 そのようなステロール類としては、 例えば、 エルゴステロ -ール、 コレステロール等、 ペルヒ ドロシクロペンタノフエナントレンを有する全 てのステロイ ドが挙げられるが、 好ましくはコレステロールである。 ステロール 類の含有量に制限はないが、 小胞体膜の安定性を考慮すれば、 分子集合体の構成 脂質の全モル数に対レ、 5〜50モル0/。であることが好ましく、 より好ましくは 15 〜40モル0 /0である。
本発明において、 分子集合体には、 外部瘰境の変化によって分子集合体から遊 離しうる両親媒性分子が含まれる。 当該両親媒性分子の含有量は、 標的となる臓 器 ·組織、 薬物の種類、 薬物の担持部位、 担持方法、 分子集合体の形態等に応じ て適宜決定されるものであり、 特に制限はないが、 例えば、 分子集合体の構成脂 質の全モル数に対し、 0.01〜100 モル％であること力 S好ましく、 0.05〜50 モル0 /0 であることがより好ましく、 0.1〜30モル0 /0であることが特に好まし.い。
分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、 一般に公知の方法を用 いることができる。 例えば、 リボソームの製造の手法としては、 単独または混合 脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、 高圧押出し (エクス トルージ ヨン)法、 超音波照射法、 撹拌 (ポルテックスミキシング、 ホモジナイザー)法、 凍結融解法、 マイクロフルイダィザ一法などで製造する方法、 単独または'混合脂 質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、 エタノールやエーテルなど の有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、 あるいは、 単独または混 合脂質をコ一ル酸ナトリウム、 ドデシル硫酸ナトリウム、 TritonX またはラウリ ルエーテルなどの非ィオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマ/レジヨンを 形成させ、 透析によって除去して形成する方法、 その他、 逆相蒸発法、 インキュ' ベーシヨン法などを採用することができる。
このような分子集合体に薬物を担持させる方法は、 薬物の種類等に応じて適宜 選択すればよい。 水溶性薬剤の場合には、 例えば、 リボソーム製造時に薬剤を水 相に溶解させて調製することができる。 あるいは、 リボソームを製造した後に外 水相に水溶性薬剤を添加し、 リボソーム膜の透過性を利用して、 内水相に薬剤を 導入させることができる。 内包されなかった水溶性薬剤はゲルろ過、 超遠心分離 または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。 脂溶性薬剤の場合に は、 例えば、 単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で薬剤を混合して、 上述した方法でリボソームを形成させることにより、 二分子膜の疎水部に薬物を 導入することができる。 また、 官能基をもった両親媒性分子を含有するリポソ一 ムを形成させた後に、 リボソーム表面に露出している官能基に、 水相での化学反 応を用いて薬物を担持させることもできる。 あるいは、 あらかじめリボソームを 製造した後、 水と混じり合う有機溶媒に薬剤を溶解させ、 これを外水相に添加し て薬剤を二分子膜の疎水部に導入させることができる。
次に、 本発明の薬物運搬体の具体的態様について述べる。
本発明においては、 分子集合体の外部環境の変化によって、 分子集合体を構成 する一部の両親媒性分子が分子集合体から遊離する現象を利用する。 本発明の薬 物運搬体は、.この両親媒性分子の遊離現象によって、、生体内における薬物動態を 制御するものである。 「外部環境」 とは、 分子集合体をとりまく環境を意味し、 温度、 pH、 分子集合体の希釈度、 イオン環境、 還元的雰囲気などが挙げられる。 分子集合体から遊離する両親媒性分子は、 その分子内の親水部一疎水部パラン スによって分子集合体からの遊離速度を制御することが可能である。 遊離速度は、 標的となる臓器 ·組織、 薬物の種類、 薬物の担持部位、 担持方法、 分子集合体の 形態等に応じて適宜調節することができる。 例えば、 親水部に対し疎水部の比率 が大きくなるよう 設計することにより、 遊離速度を低下させることができる。 逆に、 疎水部に対し親水部の比率を大きくすることにより遊離速度を増大させる ことができる。
本発明の薬物運搬体は、 分子集合体から一部の両親媒性分子が遊離することに よって薬物動態を制御できるものであれば特に限定されない。 本発明の薬物運搬 体は、 遊離する両親媒性分子の親水部、 疎水部、 薬物及び親水性高分子の組み合 わせ並びに制御法により、 例えば次の 4つの態様が挙げられる。
本発明の第 1の態様は、 遊離する両親媒性分子の親水部あるいは疎水部に薬物 .を担持させることによって薬物動態を制御する態様である （図 l A( a )) 。 本発 明の第 2の態様は、 遊離する両親媒性分子の親水部に、 親水性高分子、 又は認識 部位が結合した親水性高分子を担持させることによって薬物動態を制御する態様 である （図 l A( b )) 。 本発明め第 3の態様は、 両親媒性分子が分子集合体から 遊離してリポソーム等のキヤリァー表面の認識部位が発現することによって薬物 動態を制御する態様である （アクティブターゲティング、 図 l A( c )) 。 本発明 の第 4の態様は、 遊離する両親媒性分子が特に膜貫通型の構造を有することによ つて薬物動態を制御する態様である （図 l B ( d )) 。 以下、 各態様について説明 する。
(第 1の態様） ' .
本発明の第 1の態様の薬物運搬体は、 ¾離する両親媒性分子が薬物、 親水部及 ぴ疎水部から構成されており、 遊離する両親媒性分子に薬物を担持させることに よって薬物動態を制御するというものである （図 l A( a )) 。 本態様における分 子集合体から遊離する薬物を結合させた両親媒性分子 （以下 「薬物結合両親媒性 分子」 ということがある。 ） の構造としては、 両親媒性分子 1および 2 ： (薬物)— (結合部位 A)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 1
(親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部)一 (結合部位 C)一 (薬物） 2
[式中、 結合部位 Aほ親水部と薬物とを結合する部位であり、 結合部位 Bは親水 部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Cは疎水部と薬物とを結合する部 位である] が挙げられる。
(親水部)一 (結合部位 B )—(疎水部)は、 リン脂質、 スフインゴ脂質、 またはァ ' ミノ酸型脂質などとして知られる公知の全ての両親媒性分子を対象とすることが できる。 親水部には、 通常の両親媒性分子の親水部として用いられるものの他、 ポリエチレングリ コール、 多糖類、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ ビニルピロリ ド ン、 ポリグルタミン酸、 ポリ.ペプチドなどの親水性の高分子を含有する場合もあ る。 '
. 結合部位 Bは、 親水部と疎水部とを結合する部位であり、 両親媒性分子におい て通常このような機能をもつものとして知られているものであれば特に限定され ない。 結合部位 Bは、 グリセロール、 オリゴ糖類、 オリゴペプチド類、 ポリエス テル類、 ビュル系オリゴマー、 グルタミン酸またはリジンなどのアミノ酸、 ある いはこれらから構成される多分岐構造、 たとえばデンドロン構造などを介して、 一つの親水部と一つまたは二つ以上の疎水部とを結合している。 これらの中でも、 結合部位 Bは、 オリゴ糖鎖、 オリゴペプチド鎖、 ポリエステル鎖、 ビニル系オリ ゴマーおょぴデンドロン構造からなる群から選択される少なくとも 1種であるこ とが好ましい。 例えば、 グリシンュニットをスぺーサ一としたグルタミン酸の繰 返しからなるオリゴペプチド鎖は、 側鎖にカルボン酸基を任意の数だけもってお り、 そこに疎水部をアミ ド結合またはエステル結合にて任意の数だけ導入するこ とができ、 親水部はオリゴペプチド鎖の N末端に結合できる。 あるいは、 オリゴ アクリル酸またはォ ゴビニルアルコールのカルポン酸基またはヒ ドロキシル基 に疎水部を高分子反応にて結合させることができる。 例えば、 ィニファーター重 合にてこれらのオリゴマーを重合させた場合、 分子糞を制御するとともに、 末端 に官能基を導入させることができるため、-この末端に親水部を結合させることが できる。 あるいは、 グルタミン酸またはリジンからなるモノデンドロンでは、 末 端の官能基の数を世代数にて制御できる。 第一世代では 2個、 第二世代では 4個、 第三世代では 8個となる。 ここに疎水部を結合させることによって疎水部の数を 制御することができる。 親水部はモノデンドロンの逆側に 1個ある官能基に結合 させることができる。
疎水部は、 両親媒性分子に十分な疎水性を付与できるものであれば特に限定さ れない 例えば、 疎水部としては、 飽和脂肪酸、 不飽和脂肪酸、 飽和高級アルコ ール、 不飽和高級アルコール、 ステロイ ド類などが使用される。 これらは直鎖で あってもよく分岐鎖であってもよい。
本発明においては、 遊離する両親媒性分子の疎水部が 2本以上の炭化水素鎖を 有することが好ましい。 ここでいう 「疎水部が 2本以上の炭化水素鎖を有する」 とは、 結合部位 Bに炭化水素鎖が 2本以上結合する場合をいう。 炭化水素鎖は分 岐鎖であってもよく、 分岐鎖としては、 例えば、 長鎖にイソプレノイド構造を持 つものが挙げられる。
炭化水素鎖の数は特に限定されないが、 2本以上が好ましい。 炭化水素鎖の数 には上限は特に設定されないが、 合成が容易である点で通常は 1 8本以下である ことが好ましい。
疎水部に導入される炭化水素鎖としては、 アルキル鎖、 アルケニル鎖またはァ ルキニル鎖が好ましく、 立体障害を最小にすることができ分子集合体に導入しや すいことから、 特にアルキル鎖が好ましい。 これらの炭化水素鎖は、 両親媒性分 子の疎水部として十分な疎水性を示し、 かつ、 分子集合体への導入を阻害しない 範囲であれば、 置換基を有していてもよい。 また、 炭化水素鎖は、 酸素原子、 硫 黄原子、 一 N R— （ただし、 Rは置換基を有していてもよいアルキル基、 ァルケ ニル基またはアルキニル基を表す。 ） 等で、 中断されていてもよい。 炭化水素鎖 の炭素数は特に限定されるものではないが、 4 〜 2 4が好ましく、 1 0 〜 2 0が より好ましく、 1 2 〜 1 8が特に好ましい。 なお、 結合部位 Bとしてグルタミン 酸またはリジンを含む場合には、 これらの持つ 2個のカルボン酸基または 2個の ァミノ基に、 上記の疎水部を結合させることもできる。
具体的に、 （親水部）一 (結合部位 B )— (疎水部)で表される両親媒性分子として は、 ポリエチレングリコール脂質、 糖脂質、 ペプチド結合脂質、 蛋白質 (抗体、 酵素等)結合脂質、 核酸等薬物結合両親媒性分子、 多ァシル鎖型脂質、 膜貫通型 脂質などが採用できる。 ポリエチレングリコール脂質の例としては、 分子量 200 Daから 12500 Da程度、 好ましくは 1000 Daから 5000 Da程度の片末端、 あるい は両末端にアミノ基、 カルボキシル基、 水酸基、 マレイミ ド基等の置換基を持つ ポリエチレングリコーノレ、 エチレングリコーノレとプロピレンダリコーノレとの共重 合体などが挙げられ、 またそれらの末端置換基を活性化した誘導体も含まれる。 糖脂質は還元性末端基を有するもので、 分岐またほ直鎖の糖重合度が 2〜400 の オリゴ糖ゃ多糖であればよく、 天然糠または合成糖のいずれでも良い。 オリゴ糖 は、 例えば、 グノレコース、 フノレク トース、 キシロース、 ガラクース、 マンノース、 ダルコサミン等の一種又は二種以上が α結合または iS結合した糖であり、 例えば、 マルトオリゴ糠、 ラミナリオリゴ糖、 セロオリゴ糖、 イソマルトオリゴ糖、 ゲン チォオリゴ糖、. ニグ口オリゴ糖、 ラクトオリ'ゴ糖、 メリオリゴ糖、 ィヌロオリゴ 糖などが挙げられる。 多糖類では、 デンプン、 セルロース、 ムコ多糖類（ヒアル ロン酸、 コンドロイチン、 コンドロイチン硫酸、 デルマンタン硫酸、 ケタラン硫 酸、 ベパリン等)、 キチン、 キトサン、 その他多糖類の分解物、 細胞、 細菌由来 の複合糖質等が挙げられる。
本態様において、 薬物は、 結合部位 Aによって親水部に結合された式 1で表さ れる両親媒性分子 1、 または、 結合部位 Cによって疎水部末端に結合された式 2 で表される両親媒性分子 2によって分子集合体に共集合により導入される。 結合 部位 A、 Cは、 それぞれ薬物を親水部または疎水部と結合する部位である。 結合 部位 A、. Cとしては、 アミ ド結合、 エステル結合、 エーテル結合、 ウレタン結合、 ジスルフィ ド結合、 メルカプト基とマレイミ ド基とが付加した結合などが挙げら れる。 '
本発明の薬物運搬体に担持させることのできる薬物は、 少なくとも標的となる 臓器または組織の一つに作用するものであれば特に限定されない。 そのような薬— 物としては、 例えば、 酵素、 ペプチド又はタンパク質、 各種抗生物質、 各種ぺプ チド性ホルモン、 DNA、 RNA、 siRNA、 プラスミ ド、、各種抗がん剤、 中枢神経系 用薬、 末梢神経用剤、 感覚器官用薬、 循環器官用薬、 呼吸器官用薬、 消化器官用 薬、 ホルモン剤、 泌尿生殖器官および肛門用薬、 外皮用薬、 歯科口腔用剤、 ビタ ミン剤、 滋養強壮薬、 血液および体液用薬、 人工透析用薬、 その他の代謝性医薬 品、 細胞賦活用剤、 腫瘍用薬、 放射性医薬品 アレルギー用薬、 生薬および漢方 処方に基づく医薬品、 抗生物質製剤、 化学療法剤、 生物学的製剤、 診断用薬など がある。.ペプチドまたはタ パク質の一例としては、 インターロイキン等の各種 サイト力イン、 細胞伝達因子、 フイブリノ一ゲン、 コラーゲン、 ケラチン、 プロ テオグルカン等細胞外マトリックス剤としてのポリぺプチドまたはその構造の一 部としてのオリゴ体、 あるいはォキシトシン、 ブラジキニン、 チロ トロビン放出 因子、 エンケフアリン等の機能性ポリペプチドが挙げられる。 酵素としては、 力 タラーゼ、 キモトリブシン、 チトクローム、 アミラーゼなどが挙げられるが、 こ れらに何ら限定されるものではない。 これらの薬物は、 1種単独で用いてもよく、 2種以上を組み合わせて用いることもできる。
この分子集合体を、 例えば、 血中に投与すると、 分子集合体が希釈されること によって、 リボソームに担持された薬物結合両親媒性分子が遊離する。 遊離した 薬物結合両親媒性分子は、 血流に乗って循環し、 吸収 ·代謝 ·排泄きれる。 この ため、 薬物結合両親媒性分子は平衡に達することなく分子集合体から一方的に遊 離する。 遊離速度は、 薬物結合両親媒性分子の親水性一疎水性パランスが親水性 側に傾いた両親媒性分子ほど速い。 この遊離速度は、 親水部における親水性高分 子の分子量または電荷量、 あるいは疎水部におけるアルキル長鎖などの炭化水素 鎖の長さまたは本数によって制御することができる。
両親媒性分子 1または 2の親水性一疎水性バランスは、 薬物の種類、.標的とな る臓器または組織、 病態、 両親媒性分子 1または 2自体の動態などに応じて適宜 設計すればよい。 この様な両親媒性分子 1または 2は、 上述した方法により分子 集合体、 例えばリン脂質からなるリポソームの二分子膜に導入することができる。 第 1の態様において、 両親媒性分子 1および 2の含有量は、 薬物の種類、 標的 となる臓器または組織、 病態などに応じて適宜決定されるものではあるが、 それ ぞれ、 分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 0.01〜30 モル％であることが 好ましく、 0.1〜10モル％であることが特に好ましい。
(第 2の態様）
本発明の第 2の態様の薬物運搬体は、 遊離する両親媒性分子の親水部に、 親水 性高分子、 又は認識部位が結合した親水性高分子を担持させることによつて薬物 動態を制御するというものである （図 l A( b )) 。 本発明の第 2の態様の薬物運 搬体は、 第 1の態様の 「薬物」 の部分が 「親水性高分子」 となっており、 基本的 に親水性高分子、 親水部及ぴ疎水部を含むものである。 また、 本態様には、 親水 性高分子に、 さらに認識部位が結合されたものも含まれる。 本態様における分子集合体から遊離する両親媒性分子の構造としては、 分子内 に親水性高分子が結合した両親媒性分子 3および 4 '： (親水性高分子)— (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 3
(認識部位)一 (結合部位 E)— (親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)— (結合部 位 B )— (疎水部） 4
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Dは親 水性高分子と親水部とを結合する部位であり、 結合部位 Eは認識部位と親水性高 分子とを結合する部位である] が挙げられる。
式 3または 4で表される両親媒性分子は、 例えばリン脂質と共集合させること により、 リポソームの表面を親水性高分子によって修飾することができるもので ある。 親水性高分子としては、 第 1の態様の親水部の説明で記載したものと同じ ものを使用できる。 親水性高分子の分子量は 200 Daから 20000 Da程度であるこ とが好ましく、 2000 Daから 12500 Da程度であるこ-とが特に好ましい。 親水性 高分子がポリエチレングリコール鎖であれば、 修飾していないリボソームと比較 してリボソームの血中滞留時間を大幅に延¾させる効果がある。 また、 親水性高 分子自体を、 臓器または組織を構成する細胞に認識されやすい多糖類とすること により、 その臓器または組織に対する特異性を高めることができる。 特に、 両親 媒性分子 4は、 例えば表面修飾ポリエチレングリコール鎖などの親水性高分子の 末端にオリゴペプチド鎖または糖鎖などの認識部位を有しており、 薬物運搬体の 体内動態を制御することができる。
本発明では、 両親媒性分子 3または 4が外部環境の変化で遊離することによつ て、 薬物運搬体の体内動態をより精度よく制御することができる。 例えば、 リポ ソームを修飾しているポリエチレングリコール結合脂質がリボソームの血中滞留 時間を増大させているが、 これがリボソームから遊離することによって、 血中滞 留時間を短くすることができる。 遊離する速度は、 ポリエチレングリコールの分 子量または疎水部の大きさによって調節できる。 また、 両親媒性分子 4を導入し • たリボソームでは、 両親媒性分子 4を認識する臓器または組織を構成する細胞へ の特異的な集積性を高めることができるが、 両親媒性分子 4の遊離によって特異 性が低下して、 さらに遊離した両親媒性分子 4がその被認識部位に結合して、 両 親媒性分子 4が修飾されているリポソームの認識を阻害するのでより特異性が低 下する。 更には、 両親媒性分子 3および 4を混合してリボソーム表面に導入し、 更にそれらの遊離速度を各々制御することによってより精度高く薬物運搬体の体 内動態を制御することができる。 - + 結合部位 Dまたは Eは、 それぞれ親水性高分子と親水部との結合、 あるいは親 水性高分子と認識部位との結合であれば特に限定されない。 そのような結合部位 Dまたは Eとしては、 例えば、 アミ ド結合、 エステル結合、 エーテル結合、 ウレ タン結合、 ジスルフィ ド結合、 メルカプト基とマレイミド基との縮合結合やアル デヒド基とアミノ基とのシッフ塩基などが挙げられる。
認識部位としては、 標的となる臓器または組織を特異的に認識するものであれ ば特に限定されない。 認識部位の一例としては、 上記記載のオリゴ糖、 抗体、 ぺ プチドホルモン、 レクチン、 .糖タンパク等が挙げられるが、 これらに限定される ものではない。
第 2の態様において、 両親媒性分子 3および 4の含有量は、 所望の血中対流時 間や認識能に応じて適宜決定されるものではあるが、 それぞれ、 分子集合体の構 成脂質の全モル数に対し、 0.01〜50 モル％であることが好ましく、 0.1〜20 モ ル％であることが特に好ましい。
(第 3の態様） .
