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WO2006085616A1 - 核酸配列増幅方法 - Google Patents

核酸配列増幅方法 Download PDF

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WO2006085616A1
WO2006085616A1 PCT/JP2006/302360 JP2006302360W WO2006085616A1 WO 2006085616 A1 WO2006085616 A1 WO 2006085616A1 JP 2006302360 W JP2006302360 W JP 2006302360W WO 2006085616 A1 WO2006085616 A1 WO 2006085616A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
primer
nucleic acid
acid sequence
amplification
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2006/302360
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mitinori Saitou
Kazuki Kurimoto
Yukihiro Yabuta
Yasuhide Ohinata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN
Original Assignee
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN filed Critical RIKEN
Priority to EP06713503A priority Critical patent/EP1845160A4/en
Priority to JP2007502659A priority patent/JP5526326B2/ja
Priority to US11/884,084 priority patent/US9222129B2/en
Publication of WO2006085616A1 publication Critical patent/WO2006085616A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid sequence amplification method that enables quantitative microarray analysis, and more particularly, to a nucleic acid sequence amplification method that enables quantitative microarray analysis at a small number of cells, preferably a single cell level.
  • a biological phenomenon is a system that is formed by a complex interaction of a large number of gene products. To understand this fundamentally, it is necessary to accurately grasp the expression dynamics of each gene product. Essential as a starting point. Analysis using microarrays has been actively conducted as a means of systematic gene expression analysis. In microarray analysis, several tens of thousands of oligonucleotide spots are created on a support such as slide glass, and a target prepared from the RNA of the cell or tissue to be analyzed is hybridized, and the resulting hybrid is obtained. This method comprehensively measures the transcription level of each gene using the intensity of formation as an index. This is useful as a method for efficiently and quantitatively measuring the dynamic behavior of all genes in living organisms, and provides gene expression information for various life phenomena, and in the medical, food, and substance production fields. It can be the first step that spreads to the effective application of.
  • Alfymetrix's oligonucleotide microarray GeneChip series which is capable of comprehensively and quantitatively measuring gene expression levels, is the first cell in the GeneChip series! Reverse transcription of total tissue-derived mRNA and cDNA Then, in vitro transcription reaction using T7 RNA polymerase is performed to synthesize labeled cRNA (antisense strand), and the synthesized cRNA is hybridized to the array.
  • T7 RNA polymerase is performed to synthesize labeled cRNA (antisense strand)
  • the synthesized cRNA is hybridized to the array.
  • about 1000 to 100,000 cells must be prepared to extract the total mRNA and create a target.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 The method of synthesizing cDNA from a very small amount of mRNA at the single cell level and amplifying it while maintaining the relative relationship of gene expression was first proposed by G. Brady et al. (Non-Patent Documents 1 and 2). In 2003, a microarray experiment was reported in which cDNA amplified using this technique was fluorescently labeled (Non-patent Document 3). However, these techniques have the following drawbacks, and quantitative microarray analysis at the single cell level is still in practical use.
  • the PCR method is a method of amplifying DNA exponentially by doubling or doubling the cage type. Therefore, the slight difference in amplification efficiency between different gene products will ultimately result in many-fold differences, greatly distorting the relative relationship between gene expression levels. This is particularly serious for gene products with relatively low expression levels, and this is a factor that greatly reduces the detection sensitivity.
  • Such a distortion in the relative relationship of gene expression during the amplification process by the normal PCR method is called a “systematic error (systematic error)”.
  • RNA from single cells Extracting and purifying very small amounts of RNA at this level is usually not practical, and the possibility of losing low copy mRNA at the time of this operation cannot be denied.
  • linear amplification is much less efficient than the PCR method because the amplification efficiency of nucleic acid sequences is much lower than the PCR method.
  • the amplification product is inevitably labeled RNA, so it is difficult to store the sample compared to DNA, and because the amplification product is labeled RNA, gene-specific PCR is used to confirm the success of amplification.
  • the inconvenience of having to perform the reverse transcription reaction again before the process, and the high level of skill required due to the complicated experimental work of repeating the synthesis and purification of RNA It seems that it is unsuitable for analysis.
  • Non-Patent Document 1 Brady, G., M. Barbara, et al. (1990). "Representative in vitro cDNA a mplification from individual hemopoietic cells and colonies.” Methods Molec. Cell. Biol. 2 (17-25) .
  • Non-Patent Document 2 Iscove, NN, M. Barbara, et al. (2002). "Representation is faithlully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub—picogram quantities of mRNA.” Nat Biotechnol 20 (9): 940-3 .
  • Non-Patent Document 3 Tietjen, I., J. M. Rihel, et al. (2003). "Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors.” Neuron 38 (2): 161-75.
  • Non-Patent Document 4 Kamme et.al, Single-Cell Microarray Analysis in Hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity, The Journal of Neuroscience, May 1, 2003, 23 (9): 3607
  • RNA at a single cell level is c c
  • Primary strand cDNA is prepared by reverse transcription using a first primer comprising a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably a reverse strand, and preferably reverse. Perform a 5–10 minute copy reaction to prepare primary-strand cDNA, or prepare primary-strand cDNA that is approximately uniform in length,
  • step (b) After the reaction of step (a), the remaining first primer is deactivated, preferably the remaining first primer is degraded by exonuclease I and deactivated,
  • step (c) The first-strand cDNA obtained in step (a) is subjected to a poly A tailing reaction, which is then used as a cage to form a second primer consisting of poly T and any additional nucleic acid sequence Y, preferably a sequence.
  • Second strand DNA is prepared using the second primer having the nucleic acid sequence shown in No. 2, and the additional nucleic acid sequences X and Y in the first primer and the second primer, respectively, The sequence is different,
  • step (d) The first primer is added and PCR amplification is performed, preferably PCR amplification is performed for 10 to 30 cycles. More preferably, the secondary strand double-stranded DNA obtained in step (c) is 3 — Divide into 10 parts, perform PCR amplification for each, then combine the amplification products together, and more preferably perform PCR amplification with the annealing temperature close to the Tm value of the primer.
  • a primer set that also has a combination ability of a third primer consisting of an additional nucleic acid sequence X and a promoter sequence that binds to its 5 ′ side, and a second primer, or
  • RNA polymerase and labeled nucleotide triphosphate to the nucleic acid population obtained by X @ (e) to prepare a nucleic acid population comprising labeled RNA.
  • a method further comprising:
  • a nucleic acid population that has the ability to amplify product and that has a relative relationship between gene expression levels in a biological sample prepared by the method of the present invention, and the amplification product has a substantially uniform length.
  • Quantitative microarray analysis method applying the nucleic acid population to a microarray; a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and a nucleic acid having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • a primer pair comprising a molecule and a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • Primary strand cDNA is prepared by reverse transcription using a first primer comprising a nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably a reverse strand, and preferably reverse. Perform a 5–10 minute copy reaction to prepare primary-strand cDNA, or prepare primary-strand cDNA that is approximately uniform in length,
  • step (b) After the reaction of step (a), the remaining first primer is deactivated, preferably remains Decompose and inactivate the first primer with exonuclease I,
  • step (c) The first-strand cDNA obtained in step (a) is subjected to a poly A tailing reaction, which is then used as a cage to form a second primer consisting of poly T and any additional nucleic acid sequence Y, preferably a sequence.
  • Second strand DNA is prepared using the second primer having the nucleic acid sequence shown in No. 2, and the additional nucleic acid sequences X and Y in the first primer and the second primer, respectively, The sequence is different,
  • the first primer is added and PCR amplification is performed, preferably PCR amplification is performed for 10 to 30 cycles. More preferably, the secondary strand double-stranded DNA obtained in step (c) is 3 — Divide into 10 parts, perform PCR amplification for each, then combine the amplification products together, and more preferably perform PCR amplification with the annealing temperature close to the Tm value of the primer.
  • a primer set that also has a combination ability of a third primer consisting of an additional nucleic acid sequence X and a promoter sequence that binds to its 5 ′ side, and a second primer, or
  • RNA polymerase and a labeled nucleotide triphosphate to the nucleic acid population obtained by X @ (e) to prepare a nucleic acid population comprising labeled RNA,
  • a method further comprising:
  • the nucleic acid sequence is an amplification product that retains the relative relationship of the gene expression level in the biological sample
  • First-strand cDNA is prepared by reverse transcription using a first primer consisting of column X, preferably the first primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and preferably 5-10.
  • a biological sample specifically a eukaryotic cell, preferably one to several cells, more preferably a single cell force, isolated in the form of an isolated mRNA
  • First-strand cDNA is prepared by reverse transcription using a first primer consisting of column X, preferably the first primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and preferably 5-10.
  • step (b) After the reaction of step (a), the remaining first primer is deactivated, preferably the remaining first primer is degraded by exonuclease I and deactivated,
  • step (c) The first-strand cDNA obtained in step (a) is subjected to a poly A tailing reaction, which is then used as a cage to form a second primer consisting of poly T and any additional nucleic acid sequence Y, preferably a sequence.
  • Second strand DNA is prepared using the second primer having the nucleic acid sequence shown in No. 2, and the additional nucleic acid sequences X and Y in the first primer and the second primer, respectively, The sequence is different,
  • the first primer is added and PCR amplification is performed, preferably PCR amplification is performed for 10 to 30 cycles. More preferably, the secondary strand double-stranded DNA obtained in step (c) is 3 — Divide into 10 parts, perform PCR amplification for each, then combine the amplification products together, and more preferably perform PCR amplification with the annealing temperature close to the Tm value of the primer.
  • a primer set that also has a combination ability of a third primer consisting of an additional nucleic acid sequence X and a promoter sequence that binds to its 5 ′ side, and a second primer, or
  • RNA polymerase and a labeled nucleotide triphosphate to the nucleic acid population obtained by X @ (e) to prepare a nucleic acid population comprising labeled RNA,
  • a method further comprising:
  • a kit for preparing a cDNA population for application to a microarray (a) Biological samples, specifically eukaryotic cells, preferably 1 to several cells, more preferably 1 cell force Isolated mRNA force For preparing primary strand cDNA
  • a first primer comprising poly T and an optional additional nucleic acid sequence X, preferably a first primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
  • a second primer comprising poly T and an optional additional nucleic acid sequence Y for preparing double-stranded DNA, preferably a second primer having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein The additional nucleic acid sequences X and Y in the first primer and the second primer are different from each other,
  • a primer set that also has a combination ability of a third primer consisting of an additional nucleic acid sequence X and a promoter sequence that binds to its 5 ′ side, and a second primer, or
  • a kit comprising a primer set consisting of
  • the present invention relates to a kit in which the cDNA population retains the relative relationship of the gene expression level in the biological sample!
  • the present invention provides a highly reliable quantitative quantitative micro-amount cDNA amplification technology that can be directly applied to oligonucleotide microarrays by a simple PCR method.
  • a single cell force can be synthesized and amplified in a single experiment in a sufficient amount for a microarray experiment.
  • Comparison between the conventional method and the method of the present invention was carried out using real-time PCR experiments in which several gene products were probed. Both systematic error (systematic error) and random error were remarkably improved. It was confirmed. Furthermore, in the microarray experiment conducted using the present invention method, it was confirmed that analysis at a single cell level with a good reproducibility, which was much improved over the conventional method, was possible. . Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a chart for explaining the nucleic acid sequence amplification method of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph comparing gene expression levels by conventional cDNA amplification method and amplification method of the present invention with respect to systematic error and random error.
  • FIG. 3 is a graph comparing the amount of original RNA and the amount of gene expression by the amplification method of the present invention with respect to the signal intensity on the microarray.
  • FIG. 4 is a graph comparing two gene expression levels independently amplified by the amplification method of the present invention with respect to signal intensity on a microarray.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the copy number of a gene product obtained by the amplification method of the present invention and the signal intensity on the microarray.
  • FIG. 6 (a) is a graph showing that the relative gene expression level is maintained before and after purification by gel electrophoresis (gel purification).
  • the relative gene expression level was quantified using ABI real-time PCR.
  • the vertical axis is the relative gene expression level before gel purification, and the horizontal axis is the relative gene expression level after gel purification.
  • the gene expression level was shown by Cycle of threshold (Ct value).
  • Figure 6 (b) is a graph showing the change in relative gene expression after the in vitro transcription reaction. Open squares indicate the cases where the in vitro transcription reaction was performed directly after gel purification. The black square shows the case where in-vitro transcription reaction was performed after 1 cycle PCR after gel purification.
  • the horizontal axis represents the relative gene expression level in DNA after gel purification
  • the vertical axis represents the relative gene expression level in RNA after in vitro transcription reaction.
