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WO2006088047A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

蛍光検出装置及び蛍光検出方法 Download PDF

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WO2006088047A1
WO2006088047A1 PCT/JP2006/302633 JP2006302633W WO2006088047A1 WO 2006088047 A1 WO2006088047 A1 WO 2006088047A1 JP 2006302633 W JP2006302633 W JP 2006302633W WO 2006088047 A1 WO2006088047 A1 WO 2006088047A1
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WO
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fluorescence
sample
signal
laser light
detection
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2006/302633
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English (en)
French (fr)
Inventor
Noriaki Kimura
Kyoji Doi
Takayoshi Yumii
Takashi Yoshida
Shigeyuki Nakada
Hironori Hayashi
Kazuteru Hoshishima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
Original Assignee
Mitsui Engineering and Shipbuilding Co Ltd
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Priority claimed from JP2005285084A external-priority patent/JP4540579B2/ja
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Priority to US11/816,244 priority patent/US7822558B2/en
Priority to DK06713774.5T priority patent/DK1855102T3/da
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    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes

Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method for irradiating a measurement target with a laser beam whose intensity is modulated, receiving a fluorescence signal having a measurement target strength by the irradiation, and performing signal processing on the signal.
  • a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method identify fluorescence emitted from a fluorescent dye when irradiated with a laser beam while flowing a measurement target such as a flow cytometer used in the medical and biological fields through a sheath liquid. By identifying the measurement object, the present invention is applied to an analyzer that can analyze the measurement object in a short time.
  • a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method for obtaining each fluorescence intensity using a fluorescence detection value of a plurality of labeled samples emitted by simultaneously irradiating a plurality of labeled samples with laser light using a flow cytometer or the like.
  • a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method for obtaining each fluorescence intensity using a fluorescence detection value of a plurality of labeled samples emitted by simultaneously irradiating a plurality of labeled samples with laser light using a flow cytometer or the like.
  • a flow cytometer used in the medical and biological fields receives fluorescence from a fluorescent dye of a measurement object by irradiating a laser beam and detects the type of the measurement object.
  • the device is built in.
  • a flow cytometer uses a binding such as an antigen-antibody reaction, and samples such as cells, DNA, RNA, enzymes, proteins, and microbeads labeled with fluorescent dyes in physiological saline. Make the sample liquid turbid, and flow it so that the sample liquid is wrapped with another solution called sheath liquid, so that each labeled sample is subjected to pressure and flows at a speed of about 10 m / second. It is a device that forms a sheath flow, irradiates the sheath flow with laser light, and measures fluorescence and scattered light for each sample.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence emitted by the samples is measured to identify which fluorescent sample of the multiple types of samples has passed.
  • a labeled sample in which different types of fluorescent dyes are attached to various types of samples is used. This labeled sample is irradiated with laser light, and the fluorescence emitted at that time is measured.
  • a flow cytometer for example, can measure the relative amount of intracellular DNA, RNA, enzyme, protein, etc. in a cell, and can analyze these functions in a short time.
  • a cell sorter or the like that identifies specific types of cells and chromosomes by fluorescence and selects and collects only the specified cells and chromosomes in a live state is used.
  • Non-Patent Document 1 for example, a plurality of laser beams having different wavelength bands such as 488 nm, 595 nm, and 633 nm are irradiated, and a plurality of fluorescences having different wavelength bands emitted from the fluorescent dye by each laser beam are bandpassed.
  • a flow cytometer that uses a photomultiplier tube (PMT) to be separated and detected using a filter is disclosed. This makes it possible to identify fluorescence from a plurality of fluorescent reagents (fluorescent dyes) and instantly specify the types of a plurality of measurement objects.
  • PMT photomultiplier tube
  • the wavelength band of the fluorescence emitted from the fluorescent reagent is relatively wide, such as about 400 to 800 nm! However, it is a label that can distinguish only the fluorescence in the wavelength band of about 3 to 4 in the visible light wavelength band. Can not be used effectively as. There is a limit to increasing the number of fluorescence that can be identified by combining multiple fluorescent reagents.
  • the number of distinguishable fluorescences can be increased by using the detected fluorescence intensity together with the fluorescence wavelength.
  • the number that can be identified when using the intensity of fluorescence is about 2 to 5, and even when combined with the number that can be identified in the wavelength band of about 3 to 4 described above, the fluorescence can be identified.
  • the number is at most about 20. For this reason, even if such a flow cytometer is used, it is difficult to identify and analyze a very large number of measurement objects in a short time, and there is a problem.
  • a fluorescent dye is attached to the biological substance with a fluorescent reagent in advance, and is labeled with a fluorescent dye different from the fluorescent dye attached to the microbeads described later. It becomes.
  • This biological material is then mixed with a liquid containing microbeads having a diameter of 5 to 20 ⁇ m and having a unique structure such as a carboxyl group on the surface.
  • the structure such as the carboxyl group is a biological material having a certain known structure. Acts on the body to biocouple (couple).
  • the flow cytometer is provided with a plurality of photoelectric converters having different light receiving wavelength bands, and fluorescent dyes matching the light receiving wavelength bands are selected and used.
  • the measurement values obtained by the plurality of photoelectric converters represent the fluorescence intensity of each fluorescent dye.
  • the measurement result of the fluorescent intensity is deviated from the actual fluorescent intensity. In order to correct this deviation, the detection value is generally corrected.
  • Examples of such correction include a fluorescence value correction method disclosed in Patent Document 1 below.
  • Patent Document 1 measured values obtained by a plurality of photoelectric conversions are represented as vectors, while an inverse matrix of a preset correction matrix is created, and the inverse matrix is applied to the vector.
  • the correction matrix is a two-dimensional correlation diagram (scanner) as shown in FIGS. 8B and 9B of Patent Document 1. This is a matrix of geometric transformation that corrects the positional relationship in (tagram). For this reason, in order to create an inverse matrix from a correction matrix and to apply this inverse matrix to a vector whose elements are measured values, the correction matrix must be a square matrix.
  • the matrix size of this correction matrix depends on the number of photoelectric converters that output measurement values, the autofluorescence emitted by samples (measurement objects) such as microbeads and cells, and the types of fluorescence emitted by fluorescent dyes attached to these samples.
  • the number of photoelectric changes ⁇ and the number of received fluorescence must be equal.
  • Measuring using a large number of photoelectric conversions increases the number of photoelectric converters arranged and increases the number of processing circuits that process the measured values, increasing the cost of the flow cytometer and its processing equipment. For this reason, there is a problem that the types of fluorescent light that can be measured simultaneously are limited depending on the number of photoelectric conversion arrangements.
  • Tokusen Literature 1 http://www.bdDiosciences.com/pharmingen/protocols/Fluorochrome— Absorption.shtml (searched January 23, 2005)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-83894
  • the present invention performs signal processing when receiving a fluorescence signal of the measurement target force by irradiating the measurement target with laser light and performing signal processing.
  • Fluorescence detection device that can identify the type of fluorescence generated by a sample, which is a measurement object such as a large number of microbeads, and can identify a fluorescent signal efficiently in a short time, for example, is preferably used for a flow cytometer The object is to provide a fluorescence detector.
  • the present invention when each fluorescence intensity is obtained using a detected value of fluorescence emitted by irradiating a labeled sample on which a plurality of fluorescent dyes are labeled with laser light, an identifiable fluorescent dye that is simultaneously measured is obtained. It is an object of the present invention to provide a fluorescence detection method, a fluorescence detection apparatus, and a fluorescence detection method capable of increasing the number of types compared to the conventional one. Means for solving the problem [0011]
  • the present invention is a fluorescence detection apparatus that receives fluorescence emitted from a measurement object by irradiating the measurement object with laser light, and performs signal processing of a fluorescence signal obtained at this time.
  • a laser light source unit that emits a laser beam to be irradiated, a light receiving unit that outputs a fluorescence signal of fluorescence emitted from a measurement object irradiated with the laser beam, and a time modulation of the intensity of the laser beam emitted from the laser light source unit
  • a light source control unit that generates a modulation signal of a predetermined frequency and a measurement target using the modulation signal from a fluorescence signal output from the light receiving unit by irradiating a measurement object with time-modulated laser light
  • a processing unit for calculating a fluorescence relaxation time of fluorescence of an object, and a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light characterized by comprising a processing unit.
  • the processing unit calculates the fluorescence relaxation time by obtaining a phase delay of the fluorescence signal with respect to the modulation signal.
  • the light source control unit uses, as a pulse control signal, a code key sequence signal selected from a plurality of code key sequence signals in which a 1-bit signal value is encoded with a predetermined length and is orthogonal to each other. And the laser light emission ON / OFF is set so that the laser light emission ON time is longer than one period of the time modulation of the laser light.
  • the processing unit calculates the fluorescence relaxation time and discriminates fluorescence from the measurement object from the received light signal output from the light receiving unit using the encoded sequence signal.
  • the plurality of encoded sequence signals are configured by shifting one encoded signal in the bit direction so that the encoded sequence signals are orthogonal to each other by this shift. Preferred to be composed ,.
  • the laser light source unit includes a plurality of laser light sources that emit a plurality of laser beams, and the light source control unit orthogonally turns on and off the emission of laser beams from the plurality of laser light sources.
  • the processing unit is controlled using a plurality of encoded sequence signals, and the processing unit encodes the code signal used for emitting the laser light from the fluorescence signal output by overlapping the optical signals of the plurality of laser light powers in the light receiving unit. It is preferable to separate the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the measurement object by irradiation of each laser beam using the series signal.
  • the measurement object is a plurality of labeled samples labeled with a plurality of fluorescent dyes that emit different fluorescence
  • the light receiving unit is a labeled substrate that emits when irradiated with the laser light.
  • a plurality of detection sensors having different light receiving wavelength bands to receive the fluorescence of the sample, and collecting the detection value of the fluorescence signal including phase information from each detection sensor, and the processing unit includes the fluorescence Create a matrix that calculates the fluorescence relaxation time of the fluorescence emitted by the dye, and further sets the matrix element of the correction conversion matrix for obtaining the fluorescence intensity using the calculated fluorescence relaxation time.
  • a set of detection values of the fluorescence signal including the phase information collected from each detection sensor camera as a vector, and an inverse matrix generated by the correction conversion matrix force is applied to this vector to generate the labeled sample. It is preferable to have an intensity calculation unit that obtains the fluorescence intensity of the fluorescence emitted from each.
  • the processing unit has the autofluorescence of the first-order lag system for the unlabeled sample.
  • a first calibration unit that obtains a fluorescence relaxation time and a gain constant when the response is a relaxation response, wherein the first calibration unit uses the unlabeled sample as a measurement object and performs the predetermined measurement.
  • detection values including phase information are collected for each detection sensor force, and the fluorescence relaxation time and gain constant of the autofluorescence emitted from the label-free sample are obtained from these detection values.
  • the matrix creation unit creates the correction conversion matrix using the fluorescence relaxation time and the gain constant obtained by the first calibration unit. .
  • a fluorescence relaxation time and a gain constant when the fluorescence emitted from the fluorescent dye is a first order lag relaxation response are obtained for each type of the labeled sample.
  • a second calibration unit wherein the second calibration unit uses a labeled sample attached to a sample in which one of the fluorescent dyes emits autofluorescence as an object to be measured at the predetermined frequency.
  • detection values including phase information are collected for each detection sensor force, and from these detection values, the fluorescence relaxation time of the fluorescence emitted by the fluorescent dye of this labeled sample is determined.
  • a gain constant is obtained, and this fluorescence relaxation time and gain constant are applied to the labeled sample while changing the type of fluorescent dye attached to the autofluorescent sample.
  • the present invention provides fluorescence detection for obtaining each fluorescence intensity from the fluorescence detection values of a plurality of labeled samples that emit different fluorescence by irradiating a plurality of labeled samples labeled with a plurality of fluorescent dyes with laser light.
  • a laser light source unit that emits a laser beam that irradiates a measurement object, a light receiving unit that outputs a fluorescent signal of fluorescence emitted from the measurement object irradiated with the laser beam, and a laser light source unit
  • a light source control unit that generates a modulation signal having a predetermined frequency, and a fluorescence signal output from the light-receiving unit by irradiating the measurement object with the time-modulated laser beam.
  • a processing unit that calculates the fluorescence relaxation time of the fluorescence of the measurement object using the modulation signal, and
  • the light receiving unit includes a plurality of detection sensors having different light receiving wavelength bands for receiving fluorescence of the labeled sample when the intensity of the laser light is time-modulated at a predetermined frequency and applied to the labeled sample
  • the processing unit includes: By receiving light by the plurality of detection sensors, the input unit that collects each detection sensor force including detection values including phase information and each fluorescence of the label sample irradiated with the laser light is a relaxation response of the first order lag system.
  • a matrix generation unit that sets the matrix elements of the correction conversion matrix using the parameters of the transfer function and creates the correction conversion matrix, and a set of detection values including the phase information collected for each detection sensor force
  • an intensity calculation unit for calculating the fluorescence intensity of the fluorescence emitted from each of the labeling samples by applying an inverse matrix created from the correction conversion matrix to the vector.
  • the present invention is a fluorescence intensity calculation method for obtaining each fluorescence intensity from detection values of fluorescence emitted by irradiating a plurality of labeled samples labeled with a plurality of fluorescent dyes with laser light.
  • the intensity of the light is time-modulated at a predetermined frequency and irradiated to the labeled sample, and the detected value including the phase information is detected by detecting the fluorescence of the labeled sample at multiple detection sensors with different receiving wavelength bands.
  • the correction is performed by setting the matrix element of the correction conversion matrix using the parameter of the transfer function when the sensor force is collected and each fluorescence of the labeled sample irradiated with the laser light is assumed to be a relaxation response of the first-order lag system.
  • a fluorescence matrix that generates a label sample force by creating a transformation matrix and a set of detection values including the phase information collected from each detection sensor as a vector, and applying an inverse matrix created from the correction transformation matrix to this vector. And a step of obtaining the fluorescence intensity of the method.
  • the labeled sample has a plurality of different types by attaching different types of fluorescent dyes to the sample that emits autofluorescence upon irradiation with laser light, and the laser light to the labeled sample.
  • the wavelength spectrum of the fluorescence emitted from at least one of the fluorescent dyes and the autofluorescence emitted from the sample may be partially overlapped with each other in the wavelength region due to irradiation.
  • the step of creating the correction conversion matrix when the sample that emits autofluorescence is referred to as an unlabeled sample without attaching a fluorescent dye, First calibration is performed to obtain a fluorescence relaxation time and a gain constant when the autofluorescence is a first order lag relaxation response.
  • the unlabeled sample is By irradiating a laser beam time-modulated at the predetermined frequency as a measurement object, detection values including phase information are collected for each detection sensor force, and these detection value forces The autofluorescence emitted from the unlabeled sample is collected. A fluorescence relaxation time and a gain constant are obtained, and the correction conversion matrix is created using the fluorescence relaxation time and the gain constant obtained by the first calibration.
  • the detection values used when obtaining the fluorescence relaxation time and the gain constant are the amplitude values of the cos component and the sin component of the signal waveform detected by the detection sensor. Detection values including phase information are collected for each of the labeled samples, and it is preferable to extract a plurality of detection value force representative values and use them for the first calibration. Good.
  • the fluorescence relaxation time and the gain constant when the fluorescence emitted by the fluorescent dye is assumed to be a first order lag relaxation response are obtained.
  • the second calibration is performed separately for each type of the labeled sample, and in this second calibration, the labeled sample attached to the sample in which one of the fluorescent dyes emits autofluorescence is measured.
  • detection values including phase information are collected for each detection sensor force, and the fluorescence fluorescence emitted by the fluorescent dye of this labeled sample is obtained from these detection values.
  • the type of fluorescent dye that obtains the relaxation time and gain constant and attaches the fluorescence relaxation time and gain constant to the sample that emits autofluorescence. While changing, the fluorescence relaxation time and gain constant of the fluorescence emitted by all the fluorescent dyes contained in the labeled sample are obtained, and the fluorescence relaxation time and gain constant in the labeled sample obtained by this second calibration are used to It is preferable to create a correction transformation matrix.
  • a sample that does not have the fluorescent dye attached and has a sample power to emit the autofluorescence is referred to as an unlabeled sample.
  • a first calibration for obtaining a fluorescence relaxation time and a gain constant when the autofluorescence is assumed to be a first order lag relaxation response is performed on the unlabeled sample, and the first calibration is performed. Then, by irradiating the unlabeled sample with the laser beam time-modulated at the predetermined frequency as the measurement object, the detection values including the phase information are collected for each detection sensor force, and the label-free from the detection values.
  • the fluorescence relaxation time and gain constant of the fluorescence emitted by the sample and determine the fluorescence relaxation time and gain constant obtained by this first calibration.
  • the second calibration it is preferable to determine the fluorescence relaxation time and gain constant for each fluorescent emitted by the fluorescent dye of the labeled sample.
  • the gain constant obtained by the second calibration is used to create the correction conversion matrix, detection of each detection sensor is performed for each fluorescence emitted by the fluorescent dye of each labeled sample.
  • the gain constant that also provides value power is the highest of these gain constants. It is preferable to use it as a standard with a large gain constant.
  • the detection values used when obtaining the fluorescence relaxation time and the gain constant are the cos component and sin component of the signal waveform detected by the detection sensor.
  • a detection value that is an amplitude value and includes this phase information is collected for each of the labeled samples, and a representative value of the detection value of the plurality of labeled samples is extracted and used for the second calibration. I prefer that.
  • microbeads or the like are used as a measurement object, and the measurement object is irradiated with laser light whose intensity is modulated at a predetermined frequency, and the fluorescence relaxation time of the fluorescence emitted at that time is obtained. Since this fluorescence relaxation time varies depending on the type of fluorescent dye, this fluorescence relaxation time can be used to identify the type of fluorescence and the type of measurement object. That is, since the fluorescence relaxation time can be used for fluorescence identification in addition to the fluorescence wavelength and fluorescence intensity conventionally used for fluorescence identification, the number of distinguishable fluorescence increases. This is particularly effective for a flow cytometer that efficiently identifies a measurement object in a short time using a large number of fluorescent dyes.
  • a gain constant corresponding to the fluorescence intensity can be obtained even when a labeled sample labeled with a plurality of fluorescent dyes is irradiated with laser light.
  • the laser light is time-modulated at a predetermined frequency, phase difference information can be detected from one photoelectric converter. Therefore, since the fluorescence intensity is obtained using these values, the number of labeled samples that can be obtained by measurement as in the past is the type of fluorescent light that can be discriminated when the number of photoelectric conversion elements is the same. Can be increased as compared with the prior art.
  • the fluorescence intensity for multiple types of labeled samples perform the first and second calibrations to calculate the fluorescence relaxation time constant and gain constant using the unlabeled sample and each type of labeled sample. So multiple types of signs sun The fluorescence intensity for the pull can be obtained with high accuracy.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer using a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic configuration diagram showing an example of a laser light source used in a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing a spectral intensity distribution of laser light emitted from the laser light source section shown in FIG. 2 and light emitted by a fluorescent dye.
  • FIG. 4 is a schematic configuration diagram showing an example of a light receiving unit used in a fluorescence detection apparatus using an intensity-modulated laser beam according to the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic configuration diagram showing an example of a control processing unit used in a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining an IQ mixer of the control / processing section shown in FIG. 5.
  • FIG. 7] (a) and (b) are diagrams showing examples of signals generated by the fluorescence detection apparatus using the intensity-modulated laser light of the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating the characteristics of the fluorescence intensity of light emitted from a fluorescent dye.
  • FIG. 9 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer using the fluorescence intensity detection device of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing an example of a light receiving unit of the flow cytometer shown in FIG. 1.
  • FIG. 11 is a schematic configuration diagram showing an example of a control / processing unit of the flow cytometer shown in FIG. 1.
  • FIG. 12 is a schematic configuration diagram showing an example of the analyzer of the flow cytometer shown in FIG.
  • FIG. 13 is a flowchart showing an example of the flow of the fluorescence intensity detection method of the present invention.
  • FIG. 14 is a flowchart showing an example of a first calibration flow performed by the fluorescence intensity detection method of the present invention.
  • FIG. 15 is a flowchart showing an example of a second calibration flow performed by the fluorescence intensity detection method of the present invention. Explanation of symbols
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 using a fluorescence detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention.