本発明の第 3の態様の薬物運搬体は、 分子集合体を構成する一部の両親媒性分 子が遊離することによつて分子集合体表面の認識部位が発現し、 それにより薬物 動態を制御するというものである （図 l A( c )) 。 本態様の薬物運搬体としては、 例えば、 両親媒性分子 5が担持されている分子集合体であって、 該分子集合体に 導入されている両親媒性分子 3が両親媒性分子 5の認識を阻害する状態にあって、 両親媒性分子 3の遊離によって両親媒性分子 5の認識能が発現されることで薬物 動態が制御される薬物運搬体が挙げられる。
本態様において、 両親媒性分子 5および 3 ： (認識部位)一 (結合部位 E )一 (親水部)一 (結合部位 B )一 (疎水部） 5
(親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 3
[式中、 結合部位 Bおよび結合部位 Dは前記と同じ意味であり、 結合部位 Eは認 識部位と親水部とを結合する部位である。 ] を共に分子集合体の表面に共集合さ せる場合、 両親媒性分子 3の親水性高分子は、 両親媒性分子 5の認識部位よりも 分子量が大きい親水性高分子であることが好ましい。 このような組み合わせで両 親媒性分子を用いることにより、 親水性高分子によって分子集合体表面の認識部 位を、 臓器または組織の細胞による認識から阻害することができる。 この状態で 分子集合体を血中に投与すると希釈効果等の外部環境の変化によつて両親媒性分 子 3が遊離する。 これに伴って、 両親媒性分子 5の認識部位がリポソ一 Λの表面 に露出するとその認識部位によつて臓器または組織を構成する細胞への特異的な 集積性が高まるため、 薬物運搬体の体内動態を制御することができる。 さらに、 両親媒性分子 5が遊離することによつて特異的な集積性が低下し、 これによつて も薬物運搬体の体内動態を制御できる。 両親媒性分子 5の有する認識部位として は、 倉 2の態様で述べたものと同じものを 示することができる。
例えば、 両親媒性分子 5としては、 グルタミン酸またはリジンなどの親水部の 末端にオリゴぺプチド鎖または糖鎖などの認識部位を有するものが挙げられる。 特に糖鎖は糖結合タンパク質であるレクチンによつて構造特異的に認識されるこ とから、 糖鎖を認識部位として有する両親媒性分子 を含む分子集合体は、 細胞 膜表面上のタンパク質や糖鎖などのリガンドゃレセプターを特異的に認識するキ ャリアとして利用することができ、 有用性が高い。
両親媒性分子 3としては、 第 2の態様において述べたものと同じものを例示す ることができる。 本態様では、 両親媒性分子 3の有するポリエチレングリコール 鎖などの親水性高分子によって、 両親媒性分子 5の認識能が阻害される。 両親媒 性分子 3における親水性高分子は、 両親媒性分子 5の認識能を阻害できるもので あれば特に制限されないが、 分子量が 200 Daカゝら 20000 Da程度であることが好 ましく、 2000 Daから 12500 Da程度であることが特に好ましい。
第 3の態様において、 両親媒性分子 5の含有量ば、 所望の認識能に応じて適宜 決定されるものではあるが、 分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 0.01〜50 モル％であることが好ましく、 0.1〜30 モル％であることが特に好ましい。 また 親媒性分子 3の含有量は、 両親媒性分子 5の認識能を阻害できる範囲であれば 制限はないが、 分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 0.01〜30 モル％であ ることが好ましく、 0.05〜10モル％であることが特に好ましい。
. なお、 両親媒性分子 3の遊離速度は、 親水性高分子の分子量または電荷量ある いは疎水部の大きさによって制御することができる。 両親媒性分子 5の遊離速度 についても同様の方法で制御することができる。 従って、 これらの両親媒性分子 の相対的な遊離速度は目的に応じて適宜設計することができる。
(第 4の態様）
本発明の第 4の態様は、 分子集合体の膜を貫通する膜貫通型両親媒性分子が遊 離することによって、 薬物運搬体の体内動態を制御するというものである （図 1 B ( d )) 。 上述した第 1〜3の態様で例示した両親媒性分子の構造は、 遊離する 両親媒性分子が、 簡単には親水部一疎水部で示される構造で分類されるものであ るが、 本発明に用いられる両親媒性分子は親水部一疎水部一親水部で示される構 造で分類されるものであっても良い。 本態檫においては、 このような構造を有す る両親媒性分子が好ましい。
本態様に用いられる両親媒性分子としては、 具体的には、
(薬物)一 (转合部位 A)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部)一 (結合部位 B )— (親水 部） 6 (薬物)— (結合部位 A)— (親水部)— (結合部位 B )— (疎水部)一 (結合部位 B )— (親水 部)一 (結合部位 A)— (薬物） 7 '
(親水性高分子）一（結合部位 D)—（親水部）一（結合部位 B )—（疎水部)一 (結合部位 B )— (親水部） 8 (親水性高分子)一（結合部位 D )—（親水部）一（結合部位 B )—(疎水部)一 (結合部位 B )— (親水部)一 (結合部位 D)— (親水性高分子） 9 (認識部位)一 (結合部位 E )— (親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部）一 (結合部位 B )— (疎水部)一 (結合部位 B )— (親水部)一 (結合部位 D)— (親水性高分子） 1 0 ,
(認識部位)— (結合部位 E )— (親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部）— (結合部位 B )—（疎水部）一 (結合部位 B )— (親水部)一 (結合部位 D)— (親水性高分子）一（結合 部位 E)— (認識部位） 1 1
[式中、 結合部位 A、 結合部位 B、 結合部位 Dおよび結合部位 Eは前記と同じ意 味である。 ] で表される両親媒性分子などが挙げられる。 - これらの両親媒性分子は、 例えば、 リボソームの二分子膜において二分子膜を 貫通する構造で集合体中に導入される。 疎水部は一本鎖でも二本鎖以上でも構わ ないが、 これは結合部位 Bによって決まる。 また、 疎水部の長さは二分子膜を貫 通できる長さであれば構わないが、 炭素数では 2 0〜 5 .0、 好ましくは 2 8〜3 6である。 両親媒性分子 7または 9のような対称型の構造は合成が容易である力 例えばリボソームを形成した場合にリボソームの内水相側にも親水性高分子また は薬物が配向することになる。 このことは遊離速度の制御、 即ち薬物動態の制御 として都合が良い場合もあるが、 親水性高分子または薬物がリボソーム表面に露 出しないため、 これらが有効に機能し得ず、 無駄になる場合がある。 後者の場合 には、 リボソームに両親媒性分子を導入した後、 表面に露出している両親媒性分 子の末端にのみ薬物または親水性高分子を結合部位 Aまたは結合部位 Dを介して 結合させることもできる。 膜貫通型両親媒性分子の場合、 遊離速度の制御は親水 性一疎水性パランスのほか、 内水相に面.している親水部の大きさや電荷量も重要 な因子となる。 すなわち、 膜貫通型両親媒性分子の疎水性が低くても、 内水相に 面している親水性が強ければ膜貫通型両親媒性分子はリボソームから遊離し難く なる。 第 4の態様において、 両親媒性分子 6〜1 1の含有量は特に制限されないが、 それぞれ、 分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 0.01〜100 モル0 /0であるこ とが好ましく、 0.1〜25モル％であることが特に好ましい。
(両親媒性分子の遊離速度の制御方法）
両親媒性分子の分子集合体からの遊離現象は、 外部環境の変化により生じる。 「外部環境」 とは、 前述したように分子集合体をとりまく環境を意味し、 外部環 境としては、 例えば、 分子集合体を希釈するための希釈液、 分子集合体の温度を 変化させる周囲温度、 分子集合体の pHを変化させるための周囲水素イオン濃度 などが挙げられる。 このように外部環境の変化としては、 血中投与した際の希釈 に る平衡状態から非平衡状態へのシフトに限らない。 平衡状態は温度によって もシフトする。 例えば、 温度が上昇すると平衡状態は遊離側にシフトするので、 遊離を促進させることができる。 さらに分子集合体の運動性にも影響を受ける。 例えば、 ジパルミ トイ/レホスファチジルコリンリボソームの場合、 ゲル一液晶相 転移温度は 42°Cにあるが、 相転移温度以下の 35°Cよりも相転移温度付近の 40°C や相転移温度以上の.43°Cの方が膜の分子充填状態が乱れて遊離し易くなる。 従 つて、 カイロ、 赤外線、 マイクロウエーブまたはカテーテルなどによる局所加温 によつて分子集合体から両親媒性分子を局所的に遊離させることができる。 ある いは酸化鉄の微粒子をリボソームに内包させて、 これをマイクロウェーブで加温 させることによって、 当該リボソームの温度を局所的に制御できる。 相転移温度 は、 相転移温度の異なる脂質の組合せとその組成、 例えばジミリストイルフォス ファチジルコリンとジパルミ トイルフォスファチジルコリンの組成を変えること により変化させることができる。 また、 ポリ- (N-イソプロピルアクリルアミ ド) (PNIPAM)などの温度応答性高分子が.遊離する両親媒性分子の親水性高分子で あれば、 相転移温度以下では親水性が高まり遊離し易くなる。
分子集合体からの両親媒性分子の遊離速度は、 例えば、 プロ トン、 アルカリ金 属イオンおよびアルカリ土類金属イオンの濃度変化を利用することにより調節す ることができる。 例えば、 親水部にアミノ基を持たせれば、 低 pHでのアミノ基 のプロトン化によって親水性が向上し遊離速度が大きくなる。 また、 親水部に力 ルボン酸基を持たせれば、 高 pHでのカルボン酸基の解離によって親水性が向上 し遊離速度が大きくなる。
あるいは、 遊離する両親媒性分子の結合部位または疎水部にエステル結合、 ァ ミ ド結合、 ウレタン結合及びシッフ塩基からなる群から選択される少なくとも 1 種の結合を含有し、 分子集合体からの両親媒性分子遊離現象がこれらの結合の加 水分解によるものであることも好ましい。 例えば、 結合部位 Bがリジンであり、 その力ルポキシル基に長鎖アルコールをエステル結合させて疎水部を導入し、 更 にはァミノ基には長鎖脂肪酸をアミ ド結合させて疎水部を導入した両親媒性分子、 または結合部位が 2-ァミノペンタン二酸などのジカルボン酸誘導体であり、 そ のカルボキシル基に長鎖アルコールをエステル結合させて疎水部を導入した両親 媒性分子、 あるいはグリセロールに脂肪酸をエステル結合させて疎水部を導入し た両親媒性分子は、 pH の低下によって加水分解が起こり、 その結合が解離する ことによって両親媒性分子の親水性一疎水性バヲンスが大きく親水性側に傾き、 分解された両親媒性^^子の遊離が起こる。 この遊離によってリボソームの二分子 膜の分子充填状態が大きく乱れ、 内包された薬物の放出が促進されるので、 薬物 運搬体の体内動態を制御することができる。 この体内動態は、 血流または臓器、 組織のみならず細胞内をも含めることができ、 pH 変化に応答して両親媒性分子 を遊離する系は細胞内での動態制御にも用いられる。
また、 親水部にリン酸基を持つ両親媒性分子は、 カルシウムイオンなどの 2価 のカチオンと結合し、 親水性一疎水性パランスが疎水性側に傾き、 その遊離速度 が低下する。 本発明においてはこの現象も利用することができる。 更には、 タエ ン酸などのキレート剤によってこのカルシウムイオンを捕捉することによって、 抑制されていた遊離速度を促進させることもできる。 一般に、 解離基を親水部に もち、 これによつて親水性一疎水性パランスが制御されている両親媒性分子では、 水相のイオン強度の増大に伴って電荷遮蔽が起こるため、 このパランスは疎水性 側に移動して遊離速度が減少する。
遊離する両親媒性分子の結合部位 Bまたは疎水部にジスルフィド結合を含有し、 分子集合体からの両親媒性分子の遊離現象が、 ジスルフィ ド結合の還元による切 断であることも好ましい。 このような両親媒性分子としては、 例えば、 システィ ンのァミノ基に脂肪酸をアミ ド結合にて導入し、 もう一つの疎水部をアルカンチ- ォーノレのジスルフィ ド結合にてシスティンのメルカプト基に導入し、 カルボン酸 基には親水部を導入させたものが挙げられる。 あるいは、 疎水部のアルキル鎖に ジスルフィ ド基を導入させる方法も有効である。 これは上記の両親媒性分子 6か ら 1 1までの膜貫通型両親媒性分子の疎水部に導入する場合も含まれる。 ジスル ブイ ド基は複数導入することができる。 結合部位に導入する場合は、 結合部位 B に導入するのが好ましい。
これらのジスルフィ ド基は、 生体内または細胞内の還元作用、 例えばシスティ ンまたはグルタチオンなどによる還元によって切断されると、 両親媒性分子の親 水性一疎水性パランスが親水性側に傾き、 切断された両親媒性分子が遊離する。 本発明はこの現象を利用するものである。
その他、 外部環境の変化による両親媒性分子の分子集合体からの遊離を促進す る方法としては、 ずり応力、 振動、 光反応、 ラジカル反応、 活性酸素による過酸 化反応、 生体由来の界面活性作用などが挙げられるが、 これらに限定されるもの ではない。
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらにより 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
本実施例では、 リジンをスぺーサー （結合部位 Bに相当する) として親水部に ポリエチレングリコール (PEG)、 疎水部に 2本のアルキル基を有する化合物を合 成した。
(A) まず、 リジンの力ルポキシル基に保護基を以下のようにして導入した。 すなわち、 L-リジン（5.1 g、 35.2 mmol)、 p-トルェ,ンスルホン酸（14.7 g、 77.3 mmol)およびべンジルアルコール（14.0 g、 124.1 mmol)を溶媒ベンゼン (30 mL)に 溶解させ、 生成水を除去しながら、 100°Cで 6 時間還流させた。 溶媒を減圧除去 した後、 残分に対し、 ジェチルエーテルにて再沈殿精製を 3·回行った。 この精製 した生成物をメタノール ジェチルエーテルの混合溶媒から 4°Cで再結晶し、 濾 過し、 乾燥してカルボキシル基をべンジルエステルで保護したリジン誘導体 1 (化合物 1) を白色固体として得た ( 8.0 g、 収率 88 %)。 化合物 1
Figure imgf000028_0001
リジン誘導体 1 の分析結果：
薄層クロマ トグラフィ一（シリ力ゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量/容量）： Rf ： 0.2 (モノスポッ ト）。
赤外吸収スぺク トル (cm )： 3034； 2952 [ V N-H (NH3 +)] ； 1749 [vc=0 (エステル)] ；
Figure imgf000028_0002