  • the relative gene expression level was quantified by real-time PCR after conversion to DNA by reverse transcription reaction. One cycle of PCR significantly improved the maintenance of relative gene expression levels.
  • the present invention provides a method for preparing a nucleic acid population comprising amplification products that retain the relative relationship of gene expression levels in a biological sample, and a nucleic acid population obtained by the method.
  • the “amplification product retaining the relative relationship of the gene expression level in the biological sample” means an amplification product in which the entire composition of the gene product group in the biological sample is substantially retained.
  • Standard protocol for oligonucleotide microarray experiments This means that the amount of product that can be applied to the microarray analysis is secured, that is, the level of product that can be applied to microarray analysis.
  • biological sample refers to a biological species having poly A at the 3 ′ end of mRNA, for example, a cell of an eukaryotic organism such as an animal including a mammal such as a human mouse, a plant, a fungus, or a protist. Means.
  • the present invention is expected to be applied as a biological sample to cells derived from the nervous system or blood cells, or somatic stem cells or cancer cells.
  • the number of cells as a biological sample is not particularly limited, considering that the present invention can be amplified with good reproducibility while maintaining the relative relationship of gene expression levels in the biological sample, Can be applied to a cell level of 100 or less, tens, 1 to several, and ultimately one.
  • “Quantitative microarray analysis” is a microarray analysis in which the expression level of a gene in a biological sample can be reflected and displayed in a label intensity such as a fluorescence intensity according to the expression level.
  • gene fragments probes
  • RNA target
  • gene expression is also based on fluorescence intensity. It is a method to check the amount. Increasing the number of gene fragments to be fixed as probes enables more comprehensive gene expression analysis.
  • the outline of the method of the present invention is as follows. Create primary strand cDNA with the first primer, deactivate the unreacted primer of the first primer, add poly A with TdT, create the secondary strand with the second primer, and again use the first primer In addition, PCR amplification is performed. The product is further PCR amplified using the third and second primers. Thereafter, by-products on the low molecular weight side that are not clearly derived from mRNA are removed if desired.
  • FIG. 1 shows an outline of the method of the present invention.
  • FIG. 1 is merely an example of the method of the present invention, and those skilled in the art can implement the present invention with appropriate modifications.
  • each step of the method of the present invention will be described in detail with reference to FIG.
  • First strand cDNA is prepared by reverse transcription using the first primer that also has poly T and any additional nucleic acid sequence and force, using the isolated mRNA as a biological sample from the biological sample force.
  • the reverse transcription reaction time is preferably shortened to 5-10 minutes, more preferably about 5 minutes, so that the amplification efficiency in the subsequent PCR reaction does not depend on the length of the vertical cDNA.
  • Primary-strand cDNAs with uniform lengths are synthesized for the long mRNA. “Primary-strand cDNA length is almost uniform” means that a long-length primary-strand cDNA can be obtained for such a long mRNA, and does not exclude the presence of short-strand cDNA. .
  • the remaining first primer is removed by decomposition or other methods.
  • the remaining primer may be digested with exonuclease I or exonuclease T. Alternatively, it can be inactivated by modifying the 3 ′ side of the remaining primer with alkaline phosphatase or the like.
  • Non-Patent Document 2 In conventional methods, by-products generated during the amplification process account for 30% or more of the total (for example, see Non-Patent Document 2). We found that this byproduct was amplified by an unintended pathway and that the remaining primer in the synthesis of the first strand cDNA was inactivated, thereby minimizing byproduct formation.
  • the primary strand cDNA obtained in the step (a) is subjected to a poly A tailing reaction, and this is used as a saddle type, using a second primer composed of poly T and an optional additional nucleic acid sequence Y as a secondary strand.
  • a second primer composed of poly T and an optional additional nucleic acid sequence Y as a secondary strand.
  • the second primer used here and the first primer used in step (a) are characterized in that they have a certain identity with different nucleic acid sequences and do not contain a promoter sequence.
  • the additional nucleic acid sequences X and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in the first primer: poly T + arbitrary additional nucleic acid sequence X and second primer: poly T + arbitrary additional nucleic acid sequence Y used in step (a) are different in sequence.
  • poly T + arbitrary additional nucleic acid sequence X and second primer poly T + arbitrary additional nucleic acid sequence Y used in step (a) are different in sequence.
  • the additional nucleic acid sequences X and Y further select a common sequence such that the Tm value of the common sequence in X and Y is lower than the Tm values in the first and second primers, respectively, and as much as possible Try to leave that value apart. By doing so, it is possible to prevent unwanted cross-annealing in which the first and second primers anneal to different sites during subsequent PCR reactions.
  • the Tm value of the consensus sequence is selected so as not to exceed the annealing temperature after the first and second primers are annealed.
  • the Tm value is the temperature when annealing with the half-strength complementary strand of the DNA molecule.
  • the annealing temperature should be set to a temperature that allows primer pairing, and is usually lower than the Tm value of the primer.
  • the nucleic acid sequences of the first primer and the second primer have 77% or more, more preferably 78% or more, more preferably 80 ⁇ 1%, and most preferably 79% identity.
  • the upper limit of sequence identity is at 0/0 of the upper limit described above, the Tm value of the common sequences of both primers does not exceed the annealing temperature.
  • the nucleic acid sequences of the first primer and the second primer have the identity of the additional nucleic acid sequences X and Y of 55% or more, more preferably 57% or more, and even more preferably 60 ⁇ 2%. Both sequences can also be defined.
  • the upper limit is attached Tm value of the consensus sequence in the nucleic acid sequences X and Y The upper limit of% that does not exceed the annealing temperature in the PCR reaction.
  • the additional nucleic acid sequences X and Y in the first and second primers to be used preferably each have a palindromic sequence.
  • restriction enzyme sites such as restriction enzyme sites such as Ascl, BamHI, Sail, Xhol and other EcoRI, EcoRIV, Nrul, Notl have palindromic sequences.
  • specific examples of the first and second primers include a primer pair of a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Example 1 When using the T7 promoter as the 3 'primer and the 5' primer sequence (T7_reverse) in which the 5 'force of the T7 promoter sequence is reversed, the base composition of these two primers is Although the Tm values were the same, the relative relationship of gene expression levels was broken.
  • Example 2 Primer combination VI (SEQ ID NO: 1) and IDT (Saito, H. Kubota, M.Roberts, RWChi, Q. Matsunami, H. (2004).
  • RTP family memoers induce lunctional exp ression of mammalian odorant When using receptors Cell 119 (5): 679-91., TATAGAATTCGC GGCCGCTCGCGA (dT) 24), these two primers had a total sequence identity of 74.5%. The relative relationship was broken.
  • V3 (dT) 24 (SEQ ID NO: 3) sequence with restriction enzyme site AscI (GGCGCGCC) changed to Notl (GCGGCCGC) (V3NotI (dT) 24) combined with Vl (dT) 24 In these cases, these two primers had a total identity of 76.9%, but the relative relationship of gene expression was still broken.
  • the first and second primers used have a higher Tm value than that used for normal PCR. It is preferable to have a primer.
  • the annealing temperature can be brought close to the Tm value of the primer, thereby suppressing non-specific annealing.
  • the annealing temperature of the primer used in the present invention is 60 ° C or higher and lower than 90 ° C, preferably about 70 ° C, and most preferably 67 ° C.
  • PCR amplification is performed for 10 30 cycles, preferably about 20 cycles in the present invention.
  • non-specific annealing can be suppressed by bringing the annealing temperature in PCR amplification close to the Tm value of the primer used.
  • the annealing temperature is 60 ° C or higher and lower than 90 ° C, preferably about 70 ° C. C, most preferably 67 ° C.
  • step (d) a plurality of primary strand cDNAs derived from the same starting sample, eg 3
  • the third primer is a promoter 5 'to the additional nucleic acid sequence X or Y in the nucleotide sequence of the primer of either the first primer or the second primer.
  • a primer set that also has a combination ability of a third primer consisting of an additional nucleic acid sequence X and a promoter sequence that binds to its 5 ′ side, and a second primer, or
  • the promoter region is not particularly limited as long as it is a site that can be recognized by RNA polymerase, but is preferably a T7 promoter region, a T3 promoter region, or an SP6 promoter region.
  • a nucleic acid molecule having the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is used.
  • PCR amplification is performed for 4 10 cycles, preferably 5 cycles, using either the primer set (1) or (2).
  • the number of cycles is required to be at least 3 cycles from the viewpoint of securing a sufficient number of amplification products including the promoter region.
  • the annealing temperature is the same as that described in the section (d).
  • a nucleic acid population having an amplification product strength that retains the relative relationship of the gene expression level in the biological sample is prepared.
  • Another aspect of the present invention is a nucleic acid population having the ability of an amplification product, which retains the relative relationship of gene expression levels in a biological sample, prepared by the steps (a) to (e) above.
  • “having a substantially uniform length” means that amplification products having a uniform length can be obtained for mRNA having a long length, and the presence of amplification products having a short length is excluded. is not.
  • the amplification products in the nucleic acid population of the present invention are oriented so that the 3 'side and the 5' side can be distinguished.
  • the nucleic acid population of the present invention obtained by the above-described process is useful as a sample to be applied to quantitative microarray analysis or a sample for sequencing.
  • RNA with a by-product as a cocoon-shaped RNA is also synthesized in the next step (f). Mae. This may adversely affect hybridization experiments on microarrays.
  • the by-product DNA removal step may be carried out using any means known in the art such as gel filtration and gel electrophoresis, but by-product by purification by gel electrophoresis. It is preferable to remove the product DNA. The reason is that gel electrophoresis is easy to operate, has a good recovery rate, has a high size resolution, and is inexpensive.
  • the length of the by-product DNA to be removed is usually about 300 bp or less. For example, DNA having a length of about 200 bp or less may be removed.
  • Byproduct DNA may be removed before or after the promoter region is added, but after the promoter region is added, there is abundant amplified cDNA, so purification efficiency and operational safety (sample cDNA) It is preferable to add a promoter area in terms of preventing loss of
  • the present inventors change the relative gene expression level in RNA as a transcript at a certain frequency. I found out.
  • further PCR is performed, and the amplified product is used as a cocoon to perform an in vitro transcription reaction.
  • the PCR conditions are not particularly limited as long as the target DNA sequence is amplified, but preferred PCR conditions are the same as those for the promoter sequence addition reaction in step (e).
  • the by-product DNA removal step and the subsequent PCR amplification step as described above are the amplification products that retain the relative relationship of the gene expression level in the biological sample of the present invention.
  • a method for preparing a nucleic acid library that retains the relative relationship of gene expression levels in biological samples, and the present invention can be applied to any of the kits of the invention.
  • RNA polymerase and labeled nucleotide triphosphate By applying RNA polymerase and labeled nucleotide triphosphate to the nucleic acid population of the present invention obtained by the above steps (a) to (e), a nucleic acid population comprising labeled RNA can be prepared.
  • This labeled nucleic acid population can be applied to Aifymetrix's oligonucleotide microarray GeneChip series, which is now becoming the mainstream, capable of simultaneously measuring multiple gene expression levels.
  • the present invention provides a method for amplifying a nucleic acid sequence, comprising steps (a) to (e) in the method for preparing a nucleic acid population of the present invention.
  • the nucleic acid sequence consists of an amplification product that retains the relative relationship of the gene expression level in the biological sample.
  • the present invention provides a library having a relative relationship of gene expression levels in a biological sample, including steps (a) to (e) in the nucleic acid population preparation method of the present invention.
  • a method of preparation is provided.
  • a cDNA library prepared by this method is a library that retains the relative relationship of gene expression levels in biological samples.
  • E. coli is transformed with a plasmid cloned from this cDNA library and grown on a medium, tens of thousands of colonies are generated corresponding to each transformant.
  • the expression frequency is high, if it is a gene, exactly the same corresponding sequence appears in the database at the number of times corresponding to the expression frequency. Will do. Therefore, by calculating the frequency in this way, it is theoretically possible to know the relative relationship between gene expression levels in biological samples without using a microarray. That is, if the cDNA library of the present invention is prepared, genome information is known by examining the appearance frequency of the same sequence by comprehensive sequence analysis. Whether or not there is a relative relationship between gene expression levels.
  • a database based on the library created in this way is called an expression sequence tag [EST] database.
  • EST expression sequence tag
  • the [Directed] EST library database which maintains the relative relationship of gene expression levels with high reproducibility, can be used for species that are difficult to apply to microarrays, that is, for the majority of species that still know the entire genome sequence.
  • the relative amount of gene expression is known at the single cell level without using a microarray, it is very effective in that respect.
  • analysis that takes into account differences among individuals, such as genetic polymorphisms, becomes possible at the single cell level.
  • the present invention provides a kit for preparing a cDNA population for application to a microarray.