  • the flow cytometer 10 irradiates a sample 12 such as a microbead to be measured with a laser beam, detects a fluorescent fluorescence signal emitted from a fluorescent dye provided in the sample 12, and performs signal processing on the signal processing device 20 And an analysis device (computer) 80 for analyzing the measurement object in the sample 12 from the processing result obtained by the signal processing device 20.
  • a sample 12 such as a microbead to be measured with a laser beam
  • an analysis device 80 for analyzing the measurement object in the sample 12 from the processing result obtained by the signal processing device 20.
  • the signal processing device 20 modulates the intensity of the laser light from the laser light source unit 22, the light receiving units 24 and 26, and the laser light source unit 22 at a predetermined frequency, and also turns on and off the laser light emission.
  • a control unit 28 including a control unit for controlling and a signal processing unit for identifying a fluorescent signal from the sample 12, and a pipe line for forming the flow cell by flowing the sample 12 in the sheath liquid forming a high-speed flow 30.
  • a collection container 32 is provided at the outlet of the conduit 30.
  • the flow cytometer 10 has a cell sorter for separating biological materials such as specific cells in the sample 12 within a short period of time from laser light irradiation, so that they are separated into separate collection containers. It can also be configured.
  • the laser beam is a pipeline 30
  • a lens system is provided to focus at a predetermined position.
  • a measurement point of the sample 12 is formed at the focus position of the laser beam.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the configuration of the laser light source unit 22.
  • Laser light source 22 is 350 ⁇ ! This part emits laser light having a wavelength in the visible light band of ⁇ 800 nm, intensity-modulated and code-modulated.
  • the laser light source unit 22 includes an R light source 22r, a G light source 22g, and a B light source 22b.
  • the R light source 22r emits mainly red laser light R as CW (continuous wave) laser light having a constant intensity, and emits the CW laser light intermittently while modulating the intensity of the CW laser light at a predetermined frequency.
  • the G light source 22g emits the green laser light G as CW laser light having a constant intensity, and emits it intermittently while modulating the intensity of the bracketed CW laser light at a predetermined frequency.
  • the B light source 22 b emits blue laser light B as CW laser light having a constant intensity, and emits it intermittently while modulating the intensity of the parent CW laser light at a predetermined frequency.
  • the laser light source unit 22 transmits a laser beam having a specific wavelength band and reflects a laser beam having another wavelength band.
  • a lens system 23c for focusing the laser beam to be focused on a measurement point in the conduit 30; a laser dryer 34r, 34g and 34b for driving each of the R light source 22r, the G light source 22g and the B light source 22b; And a power splitter 35 that distributes the processed signal to the laser drivers 34r, 34g, and 34b.
  • a light source for emitting these laser beams for example, a semiconductor laser is used.
  • the laser light has an output of, for example, about 5 to: LOOmW.
  • the frequency (modulation frequency) for modulating the intensity of the laser light is slightly longer than the fluorescence relaxation time, for example, 10 to 1 OO MHz.
  • the dichroic mirror 23a is a mirror that transmits the laser beam R and reflects the laser beam G.
  • the dichroic mirror 23a transmits the laser beams R and G and reflects the laser beam B.
  • the laser beams R, G, and B are combined to become irradiation light that irradiates the sample 12 at the measurement point.
  • the laser drivers 34r, 34g, and 34b are connected to the control / processing unit 28, and are configured to control the intensity of emission of the laser beams R, G, and B and the on-off state of the emission.
  • the intensity of each of the laser beams R, G, and B is modulated at a predetermined frequency by a modulation signal and a pulse modulation signal, and on / off of emission is controlled.
  • the R light source 22r, the G light source 22g, and the B light source 22b oscillate in a predetermined wavelength band so that the laser lights R, G, and B excite the fluorescent dye to emit fluorescence in a specific wavelength band.
  • the fluorescent dyes excited by the laser beams R, G, and B are attached to a sample 12 such as a biological substance or microbeads to be measured for fluorescence, and when the sample 12 passes through the pipeline 30 as a measurement object.
  • the laser beam R, G, and B is irradiated and emits fluorescence at a specific wavelength.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing the oscillation wavelength of the laser beam and the fluorescence intensity distribution of the fluorescence emitted by the fluorescent dye by this laser beam.
  • the wavelength ⁇ emitted from the B light source For example, the wavelength ⁇ emitted from the B light source
  • fluorescence with a central wavelength fluorescence with a central wavelength
  • fluorescence with a central wavelength fluorescence with a central wavelength
  • one type of light source power can be emitted by irradiating laser light of a wavelength.
  • the light receiving unit 24 is disposed so as to face the laser light source unit 22 with the pipe 30 interposed therebetween.
  • the light receiving unit 24 includes a photoelectric converter that outputs a detection signal indicating that the sample 12 passes through the measurement point when the laser beam is forward scattered by the sample 12 passing through the measurement point.
  • the signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the control 'processing unit 28, and is used as a trigger signal for notifying the timing at which the sample 12 passes the measurement point in the pipe 30 in the control / processing unit 28. .
  • the light receiving unit 26 is arranged in a direction perpendicular to the emission direction of the laser light emitted from the laser light source unit 22 and perpendicular to the moving direction of the sample 12 in the conduit 30. It has been.
  • the light receiving unit 26 includes a photoelectric converter that receives fluorescence emitted from the sample 12 irradiated at the measurement point.
  • FIG. 4 is a schematic configuration diagram showing a schematic configuration of an example of the light receiving unit 26.
  • the light receiving unit 26 shown in FIG. 4 includes a lens system 26a that focuses the fluorescent signal from the sample 12, dichroic mirrors 26b and 26b, bandpass filters 26c to 26c, a photomultiplier tube, and the like.
  • Photoelectric converters 27a to 27c are Photoelectric converters 27a to 27c.
  • the lens system 26a collects the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surfaces of the photoelectric converters 27a to 27c. It is configured to be bundled.
  • the dichroic mirrors 26b and 26b are configured to be bundled.
  • the band-pass filters 26c to 26c are installed in front of the light receiving surfaces of the photoelectric conversion elements ⁇ 27a to 27c.
  • the wavelength band of the transmitted fluorescence is set corresponding to the wavelength band of the fluorescence emitted by the fluorescent dye shown in FIG. 2, for example, the wavelength emitted by the laser light of the wavelength emitted from the B light source is set to the middle.
  • the fluorescence having wavelength 21 as the central wavelength and the fluorescence having wavelength 13 as the central wavelength have signal information modulated by a code sequence signal (codes 1 to 3 in FIG. 7) described later. It is received by the photoelectric conversion 27 a ⁇ 27 C as fluorescence. That is, the fluorescence signal force generated by receiving the light can be identified by performing the signal processing described later, which laser beam emits the fluorescence signal.
  • the photoelectric converters 27a to 27c are sensors that include a sensor including, for example, a photomultiplier tube, and convert light received by the photoelectric surface into an electrical signal.
  • a sensor including, for example, a photomultiplier tube
  • the output electric signal is a fluorescent signal having signal information.
  • This fluorescence signal is amplified by an amplifier and supplied to the control 'processing unit 28.
  • the control / processing unit 28 includes a signal generation unit 40, a signal processing unit 42, and a controller 44.
  • the signal generator 40 and the controller 44 form a light source controller that generates a modulation signal having a predetermined frequency.
  • the signal generation unit 40 is a part that generates a modulation signal for modulating (amplitude modulation) the intensity of the laser light at a predetermined frequency.
  • the signal generation unit 40 includes an oscillator 46, a power splitter 48, and amplifiers 50 and 52.
  • the signal generation unit 40 converts the generated modulation signal into a power split of the laser light source unit 22. This is a part that supplies the signal to the signal processing unit 42 as well as the signal to the signal processing unit 42.
  • the reason why the modulation signal is supplied to the signal processing unit 42 is that it is used as a reference signal for detecting the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c, as will be described later.
  • the modulation signal is a sine wave signal having a predetermined frequency, and is set to a frequency in the range of 10 to: LOOMHz.
  • the signal processing unit 42 is a part that extracts information on the phase delay of the fluorescence emitted by the microbeads by the irradiation of the laser light, using the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c.
  • the signal processing unit 42 is a sine wave signal supplied from the signal generation unit 40 to each of the amplifiers 54a to 54c that amplify the fluorescence signals output from the photoelectric converters 27a to 27c and the amplified fluorescence signals.
  • a power splitter 56 that distributes the modulation signal and IQ mixers 58a to 58c that synthesize the fluorescence signal amplified with the modulation signal as a reference signal are configured.
  • IQ mixers 58a to 58c are devices that combine the fluorescence signals supplied from the photoelectric converters 27a to 27c with the reference signals using the modulation signals supplied from the signal generation unit 40 as reference signals. Specifically, each of the IQ mixers 58a to 58c calculates a processing signal including a cos component and a high frequency component of the fluorescence signal by multiplying the reference signal by the fluorescence signal (RF signal) as shown in FIG. At the same time, the signal obtained by shifting the phase of the reference signal by 90 degrees is multiplied by the fluorescence signal to calculate a processing signal including the sin component and the high frequency component of the fluorescence signal. The processing signal including the cos component and the processing signal including the sin component are supplied to the controller 44.
  • the controller 44 controls the signal generation unit 40 to generate a sine wave signal having a predetermined frequency, and controls the laser drivers 34r, 34g, and 34b of the laser light source unit 22 using the encoded sequence signal. Controls on / off of emission, and further removes high-frequency components from the processing signal including the cos component and sin component of the fluorescence signal obtained by the signal processing unit 42 to remove the cos component and sin component of the fluorescence signal. This is the part that you want.
  • the controller 44 includes a system controller 60, a low-pass filter 62, an amplifier 64, and an AZD conversion 66.
  • the system controller 60 gives instructions for controlling the operation of each part and manages the entire operation of the flow cytometer 10.
  • the low-pass filter 62 takes a high-frequency component from a processing signal obtained by adding a high-frequency component to the cos component and sin component calculated by the signal processing unit 42. except.
  • the amplifier 64 amplifies the processed signal of the cos component and sin component from which the high frequency component has been removed.
  • the AZD transformation 66 samples the amplified processing signal. More specifically, the system controller 60 determines the oscillation frequency of the oscillator 46 for intensity modulation of the laser light. Further, the system controller 60 generates a pulse control signal for controlling on / off of the laser light emission to the laser dryers 34r, 34g, 34b.
  • This pulse control signal is generated by one encoded sequence signal selected from a plurality of encoded sequence signals orthogonal to each other.
  • This code sequence signal is composed of a 1-bit signal value and is encoded with a number of bits of a predetermined code length.
  • a reference code ⁇ sequence signal is generated using the) and a sequence code T -c (T is the high bit direction)
  • the encoded sequence signal is generated using a ql bit, bit shift operator).
  • the sequence code T′C is ⁇ a, a, a,, a ⁇ .
  • sequence codes C, T -C, T 'C used to generate this code sequence signal are
  • the generated encoded sequence signals are also orthogonal to each other.
  • PN series Pseudrandom Noise series
  • This PN sequence can be defined by the following formula (1), for example.
  • the order is 8th.
  • sequence code C is a PN sequence code
  • another sequence code having the same code length N as the sequence code C is assigned to C ′.
  • T-C ' ⁇ b, b, b,, b ⁇ and the cross-correlation between sequence codes c and c' q q q + 1 q + 2 q + N-1 ⁇
  • the number R, (q) is defined as in the following equation (2).
  • N is the number of terms a and b cc A l q + i in the sequence code (i is an integer between 0 and N-1), and N is the term a and the term b in the sequence code
  • V represents the value shown in the following formulas (3) and (4).
  • FIG. 7 (a) shows an example of the generated code sequence signal.
  • the laser light source emission z-off is controlled intermittently so that the laser beam is not emitted when the value is high.
  • the signal at time 0 of the code 2 sequence signal of code 2 corresponds to the signal at time 1 of code 1
  • the signal after time 0 of code 2 is the time t of code 1 It is generated corresponding to the subsequent signals.
  • the signal after time 0 is generated corresponding to the signal after time t of code 1.
  • the light source control unit 28a cyclically generates these signals so that code 1 is supplied to the laser driver 34r, code 2 is supplied to the laser driver 34g, and code 3 is supplied to the laser driver 34b as pulse control signals. Constructed.
  • the encoded sequence signal in the present invention is generated using the sequence code of the PN sequence, but the generation of the encoded sequence signal having autocorrelation and orthogonality in the present invention is performed by the above method. Without limitation, any method can be used as long as it generates a coded sequence signal having autocorrelation and orthogonality!
  • Fig. 7 (b) shows the relationship between the pulse modulation by the sign-rich sequence signal and the intensity modulation by the frequency of the laser beam.
  • the laser beam is modulated so that the intensity oscillates at a cycle shorter than the on state time.
  • the system controller 60 of the controller 44 generates a coded sequence signal using a sequence code as shown in Fig. 7 (a), and turns on laser light emission to each of the laser drivers 34r, 34g, 34b. It is supplied as a pulse control signal that controls Z-off.
  • the sampling in the AZD variation 66 of the controller 44 is performed by setting the sampling time resolution width (sampling interval) in order to efficiently calculate the correlation function between the encoded sequence signal and the fluorescent signal, as will be described later. It is preferable to align with the time resolution width of the sign key sequence signal. For example, if the time resolution width of the encoded sequence signal is 0.5 microseconds, it is preferable that the time resolution width of the sampling of the fluorescent signal is also 0.5 microseconds or an integer thereof.
  • the analyzer 80 obtains the phase delay angle of the fluorescence with respect to the laser beam, and further, this phase
  • the analysis apparatus 80 first performs autocorrelation of the encoded sequence signal with respect to this processed signal. Using the property and orthogonality, the sign recognition conversion is performed, and the values of the cos component and sin component of the fluorescence signal for each laser beam are extracted. Using the values of the cos component and sin component, the phase delay angle of the fluorescence with respect to the laser beam is obtained.
  • the type of sample 12 is specified by obtaining the fluorescence relaxation time constant (fluorescence relaxation time) from this phase delay angle and identifying the fluorescent dye. Further, by knowing the coded sequence signal used in the coding discrimination conversion, it is specified which laser beam the fluorescent signal is caused by.
  • the obtained phase shift angle depends on the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted by the fluorescent dye.
  • the cos component and the sin component are expressed by the following formula (5 ) And (6).
  • 0 is the phase shift angle
  • ⁇ is the modulation frequency of the laser beam
  • ⁇ is the fluorescence relaxation time constant.
  • the fluorescence relaxation time constant ⁇ is given by I as the initial fluorescence intensity as shown in Fig. 8.
  • the phase shift angle 0 is obtained from the ratio tan ( ⁇ ) of the cos component and the sin component of the fluorescence signal, and using this phase shift angle ⁇ , the fluorescence relaxation time constant is calculated from the above equations (5) and (6). ⁇ can be obtained.
  • This fluorescence relaxation time constant varies depending on the type of fluorescent dye as described above.
  • the apparent fluorescence relaxation time constant ⁇ also changes according to the ratio. Therefore, the ratio of the two fluorescent dyes can be specified by obtaining the fluorescence relaxation time constant ⁇ .
  • the type of fluorescence emitted can be identified. Twelve types can be identified.
  • the fluorescence signal that also emits the fluorescent dye force in the sample 12 is a fluorescence signal by laser light modulated (controlled for emission) according to a known sign sequence signal generated by the system controller 60. For this reason, this fluorescence signal is also a signal whose light intensity is modulated in accordance with the code sequence signal generated by the system controller 60. Therefore, by synchronizing the code (encoded sequence signal) that is the input signal generated by the system controller 60 and the fluorescence signal that is the response signal, and examining the correlation function, the laser whose fluorescence signal is modulated by which code It is possible to know whether or not a fluorescent signal by light is included.
  • the correlation function between the code generated by the system controller 60 and the fluorescence signal is calculated, and if there is a code having a high correlation value with the fluorescence signal, the fluorescence signal is modulated by this code (sign signal). It can be said that it is included as a fluorescence signal by the emitted laser beam. On the other hand, it can be said that a code having a very low correlation or no correlation does not include a fluorescence signal by a laser beam modulated by this code. Therefore, by emitting laser light modulated with a different code for each laser light source, it is possible to know by which laser light the received fluorescence is emitted.
  • the analyzer 80 obtains a stable value by repeatedly averaging the correlation function between the code as the input signal and the fluorescence signal as the response signal according to the cycle of the circulating code. Based on the obtained value, the laser light used to identify the received fluorescence is specified. In addition, since the wavelength band of light received by each of the photoelectric converters 27a to 27c is also known, the type of fluorescence can be specified.
  • the analysis device 80 includes the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted by the fluorescent dye, the fluorescence It is possible to identify the type of the sample 12 passing through the pipe line 30 by specifying the fluorescent dye provided on the sample 12 such as microbeads using the information on which laser light the optical signal is from .
  • the fluorescent dye provided on the sample 12 such as microbeads
  • the type of the DNA fragment of the microbead can be known by specifying the fluorescent dye.
  • the analyzer 80 obtains a histogram of the types of biological materials in the sample 12 and various characteristics in a short time.
  • the flow cytometer 10 is configured as described above.
  • the signal processing device 20 of the flow cytometer 10 first generates a signal of a predetermined frequency in the oscillator 46 in response to an instruction from the controller 44, and the signal is amplified by the amplifier 50, and the laser light source unit. 22 and the signal processing unit 42. In this state, the sample 12 flows through the pipe 30 and a flow is formed.
  • the flow has, for example, a flow rate of 1 to 10 mZ seconds in a flow path diameter of 100 / z m. Further, when microbeads are used as the sample 12, the sphere diameter of the microbeads is several ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • a detection signal for detecting the passage of the sample 12 by the light receiving unit 24 is output to the controller 44 as a trigger signal.
  • the controller 44 uses this detection signal as a trigger signal, and generates a code signal sequence signal having self-correlation and orthogonality with other code signal sequence signals in synchronization with the trigger signal. .
  • This code sequence signal is repeatedly generated cyclically.
  • This encoded sequence signal is supplied to laser dryers 34r, 34g, and 34b for use as a pulse control signal for controlling on / off of laser light emission from the laser light source section 22.
  • the on-Z-off of the emission of each laser beam is controlled in accordance with this pulse control signal, and a laser beam having signal information pulse-modulated by the sign-rich sequence signal is generated.
  • This laser light is used to excite the fluorescent dye in the sample 12 passing through the measurement point, and the fluorescent dye emits fluorescence when irradiated with this laser light. Depart here The fluorescence is received by the light receiving unit 26.
  • the intensity of the laser beam whose emission is on is modulated at a predetermined frequency.
  • Fluorescence from the fluorescent dye emitted by irradiation with such laser light is intensity-modulated at a predetermined frequency with a phase delay angle, and is emitted by being excited by laser light according to the on / off state of the laser light. Fluorescence is also an on / off signal.
  • the time required to irradiate the modulated laser beam with the detection power of the passage of the sample 12 by the light receiving unit 24 is extremely short. In a few seconds to several seconds when the sample 12 passes the measurement point.
  • the sample 12 is irradiated with laser light whose on-Z-off is controlled by a coded series signal that cyclically repeats while amplitude-modulating at a predetermined frequency.
  • the modulation frequency of the laser light is, for example, 10 to: LOO MHz.
  • the encoded sequence signal is generated with a time resolution width of about 1 ⁇ s, for example, a time resolution width of 1 ⁇ s
  • the code length ⁇ is a 7-bit code key modulation signal
  • the laser beam is modulated based on the encoded sequence signal generated repeatedly. Therefore, during the period from several seconds to several seconds when the sample 12 passes through the measurement point, the laser beam is circulated several times to several tens of times with a sign signal sequence signal having 7 seconds as one cycle.
  • the fluorescence signals received and output by photoelectric conversions 27a to 27c of light receiving unit 26 are amplified by amplifiers 54a to 54c, and sine waves supplied from signal generation unit 40 by IQ mixers 58a to 58c.
  • the signal is combined with the modulation signal.
  • the IQ mixers 58a to 58c generate a composite signal obtained by multiplying the modulation signal (reference signal), which is a sine wave signal, and the fluorescence signal, and adjust the phase of the modulation signal (reference signal), which is a sine wave signal.
  • a signal synthesized by multiplying the signal shifted by 90 degrees and the fluorescence signal is generated.
  • the two synthesized signals generated are sent to the low-pass filter 62 of the controller 44, the high frequency components are removed, and the cos component and sin component signals of the fluorescence signal are extracted.
  • the cos component and sin component signal of this fluorescence signal are amplified, AZD converted, and sent to the analyzer 80.