1H-NMRスぺク トル（ DMSO-d6 , 500 MHz , S(ppm) )： 1.28 , 1.40 (m, 2Η, lys j3 - CH2)； 1.51 (m, 2H, lys y -CH2)； 1.80 (m, 2H, lys δ -CH2)； 2.29 (s, 6H， -CH3)； 2.70 (m, 2H, lys ε -CH2)； 4.09 (s, 1H, lys a -CH2)； 5.25 (s, 2H, -CH2)； 7.12， 7.48 (8H, p- Tos-aroma.)； 7.35-7.42 (5H, aroma.)； 7.67 , 8.38 (s, 6H, -NH3+)。
(B) リジン誘導体 1 のァミノ基に疎水性基としてアルキル基を以下のように して導入した。 すなわち、 パルミチン酸 (3.2 g、 12.4 mmol)と Ν,Ν'-ジシクロへキ シルカルポジィ 'ミ ド (2.6 g、 12.4. mmol)を溶媒ク口口ホルムに溶解させ 25°Cで 30 分間撹拌した後、 リジン誘導体 1 (3.0 g、 5.12 mmol)とトリェチルァミン (1.2 g、 11.4 mmol)を添加した。 この反応混合物を 4°Cで 12時間撹拌し、 グラスフィルタ 一 (G4)で濾過した後、 溶媒を減圧除去した。 残分をクロ口ホルム（100 mL)に再溶 解させ、 炭酸ナトリウム飽和水溶液で 3回、 水で 3回洗浄した。 クロ口ホルム層 を無水硫酸ナトリゥムで脱水した後、 溶媒を減圧除去した。 メタノール (200 mL) から 4°Cで再結晶し、 濾過後、 乾燥して各ァミノ基にそれぞれアルキル基をアミ ド結合させたリジン誘導体 2 (化合物 2) を白色固体として得た (2.9 g、 収率 79 ¾\
化合物 2
Figure imgf000028_0003
リジン誘導体 2の分析結果：
薄層クロマトグラフィ一（シリ力ゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量/容量)： Rf： 0.53 (モノスポット）。 - 赤外吸収スぺク トル (cm'1)： 3311 [ v N-H (アミ ド)]； 1748 [ v c=0 (エステル)] ; 1640 [ V c=o (ァミ ド)]； 1553 [ δ Ν-Η (ァミ ド): 1。
1H-NMRスぺク トル (CDC13, 500 MHz , 8 (ppm) )： 0.85 (t, 6H, -CH3)； 1.23 (s, 50H, -CH2-CH2- , lys γ -CH2)； 1.46 (m， 2H, lys δ -CH2)； 1.58 (m, 4H, -N-CO-C-CH2-)； 1.66 , 1.82 (m, 2H， lys β -CH2)； 2.12 , 2.20 (t, 4H, -N-CO-CH2-)； 3.16 (m, 2H, lys ε - CH2)； 4.58 (s, IH, lys a -CH2)； 5.13 (s, 2H, -CH2)； 5.65 (br, IH, -NH-CO-)； 6.16 (d, IH, -NH-CO-)； 7.29-7.37 (5H, aroma.)。
(C) リジン誘導体 2 (1.52 g、 2.13 mmol)をク口口ホルム/メタノール混合溶媒 (10 / 7 (容量/容量））に溶解させ、 1規定の水酸化ナトリゥム水溶液 (3.4 mL)を添加 した。 この反応混合物を 25°Cで 4 時間撹拌した後、 1 規定塩酸水溶液を添加し (pH 3.0 まで)、 溶媒を減圧除去した。 残分を水おょぴメタノールで洗浄し、 乾燥 してジパルミ ト ルリジン誘導体 3 (化合物 3) を白色固体として得た (1.3 g、 収 率 98 %)。
化合物 3
Figure imgf000029_0001
ジパルミ トイルリジン誘導体 3の分析結果： '
薄層クロマトグラフィー（シリ力ゲルプレート、 クロロホルム/メタノール (4/1) (容量/容量）： Rf： 0.45 (モノスポット）。
赤外吸収 ぺク トル (cm-1)： 3305 [vN_H (アミ ド)]； 1721 [Vc=0 (力ルポ二ル)]； 1638 [Vc=0 (アミ ド)] ； 1553 [δΝ_Η (アミ ド)]。
1H-NMRスぺク トル ( DC13, 500 MHz . 5(ppm) )： 0.84 (t, 6H, -CH.)； 1.24 (s, 50H, - CH2-CH2- , lys γ -CH2)； 1.36 (m, 2H， lys δ -CH2)； 1.47 (m, 4H, -N-CO-C-CH2 -)； 1.55 , 1.67 (m, 2H, lys β -CH2)； 2.02 , 2.09 (t, 4H, -N-CO-CH2-)； 2.99 (m, 2H, lys ε - CH2)； 4.14 (s, IH, lys a -CH2)； 7.55 (br, IH, -NH-CO-)； 7.78 (d, IH, -NH-CO-)； 12.23 (br, IH, -COOH)。
MS(LCQ)： C38H74N204についての計算値： 623.0：実測値： 623.5 (M+H)+ 0
(D) パルミチン酸の代わりにミ リスチン酸、 ステアリン酸を用いた以外は上 記 (B)および (C)と同様の操作により、 それぞれ白色固体のジアルキルリジン誘導 体 (ジミリストイルリジン誘導体 4 (化合物 4) およびジステアロイル誘導体 5 (化合物 5) )を得た。
Figure imgf000030_0001
ジミリストイルリジン誘導体 4の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリ力ゲルプレート、 ク口'口ホルム/メタノール (4/1) (容量/容量）： Rf： 0.40 (モノスポット；)。
赤外吸収スぺク トル (cm-1)： 3305 [vN-H (アミ ド)]； 1721 [vc=0 (力ルポ二ル)]； 1638 [vc=0 (アミ ド)] ； 1553 [δΝ-Η (アミ ド)]。
1H-NMRスぺク トル (CDC13, 500 MHz , S(ppm) )： 0.84 (t, 6H, -CH3)； 1.24 (s, 42H, - CH2-CH2- , lys y -CH2)； 1.36 (m, 2H, lys δ -CH2)； 1.47 (m, 4H, -N-CO-C-CH2 -)； 1.55 , 1.67 (m, 2H, Iys j3 -CH2)； 2.02 , 2.09 (t, 4H, -N-CO-CH2-)； 2.99 (m, 2H, lys ε - CH2)； 4.14 (s, IH, lys a -CH2)； 7.55 (br, IH, -NH-CO-)； 7.78 (d, IH, -NH-CO-)； 12.23 (br, IH, -COOH)。 ジステアロイル誘導体 5の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリ力ゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量/容量）： Rf： 0.53 (モノスポット；)。
赤外吸収スぺク トル (cm )： 3305 [vN_H (アミ ド)]； 1721 [Vc=0 (カルボ二ル)]； 1638 [vc=o (ァミ ド)]； 1553 [δΝ-Η (ァミド)]。
1H-NMRスぺク トル (CDC13, 500 MHz , 5(ppm) )： 0.84 (t, 6H, -CH3)； 1.24 (s, 56H, - CH2-CH2- , lys y -CH2)； 1.36 (m, 2H, lys δ -CH2)； 1.47 (m, 4H, -N-CO-C-CH2-)； 1.55 , 1.67 (m, 2H, lys β -CH2)； 2.02 , 2.09 (t, 4H, -N-CO-CH2-)； 2.99 (m, 2H, lys ε - CH2)； 4.14 (s， IH, lys a -CH2)； 7.55 (br, IH, -NH-CO-)； 7.78 (d, IH, -NH-CO-)； 12.23 (br, IH, -COOH)。
(E) ジパルミ トイルリジン誘導体 3 とポリエチレングリコールとを以下のよ うにして結合させた。 すなわち、 ジパルミ トイルリジン誘導体 3 (125 mg、 0.2 mmol)と DCC(41 mg、 0.2 mmol)をクロ口ホルムに溶解し、 4°Cで 1時間撹拌した 後、 分子量 5000 のモノメ トキシァミノポリエチレングリコール (500 mg、 0.1. mmol)とジメチルァミノピリジン (24 mg、 0.2 mmol)を溶解したク口口ホルム溶液 中に滴下した。 この反応混合物を 25°Cで 6 時間撹拌した後、 グラスフィルター (G4)で濾過レ、 濾液をジェチルエーテルに滴下した。 沈殿物を濾過回収し、 乾燥 した後、 シリカゲル力ラム (溶媒： クロロホルム/メタノ一ル= 6/1 (容量/容量)で両 親媒性化合物 6 (化合物 6) を単離した (500 mg、 収率 88 %)。
Figure imgf000031_0001
化合物 6 化合物 6の分析結果：
薄層ク口マトグラフィー（シリ力ゲルプレ
(容量/容量）： Rf： 0.73 (モノスポット）。 赤外吸収スぺク トル (cir 1)： 3294 [vN_H (アミ ド)]； 1634 [vc=0 (アミド)] ； 1553 [δΝ.Η (ァミ ド)]。
1H-NMRスぺク トル (CDC13, 500 MHz , 6(ppm) )： 0.88 (t, 6H, -CH3)； 1.25 (s, 5 OH, - CH2-CH2- , lys -CH2)； 1.32 (m， 2H, lys δ -CH2)； 1.63-1.80 (8H, -CH2-C-N-, -N-CO- C-CH2-， lys β -CH2)； 2.27 , 2.38 (t, 4H, -N-CO-CH2-)； 3.29 (m, 2H, lys ε -CH2)； 3.38 (3H, -0-CH3)； 3,43 (2H, -CH2-NH-)； 3.66 (PEG)； 4.39 (s, IH, lys a -CH2)。
13C-NMR (CDC13、 500 MHz, δ (ppm) )： 14.12； 22.68 ； 25.74； 28.75 ； 29.34； 29.53 29.65； 31.92； 36.35； 38.13 ； 59.02； 70.44； 71.95。 (F) 上記 (E)と同様の操作により、 ポリエチレングリコ ル (PEG)の分子量と 疎水基の炭素数が異なる組合わせで次の化合物を得た。
P50-2C14の分析結果：. PEG分子量 （5000) 、 疎水基 （-(CH2)14CH3 X 2)
薄層ク口マ トグラフィ一（シリ力ゲルプレート、 クロロホルム/メタノール (4/1) (容量/容量）： Rf： 0.55 (モノスポッ ト）。
赤外吸収スぺク トル (cm-1)： 3294 [vN-H (アミ ド)]； 1634 [vc=0 (アミド)]； 1553 [δΝ-Η (ァミ ド)]。
1H-NMRスぺク トル (CDC13, 500 MHz , 5(ppm) )： 0.88 (t, 6H, -CH3)； 1.25 (s, 46H, - CH2-CH2-， lys -CH2)； 1.32 (m, 2H, lys δ -CH2) ； 1.63-1.80 (8H， -CH2-C-N-， -N-CO- C-CH2-， lys j3 -CH2)； 2.15 , 2.23 (t, 4H, -N-CO-CH2-)； 3.29 (m, 2H, lys ε -CH2)； 3.38 (3H, -0-CH3)； 3.43 (2H, -CH2-NH-)； 3.66 (PEG)； 4.39 (s, IH, lys -CH2)。
P125-2C14の分析結果： PEG分子量 ( 12500) 、 疎水基 (-(CH2)14CH3 X 2) 薄層ク口マ トグラフィ一（シリ力ゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量/容量）： Rf： 0.50 (モノスポッ ト；)。
赤外吸収スぺク トル (cm-1)： 3294 [vN-H (ァミ ド)]； 1634 [vc=0 (ァミド)]； 1553 [δΝ.Η (ァミ ド)： I。
1H-NMRスぺク トル (CDC13, 500 MHz , 5(ppm) )： 0.88 (t, 6H， -CH3)； 1.25 (s， 46H， - CH2-CH2-， lys y -CH2)； 1.32 (m, 2H, lys δ -CH2)； 1.63-1.80 (8H, -CH2-C-N-5 -N-CO- C-CH2-， lys β -CH2)； 2.15 , 2.23 (t, 4H, -N-CO-CH2-)； 3.29 (m, 2H, lys ε -CH2)； 3.38 (3H， -0-CH3)； 3.43 (2H, -CH2-NH-)； 3.66 (PEG)； 4.39 (s, 1H, lys a -CH2)0
P125-2C16の分析結果： PEG分子量 （12500) 、 疎水基 (-(CH2)16CH3 X 2) 薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量/容量）： Rf： 0.63 (モノスポット)。 '
赤外吸収スぺク トル (cm-1)： 3305 [vN-H (アミ ド)] ； 1638 [vc=0 (アミ ド)] ； 1556 [δΝ-Η (ァミ ド )]。
1H-NMRスぺク トル (CDC13, 500 MHz , S(ppm) )： 0.88 (t, 6H, -CH3)； 1.25 (s, 50H, - CH2-CH2- , lys 7 -CH2)； 1.32 (m, 2H, lys δ -CH2)； 1.63-1.80 (8H, -CH2-C-N-， -N-CO- C-CH2-， lys β -CH2)； 2.27 , 2.38 (t， 4H, -N-CO-CH2-)； 3.29 (m, 2H, lys ε -CH2)； 3.38 (3H, -0-CH3)； 3.43 (2H, -CH2-NH-)； 3.66 (PEG)； 4.39 (s, 1H, lys a -CH2)。
〔実施例 2〕
本実施例では、 実施例 1の方法で得られたリジン型 PEG脂質 （以下 「PEG脂 質」 という） の小胞体への導入安定度および小胞体凝集抑制効果を PEG脂質構 造との相関から明らかにした。
小胞体分散液 (17.0 mM, 15.0 mL)に PEG脂質水溶液 (17.0 μ M, 22.6 mL)を混合後 37°Cにて撹拌し PEG脂質導入小胞体分散液を得た。 この PEG脂質導入小胞体分 散液をリン酸緩衝液 (PBS, pH 7.0)で 6倍希釈し、 12時間後まで経時的に導入量を 測定した。 導入量は以下のように算出できる（Yoshioka, H. Biomaterials 1991 , 12, 861)。 、
PEG脂質導入小胞体分散液を超遠心分離 (33,000 rpm, 30 min)して、 未導入 PEG 脂質を分離した後、 真空乾燥して CDC13に溶解した。 不溶成分を PTFEフィルタ 一 (0.2 μ πι)で除去した後、 ^-NMR測定を行い、 DPPC コリンメチルプロトン（5 =3.36 ppm)と PEG鎖メチレンプロトン（δ =3.64 ppm)の面積比を利用して導入率 を算出した。 超遠心分離を行ったものと行っていないものの小胞体コリンメチル プロトンの積分値を一定としたときの PEG鎖メチレンプロトンの積分値をそれ ぞれ HPEG+、 HPEG-とし、 PEG脂質の仕込み濃度を A (mol%)とすると、 PEG脂質 導入量は次式から算出できる。-