  • the kit of the present invention comprises
  • a second primer comprising poly T and an optional additional nucleic acid sequence Y for preparing double-stranded DNA, wherein the attached nucleic acid sequences X and X in the first primer and the second primer, respectively Y are different in sequence from each other, and
  • a primer set that also has a combination ability of a third primer consisting of an additional nucleic acid sequence X and a promoter sequence that binds to its 5 ′ side, and a second primer, or
  • a third primer composed of an additional nucleic acid sequence Y and a promoter sequence that binds to the 5 ′ side thereof, and a primer set that also has the ability to combine the first primer.
  • the kit of the present invention may further include various reagents for amplifying nucleic acids.
  • primers for control experiments can be included.
  • kits of the present invention examples include All reagents, Spike RNA, ES cell-derived RNA (for control experiments), primers for cDNA amplification (Vl [dT] 24, V3 [dT] 24, T7V1), DNA purification kit (Qiagen), controller Primers for real-time PCR for roll experiments (Gapdh, Oct4, Nanog, Sox2, Ezh2, Yyl, Eras, Tiar gene specific primers).
  • the kit of the present invention preferably prepares a cDNA population that retains the relative relationship of the gene expression level in a biological sample and also has the ability to produce amplified products.
  • the kit of the present invention is a method for preparing a nucleic acid population that also has an amplification product ability and retains the relative relationship of gene expression levels in a biological sample of the present invention, a nucleic acid amplification method, and biology. Can be used to carry out a method for preparing a nucleic acid library that retains the relative relationship of gene expression levels in a target sample.
  • RNAguard RNase Inhibitor (trade name) (Amersham), 31.2 U / ⁇ 1 1.0 Primer VI (dT) 24 , 10 ng / ⁇ 1 2.0 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), 2.5 mM 2.0 Spike RNA mixture ( (Lys 1000, Dap 100, Phe 20, and Thr 5 copies / 21.0 II 1)
  • RNAguard RNase Inhibitor (trade name) (Amersham), 31.2 U / 1 1.0
  • Step 2 Reverse transcription
  • RT mixture ((2) in Table 1) 0.3 1 was added to the sample prepared in step 1 and allowed to react at 50 ° C for 5 minutes (hot water bath). Next, the reaction was stopped by treating at 70 ° C. for 10 minutes (hot water bath), and then centrifuged in a table centrifuge and placed on ice for 1 minute.
  • exonuclease I mixture ((3) in Table 1) to the sample prepared in step 2, react at 37 ° C for 30 minutes, and then treat at 25 ° C at 80 ° C for 25 minutes. (PCR machine). The processed product was centrifuged and placed on ice for 1 minute.
  • Process 4 Poly (A) tailing
  • TdT mix ((4) in Table 1) 61 to the sample prepared in step 3 and react at 37 ° C for 15 minutes (water bath), then treat at 70 ° C for 10 minutes to stop the reaction. (Water bath). Subsequently, it was centrifuged with a tabletop centrifuge and placed on ice for 1 minute.
  • Step 5 Addition of primer V3 (dT) and PCR amplification
  • reaction product poly-A tailed reverse transcription product prepared in step 4 was poured into 4 thin-wall 200 ⁇ 1 PCR tubes at a rate of 3 ⁇ l.
  • PCR mixture I (1 in Table 1 (5)) 20 1 to each tube, and perform DNA elongation reaction for 1 cycle at 95 ° C for 3 minutes, 50 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes. Left for 1 minute and centrifuged for 15 seconds in a tabletop centrifuge.
  • PCR mixture 11 ((6) in Table 1) 20 1 to each tube, then add mineral oil to each tube, 95 ° C for 30 minutes, 67 ° C for 1 minute, 72 ° C for 3 minutes (PCR amplification reaction was performed 20 cycles under the condition of 6 seconds for each cycle.
  • Step 7 The PCR product in each tube obtained in step 5 was mixed.
  • the smear DNA (all of 300 bp or more) was excised (approximately 0.3-0.5 g) and purified with the Qiagen gel purification kit.
  • the final cDNA product yielded approximately 10 ⁇ g of unlabeled RNA when the 10 ⁇ l scale ⁇ 7 reaction using Ambion MEGA Script was performed for 2 hours (4 ⁇ 1 was used as a cage).
  • Mouse ES cell-derived RNA was diluted to the level of 1 cell (approximately 10 picograms), and cDNA was synthesized and amplified using the AL1 method (Non-patent Document 3) and the V1V3 method of the present invention.
  • Invention VI V3 is the method described in Example 1. In all experiments, amplification was performed from RNA diluted from the same unamplified RNA (hereinafter referred to as the original RNA). Six independent experiments were conducted for each method.
  • the relative expression level of each gene in the amplified cDNA population that is, the amount of amplified cDNA derived from each gene product mRNA, is diluted or amplified, and the original ES cell-derived RNA (1 microgram) Compared with the relative expression level of each gene, the difference in deviation from the original RNA AL1 method and V1V3 method were examined.
  • RNA derived from ES cells it is considered that thousands to 10,000 genes are expressed. Eight representative genes (Gapdh, Oct4, Sox2, Ezh2, Yyl, Nanog, Eras, Tiar) were selected from them, and the expression level of each gene in the original RNA and amplified cDNA was determined by real-time PCR (reference: (http: ⁇ www.takara-bio.co.jp/prt/pdfs/prtl.pdf) The relative amount was calculated by standardizing the expression level of each gene using Gapdh.
  • the horizontal axis plots the relative expression level of each gene normalized by Gapdh in the original RNA (fold change from Gapdh, that is, the force that is the multiple expression level of Gapdh).
  • the direction of the axis was set so that the left force was also directed to the right and the relative expression level was reduced.
  • the expression level of Oct4 is close to that of Gapdh (approximately 1 / 1.2), and the expression level of Tiar S is the least (approximately 1/650). In other words, by selecting the above eight genes, gene expression levels that range approximately 650 times can be examined.
  • the black circles and X indicate the average values of the original gene deviations of the relative gene expression levels in the cDNA populations amplified by the V1V3 method and AL1 method, respectively. The bar indicates the standard deviation in each gene expression level.
  • the deviation from the original for all genes is within the range of 0.5 times (1 in 2 minutes) to 0.25 times (1/4).
  • V1V3 method is much smaller than the AL1 method! / And fits in the width! /.
  • FIG. Figure 3 shows how much the relative relationship between the original gene expression levels is maintained during the cDNA amplification process.
  • the signal intensity of each gene in the original RNA is plotted on the horizontal axis
  • the signal intensity of each gene in the amplified cDNA population is plotted on the vertical axis. Lines corresponding to the magnification change from the original, 2x, 5x, 10x, 1 / 2x, 1 / 5x, and 1 / 10x are shown on the graph.
  • RNA from ES cells was diluted to the level of one cell, two of which were selected and amplified independently in separate tubes, resulting in cDNA population # 1 and cDNA population # 2. For these, GeneChip microarray analysis was performed.
  • the amplified cDNA population # 1 is plotted on the horizontal axis
  • the amplified cDNA population # 2 is plotted on the vertical axis. Over 90% of all genes were in the range of 1/2 to 2 times. The R2 value between the signal intensities of the two cDNA populations was 0.92.
  • the Spike method is a method of adding positive RNA (Spike RNA) that does not exist on the mouse genome to a reaction system such as cDNA synthesis 'amplification' labeling for positive control. Since Affymet rix GeneChip provides probes targeting the genes lys, dap, phe, thr, trp derived from Bacillus subtilis, these genes can be used as Spike RNA. Since these genes are derived from the prokaryotic Bacillus subtilis, there is no poly A at the 3 'end, and as such cannot be amplified with our cDNA amplification system.
  • Lys, Dap, Phe, and Thr RNA artificially labeled with poly A at the 3 'end were added to 1000, 100, 20, 5 copies per cell, respectively. Then, cDNA was synthesized and amplified together with ES cell-derived RNA.
  • the horizontal axis represents the number of copies copied, and the vertical axis represents the signal intensity on the microarray.
  • Black diamonds indicate unamplified spike RNA added to the original RNA (5 g, approximately 5 ⁇ 10 5 cells) (added for 5 ⁇ 10 5 cells).
  • Open squares, diamonds, triangles, and X indicate Spike RNA added to ES cell-derived RNA diluted to 1 cell level. These Spike RNAs are added to one cell. Lys, Dap and Phe RNA were amplified with good reproducibility Thr RNA (5 copies / cell) was not amplified with good reproducibility. The R2 coefficient between Lys, Dap and Phe RNA copy number and signal intensity was 0.93.
  • Step 9 of Example 1 The product 1 obtained in Step 9 of Example 1 was size-fractionated by 2% agarose gel electrophoresis, and then the DNA was visualized by staining with ethidium bromide to obtain a DNA having a size of about 300 bp or less.
  • the gel containing the portion was cut out using a commercially available force razor, and DNA was extracted from the gel fragment using a Qiagen gel extraction kit.
  • OxExTaq buffer (Takara 20.0 ⁇ 1 2.5 mM each dNTP (dATP, dCTP, cGTP, dTTP) (Takara) 20.0 ⁇ 1 H20 141.2 ⁇ ⁇
  • the PCR temperature conditions are:
  • RNA population thus obtained is very suitable for use in, for example, the Aifymetrix oligonucleotide microarray GeneChip series.
  • the present invention can be used in the fields of biochemical research, medicine, food, substance production, and the like.

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Abstract

　本発明は、生物学的試料から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ポリＴと任意の付加核酸配列Ｘとからなる第１のプライマー、およびポリＴと任意の付加核酸配列Ｙとからなる第２のプライマーを用いて（ここに、第１のプライマーおよび第２のプライマーにおけるそれぞれ付加核酸配列ＸおよびＹは互いに配列が異なっている）、ＰＣＲ増幅を行うことを特徴とする。

Description

明 細 書
核酸配列増幅方法
技術分野
[0001] 本発明は、定量的マイクロアレイ解析を可能にする核酸配列増幅方法、詳細には 少数の細胞、好ましくは単一細胞レベルでの定量的マイクロアレイ解析を可能にする 核酸配列増幅方法に関する。
背景技術
[0002] 生命現象はきわめて多くの遺伝子産物が複雑に相互作用することで成立するシス テムであり、これを本質的に理解するためには、各遺伝子産物の発現動態を正確に 把握することが出発点として必須である。システマティックな遺伝子発現解析の手段 としてマイクロアレイによる解析が盛んに行われている。マイクロアレイ解析は、スライ ドガラス等の支持体上に数千力 数万個のオリゴヌクレオチドスポットを作成し、解析 する細胞または組織由来の RNAから調製した標的をハイブリダィゼーシヨンさせ、得 られたハイブリッド形成の強度を指標にして、各遺伝子の転写量を網羅的に測定す る方法である。これは、生物の持つ全ての遺伝子の動的挙動を効率的かつ定量的に 計測する手法として有用であり、様々な生命現象における遺伝子発現情報を与え、 ひいては、医学、食品分野あるいは物質生産分野での効果的な応用へと広がる第 一歩となり得る。
[0003] 遺伝子発現量を網羅的かつ定量的に測定できる、現在主流となりつつある Alfymet rix社のオリゴヌクレオチドマイクロアレイ GeneChipシリーズでは、まず細胞ある!/、は組 織由来の総 mRNAを逆転写して cDNAを調製し、次いで T7 RNAポリメラーゼを用いて 試験管内転写反応を行いラベルイ匕した cRNA (アンチセンス鎖)を合成し、その合成 c RNAをアレイにハイブリダィズする。しかしながら、この技術は、総 mRNAを抽出して標 的を作製するために、 1000から 10万個程度の細胞を用意しなければならない。
[0004] 人間を含めた多細胞生物の発生の過程や、神経、血球系、体性幹細胞、癌細胞な どにお ヽては、きわめてその数が少な 、極微少量の細胞群が重要な機能を果たして おり、究極的には 1個の細胞、即ち単一細胞レベルでの解析が不可欠であると考え られる。この単一細胞レベルでの解析において重要な点は、定量的マイクロアレイ解 祈のために、マイクロアレイ解析に適用可能なレベルにまで標的核酸配列を増幅す る必要があり、また、その増幅は、単一細胞における遺伝子発現量の相対的な関係 を可能な限り保持したままの増幅であることが必要な点である。
単一細胞レベルの極微少量の mRNAから cDNAを合成し、遺伝子発現量の相対的 な関係を保持したまま増幅する手法は、 90年に G.Bradyらによって初めて提唱され、 改善が続けられている（非特許文献 1、 2)。また 03年にはこの手法を用いて増幅した cDNAを蛍光ラベルして行ったマイクロアレイ実験が報告された (非特許文献 3)。しか しながら、これらの技術には以下に述べる欠点があり、いまだ単一細胞レベルでの定 量的マイクロアレイ解析は実用化されて 、な 、。
1)通常の PCR法による遺伝子発現量の相対的関係の歪み
PCR法は、铸型を倍また倍にすることによって、 DNAを指数関数的に増幅させる手 法である。従って異なる遺伝子産物間のわずかな増幅効率の差異力 最終的には何 倍もの差となって、遺伝子発現量の相対的な関係を大きくひずませてしまう。このこと は特に、発現量が比較的少ない遺伝子産物について深刻であり、その検出感度が 相対的に大きく引き下げられてしまう要因になっている。通常の PCR法による増幅過 程における遺伝子発現量のこのような相対的関係の歪みは「システマティックな誤差 (系統誤差)」と呼ばれる。
[0005] 2)各遺伝子発現量の増幅過程でのばらつき
PCR法のもつ指数関数的増幅と 、う特性ゆえに、増幅過程におけるランダムな誤差 も、やはり指数関数的に増幅してしまう。増幅の各ステップで起きるわず力な誤差が 最終的には何倍もの差となり、増幅後に各遺伝子産物の発現量を見積もる際、信頼 性を著しく下げる重大な要因となっている。いわゆる、各遺伝子発現量の増幅過程で のランダムな誤差である。
[0006] 近年になって、 PCR法の持つ上記欠点を克服するため、単一細胞レベルの極微少 量 mRNAから cDNAの一次鎖を合成する際（一次鎖 cDNA合成時）、 3'側 T7プロモー ターを付加して、試験管内転写反応による増幅 (線形増幅)を行う方法が報告され（ 非特許文献 4)、この原理を利用したキットが商品化された (キット販売元: Epicentre 社)。し力し、このキットを利用して、単一細胞レベルの極微少量の mRNAを遺伝子発 現量の相対的な関係を保持したまま増幅するオリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験を 行うには、単一細胞から RNAを抽出する作業が必要であり、このレベルの極微少量 RNAを抽出 '精製することは通常は現実的でなぐこの作業の時点で低コピー mRN Aをロスしてしまう可能性を否定できない。また、線形増幅は、核酸配列の増幅効率 が PCR法に比べ格段に劣るために得られる増幅産物の量が少なぐ現状では一度の 増幅実験で一度のマイクロアレイ実験し力行うことが出来ず、線形増幅では増幅産物 が必然的にラベル化 RNAであるため、 DNAに比べて試料の保存が困難であり、増 幅産物がラベル化 RNAであるがゆえに増幅の成否を確認するための遺伝子特異的 PCRの前に、再び逆転写反応を行わねばならない不便さがあり、さらには RNAの合 成と精製を繰り返す煩雑な実験作業ゆえに要求される高度な手技が必要なことから 、実際の単一細胞レベルの解析には不向きであると思われる。
非特許文献 1 : Brady, G., M. Barbara, et al. (1990). "Representative in vitro cDNA a mplification from individual hemopoietic cells and colonies." Methods Molec. Cell. Bi ol. 2(17-25).