  • the AZD conversion is synchronized with the timing of the trigger signal from the light receiving unit 24, and the fluorescence signal is sampled with the same time resolution width as the time resolution width At of the encoded sequence signal.
  • Sampling is, for example, 16-bit sampling (0 to 32767 gradations) Sampling). Since the fluorescence signal is emitted by laser light pulse-modulated by the sign key sequence signal, the sampled data obtained from the fluorescence signal force includes the information of the sign key sequence signal! /
  • p ( t) is a time modulation component by PN code modulation signal
  • ⁇ is modulation frequency
  • reference signal (modulation signal) A (t) supplied to IQ mixers 58a to 58c is defined by the following equation (8).
  • a 0 (t) cos ( ⁇ t)... (8)
  • the encoded sequence signal used for time modulation of the laser beam has autocorrelation and orthogonality to other encoded sequence signals.
  • the coding discrimination conversion for decomposing the digital signal is performed for each laser beam.
  • 1 / 2′r′cos (0) and 1 / 2′r′sin ( ⁇ ) in the equation (11) are obtained by the code recognition conversion.
  • 0 represents the phase delay angle of the fluorescence emitted by the laser beam emitted from the i-th laser light source unit 22 with respect to the laser beam. Therefore, tan ( ⁇ ) can be obtained using the values of 1 / 2'r'cos ( ⁇ ) and 1 / 2'r'sin ( ⁇ ). Using this value of tan (0) and the above-described equations (1) and (2), the fluorescence relaxation time constant is obtained.
  • this fluorescence relaxation time constant varies depending on the fluorescent dye, the type of sample 12 such as microbeads is different (the type of biological material adhering to sample 12 is different).
  • the type of the fluorescent dye can be specified.
  • the type of the sample 12 can be specified. Therefore, the type of sample 12 is specified from the fluorescence emitted by sample 12.
  • the apparent fluorescence relaxation time constant ⁇ also changes according to this ratio. Therefore, an extremely large number of fluorescence relaxation time constants can be set by changing the mixing ratio. Therefore, by using fluorescent dyes having different fluorescence relaxation time constants for each type of microbeads, it is possible to set a large number of types of microbeads that can distinguish emitted fluorescence.
  • the encoded sequence signal having autocorrelation can be known when performing the above-described code-identification conversion, it is possible to identify which laser beam the fluorescent signal is from. . Conventionally, since laser light is not modulated and signal information is not included in fluorescence, it is not possible to specify which laser light is excited by excitation.
  • fluorescence emitted at the same wavelength can be received as different fluorescence signals by changing the encoded series signal of the laser light used for excitation. For this reason, by using a large number of encoded sequence signals having orthogonality, a large number of laser beams used for excitation of the fluorescent dye can be identified in a short time. Therefore, even if there are a large number of fluorescent dyes that are close to each other in the fluorescence wavelength band, The signal information of the laser beam to be irradiated is included in the fluorescence even if it is irradiated. As long as this signal information can be identified in the received light signal, the fluorescent dye attached to the sample can be specified.
  • the types of fluorescent dyes that can be identified can be increased by calculating the fluorescence relaxation time constant of the fluorescence emitted by the fluorescent dye.
  • the number of distinguishable fluorescent dyes increases to a very large number.
  • one type is a fluorescent dye selected from Cascade Blue, Cascade Yellow, Alexa Fluor 405, DAPI, Dapoxyl, Dialkylaminocoumarin, Hydroxycoumarin, Marine Blue, Pacific Blue, PyMPO.
  • the other type is preferably a semiconductor quantum fluorescent dye which is selected as a medium force between Q-Dot (trade name manufactured by Quantum Dot) and Evic-Tag (trade name manufactured by Evident Technology).
  • the former fluorescent dye has a shorter fluorescence relaxation time constant than the latter fluorescent dye.
  • the fluorescence relaxation time constant can be changed greatly.
  • Q-Dot has a fluorescence relaxation time constant of 20 to 40 nanoseconds.
  • FIG. 9 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 110 using the fluorescence intensity detection apparatus using intensity-modulated laser light according to the present invention.
  • the flow cytometer 110 is a laser beam applied to a labeled sample 112 in which a fluorescent dye is attached to a receptor sample such as microbeads or specific cells (hereinafter referred to as a sample) by chemical or physical binding.
  • the signal processing device 120 that detects and processes the fluorescence signal of the fluorescence emitted from the labeled sample 112, and the processing result force obtained by the signal processing device 120
  • the analysis device (computer) ) Has 180 and.
  • the sample is adapted to autofluorescence upon irradiation with laser light.
  • the signal processing device 120 includes a laser light source unit 122, light receiving units 124 and 126, and a laser light source unit 1 Control unit 128 having a control unit that modulates the intensity of laser light from laser 22 at a predetermined frequency and a processing unit that processes a fluorescence signal from labeled sample 112, and labeled sample 112 is flowed together with a sheath liquid that forms a high-speed flow. And a conduit 130 forming a flow cell.
  • a recovery container 132 is provided at the outlet of the conduit 130.
  • a cell sorter for separating biological materials such as specific cells in the labeled sample 112 within a short time by laser light irradiation is arranged and separated into separate collection containers. It ’s all about making things.
  • the laser light source unit 122 is a portion that emits a continuous wave laser beam in a visible light band of 350 nm to 800 nm, for example, a laser beam having a wavelength of 405 nm, with an intensity modulation at a predetermined frequency.
  • a semiconductor laser is used as a light source for emitting laser light, and laser light is emitted at an output of, for example, about 5 to: LOOmW.
  • the frequency (modulation frequency) for modulating the intensity of the laser light has a slightly longer period than the fluorescence relaxation time (fluorescence relaxation time constant), for example, 10 to 1 OO MHz.
  • each laser beam can be identified so that it can be identified which of the R, G, and B fluorescent light has reacted by the laser beam irradiation. It is possible to include the signal information of code-rich sequences orthogonal to each other.
  • the laser light source unit 122 oscillates in a predetermined wavelength band so that the laser light excites the fluorescent dye to emit fluorescence in a specific wavelength band.
  • the fluorescence emitted by the laser light is the fluorescence emitted by the labeled sample 112 to be measured (autofluorescence) and the fluorescence emitted by the fluorescent dye of the labeled sample 112.
  • the measurement point is measured. And emits fluorescence at a specific wavelength upon receiving laser light.
  • the light receiving unit 124 is disposed so as to face the laser light source unit 122 with the conduit 130 interposed therebetween.
  • the light receiving unit 124 includes a photoelectric converter that outputs a detection signal indicating that the labeled sample 112 passes through the measurement point by receiving laser light scattered forward by the labeled sample 112 passing through the measurement point.
  • the signal output from the light receiving unit 124 is supplied to the control 'processing unit 128, and used as a trigger signal for notifying the control / processing unit 128 of the timing at which the labeled sample 112 passes the measurement point in the pipe 130. It is done.
  • the light receiving unit 126 is orthogonal to the emission direction of the laser light emitted from the laser light source unit 122 and is orthogonal to the moving direction of the labeled sample 12 in the conduit 130. Arranged in the direction.
  • the light receiving portion 126 includes a photoelectric converter such as a photomultiplier (photomultiplier tube) or a valanche photodiode that receives fluorescence emitted from the labeled sample 112 irradiated at the measurement point.
  • FIG. 10 is a schematic configuration diagram showing a schematic configuration of an example of the light receiving unit 126.
  • the light receiving section 126 shown in FIG. 10 includes a lens system 126a that focuses the fluorescence from the labeled sample 112, Dyck P mirrors 126b and 126b, non-sound-final evenings 126c to 126c, and light.
  • photoelectric multipliers 127a to 127c such as electron multiplier tubes.
  • the lens system 126a is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 126 onto the light receiving surfaces of the photoelectric conversion units 27a to 127c.
  • the light receiving unit 126 has the same configuration as that of the light receiving unit 26 in the first mode and performs the same function, and thus the description thereof is omitted.
  • control and processing unit 128 includes a signal generation unit 140, a signal processing unit 142, and a controller 144.
  • the signal generation unit 140 and the controller 144 form a light source control unit that generates a modulation signal having a predetermined frequency.
  • the signal generation unit 140 is a part that generates a modulation signal for modulating (amplitude modulation) the intensity of laser light at a predetermined frequency.
  • the signal generation unit 140 includes an oscillator 146, a power splitter 148, and amplifiers 150, 152, and supplies the generated modulation signal to the laser light source unit 122 and also to the signal processing unit 142. Part. As will be described later, the modulation signal is supplied to the signal processing unit 142 in order to detect the phase difference of the fluorescence signals output from the photoelectric converters 127a to 127c. This is for use as a reference signal.
  • the modulation signal is a sine wave signal having a predetermined frequency, and is set to a frequency in the range of 10 to: LOOMHz.
  • the signal processing unit 142 has the same configuration as that of the signal processing unit 42 in the first aspect described above, and has the same function, and thus the description thereof is omitted.
  • the phase difference detector 156 shown in FIG. 11 includes a power splitter and IQ mixer similar to the power splitter 56 and IQ mixers 58a to 58c shown in FIG.
  • An IQ mixer (not shown) provided in the phase difference detector 156 uses a fluorescence signal supplied from the photoelectric converters 127a to 127c as a reference signal and a modulation signal supplied from the signal generator 140 as a reference signal.
  • Each IQ mixer multiplies the reference signal by the fluorescence signal (RF signal) to calculate the processing signal containing the cos component (real part) and the high-frequency component of the fluorescence signal, and the phase of the reference signal is 90 degrees.
  • the shifted signal is multiplied by the fluorescence signal to calculate a processing signal including the sin component (imaginary part) and the high frequency component of the fluorescence signal.
  • the processing signal including the cos component and the processing signal including the sin component are supplied to the controller 144.
  • the controller 144 controls the signal generation unit 40 to generate a sine wave signal having a predetermined frequency, and the signal processing unit 42 obtains the controller 144.
  • the high frequency component is removed from the processed signal including the cos component and the sin component of the fluorescence signal to obtain the cos component and the sin component of the fluorescence signal.
  • the controller 144 is different from the controller 44 in that it does not generate a code signal sequence signal for performing a modulation on each laser beam.
  • the controller 144 gives instructions for controlling the operation of each part, and controls the system controller 160 that manages the entire operation of the flow cytometer 110, and the cos component and sin component calculated by the signal processing unit 142.
  • a low-pass filter 162 that removes high-frequency components from the processing signal with the high-frequency components added
  • an amplifier 164 that amplifies the processing signals of the cos component and sin component from which the high-frequency components have been removed
  • the AZD variant that samples the amplified processing signal l66 And.
  • the processing signals of the cos component and the sin component from which the high frequency component has been removed are sampled and supplied to the analyzer 180.
  • the analyzer 180 processes the signal values of the cos component (real part) and sin component (imaginary part) of the fluorescence signal. Is a device having a vector component as a vector component, and applies an outer curve to a reverse matrix created from a predetermined correction conversion matrix to calculate the fluorescence intensity.
  • FIG. 12 is a schematic configuration diagram of the analyzer 180.
  • the analysis device 180 is a device configured by starting a predetermined program on a computer. In addition to the CPU 182, the memory 184, and the input / output port 186, the first calibration unit formed by starting software. 188, a second calibration unit 190 and an intensity calculation unit 192. A display 194 is connected to the analyzer 180.
  • the process performed by the analyzer 180 is a process along the flow shown in Figs.
  • the intensity calculating unit 192 executes the main part of the processing flow shown in FIG. 13 (steps S30 to S50), and the first calibration unit 188 is the main part of the processing flow shown in FIG. 14 (steps S 120 to S 150). ),
  • the second calibration unit 190 executes the main part (steps S220 to S270) of the processing flow shown in FIG.
  • the CPU 182 is an arithmetic processor provided in the computer, and substantially executes various calculations of the first calibration unit 188, the second calibration unit 190, and the intensity calculation unit 192.
  • the memory 184 is a ROM that stores programs that form the first calibration unit 188, the second calibration unit 190, and the intensity calculation unit 192, and the first calibration unit 188, the first calibration unit 188, and the first calibration unit 188. 2 RAM for storing the processing results calculated by the calibration unit 190 and the intensity calculating unit 192 and the data supplied from the input / output port 186.
  • the input / output port 186 accepts input of detection values of the cos component (real part) and sin component (imaginary part) of the fluorescence signal supplied from the controller 144, and the first calibration unit 188 and the second calibration unit.
  • the processing result values created by 190 and intensity calculation unit 192 are used to output information such as scattergrams to display 194.
  • the display 194 displays graphs such as scattergrams of processing result values such as fluorescence relaxation time constants and gain constants obtained by the first calibration unit 188, the second calibration unit 190, and the intensity calculation unit 192. indicate.
  • the intensity calculation unit 192 is a part that executes the main part of the processing flow shown in FIG. 13, and obtains each fluorescence intensity from the detected values of the cos component and the sin component supplied from the controller 144. That is, the intensity calculation unit 192 uses the parameters of the transfer function (gain constant, fluorescence relaxation time constant) when the fluorescence of the labeled sample irradiated with the laser light is a first-order lag relaxation response.
  • a correction conversion matrix is created by setting the matrix elements of the correction conversion matrix and obtaining the matrix elements of the correction conversion matrix.
  • a set of detection values (detection values including phase information) of the cos component and sin component collected from each detection sensor supplied from the controller 144 is used as a vector, and the correction conversion matrix previously created for this vector is used.
  • the labeled sample 112 is a labeled sample that is labeled by attaching different types of fluorescent dyes to samples such as cells and microbeads.
  • the number of labeled samples is n,
  • m and n are set to satisfy 2'm ⁇ n + l.
  • the first calibration unit 188 When the first calibration unit 188 has no sample to emit autofluorescence such as microbeads and has no sample to emit autofluorescence, it is referred to as an unlabeled sample. This is a part for obtaining the fluorescence relaxation time constant and gain constant when the relaxation response of the system is assumed. Specifically, the first calibration unit 188 irradiates a laser beam, which is time-modulated at a predetermined frequency, with a label-free sample as a measurement object, thereby converting a detection value including phase information into each photoelectric conversion. The fluorescence relaxation time constant and gain constant of autofluorescence emitted from the unlabeled sample are calculated from these detection values and stored in the memory 184. Details will be described later.
  • the second calibration unit 190 is a part for calculating the fluorescence relaxation time constant and the gain constant for each of the types of labeled samples having a fluorescent dye, separately. Even in this case, it is assumed that the fluorescence emitted by the fluorescent dye is a first-order delayed response.
  • the second calibration unit 190 is a labeled sample that is labeled using only one type of fluorescent dye (a microvibe that emits autofluorescence with one type of fluorescent dye attached).
  • Sample a microvibe that emits autofluorescence with one type of fluorescent dye attached.
  • detection values including phase information are collected for each detection sensor force. From the detected values, the fluorescence relaxation time constant and gain constant of the fluorescence emitted by the fluorescent dye of the selected labeled sample are calculated.
  • the relaxation time constant and gain constant of all the fluorescence emitted by the fluorescent dye of the labeled sample are calculated, and the calculated relaxation time constant and gain constant are stored in the memory. To remember. Details will be described later.
  • the fluorescence relaxation time constant and the gain constant of the autofluorescence and the fluorescence emitted by the fluorescent dye calculated by the first calibration unit 188 and the second calibration unit 190 and stored in the memory 184 are the intensity.
  • the correction conversion matrix is created in the calculation unit 192, it is used as a parameter of the transfer function and used for calculating the matrix elements of the correction conversion matrix.
  • the reason for using the fluorescence relaxation time constant and gain constant of autofluorescence calculated by the first calibration unit 188 is that the accuracy of the calculation result of the n fluorescence intensities emitted by the fluorescent dye deteriorates due to autofluorescence that also emits the labeled sample force. Is to prevent.
  • the fluorescence relaxation time constant and gain constant calculated by the second calibration unit 190 are used when simultaneously measuring the fluorescence emitted from n fluorescent dyes. This is to obtain the fluorescence intensity with high accuracy. That is, the intensity calculation unit 192 stores the fluorescence relaxation time constant and gain constant of autofluorescence that are stored and known in the memory 184, and the fluorescence relaxation time constant of each fluorescent dye that is stored and known in the memory 184. Then, a correction conversion matrix is created using the gain constant and the fluorescence constant is obtained using this. Details will be described later.
  • n types of labeled samples are prepared (step S10).
  • the n types of labeled samples are those in which n types of fluorescent dyes are attached to a sample such as microbeads and labeled, and are turbid in the measurement solution.
  • the labeled sample solution forms a flow cell in the conduit 130 using sheath liquid.
  • the flow cell has an intensity change at a predetermined frequency.
  • the fluorescence is measured by irradiating the adjusted laser beam (step S20).
  • the processing signal including the cos component and the sin component of the fluorescence signal is extracted by the phase difference detector 156 of the signal processing unit 142.
  • This processing signal is obtained as a detection value by the controller 144 from which a high-frequency signal is removed by the low-pass filter 162, and the cos component and sin component of the fluorescent signal are AD-converted.
  • the obtained cos component and sin component are supplied to the analyzer 180, and a scattergram (two-dimensional correlation diagram) is displayed using information on the cos component and sin component obtained within a predetermined measurement time. Is displayed at 194 (step S30).
  • the scattergram is displayed on the display 194, and the detected values of the cos component and sin component detected for each photoelectric change ⁇ are combined into a vector vector. Apply the created inverse matrix (step S50). By applying a reverse matrix to the vector, a gain constant in the fluorescence emitted by each labeled sample is obtained, and this gain constant is obtained as a vector of the ratio of the fluorescence intensity.
  • the ratio of the fluorescence intensity thus determined and the fluorescence relaxation time constant are displayed on the display 194 (step S50).
  • the detection values (cos component and sin component) output from each photoelectric converter are the fluorescence from n types of fluorescent dyes emitted from the labeled sample.
  • the transfer function of each first-order lag system of one type of autofluorescence is added and expressed as the following equations (12) and (13).
  • ⁇ l to n
  • m The gain constant detected by the photoelectric converter is standardized by the maximum gain constant.
  • ⁇ is the time of fluorescence relaxation when the labeled sample emitting autofluorescence emits autofluorescence.
  • ⁇ is an angular frequency obtained by multiplying the modulation frequency of the laser light by 2 ⁇ .
  • a is n kinds of fluorescent dyes
  • gain constant of autofluorescence when one type of autofluorescence is emitted simultaneously are simultaneously applied to labeled samples labeled with n types of fluorescent dyes.
  • equations (12) and (13) force are expressed using the correction transformation matrix M as shown in the following equation (14).
  • the matrix element of the correction transformation matrix M is, for example, a 1 ⁇ 1 matrix element is ⁇ (1+ ( ⁇ ⁇ ⁇ ) 2 ).
  • m and n are set so as to satisfy 2′m ⁇ n + 1 as described above. For this reason, the vertical size of the correction transformation matrix is reduced, for example, a row with a small value of ⁇ is taken. Except for the matrix size of (n + 1) X (n + 1). As a result, the matrix of the correction transformation matrix M is reduced in size, and an inverse matrix M′— 1 of the reduced square matrix M ′ is obtained, and this inverse matrix M′— 1 is converted into the left-hand side vector A of Equation (14). As a result, the right side vector X in the equation (14) is calculated (step S40).
  • Equation (14) by multiplying both sides of Equation (14) by the transposed matrix of the correction conversion matrix ⁇ , the correction conversion matrix is expressed as (n + 1) X ( n + 1) matrix changed to a square matrix M ⁇ M of size of the inverse matrix (M ⁇ M of this square matrix) - 1, iota Micromax multiplied by the transposed matrix on the left side of the vector a in the formula (14)
  • a (i ⁇
  • the gain constants ⁇ and a represent the fluorescence intensity of each fluorescence.
  • An unlabeled sample is a solution of one type of sample that autofluoresces when irradiated with laser light.
  • Examples of such a sample include a receptor sample such as a microbead or a cell provided with a Weiss force capable of binding an antibody or the like.
  • step S 110 the unlabeled sample is measured with a flow cytometer.
  • step S110 Measurement by the flow cytometer (step S110) and display of the scattergram (step S120) are the same as steps S20 and S30 shown in FIG.
  • the sample population in the fluorescence region of the unlabeled sample is selected based on the scattergram displayed on the display 194 (step S130). This selection is performed using an input operation system such as a mouse by the operator, and the cos component and sin component of the unlabeled sample included in the selected sample population region, or the representative value of the amplitude and phase difference of the fluorescence signal. (For example, average value, centroid value, frequency peak value) are obtained (step S140).