[PEG-lipid] = A X (HpEG+ / HPEG- ) ( mol% )
PEG脂質の小胞体からの脱離挙動
PBS(pH 7.0)により 6倍希釈した後の PEG脂質の小胞体からの脱離挙動の観測 結果 （1H-NMR) を図 2に示した。 図 2中の記号はそれぞれ、 （會） P50-2C14, (〇） P125-2C14, (▲) P50-2C16, (△) P125-2C16, (□) P125-2C18, (■) P125-4C16, (♦) P50-DPPE, (◊) P125-DSPE を表す。 2 本鎖の PEG脂質については、 P125-2C18 (PEG分子量 (12500) 、 疎水基 (-(CH2)16CH3 X 2) ) 、 P125-4C16 (PEG分子量 (12500) 、 疎水基 （-(CH2)14CH3 X 4) ) および P50-2C16 (PEG分子量 （5000) 、 疎水基 （-(CH2)14CH3 X 2) ) では脱離が認められなかったのに対し、 P125-DSPE (PEG 分子量 ( 12500) がジステアロイルホスファチジルエタノールァミン DSPE に結合した PEG脂質） や P125-2C16 (PEG分子量 （12500) 、 疎水基 （- (CH2)14CH3 X 2) ) では 3 時間後には各々約 8%、 約 10 %が小胞体から脱離した。 他方、 P50-2C14 (PEG 分子量 （5000) 、 疎水基 （-(CH2)12CH3 X 2) ) 、 P125- 2C14 (PEG分子量 （12500) 、 疎水基 （-(C¾)12CH3 X 2) ) では 12 時間後にそ れぞれ約 20、 30 %が小胞体から脱離した。 従って PEG鎖の分子量の増大あるい はアルキル鎖長を短くすることでリボソーム表面の PEG鎖が脱離し易くなり、 血中滞留性の制御ならぴに指向性の増大が可能となった。
ざらに、 P50-2C16では脱離が認められないのに対し、 P50-DPPE (PEG分子量 ( 5000) 疎水基 （-(CH2)16CH3 X 2) ) では 20 %程度が脱離した。 なお、 P50- DPPEは、 PEG分子量 （5000) がジパルミ トイルホスファチジルエタノールアミ ンに結合した PEG脂質である。 PEG-DPPE では、 リン脂質頭部の親水性による 脂質全体の親水性増大の影響が考えられる一方で、 リジン型 PEG脂質ではその 影響がないばかりでなく、 リジン骨格におけるアミ ド結合部と小胞体リン脂質ェ ステル部の水素結合が安定導入に寄与していると考えられる。
〔実施例 3〕
1 . 新規膜貫通型脂質の合成 ジァミノ PEG (M.w.=220) を出発物質として、 まず片末端を' t-ブトキシ (Boc) 基で保護した。 ベンジルォキシカルボニル (Z)基を用いると最後の脱保護操作
(接触還元、 又は強酸） で疎水部のジスルフィ ドが切断される恐れがあるため、 弱酸でも脱保護が可能な Boc基を選択した。 また、 Boc基の切断を防ぐため、 酸 の混入と加熱をできるだけ避けた。
4,7, 10-Trioxa- 1,13 -tridecanediamine ( 6.6 g、 30 mmol ) と ト リエチルァミ ン (TEA, 1.5 g、 15 mmol) を 20 mL蒸留クロ口ホルムに溶解し、 無水 t-ブドキシ カルボニル （ （Boc) 20、 3.3 g、 15 mmol) の蒸留クロ口ホルム溶液 （100 mL) を徐々に滴下して反応させた。 4°Cで 6 時間攪拌後、 溶媒を減圧除去し、 ベンゼ ンに再溶解して不溶の塩成分をろ過した。 シリカゲルカラム （中性、 溶媒： クロ 口ホルム/メタノール （4ノ 1 ) (容量 Z容量） 精製により片末端のみを Boc 基 で保護した PEG脂質誘導体 （7) (化合物 7) を淡黄色粘稠液体で得た （2.4 g、 収率 50 %) 。
Figure imgf000035_0001
化合物 7
PEG脂質锈導体 7の分析結果：
薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール （4 / 1) (容量 Z容量） ： Rf : 0.27 (モノスポット） ） 。
赤外吸収スペク トル （cnT1) ： 3363 ( v N-H) ； 1709 ( v c=o) ； 1520 ( v N-H) ； 1271 ( v c-o) 。 . , >
1H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm)) . ： 1.43 (s, 9H， t-butyl) ； 1.71-1.78 (m, 4H, -CH2-C-N-) ； 2.75-2.81 (t, 2H, -CH2-N) ； 3.20-3.39 (br, 2H, -CH2-N-) ； 3.49- 3.65 (m, 12H, POE) 。
2,2'-dipyridyl disulfide(2-PD、 4.3 g、 19.2 mmol)を窒素雰囲気下、 20mL 蒸留 THF中で 1時間攪拌して脱酸素後、 1,10-decanedithiol (1.0 g、 4.8 mmol) の THF 溶液 （10 mL) を徐々に滴下させ、 37°Cで 10 時間、 チオール ·ジスルフィ ド交 換反応により 1,10-decanedithiol の両末端に PD 基を導入した （0.82 g、 収率 40 %) 。 溶媒を減圧除去し、 フラッシュカラム （シリカゲル、 溶媒： クロロホ ルム/酢酸ェチル ( 10/ 1 ) (容量/容量） ） により精製を行った。 2-PD は 1,10-decanedithiolに対して 4当量仕込んだが、 アルキル鎖が数倍長い副生成物が 得られて収率が低下したと考えられる。 化合物 8 は ^-NMR ESI-MS にて構造 確認を行った。 再び化合物 8 (0.77 g、 1.8 mmol) を窒素雰囲気下、 20 mL蒸留 THF 中で 1 時間攪拌して脱酸素を行い、 10-carboxy-l-decanethiol (0.79 g、 3.6 mmol) の THF溶液 (20 mL) を徐々に滴下して 10時間反応させた。 ジェチルェ 一テルにて再沈殿精製を 2回行い、 クロ口ホルムより再結晶して炭素鎖が 30の ジカルボン酸誘導体 9 (化合物 9) を白色固体で得た （1.1 g、 収率 93 %) 。
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0002
化合物 9 化合物 8及び 9の分析結果：
(化合物 8)：薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム /酢 酸ェチル （10/1) (容量 Z容量） ： Rf : 0.7 (モノスポッ ト） ） 。
1H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm)) ： 1.23-1.38 (m, 12H, -CH2-) ； 1.65-1.71 (m, 4H, -S-C-CH2-) ； 2.79 (t, 4H, -S-CH2-) ； 7.05-8,46 (m, 8H, -C5NH4) 。
(化合物 9)：薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム ア セトン （4Z1) (容量 Z容量） ： Rf : 0.23 (モノスポッ ト） ) 。
赤外吸収スペク トル （cm4) ： 3038 ( V 0-H) ； 1694 ( v c=o) ； 1229 ( v C-o) 。 1H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm)) ： 1.29-1.39 (m, 36H, -CH2 -) ； 1.61-1.70 (m, 12H, -CH2-C-CO-, -CH2-C-S-) ； 2.35 (t, 4H, -CH2-CO-)； 2.68 (t, 8H, -C¾-S -)。 ジカルボン酸誘導体 (化合物 9) (0.20 g、 0.31 mmol), BOP試薬 （0.30 g、 0.69 mmol) 、 TEA (0.22 g、 2.2 mmol) 及ぴ片末端ァミノ PEG (化合物 7) (0.74 g、 2.3 mmol) を 20 mL蒸留クロ口ホルム中で 12時間反^させ、 'アミ ド結合を形成させ た。 4 %クェン酸水溶液、 及び水で分液を行い （クロ口ホルム相採取) 、 溶媒を 減圧除去した後、 フラッシュカラム （シリカゲル、.溶媒： クロ口ホルム Zァセト ン （2Z1) (容量 Z容量） ）' により精製して化合物 10 を白色個体で得た （0.35 g、 収率 91 %) 。
Figure imgf000037_0001
化合物 1 0
化合物 10の分析結果：
薄層クロマ トグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/アセトン （2Z 1) (容量 Z容量） ： : 0.44 (モノスポッ ト） ） 。
1H-NMR (CDC13、 500 ΜΗζ、 δ (ppm)) ： 1.28-1.37 (m, 36H, -CH2-) ； 1.44 (s, 18H, t-butyl) ； 1.56-1.70 (m, 12H, -CH2-C-CO-/-CH2-C-S-) ； 1.73-1.80 (m， 8H, - CH2-C-N-) ； 2.13-2.16 (t, 4H, -CH2-CO-) ； 2.66-2.69 (t, 8H, -CH2-S-) ； 3.31- 3.22 (m, 4H, -CH2-NH-COO-) ； 3.33-3.37 ( q, 4H, -CH2-NH-) ； 3.53-3.66 (m, 24H, POE) 。 ィ匕合物 1ひ （0.156 g、 0.125 mmol) を 5 mL ジクロロメタンに溶解し、 2,6- Lutidine (0.82 mL, 1 ,5 M) 及び Trimethylsilyl Triflate (0.89 mL, 1 M) を加えて 室温で 1時間攪拌した。 ニンヒ ドリンスプレーでァミノ基の出現を確認後、 耐酸 ポンプにて 60〜70°Cで溶媒を減圧除去し、 水で 2 回洗浄した後、 ジェチルエー テルにて再沈殿精製を行って、 膜貫通型脂質 (11) (化合物 11 ) を淡黄色固体で得 た （0,12 g、 収率 93 %) 。
Figure imgf000037_0002
化合物 1 1 膜貫通型脂質 11の分析結果：
薄層クロマ トグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール （4 /\) (容量 Z容量） ： Rf : 0.19 (モノスポッ ト） ） 。
赤外吸収スペク トル （cnT1) ： 3326 ( vN-H) ； 1637 .( v c=o) ; 1540 ( vN_H) ； 1252 (vc.o) ； 1114 ( v C-o-c) ; 1314 ( - s) 。
1H-NMR (CDC13、 500 MHzヽ δ (ppm)) ： 1.28-1.43 (m, 36H, -CH2-) ； 1.59-1.80 (m, 20H, -CH2-C-CO-/-CH2-C-S-/-CH2-C-N) ； 2.13-2.16 (t， 4H, -CH2-CO-) ； 2.66-2.69 (t, 8H, -CH2-S-) ； 2.87-2.89 (t, 4H, -CH2-NH-C-0-) ; 3.32-3.36 (q, 4H: -CH2-NH-) ； 3.54-3.65 (m, 24H, POE) 。
2. 蛋白質担持リボソームの調製
DPPC (1.0 g, 1.36 mmol) 、 コレステロール （0.42 g, 1.09 mmol) 、 DPEA (0.19 g, 0.27 mmol) の混合脂質に、 膜貫通型脂質 (11) (8.5 mg, 8.16μπιο1) を 0.3 mol%混合して 5 mLベンゼンに溶解後、 凍結乾燥を行った。 ベンゼンを除去 した後、 脂質濃度が約 2 wt%になるようリン酸緩衝生理食塩水 （PBS) に水和し た （r丄、 終夜） 。 その後、 凍結融解処理を行い、 extrusion法にて最終孔径 50 nm まで透過させた。 超遠心分離にて外水相を洗浄した後、 リン脂質定量で濃度を調 整して、 粒径が約 140nmの 1枚膜リボソームを調製した。 3. 膜貫通型脂質の導入量測定
導入量は、 膜貫通型脂質の両末端アミノ基にフルォレスカミンにて蛍光標識し て、 蛍光測定により定量した。 膜貫通を証明する為 Jこ、 （a)リボソーム表面アミ ノ基のみ、 及び (b)リボソーム中の全ァミノ基の 2通りの測定を行い、 両者を比 較した。
Glu2C16 (30 mg, 50 μ mol) に THF、 フルォレスカミン （42 mg, 0.15匪 ol) を 加えて 15分攪拌て希釈後、 蛍光測定（ iex = 390 nm, ； L em = 475 nm)により検量線 を作成した （ =0.9994) 。
(a) : リボソーム分散液 （[DPPC] = 1 wt%, 1 mL) に lOO^uL フルォレスカミン (10 mg SOOizLァセト ） を加えて 15分間攪拌後、 超遠心分離で未反応のフ ルォレスカミンを除去した。 THFに再溶解し、 蛍光測定 （； L ex = 390 nm, λ em = 475 nm) を行った。
(b)： リボソーム分散液 （[DPPC] = 1 wt%, 1 mL) を THFに溶解し、 100 /i Lフル ォレスカミン （10 mgZ500 L アセ トン） を加えて 15 分間攪拌後、 蛍光測定 ( jU ex = 390 nm, em = 475 nm) を行った。
[結果]
蛍光測定の結果、 リボソーム表面アミノ基は全ァミノ基の約 50 %であった (表 1) 。 以上の結果、 及ぴ長鎖アルキルがメチレン同士の立体障害を最小にす る為に真っ直ぐなコンホメーシヨンをとり易い事を考慮すると、 今回導入した合 成脂質はリボソーム二分子膜を貫通して膜内に固定化され、 末端アミノ基がリポ 'ソーム表面から充分に露出していると結論できる。 リポソ一ム中のアミノ基量
Outer ammo grout) of liposome (mol%) 0.20
Total amino group of liposome (mol%) 0.42
Exposed amino group (%) 48
Figure imgf000039_0001
4. リボソーム表面への蛋白質の導入 ' '
調製したリ ボソームの表面アミ ノ基に、 架橋剤 N-Succinimidyl 3-(2- pyridyldithio) propionate (SPDP)及ぴ N-Succimmidyl 3-Maleimidopropionate (SMDP) を用いて、 フルォレセィンィソチオシァネート（FITC)標識したモデル蛋白質（口- Lactalbumin (分子量: 14 kDa)、 rHSA(66.5 kDa)、 IgG(150 kDa)、 Ferritin(460 kDa) Thyrogrobulin(670 kDa))を結合させた。 蛋白質は電気泳動マーカーの中から、 分 子量依存性を解析するために等電点の近いものを選択した （表 2) 。
表 2 蛋白質の特性
M.w.CkDa Isoelectric point
a-Lactalbumin 14 4.1-4.8
rHSA 66.5 5.1
IgG 150
Ferritin 460 4.0-5.0
Thvrogrobulin 670 4.5 [蛋白質の調製].