非特許文献 2 : Iscove, N. N.， M. Barbara, et al. (2002). "Representation is faithlully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub— picogram quantities of m RNA." Nat Biotechnol 20(9): 940—3.
非特許文献 3 : Tietjen, I., J. M. Rihel, et al. (2003). "Single— cell transcriptional analy sis of neuronal progenitors." Neuron 38(2): 161—75.
非特許文献 4 : Kamme et.al, Single-Cell Microarray Analysis in Hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity, The Journal of Neuroscienc e, May 1, 2003, 23(9):3607
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
このように、これまでの核酸配列増幅方法は、 Aifymetrix社を含む、大多数のオリゴ ヌクレオチドマイクロアレイ実験の標準プロトコルに適用できる水準には到達していな いため、より効率的かつ簡便な核酸配列の増幅方法が求められる。 課題を解決するための手段
[0008] 上記のとおり、 Aifymetrix社のオリゴヌクレオチドアレイ GeneChipシリーズへ増幅産 物を応用する場合、その増幅手法は効率性や簡便性の点カゝら PCR法を採用するの が適切である。しかし、この場合、 PCR法の増幅によって指数関数的に増加する上記 の重大な誤差を避ける必要がある。
そこで、本発明では以下の手法により、単一細胞レベルでの極微少量の RNAから c
DNAを合成し、遺伝子発現量の相対的な関係を可能な限り保持したままで増幅する ことによって、定量的マイクロアレイ解析を可能にした。
[0009] 即ち、本発明は、
(1) 生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持している増幅産 物からなる核酸集団を調製する方法であって、
(a)生物学的試料、具体的には真核生物の細胞、好ましくは 1個から数個の細胞、よ り好ましくは 1個の細胞力ゝら単離した mRNAを铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配 列 Xとからなる第 1のプライマー、好ましくは配列番号 1に示す核酸配列を有する第 1 のプライマーを用 、て逆転写することにより一次鎖 cDNAを調製し、好ましくは逆転 写反応を 5— 10分行い一次鎖 cDNAを調製し、あるいは長さがほぼ均一である一次 鎖 cDNAを調製し、
(b)工程 (a)の反応の後、残存する第 1のプライマーを失活させ、好ましくは残存する 第 1のプライマーをェキソヌクレアーゼ Iにて分解して失活させ、
(c)工程 (a)により得られた一次鎖 cDNAをポリ Aテーリング反応に付し、次いでこれ を铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2のプライマー、好ましくは 配列番号 2に示す核酸配列を有する第 2のプライマーを用いて二次鎖である 2本鎖 DNAを調製し、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーにおけるそれぞれ 付加核酸配列 Xおよび Yは互いに配列が異なっており、
(d)第 1のプライマーを添カ卩し、 PCR増幅を行い、好ましくは PCR増幅を 10— 30サイ クル行い、さらに好ましくは工程 (c)により得られた二次鎖 2本鎖 DNAを 3— 10個に 小分けし、それぞれ PCR増幅を行い、次いでそれぞれの増幅産物を一緒にまとめ、 より好ましくはアニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけて PCR増幅を行い、次 いで
(e)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセットを用いて PCR増幅を行 、、好まし くは PCR増幅を 4 10サイクル行い、より好ましくはアニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけて PCR増幅を行う方法：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、好ましくは配列番号 3に示す核酸配列を有する第 3のプライマー、および第 1 のプライマーの組み合わせからなるプライマーセット；
[0010] 好ましくは、 (f) X@ (e)により得られた核酸集団に RNAポリメラーゼおよびラベル 化したヌクレオチド 3燐酸を適用し、ラベル化された RNAからなる核酸集団を調製す る工程、をさらに含む方法；
本発明の方法により調製される、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な 関係を保持している増幅産物力 なる核酸集団であって、増幅産物がほぼ均一の長 さを有している核酸集団；
該核酸集団をマイクロアレイに適用する、定量的マイクロアレイ解析方法； 配列番号 1に示す核酸配列を有する核酸分子、配列番号 2に示す核酸配列を有 する核酸分子、配列番号 3に示す核酸配列を有する核酸分子、および配列番号 1に 示す核酸配列を有する核酸分子、および配列番号 2に示す核酸配列を有する核酸 分子からなるプライマー対；
[0011] (2) 以下の工程を含む、核酸配列の増幅方法：
(a)生物学的試料、具体的には真核生物の細胞、好ましくは 1個から数個の細胞、よ り好ましくは 1個の細胞力ゝら単離した mRNAを铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配 列 Xとからなる第 1のプライマー、好ましくは配列番号 1に示す核酸配列を有する第 1 のプライマーを用 、て逆転写することにより一次鎖 cDNAを調製し、好ましくは逆転 写反応を 5— 10分行い一次鎖 cDNAを調製し、あるいは長さがほぼ均一である一次 鎖 cDNAを調製し、
(b)工程 (a)の反応の後、残存する第 1のプライマーを失活させ、好ましくは残存する 第 1のプライマーをェキソヌクレアーゼ Iにて分解して失活させ、
(c)工程 (a)により得られた一次鎖 cDNAをポリ Aテーリング反応に付し、次いでこれ を铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2のプライマー、好ましくは 配列番号 2に示す核酸配列を有する第 2のプライマーを用いて二次鎖である 2本鎖 DNAを調製し、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーにおけるそれぞれ 付加核酸配列 Xおよび Yは互いに配列が異なっており、
(d)第 1のプライマーを添カ卩し、 PCR増幅を行い、好ましくは PCR増幅を 10— 30サイ クル行い、さらに好ましくは工程 (c)により得られた二次鎖 2本鎖 DNAを 3— 10個に 小分けし、それぞれ PCR増幅を行い、次いでそれぞれの増幅産物を一緒にまとめ、 より好ましくはアニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけて PCR増幅を行い、次 いで
(e)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセットを用いて PCR増幅を行 、、好まし くは PCR増幅を 4 10サイクル行い、より好ましくはアニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけて PCR増幅を行う方法：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、好ましくは配列番号 3に示す核酸配列を有する第 3のプライマー、および第 1 のプライマーの組み合わせからなるプライマーセット；
[0012] 好ましくは、 (f) X@ (e)により得られた核酸集団に RNAポリメラーゼおよびラベル 化したヌクレオチド 3燐酸を適用し、ラベル化された RNAからなる核酸集団を調製す る工程、をさらに含む方法；
より好ましくは、核酸配列が、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関 係を保持して ヽる増幅産物カゝらなる方法；
[0013] (3)生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持して 、る核酸ライブ ラリーの調製方法であって、
(a)生物学的試料、具体的には真核生物の細胞、好ましくは 1個から数個の細胞、よ り好ましくは 1個の細胞力ゝら単離した mRNAを铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配 列 Xとからなる第 1のプライマー、好ましくは配列番号 1に示す核酸配列を有する第 1 のプライマーを用 、て逆転写することにより一次鎖 cDNAを調製し、好ましくは逆転 写反応を 5— 10分行い一次鎖 cDNAを調製し、あるいは長さがほぼ均一である一次 鎖 cDNAを調製し、
(b)工程 (a)の反応の後、残存する第 1のプライマーを失活させ、好ましくは残存する 第 1のプライマーをェキソヌクレアーゼ Iにて分解して失活させ、
(c)工程 (a)により得られた一次鎖 cDNAをポリ Aテーリング反応に付し、次いでこれ を铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2のプライマー、好ましくは 配列番号 2に示す核酸配列を有する第 2のプライマーを用いて二次鎖である 2本鎖 DNAを調製し、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーにおけるそれぞれ 付加核酸配列 Xおよび Yは互いに配列が異なっており、
(d)第 1のプライマーを添カ卩し、 PCR増幅を行い、好ましくは PCR増幅を 10— 30サイ クル行い、さらに好ましくは工程 (c)により得られた二次鎖 2本鎖 DNAを 3— 10個に 小分けし、それぞれ PCR増幅を行い、次いでそれぞれの増幅産物を一緒にまとめ、 より好ましくはアニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけて PCR増幅を行い、次 いで
(e)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセットを用いて PCR増幅を行 、、好まし くは PCR増幅を 4 10サイクル行い、より好ましくはアニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけて PCR増幅を行う方法：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、好ましくは配列番号 3に示す核酸配列を有する第 3のプライマー、および第 1 のプライマーの組み合わせからなるプライマーセット；
[0014] 好ましくは、 (f) X@ (e)により得られた核酸集団に RNAポリメラーゼおよびラベル 化したヌクレオチド 3燐酸を適用し、ラベル化された RNAからなる核酸集団を調製す る工程、をさらに含む方法；
[0015] (4)マイクロアレイに適用するための cDNA集団を調製するキットであって、 (a)生物学的試料、具体的には真核生物の細胞、好ましくは 1個から数個の細胞、よ り好ましくは 1個の細胞力 単離した mRNA力 一次鎖 cDNAを調製するための、ポ リ Tと任意の付加核酸配列 Xとからなる第 1のプライマー、好ましくは配列番号 1に示 す核酸配列を有する第 1のプライマー、
(b)第 1のプライマーを失活させるための試薬、好ましくはェキソヌクレアーゼ I、
(c) 2本鎖 DNAを調製するための、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2の プライマー、好ましくは配列番号 2に示す核酸配列を有する第 2のプライマー、ここに 、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーにおけるそれぞれ付加核酸配列 Xおよび Yは互いに配列が異なっており、
(d)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセット：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、好ましくは配列番号 3に示す核酸配列を有する第 3のプライマー、および第 1 のプライマーの組み合わせからなるプライマーセットを含むキット、
好ましくは、 cDNA集団が、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係 を保持して!/、る増幅産物力もなるキット；に関する。
発明の効果
[0016] 本発明は、簡便な PCR法による、オリゴヌクレオチドマイクロアレイへ直接応用できる 、信頼性の高い、定量的な極微少量 cDNA増幅技術を提供する。本発明方法では、 一日の実験で単一細胞力もマイクロアレイ実験に十分な量の铸型 cDNAを合成 '増 幅することができる。従来法と本発明方法の比較を、いくつかの遺伝子産物をプロ一 ブにした、リアルタイム PCR実験を用いて行い、システマティック誤差 (系統誤差）、ラ ンダム誤差ともに疑う余地もなく著しく改善されていることが確認された。さらに、本発 明方法を用いて行ったマイクロアレイ実験では、従来法よりも遥かに改善された、再 現性の良い定量的な単一細胞レベルでの解析が可能となったことが確認された。 図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は、本発明の核酸配列増幅方法を説明するチャート図である。 [図 2]図 2は、従来の cDNA増幅方法および本発明増幅方法による遺伝子発現量を、 系統誤差およびランダム誤差について比較したグラフである。