  • the fluorescence relaxation time constant and gain constant are defined using the following formulas (15) to (18) that define the relationship between the representative value and the fluorescence relaxation time constant and gain constant.
  • a number is determined (step S 150).
  • ⁇ is the angular frequency obtained by multiplying the modulation frequency of the laser beam by 2 ⁇ .
  • C is a proportionality constant.
  • the fluorescence relaxation time constant ⁇ of autofluorescence and the gain constant ⁇ of autofluorescence are given by equations (15) to (18).
  • the fluorescence relaxation time constant and gain constant of the unlabeled sample thus calculated are stored in the memory 184 (step S 150).
  • the first calibration is performed as described above.
  • one type of labeled sample refers to one type of self-luminous sample such as microbeads attached with one type of fluorescent dye.
  • the fluorescence is measured by the flow cytometer 110 (step S210), and the measurement result is displayed on the scattergram (step S220), and a sample group in one type of labeled sample is selected from the scattergram. .
  • step S210 The measurement by the flow cytometer (step S210) and the display of the scattergram (step S220) are the same as steps S20 and S30 shown in FIG.
  • the sample population is selected to identify the autofluorescence emitted by the sample in a single labeled sample. Specifically, a sample group in the fluorescent region of one type of labeled sample is selected in the scanter drum displayed on the display 94. This selection is performed using an input operation system such as a mouse by an operator, and the cos component and sin component of the fluorescence emitted from the labeled sample included in the selected sample group region, or the amplitude and position of the fluorescence signal. Representative values of the phase difference (for example, average value, barycentric value, frequency peak value) are obtained (step S240).
  • the fluorescence relaxation time constant and gain of autofluorescence emitted from the labeled sample calculated by the first calibration and stored in the memory 184 are determined.
  • the fluorescence relaxation time constant and the gain constant of the fluorescence emitted from the following formulas (19) to (21) force-labeled sample are calculated (step S250).
  • the subscripts [1] and [2] in Eq. (19) indicate the amplitude of the fluorescence signal ((cos component) 2 + (sin component) 2 )) (1 / 2), the photoelectric conversion number with the largest amplitude value and the second largest amplitude value are the photoelectric converter numbers. Therefore, ⁇ and ⁇ are ratios normalized to the maximum gain of the gain constant calculated in the first calibration among the self-luminous fluorescence, and the subscripts [1] and [2] Since the number is known, it is a known value.
  • the fluorescence relaxation time constant ⁇ calculated by the equation (19) is stored in the memory 184 for use in calculating the matrix element value of the correction transformation matrix in the equation (14) in the processing flow shown in FIG. . Furthermore, this fluorescence relaxation time constant ⁇
  • ⁇ is calculated from Equation (20) using 1.
  • a is the maximum gain constant of autofluorescence in the second calibration.
  • Omax i [l] i [l] This is the gain constant of the fluorescence received at the photoelectric conversion number with the maximum amplitude value among the fluorescence emitted by the element.
  • the gain constant ⁇ of the fluorescence received by the j-th photoelectric converter in the equation (22) is calculated using the following equation (22).
  • the calculated fluorescence relaxation time constant and gain constant are stored in the memory 184.
  • the calculated value is a parameter of fluorescence in one type of labeled sample. Therefore, it is determined whether or not each of the ⁇ types of labeled samples has been prepared and the fluorescence parameter has been obtained (step S260).
  • the fluorescence relaxation time constant and gain constant for each fluorescent dye are calculated from the fluorescence measurement of each type of labeled sample and stored in the memory 184.
  • the fluorescence relaxation time constant and the gain constant stored in the memory 184 in this way are used to create a correction conversion matrix in step S40 in the process shown in FIG.
  • max ⁇ used in the correction transformation matrix in equation (11) can be obtained.
  • the normalized ⁇ is stored in the memory 184 for use in calculating the matrix element value of the correction conversion matrix in the equation (22) in the processing flow shown in FIG.
  • a gain constant corresponding to the fluorescence intensity can be obtained based on the processing flow shown in FIG. 13 even when n types of labeling samples are irradiated with laser light.
  • the laser light is time-modulated with a predetermined frequency, the values of the cos component and the sin component can be detected from one photoelectric converter. Therefore, since the fluorescence intensity is obtained using these values, the number of labeled samples that can be obtained by measurement as in the past is not limited to the same number or less as the number of photoelectric conversion elements arranged as in the past. . In other words, when the number of arranged photoelectric converters is the same, the number of types of fluorescence that can be identified can be increased compared to the conventional case.
  • the fluorescence relaxation time constant and gain constant are calculated using the unlabeled sample and each type of labeled sample. Since the first calibration and the second calibration are performed, the fluorescence intensity can be obtained with high accuracy in the process shown in FIG.

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Abstract

　本発明の蛍光検出装置は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う。蛍光検出装置は、測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部と、時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力された蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部と、を有する。この装置を用いて収集された、標識サンプルが発する蛍光の位相情報を含む検出値から、標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度を求める。

Description

蛍光検出装置及び蛍光検出方法
技術分野
[0001] 本発明は、強度変調したレーザ光を測定対象物に照射し、この照射による測定対 象物力もの蛍光信号を受け、この信号について信号処理を行なう蛍光検出装置及 び蛍光検出方法に関する。蛍光検出装置及び蛍光検出方法は、例えば、医療、生 物分野で用いられるフローサイトメータ等のような測定対象物をシース液に流しつつ 、レーザ光が照射されて蛍光色素が発する蛍光を識別し測定対象物を識別すること により、測定対象物の分析等を短時間に行なうことのできる分析装置に適用される。 特に、フローサイトメータ等を利用して、複数の標識サンプルに同時にレーザ光を照 射することによって発する複数の標識サンプルの蛍光の検出値を用いて各蛍光強度 を求める蛍光検出装置及び蛍光検出方法に関する。
背景技術
[0002] 医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することによ り測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍 光検出装置が組み込まれて 、る。
フローサイトメータは、具体的には、抗原抗体反応等の結合を利用して、蛍光色素 が標識された細胞、 DNA、 RNA、酵素、蛋白等やマイクロビーズ等のサンプルを生 理食塩水等に混濁させてサンプル液を作り、シース液と呼ばれる別の溶液でサンプ ル液を包み込むように流すことにより、標識されたサンプル 1つ 1つが圧力を受けて毎 秒 10m以内程度の速度で流れるラミナ一シースフローを形成させ、このシースフロー にレーザ光を照射し、サンプル毎の蛍光や散乱光を計測する装置である。例えば、 多種類のサンプルを分析対象とする場合、サンプルの発する蛍光の蛍光強度を計 測して、多種類のサンプルのうちどの蛍光特性をもつサンプルが通過したかを識別 する。このとき、多種類のサンプルに対して種類別に異なる蛍光色素を付着させた標 識サンプルが用いられる。この標識サンプルにレーザ光を照射し、そのとき発する蛍 光の計測を行なう。 又、フローサイトメータでは、例えば、細胞内の DNA、 RNA、酵素、蛋白質等の細 胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定 のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生き た状態で短時間で選別収集するセル'ソータ等が用いられる。
これの使用においてはより多くの測定対象物を短時間に蛍光の情報力 特定する ことが要求される。
[0003] 下記非特許文献 1では、例えば 488nm、 595nm、 633nm等の波長帯域の異なる 複数のレーザ光を照射して、各レーザ光によって蛍光色素から発する波長帯域の異 なる複数の蛍光をバンドパスフィルタを用いて分離して光電子倍増管 (PMT)で検出 するフローサイトメータが開示されている。これにより、複数の蛍光試薬 (蛍光色素)か らの蛍光を識別して複数の測定対象物の種類を瞬時に特定することが可能となると されている。
[0004] しかし、蛍光試薬から発する蛍光の波長帯域は略 400〜800nm等と比較的帯域 幅が広!、ものの、可視光波長帯域で 3〜4程度の波長帯域の蛍光しか識別可能なラ ベルとして有効に用いることができな 、。複数の蛍光試薬を組み合わせて識別できる 蛍光の数を増やすことには限界がある。
また、識別可能な蛍光の数を増やすために、蛍光の波長とともに、検出される蛍光 の強度を用いて、識別できる蛍光の数を増加させることもできる。しかし、この場合に おいても、蛍光の強度を用いたときの識別可能数は 2〜5程度であり、上述した 3〜4 程度の波長帯域における識別可能数とともに組み合わせても、蛍光の識別可能数は 、せいぜい 20程度である。このため、このようなフローサイトメータを用いても、極めて 多数の測定対象物につ 、て短時間に識別して分析を行なうことが難し 、、 t 、つた 問題があった。
[0005] 例えば、 DNA等の生体物質をフローサイトメータで分析する場合、この生体物質に 予め蛍光試薬により蛍光色素が付着され、後述するマイクロビーズに付着された蛍 光色素と異なる蛍光色素でラベル化される。そして、この生体物質は、表面にカルボ キシル基等の特異な構造体の設けられた、直径 5〜20 μ mのマイクロビーズを含む 液体に混ぜられる。上記カルボキシル基等の構造体は、ある既知の構造の生体物質 に作用して生体結合 (カップリング)する。したがって、マイクロビーズからの蛍光と生 体物質の蛍光とを同時に検出した場合、生体物質は、マイクロビーズの構造体と生 体結合していることがわかる。これにより、生体物質の特性を分析することができる。し かし、多種多様なカップリング用の構造体を備える多種のマイクロビーズを用意して 生体物質の特性を短時間に分析するには、極めて多種類の蛍光色素が必要となる。 しかし、同時に識別可能な蛍光試薬の種類が少ないことから一度に多種類のマイク 口ビーズを用いて短時間に効率よく生体物質を分析することができない。
[0006] また、測定対象物に照射して蛍光を測定する測定点を管路の長手方向に複数設 け、各測定点にて照射されるレーザ光が互いに干渉しないようにする方法も考えられ る。しかし、この場合、レーザ光ゃ受光部を測定点の数に応じて多数設ける必要があ る。また、フローセルを形成する管路も長くなるので管路を流れるシース液の流路抵 抗は大きくなり、シース液に与えるべき圧力も大きくなる。このため、装置が大型化す るといった問題があった。
[0007] 又、フローサイトメータを用いた蛍光の計測のとき、多種類の蛍光色素が発する各 蛍光と、細胞やマイクロビーズ等のサンプル自体が発する自家蛍光とを同時に計測 し識別することが必要である。このため、フローサイトメータには、受光波長帯域を異 ならせた複数個の光電変換器が備えられ、この受光波長帯域に合致した蛍光色素 がそれぞれ選択されて使用される。その際、複数の光電変換器で得られた計測値は 各蛍光色素における蛍光強度を表すものとされている。しかし、複数の蛍光が光電 変換器の受光波長範囲において同時に受光されることにより、蛍光強度の計測結果 が実際の蛍光強度に対してずれが生じる。このずれを補正するために、検出値の補 正が一般に行われる。
このような補正として、例えば下記特許文献 1に開示される蛍光値補正方法が挙げ られる。
[0008] 下記特許文献 1では、複数の光電変 にて得られた計測値をベクトルとして表し 、一方、予め設定した補正行列の逆行列を作成し、この逆行列を上記ベクトルに作 用させることで、真の蛍光強度を算出することができるとされている。この場合、補正 行列は、当該特許文献 1の図 8 (B)、図 9 (B)に示すように、二次元相関図 (スキヤッ タグラム）における位置関係を修正する幾何学変換の行列である。このため、補正行 列から逆行列を作り、この逆行列を、計測値を要素とするベクトルに作用させるには、 補正行列が正方行列であることが必要となる。この補正行列の行列サイズは、計測値 を出力する光電変換器の数と、マイクロビーズや細胞等のサンプル (測定対象物）の 発する自家蛍光及びこのサンプルに付着した蛍光色素の発する蛍光の種類の合計 数とによって定まることから、補正行列が正方行列であるためには、光電変^^の数 と受光する蛍光の数が等しくなければならない。すなわち、マイクロビーズや細胞等 のサンプルに付着される蛍光色素を 4種類とすると、 1種類の自家蛍光と合わせた数 、すなわち 5個の光電変 による計測が必要となる。光電変 を多数用いて計 測することは、光電変換器の配置する個数は増える他、計測値に処理を施す処理回 路も増大するため、フローサイトメータ及びその処理装置のコストは増大する。このた め、同時に計測される識別可能な蛍光の種類は、光電変翻の配置数に応じて制 限されるといった問題が生じる。
[0009] 特千文献 1： http://www.bdDiosciences.com/pharmingen/protocols/Fluorochrome— Absorption.shtml (2005年 1月 23日検索）
特許文献 1：特開 2003— 83894号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、測定対象物にレーザ光を照射 することにより測定対象物力 の蛍光信号を受信して信号処理を行う際、この信号処 理により多数のマイクロビーズ等の測定対象物であるサンプル力 発する蛍光の種 類を識別することができ、特に短時間で効率よく蛍光信号を識別する蛍光検出装置 、例えば、フローサイトメータに好適に用いられる蛍光検出装置を提供することを目 的とする。さらに、本発明は、複数の蛍光色素が標識された標識サンプルにレーザ光 を照射することによって発する蛍光の検出値を用いて各蛍光強度を求める場合、同 時に計測される識別可能な蛍光色素の種類を従来に比べて多くすることができる蛍 光検出方法及び蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段 [0011] 本発明は、測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光 を受光し、このとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、測定 対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定 対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、前記レーザ光源部から出 射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周波数の変調信号を生成 する光源制御部と、時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記 受光部で出力された蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍 光緩和時間を算出する処理部と、を有することを特徴とする強度変調したレーザ光に よる蛍光検出装置を提供する。
[0012] その際、前記処理部は、前記蛍光信号の前記変調信号に対する位相遅れ求める ことにより、前記蛍光緩和時間を算出することが好ましい。
前記光源制御部は、 1ビットの信号値が所定長さで符号化され、かつ互いに直交す る複数の符号ィ匕系列信号の中から選択された符号ィ匕系列信号をパルス制御信号と して用い、かつ前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオンの時間が、前記レー ザ光の前記時間変調の 1周期よりも長くなるように、前記レーザ光の出射のオン/オフ を設定して制御し、前記処理部は、前記蛍光緩和時間を算出するとともに、前記受 光部で出力された受光信号から、前記符号化系列信号を用いて測定対象物からの 蛍光を識別することが好ましい。このとき、前記複数の符号化系列信号は、 1つの符 号ィ匕系列信号をビット方向にシフトして構成されたものであり、このシフトによって符 号化系列信号が互 ヽに直交するように構成されて 、ることが好ま 、。
また、前記レーザ光源部は、複数のレーザ光を出射する複数のレーザ光源を有し、 前記光源制御部は、複数のレーザ光源からのレーザ光の出射のオン Zオフを、互い に直交する前記複数の符号化系列信号を用いて制御し、前記処理部は、前記受光 部において複数のレーザ光力 の光信号が重なって出力された蛍光信号から、レー ザ光の出射に用いた符号ィ匕系列信号を用いて、各レーザ光の照射により測定対象 物が発する蛍光の蛍光信号をそれぞれ分離することが好ましい。