蛋白質 2.0 g/dL (1 mL、 PBS)に SPDP(3.8 mg/Ethanol 2 mL)を 8 L(1.5 eq)添加、 室温にて 30分攪拌した。 その後、 FITC (6 mg/lN NaOH 250 μ L, PBS 750
200 /i L(5 eq)添加、 室温にてさらに 30分攪拌した。 ゲルカラムクロマトグラフィ 一 (Sephadex G25)にて未反応の SPDP、 FITCを除去した。 DTT(15.4 mg/PBS 1 mL) を 40 L(20 mM)添加し、 30分攪拌後、 ゲル力ラムクロマトグラフィ一 (Sephadex G25)にて未反応の DTTを除去した。 [SMDP結合リボソーム調製] ― 膜貫通型脂質導入リボソーム分散液 （PBS 5 mL, [DPPC] = 2.8 g/dL) に SMDP(30 mg/500 L DMF)を 38 ^ L添加し、 室温にて 1時間撹拌した。 超遠心分 離 (33,000 rpm、 60 minx2)より未反応の SMDPを除去した。 [蛋白質結合リボソーム調製]
SMDP導入リボソーム分散液 （PBS 4 mL ([Lipid] = 0.6 g/dL)に SPDP導入蛋白 質溶液 (0.4 g/dL)を 1 mL添加し、 4°Cにて 12時間攪拌した。 遠心分離 (10,000 rpm、 5 min X 3)より未反応の蛋白質を除去し、 リボソーム表面にそれぞれ 5 種類の蛋 白質を結合させた。
[蛋白質結合量の定量]
調製した蛋白質結合リボソーム分散液をェタノール溶液に溶解し、 溶液の蛍光 強度（ ex=490 nm, λ sm=520 nm)を測定して導入された蛋白質の結合数及ぴリポソ ーム表面ァミノ基に対する結合率を算出した (表 3)。 表 3 蛋白質の結合率
Mw The Number of protein Conjugation ratio of
protein
(kDa conjugated to a liposome proteins (%)
a-Lactalbumin 14 335 52
rHSA 66.5 141 21
IgG 150 106 16
Fentin 460 59 10
Thyrogrobulin 670. " 46 7
5. 蛋白質結合膜貫通型脂質の脱離速度測定
調製した 5種の蛋白質 (FITC標識)結合リボソームを pH 7.4、 37°Cにて振とう し、 蛋白質の脱離挙動を蛍光測定した。
[実験方法] ,
蛋白質結合リボソーム分散液 （PBS 10 mL、 [Lipid] = 0.8 g/d 4°C保存）を 37°C にて振とうした。 開始 5 分後に control(0 min)l mL を採取し、 遠心分離 (10,000 rpm、 5 min)後、 上澄み (700 μ L)の蛍光測定を行い （FITC、 1 ex = 490 nm, em = 520 nm), 検量線より脱離した蛋白質を定量した。 2、 4、 8、 12、 24時間後も同 様の操作により、 脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。 結果を図 3に示した。 図 3 中の記号はそれぞれ、 (拳） a -Lactalbumin、 (園) rHSA、 (D)IgG. (A)Ferritin, (A)Thyroglobulinを表す。
蛋白質分子量の増加に伴いリボソーム表面からの脱離が促進されたが、 分子量 が 66.5 kDaの rHSAまでは約 90 %が安定に保持された。
6. 膜透過性還元剤添加による脱離効果 ，
前述の脱離評価より、 最も脱離が少なかった α -Lactalbumin結合リボソームに ついて、 膜透過性の還元剤である L-システィン (Cys)を外水相に共存させて脱離 評価を行った。
[実験方法]
a -Lactalbumin結合リボソーム分散液 （PBS 1 mL X 8 サンプル、 [Lipid] = 0.8 g/dL、 4°C保存)を窒素雰囲気下で撹拌 (30 min、 4°C)後、 20 mM Cys溶液を添加し、 pH 7.4、 37°Cにて振とうした。 開始 5分後に control(O min)l mLを採取し、 遠心 分離 (10,000 rpm、 5 min)後、 上澄み (700 μ L)の蛍光測定を行って (FITC、 λ ex = 490 nm、 ； L em = 520 nm)、 検量線より脱離した蛋白質を定量した。 2、 4、 8、 12、 24 時間後も同様の操作により、 脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。 結果 を図 4に示した。 図 4中の記号はそれぞれ、 （·） ο; -Lactalbumin (Cys無添加系） 、 (〇） a -Lactalbumin + Cys溶液 （Cys添加系） を表す。 .
Cys無添加系では 24時間'後でも 90 %以上がリポソーム表面に保持されていた 力 Cys添加系では徐々に蛋白質の脱離が促進され、 24時間後には 95 %が脱離 した。 Cysがリボソーム二分子膜を透過し、 二分子膜内に導入した膜貫通脂質の ジスルフィ ド結合を還元することによる脱離効果であると考えられる。
〔実施例 4〕
1. 多アルキル鎖型糖脂質の合成
p_トルエ スルホン酸一水和物 (4.56 g、 24 mmol)のベンゼン溶液（100 mL)を 85°Cにて沸点還流し、 ジンスターグを用いて反応前に水を除去した。 反応液にグ ルタミン酸 (2.96 g、 20 mmol)とへキサデシルアルコール （10.7 g、 44 mmol), ま たはォクタデシルアルコール (10.7 g、 44 mmol)を添加し、 10 時間生成水を除去 しながら沸点還流した。 反応の進行に伴い、 懸濁液は徐々に溶解し黄色透明に変 化した。 反応終了後、 溶媒を減去し、 炭酸ナトリウム飽和水溶液/クロ口ホルム にて 3回分液操作を行った後、 硫酸マグネシウムにて脱水、 メタノール 4°Cにて 再結晶を行い、 ジァシルグルタミン酸誘導体 12 (化合物 12) (83%)および 13 (化合物 13) (；85%)を得た。
化合物 1 2
Figure imgf000042_0001
化合物 1 3 ジァシルグルタミン酸誘導体 12の分析結果： - 薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム Zメタノール （4 /\) (容量/容量） ： Rf : 0.83. (モノスポット). ） 。
赤外吸収スぺクトル （cm-1)： 1737 ( v c=o ester).
1H-NMR (CDC13、 500 MHz, δ pm)： 0.89 (t，6H，-CH3)； 1.25 (s,52H,-CH2-CH2-)； 1.62 (m,4H,-CO-0-C-CH2)； 1.84 (m,lH,glu j3 -CH2)； 2.08 (m,lH, glu j3 -CH2)； 2.45 (t,2H, gluy -CH2)； 3.45 (t,lH, glua -CH)； 4.06,4.10 (t,4H, -CO-0-CH2)
MS(ESI) Calcd： 595.9 ； Found： 597.3 (MH)+. 両末端ァミン PEG(9.01 g、 41 mmol)のク口口ホルム溶液 (10 mL)にトリェチル ァミン (5.71 mL、 41 mmol)を添加し、 室温にて攪拌した。 Zクロライド (6.98 g、 41 mmol)のクロ口ホルム溶液を滴下漏斗にてゆつくりと（2秒に 1滴程度)滴下し た。 反応は滴下に伴って速やかに進行し、 TLC (クロ口ホルム/メタノール = 4/1, シリカゲルプレート）にて片末端保護の目的物が出現 (Rf=0.42)するが、 この他に 両末端保護の副生成物 (Rf=0.81)も生成した。 反応終了後、 溶媒を減去、 カラ クロマトグラフィー（シリ力ゲル， ク口口ホルム/メタノール = 4/1)により両末端 保護の副生成物と TEA塩酸塩を除去そ、 目的の化合物 14を精製した。 化合物の 同定は IRおよび iH-NMR ESI-MS により行った。 また、 TEA塩はベンゼン、 酢酸ェチルに不溶であり、 これを用いて除去も可能である。
Figure imgf000043_0001
化合物 1 4
化合物 14の分析結果：
薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルムノメタノール （4 /1) (容量 容量） ： Rf : 0.42 (モノスポット） ） 。
赤外吸収スぺク トル（cm-1) ： 1713( r c=o ester) ； 1623( v c=o amide)； 1528( δ N amide). 1H-NMR(CDC13^ 500 MHzゝ δ ppm)： 1.25(br,2H,NH2-C-)； 1.80(m,2H,NH2-C-CH2- )； 1.94(m,2H, CONH-C-CH2-)； 3.11(m，2H, NH2-CH2-)； 3.30(q,2H,CONH-CH2-)； 3.58(t,12H5 -O-CH2-)； 5.08(s,2H, C6H5-CH2-)； 7.34(t,5H, C6H5-CH2-)； 7.57(br,lH, - CONH-)
MS(ESI) Calcd： 354.4； Found： 355.4 (MH)+. 化合物 14(500 mg、 1.4 mmol)の DMF溶液 (5 mL)にトリェチルァミン（196 μ L、 1.4 mmol)、 マルトース（507 mg、 1.4 mmol)を添加して 70°C、 12時間攪拌した。 反応の進行に伴い、 TLC (クロロホルム/メタノール/水 = 65/25/4,シリ力ゲルプレ ート）にて目的物のスポットが出現 (Rf=0.09)した。 反応終了後、 溶媒を減去し、 カラムクロマトグラフィー（シリカゲル， クロ口ホルム/メタノール /水 = 65/25/4) により、 目的の化合物 15を精製した。 化合物の同定は IRおよび iH-NMR ESI- MSにより行った。
Figure imgf000044_0001
化合物 1 5
化合物 15の分析結果： ，
薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール/水
(65/25/4) (容量 _ 容量） ： Rf : 0.18 (モノスポッ ト） ） 。
赤外吸収スぺク トル (cm-1)： 1720( v c=o、 ester)； 1654( v c=0、 amide)； 1540( δ N-H、 amide).
1H-NMR(D20, 500 MHz, δ ppm)： 1.71(m,2H, NH-C-CH2-)； 1.84(m,2H, CONH-C- CH2-)； 3.07(m,2H, NH-CH2-)； 3.15(m，2H, CONH-CH2-)； 3.21(t，lH, maltoseC-4)； 3.31(t,lH, maltoseC-4) ； 3.57(t,12H, -0-CH2-)； 3.49-3.96(m,10H, maltoseC-2,3,5,6)； 4.59(d, lH, maltoseC-1) ； 5.05(br,lH, maltoseNH-C-C-) ； 5.16(d,lH, maltoseC- l ,anomericH)； 5.33(d,2H, C6H5-CH2-)； 7.37(t,5H, C6H5-CH2-)； 8.39(br, lH, -CONH-). MS(ESI) Calcd： 678.7； Found： 679.4 (MH)+. 化合物 15(1.00 g、 1.4 mmol)の DMF溶液（10 mL)にトリェチルァミン (698 μ L、 5.0 mmol), ェピクロロヒ ドリン (228 μ ί、 2.8 mmol)を添加し、 40°Cにて 2時間攪 拌した。 反応の進行に伴い、 TLC (クロ口ホルム/メタノール/水 = 65/25/4，シリカ ゲルプレート）にてエポキシ基の導入による新たなスポッ トが出現 (Rf=0.19,0.27) したが、 化合物 16 の単離は行わず、 続く反応により 12(Glu2C16、 2.33 g、 3.9 mmol)を添加し、 60°Cにて 18 時間攪拌し、 エポキシ基に結合させた。 反応終了 後、 DMF を減去し、 カラムクロマトグラフィー（シリカゲル， クロ口ホルム/メタ ノ一ル= 10/1)により 2本鎖糖脂質 17(Rf= 0.38，ク口口ホルム/メタノール == 10/1 , シリカゲルプレート）、. 4 本鎖糖脂質 19(Rf= 0.50)を精製した。 化合物の同定は IRおよび ^-NME ESI-MSにより行った。 炭素数 18の糖脂質、 2本鎖 18(Rf= 0.40,クロ口ホルム/メタノール = 10/1,シリカゲルプレート）、 4 本鎖 20(Rf= 0.51) も同様に合成した。
Figure imgf000046_0001
化合物 17： n=15
化合物 18： n=17
Ri or R2 = OH
Figure imgf000046_0002
化合物 19： n=15
化合物 20： n=17
Figure imgf000046_0003
本反応は水酸 ¾の反応性の差異を利用して 6位の一級水酸基にアルキル鎖を導 入するものである。 アルキル鎖 4本の導入では、 エステル結合を用いて導入を試 みたがアルキルグルタメート同士の立体障害により収率が低く単離が困難であつ た。 より活性の高いエポキシ基を用いることでアルキル鎖 4本の導入および単離 が可能となり、 糖脂質 17〜20 (化合物 17〜20) の合成が可能であった。 糖脂質 19 (4C16)の分析結果：
薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール （10 /1) (容量 容量） ： Rf : 0.50 (モノスポッ ト） ） 。
赤外吸収スぺク トル (cm-1) ： 1731( v 0=0； ester) ； 1672( c=0、 amide) ； 1521( δ Ν_Η、 amide).
1H-NMR(CD3OD、 500 MHz, δ ppm) ： 0.89(t,12H，- CH3) ； l,28(s,104H,-C¾-CH2- ) ； 1.64(m,8H,-CO-0-C-CH2) ； 1.74(m,4H, glu β -CH2, NH-C-CH2-) ； 2.01(m,2H, CONH-C-CH2-) ； 2.14(m,2H, glu β -CH2) ； 2.29-2.35(m,8H, NH-CH2-C(OH)-C-0-， NH-C-C(OH)-CH2-0-)； 2.45(m,4H, gluy -CH2)； 2.55(m,2H, NH-C-CH(OH)-C-O-)； 3.11(m,2H, NH-CH2-) ； 3.18(m,2H, CONH-CH2-) ； 3.49-3.74(m,12H, maltoseC- 2,3,4,5,6)； 3.51(m,14H, -0-CH2-,glu a -CH)； 4.06(t,2H, maltoseC-1)； 4.15(t,4H, - CO-0-CH2)； 4.27(t,4H, -CO-0-CH2)； 5.05(m,2H, C6H5-CH2-)； 7.33(t,5H, C6H5-CH2- )； 8.01(br,lH, -CONH-).
MS(ESI) Calcd： 1981.4； Found: 1981.4(MH)+. ィ匕合物 17 (20 mg、 10 nmol)のェタノール溶液 (3 mL)に Pdブラック粉末 (20 mg) (または Pd/C粉末)を添加し、 "¾2ガス (Zn/H2S04にて発生)通気下、 室温にて 4時 間攪拌した。 反応の進行に伴い、 TLC にて、 ニンヒ ドリン陽性のスポッ ト、 21(Rf= 0.09,クロロホルム/メタノール = 10/1,シリ力ゲルプレート）が出現した。 反応終了後、 Pd 粉末を濾別し、 溶媒を減去した後、 カラムクロマトグラフィー (シリカゲル， クロロホ ム /メタノール/水 = 5/1)により 目的の化合物 21 を精製し た。 化合物の同定は IRおよび iH-NMR ESI-MSにより行った。 化合物 21 (Rf= 0.12,クロ口ホルム/メタノール = 10/1,シリカゲルプレート）、 化合物 22 (Rf=0.03) 化合物 24 fRf=0.03)も同様に合成した。
0；3 v NH2
化合物 21 ： n=15
化合物 22
Figure imgf000048_0001
Rl or 2= OH 化合物 23： n=15
化合物 24：
Figure imgf000048_0002
化合物 23 (4C16)の分析結果：
薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール （10 / 1 ) (容量/容量） ： Rf : 0.09 (モノスポッ ト） ） 。
赤外吸収スぺク トル (cm-1)： 1738( c=o ester).