[図 3]図 3は、オリジナル RNAの量および本発明増幅方法による遺伝子発現量を、マ イクロアレイ上でのシグナル強度について比較したグラフである。
[図 4]図 4は、本発明増幅方法により独立に増幅した二つの遺伝子発現量を、マイク ロアレイ上でのシグナル強度について比較したグラフである。
[図 5]図 5は、本発明増幅方法による遺伝子産物のコピー数とマイクロアレイ上のシグ ナル強度との関係を示すグラフである
[図 6]図 6 (a)は、ゲル電気泳動による精製 (ゲル精製)の前後において相対的遺伝 子発現量が維持されて!ヽることを示すグラフである。相対的遺伝子発現量は ABI社 のリアルタイム PCRを用いて定量した。縦軸はゲル精製前、横軸はゲル精製後の相 対的遺伝子発現量である。遺伝子発現量は Cycle of threshold (Ct値)で示した。図 6 (b)は、試験管内転写反応後における相対的遺伝子発現量の変化を示すグラフであ る。白抜きの四角はゲル精製後直接試験管内転写反応を行った場合を示す。黒四 角はゲル精製後 1サイクル PCRを行った後、試験管内転写反応を行った場合を示す 。横軸はゲル精製後の DNAにおける相対的遺伝子発現量、縦軸は試験管内転写 反応後の RNAにおける相対的遺伝子発現量である。 RNAについては、逆転写反 応によって DNAに変換した後、リアルタイム PCRにより相対的遺伝子発現量を定量 した。 1サイクルの PCRにより、相対的遺伝子発現量の維持が著しく改善された。 発明を実施するための最良の形態
(1) 生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持している増幅産 物からなる核酸集団を調製する方法
本発明は、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持している 増幅産物からなる核酸集団を調製する方法、およびその方法により得られた核酸集 団を提供する。
本発明において、「生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持し ている増幅産物」とは、生物学的試料における遺伝子産物群全体の構成がほぼ保持 されて 、る増幅産物であって、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ実験の標準プロトコル に適用できる水準、即ちマイクロアレイ解析に適用可能なレベルの産物量が確保さ れて!、る増幅産物を意味する。
本発明において「生物学的試料」とは、 mRNAの 3'末端にポリ Aを持つ生物種、例 えばヒトゃマウスなどの哺乳類を含む動物、植物、菌類、原生生物などの真核生物の 細胞を意味する。本発明は特に、生物学的試料として神経系もしくは血球系由来の 細胞、または体性幹細胞または癌細胞への応用が期待される。
生物学的試料としての細胞の数は特に制限されな 、が、本発明が生物学的試料 における遺伝子発現量の相対的な関係を保持したまま再現性良く増幅可能である点 を考慮すると、細胞の数は 100個以下、数十個、 1個から数個、究極には 1個の細胞 レベルに応用可能である。
「定量的マイクロアレイ解析」とは、生物学的試料における遺伝子発現量をその発 現量に応じた、例えば蛍光強度などの標識強度に反映させて表示できるマイクロア レイ解析である。マイクロアレイ解析はサイズの小さなガラス板支持体に遺伝子断片 ( プローブ)を高密度に固定し、そこに、遺伝子発現を解析する RNA (標的）を蛍光標 識してハイブリダィズさせ、蛍光強度も基づき遺伝子発現量を調べる方法である。プ ローブとして固定する遺伝子断片の数を増やすことにより、より網羅的な遺伝子発現 の解析が可能となる。
[0019] 本発明方法の概要を示すと次の通りになる。第 1のプライマーで一次鎖 cDNAをつ くり、第 1のプライマーのうち未反応プライマーを失活させ、 TdTでポリ A付加し、第 2 のプライマーで二次鎖をつくり、再び第 1のプライマーを加えて PCR増幅する。その産 物に対して第 3のプライマーと第 2のプライマーを用いてさらに PCR増幅する。その後 、所望により、明らかに mRNA由来ではない低分子量側の副産物を除去する。
[0020] 本発明の方法の概要を図 1に示す。図 1はあくまでも本発明の方法の一例につい ての説明であり、当業者は適宜変更を加えて本発明を実施することができる。以下に おいて本発明方法の各工程について図 1を参照しつつ詳細に説明する。
[0021] (a)—次鎖 cDNAの調製
生物学的試料力ゝら単離した mRNAを铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 と 力もなる第 1のプライマーを用いて逆転写することにより一次鎖 cDNAを調製する。 以後の PCR反応における増幅効率が铸型 cDNAの長さに依存しないように、好まし くは逆転写反応の時間を 5— 10分、より好ましくは約 5分間にまで短縮すればよい。 これにより、全長の長い mRNAについて、長さのそろった一次鎖 cDNAが合成され る。「一次鎖 cDNAの長さがほぼ均一」とは、このような全長の長い mRNAについて 長さのそろった一次鎖 cDNAが得られることを意味し、短 ヽ cDNAの存在を排除す るものではない。
[0022] (b)残存する第 1のプライマーを失活
工程 (a)の反応の後、残存する第 1のプライマーを分解その他の方法により除去す る工程である。典型的にはェキソヌクレアーゼ Iまたはェキソヌクレアーゼ Tにより残存 プライマーを分解すればよい。あるいは、残存プライマーの 3'側をアルカリホスファタ ーゼ等により修飾することにより、失活させることもできる。
これまでの方法では、増幅の過程で生じる副産物が全体の 30%以上を占めてしまう (例えば、非特許文献 2参照)。我々はこの副産物が、一次鎖 cDNA合成での残存プ ライマーが、意図しない経路で増幅されたものであることを見いだし、それを失活させ ることにより、副産物生成を最小限に抑えた。
[0023] (c)ポリ Aテーリング反応、および第 2のプライマーを用いた二次鎖 2本鎖 DNAの調 製
工程 (a)により得られた一次鎖 cDNAをポリ Aテーリング反応に付し、次いでこれを 铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2のプライマーを用いて二次 鎖である 2本鎖 DNAを調製する。
ここに使用する第 2のプライマーと工程 (a)にて用いる第 1のプライマーとは、相互 に核酸配列が異なる力 一定の同一性を有し、かつプロモーター配列を含まないこと を特徴とする。
従来の極微少量 cDNA増幅技術では、 cDNAの 3 '側と 5，側に対して同一のプライ マーを用いるため、 T7プロモーターを付カ卩して cRNAだけを合成することができな!/ヽ 。また、両側からラベル化 RNAを合成したり、 2本鎖 cDNAをそのままラベル化して アレイにハイブリダィズしても、センス鎖とアンチセンス鎖が互いにハイブリダィズする ため、アレイ上のオリゴヌクレオチドに定量的にノ、イブリダィズするとは限らず、オリゴ ヌクレオチドアレイの優れた再現性と定量性が深刻にスポイルされてしまう。
試行錯誤の後、互いに配列が異なり、相互に類似したプライマーセットがより効率 的な増幅を行うことを見出した。
[0024] 以下、第 1および第 2のプライマーについて、より詳細に説明する。
工程 (a)にて用いる第 1のプライマー： ポリ T+任意の付加核酸配列 X、および第 2 のプライマー： ポリ T+任意の付加核酸配列 Y、における付加核酸配列 Xおよび Υ は、互いに配列が異なる。 cDNAの 3'側と 5'側に対して異なるプライマーを用いるこ とによって、以後の PCR増幅において 3'側と 5'側を区別できる方向性をつけること ができ、これにより、以後の工程において cDNAの 3，側にのみ T7プロモーターを付 加することがはじめて可能になった。増幅の初めから T7プロモーターを含むプライマ 一を用いると、システマティック誤差 (系統誤差)とランダム誤差の両方が著しく増加 する。この意味において、付加核酸配列 Xおよび Yはプロモーター配列を含んではな らない。
[0025] 付加核酸配列 Xおよび Yはさらに、 Xおよび Yにおける共通配列の Tm値力 第 1お よび第 2のプライマーにおける Tm値それぞれよりも低くなるように共通配列を選択し 、かつ可能な限りその値が離れるようにする。そうすることで、以後の PCR反応におけ るアニーリングの際に第 1および第 2のプライマーが互いに別の部位にァニールして しまう望ましくないクロスアニーリングを防止できる。換言すれば、共通配列の Tm値 は、第 1および第 2のプライマーをアニーリングする以後のアニーリング温度を超えな いように選択する。 Tm値とは、 DNA分子の半数力 相補鎖とァニールするときの温 度である。なお、アニーリング温度はプライマーの対合を可能にする温度に設定し、 通常、プライマーの Tm値よりも低い温度にする。
[0026] 好ましくは、第 1のプライマーと第 2のプライマーの核酸配列は 77%以上、より好ま しくは 78%以上、さらに好ましくは 80± 1%、最も好ましくは 79%の同一性を有する 。配列同一性の上限は上記の通り、両プライマーの共通配列の Tm値がアニーリング 温度を超えない上限の0 /0である。あるいは、第 1のプライマーと第 2のプライマーの核 酸配列は、付加核酸配列 Xおよび Yが 55%以上、より好ましくは 57%以上、さらに好 ましくは 60± 2%の同一性を有している両配列、と規定することもできる。上限は、付 加核酸配列 Xおよび Yにおける共通配列の Tm値力 PCR反応におけるァニーリン グ温度を超えな 、上限の％である。
[0027] 使用する第 1および第 2のプライマーにおける付加核酸配列 Xおよび Yは好ましく は、それぞれパリンドローム配列を有する。具体的には制限酵素部位、例えば Ascl、 BamHI, Sail, Xhol部位、その他 EcoRI, EcoRIV, Nrul, Notlなど、ほとんどすべての制 限酵素部位はパリンドローム配列を有して 、るので、これらの配列を有することができ る。従って、第 1および第 2のプライマーの具体例として、配列番号 1に示す核酸配列 を有する核酸分子および配列番号 2に示す核酸配列を有する核酸分子のプライマ 一対が挙げられる。
[0028] 第 1および第 2のプライマーの核酸配列における上記同一性は、遺伝子発現量の 相対的関係を保持する増幅が良好でな力つた次の実験例に基づく。
例 1 : 3'側プライマーとして T7プロモーター、 5'側プライマーとして T7プロモーター の配列の 5'力も 3'の順序を逆にした配列（T7_reverse)を用いた場合、これら 2つのプ ライマーは塩基組成が同一で Tm値も同一だが、遺伝子発現量の相対的関係は崩 れていた。
例 2： プライマーの組み合わせで VI (配列番号 1)と IDT (Saito, H. Kubota, M.Rob erts, R. W.Chi, Q.Matsunami, H. (2004). RTP family memoers induce lunctional exp ression of mammalian odorant receptors Cell 119 (5): 679-91.、 TATAGAATTCGC GGCCGCTCGCGA(dT)24)を用いた場合、これら二つのプライマーは全体で 74. 5 %の配列同一性をもって 、たが、これも遺伝子発現量の相対的関係が崩れて 、た。 例 3 : V3(dT)24 (配列番号 3)の配列の内、制限酵素部位 AscI (GGCGCGCC)を N otl (GCGGCCGC)に変えたもの（V3NotI(dT)24)を Vl(dT)24と組み合わせて行った 場合、これら二つのプライマーは全体で 76. 9%の同一性を持つが、やはり遺伝子 発現量の相対的関係が崩れていた。
このようにして、最終的に、全体の約 80%近くが同一の配列力もなるプライマーセット によって、方向性のある増幅が誤差を抑制しながら効率よくおこなわれることを確認し た。
[0029] さらに、用いる第 1および第 2のプライマーは、通常の PCRに使うよりも高い Tm値を 持って 、るプライマーであることが好まし 、。通常の PCRに使うよりも高!、Tm値を持 つプライマーを用いることにより、アニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけるこ とができ、それにより非特異的なアニーリングを抑制できる。
アニーリング温度は典型的には 55°Cであるので、通常の PCRの使う Tm値は 60°C である。そこで、本発明に用いるプライマーのアニーリング温度は 60°C以上 90°C未 満、好ましくは約 70°C、最も好ましくは 67°Cである。
[0030] (d) PCR増幅
次に、第 1のプライマーをさらに添加し、 PCR増幅を行う。
システマティックな誤差 (系統誤差)を抑えながら DNAを効率よく増幅することができ る、適切な PCRサイクル数を決定する必要がある。 1細胞レベルにまで希釈した ES 細胞由来の RNAを出発試料として、 PCRを 4 30サイクル行い、相対的な発現量 が数倍力 数百倍異なるいくつかの遺伝子産物の相対的な量を比較した実験を行つ た。その結果、それらの相対的関係が保持されながら効率的に増幅される最大のサ イタル数として、 24サイクルが決定された。ただし、このサイクル数は、 PCRに用いる 溶媒、温度、プライマー等により変動し得るので、本発明においては PCR増幅を 10 30サイクル、好ましくは約 20サイクル行う。