[0013] 又、前記測定対象物は、異なる蛍光を発する複数の蛍光色素により標識された複 数の標識サンプルであり、前記受光部は、前記レーザ光が照射されて発する標識サ ンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位 相情報を含む前記蛍光信号の検出値を各検出センサから収集する入力部を有し、 前記処理部は、前記蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時間を算出し、さらに、算出 した前記蛍光緩和時間を用いて、蛍光強度を求めるための補正変換行列の行列要 素を設定して前記補正変換行列を作成する行列作成部と、各検出センサカゝら収集さ れた前記位相情報を含んだ前記蛍光信号の検出値の組をベクトルとし、このベクトル に前記補正変換行列力 作成される逆行列を作用させて標識サンプルの各々が発 する蛍光の蛍光強度を求める強度算出部と、を有することが好ましい。
[0014] 又、蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからなるものを無 標識サンプルというとき、前記処理部は、前記無標識サンプルについて、前記自家 蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時間及びゲイン定数を求 める第 1のキャリブレーション部を有し、前記第 1のキャリブレーション部は、前記無標 識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射 することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサ力 収集し、これらの検出値 から前記無標識サンプルの発する前記自家蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を 求め、前記行列作成部は、この第 1のキャリブレーション部で求められた蛍光緩和時 間及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成することが好ま 、。
[0015] さらに、前記標識サンプルの種類すべてについて、前記蛍光色素が発する蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時間及びゲイン定数を、前記標 識サンプルの種類の別に求める第 2のキャリブレーション部を有し、前記第 2のキヤリ ブレーシヨン部は、前記蛍光色素のうちの 1種類が前記自家蛍光を発するサンプル に付着した標識サンプルを測定対象物として、前記所定の周波数で時間変調したレ 一ザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサ力 収集し、こ れらの検出値から、この標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時間及 びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時間及びゲイン定数を、前記自家蛍光を発する サンプルに付着させる蛍光色素の種類を変えながら、前記標識サンプルに含まれる すべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、前記行列 作成部は、この第 2のキャリブレーション部で求められた前記標識サンプルにおける 蛍光緩和時間及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成することが好ま ヽ
[0016] さらに、本発明は、複数の蛍光色素により標識された複数の標識サンプルにレーザ 光を照射することによって異なる蛍光を発する複数の標識サンプルの蛍光の検出値 から各蛍光強度を求める蛍光検出装置であって、測定対象物に照射するレーザ光を 出射するレーザ光源部と、レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光 信号を出力する受光部と、前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変 調させるために、所定の周波数の変調信号を生成する光源制御部と、時間変調した レーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力された蛍光信号から 、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部と、 を有し、
前記受光部は、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに 照射したときの標識サンプルの蛍光を受光する受光波長帯域の異なる複数の検出 センサを有し、前記処理部は、前記複数の検出センサで受光することにより、位相情 報を含む検出値を各検出センサ力 収集する入力部と、レーザ光を照射した標識サ ンプルの各蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを 用いて補正変換行列の行列要素を設定して前記補正変換行列を作成する行列作 成部と、各検出センサ力 収集された前記位相情報を含む検出値の組をベクトルとし 、このベクトルに前記補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプ ルの各々が発する蛍光の蛍光強度を求める強度算出部と、を有することを特徴とす る蛍光検出装置を提供する。
[0017] また、本発明は、複数の蛍光色素により標識された複数の標識サンプルにレーザ 光を照射することによって発する蛍光の検出値から各蛍光強度を求める蛍光強度算 出方法であって、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに 照射し、このときの標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサ で受光することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサ力 収集するステップ と、レーザ光を照射した標識サンプルの各蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとした ときの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列の行列要素を設定して前記補正 変換行列を作成するステップと、各検出センサから収集された前記位相情報を含む 検出値の組をベクトルとし、このベクトルに前記補正変換行列から作成される逆行列 を作用させて標識サンプル力 発する蛍光の蛍光強度を求めるステップと、を有する ことを特徴とする蛍光検出方法を提供する。
[0018] その際、前記標識サンプルは、互いに異なる種類の蛍光色素が、レーザ光の照射 により自家蛍光を発するサンプルへ付着することにより、異なる複数の種類を有し、 前記標識サンプルへのレーザ光の照射により、前記蛍光色素のうち少なくとも 1種類 の蛍光色素から発する蛍光と前記サンプルから発する自家蛍光とは、波長スぺクトラ ムが波長領域で部分的に互いに重なって 、てもよ 、。
前記蛍光検出方法において、前記検出センサの個数を m個、前記蛍光色素の種 類を n種類としたとき、 2 · m≥ n + 1を満足することが好ま 、。
[0019] なお、前記補正変換行列を作成するステップでは、蛍光色素が付着しておらず、前 記自家蛍光を発するサンプルカゝらなるものを無標識サンプルと ヽうとき、この無標識 サンプルについて、前記自家蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光 緩和時間及びゲイン定数を求める第 1のキャリブレーションが行われ、前記第 1のキ ヤリブレーシヨンでは、前記無標識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数 で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出セ ンサ力 収集し、これらの検出値力 前記無標識サンプルの発する前記自家蛍光の 蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、前記第 1のキャリブレーションにより求められ た蛍光緩和時間及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成することが好まし い。このとき、前記補正変換行列の作成において、前記補正変換行列を作成するた めに前記第 1のキャリブレーションにより求められる前記ゲイン定数を用いる際、各検 出センサの検出値力も得られるゲイン定数を、これらのゲイン定数のうち最大となるゲ イン定数で規格ィ匕して用いることが好ましい。このとき、前記第 1のキャリブレーション において、前記蛍光緩和時間及びゲイン定数を求めるときに用いられる検出値は、 前記検出センサで検出された信号波形の cos成分及び sin成分の振幅値であり、こ の位相情報を含む検出値は、前記標識サンプルの 1つ 1つに対して収集され、これら 複数の検出値力 代表値を抽出して前記第 1のキャリブレーションに用いることが好 ましい。
[0020] 前記補正変換行列を作成するステップでは、前記標識サンプルの種類すべてにつ いて、前記蛍光色素が発する蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光 緩和時間及びゲイン定数を、前記標識サンプルの種類の別に求める第 2のキヤリブ レーシヨンが行われ、この第 2のキャリブレーションでは、前記蛍光色素のうちの 1種 類が前記自家蛍光を発するサンプルに付着した標識サンプルを測定対象物として、 前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む 検出値を各検出センサ力 収集し、これらの検出値から、この標識サンプルの蛍光 色素が発する蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時間及び ゲイン定数を、前記自家蛍光を発するサンプルに付着させる蛍光色素の種類を変え ながら、前記標識サンプルに含まれるすべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和 時間及びゲイン定数を求め、この第 2のキャリブレーションにより求められた前記標識 サンプルにおける蛍光緩和時間及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成 することが好ましい。
[0021] なお、前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎の蛍光緩和時間及びゲイン 定数を求める際、前記蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプル 力もなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家 蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時間及びゲイン定数を求 める第 1のキャリブレーションが行われ、前記第 1のキャリブレーションでは、前記無標 識サンプルを測定対象物として前記所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射 することにより、位相情報を含む検出値を各検出センサ力 収集し、これらの検出値 から前記無標識サンプルの発する蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、この 第 1のキャリブレーションにより求められた蛍光緩和時間及びゲイン定数を用いて、前 記第 2のキャリブレーションにお 、て、前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎 の蛍光緩和時間及びゲイン定数を求めることが好まし 、。前記補正変換行列の作成 において、前記補正変換行列を作成するために前記第 2のキャリブレーションにより 求められる前記ゲイン定数を用いる際、各標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎 に、各検出センサの検出値力も得られるゲイン定数を、これらのゲイン定数のうち最 大となるゲイン定数で規格ィ匕して用いることが好まし 、。
[0022] 又、前記第 2のキャリブレーションにお 、て、前記蛍光緩和時間及びゲイン定数を 求めるときに用いられる検出値は、前記検出センサで検出された信号波形の cos成 分及び sin成分の振幅値であり、この位相情報を含む検出値は前記標識サンプルの 1つ 1つに対して収集され、これら複数の標識サンプルの検出値力 代表値を抽出し て前記第 2のキャリブレーションに用いることが好ま 、。
発明の効果
[0023] 本発明は、マイクロビーズ等を測定対象物とし、この測定対象物に所定の周波数で 強度変調したレーザ光を照射し、そのとき発する蛍光の蛍光緩和時間を求める。この 蛍光緩和時間は、蛍光色素の種類によって異なっているため、この蛍光緩和時間を 用いて、蛍光の種類、さらには測定対象物の種類を識別することができる。すなわち 、従来、蛍光の識別に用いられる蛍光の波長及び蛍光の強度のほかに、蛍光緩和 時間を蛍光の識別のために用いることができるので、識別可能な蛍光の数は増大す る。特に多数の蛍光色素を用いて短時間に測定対象物を効率良く特定するフローサ イトメータにとっては有効である。
また、複数のレーザ光を用いる場合、レーザ光毎に互いに直交する符号化系列信 号をレーザ光のパルス制御信号として用いることで、受光した蛍光信号がどのレーザ 光の照射に拠るものかを特定することができる。これにより、短時間に測定対象物を 効率良く特定することができる。
さらに、本発明は、複数の蛍光色素が標識された標識サンプルにレーザ光を照射 しても、蛍光強度に対応するゲイン定数を求めることができる。その際、レーザ光を所 定の周波数で時間変調するので、 1つの光電変換器から位相差情報を検出すること ができる。したがって、これらの値を用いて蛍光強度を求めるので、従来のように、計 測により求めることができる標識サンプルの数は、光電変^^の配置個数が同じ場 合、識別可能な蛍光の種類を従来に比べて多くすることができる。
また、複数種類の標識サンプルに対する蛍光強度の前に、無標識サンプル及び各 種類ごとの標識サンプルを用いて蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出する第 1の キャリブレーション及び第 2のキャリブレーションを行なうので、複数種類の標識サン プルに対する蛍光強度を精度良く求めることができる。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイトメ一 タの概略構成図である。
[図 2]本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられるレーザ光源 部の一例を示す概略構成図である。
[図 3]図 2に示すレーザ光源部から出射されるレーザ光と蛍光色素の発する光のスぺ タトル強度分布を模式的に示す図である。
[図 4]本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる受光部の一 例を示す概略構成図である。
[図 5]本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置に用いられる制御 '処理 部の一例を示す概略構成図である。
[図 6]図 5に示す制御 ·処理部の IQミキサを説明する図である。
[図 7] (a)及び (b)は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置で生成さ れる各信号の例を示す図である。
[図 8]蛍光色素が発する光の蛍光強度の特性を説明する図である。
[図 9]本発明の蛍光強度検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。
[図 10]図 1に示すフローサイトメータの受光部の一例を示す略構成図である。
[図 11]図 1に示すフローサイトメータの制御 ·処理部の一例を示す略構成図である。
[図 12]図 1に示すフローサイトメータの分析装置の一例を示す略構成図である。
[図 13]本発明の蛍光強度検出方法の流れの一例を示すフローチャートである。
[図 14]本発明の蛍光強度検出方法で行う第 1のキャリブレーションの流れの一例を示 すフローチャートである。
[図 15]本発明の蛍光強度検出方法で行う第 2のキャリブレーションの流れの一例を示 すフローチャートである。 符号の説明
[0025] 10, 110 フローサイトメータ ， 120 信号処理装置
, 122 レーザ光源部
r R光源
g G光源
b B光源
a , 23a， 26b , 26b ダイクロイツクミラー
1 2 1 2
c. 26a, 126a レンズ系
, 26, 124, 126 受光部
c , 26c， 26c , 126c , 126c , 126c ノ ンドノ スフイノレ夕
1 2 3 1 2 3
a~27c, 127 &〜 127c 光電変換器
, 128 制御 ·処理部
, 130 管路
, 132 回収容器
r, 34g, 34b レーザドライノ
, 48, 56 パワースプリッタ
, 140 信号生成部
， 142 信号処理部
, 144 コントローラ
, 146 発振器
, 52, 54a, 54b, 54c, 64, 150, 152, 154a, 154b, 154c, 164 アンプa, 58b, 58c IQ キサ
, 160 システム制御器
, 162 ローノ スフィルタ
, 166 A/D変^^
, 180 分析装置
2 標識サンプル
6 位相差検出器
2 CPU 184 メモリ
186 入出力ポート
188 第 1キャリブレーションユニット
190 第 2キャリブレーションユニット
192 強度算出ユニット
発明を実施するための最良の形態
[0026] 以下、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置及び蛍光検出方法を 好適に用いるフローサイトメータを基に詳細に説明する。
まず、本発明の第 1の態様について説明する。
[0027] 図 1は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置を用いたフローサイト メータ 10の概略構成図である。
フローサイトメータ 10は、レーザ光を測定対象とするマイクロビーズ等の試料 12に 照射し、試料 12中に設けられた蛍光色素の発する蛍光の蛍光信号を検出して信号 処理する信号処理装置 20と、信号処理装置 20で得られた処理結果から試料 12中 の測定対象物の分析を行なう分析装置 (コンピュータ) 80とを有する。
[0028] 信号処理装置 20は、レーザ光源部 22と、受光部 24、 26と、レーザ光源部 22から のレーザ光を所定の周波数で強度変調させるとともに、レーザ光の出射のオン Zォ フを制御する制御部及び試料 12からの蛍光信号を識別する信号処理部を含んだ制 御'処理部 28と、高速流を形成するシース液に含ませて試料 12を流してフローセル を形成する管路 30と、を有する。
管路 30の出口には、回収容器 32が設けられている。フローサイトメータ 10には、試 料 12中の特定の細胞等の生体物質を、レーザ光の照射から短時間内に分離するた めのセル'ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構成することもできる。
[0029] レーザ光源部 22は、波長の異なる 3つのレーザ光、例えばえ =405nm、 λ = 53
1 2
3nmおよびえ =650nm等のレーザ光を出射する部分である。レーザ光は、管路 30
3
中の所定の位置に集束するようにレンズ系が設けられる。レーザ光の集束位置には 試料 12の測定点が形成される。
[0030] 図 2は、レーザ光源部 22の構成の一例を示す図である。 レーザ光源部 22は、 350ηπ！〜 800nmの可視光帯域の波長を有し、強度変調し、 かつ符号ィ匕変調したレーザ光を出射する部分である。
レーザ光源部 22は、 R光源 22r、 G光源 22g及び B光源 22bを有する。 R光源 22r は、主に赤色のレーザ光 Rを強度が一定の CW (連続波）レーザ光として出射し、か つこの CWレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射する。 G 光源 22gは、緑色のレーザ光 Gを強度が一定の CWレーザ光として出射し、かっこの CWレーザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射する。 B光源 22 bは、青色のレーザ光 Bを、強度が一定の CWレーザ光として出射し、かっこの CWレ 一ザ光の強度を所定の周波数で変調しながら、断続的に出射する。
この他、レーザ光源部 22は、特定の波長帯域のレーザ光を透過し、他の波長帯域 のレーザ光を反射するダイクロイツクミラー 23a
1、 23aと、レーザ光 R, Gおよび Bから 2
なるレーザ光を管路 30中の測定点に集束させるレンズ系 23cと、 R光源 22r、 G光源 22gおよび B光源 22bのぞれぞれを駆動するレーザドライノく 34r, 34gおよび 34bと、 供給された信号をレーザドライバ 34r, 34gおよび 34bに分配するパワースプリッタ 35 と、を有する。
[0031] これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ 光は、例えば 5〜： LOOmW程度の出力である。一方、レーザ光の強度を変調する周 波数 (変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長い、例えば 10〜1 OOMHzである。
ダイクロイツクミラー 23aは、レーザ光 Rを透過し、レーザ光 Gを反射するミラーであ
1
り、ダイクロイツクミラー 23aは、レーザ光 Rおよび Gを透過し、レーザ光 Bを反射する
2
ミラーである。
この構成によりレーザ光 R, Gおよび Bが合成されて、測定点の試料 12を照射する 照射光となる。
[0032] レーザドライバ 34r, 34gおよび 34bは、制御.処理部 28に接続されて、レーザ光 R , G, Bの出射の強度及び出射のオン Zオフが制御されるように構成される。ここで、 レーザ光 R, G, Bの各々は、後述するように変調信号、パルス変調信号によって、所 定の周波数で強度が変調され、かつ出射のオン Zオフが制御される。 [0033] R光源 22r、 G光源 22gおよび B光源 22bは、レーザ光 R、 Gおよび Bが蛍光色素を 励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振す る。レーザ光 R、 Gおよび Bによって励起される蛍光色素は、蛍光計測しょうとする生 体物質やマイクロビーズ等の試料 12に付着されており、試料 12が測定対象物として 管路 30を通過する際、測定点でレーザ光 R、 Gおよび Bの照射を受けて特定の波長 で蛍光を発する。
図 3は、レーザ光の発振波長と、このレーザ光によって蛍光色素の発する蛍光のス ベクトル強度分布を模式的に示す図である。例えば、 B光源から出射する波長 λ の
11 レーザ光の照射により、異なる 3つの蛍光色素によって中心波長をえ とする蛍光、
12
中心波長をえ とする蛍光、および中心波長をえ とする蛍光の 3種類の蛍光を発す
13 14
る。同様に、 G光源から出射する波長え のレーザ光の照射により 2種類の蛍光（λ
21 22
, λ )を発する。また、 Β光源力も出射する波長え のレーザ光の照射により 1種類
23 31
の蛍光（λ )
32を発する。
[0034] 受光部 24は、管路 30を挟んでレーザ光源部 22と対向するように配置されて 、る。
受光部 24は、測定点を通過する試料 12によってレーザ光が前方散乱することにより 、試料 12が測定点を通過する旨の検出信号を出力する光電変換器を備える。この 受光部 24から出力される信号は、制御'処理部 28に供給され、制御，処理部 28にお いて試料 12が管路 30中の測定点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用 いられる。
[0035] 一方、受光部 26は、レーザ光源部 22から出射されるレーザ光の出射方向に対して 垂直方向であって、かつ管路 30中の試料 12の移動方向に対して垂直方向に配置さ れている。受光部 26は、測定点にて照射された試料 12が発する蛍光を受光する光 電変換器を備える。
図 4は、受光部 26の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
[0036] 図 4に示す受光部 26は、試料 12からの蛍光信号を集束させるレンズ系 26aと、ダイ クロイツクミラー 26b , 26bと、バンドパスフィルタ 26c〜26cと、光電子倍増管等の
1 2 1 3
光電変換器 27a〜27cと、を有する。