1H-NMR(CD3OD , 500 ΜΗζ、 δ ppm) ： 0.89(t,12H,-CH3) ； 1.28(s,104H,-CH2-CH2- ) ； 1.61(m58H,-CO-0-C-CH2) ； 1.77(m,4H, glu β -CH2, NH-C-C¾-) ； 1.92(m，2H, CONH-C-CH2-) ； 2.14(m,2H, glu β -CH2) ； 2.24-2.41 (m,8H, NH-CH2-C(OH)-C-0-, NH-C-C(OH)-CH2-0-)； 2.44(m,4H, glu y -CH2)； 2.68(m,2H, NH-C-CH(OH)-C-O-)； 3.09(m,2H, NH-CH2-) ； 3.15(m,2H, CONH-CH2-) ； 3.49-3.79(m,12H, maltoseC- 2,3,4,5,6)； 3.63(m?14H, -0-CH2-,glu -CH) ； 4.06(t,2H, maltoseC-1)； 4.15(t,4H, - CO-0-CH2)； 4.28(t,4H, -CO-0-CH2). 2. 多アルキル鎖型糖脂質の臨界ミセル濃度測定
[方法]
糖脂質 (化合物 21〜24)分散液 (純水 2mL, 1, 5, 10, 20, 30, 50, ΙΟΟ μ Μ)に DPH溶 液 (30 μ Μ, THF)を 2 μ ί添加し、 37°Cにて 2時間で振とうした。 37°Cにて、 蛍光 測定 (DPH、 ； L ex = 357 nm、 λ εηι = 430 nm)により、 蛍光強度が急激に上昇する 糖脂質濃度を臨界ミセル濃度 (CMC)とした。
[結果]
. 化合物 21の CMCは 20 ^α Μであるのに対し、 化合物 22では 18 μ Μとなり、 アルキル鎖長を C16から C18 にすることで CMC は若干低下した。 他方、 化合 物 23 の CMCは 8.0 μ Μ、 化合物 24では 7.0 μ Μであり、 アルキル鎖数を 2本 から 4本に増加させることで大幅な CMCの低下が認められた。 このことから、 アルキル鎖数を増加させることが疎水性相互作用の増大に有効であることを確認 した。 結果を図 5に示した。 図 5中の記号はそれぞれ、 （ロ)21 (2C16) 、 （匿)22 (2C18) 、 (0)23 (4C16) 、 (秦)24 (4C18) を表す。
3. 糖脂質導入リボソームの調製
DPPC (600 mg)、 コレステロール （316 mg)あるいは糖脂質 (化合物 21 (3.9 mg)、 化合物 22 (4.1 mg)、 化合物 23 (6.0 mg)、 化合物 24 (6.4 mg)) (DPPC/コレステロ一 ル= 1/1 (モル比） 、 糖脂質 = 0.20 mol%)をクロ口ホルム 30 mLに溶解して混合 した。 クロ uホルムをエバポレーターにて除去し、 真空乾燥後、 PBS 50mL中に て 12時間水和攪拌した （[Lipid] = 2.0 g/dL)0 水和後、 45°Cにて 4時間ァニーリ ング処理し、 ェクストリユーダ一にて造粒 (3000→8QO→650→450→300→220 nm X 2)し、 粒径制御した。 遠心分離 (10,000 rpm、 5 min X 3)により外水相を除去、 PBS中に再分散して糖脂質含有リボソーム分散液を調製した。
4. リボソーム表面の糖脂質定量
リボソーム分散液 （PBS 1 mL, [Lipid] = 0.15 g/dL)中にフルォレスカミン （30 mg/Acetone 450 A( L)を 100 L 添加して、 室温にて 30 分攪拌した。 遠心分離 (10，000 rpm、 5 min X 3)にて、 未反応のフルォレスカミンを除去し、 クロ口ホル ム /メタノール = 2/1 に溶解 (総量 2 mL)して、 蛍光測定（ L ex = 390 nm, l em = 475 nm)よりリポソーム表面のアミノ基を定量した (表 4)。 表 4 リポソームの特性及びリポソ-ーム表面の H2基量
Outer NH 2 Ratio of Outer NH 2 per
Glycolipid Diameter (mn)
(mol%) outer H 2 (%) liposome ( 102)
21 (2C16) 280 ± 110 ' 0.052 26 3.5
22 (2C18) 290土 120 0.044 22 3.1
23 (4C16) 270土 100 0.044 22 2.7 '
24 (4C18) 280 ± 110 0.046 23 3.1
5. リボソーム表面への蛋白質の導入
架橋剤 SPDP を用いてリボソーム表面に導入した NH2基、 および蛋白質表面 の NH2基をジスルフィ ド結合にて架橋し、 リボソーム表面にそれぞれ 5 種類の 蛋白質を結合させた (表 5)。 表 5 蛋白質の特性
Figure imgf000050_0001
a-iactalbumm (from oovie milk) 14.0 4.1-4.8
rHSA , 66.5 5.1
Catalase (from bovie liver) 232 5.5
Ferritin (from equine spleen) 440 4.0 -5.0
Thyroglobulin ffrom bovie thvroid) 670 4.5
[蛋白質の調製]
蛋白質 2.0 g/dL (1 mL、 PBS)に SPDP(3.8 mg/Methanol 2 mL)を 8 μ L(1.5 eq)添加 し、 室温にて 30分攪拌した。 その後、 FITC (6 mg/lN NaOH 250 L, PBS 750 μ L) を 200 1^(5 eq)添加し、 室温にてさらに 30分攪拌した。 ゲルカラムクロマトグ ラフィー（Sephadex G25)にて未反応の SPDP、 FITC を除去した。 DTT(15.4 mg/PBS 1 mL)を 40 μ L(20 mM)添加し、 30分攪拌後、 ゲル力ラムクロマトグラフ ィ一 (Sephadex G25)にて未反応の DTTを除去した。
[SPDP結合リボソーム調製]
糖脂質導入リ ボソーム分散液 （PBS 10 mL [Lipid] = 2.0 g/dL)に SPDP(8 mg/Methanol )を 450 添加し、 室温にて 30分攪拌した。 遠心分離 (10,000 rpm 5 minX 3)より未反応の SPDPを除去した。
[蛋白質結合リボソーム調製]
SPDP導入リポソーム分散液 （PBS 4 mL ([Lipid] = 0.6 g/dL)に SPDP導入蛋白質 溶液 (0.4 g/dL)を 1 mL添加、 4°Cにて 12時間攪拌した。 遠心分離 (10,000 rpm, 5 minX 3)より未反応の蛋白質を除去し、 リボソーム表面にそれぞれ 5 種類の蛋白 質を結合させた。 [蛋白質結合量の定量]
蛋白質結合リボソーム分散液 (PBS 1 mL [Lipid] = 0.8 g/dL)に DTT(15.4 mg/PBS 1 mL)を 20 L(20 mM)添加し、 37°Cにて 4時間攪拌した。 遠心分離 (10,000 rpm, 5 min)後、 上澄み (700 μ L)を蛍光測定 (FITC、 λ ex = 490 nm、 λ em = 520 nm)、 検 量線から結合蛋白質量を定量した (表 6)。
表 6 蛋白質結合量
M ( kDa) Proteins per Binding
liposome ( χ 10) efficiency (%)
a-lactalbumm 14.0 18 55
rHSA 66.5 14 44
Catalase 232 10 30
Ferritin 440 9.2 28
Thyroglobuhn 670 8.3 25
6. 蛋白質結合糖脂質の脱離速度測定
調製した 5種の蛋白質 (FITC標識)結合リボソームを pH 7.4、 37°Cにて振とう し、 蛋白質結合糖脂質の脱離挙動を蛍光測定した。
[実験方法]
蛋白質結合リボソーム分散液 （PBS10 mL、 [Lipid] = 0.8 g/dL 4°C保存）を 37°C にて振とうした。 開始 5分後に control(0 min)l mLを採取、 遠心分離 (10,000 rpm、 5 min)後、 上澄み (70(Ui L)の蛍光測定 （FITC、 ex = 490 nm、 1 em = 520 nm), 検量線より脱離した蛋白質結合糖脂質を定量した。 2、 4、 8、 12、 24 時間後も同 様の操作により、 脱離した蛋白質量の経時変化を測定した。 結果を図 6に示した。 図 6中、 （a)は a -Lactalbumin (Mw: 14.0 kD)、 （b)は r-HSA (Mw: 66.5 kD)、 （c)は Catalase (Mw: 232 kD)、 （d)は Ferritin (Mw: 440 kD)、 （e)は Thyrogroburin (Mw: 669 kD)の測定結果であり、 図 6 中の記号はそれぞれ、 （ロ）21 ( 2C16 ) 、 ( B )22 (2C18) 、 (0)23 (4C16) 、 (·)24 (4C18) を表す。
Ferritin(Mw:440kDa)の測定結果では、 化合物 21の脱離速度は 12 %/hrでぁるの に対し、 化合物 22では 11 %/hrとなり、 アルキル鎖長を C18にすることで脱離 速度は若干抑制された。 他方、 化合物 23の脱離速度は 4.4 %/hr、 化合物 24では 3.5 %/hrであり、 2C (2本鎖） 群と比較してそれぞれ 0.36倍、 G.32倍となり、 アルキル鎖数を 2本から 4本に増加させることで脱離速度は大幅に抑制され、 24 時間後に 2.3倍め蛋白質の保持に成功した。 また、 これらの脱離速度の差異は糖 脂質の CMC と一致しており、 さらに脱離速度を抑制するには糖鎖の水酸基をァ セチル基に変換して疎水部とし、 CMCを小さくする方法が考えられる。
次に、 蛋白質分子量と脱離速度との関係を図 7に示した。 図 7中の記号はそれ ぞれ、 ( D )21 (2C16) 、 (麗）22 (2C18) 、 (0)23 (4C16) 、 （参) 24 (4C18) を表 す。 2本鎖では、 蛋白質分子量 31倍 (14 kDa〜440 kDa)の増加に対して脱離速度 は 10.7倍 (1.0 %/hr〜10.7 %/hr)に促進された。 他方、 4本鎖では脱離速度は 5.0倍 (0.7 %/hr〜3.9 %/hr)であり、 蛋白質分子量 440 kDaまでは分子量が増大しても脱 離速度はほとんど促進されなかった。 これは、 4本鎖では 440 kDaまでは分子量 • の堦大に伴い脱離速度の抑制効果が大きくなることを示している。 しかし、 440 kDa以上では 4本鎖でも脱離し易くなり、 アルキル鎖数の違いによる影響は分子 量の増大と共に小さくなるものと考察される。 〔実施例 5〕
pH応答性脂質の合成
Z-Lys(H)-OBzl · benzenesulfonate (1.5 g 2.8 mmol BOP試薬（1.5 g 3.4 mmol lauric acid (380 mg 3.4 mmol TEA(0.34 g 3.4 ol)を 30 mL蒸留ジク口ロメ タン中で 4°C 6 時間反応させ、 ァミノ結合を形成させた。 飽和炭酸ナトリウム、 および水で分液を行い（クロ口ホルム相採取)、 溶媒を減圧除去後、 淡黄色粘稠液 体を得た (2.01 g、 収率 91%)。 その後接触還元法にて脱保護し、 カラム（シリカゲ ル、 クロ口ホルム/メタノール =(8/1)(容量/容量))による精製を行って 25 を淡黄色 粘稠液体で得た (596 mg、 収率 50 %)。 25(596 mg 1.1 mmol)と p-トルエンスルホ ン酸一水和物 (259 mg 1.4 mmol), n-テトラデカノール (300 mg 1.4 mmol)をベン ゼン 100 mL中で 105°C 12時間沸点還流しエステル結合を形成させた。 飽和炭 酸ナトリゥム水溶液、 および水で分液を行い（クロロホルム相採取)、 溶媒を減圧 除去後、 メタノール再結晶による精製を行い白色固体 26(550 mg、 収率 58%)を 得た。
化合物 2 6
Figure imgf000053_0001
化合物 26の分析結果：
薄層ク口マトグラフィ一（シリ力ゲル、 クロ口ホルム/メタノール（8/1) (容量/容 量）： Rf : 0.50(モノスポット））
1H-NMR(CDC13、 500 MHzヽ δ (ppm))： 0.88 (t, 6H， -CH3)； 1.25 (m, 38H, -C¾-， -Lys - β - γ -, CH2-)； 1.6 (m, 4H， -CO-0-CH2-, -NH-CO-C-CH2-)； 2.2 (m, 2H, -CH2-N-CO- )； 3.6 (t, 1H, -Lys-)； 4.0 (t , 4H, -COO-CH2-， -N-CO-CH2-)；. 4.9(b, 1H， -N-H-C-0-)。 化合物 26(200 mg、 0.38 mmol)、 BOP試薬 (202 mg、 0.48 mmol), TEA(48 mg、 0.48 mmol)及び Boc-Glu-OtBu(139 mg、 0.46 mmol)を 20 mL蒸留クロロホルム中で 12 時間反応させ、 アミ ド結合を形成させた。 飽和炭酸ナトリウム、 及び水で分 液を行い（クロ口ホルム相採取）、 溶媒を減圧除去後、 凍結乾燥し 27(80 mg、 30 %)を得た。
Figure imgf000054_0001
合物 2 7
化合物 27の分析結果：.