工程（d)において、 PCR増幅におけるアニーリング温度を、用いるプライマーの Tm 値に近づけることにより、非特異的なアニーリングを抑制することができる。例えば、 配列番号 1に示す核酸配列を有する核酸分子および配列番号 2に示す核酸配列を 有する核酸分子のプライマー対を用いる場合、アニーリング温度は、 60°C以上 90°C 未満、好ましくは約 70°C、最も好ましくは 67°Cである。
[0031] 工程 (d)では、同一の出発サンプルに由来する一次鎖 cDNAを複数の、例えば 3
10個、好ましくは約 4個のチューブに小分けし、それぞれ PCR反応を行い、最後に 再び混合するのが好ましい。そうすることにより、ランダム誤差が平均化され、それを 著しく抑制することができる。
[0032] (e)第 3のプライマーを用い、 PCR増幅
第 3のプライマーは、第 1のプライマーまたは第 2のプライマーのいずれか一方のプ ライマーにおけるヌクレオチド配列中の付加核酸配列 Xまたは Yの 5 '側にプロモータ 一領域が結合して 、るプライマーである。
よって、ここで用いるプライマーセットは、
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 1のプライマーの組み合わせからなるプライマーセット、のいずれか から選択する。
プロモーター領域は、 RNAポリメラーゼが認識できる部位であれば特に制限されな いが、好ましくは T7プロモーター領域、 T3プロモーター領域、 SP6プロモーター領域 である。具体的には、配列番号 3に示す核酸配列を有する核酸分子を用いる。 この工程では、上記プライマーセット（1)または（2)のいずれかを用い、 PCR増幅を 4 10サイクル、好ましくは 5サイクル行う。このサイクル数は、プロモーター領域を含 む増幅産物を充分な数で確保する観点から、少なくとも 3サイクル以上必要である。 アニーリング温度は（d)項での説明と同様である。
[0033] 上記工程 (a)から（e)により、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関 係を保持している増幅産物力 なる核酸集団が調製される。本発明は別の態様とし て、上記工程 (a)から (e)により調製される、生物学的試料における遺伝子発現量の 相対的な関係を保持している増幅産物力 なる核酸集団であって、増幅産物がほぼ 均一の長さを有している核酸集団を提供する。ここに、「ほぼ均一の長さを有している 」とは、全長の長い mRNAについて長さのそろった増幅産物が得られることを意味し 、短い長さの増幅産物の存在を排除するものではない。さらに、本発明の核酸集団 中の増幅産物は 3 '側と 5 '側を区別できる方向付けがされて 、る。
[0034] 上記工程により得られる本発明の核酸集団は、定量的マイクロアレイ解析に適用す るための試料、あるいは配列決定用の試料として有用である力 本発明の方法で得 られた増幅産物中には、 mRNAに由来する cDNA (主に約 500bp以下の長さをも つ DNAの一部の集団）と副産物 DNA (主に約 200bp以下の長さをもつ DNAの集 団）の混合物である。力かる副産物が混入したままプロモーター領域を付加して試験 管内転写反応を行うと、次工程 (f)において副産物を铸型とした RNAも合成されてし まう。これはマイクロアレイへのハイブリダィゼーシヨン実験に悪影響を及ぼすおそれ がある。すなわち、副産物が混入していると、必要なターゲット RNAの量を測定する ことが不可能になる。その理由は、 RNA量を定量する際に副産物と「正しい」産物を 見分けることが不可能だ力もである。したがって、増幅産物の用途によっては (例えば 、これを試験管内転写反応により RNAとし、 AfiVmetrix社のオリゴヌクレオチドマイク ロアレイ GeneChipシリーズに適用する等）、増幅産物中の副産物 DNAを除去するこ とが必要となる。
[0035] カゝかる副産物 DNAの除去工程はゲル濾過法、ゲル電気泳動法などの当該分野で 公知の 、ずれの手段を用いて行ってもよ!、が、ゲル電気泳動による精製により副産 物 DNAを除去することが好ましい。その理由は、ゲル電気泳動は操作が簡便で、回 収率が良好で、サイズ分離能が高ぐ安価だ力もである。除去される副産物 DNAの 長さは通常約 300bp以下であり、例えば約 200bp以下の長さのものを除去してもよ い。副産物 DNA除去のタイミングはプロモーター領域を付加する前、後のいずれで あってもよいが、プロモーター領域付加後においては増幅された cDNAが豊富に存 在するので、精製効率や操作の安全 (試料 cDNAの喪失を防止）の面から、プロモ 一ター領域を付加後が好まし ヽ。
[0036] 本発明者らは、上述のごとく副産物 DNAを除去した集団を铸型として試験管内転 写反応を行うと、ある頻度で、転写産物である RNAにおける相対的遺伝子発現量に 変化が生じることを見出した。これを解消するためには、副産物 DNA除去工程後、さ らに PCRを行って、その増幅産物を铸型にして試験管内転写反応を行うと、転写産 物 RNAにおける相対的遺伝子発現量が完全に維持されることがわ力つた (実施例 2 参照)。この PCRの条件は、目的とする DNA配列が増幅されるものであれば特に制 限はないが、好ましい PCR条件は、工程 (e)のプロモーター配列付加反応と同様の 条件である。この PCRのサイクル数についても制限がないが、通常は数回で十分で ある。 PCRにより相対的遺伝子発現量が変化するリスクを小さくするたにはサイクル 数を減らすことが好ましぐ 1回だけでも十分効果がある。
[0037] 上述のような副産物 DNA除去工程、およびその後の PCR増幅工程は、本発明の 、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持して 、る増幅産物か らなる核酸集団を調製する方法のみならず、下記の本発明の核酸増幅方法、ならび に生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持している核酸ライブ ラリーの調製方法、ならびに本発明のキットのいずれにおいても適用可能である。
[0038] (f)本発明の核酸集団を RNAからなる核酸集団に変換
上記工程 (a)から（e)により得られる本発明の核酸集団に RNAポリメラーゼおよび ラベルイ匕したヌクレオチド 3燐酸を適用することにより、ラベルイ匕された RNAからなる 核酸集団を調製することができる。このラベル化された核酸集団は、複数の遺伝子発 現量を同時に測定できる、現在主流となりつつある Aifymetrix社のオリゴヌクレオチド マイクロアレイ GeneChipシリーズに適用することができる。
[0039] (2)核酸配列増幅方法
本発明は別の態様として、本発明の核酸集団調製方法における工程 (a)から (e)を 含む、核酸配列の増幅方法を提供する。好ましくは、核酸配列は、生物学的試料に おける遺伝子発現量の相対的な関係を保持している増幅産物からなる。
[0040] (3)生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持して 、る核酸ライブ ラリーの調製方法
本発明はさらに別の態様として、本発明の核酸集団調製方法における工程 (a)から (e)を含む、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持して 、るラ イブラリーの調製方法を提供する。
本方法により調製される cDNAライブラリ一は、生物学的試料における遺伝子発現 量の相対的な関係を保持して 、るライブラリーである。この cDNAライブラリーをクロ 一ユングしたプラスミドによって大腸菌を形質転換し、培地上で発育させれば、形質 転換体それぞれに対応して幾万ものコロニーが生成される。次いで、それらをピック アップしてそれぞれのプラスミドの配列を決定し、データベース化すると、発現頻度の 高 、遺伝子であれば、それに対応する全く同一の配列がデータベース上その発現 頻度に応じた回数で出現することになる。従って、このようにして頻度を算定すること で、マイクロアレイを用いなくても、理論的には生物学的試料における遺伝子発現量 の相対関係を知ることができる。即ち、本発明の cDNAライブラリーを調製すれば、 網羅的な配列解析により同一配列の出現頻度を調べることで、ゲノム情報が既知で あってもなくても、遺伝子発現量の相対的関係を知ることが出来る。
このようにして作製されたライブラリーに基づくデータベースは、 expression sequenc e tag[EST]データベースと呼ばれる。既知の ESTデータベースの中には、 ESTの 5'- ,3 '-の向きが不明であるものがあるが、本方法により作製されるライブラリーでは、その 向きが明確に分かる。遺伝子発現量の相対的関係を再現性よく保った [有向] ESTラ イブラリーデータベースは、マイクロアレイの適用が困難な生物種、すなわち全ゲノム 配列がまだ分かって ヽな 、大多数の生物種にぉ 、ても、マイクロアレイを用いずに単 一細胞レベルで遺伝子発現の相対量がわかると 、う点で非常に有効である。また全 ゲノムがわ力つている生物種に関しても、遺伝子多型等の個体間の違いを考慮に入 れた解析が、単一細胞レベルで可能になる。
[0041] (4)マイクロアレイに適用するための cDNA集団を調製するキット
さらなる別の態様として本発明は、マイクロアレイに適用するための cDNA集団を 調製するためのキットを提供する。
本発明のキットは、
(a)生物学的試料から単離した mRNAから一次鎖 cDNAを調製するための、ポリ丁と 任意の付加核酸配列 Xとからなる第 1のプライマー、
(b)第 1のプライマーを失活させるための試薬、
(c) 2本鎖 DNAを調製するための、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2の プライマー、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーにおけるそれぞれ付カロ 核酸配列 Xおよび Yは互いに配列が異なっており、および
(d)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセット：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 1のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、を含む。
[0042] 本発明のキットは、他に核酸を増幅するための各種試薬を含むことができる。さらに 、コントロール実験のためのプライマー等を含むこともできる。
本発明のキットに含まれる構成要素を例示すれば、以下の通りである： 以下の実 施例に示す全ての試薬、 Spike RNA、 ES細胞由来 RNA (コントロール実験用）、 cDNA 増幅用プライマー（Vl[dT]24, V3[dT]24, T7V1)、 DNAの精製キット（Qiagen)、コント ロール実験のためのリアルタイム PCR用プライマー（Gapdh, Oct4, Nanog, Sox2, Ezh 2, Yyl, Eras, Tiarの各遺伝子特異的プライマー）。
本発明のキットは、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持し て 、る増幅産物力もなる cDNA集団を調製するものが好ま 、。
[0043] 本発明の上記キットは、本発明の、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的 な関係を保持している増幅産物力もなる核酸集団を調製する方法、核酸増幅方法、 ならびに生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持している核酸 ライブラリーの調製方法を実施するために使用することができる。
[0044] 以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する力 本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
実施例にて使用している各種緩衝液等は Saito, H. Kubota, M.Roberts, R. W.Chi, Q.Matsunami, H. (2004). "RTP family members induce functional expression of mam malian odorant receptors" Cell 119 (5): 679-91を参考にして調製したものであり、以 下の組成を有する。
[表 1]
(1) 細胞溶解緩衝液 in 1)
10 . -: PCR 緩衝液 II (1¾ 2不含） （Applied Biosystems) 10.0
MgCl2 (Appl ied Biosystems) , 25 mM 6.0
NP40 (Nacalai) , 5% 10.0
DTT (Invitrogen) , 0.1 M 5.0
Prime RNase Inhibitor (商品名) (Eppendorf) , 30 U/ i 1 1, 0
RNAguard RNase Inhibitor (商品名） (Amersham) , 31.2 U/ μ 1 1.0 プライマー VI (dT)24， 10 ng/μ 1 2.0 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP)， 各 2.5 mM 2.0 Spike RNA 混合物 （Lys 1000, Dap 100, Phe 20, および Thr 5 コピー/ 21.0 II 1)
DDW (二回蒸留脱イオン水） （Gibco) 42.0 終容量 100.0
(2) RT 混合物 in 1)
Superscript III (商品名） (Invitrogen) , 200 U/ /J 1 6.0