レンズ系 26aは、受光部 26に入射した蛍光を光電変 27a〜27cの受光面に集 束させるように構成されている。ダイクロイツクミラー 26b , 26bは、所定の範囲の波
1 2
長帯域の蛍光を反射させて、それ以外は透過させるミラーである。バンドパスフィルタ 26c〜26cでフィルタリングして光電変 27a〜27cで所定の波長帯域の蛍光を
1 3
取り込むように、ダイクロイツクミラー 26b , 26bの反射波長帯域および透過波長帯
1 2
域が設定されている。
[0037] バンドパスフィルタ 26c〜26cは、各光電変^^ 27a〜27cの受光面の前面に設
1 3
けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波 長帯域は、図 2に示す蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されており 、例えば B光源から出射した波長え のレーザ光の照射によって発する波長え を中
11 13 心とする一定の波長幅の帯域である。この場合、図 3に示すように G光源から出射し た波長え のレーザ光の照射によって発する波長え を中心とする蛍光は波長え
21 22 13 の近傍に中心波長を持っため、波長え 13を中心とする蛍光とともにバンドパスフィル タを透過する。しかし、波長え 21を中心波長とする蛍光と波長え 13を中心波長とする 蛍光とは、後述する符号ィ匕系列信号 (図 7中のコード 1〜3)で変調された信号情報を 持った蛍光として光電変 27a〜27Cで受信される。すなわち、受光されて生成さ れる蛍光信号力 後述する信号処理を行うことにより、どのレーザ光により発した蛍光 の信号であるかを識別することができる。
[0038] 光電変換器 27a〜27cは、例えば光電子倍増管を備えたセンサを備え、光電面で 受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は信号情報 を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は信号情報を持った蛍 光信号となる。この蛍光信号は、アンプで増幅されて、制御'処理部 28に供給される
[0039] 制御 ·処理部 28は、図 5に示すように、信号生成部 40と、信号処理部 42と、コント口 ーラ 44と、を有して構成される。信号生成部 40及びコントローラ 44は、所定の周波数 の変調信号を生成する光源制御部を形成する。信号生成部 40は、レーザ光の強度 を所定の周波数で変調 (振幅変調)するための変調信号を生成する部分である。具 体的には、信号生成部 40は、発振器 46、パワースプリッタ 48及びアンプ 50, 52を 有する。信号生成部 40は、生成される変調信号を、レーザ光源部 22のパワースプリ ッタ 35に供給するとともに、信号処理部 42に供給する部分である。信号処理部 42に 変調信号を供給するのは、後述するように、光電変換機 27a〜27cから出力される蛍 光信号を検波するための参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定 の周波数の正弦波信号であり、 10〜： LOOMHzの範囲の周波数に設定される。
[0040] 信号処理部 42は、光電変換器 27a〜27cから出力される蛍光信号を用いて、レー ザ光の照射によりマイクロビーズが発する蛍光の位相遅れに関する情報を抽出する 部分である。信号処理部 42は、光電変換器 27a〜27cから出力される蛍光信号を増 幅するアンプ 54a〜54cと、増幅された蛍光信号のそれぞれを信号生成部 40から供 給された正弦波信号である変調信号を分配するパワースプリッタ 56と、この変調信号 を参照信号として増幅された蛍光信号と合成する IQミキサ 58a〜58cと、を有して構 成される。
[0041] IQミキサ 58a〜58cは、光電変換器 27a〜27cから供給される蛍光信号を、信号生 成部 40から供給される変調信号を参照信号として、この参照信号と合成する装置で ある。具体的には、 IQミキサ 58a〜58cのそれぞれは、図 6に示すように、参照信号 を蛍光信号 (RF信号)と乗算して、蛍光信号の cos成分と高周波成分を含む処理信 号を算出するとともに、参照信号の位相を 90度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算し て、蛍光信号の sin成分と高周波成分を含む処理信号を算出する。この cos成分を含 む処理信号及び sin成分を含む処理信号は、コントローラ 44に供給される。
コントローラ 44は、信号生成部 40に所定の周波数の正弦波信号を生成させるよう に制御するとともに、レーザ光源部 22のレーザドライバ 34r, 34g, 34bを、符号化系 列信号を用いてレーザ光の出射のオン Zオフを制御し、さらに、信号処理部 42にて 求められた蛍光信号の cos成分及び sin成分を含む処理信号から、高周波成分を取 り除いて蛍光信号の cos成分及び sin成分を求める部分である。
[0042] 具体的には、コントローラ 44は、システム制御器 60、ローパスフィルタ 62、アンプ 6 4及び AZD変翻 66を有する。
システム制御器 60は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサ イトメータ 10の全動作を管理する。ローパスフィルタ 62は、信号処理部 42で演算さ れた cos成分、 sin成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り 除く。アンプ 64は、高周波成分の取り除かれた cos成分、 sin成分の処理信号を増幅 する。 AZD変翻66は、増幅された処理信号をサンプリングする。より具体的には 、システム制御器 60は、レーザ光の強度変調のために、発振器 46の発振周波数を 定める。さらに、システム制御器 60は、レーザドライノく 34r, 34g, 34bにレーザ光の 出射のオン Zオフを制御するパルス制御信号を生成する。このパルス制御信号は、 互いに直交する複数の符号化系列信号の中から選択された 1つの符号化系列信号 によって作られたものである。この符号ィ匕系列信号は、 1ビットの信号値で構成され、 所定の符号長さのビット数で符号化されて ヽる。
以下、符号化系列信号について説明する。
[0043] コントローラ 44は、系列符号 C={a , a , a , , a } (Νは自然数で符号長
0 1 2 N-1
さを表す)を用いて基準となる符号ィ匕系列信号を生成するとともに、さらにこの系列符 号 Cを qlビット、高ビット方向にビットシフトさせた系列符号 T -c(T は、高ビット方
ql ql
向に qlビット、ビットシフトする作用素である）を用いて符号化系列信号を生成する。 ここで、系列符号 T 'Cは、 {a , a , a , , a }である。さらに、系列
ql ql ql + 1 ql + 2 ql + N— 1
符号 Cを q2ビット（例えば、 q2 = 2 Xql)、高ビット方向にビットシフトさせた系列符号 T 'Cを用いて符号化系列信号を生成する。
q2
この符号ィ匕系列信号を生成するために用いられる系列符号 C, T -C, T 'Cは、
ql q2 互いに直交する特性を有するので、生成される符号化系列信号も互いに直交する。
[0044] 系列符号 Cの一例として、下記に示すように、例えば係数 hと (j = 1〜8の整数)初 期値 a (kは 0〜7の整数）とを用いて符号化される PN系列（Pseudrandom Noise系列) k
が挙げられる。この PN系列は、例えば下記式（1)により定義することができる。式（1) では次数を 8次としている。ここで、 Nは上記系列符号の符号長さであり、例えば N = 255 ( = 28— 1)ビットとされる。
[0045] [数 1]
Figure imgf000020_0001
a。=0, a O, =0， =0， =0， =0， =0, ¾ ~1 ·· · )
8
a8+i -∑ hja8-j+i (ί=0,1，2,···) (mod2) [0046] 系列符号 Cが PN系列符号である場合、符号長さが Nの巡回符号となるので、 a = a , a =a , となる。また、系列符号 Cと同じ符号長さ Nの別の系列符号を C'
0 N+1 1
= {b , b , b , ,b }とし、上記作用素 Tを系列符号 C'作用させた系列符号
0 1 2 N-1} q
T - C' = {b , b , b , ,b }として、系列符号 cと c'との間の相互相関関 q q q+1 q+2 q+N-1}
数 R ,(q)を下記式（2)のように定義する。ここで、 Nは系列符号における項 aと項 b cc A l q+i の（iは 0以上 N— 1以下の整数）一致する数であり、 Nは系列符号における項 aと項 b
D i の不一致の数である。また、 Nと Nの和は符号長さ Nとなる（N +N =N)。ここで q+i A D A D
、 iと q+iは mod (N)で考える。
[0047] [数 2]
,、 A-ND ( λ
R- (q) = ' · ' (2)
[0048] 上記 PN系列において 2つの系列符号を項毎に mod (2)で加算した結果はもとの P
N系列を巡回シフトした PN系列になる性質があり、 PN系列の値が 0となる個数は値 力 となる個数より 1つだけ少ないので、 N -N = 1となる。これより、 PN系列にお
A D
V、て下記式（3)および (4)に示す値を示す。
[0049] [数 3]
Rcc' (q) = 1 { q = 0 (modN) } · · · (3)
画
Rcc' (q) = -— { q + 0 (modN) } ' ' · (4) [0050] 上記式（3)よりビットシフト量が 0、すなわち q = 0の場合、式（3)に示すように R , (q
)の値は 1となり、自己相関性を有する。一方、ビットシフト量が 0でない、すなわち q> 0の場合、式 (4)に示すように R (q)は一（1ZN)となる。ここで符号長さ Nを大きく することにより、 R (q) (q >0)の値は 0に近づく。すなわち、系列符号 Cと C，は自己 相関性を持ち、かつ直交性を有するといえる。
[0051] このような自己相関性および直交性を有する系列符号を用いて、値が 0と値が 1の 2 値力 なる符号ィ匕系列信号を生成する。
図 7 (a)は、生成される符号ィ匕系列信号の一例を示している。コード 1の符号ィ匕系列 信号は、符号長さ N = 255ビットの信号であり、符号長さ Nと時間分解幅 A tとの積は 、図 7 (a)中の時刻 0〜tの時間となる。この信号において値が 1のときレーザ光を出
3 射し、値力^のときレーザ光を出射しないようにして断続的にレーザ光源の出射のォ ン zオフが制御される。
[0052] ここで、コード 2の符号ィ匕系列信号の時刻 0における信号は、コード 1の時刻 にお ける信号に対応しており、コード 2の時刻 0以降の信号が、コード 1の時刻 t以降の信 号に対応して生成されている。同様に、コード 3の符号ィ匕系列信号の時刻 0における 信号は、コード 1の時刻 t (例えば、 t = 2 X t )における信号に対応しており、コード 3
2 2 1
の時刻 0以降の信号が、コード 1の時刻 t以降の信号に対応して生成されている。
2
光源制御部 28aは、これらの信号を巡回的に繰り返し生成し、コード 1はレーザドラ ィバ 34rに、コード 2はレーザドライバ 34gに、コード 3はレーザドライバ 34bにパルス 制御信号として供給されるように構成されて ヽる。
[0053] なお、本発明における符号化系列信号は上記 PN系列の系列符号を用いて生成さ れるが、本発明における自己相関性および直交性を有する符号ィヒ系列信号の生成 は、上記方法に限定されず、自己相関性および直交性を有する符号化系列信号を 生成する限りにお!、てどのような方法を用いてもょ 、。
[0054] 図 7 (b)は、符号ィヒ系列信号によるパルス変調と、レーザ光の周波数による強度変 調との関係を示している。パルス変調によりレーザ光がオン状態の場合、レーザ光は 少なくともオン状態の時間に比べて短 、周期で強度が振動するように変調されて 、 る。
[0055] コントローラ 44のシステム制御器 60は、図 7 (a)に示すような系列符号を用いて符 号化系列信号を生成し、各レーザドライバ 34r, 34g, 34bにレーザ光の出射のオン Zオフを制御するパルス制御信号として供給する。
[0056] なお、コントローラ 44の AZD変 66におけるサンプリングは、後述するように符 号化系列信号と蛍光信号との相関関数を効率良く演算するために、サンプリングの 時間分解幅 (サンプリング間隔)を、符号ィ匕系列信号の時間分解幅に揃えられるのが 好ましい。例えば符号化系列信号の時間分解幅が 0. 5マイクロ秒であれば蛍光信 号のサンプリングの時間分解幅も 0. 5マイクロ秒あるいはその整数分の 1とするのが 好ましい。
[0057] 分析装置 80は、蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求め、さらに、この位相 遅れ角度力も蛍光緩和時定数（=蛍光緩和時間）を求めるとともに、受光部 26から 出力された蛍光信号は、どのレーザ光の照射によるもの力を特定する装置である。分 析装置 80は、コンピュータにより構成され、本発明における蛍光緩和時間（=蛍光緩 和時定数)を算出する処理部を形成する。
[0058] 蛍光信号の cos成分及び sin成分を含む処理信号は、符号化系列信号の情報を含 んでいるので、分析装置 80では、この処理信号に対して、まず、符号化系列信号の 自己相関性及び直交性を用いて、符号ィ匕識別変換を行い、各レーザ光毎の蛍光信 号の cos成分及び sin成分の値を抽出する。この cos成分及び sin成分の値を用いて 蛍光のレーザ光に対する位相遅れ角度を求める。この位相遅れ角度から蛍光緩和 時定数 (蛍光緩和時間）を求め、蛍光色素を識別することにより、試料 12の種類を特 定する。さらに、上記符号化識別変換において用いられた符号化系列信号を知るこ とにより、蛍光信号がどのレーザ光の照射によるものかを、特定する。
[0059] なお、求められた位相ずれ角度は、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数に 依存しており、例えば 1次緩和過程で表した場合、 cos成分及び sin成分は、下記式（ 5) , (6)で表される。
[0060] [数 5]
1
cos ( Θ ) = - …（5)
β + ( ω τ ) 2
[数 6] sin ( θ ) = ― …（6)
ϊ + ( ω τ ) 2
ここで、 0は位相ずれ角度であり、 ωはレーザ光の変調周波数であり、 τは蛍光緩 和時定数である。蛍光緩和時定数 τは、図 8に示すように初期蛍光強度を Iとすると
0
、この時点力も蛍光強度力 Ze (eは自然対数の底、 e = 2. 71828)となる時点まで
0
の時間をいう。
[0061] 蛍光信号の cos成分及び sin成分の比 tan ( Θ )から位相ずれ角度 0を求め、この位 相ずれ角度 Θを用いて、上記式（5)、（6)から、蛍光緩和時定数 τを求めることがで きる。この蛍光緩和時定数ては、上述したように、蛍光色素の種類によって変わるも のであり、また、 2種類の蛍光色素の比率を変えて混合すると、比率に応じてみかけ の蛍光緩和時定数 τも変わる。このため、蛍光緩和時定数 τを求めることで、 2つの 蛍光色素の比率を特定することができる。
このように、蛍光検出用マイクロビーズに、強度変調したレーザ光を照射し、そのと き発する蛍光を検出することにより、発する蛍光の種類を識別することができ、これに よりマイクロビーズ等の試料 12の種類を特定することができる。
[0062] 試料 12中の蛍光色素力も発する蛍光の信号は、システム制御器 60で生成された 既知の符号ィ匕系列信号に従って変調された（出射を制御した)レーザ光による蛍光 信号である。このため、この蛍光信号もシステム制御器 60で生成された符号ィ匕系列 信号に従って光強度が変調した信号となっている。したがって、システム制御器 60で 生成された入力信号であるコード (符号化系列信号)と応答信号である蛍光信号とを 同期させて相関関数を調べることにより、蛍光信号がどのコードによって変調された レーザ光による蛍光信号を含んでいるかを知ることができる。すなわち、システム制御 器 60で生成されたコードと蛍光信号との相関関数を演算し、蛍光信号と高い相関値 を持つコードがある場合、蛍光信号は、このコード (符号ィ匕系列信号）によって変調さ れたレーザ光による蛍光信号として含んでいるといえる。一方、相関が極めて低いか 、無相関を示すコードは、このコードによって変調されたレーザ光による蛍光信号とし て含んでいないといえる。したがって、レーザ光源毎に異なるコードで変調したレー ザ光を出射させることで、受光した蛍光がどのレーザ光により発したものであるかを知 ることがでさる。
分析装置 80は、入力信号であるコードと応答信号である蛍光信号との相関関数を 、巡回するコードの周期にしたがって繰り返し平均化処理することにより、安定した値 として求める。求めた値によって、受光した蛍光がどのレーザ光により蛍光したもので あるかを特定する。また、各光電変換器 27a〜27cが受光する光の波長帯域もわか つているので、蛍光の種類も特定することができる。
こうして、蛍光信号から、試料 12中の蛍光色素がどのレーザ光の照射によりどの波 長帯域で放射した蛍光の信号を含んで ヽるかを識別し、特定することができる。
[0063] 分析装置 80は、上述したように、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数と、蛍 光信号がどのレーザ光によるものかの情報とを用いて、マイクロビーズ等の試料 12に 設けられた蛍光色素を特定して、管路 30を通過する試料 12の種類等を特定すること ができる。マイクロビーズの場合、マイクロビーズの蛍光色素に対応させて、例えば、 所定の DNA断片を設けているので、蛍光色素を特定することで、マイクロビーズの D NA断片の種類を知ることができる。これにより、マイクロビーズの蛍光とともに被検体 の DNA断片に設けられた蛍光を同時に計測した場合、マイクロビーズの特定の DN A断片に被検体の DNA断片が作用して生体結合したものと判断する。このようにし て、被検体の DNA断片がどのマイクロビーズに結合するかを分析することができる。 こうして、分析装置 80は試料 12中の生体物質の種類のヒストグラムや各種特性を 短時間に求める。
フローサイトメータ 10は以上のように構成される。
このようなフローサイトメータ 10の信号処理装置 20は、まず、コントローラ 44からの 指示により、所定の周波数の信号を発振器 46に発生させ、この信号がアンプ 50によ り増幅されて、レーザ光源部 22及び信号処理部 42に供給される。この状態で、試料 12が管路 30を流れ、フローが形成される。フローは、例えば 100 /z mの流路径に 1 〜10mZ秒の流速を有する。また、試料 12としてマイクロビーズを用いる場合、マイ クロビーズの球径は数 μ m〜30 μ mである。
レーザ光による照射が測定点に成されると、受光部 24で試料 12の通過を検出する 検出信号がコントローラ 44にトリガ信号として出力される。
コントローラ 44では、この検出信号をトリガ信号とし、このトリガ信号に同期して、自 己相関性を有し、かつ他の符号ィ匕系列信号と直交性を有する符号ィ匕系列信号を生 成する。この符号ィ匕系列信号は巡回的に繰り返し生成される。この符号化系列信号 は、レーザ光源部 22からのレーザ光の出射のオン Zオフを制御するパルス制御信 号として用いるために、レーザドライノく 34r, 34g, 34bに供給される。
レーザ光源部 22では、このパルス制御信号に従って各レーザ光の出射のオン Zォ フが制御され、符号ィヒ系列信号によってパルス変調した信号情報を備えるレーザ光 が生成される。このレーザ光は測定点を通過する試料 12中の蛍光色素を励起させる ために用いられ、このレーザ光の照射により蛍光色素が蛍光を発する。ここで発する 蛍光は、受光部 26にて受光される。出射がオン状態のレーザ光は、所定の周波数で 強度が変調している。
このようなレーザ光で照射されて発する蛍光色素からの蛍光は、位相遅れ角度を 持って所定の周波数で強度変調するとともに、レーザ光のオン Zオフに応じて、レー ザ光に励起して発する蛍光もオン Zオフの信号となっている。
[0065] このようにして、受光部 24による試料 12の通過の検出力も変調されたレーザ光を 照射するまでの時間は極めて短ぐ試料 12が測定点を通過する数 〜数 秒の 間に、所定の周波数で振幅変調しつつ、巡回的に繰り返す符号化系列信号によつ てオン Zオフが制御されたレーザ光が試料 12に照射される。
ここで、レーザ光の変調周波数は、例えば 10〜： LOOMHzである。また、符号化系 列信号は、約 1 μ秒の時間分解幅、例えば 1 μ秒の時間分解幅で生成される場合、 符号長さ Νが 7ビットの符号ィ匕変調信号とすると、 7 秒 (= 1. 0 X 7)を 1周期として符 号化系列信号が繰り返し巡回して生成される。この繰り返し生成される符号化系列信 号に基づいてレーザ光が変調される。したがって、試料 12が測定点を通過する数 〜数 秒の間に、レーザ光は、 7 秒を 1周期とする符号ィ匕系列信号が数回〜数 10回巡回される。
[0066] 受光部 26の光電変 27a〜27cで受光されて出力される蛍光信号は、アンプ 5 4a〜54cで増幅され、 IQミキサ 58a〜58cにより、信号生成部 40から供給された正 弦波信号である変調信号と合成される。
IQミキサ 58a〜58cでは、正弦波信号である変調信号 (参照信号)と蛍光信号を乗 算した合成信号が生成されるとともに、正弦波信号である変調信号 (参照信号）に対 して位相を 90度シフトさせた信号と蛍光信号を乗算して合成した信号が生成される。 次に、生成された 2つの合成信号は、コントローラ 44のローパスフィルタ 62に送られ 、高周波成分が除去されて、蛍光信号の cos成分及び sin成分の信号が取り出される 。この蛍光信号の cos成分及び sin成分の信号は増幅され、 AZD変換され、分析装 置 80に送られる。 AZD変換は、受光部 24からのトリガ信号のタイミングで同期が取 られ、符号化系列信号の時間分解幅 A tと同じ時間分解幅で、蛍光信号のサンプリ ングが行われる。サンプリングは例えば 16ビットのサンプリング（0〜士 32767の階調 のサンプリング)である。なお、蛍光信号は、符号ィ匕系列信号によってパルス変調さ れたレーザ光によって発するものであるため、この蛍光信号力 得られるサンプリング されたデータは、符号ィ匕系列信号の情報が含まれて！/、る。
[0067] 例えば、 i番目（i = 1〜3の自然数)のレーザ光源部 22から出射される時間変調した レーザ光の強度振幅 A (t)を下記式（7)のように定め（p (t)は PN符号ィ匕変調信号に よる時間変調成分、 ωは変調周波数)、 IQミキサ 58a〜58cに供給される参照信号（ 変調信号) A (t)を下記式（8)で定める。このとき、 IQミキサ 58a〜58cで用いられる
0
、正弦波信号である変調信号 (参照信号）に対して位相を 90度シフトさせた信号 A
90
(t)は下記式（9)のように定まる。一方、蛍光信号の振幅を下記式（10)で定めると、 I Qミキサ 58a〜58cで合成されて得られる合成信号は下記式（1 1)のように表される。 この 2つの合成信号のうち高次成分はローパスフィルタ 62を用いて除去され、この後 、 AZD変換されデジタル信号が生成される。
[0068] [数 7]
A； (ΐ) = ρ; (ΐ) · cos ( ω t )
(7)
( i - 1 , 2 , 3 ) *
[数 8]
A 0 (t) = cos ( ω t ) … (8)
[数 9]
Ago (t) = -sin ( ω t ) …（9)
[数 10]
A (t) =∑ P i (ΐ) · n · cos ( ω t + 0 i )
(10)
i=1 ( r;は蛍光の強度振幅）
[数 11]
― ∑ P i (t) · r; · cos θ ι + (高次成分）
乙 i=l
合成信号 = (I D
∑ i W ' ' sin + (高次成分）
乙
レーザ光の時間変調に用いた符号化系列信号は自己相関性を有し、他の符号化 系列信号に対して直交性を有するので、符号ィ匕系列信号と AZD変換されたデジタ ル信号との間の相関関数を算出することで、レーザ光毎に上記デジタル信号を分解 する符号化識別変換が行われる。すなわち、符号ィ匕識別変換により、式（11)におけ る 1/2 'r ' cos ( 0 )及び 1/2 'r ' sin ( Θ )が得られる。ここで 0 .は、 i番目のレーザ 光源部 22から出射されるレーザ光により発する蛍光の、レーザ光に対する位相遅れ 角度を表す。したがって、 1/2 'r ' cos ( Θ )及び 1/2 'r ' sin ( Θ )の値を用いて tan( Θ )を求めることができる。この tan( 0 )の値と上述した式（1)及び（2)とを用いて、蛍 光緩和時定数てが求められる。
[0070] この蛍光緩和時定数ては、蛍光色素によって異なるので、マイクロビーズ等の試料 12の種類が異なる (試料 12に付着している生体物質の種類が異なる)ものには異な る種類の蛍光色素を用いることで、蛍光色素の種類を特定することができる。これに より、試料 12の種類を特定することができる。したがって、試料 12の発する蛍光から、 試料 12の種類を特定する。これとともに、所定の蛍光色素を設けた生体物質の発す る蛍光を検出する場合、生体物質がどの種類の試料 12に設けられた構造体に生体 結合するかを特定することができ、この結果を用いて分析することができる。