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール（8/1)(容量/容 量）： Rf : 0.71(モノスポッ ト））
1H-NMR(CDC13、 500 MHzヽ δ (ppm))： 0.88 (t, 6H, -CH3)； 1.25 (m, 38H, -CH2-， -Lys - β - γ -, CH2-)； 2.2 (m, 2H, -CH2-N-CO-)； 3.2 (t， 1H, -Lys-)； 4.0 (t , 4H, -COO-CH2-, -N-CO-CH2-)； 5.1 (b, 1H, -N-H-C-0-)； 7.3(s, lH, -Glu-CO-NH -)。 また、 次のようにして、 化合物 28及び 29を合成した。
N-t-Boc-L-glutamic acid-g-butyl ester (764 mg、 2.52 mmol)と DCC (513 mg、 2.52 mmol)をジクロロメタンに溶解し、 4°Cで 30分間撹拌した後、 Glu2C16(l g、 1.68 mmol)を溶解したジクロロメタン溶液に滴下した。 反応溶液を室温で 5 時間撹拌 した後、 反応液を濾過し、 溶媒を減圧除去した。 メタノールから 4°Cで再結晶し て濾過後、 乾燥して Glu2C16 に親水部としてアミノ基およびカルボキシル基保 護グルタミン酸を結合させた化合物を白色固体として得た（1.15 g)。 この化合物 を TFA 10 mLに溶解し、 4°Cで 2時間撹拌した後、 クロ口ホルムを加え、 炭酸ナ トリウム飽和水溶液で 2回、 純水で 2回洗浄した。 クロ口ホルム層を無水硫酸ナ トリウムで脱水後、 溶媒を減圧除去した。 ベンゼンに溶解後、 凍結乾燥し化合物 28(0.89 g)を白色粉末で得た。
化合物 29は、 化合物 27 の合成法と同様にし、 lauric acidの代わりに myristic acidを用いた o
化合物 2 8
化合物 2 9
Figure imgf000055_0001
化合物 28の分析結果：
薄層クロマトグラフィー (シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量/容 量）： Rf : 0.24(モノスポット））
1H-NMR(CDC13、 500 MHz, 8 (ppm))： 0.88 (t, 6H, -CH3)； 1.26 (m, 46H, -CH2-CH2- )； 1.61 (m, 4H, -CO-O-CH2-) 2.2 (m, 4H, glu ^S -CH2-)； 2.32、 2.41 (m, 4H, glu y - CH2-)； 3.4 (m , IH, -CH-CON-)； 4.07、 4.12 (t, 4H, -CO-0-CH2-)； 4.5 l (m, IH, -CH- CO-O-) 化合物 29の分析結果： ，
薄層クロマトグラフィー（シリ力ゲル、 ク口口ホルム/メタノール（8/1) (容量/容 量）： Rf : 0.71(モノスポット））
1H-NMR(CDC13、 500 MHzゝ δ (ppm)) ： 0.88 (t, 6H, -CH3) ； 1.25 (m, 38H, -CH2-， - Lys- β - γ -, CH2 -)； 2.2 (m, 2H, -CH2-N-CO-)； 3.2 (t, IH, -Lys-)； 4.0 (t , 4H, -COO- CH2-， -N-CO-CH2-)； 5.1 (b, IH, -N-H-C-0-)； 7.3(s, IH, -Glu-CO-NH-)
2. リボソームの調製 1 ,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC 29 mg、 36mmol)、 コレステロ ール （18 mg、 48 mmol)、 PEG-DSPE (2.1 mg、 0.036麵 ol)の混合脂質と、 ィ匕合物 28 (26 mg、 36 mmol)を 5 mL t-ブチルアルコールに溶解させて混合した後、 凍結 乾燥を行った。 乾燥後、 脂質濃度が 2 wt%になるようにリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)に室温で 12時間水和後、 extrusion法にて最終孔径 0.22 μ mまで透過させた, 超遠心分離にて外水相を洗浄後、 リン脂質定量値から濃度を調整し、 粒径が 250 nm程度のリボソームを調製した。
3. リボソームの分散安定度測定
調製したリボソームの安定度を、 光散乱を用いた粒径測定より行った。 その結 果、 化合物 28 の膜含有量によってリボソームの粒径は変化しなかった （表 7) ,
表 7 pH応答性リポソ- -ムの特性
モル比 「nml
5/5/1/0.03 247 ± 101
DOPC/c oV(28) PEG-DPE
3/4/3/0.03 245 ± 98
4. リボソーム中での化合物 28の低 pHによる加水分解
調製したリボソーム（DOPC/chol/Q¾/PEG-DPE=3/4/3/0.03、 モル比）を 37°C、 pH4.5 の PBS に分散させ、 24 時間後に分散液を凍結乾燥した。 乾燥させた混合 脂質粉末をクロ口ホルムに溶解し、 薄層クロマトグラフィー（シリカゲルプレー ト、 クロ口ホルム/メタノール (8/1) (容量/容量)、 検出：ヨウ素）にて検出した。 検 出結果は、 図 8に示した通りである。
化合物 28 の Rf=0.21 のスポットが消失し、 新たに Rf=0.05付近にスポットが 見られ.た。 これは化合物 28が pH 4.5で加水分解してリゾ体を生成したことによ るものと思われる。 5. リボソームの低 pHにおける内包分子の放出促進
調製したリボソーム (DOPCん hol/(2¾/PEG-DPE=3/4/3/0.03)の pH応答性を検証 するために、 内包分子にカチオン性蛍光 HPTS (l-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonic acid)を 内包させた小胞体を調製し、 蛍光色素の漏出を測定した。 測定は、 調製した'リポ ソームをそれぞれの pHで 37°Cの HEPES緩衝液に添加し、 10分後に pH 7.4に戻 してから行った （ ex : 413 nm, em - 512 nm) 。 HPTSは高濃度では消光してお り、 小胞体から漏出した HPTSが希釈によって蛍光を発する原理を利用して、 膜 の透過率 （放出率） を以下の式 1. 1から算出した。 released % = (Ix - Ιο)/(Ιτ 1.1 - Ιο) (1.1)
Ιο： t=0(hr)における蛍光強度
Ix： t=x(hr)における蛍光強度
IT: 10°/oTriton-X 300 加えたときの蛍光強度 各 pHにおける 10分後の放出率を図 9に示した。 また、 各 pH における経時的 な内包分子の放出を測定した結果を図 10に示した。 図 10中の記号はそれぞれ、 (國） ρΗ 3.5、 (Δ) pH 4.5, (〇） pH 5.5、 （◊) pH 6.5、 （口） pH 7.3、 （▲) pH 11にお ける測定結果を表す。 pH3.5で約 20%の内包蛍光分子が放出したが、 pH6以上で はほとんど放出がされなかった。 よって化合物 28 を膜成分としたリボソームは、 低 pHによつて化合物 28が加水分解し、 加水分解した化合物 28のリゾ体はより 親水性が高いために小胞体から遊離することに伴って、 二分子膜の分子充填状態 が乱れて内包蛍光分子の放出速度が高まったものと考察される。
さらに、 化合物 28および 29のそれぞれ 10 mol%を膜成分としたリボソームを 調製し、 その pH応答性についても検証した。
リボソームの調製は、 前記 「 2 . リボソーム調製」 と同様にして行い、 (DOPC/chol/(28または 29)/PEG-DPE=5/5/l/0.03、 モル比）を得た。 その特性は表 7 に示したとおりである。
内包分子の放出は、 前記と同様の方法で蛍光強度を測定し、 その測定結果をも とに上記式 1. 1から算出した。 各 pHにおける 10分後の放出率を図 11に示した。 化合物 28または 29を膜成分 （10 mol%) としたリボソームは、 pH 4において 内包分子が急激に放出された。 低 pHにより放出率が增加することから、 分解性 脂質 （化合物 28または 29) の加水分解により、 生じたリゾ体が遊離し、 その際 リポソ一ムニ分子膜の分子充填状態が乱れ、 内包分子の放出が促進されたと考え られる。 〔実施例 6〕
1. ジスルフィ ド脂質の合成
下記のスキームに従い、 疎水部にジスルフィ ド基を有するジスルフィ ド脂質を 合成した。
Figure imgf000058_0001
(A) Να,Να'-di-Boc-L-cystine ((Boc-Cys-OH)2) (2.64 g, 6 mmol)を DMF40 mLに 溶解させ、 TEA(7 mL, 50 mmol)に溶解させた hexadecylmercaptan(1.55 g, 6 mmol) を滴下した。 40°Cにて 2時間反応させ、 ジスルフイド結合を形成させた。 溶媒除 去後、 ジェチルエーテルに溶解させ、 飽和硫酸水素カリウム、 飽和炭酸水素ナト リウム、 塩化ナトリゥムにて分液を行い（ジェチルエーテル層回収)、 溶媒を減圧 除去後、 カラム （中性シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール =9/1(容量/容量） ） による精製を行い、 化合物 30を白色固体として得た (437 mg, 収率 16%)。 化合物 30の分析結果：
薄層ク口マトグラフィ一（シリ力ゲル、 クロ口ホルム/メタノール (9/1) (容量/容 量）： Rf : 0.17(モノスポット）） 1H-NMR(CDC13 、 500 MHz、 δ (ppm)) :0.85(t,3H,-CH3),1.23(br,26H,-CH2-)， 1.38(s,9H,Boc), 1.58(m,2H,S-CH2-C¾-)， 2.69(t,2H,S-CH2-)5 2.93, 3.06(dd,lH，NH- CH(COOH)-CH2-), 4.16(t,lH,NH-CH(COOH)-) (B) 化合物 30(372 mg, 0.78 mmol)をジクロロメタン 20 mL に溶解させ、 hexadecylamine(188 mg, 0.78 mmol), DIEA(0.33 mL, 0.85 mmol). BOP試薬 (442 mg, 1 mmol )を加え、 室温にて 2時間反応させ、 アミ ド結合を形成させた。 反応 終了後、 クロ口ホルムに溶解させ、 飽和硫酸水素カリウム、 飽和炭酸水素ナトリ ゥム、 塩化ナトリウムにより分液を行い （クロ口ホルム層回収） 、 溶媒を減圧除 去後、 60°Cメタノールから再結晶を行い、 化合物 31 を白色粉末として得た (420 mg,収率 77%)。 化合物 31の分析結果： '
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール (9/1)(容量/容 量）： Rf : 0.90(モノスポッ ト））
1H-NMR(CDC13、 500 MHz、 δ (ppm)) :0.88(t,6H,-CH3), 1.25(br,52H,-CH2 -), 1.45(s,9H，Boc), 1.59(m,2H,NH-CH2-CH2-)， 1.65(m,2H,S-CH2-CH2-), 2.71(t,2H,S-CH2 -), 3.02-3.04(dd, 1 H,NH-CH(COOH)-CH2-)5 3.24(t,2H,NH-CH2-)， 4.36(t，lH，NH- CH(COOH)-)
(C) 化合物 31 (415 mg, 0.59 mmol)を TFA20 mLに溶解させ、 4°C、 1時間にて Boc基の脱保護を行った。 反応終了後、 炭酸水素飽和ナトリウム、 水にて分液を 行レ、（クロ口ホルム層回収)、 溶媒を減圧除去後、 カラム（中性シリカゲル、 クロ 口ホルム/メタノール =30/1(容量/容量))による精製を行い、 化合物 32 を白色粉末 として得た (252 mg, 71%)。 化合物 32の分析結果：
薄層クロマトグラフィ一（シリ力ゲル、 クロ口ホルム/メタノール (9/1) (容量/容 量）： Rf : 0.68(モノスポッ ト）） 1H-NMR(CDC13、 500 MHz, δ (ppm))：
0.88(t,6H，- CH3), 1.25(br,52H,-CH2-)， 1.50(m,2H,NH-CH2-CH2-)， 1.67(m,2H,S-CH2- CH2-)， 2.70(t,2H，S-CH2-)， 3.23(t,2H-CONH-CH2-), 3.29,3.31 (dd, 1 H5NH-CH(COOH)- C¾-)， 3.68(t,2H,NH-CH(COOH)-)
(D) 化合物 32 (250 mg, 0.42 mmol) をジクロロメタン 15 ml に溶解させ DIEA(0.45 mL, 1.2 mmol), Boc-Glu(OtBu)-OH(140 mg, 0,46 mol)、 BOP試薬をジク ロロメタンと共に室温で 10 時間反応させ、 アミ ド結合を形成した。 反応終了後、 クロ口ホルムに溶解させ、 飽和硫酸水素カリウム、 飽和炭酸水素ナトリウム、 水 にて分液を行い（クロ口ホルム ¾回収)、 溶媒を減圧除去後 60°Cメタノールから再 結晶を行い、 化合物 33を白色粉末として得た (317 mg, 収率 85%)。 化合物 33の分析結果：.
薄層ク口マトグラフィ一（シリ力ゲル、 クロ口ホルム/メタノール (9/1)(容量/容 量）： Rf :0.84(モノスポッ ト））
1H-NMR(CDC13、 500 MHz, δ (ppm))：
0.87(t,6H,-CH3)5 1.25(br，52H,-CH2-)， 1.44,1.46(s,18H,Boc)， 1.52(m,2H,NH-CH2-CH2-)， 1.66(m,2H,S-CH2-CH2-), 1.85,2.17(dd,lH,-NH-CH(COOH)-CH2-CH2-)， 2.33 (t,2H,- CH2-COO), 2.71(t,2H3-S-CH2-), 3.07(d,2H,-CH2-S-), 3.24(t,2H,CONH-CH2-), 4.25(t,lH,Boc-NH-CH(COOH)-)， 4.67(t,lH,-NH-CH(COOH)-)
(E) 化合物 33 (117 mg, 0.13 mmol)に TFA10 mL、を加え、 4°Cにて 2.5時間、 Boc 基、 OtBu基の脱保護を行った。 反応終了後、 飽和炭酸ナトリゥム、 水にて 分液を行い（クロ口ホルム層回収)、 カラム（中性シリカゲル、 クロ口ホルム/メタ ノール =9/1(容量/容量))により精製を行い化合物 34 (Glu-Cys-SC16)を白色粉末とし て得た (65 mg収率 69 %)。 化合物 34の分析結果：
薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール (4/1)(容量/容 量）： Rf :0.11(モノスポット））
1H-NMR(CDC13、 500 MHz, δ ( pm))：
0.80(t,6H,-CH3), 1.18(br,52H,-CH2-)， 1.42(m,2H5NH-CH2-CH2-), 1.58(m,2H,S-CH2- CH2-), 2.02, 2.09(dd,lH,-NH-CH(COOH)-CH2-CH2-)5 2.40(t,2H,-CH2-COO),2.62(t,2H,- S-CH2-)， 2.85,3.15(dd,2H,-CH2-S-), . 3.01(t,2H,CONH-CH2-)， 3.52(t,lH，N¾- CH(COOH)-), 4.50(t,lH,-NH-CH(COOH)-)
2. リボソームの調製 .
DPPC、 コレステロール、 Glu-Cys-SC16、 PEG-Ghi2C16をモル比 3/4/3/0.03 にて 混合させ、 クロ口ホルムに若干のメタノールを添加して、 最終濃度 5 wt%となる ように溶解させた。 溶解後、 溶媒の除去、 真空乾燥を経て混合脂質粉末を得た。 力ルセイン内包リボソームを得るため、 混合脂質を 100 mM力ルセイン水溶液 (2 wt%)にて水和 (r.t.,6 hr)後、 高圧押出し法（フィルタ一孔径； 5000 nm, 650 nm, 450 nm, 220 nm X 2 回）にて粒径制御（ φ =268土 103 nm)した。 未内包力ルセインは SephadexG— 75カラムにて除去した。
濃度を変化 （終濃度 10， 5, 1.0, 0.5, 0.1 mM) させた還元剤 （システィンまたは ダルタチオン） '水溶液に、 調製した力ルセイン内包リボソーム (総脂質濃度： 1 mg/ml)を添加し、 1 時間振とう後、 pH 7.4 にて蛍光測定（ λ ex:488 nm, A em:517 nm)を行い、 力ルセイン放出率を以下の式から算出した。
力ルセイン放出率 「％」 =(FX— F0)/(Fi00_F0)X l00
Fx=還元後における蛍光強度
F100=リポソームの完全可溶 後の蛍光強度
Fo=PBSにて 37°Clhr静置後の蛍光強度
結果を図 12 に示す。 図 12 中、 -〇-はシスティン添加系を示し、 -口-はグルタ - チオン添加系を示す。 図 12に示されるとおり、 膜成分として Glu-Cys-SC16を混 合したリボソームは還元剤の存在により力ルセインの放出が促進された。 特にシ スティン添加系では各濃度にて高い放出率を示したのに対し、 グル夕チオン添加 系では濃度依存的に放出率は增大した。 これは、 システィンの方が小胞体膜に対 して高い膜透過性と還元速度定数を持っため、 Glu-Cys-SC16 のリゾ化がより早く 進行し、 リゾ体のリボソーム膜からの脱離に伴って内包力ルセインが放出された ものと考えられる。 また力ルセインの放出率が 70%に留まったのは、 すべての Glu-Cys-SC16がリゾ体となって脱離した後安定な小胞体としてカルセィンを保持 したためと思われる。
〔実施例 7〕
1. マルトペンタォーゼ (MP)結合脂質の合成
下記のスキームに従い、 マルトペンタォーゼ結合脂質を合成した。
Figure imgf000062_0001
Glu2C18 MP-Glu2C18
MP (0.25 g、 0.302 mmol)、 Glu2C18 (0.098 g、 0.151 mmol)を DMF (2 mL)に溶解 し、 70。Cで 12時間攪拌した。 ニンヒ ドリンにより Glu2C18 のァミンのスポッ ト が消失したことを確認し、 反応溶液をアセトンでの再沈殿と水洗いにより精製し、 MP-Glu2C18を白色粉末で得た (0.145 g、 収率 66%)。
MP-Glu2C18の分析結果： ，
TLC (シリ力ゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール /水 (3/4/1) (v/v/v)： Rf： 0.85 (モノスポッ ト）. IRCcm"1)： 1736 [ v c=o (amide)]； 1676 [ v c=o (amide)]； 1553 [ δ N-H (amide)].