RNAguard RNase Inhibitor (商品名） (Amersham) , 31.2 U/ 1 1.0
T4 gene 32 protein (商品名) (Roche) , 6 μ g/ μ 1 2.0 終容量 9.0
(3) ェキソヌ ク レアーゼ I 混合物 ( 1)
10 > Exonucleasel 緩衝液 (Takara) 3.0
DDW (二回蒸留脱イオン水） （Gibco) 24.0
ExonucleaseI_(Takaraj , —5 U/ μ 1 3.0 _ 終容量 30, 0
(4) TdT 混合物 (μ 1)
10 -: PCR 緩衝液 II (1¾( 12不含） （Applied Biosystems) 12.0
MgCl2 (Appl ied Biosystems) , 25 mM 7.2 dATP (Amersham Pharmacia)， 100 mM 3.6
RNaseH (Invitrogen) , 2V/ 1 6.0 terminal deoxynucleot idyl transferase (TdT) , recombinant (Invitrog 6, 0 en), 15 ϋ/ μ 1
DDW (二回蒸留脱イオン水） （Gibco) 85.2
(5) PCR 混合物 I (μ 1)
10 -: Extaq 緩衝液 160.0 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, および dTTP) , 各 2.5 mM 160.0 プライマー V3(dT)24, l u g/ μ ΐ 32.0
Extaq Hot Start Vers ion, 5 U/μ 1 16.0
DDW (二回蒸留脱イオン水）—（Gibco) 1232.0 終容量 1600.0
(6) PCR 混合物 II ( μ 1)
10 Extaq 緩衝液 160.0 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, および dTTP), 各 2.5 mM 160.0 プライマー Vl(dT)24, l g/u l 32.0
Extaq Hot Start Vers ion, 5 U/μ 1 16.0
DDW —(二回蒸留脱イオン水） （Gibco) 1232.0 終容量 1600.0
(7) PCR 混合物 III ( μ 1)
10 > Extaq 緩衝液 20.0 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, および dTTP) , 各 2.5 mM 20.0 プライマー T7-V1, 1 μ g/ μ ΐ 4. 0 プライマー V3 (dT)24， 1 μ g/ μ 1 4.0
Extaq Hot Start Version, 5 U/ 1 2.0
DDW (Gibco) 140.0 終容量 190.0
[0045] 表 1中、使用しているプライマーは次の通りである
[表 2]
プライマ
Vl(dT)2
(オペ口 ン )
V3(dT)24
(オペ口 ン )
T7-V1
(オペ口 ン C-3' 〔配列番号 3 ) 実施例 1
[0046] A.一次鎖 cDNAの合成および指数関数的な増幅
工程 1： プライマー VI (dT) の添カロ まず、マウス初期胚 (受精後 6.5-8.5日胚)の尿膜基底部をグラスキヤビラリ一で切り 取り、 0.05%トリプシン処理して単一細胞にした後、マウスピペットで細胞を採取した。 一回の実験で 20個の細胞を採取した。 0.5 ml thin-wall PCRチューブ中、得られた 単一細胞 (く 0.5 1)に細胞溶解緩衝液 (表 1の (1)) 4.5 1を加え、 15秒間、卓上遠心 機にて遠心し、氷上に置いた。 70°Cに 90秒間加温し (湯浴）、氷上に 1分間おいた。 次いで、卓上遠心機にて遠心し、氷上に置いた。
[0047] 工程 2 : 逆転写
工程 1にて調製した試料に RT混合物（表 1の (2)) 0.3 1をカ卩え、 50°Cにて 5分反応 させた (湯浴)。次いで、 70°Cにて 10分間処理し (湯浴）、反応を停止させ、次いで、 卓上遠心機にて遠心し、氷上に 1分間置いた。
[0048] 工程 3 : ェキソヌクレアーゼ分解
工程 2にて調製した試料にェキソヌクレアーゼ I混合物（表 1の (3)) 1 μ 1を加え、 37 °Cにて 30分反応させ、次!、で 80°Cにて 25分処理した（PCRマシン)。得られた処理物 を遠心し、氷上にて 1分間置いた。
[0049] 工程 4 : ポリ (A)テーリング
工程 3にて調製した試料に TdTミックス（表 1の (4)) 6 1を加え、 37°Cにて 15分反 応させ (水浴)、次いで 70°Cで 10分間処理し反応を停止させた (水浴)。次いで、卓上 遠心機にて遠心し、氷上に 1分間置いた。
[0050] 工程 5 : プライマー V3 (dT) の添カ卩と PCR増幅
24
工程 4にて調製した反応産物 (ポリ- Aテール化逆転写産物) 12 μ 1を thin-wall 200 μ 1 PCRチューブ 4本に 1本あたり 3 μ 1分注した。各チューブに PCR混合物 I (表 1 の (5)) 20 1を加え、 95°C 3分、 50°C 2分、 72°C 3分の条件にて DNA伸長反応を 1サ イタル行い、氷上にて 1分静置し、卓上遠心機にて 15秒遠心した。
各チューブに PCR混合物 11 (表 1の (6)) 20 1をカ卩え、次いで各チューブにミネラル オイルをカ卩え、 95°C 30分、 67°C 1分、 72°C 3分（各サイクルについて付カ卩的に 6秒)の 条件にて PCR増幅反応を 20サイクル行った。
[0051] 工程 6 :
工程 5にて得られた各チューブにおける PCR産物を混合した。 [0052] 工程 7 :
Qiagen PCR精製キットで精製し、 EB緩衝液 50 μ 1で溶出した。
[0053] Β. Τ7プロモーターの付カロ
工程 8 :
Τ7プロモーターを付カ卩するため、工程 7にて調製した cDNA 10 1を 4本の thin- wall 200 /z lチューブに分注し（1本あたり 2.5 1)、各チューブに PCR混合物 ΠΙ (表 1の ( 7)) 47.5 1をカ卩え、さらにミネラルオイルをカ卩えた。これに対して、 95°C 5分、 64°C1分 、 72°C 5分 18秒を 1サイクル、次いで、 95°C 5分、 67°C 1分、 72°C 5分 18秒（各サイク ルについて付カ卩的に 6秒)を 4サイクル行い、 PCR増幅反応を行った。
[0054] 工程 9 :
Qiagen PCR精製キットで精製し、 EB緩衝液 50 μ 1で溶出した。
[0055] C.ゲル精製
工程 10 :
工程 9にて得られた産物 35 μ 1に DNAローデイング緩衝液 (Takara) 7 μ 1を加え、 2 %ァガロースゲルにて ΒΡΒ (ブロモフエノールブルー）がおおよそ 2- 3 cm移動するまで 100Vで約 10分間電気泳動した。
[0056] 工程 11 :
スメァ DNA (300 bp以上のもの全部）を切り出し（およそ 0.3 - 0.5 g)、 Qiagenゲル 精製キットで精製した。
最終的な cDNA産物は、 Ambion MEGA Scriptを用いた 10 μ 1スケールの Τ7反応を 2時間したとき (4 μ 1を铸型として用いる）、約 10 μ gの非標識 RNAを与えた。
[0057] 試験例 1
従来の cDNA増幅方法 (AL1法)と本発明の cDNA増幅方法 (V1V3法)との比較
マウス ES細胞由来の RNAを 1細胞レベル (およそ 10ピコグラム)にまで希釈し、 AL1 法 (非特許文献 3)および本発明 V1V3法を用いて cDNAを合成 ·増幅した。本発明 VI V3法は実施例 1に記載の方法である。すべての実験において、同一の未増幅 RNA( 以下、オリジナル RNAと称す)から希釈された RNAから増幅を行った。それぞれの方 法について、 6回の独立した実験を行った。 増幅された cDNA集団における各遺伝子の相対的発現量、すなわち各遺伝子産物 mRNAに由来する増幅後の cDNAの量を、希釈も増幅もして 、な 、オリジナルの ES細 胞由来 RNA(1マイクログラム)における各遺伝子の相対的発現量と比較し、オリジナル RNAからの偏差力AL1法と V1V3法でどの程度違うのかを調べた。
ES細胞由来の RNAでは、数千から一万個の遺伝子が発現していると考えられる。 その中から代表的な 8つの遺伝子 (Gapdh,Oct4,Sox2,Ezh2,Yyl,Nanog,Eras,Tiar)を 選び、オリジナル RNAおよび増幅された cDNAにおける各遺伝子の発現量を、リアル タイム PCR (参考： http：〃 www.takara-bio.co.jp/prt/pdfs/prtl.pdf)によって測定した 。 Gapdhを用いて各遺伝子の発現量を規格ィ匕して相対量を算出した。
得られた結果を図 2に示す。
図中、横軸には、オリジナル RNAにおける、 Gapdhで規格化した各遺伝子の相対的 発現量（Gapdhからの倍率変化、すなわち Gapdhの何倍の発現量である力）をプロット した。左力も右に向力つて相対的発現量が小さくなるように軸の向きをとつた。 Oct4の 発現量が Gapdhにもつとも近く（およそ 1/1.2)、 Tiarの発現量力 Sもっとも少ない（およそ 1/650)。すなわち、上記 8つの遺伝子を選ぶことで、約 650倍の範囲に及ぶ遺伝子発 現量が調べられる。
縦軸には、増幅された cDNA集団における、相対的遺伝子発現量のオリジナルから の倍率変化 (Gapdhで規格ィ匕した各遺伝子の発現量力 オリジナルの何倍である力） をプロットした。 X 10Q (=1倍)を中心として、上下にずれるほど偏差が大きくなつている 。上にプロットされるほど、オリジナルの RNAよりも相対的発現量が小さく（実際よりも 小さく見積もられている）、下にプロットされるほどオリジナルの RNAよりも相対的発現 量が大きい (実際よりも大きく見積もられている)。黒丸および X印はそれぞれ、 V1V3 法および AL1法によって増幅された cDNA集団における、相対的遺伝子発現量のォ リジナルカ の偏差の平均値を示す。バーは各手法'各遺伝子発現量における標準 偏差を示す。
図 2から、 AL1法および V1V3法による cDNA増幅過程で生じた、相対的遺伝子発現 量のひずみの大きさを知ることが出来る。すなわち黒丸および X印によって系統誤 差 (再現性をもって生じる誤差)を、またバーの長さによってランダム誤差の大きさ (各 実験間でのばらつきの大きさ）を知ることが出来る。
V1V3法（黒丸）では、すべての遺伝子についてオリジナルからのズレが 0.5倍 (2分 の 1)から 0.25倍 (4分の 1)の範囲に収まっている。一方、 AL1法（X印）ではオリジナル 力ものズレが遥かに大きぐ多くの遺伝子が X 10— 10分の 1)から X 10— 2 (100分の 1 )の範囲にプロットされる。
さらに各遺伝子のバーの大きさに注目すると、 V1V3法の方が AL1法よりもはるかに 小さ!/、幅の中に納まって!/、ることが分かる。
これらのことから、 V1V3法は AL1法よりも系統誤差'ランダム誤差ともに大幅に改善 されていることが明らかになった。
試験例 2
オリジナル RNAおよび増幅された cDNA集団におけるマイクロアレイ上でのシグナル 強度の比較
オリジナルの ES細胞由来 RNA(5 g、約 5 X 105細胞)を試料として Alfymetryx社の G eneChipマイクロアレイ解析を行った。また、 ES細胞由来 RNAを 1細胞レベルにまで希 釈し (およそ 10 pg)、それを本発明の V1V3法により増幅した cDNA集団を試料とし、 同様に GeneChipマイクロアレイ解析を行った。
得られた結果を図 3に示す。図 3から、オリジナルの遺伝子発現量の相対的関係が 、 cDNA増幅過程でどの程度保たれて 、る力を知ることが出来る。
図中、横軸にオリジナル RNAにおける各遺伝子のシグナル強度をプロットし、縦軸 に増幅 cDNA集団における各遺伝子のシグナル強度をプロットした。オリジナルから の倍率変化が、 2倍、 5倍、 10倍、 1/2倍、 1/5倍、 1/10倍に対応する線をグラフ上に示 した。
図 3は、全遺伝子の 90%以上が、 1/2倍から 2倍の範囲の中に納まることを示している 。さらに、増幅 cDNA集団とオリジナル RNAのシグナル強度間の R2値は 0.88であった（ R2値 =相関係数 Rの二乗)。これらのことから、 V1V3法による増幅力 もともとの遺伝 子発現の相対的関係を大きく歪ませていないことが明らかになった。この結果は図 2 に示す、代表的な 8つの遺伝子にっ 、てリアルタイム PCR実験で測定した結果とも 良く一致する。 [0060] 試験例 3
独立に増幅した二つの DNA集団におけるシグナル強度の比較
ES細胞由来の RNAを 1細胞レベルにまで希釈し、そのうち 2つを選択しそれぞれを 別個のチューブで独立に増幅し、 cDNA集団 #1および cDNA集団 #2を得た。これらに つ!、て GeneChipマイクロアレイ解析を行った。
得られた結果を図 4に示す。図 4から、 cDNA増幅がどの程度再現性良く行われるか を知ることが出来る。
図中、横軸に、増幅した cDNA集団 #1を、縦軸に、増幅した cDNA集団 #2をプロット した。全遺伝子の 90%以上が、 1/2倍から 2倍の範囲の中に納まった。二つの cDNA集 団のシグナル強度間の R2値は 0.92であった。
各遺伝子のプロットは対角線付近に集まり、倍率変化 2倍以内の遺伝子力 ¾0%以上 であった。これらのことから、 V1V3法による増幅が再現性良く行われることが明らかに なった。
[0061] 試験例 4
遺伝子産物のコピー数とマイクロアレイ上のシグナル強度の対応
マイクロアレイ上でのシグナル強度と mRNAのコピー数を関係付けるために、「Spike 法」と呼ばれる実験を行った。