特に、異なる 2種類の蛍光色素を異なる比率で混合すると、この比率に応じてみか けの蛍光緩和時定数 τも変化する。このため、混合する比率を変えることで極めて多 数の蛍光緩和時定数を設定することができる。したがって、マイクロビーズの種類毎 に異なる蛍光緩和時定数を有する蛍光色素を用いることで、発する蛍光が識別可能 なマイクロビーズの種類を多数設定することができる。
[0071] さらに、上述した符号ィ匕識別変換を行う際に、自己相関性を有する符号化系列信 号を知ることができるので、蛍光信号がどのレーザ光によるものかを特定することがで きる。従来、レーザ光を変調して信号情報を蛍光の中に含ませることをしないので、ど のレーザ光の励起による蛍光であるかを特定することはできない。
本発明では、同一の波長で放射する蛍光であっても、励起に用いるレーザ光の符 号化系列信号を変えることで、異なる蛍光信号として受光することができる。このため 、直交性を有する符号化系列信号を多数用いることで、蛍光色素の励起に用いられ る多数のレーザ光を短時間のうちに特定することができる。したがって、蛍光の波長 帯域が近接する多数の蛍光色素であっても、たとえ多数のレーザ光を合成して一度 に照射しても、照射するレーザ光の信号情報が蛍光に含まれている。この信号情報 が受光信号の中で識別できる限りにおいて、試料に付着した蛍光色素を特定するこ とがでさる。
[0072] このように本発明では、蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時定数を算出すること で、識別可能な蛍光色素の種類を増大させることができる。特に、蛍光緩和時定数 が異なる 2種類の蛍光色素を予め定めて混合する比率を定めて用いることにより、 2 種類の蛍光緩和時定数の 、ずれとも異なる蛍光緩和時定数を有するようにすること ができ、識別可能な蛍光色素が極めて多数に増大する。 2種類の蛍光色素の例とし て、 1つの種類は、 Cascade Blue.Cascade Yellow, Alexa Fluor405, DAPI, Dapoxyl, Dialkylaminocoumarin, Hydr oxycoumarin , Marine Blue, Pacific Blue, PyMPOの中力 ら選択される蛍光色素であり、他の種類は、 Q- Dot (Quantum Dot社製商品名）、 Evic -Tag (Evident Technology社製商品名）の中力も選ばれる半導体量子蛍光色素であ ることが好ましい。前者の蛍光色素は、後者の蛍光色素に比べて蛍光緩和時定数が 短い。この 2種類の蛍光色素の混合する比率を変えることで、蛍光緩和時定数を大き く変化させることができる。例えば、 Q-Dotは、 20〜40ナノ秒の蛍光緩和時定数を有 する。
[0073] 以上が、本発明の蛍光検出装置の第 1の態様の説明である。
次に、本発明の蛍光検出装置の第 2の態様について説明する。
[0074] 図 9は、本発明の強度変調したレーザ光による蛍光強度検出装置を用いたフロー サイトメータ 110の概略構成図である。
[0075] フローサイトメータ 110は、マイクロビーズや特定の細胞等の受容体サンプル（以降 、サンプルという）に蛍光色素が化学的結合又は物理的結合により付着して標識され た標識サンプル 112にレーザ光を照射し、この標識サンプル 112から発する蛍光の 蛍光信号を検出して信号処理する信号処理装置 120と、信号処理装置 120で得ら れた処理結果力 標識サンプル 112の分析を行なう分析装置 (コンピュータ） 180と を有する。前記サンプルは、レーザ光の照射に対して自家蛍光するようになっている
[0076] 信号処理装置 120は、レーザ光源部 122と、受光部 124, 126と、レーザ光源部 1 22からのレーザ光を所定の周波数で強度変調させる制御部及び標識サンプル 112 からの蛍光信号を処理する処理部を有する制御'処理部 128と、高速流を形成する シース液とともに標識サンプル 112を流してフローセルを形成する管路 130と、を有 する。
管路 130の出口には、回収容器 132が設けられている。フローサイトメータ 110に は、レーザ光の照射により短時間内に標識サンプル 112中の特定の細胞等の生体 物質を分離するためのセル'ソータを配置して別々の回収容器に分離するように構 成することちでさる。
[0077] レーザ光源部 122は、 350nm〜800nmの可視光帯域の連続波のレーザ光、例え ば波長 405nmのレーザ光を所定の周波数で強度変調して出射する部分である。レ 一ザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられ、例えば 5〜： LOOmW 程度の出力でレーザ光が出射される。一方、レーザ光の強度を変調する周波数 (変 調周波数)は、その周期が蛍光緩和時間 (蛍光緩和時定数）に比べてやや長い、例 えば 10〜 1 OOMHzである。
なお、本発明においては、 1つのレーザ光の他に、上述した第 1の態様のように、波 長の異なる 3つのレーザ光、例えばえ =405nm
1 、 λ = 533nmおよびえ =650nm
2 3 等のレーザ光を同時に出射させるように構成してもよい。この場合、上述した第 1の態 様のように、ダイクロックミラーを用いて、 3つのレーザ光を 1つの光束にまとめて照射 する構成にするとよい。また、レーザ光の照射により蛍光が R, G, Bのうちどのレーザ 光に反応したものであるか否かを識別することができるように、上述した第 1の態様の ように、各レーザ光に互いに直交する符号ィヒ系列の信号情報を含ませる構成にする ことちでさる。
[0078] レーザ光源部 122は、レーザ光が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を 発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光によって発する蛍光は 、測定しょうとする標識サンプル 112の自ら発する蛍光（自家蛍光)及び標識サンプ ル 112の蛍光色素の発する蛍光であり、標識サンプル 112は管路 130を通過する際 、測定点でレーザ光の照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
[0079] 受光部 124は、管路 130を挟んでレーザ光源部 122と対向するように配置されてい る。受光部 124は、測定点を通過する標識サンプル 112によって前方散乱したレー ザ光を受光することにより、標識サンプル 112が測定点を通過する旨の検出信号を 出力する光電変換器を備える。この受光部 124から出力される信号は、制御'処理部 128に供給され、制御 ·処理部 128にお 、て標識サンプル 112が管路 130中の測定 点を通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
[0080] 一方、受光部 126は、レーザ光源部 122から出射されるレーザ光の出射方向に対 して直交方向であって、かつ管路 130中の標識サンプル 12の移動方向に対して直 交方向に配置されている。受光分 126は、測定点にて照射された標識サンプル 112 が発する蛍光を受光するフォトマルチプライヤ (光電子倍増管)ゃァバランシュフォト ダイオード等の光電変換器を備える。
図 10は、受光部 126の一例の概略の構成を示す概略構成図である。
[0081] 図 10に示す受光部 126は、標識サンプル 112からの蛍光を集束させるレンズ系 12 6aと、ダイク Pイツクミラー 126b , 126bと、ノ ンドソ スフイノレ夕 126c〜126cと、光
1 2 1 3 電子倍増管ゃァバランシュフォトダイオード等の光電変換器 127a〜127cと、を有す る。
レンズ系 126aは、受光部 126に入射した蛍光を光電変^ 27a〜 127cの受光 面に集束させるように構成されている。
[0082] なお、受光部 126は、第 1の態様における受光部 26と同じ構成を有し、同じ作用を するので、その説明は省略する。
[0083] 制御，処理部 128は、図 11に示すように、信号生成部 140と、信号処理部 142と、 コントローラ 144と、を有して構成される。信号生成部 140及びコントローラ 144は、所 定の周波数の変調信号を生成する光源制御部を形成する。
信号生成部 140は、レーザ光の強度を所定の周波数で変調 (振幅変調)するため の変調信号を生成する部分である。
具体的には、信号生成部 140は、発振器 146、パワースプリッタ 148及びアンプ 15 0, 152を有し、生成される変調信号を、レーザ光源部 122に供給するとともに、信号 処理部 142に供給する部分である。信号処理部 142に変調信号を供給するのは、後 述するように、光電変換機 127a〜127cから出力される蛍光信号の位相差検出のた めの参照信号として用いるためである。なお、変調信号は、所定の周波数の正弦波 信号であり、 10〜： LOOMHzの範囲の周波数に設定される。
[0084] 信号処理部 142は、上述した第 1の態様における信号処理部 42と同様の構成を有 し、同じ作用をするので、その説明は省略する。なお、図 11に示す位相差検出器 15 6は、図 5に示す、パワースプリッタ 56及び IQミキサ 58a〜58cと同様のパワースプリ ッタ及び IQミキサによって構成されるものである。
[0085] 位相差検出器 156に設けられる図示されない IQミキサは、光電変翻 127a〜12 7cから供給される蛍光信号を、信号生成部 140から供給される変調信号を参照信号
Figure imgf000032_0001
は、 IQミキサのそれぞれは、参照信号を蛍光信号 (RF信号)と乗算して、蛍光信号 の cos成分 (実数部）と高周波成分を含む処理信号を算出するとともに、参照信号の 位相を 90度シフトさせた信号を蛍光信号と乗算して、蛍光信号の sin成分 (虚数部） と高周波成分を含む処理信号を算出する。この cos成分を含む処理信号及び sin成 分を含む処理信号は、コントローラ 144に供給される。
[0086] コントローラ 144は、上述した第 1の態様におけるコントローラ 44と同様に、信号生 成部 40に所定の周波数の正弦波信号を生成させるように制御するとともに、信号処 理部 42にて求められた蛍光信号の cos成分及び sin成分を含む処理信号から、高周 波成分を取り除いて蛍光信号の cos成分及び sin成分を求める部分である。コント口 ーラ 144は、各レーザ光に対してノ ルス変調するための符号ィ匕系列信号を生成しな い点でコントローラ 44と異なる。
[0087] コントローラ 144は、各部分の動作制御のための指示を与えるとともに、フローサイト メータ 110の全動作を管理するシステム制御器 160と、信号処理部 142で演算され た cos成分、 sin成分に高周波成分が加算された処理信号から高周波成分を取り除く ローパスフィルタ 162と、高周波成分の取り除かれた cos成分、 sin成分の処理信号を 増幅するアンプ 164と、増幅された処理信号をサンプリングする AZD変 l66と 、を有する。 AZD変換器 166では、高周波成分の取り除かれた cos成分、 sin成分 の処理信号がサンプリングされて、分析装置 180に供給される。
[0088] 分析装置 180は、蛍光信号の cos成分 (実数部）、 sin成分 (虚数部）の処理信号値 をベクトル成分とするベクトルとし、予め定められた補正変換行列から作成される逆行 列に対して、ベ外ルを作用して、蛍光強度を算出する装置である。
[0089] 図 12は、分析装置 180の概略構成図である。
分析装置 180は、コンピュータ上で所定のプログラムを起動させることにより構成さ れる装置であり、 CPU182、メモリ 184、入出力ポート 186の他に、ソフトウェアを起動 することによって形成される第 1キャリブレーションユニット 188、第 2キヤリブレーショ ンユニット 190及び強度算出ユニット 192を有する。また、分析装置 180にはディスプ レイ 194が接続されている。
[0090] 分析装置 180の行う処理は、図 13〜 15に示すフローに沿った処理である。強度算 出ユニット 192は、図 13に示す処理フローの主要部分 (ステップ S30〜S50)を実行 し、第 1キャリブレーションユニット 188は図 14に示す処理フローの主要部分 (ステツ プ S 120〜S 150)を実行し、第 2キャリブレーションユニット 190は図 15に示す処理フ ローの主要部分 (ステップ S220〜S270)を実行する。
[0091] CPU182は、コンピュータに設けられた演算プロセサであり、第 1キャリブレーション ユニット 188、第 2キャリブレーションユニット 190及び強度算出ユニット 192の各種計 算を実質的に実行する。メモリ 184は、コンピュータ上で実行することにより、第 1キヤ リブレーシヨンユニット 188、第 2キャリブレーションユニット 190及び強度算出ユニット 192を形成するプログラムを格納した ROMと、第 1キャリブレーションユニット 188、第 2キャリブレーションユニット 190及び強度算出ユニット 192により算出された処理結 果ゃ入出力ポート 186から供給されたデータを記憶する RAMと、を備えている。 入出力ポート 186は、コントローラ 144から供給される蛍光信号の cos成分 (実数部 )、 sin成分 (虚数部）の検出値の入力を受け入れるとともに、第 1キャリブレーションュ ニット 188、第 2キャリブレーションユニット 190及び強度算出ユニット 192で作成され た処理結果の値ゃスキヤッタグラム等の情報をディスプレイ 194に出力するために用 いられる。
ディスプレイ 194は、第 1キャリブレーションユニット 188、第 2キャリブレーションュニ ット 190及び強度算出ユニット 192で求められた蛍光緩和時定数やゲイン定数等の 処理結果の値ゃスキヤッタグラム等のグラフを表示する。 [0092] 強度算出ユニット 192は、図 13に示す処理フローの主要部分を実行する部分であ り、コントローラ 144から供給された cos成分及び sin成分の検出値から各蛍光強度を 求める。すなわち、強度算出ユニット 192は、レーザ光を照射した標識サンプルの蛍 光がいずれも 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータ (ゲイン 定数、蛍光緩和時定数)を用いて補正変換行列の行列要素を設定して補正変換行 列の行列要素を求めることにより、補正変換行列を作成する。次に、コントローラ 144 から供給された各検出センサから収集された cos成分及び sin成分の検出値 (位相情 報を含む検出値)の組をベクトルとし、このベクトルに先に作成された補正変換行列 力 作成された逆行列を作用させて標識サンプルが発する蛍光の蛍光強度を算出 する。強度算出ユニット 192の処理の詳細については、後述する。
なお、標識サンプル 112は、異なる種類の蛍光色素が細胞やマイクロビーズ等のサ ンプルへ付着することにより、標識された標識サンプルであるが、このときの標識サン プルの種類を n種類とし、光電検出器の個数を m個としたとき、 2 'm≥n+ lを満足す るように m、 nが設定されている。
[0093] 第 1キャリブレーションユニット 188は、蛍光色素が付着しておらずマイクロビーズ等 の自家蛍光を発するサンプル力もなるものを無標識サンプルというとき、この無標識 サンプルが発する自家蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時 定数及びゲイン定数を求める部分である。具体的には、第 1キャリブレーションュ-ッ ト 188は、無標識サンプルを測定対象物として所定の周波数で時間変調したレーザ 光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各光電変 力 収集し、これら の検出値から前記無標識サンプルの発する自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン 定数を算出し、メモリ 184に記憶する。詳細の説明は後述する。
[0094] 第 2キャリブレーションユニット 190は、蛍光色素を有する標識サンプルの種類すベ てについて、それぞれ別々に、蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出する 部分である。この場合においても、蛍光色素が発する蛍光は 1次遅れ系の緩和応答 であるとする。
すなわち、第 2キャリブレーションユニット 190は、 1種類の蛍光色素のみを用いて 標識された標識サンプル（ 1種類の蛍光色素が付着した自家蛍光を発するマイクロビ ーズ等のサンプル)を準備し、この標識サンプルを測定対象物として、所定の周波数 で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出セ ンサ力 収集し、これらの検出値から、選択した標識サンプルの蛍光色素が発する蛍 光の蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出する。そして、標識サンプル中の蛍光色 素の種類を順次変えながら、標識サンプルの蛍光色素が発するすべての蛍光の緩 和時定数及びゲイン定数を算出し、算出した緩和時定数及びゲイン定数をメモリ 18 4に記憶する。詳細の説明は後述する。
[0095] このように、第 1キャリブレーションユニット 188及び第 2キャリブレーションユニット 19 0で算出されてメモリ 184に記憶された自家蛍光及び蛍光色素の発する蛍光の蛍光 緩和時定数及びゲイン定数は、強度算出ユニット 192において補正変換行列を作成 する際、伝達関数のパラメータとして用いられ、補正変換行列の行列要素の算出に 用いられる。第 1キャリブレーションユニット 188で算出された自家蛍光の蛍光緩和時 定数及びゲイン定数を用いるのは、標識サンプル力も発する自家蛍光によって蛍光 色素の発する n個の蛍光強度の算出結果の精度が劣化するのを防ぐためである。 また、上記補正変換行列の行列要素の算出の際、第 2キャリブレーションユニット 1 90で算出された蛍光緩和時定数及びゲイン定数を用いるのは、 n個の蛍光色素から 発する蛍光を同時に計測するとき、蛍光強度を精度良く求めるためである。すなわち 、強度算出ユニット 192は、メモリ 184に記憶されて既知となった、自家蛍光の蛍光 緩和時定数及びゲイン定数と、メモリ 184に記憶されて既知となった各蛍光色素の蛍 光緩和時定数及びゲイン定数とを用いて、補正変換行列を作成し、これを用いて蛍 光強度を求める。詳細の説明は後述する。
以上が分析装置 180の構成である。
[0096] このようなフローサイトメータ 110では、図 13に示すような処理が行われて、各蛍光 の蛍光強度が求められる。
まず、 n種類の標識サンプルが準備される (ステップ S 10)。 n種類の標識サンプルと は、 n種類の蛍光色素がマイクロビーズ等のサンプルに付着して標識されたものを ヽ い、測定溶液中に混濁されているものをいう。標識サンプルの溶液はシース液を用い て管路 130内にてフローセルを形成する。このフローセルに所定の周波数で強度変 調したレーザ光を照射して蛍光の計測が行われる (ステップ S20)。
[0097] 蛍光の計測は、標識サンプル 112が管路 130中の測定点を通過するタイミングを 知らせる、受光部 124の生成するトリガ信号に応じて、波長帯域の異なる m個の光電 変翻（図 10に示す形態では m= 3)による計測が開始される。
計測により得られた蛍光信号は、信号処理部 142の位相差検出器 156にて、蛍光 信号の cos成分及び sin成分を含む処理信号が取り出される。この処理信号は、コン トローラ 144において、ローパスフィルタ 162により高周波信号が除去されて、蛍光信 号の cos成分及び sin成分が AD変換されて検出値として求められる。
[0098] 求められた cos成分及び sin成分は、分析装置 180に供給され、所定の計測時間 内に求められた cos成分及び sin成分の情報を用いてスキヤッタグラム（2次元相関図 )がディスプレイ 194に表示される (ステップ S 30)。
ディスプレイ 194にスキヤッタグラムが表示されるとともに、光電変 ^^毎に検出さ れた cos成分及び sin成分の検出値をベクトル成分とするベクトルにまとめ、このべタト ルに後述する補正変換行列力も作られた逆行列を作用させる (ステップ S50)。逆行 列をベクトルに作用させることで、各標識サンプルの発する蛍光におけるゲイン定数 が求められ、このゲイン定数が蛍光強度の比率のベクトルとして求められる。
こうして求められた蛍光強度の比率と蛍光緩和時定数がディスプレイ 194に表示さ れる（ステップ S 50)。
[0099] ここで、補正変換行列の行列要素は下記のように作成される。
標識サンプルの発する蛍光が 1次遅れ系の緩和過程であるとしたとき、各光電変換 器で出力される検出値 (cos成分、 sin成分）は、標識サンプルが発する n種類の蛍光 色素からの蛍光及び 1種類の自家蛍光の各 1次遅れ系の伝達関数を加算して下記 式（12)、（13)のように表される。
[0100] [数 12]
、
(cos成分）； = -— ~~； ― + ~~； ~" 7
1 + ι · ω Μ ) ζ 1 + τ 2 '∞u ) + + … (12)
1 + η · ω Μ ) 2 1 + ν τ ο ' ω Μ ) 2
[数 13] κ ij · τ i■ ωΜ( τ ι· αι ) t 2Γて 2■ ω Μ ( τ 2· α 2 )
(sin成分）； = ― ^ T ^ ^
丄 + ( て Γ Ο>Μ ) 1 + ( て 2' C0M^ Z
fCnj ' Tn' COM T rT CKn て 0· ®Μ (て 0' 0 ) , 、
... (13)
1+ ( て η·ωΜ)2 1+( τ0·ωΜ)2
[0101] ここで τ = l〜n)は、 i番目の種類の蛍光色素が発する蛍光の蛍光緩和時定数 である。又、 κ (i=l〜n, j=l〜m)は、 i番目の種類の蛍光色素が発する蛍光が、 j 番目の光電変 において検出されるときのゲイン定数であって、 m個の光電変換 器で検出されるゲイン定数のうち最大のゲイン定数で規格ィ匕されたものをいう。
また、 τ は自家蛍光を発する標識サンプルが自家蛍光を発するときの蛍光緩和時
0
定数である。又、 κ (j=l〜m)は、前記標識サンプルが自家蛍光を発するときの自
Oj
家蛍光が、 j番目の光電変 において検出されるときのゲイン定数であって、 m個 の光電変換器で検出されるゲイン定数のうち最大のゲイン定数で規格化されたもの をいう。
これらの値は、後述する第 1のキャリブレーション（図 14に示す処理)及び第 2のキ ヤリブレーシヨン（図 15に示す処理）によって算出されてメモリ 184に記憶されたもの である。なお、 ω は、レーザ光の変調周波数に 2 πを乗算した角周波数である。
[0102] 一方、 a (i=l〜n)は、 η種類の蛍光色素の蛍光と 1種類の自家蛍光が同時に発 するときの、前記蛍光色素が発する蛍光のゲイン定数であり、このゲイン定数が同時 にレーザ光を照射したときの蛍光強度を表すものである。 a は、 n種類の蛍光色素
0
及び 1種類の自家蛍光が同時に発するときの、自家蛍光のゲイン定数である。これら のゲイン定数 a、 a は、 n種類の蛍光色素により標識された標識サンプルに同時に
i 0
レーザ光を照射したときの蛍光強度を表す未知数であり、求めようとするものである。 したがって、式（12)、（13)力 下記式（14)のように補正変換行列 Mを用いて方程 式が表される。ここで、補正変換行列 Mの行列要素は、例えば 1行 1列の行列要素は 、 κ Ζ(1+(τ ·ω )2)である。
11 1 Μ
このように伝達関数の値が行列要素となる補正変換行列 Μが作成される。
[0103] なお、補正変換行列 Μの行列サイズは、 2'mX (n+1) (縦方向 X横方向）である。
ここで、 m, nは上述したように 2'm≥n+lを満足するように設定されている。このた め、補正変換行列の縦方向のサイズを縮小して、例えば、 κ の値の小さい行を取り 除いて (n+ 1) X (n+ 1)の行列サイズにする。これにより、補正変換行列 Mの行列 はサイズが縮小し、この縮小した正方行列 M'の逆行列 M'—1が求められ、この逆行列 M'—1を式（14)の左辺ベクトル Aに作用して、式（14)中の右辺ベクトル Xが算出され る（ステップ S40)。
[0104] [数 14]
(cos成分 1
(sin成分 ) 1
(cos成分 2
(sin成分 ) 2
(cos成分 )；
(sin成分 )
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000038_0001
A X
[0105] なお、上記のように行列サイズを縮小化する方法の他に、式（14)の両辺に補正変 換行列 Μの転置行列 を掛けて、補正変換行列を、 (n+ 1) X (n+ 1)の行列サイ ズの正方行列 M^Mに変え、この正方行列の逆行列（M^M)— 1を、式（14)中の左辺 のベクトル Aに上記転置行列を掛けた ΜιΑに作用させて、式（14)の右辺のベクトル Χ(= (Μι·Μ)-1· ΜιΑ)算出することもできる。