1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz , δ (ppm) )： 0.8 (6H)； 1.2 (60H)； 1.5 (4H)； 2.0 (2H)； 2.3 (2H)； 2,8〜5.6 (56H)； 7.9(1H). 2. MP担持リボソームとコンカナパリン A (Con A) との複合体形成現象 MP-Glu2C18を DPPC/cholesterol/DHSG=5/5/l (モル比） に対し、 0, 0.3, 1, 2, 10 mol%導入し、 10 mM HEPESバッファー（1 mM Ca2+,pH 7.4)にて調製したリポソ一 ム溶液 (0.5 mg/ml)に、 D-グルコースや D-マンノースの認識部位を 4つ持つレク チン Con A水溶液 (0.5 mg/ml)を添加して、 水溶液の濁度 (O.P.値、 λ =600 nm)の経 時変化を測定した。 図 13 は、 種々の MP-Glu2C18導入率のリボソーム分散液に 対して Con A溶液を添加した際の分散液の濁度 (O.P.値、 =600 nm)の経時変化 を示したグラフである。 図 13中、 〇は MP-Glu2C18導入率 0モル％、 秦は MP- Glu2C18 導入率 0.3 モル％、 △は MP-Glu2C18 導入率 1 モル0/。、 ▲は MP- Glu2C18導入率 2モル％、 口は MP-Glu2C18導入率 10モル％における経時変化 を示す。 Con A水溶液の添加直後から溶液濁度の上昇が観察された。 これは添加 した Con. Aがリボソーム表面の糖鎖末端 D-グルコースを認識し、 リポソーム間 を架橋したためと考えられる。 また、 図 14は、 図 13の 0.5分後、 5分後の濁度 (O.P.値、 λ =600 nm)変化を MP-Glu2C18導入率に対してプロットしたグラフであ る。 図 14中、 〇は 0.5分後の濁度変化を示し、 秦は 5分後の濁度変化を示す。 リボソーム表面の MP-Glu2C18導入量に依存して濁度の上昇が観察され、 導入量 2 mol%以上で急激な濁度上昇が見られた。
,3. MP担持リボソームとコンカナパリン A (Con A) との複合体解離現象
図 15は、 2mol%MP-Glu2C18導入リボソームに 1 mol%PEG脂質 (P125-2C14)を 導入した系を、 希釈倍率を変化させて希釈し、 この系に Con A溶液を添加した 際の分散液の濁度 (O.P.値、 1 =600 nm)の経時変化を示したグラフである。 MP- Glu2C18 を DPPC/cholester.ol/DHSG=5/5/l (モル比），に対し 2 mol%導入し、 10 mM HEPES バッファー（1 mM Ca2+,pH 7.4)にて調製したリボソーム分散液 (0.5 mg/ml)に、 Con A水溶液 (0.5 mg/ml)を添加すると、 図 15 中の〇で示すように、 水溶液の濁度 (O.P.値、 =600 nm)が増加した。 ここに 5 mMの EDTAを添加する と、 図 15 中の拳で示したとおり、 濁度上昇が完全に抑制されることがわかった c このことから、 Con Aの糖認識に Ca2+が必須であることが示唆された。
次に、 1 mol%PEG脂質 (P125-2C14)溶液をリボソーム分散液の外水相に添加し てリボソーム表面を PEG鎖にて修飾すると、 図 15中の に示したとおり、 濁度 上昇が抑制されたことから、 PEG鎖の排除体積効果によりリボソーム表面 MP の認識障害が起き、 機能が阻害された。 この系を希釈率 20倍 （図 15中の▲) 、 100倍 （図 15 中の口） 、 200倍 (図 15 中の▽)に希釈してから超遠心分離にてリ ポソームを分離し、 再分散した溶液に Con A を同様に添加したところ、 希釈倍 率の上昇に伴う濁度の上昇が観察された。 これはマスキングしたリボソーム表面 からの PEG脂質の脱離により、 MPに対する Con Aの認識能が発現したためと 考えられる。
〔実施例 8〕
l . H12-vesicleの調製
1 ,2-aistearoyl-sn-glvcero-3 -phosphatidyl ethanolamme (DSPE, 5 mg, 6.9 ju mol)をク ロロ.ホルム/メタノール混合溶媒 (8/1 (v/v)) に溶解後、 triethylamine (10.4 μ ιηο1) 添刀口し攪枠させ 7こ (r.t., 10 min)o らに、 Ν-( ε -maleimidocaproyl) succinimide ester (EMCS, 21.3 mg, 69 mol)を添加し攪拌させた (r丄, 1 時間）。 1,2-distearoyl-sn- glycero-3 -Dhosphatidyl choline (DPPC, 253.2 mg, 350 ju mol)、 cholesterol (106.5 mg, 280 /i mol), DHSG (48 mg, 69 μ mol)を溶解させ、 薄膜乾燥を経て、 真空乾燥にて 溶媒を除去した。 純水 15 mLで水和♦攪拌後、 押出法にて粒径制御し（ 0.8, 0.6, 0.45, 0.22 μ ηι), 遠心分離 (100,000g, 30 min)にて未反応 EMCSや副生成物を除去、 マレイミ ド基導入リン脂質小胞体 (MAL-vesicle)を得た (4 wt%, 6 mL)。 N末端にあ らかじめシスティンを導入したドデカペプチド (H12, 100 mM, lOO L)を MAL- vesicleに添加し、 振とうさせた (r丄， 12時間)。 遠心分離 (100,000g, 30 min)にて未 結合 H12を除去し、 H12-vesicleを得た。 ，
小胞体表面の H12 結合量は， 未結合 H12 を HPLC(TSK-GEL G3000PWXL column, 7.8 mm o.d. x 300 mm h， 1 mL/min, 36 %(v/v) ァセ トニト リノレ， 0.1 % (v/v) トリフフルォロ酢酸)にて定量し、 逆算した。
2. PEG導入 H12-vesicle (PEG(H12)vesicle)の調製
H12-vesicle 分散液 (17 mM, 5 mL)に PEG脂質 (P125-2C14) 水溶液 (17.0 μ Μ, 15.8 mL)を混合後 37°Cにて 2 時間撹拌した。 さらに超遠心分離 (33,000 rpm, 30 min)にて未導入 PEG脂質を除去後、 PEG脂質導入小胞体 (PEG(H12)vesicle)を得 た。
3. H12-Vの活性化血小板への特異的結合並びに PEG鎖修飾による結合抑制 (flow cytometry)
[方法]
洗浄ヒ ト血小板 (Ι.ΟχΙΟ5 / μ 50 L)に DiOC18標識した検体 (vesicle、 PEG- vesicle、 H12-vesicle、 PEG(H12)-vesicle、 f.c. [lipid] = 0.5 mg/mL)を混合し、 トロ ンビン (f. .3 U/mL)にて血小板を活性化させ， 37 °Cにて 10分間振とうし、 ホル ムアルデヒド (f.c. 1 % (v/v))にて固定した。 血小板分画の蛍光陽性率から、 血小 板への H12-vesicleの結合率を観察した。
[結果]
結果を図 16 に示した。 DiOC18標識 H12-vesicle存在下、 トロンビン刺激させ た活性化血小板の蛍光陽性率をフローサイ トメ トリ一にて測定したところ、 85.6 %であり、 H12-Vは活性化血小板へ結合することを確認した。 また、 トロン ビン未刺激時 (2.1 %)、 PAC-1 (活性化血小板上の GPIIb/IIIaに対する H12の結合 を阻害する抗体) 在下 (3.1 %)では結合は抑制され、 vesicle存在下 (2.3 %)も同様 であった。 従って、 H12-vesicle は活性化血小板と特異的に結合することが明ら かとなつた。 '
PEGを後導入させた PEG(H12)-Vで同様の実験を行ったところ、 活性化血小板 への結合率は、 3.4 %へ減少した。 これは、 PEG の排除体積効果により、 H12 の 機能が阻害されたためと考えられる。 、
4. PEG(H12) vesicle の PEG 脂質の脱離に伴う活性化血小板への結合 （flow cytometry)
[方法] ·
PEG(H12)vesicle分散液を PBS にて 0、 6、 300倍に希釈し、 振とうさせた (r.t., 1 時間)。 遠心分離 (100,000g, 30 min)にて濃縮し、 希釈倍率を変えた 3 種類の PEG(H12)vesicle ([lipidl = 3 mg/mL)を得た。 +洗浄血小板 (LOxlO5 L, 50 μ L)に DiOC18標識したそれぞれの PEG(H12)vesicle (f.c. [lipid] = 0.5 mg/mL)を混合し、 トロンビン (f. 3 U/mL)にて血小板を活性化さ せ， 37。Cにて 10分間振とう、 ホルムアルデヒド (f.c. 1 % (v/v))にて固定した。 ポ ジティブコントロール群は PEG未導入の H12-vesicle添加時とし、 ネガティブコ ントロール群は vesicle とした。 血小板分画の蛍光陽性率から、 血小板への PEG(H12)vesicleの結合率を観察した。 結果を図 17に示した。
[結果]
PEG(H12)- vesicle (図 17では PEG(H12)-vesicle) の活性化血小板への結合率は 11.0 %であった。 PEG(H12)-vesicleの希釈倍率の増大に伴い結合率は増大し、 300 倍希釈後には H12-vesicle のそれとほぼ同等であった。 このことから、 希釈によ る PEG脂質の脱離が促進され、 H12の機能が発現したと考えられる。 産業上の利用可能性
本発明の薬物運搬体は、 外部環境の変化によって薬物動態を制御することがで きるので、 各種疾患の予防 ·治療用の製剤として極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 薬物が担持されている分子集合体を含む薬物運搬体であって、 その分子集合 体を構成する一部の両親媒性分子が外部環境の変化によって分子集合体から遊離 することによって、 生体内における薬物動態が制御される薬物運搬体。
2 . 遊離する両親媒性分子が、
(薬物)一 (結合部位 A)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 1
または
(親水部)一 (結合部位 B )一 (疎水部)一 (結合部位 C )一 (薬物） 2
[式中、 結合部位 Aは親水部と薬物とを結合する部位であり、 結合部位 Bは親水 部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Cは疎水部 薬物とを結合する部 位である] で表されるものである請求の範囲第 1項記載の薬物運搬体。
3 . 遊離する両親媒性分子が、
(親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 3 または
(認識部位)一 (結合部位 E)— (親水性高分子）一 (結合部位 D)_ (親水部)— (結合部 位 B )—(疎水部） 4
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Dは親 ■水性高分子と親水部とを結合する部位であり、 結合部位 Eは認 部位と親水性高 分子とを結合する部位である] で表され、 この両親媒性分子の遊離によって生体 内における薬物動態が制御される請求の範囲第 1項記載の薬物運搬体。
4 . (認識部位)一 (結合部位 E)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 5
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Eは認 識部位と親水部とを結合する部位である] で表される両親媒性分子 5が担持され ている分子集合体であって、 該分子集合体に導入されている
(親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部） 3
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Dは親 水性高分子と親水部とを結合する部位である ] で表される両親媒性分子 3が両親 媒性分子 5の認識を阻害する状態にあって、 両親媒性分子 3の遊離によって両親 媒性分子 5の認識能が発現されることで生体内—における薬物動態が制御されるも のである請求の範囲第 1項記載の薬物運搬体。
5 . 遊離する両親媒性分子の疎水部が 2本以上 1 8本以下の炭化水素鎖を含有す るものである請求の範囲第 1項から第 4項までのいずれかに記載の薬物運搬体。
6 . 遊離する両親媒性分子の結合部位 Bにオリゴ糖鎖、 オリゴペプチド鎖、 ポリ エステル鎖、 ビュル系オリゴマーまたはデンドロン構造を含む請求の範囲第 5項 曾己載の薬物運搬体。
7 . 遊離する両親媒性分子が、
(薬物)一 (結合部位 A)— (親水部)一 (結合部位 B )— (竦水部)一 (結合部位 B )—(親水 部） 6
または
(薬物)一 (結合部位 A)— (親水部)一 (結合部位 B ) - (疎水部)一 (結合部位 B )一 (親水 部)一 (結合部位 A)— (薬物） 7
[式中、 結合部位 Aは薬物と親水部とを結合する部位であり、 結合部位 Bは親水 部と疎水部とを結合する部位である] で表されるものである請求の範囲第 1項記 載の薬物運搬体。
8 . 遊離する両 ¾媒性分子が、
(親水性高分子)— (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部)一 (結合部位 B )—(親水部） 8
または
(親水性高分子)— (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部位 B )— (疎水部)一(結合部位 B )— (親水部)一 (結合部位 D)— (親水性高分子） 9 ,
または
(認識部位)一 (結合部位 E)— (親水性高分子)一 (結合部位 D)— (親水部)一 (結合部 位 B )—（疎水部）一（結合部位 B )—（親水部）一（結合部位 D )— (親水性高分子） 1 0
または '
(認識部位)一 (結合部位 E )一 (親水性高分子)一 (結合部位 D )— (親水部)一 (結合部 位 B )— (疎水部)一 (結合部位 B )— (親水部)一 (結合部位 D )— (親水性高分子) - (結 合部位 E)— (認識部位） 1 1
[式中、 結合部位 Bは親水部と疎水部とを結合する部位であり、 結合部位 Dは親. 水性高分子と親水部とを結合する部位であり、 結合部位 Eは認識部位と親水性高 分子とを結合する部位である] で表され、 この両親媒性分子の遊離によって生体 内における薬物動態が制御されるものである請求の範囲第 1項記載の薬物運搬体。
9 . 遊離する両親媒性分子の親水部または親水性高分子がポリエチレンダリコー ルを含有するものである請求の範囲第 1項から第 8項までのいずれかに記載の薬 物運搬体。 ―
1 0 . 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 この分子集合体の分散液の希釈 によるものである請求の範囲第 1項から第 9項までのいずれかに記載の薬物運搬 体。
1 1 . 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 温度変化によるものである請求 の範囲第 1項から第 1 .0項までのいずれかに記載の薬物運搬体。
1 2 . 分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 プロトン、 アルカリ金属イオン およびアルカリ土類金属イオンからなる群から選択される少なくとも 1種の濃度 変化によるものである請求の範囲第 1項から第 1 1項までのいずれかに記載の薬 物運搬体。
1 3 . 遊離する両親媒性分子の親水部と疎水部とを結合する部位または疎水部に、 エステル結合、 アミ ド結合、 ウレタン結合及びシップ塩基からなる群から選択さ れる少なくとも 1種の結合を含有し、 かつ分子集合体からの両親媒性分子の遊離 がこれらの結合の加水分解によるものである請求の範囲第 1項から第 1 2項まで のいずれかに記載の薬物運搬体。 .
1 4 . 遊離する両親媒性分子の親水部と疎水部とを結合する部位または疎水部に ジスルフイド結合を含有し、 かつ分子集合体からの両親媒性分子の遊離が、 ジス ルフィ ド結合の還元によるものである請求の範囲第 1項から第 1 3項までのいず れかに記載の薬物運搬体。
1 5 . 両 |¾媒性分子の遊離に伴う分子集合構造の一部または全体的な破壊によつ て、 分子集合体に保持されていた薬物が放出されるものである請求の範囲第 1項 から第 1 4項までのいずれかに記載の薬物運搬体。
1 6 . 分子集合体が小胞体構造を有するものである請求の範囲第 1項から第 1 5 項までめいずれかに記載の薬物運搬体。
1 7 . 両親媒性分子の遊離に伴う小胞体構造の一部または全体的な破壊によって 、 小胞体内水相に保持されていた薬物が放出されるものである請求の範囲第 1 6 項記載の薬物運搬体。
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