Spike法とは、マウスゲノム上に存在しない RNA (Spike RNA)を cDNAの合成 '増幅' ラベリング等の反応系に添カ卩して、ポジティブコントロールとする手法である。 Affymet rix GeneChipでは、枯草菌（Bacillus subtilis)由来の遺伝子 lys, dap, phe, thr, trpをタ 一ゲットとしたプローブを用意しているので、これらの遺伝子を Spike RNAとして用い ることが出来る。これらの遺伝子は原核生物の枯草菌に由来するため 3 '末端にポリ A が存在しないので、そのままでは我々の cDNA増幅系で増幅することが出来ない。こ のため lys, dap, phe, thr, trp遺伝子の 3'末端にポリ dAを付カ卩し、擬似的な真核生物 様の mRNAをコードするようにした人工遺伝子力 プラスミドにクローユングされている 。これらの人工遺伝子を铸型として、（cDNA合成'増幅実験とは別に) mRNAを合成' 精製して保存しておく。これらの mRNAは、どれだけの量を cDNA増幅反応系に添カロ するのかを、実験者が自由に決めることができ、添加された RNAのコピー数と、その R NAに由来するシグナル強度を関係付けることが出来る。
ここでは、 3'末端に人工的にポリ Aが付カ卩された Lys, Dap, Phe, Thr RNAを、それ ぞれー細胞あたり 1000, 100, 20, 5コピーになるように添カ卩し、 ES細胞由来 RNAととも に cDNAを合成.増幅した。
得られた結果を図 5に示す。
図中、横軸にカ卩えたコピー数、縦軸にマイクロアレイ上でのシグナル強度をプロット した。黒い菱形がオリジナル RNA (5 g、約 5 X 105細胞）に添加された未増幅の Spik e RNAを示す (5 X 105細胞分添加した)。白抜きの四角、菱形、三角、 X印は、 1細胞 レベルに希釈された ES細胞由来 RNAに添加された Spike RNAを示す。これらの Spike RNAは 1細胞分添カ卩されている。 Lys, Dap, Phe RNAは再現性良く増幅された力 Thr RNA (5コピー/細胞)は再現性良く増幅されなかった。 Lys, Dap, Phe RNAのコピー 数とシグナル強度の間の R2係数は 0.93であった。
図 5の結果は、コピー数とシグナル強度が 20コピーから 1000コピーの間で良い相関 を有することを示している。このこと力 、すくなくとも 20コピー以上の mRNAについて は、シグナル強度力 mRNAのコピー数を見積もることが出来るほどの定量性力 本 発明の増幅方法にあることがわ力つた。
実施例 2
[0062] 実施例 1の工程 9にて得られた産物 1を 2%ァガロースゲル電気泳動でサイズ 分画したのち、ェチジゥムブロミド染色によって DNAを可視化し、約 300bp以下のサ ィズの DNAを含む部分のゲルを市販の力ミソリを用いて切り取り、 Qiagenゲル DNA 抽出キット（Qiaquick GelExtraction kit)を用いてゲル断片から DNAを抽出した。
[0063] こうして副産物を除去した DNA集団について、ランダムに 40の cDNAの配列を読 んだところ、副産物は 1つも含まれていな力つた。また、ゲル精製の前後で、 cDNAに おける相対的遺伝子発現量には変化がな力つた（図 6 (a) )。
[0064] ゲル断片力 抽出された DNAを、プロモーター配列付加反応と同一の、バッファ 一、基質、酵素の組成で 1サイクルの PCRを行った。反応液組成は下記のとおりであ つた：
!OxExTaq buffer (Takara 20.0 μ 1 2.5mM each dNTP(dATP, dCTP, cGTP, dTTP) (Takara) 20.0 μ 1 H20 141.2 μ \
cDNA (副産物除去を行った DNA) 8.8 μ \
ExTaq Hot Start version (Ί akara) 2.0 μ 1
Total 200.0 μ \
[0065] 上記 PCRの温度条件は：
95°C 5分 30秒→ 67°C1分 → 72°C16分
であった。
[0066] 上記のようにして得られた PCR産物を铸型に試験管内転写反応を行うと、転写産 物 RNAにおける相対的遺伝子発現量は完全に維持されることが判明した（図 6 (b) ) 。このようにして得られた RNA集団は、例えば Aifymetrix社のオリゴヌクレオチドマイ クロアレイ GeneChipシリーズでの使用に極めて好適である。
産業上の利用可能性
[0067] 本発明は、生化学的研究分野、医学、食品分野あるいは物質生産分野等におい て利用可能である。

Claims

請求の範囲 [1] 生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持している増幅産物か らなる核酸集団を調製する方法であって、 (a)生物学的試料から単離した mRNAを铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 X と力もなる第 1のプライマーを用いて逆転写することにより一次鎖 cDNAを調製し、(b)工程 (a)の反応の後、残存する第 1のプライマーを失活させ、 (c)工程 (a)により得られた一次鎖 cDNAをポリ Aテーリング反応に付し、次いでこれ を铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2のプライマーを用いて二 次鎖である 2本鎖 DNAを調製し、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーに おけるそれぞれ付加核酸配列 Xおよび Yは互 ヽに配列が異なっており、 (d)第 1のプライマーを添加し、 PCR増幅を行い、次いで (e)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセットを用いて PCR増幅を行う方法：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 1のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット。
[2] 工程 (a)にて調製される一次鎖 cDNAの長さがほぼ均一であることを特徴とする、 請求項 1記載の方法。
[3] 上記工程 (b)にお 、て、残存する第 1のプライマーをェキソヌクレアーゼ Iにて分解 して失活させることを特徴とする、請求項 1または 2記載の方法。
[4] 工程 (d)において、 PCR増幅を 10— 30サイクル行うことを特徴とする、請求項 1—
3までの 、ずれか記載の方法。
[5] 工程 ）において、 PCR増幅を 4— 10サイクル行うことを特徴とする、請求項 1—4 までの 、ずれか記載の方法。
[6] (f)工程 (e)により得られた核酸集団に RNAポリメラーゼおよびラベルイ匕したヌクレ ォチド 3燐酸を適用し、ラベル化された RNAからなる核酸集団を調製する工程、をさ らに含む、請求項 1 5までの 、ずれか記載の方法。
[7] 工程 (a)において、逆転写反応を 5— 10分行う、請求項 1 6までのいずれか記載 の方法。
[8] 工程 (d)において、工程 (c)により得られた二次鎖 2本鎖 DNAを 3— 10個に小分け し、それぞれ PCR増幅を行い、次いでそれぞれの増幅産物を一緒にまとめる、請求 項 1 7までの 、ずれか記載の方法。
[9] 工程 (d)および (e)にお 、て、アニーリング温度をプライマーの Tm値に近づけて PC
R増幅を行う、請求項 1から 8までの 、ずれか記載の方法。
[10] さらに、下記工程：
工程 ）において、プライマー配列を付加した後に、増幅産物中の副産物 DNAを 除去し、その後、 PCR増幅を行う
を含む、請求項 1 9までのいずれか記載の方法。
[11] 生物学的試料が真核生物の細胞である、請求項 1から 10までのいずれか記載の方 法。
[12] 生物学的試料が 1個から数個の細胞である、請求項 11記載の方法。
[13] 生物学的試料が 1個の細胞である、請求項 12記載の方法。
[14] 第 1のプライマーが配列番号 1に示す核酸配列を有し、第 2のプライマーが配列番 号 2に示す核酸配列を有し、第 3のプライマーが配列番号 3に示す核酸配列を有す る、請求項 1から 13までのいずれか記載の方法。
[15] 請求項 1から 14までのいずれか記載の方法により調製される、生物学的試料にお ける遺伝子発現量の相対的な関係を保持している増幅産物からなる核酸集団であつ て、増幅産物がほぼ均一の長さを有している核酸集団。
[16] 請求項 15記載の核酸集団をマイクロアレイに適用する、定量的マイクロアレイ解析 方法。
[17] 配列番号 1に示す核酸配列を有する核酸分子。
[18] 配列番号 2に示す核酸配列を有する核酸分子。
[19] 配列番号 3に示す核酸配列を有する核酸分子。
[20] 配列番号 1に示す核酸配列を有する核酸分子、および配列番号 2に示す核酸配列 を有する核酸分子力 なるプライマー対。
[21] 以下の工程を含む、核酸配列の増幅方法： (a)生物学的試料から単離した mRNAを铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 X と力もなる第 1のプライマーを用いて逆転写することにより一次鎖 cDNAを調製し、
(b)工程 (a)の反応の後、残存する第 1のプライマーを失活させ、
(c)工程 (a)により得られた一次鎖 cDNAをポリ Aテーリング反応に付し、次いでこれ を铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2のプライマーを用いて二 次鎖である 2本鎖 DNAを調製し、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーに おけるそれぞれ付加核酸配列 Xおよび Yは互 ヽに配列が異なっており、
(d)第 1のプライマーを添加し、 PCR増幅を行い、次いで
(e)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセットを用いて PCR増幅を行う方法：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 1のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット。
[22] さらに、下記工程：
工程 ）において、プライマー配列を付加した後に、増幅産物中の副産物 DNAを 除去し、その後、 PCR増幅を行う
を含む、請求項 21記載の方法。
[23] 核酸配列が、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持して!/、 る増幅産物からなる、請求項 20または 21記載の方法。
[24] 生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持している核酸ライブラ リーを調製する方法であって、
(a)生物学的試料から単離した mRNAを铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 X と力もなる第 1のプライマーを用いて逆転写することにより一次鎖 cDNAを調製し、
(b)工程 (a)の反応の後、残存する第 1のプライマーを失活させ、
(c)工程 (a)により得られた一次鎖 cDNAをポリ Aテーリング反応に付し、次いでこれ を铸型として、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2のプライマーを用いて二 次鎖である 2本鎖 DNAを調製し、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーに おけるそれぞれ付加核酸配列 Xおよび Yは互 ヽに配列が異なっており、 (d)第 1のプライマーを添加し、 PCR増幅を行い、次いで
(e)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセットを用いて PCR増幅を行う方法：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 1のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット。
[25] さらに、下記工程：
工程 ）において、プライマー配列を付加した後に、増幅産物中の副産物 DNAを 除去し、その後、 PCR増幅を行う
を含む、請求項 24記載の方法。
[26] マイクロアレイに適用するための cDNA集団を調製するためのキットであって、
(a)生物学的試料から単離した mRNAから一次鎖 cDNAを調製するための、ポリ丁と 任意の付加核酸配列 Xとからなる第 1のプライマー、
(b)第 1のプライマーを失活させるための試薬、
(c) 2本鎖 DNAを調製するための、ポリ Tと任意の付加核酸配列 Yとからなる第 2の プライマー、ここに、第 1のプライマーおよび第 2のプライマーにおけるそれぞれ付カロ 核酸配列 Xおよび Yは互いに配列が異なっており、および
(d)下記（1)または（2) V、ずれかのプライマーセット：
(1)付加核酸配列 Xとその 5'側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 2のプライマーの組み合わせ力もなるプライマーセット、または
(2)付加核酸配列 Yとその 5 '側に結合するプロモーター配列とからなる第 3のブラ イマ一、および第 1のプライマーの組み合わせ力 なるプライマーセット、
を含むキット。
[27] cDNA集団が、生物学的試料における遺伝子発現量の相対的な関係を保持して いる増幅産物からなる、請求項 26記載のキット。
[28] 請求項 1〜25のいずれか 1項に記載の方法を行うためのものである、請求項 26ま たは 27記載のキット。
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