こうして求められた式 (14)中の右辺のベクトル Xには、既知数である τ (i= l〜n)、 τ が含まれるので、これらの値が代入されて、算出されたベクトル Xから a (i= η
0 i
)、 a が算出される。
0
最後に、各蛍光の蛍光緩和時定数 τ 、 τ 及びゲイン定数 ο； 、 a がディスプレイ 9 i 0 i 0
4に表示される。ゲイン定数 α 、 a は、各蛍光の蛍光強度を表す。
i 0
[0106] なお、上述したように、補正変換行列 Mを作成する際、メモリ 184に記憶された τ
0 及び κ を用いる力 これらの値は、図 14に示す第 1のキャリブレーションによって算
Oj
出される。
以下、第 1のキャリブレーションについて説明する。
[0107] 図 14に示す第 1のキャリブレーションでは、まず、無標識サンプルが準備される (ス テツプ SI 00)。
無標識サンプルとは、レーザ光の照射により自家蛍光する 1種類のサンプルの溶液 をいう。このようなサンプルとして、抗体等が結合可能なゥイス力が設けられたマイクロ ビーズや細胞等の受容体サンプルが挙げられる。
[0108] 次に、無標識サンプルについてフローサイトメータで計測が行われる (ステップ S 11 0)。
フローサイトメータによる計測（ステップ S110)及びスキヤッタグラムのディスプレイ 表示（ステップ S120)は、図 13に示すステップ S 20、ステップ S30と同様の処理であ るので説明は省略する。
次に、無標識サンプルが発する自家蛍光を特定するために、ディスプレイ 194に表 示されたスキヤッタグラムにぉ 、て、無標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団が 選択される (ステップ S130)。この選択は、オペレータによるマウス等の入力操作系を 用いて行われ、選択されたサンプル集団の領域に含まれる無標識サンプルの cos成 分及び sin成分、あるいは蛍光信号の振幅及び位相差の代表値 (例えば平均値、重 心値、頻度ピーク値）が求められる (ステップ S140)。
次に、求められた代表値を用いて、この代表値と蛍光緩和時定数及びゲイン定数と の間の関係を規定した下記式（15)〜（18)を用いて蛍光緩和時定数及びゲイン定 数が求められる（ステップ S 150)。
[0109] [数 15]
τ 0 ' t oi
(振幅）；= 0 - '·· (15)
71 + { τ ο· WM
[数 16]
{ θ ) ; =— tan- 1 { τ 0· ωΜ) … (16)
[数 17]
Figure imgf000039_0001
(cos成分）； = C —- ··· (17)
1 + ( τ 0 · ωΜ>
[数 18]
, τ ( · a 0j · ω Μ
(sin成分）； = - C ― ··· (18) [0110] ここで、 τ は、自家蛍光を発するサンプルの自家蛍光の蛍光緩和時定数であり、
0
ω はレーザ光の変調周波数に 2 πを乗算した角周波数である。 α は、 j番目（j = l
Oj
〜m)の光電変換器で得られる自家蛍光のゲイン定数である。 Cは比例定数である。 自家蛍光の蛍光緩和時定数 τ 及び自家蛍光のゲイン定数 α は、式（15)〜（18)
0 0j
の！、ずれか 2つを用いて算出される。
こうして算出された無標識サンプルの蛍光緩和時定数及びゲイン定数は、メモリ 18 4に記憶される（ステップ S 150)。
第 1キャリブレーションは以上のように行われる。
[0111] 次に、第 2のキャリブレーションについて説明する。
図 15に示す第 2のキャリブレーションでは、まず、 n種類の標識サンプルのうち、 1 種類の蛍光色素が付着した標識サンプルが準備される (ステップ S200)。ここで、 1 種類の標識サンプルとは、マイクロビーズ等の自己発光する 1種類のサンプルに、 1 種類の蛍光色素が付着されたものを 、う。
次に、フローサイトメータ 110により蛍光の計測が行われ (ステップ S210)、計測結 果がスキヤッタグラムに表示され (ステップ S220)、スキヤッタグラムから 1種類の標識 サンプルにおけるサンプル集団が選択される。
[0112] フローサイトメータによる計測（ステップ S210)及びスキヤッタグラムのディスプレイ 表示（ステップ S220)は、図 13に示すステップ S 20、ステップ S30と同様の処理であ るので説明は省略する。
サンプル集団の選択は、 1種類の標識サンプル中のサンプルが発する自家蛍光を 特定するために行われる。具体的には、ディスプレイ 94に表示されたスキヤッタダラ ムにおいて、 1種類の標識サンプルの蛍光領域のサンプル集団が選択される。この 選択は、オペレータによるマウス等の入力操作系を用いて行われ、選択されたサンプ ル集団の領域に含まれる標識サンプルの発する蛍光の cos成分及び sin成分、ある いは蛍光信号の振幅及び位相差の代表値 (例えば平均値、重心値、頻度ピーク値） が求められる（ステップ S240)。
[0113] 次に、求められた代表値を用い、さらに第 1のキャリブレーションで算出され、メモリ 184に記憶された標識サンプルの発する自家蛍光の蛍光緩和時定数及びゲイン定 数を用いて、下記式（19)〜（21)力 標識サンプルの蛍光色素力 発する蛍光の蛍 光緩和時定数及びゲイン定数が算出される (ステップ S250)。
[0114] [数 19] 成分 ) 成分 )
(19)
成分 ) 成分 )
[数 20]
Figure imgf000041_0001
成分） 成分）
{ 1 + ( τ * ω Μ ) 2
て て 0 ) ' Μ · o [l] · て ο
(20)
[数 21]
て i · tt i · て
成分） (21)
1 + ( τ； · ω Μ ) 2 1 + ( τ ο ' ω Μ ) "
[0115] ここで、式 ( 19)中の添字 [ 1]及び [2]は、複数の光電変 で得られた蛍光信号 の振幅 ( (cos成分) 2+ (sin成分)2)) (1/2)のうち、振幅値が最大となる光電変翻の番 号及び振幅値が 2番目に大き 、光電変換器の番号である。それゆえ、 κ 及び κ は、自己発光する蛍光のうち、第 1のキャリブレーションにおいて算出されたゲイン定 数の最大ゲインに対して規格化された比率であり、添字 [ 1]及び [2]の番号が判って いるので既知の値である。
式（19)によって算出された蛍光緩和時定数 τは、図 13に示す処理フローにおい て式（14)中の補正変換行列の行列要素の値の算出に用いるために、メモリ 184に 記憶される。さらに、この蛍光緩和時定数 τ
1を用いて、式（20)から α が算出され る。 a は、第 2キャリブレーションにお 、て自家蛍光の最大ゲイン定数である。この
Omax
a を式（21)に代入することにより、 a を算出することができる。 a は、蛍光色
Omax i[l] i[l] 素が発する蛍光のうち、振幅値が最大となる光電変^^の番号において受光した蛍 光のゲイン定数である。
同様に、下記式（22)を用いて式（22)中の j番目の光電変換器で受光した蛍光の ゲイン定数 αを算出する。
[0116] [数 22] , , , τ i · α i j κ ο j * τ ο * α omax ,
(cos成分）； = —— ― +—— ― ' ' ' (22)
1 + ( て i ' W M ) ^ 1 + ( τ 0 ' ω Μ )
[0117] こうして算出された蛍光緩和時定数及びゲイン定数は、メモリ 184に記憶される力 算出された値は、 1種類の標識サンプルにおける蛍光のパラメータである。したがつ て、 η種類の標識サンプルについてそれぞれ準備されて蛍光のパラメータが求めら れたか否かが判定される（ステップ S260)。
判定の結果、すべての種類の標識サンプルが準備されておらず、蛍光のパラメ一 タが算出されていない場合、ステップ S200〖こ戻り、ステップ S200〜ステップ S250を 繰り返す。
こうして、各種類毎の標識サンプルにおける蛍光の計測から、各蛍光色素毎の蛍 光緩和時定数及びゲイン定数がそれぞれ算出され、メモリ 184に記憶される。
こうしてメモリ 184に記憶された蛍光緩和時定数及びゲイン定数は、図 13に示され た処理中のステップ S40における補正変換行列の作成に用 ヽられる。
以上が、第 2のキャリブレーションの説明である。
第 2のキャリブレーションで算出されたゲイン定数 a (i= l〜n, j = l〜m)は、これ らのゲイン定数のうち、 iを固定し jを変えたとき最大値となるゲイン定数 max )で規 格ィ匕することにより、式（11)中の補正変換行列中で用いる κ を得ることができる。さ らに、規格化された κ は、図 13に示す処理フローにおいて式（22)中の補正変換行 列の行列要素の値の算出に用いるためにメモリ 184に記憶される。
[0118] このように、本発明では、図 13に示す処理フローに基づいて、 n種類の標識サンプ ルにレーザ光を照射しても、蛍光強度に対応するゲイン定数を求めることができる。 その際、レーザ光を所定の周波数で時間変調するので、 1つの光電変換器から cos 成分及び sin成分の値を検出することができる。したがって、これらの値を用いて蛍光 強度を求めるので、従来のように、計測により求めることができる標識サンプルの数は 、従来のように光電変^^の配置数と同数かそれ以下に制限されない。つまり、光電 変換器の配置個数が同じ場合、識別可能な蛍光の種類を従来に比べて多くすること ができる。
また、 n種類の標識サンプルに対して図 13に示す処理を行う前に、無標識サンプ ル及び各種類ごとの標識サンプルを用いて蛍光緩和時定数及びゲイン定数を算出 する第 1のキャリブレーション及び第 2のキャリブレーションを行なうので、図 13に示す 処理の際、蛍光強度を精度良く求めることができる。

Claims

請求の範囲
[1] 測定対象物にレーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を受光し、こ のとき得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、
レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と 前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の 周波数の変調信号を生成する光源制御部と、
時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力され た蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出 する処理部と、を有することを特徴とする強度変調したレーザ光による蛍光検出装置
[2] 前記処理部は、前記蛍光信号の前記変調信号に対する位相遅れ求めることにより 、前記蛍光緩和時間を算出する請求項 1に記載の強度変調したレーザ光による蛍光 検出装置。
[3] 前記光源制御部は、 1ビットの信号値が所定長さで符号化され、かつ互いに直交す る複数の符号ィ匕系列信号の中から選択された符号ィ匕系列信号をパルス制御信号と して用い、かつ前記レーザ光源部からのレーザ光の出射のオンの時間が、前記レー ザ光の前記時間変調の 1周期よりも長くなるように、前記レーザ光の出射のオン/オフ を設定して制御し、
前記処理部は、前記蛍光緩和時間を算出するとともに、前記受光部で出力された 受光信号から、前記符号化系列信号を用いて測定対象物からの蛍光を識別する、 請求項 1又は 2に記載の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
[4] 前記複数の符号化系列信号は、 1つの符号ィ匕系列信号をビット方向にシフトして構 成されたものであり、このシフトによって符号ィ匕系列信号が互いに直交するように構 成されている請求項 3に記載の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
[5] 前記レーザ光源部は、複数のレーザ光を出射する複数のレーザ光源を有し、 前記光源制御部は、複数のレーザ光源からのレーザ光の出射のオン Zオフを、互 いに直交する前記複数の符号化系列信号を用いて制御し、
前記処理部は、前記受光部において複数のレーザ光力 の光信号が重なって出 力された蛍光信号から、レーザ光の出射に用いた符号ィ匕系列信号を用いて、各レー ザ光の照射により測定対象物が発する蛍光の蛍光信号をそれぞれ分離する請求項
3または 4に記載の強度変調したレーザ光による蛍光検出装置。
[6] 前記測定対象物は、異なる蛍光を発する複数の蛍光色素により標識された複数の 標識サンプルを含み、
前記受光部は、前記レーザ光が照射されて発する標識サンプルの蛍光を受光波 長帯域の異なる複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む前記蛍光 信号の検出値を各検出センサ力 収集する入力部を有し、
前記処理部は、前記蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時間を算出し、さらに、算 出した前記蛍光緩和時間を用いて、蛍光強度を求めるための補正変換行列の行列 要素を設定して前記補正変換行列を作成する行列作成部と、各検出センサ力 収 集された前記位相情報を含んだ前記蛍光信号の検出値の組をベクトルとし、このべ タトルに前記補正変換行列力 作成される逆行列を作用させて標識サンプルの各々 が発する蛍光の蛍光強度を求める強度算出部と、を有する請求項 1に記載の蛍光検 出装置。
[7] 前記標識サンプルは、互いに異なる種類の蛍光色素が、レーザ光の照射により自 家蛍光を発するサンプルへ付着することにより、異なる複数の種類を有し、
前記標識サンプルへのレーザ光の照射により、前記蛍光色素のうち少なくとも 1種 類の蛍光色素から発する蛍光と前記サンプルから発する自家蛍光とは、波長スぺタト ラムが波長領域で部分的に互 、に重なって 、る請求項 6に記載の蛍光検出装置。
[8] 蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプル力 なるものを無標 識サンプルというとき、前記処理部は、前記無標識サンプルについて、前記自家蛍 光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め る第 1のキャリブレーション部を有し、
前記第 1のキャリブレーション部は、前記無標識サンプルを測定対象物として前記 所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出 値を各検出センサ力 収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する前 記自家蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、
前記行列作成部は、この第 1のキャリブレーション部で求められた蛍光緩和時間及 びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成する請求項 7に記載の蛍光検出装 置。
[9] 前記標識サンプルの種類すべてについて、前記蛍光色素が発する蛍光が 1次遅 れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時間及びゲイン定数を、前記標識サン プルの種類の別に求める第 2のキャリブレーション部を有し、
前記第 2のキャリブレーション部は、前記蛍光色素のうちの 1種類が前記自家蛍光 を発するサンプルに付着した標識サンプルを測定対象物として、前記所定の周波数 で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出セ ンサ力 収集し、これらの検出値から、この標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の 蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時間及びゲイン定数を、前記自 家蛍光を発するサンプルに付着させる蛍光色素の種類を変えながら、前記標識サン プルに含まれるすべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を 求め、
前記行列作成部は、この第 2のキャリブレーション部で求められた前記標識サンプ ルにおける蛍光緩和時間及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成する請 求項 7又は 8に記載の蛍光検出装置。
[10] 複数の蛍光色素により標識された複数の標識サンプルにレーザ光を照射すること によって異なる蛍光を発する複数の標識サンプルの蛍光の検出値力 各蛍光強度 を求める蛍光検出装置であって、
測定対象物に照射するレーザ光を出射するレーザ光源部と、
レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と 前記レーザ光源部から出射するレーザ光の強度を時間変調させるために、所定の周 波数の変調信号を生成する光源制御部と、
時間変調したレーザ光を測定対照物に照射することにより前記受光部で出力され た蛍光信号から、前記変調信号を用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出 する処理部と、を有し、
前記受光部は、レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに 照射したときの標識サンプルの蛍光を受光する受光波長帯域の異なる複数の検出 センサを有し、
前記処理部は、前記複数の検出センサで受光することにより、位相情報を含む検 出値を各検出センサ力 収集する入力部と、レーザ光を照射した標識サンプルの各 蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの伝達関数のパラメータを用いて補正 変換行列の行列要素を設定して前記補正変換行列を作成する行列作成部と、各検 出センサカゝら収集された前記位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、このべタト ルに前記補正変換行列から作成される逆行列を作用させて標識サンプルの各々が 発する蛍光の蛍光強度を求める強度算出部と、を有することを特徴とする蛍光検出 装置。
[11] 複数の蛍光色素により標識された複数の標識サンプルにレーザ光を照射すること によって発する蛍光の検出値から各蛍光強度を求める蛍光強度算出方法であって、 レーザ光の強度を所定の周波数で時間変調して標識サンプルに照射し、このとき の標識サンプルの蛍光を受光波長帯域の異なる複数の検出センサで受光すること により、位相情報を含む検出値を各検出センサ力 収集するステップと、
レーザ光を照射した標識サンプルの各蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたと きの伝達関数のパラメータを用いて補正変換行列の行列要素を設定して前記補正 変換行列を作成するステップと、
各検出センサ力 収集された前記位相情報を含む検出値の組をベクトルとし、この ベクトルに前記補正変換行列力 作成される逆行列を作用させて標識サンプルから 発する蛍光の蛍光強度を求めるステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法
[12] 前記標識サンプルは、互いに異なる種類の蛍光色素が、レーザ光の照射により自 家蛍光を発するサンプルへ付着することにより、異なる複数の種類を有し、
前記標識サンプルへのレーザ光の照射により、前記蛍光色素のうち少なくとも 1種 類の蛍光色素から発する蛍光と前記サンプルから発する自家蛍光とは、波長スぺタト ラムが波長領域で部分的に互 、に重なって 、る請求項 11に記載の蛍光検出方法。
[13] 前記検出センサの個数を m個、前記蛍光色素の種類を n種類としたとき、 2 -m≥n
+ 1を満足する請求項 12に記載の蛍光検出方法。
[14] 前記補正変換行列を作成するステップでは、蛍光色素が付着しておらず、前記自 家蛍光を発するサンプル力もなるものを無標識サンプルというとき、この無標識サン プルについて、前記自家蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和 時間及びゲイン定数を求める第 1のキャリブレーションが行われ、
前記第 1のキャリブレーションでは、前記無標識サンプルを測定対象物として前記 所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出 値を各検出センサ力 収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する前 記自家蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、
前記第 1のキャリブレーションにより求められた蛍光緩和時間及びゲイン定数を用 いて前記補正変換行列を作成する請求項 12又は 13に記載の蛍光検出方法。
[15] 前記補正変換行列の作成にお!、て、前記補正変換行列を作成するために前記第 1のキャリブレーションにより求められる前記ゲイン定数を用いる際、各検出センサの 検出値カゝら得られるゲイン定数を、これらのゲイン定数のうち最大となるゲイン定数で 規格化して用いる請求項 14に記載の蛍光検出方法。
[16] 前記第 1のキャリブレーションにおいて、前記蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め るときに用いられる検出値は、前記検出センサで検出された信号波形の cos成分及 び sin成分の振幅値であり、この位相情報を含む検出値は、前記標識サンプルの 1つ 1つに対して収集され、これら複数の検出値力 代表値を抽出して前記第 1のキヤリ ブレーシヨンに用いる請求項 14又は 15に記載の蛍光検出方法。
[17] 前記補正変換行列を作成するステップでは、前記標識サンプルの種類すべてにつ いて、前記蛍光色素が発する蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光 緩和時間及びゲイン定数を、前記標識サンプルの種類の別に求める第 2のキヤリブ レーシヨンが行われ、
この第 2のキャリブレーションでは、前記蛍光色素のうちの 1種類が前記自家蛍光を 発するサンプルに付着した標識サンプルを測定対象物として、前記所定の周波数で 時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出値を各検出セン サ力 収集し、これらの検出値から、この標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光の 蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、この蛍光緩和時間及びゲイン定数を、前記自 家蛍光を発するサンプルに付着させる蛍光色素の種類を変えながら、前記標識サン プルに含まれるすべての蛍光色素の発する蛍光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を 求め、
この第 2のキャリブレーションにより求められた前記標識サンプルにおける蛍光緩和 時間及びゲイン定数を用いて前記補正変換行列を作成する請求項 12〜15の 、ず れか 1項に記載の蛍光検出方法。
[18] 前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎の蛍光緩和時間及びゲイン定数を 求める際、前記蛍光色素が付着しておらず、前記自家蛍光を発するサンプルからな るものを無標識サンプルというとき、この無標識サンプルについて、前記自家蛍光が 1次遅れ系の緩和応答であるとしたときの蛍光緩和時間及びゲイン定数を求める第 1 のキャリブレーションが行われ、
前記第 1のキャリブレーションでは、前記無標識サンプルを測定対象物として前記 所定の周波数で時間変調したレーザ光を照射することにより、位相情報を含む検出 値を各検出センサ力 収集し、これらの検出値から前記無標識サンプルの発する蛍 光の蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め、この第 1のキャリブレーションにより求めら れた蛍光緩和時間及びゲイン定数を用いて、前記第 2のキャリブレーションにお 、て 、前記標識サンプルの蛍光色素が発する蛍光毎の蛍光緩和時間及びゲイン定数を 求める請求項 17に記載の蛍光検出方法。
[19] 前記補正変換行列の作成にお!、て、前記補正変換行列を作成するために前記第 2のキャリブレーションにより求められる前記ゲイン定数を用いる際、各標識サンプル の蛍光色素が発する蛍光毎に、各検出センサの検出値力 得られるゲイン定数を、 これらのゲイン定数のうち最大となるゲイン定数で規格ィ匕して用いる請求項 17又は 1 8に記載の蛍光検出方法。
[20] 前記第 2のキャリブレーションにおいて、前記蛍光緩和時間及びゲイン定数を求め るときに用いられる検出値は、前記検出センサで検出された信号波形の COS成分及 び sin成分の振幅値であり、この位相情報を含む検出値は前記標識サンプルの 1つ 1 つに対して収集され、これら複数の標識サンプルの検出値力 代表値を抽出して前 記第 2のキャリブレーションに用いる請求項 17〜19のいずれ力 1項に記載の蛍光検 出方法。
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