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WO2006059655A1 - 微生物又は細胞の分離方法 - Google Patents

微生物又は細胞の分離方法 Download PDF

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WO2006059655A1
WO2006059655A1 PCT/JP2005/022012 JP2005022012W WO2006059655A1 WO 2006059655 A1 WO2006059655 A1 WO 2006059655A1 JP 2005022012 W JP2005022012 W JP 2005022012W WO 2006059655 A1 WO2006059655 A1 WO 2006059655A1
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cells
sample
microorganisms
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Hideji Tajima
Tomoyuki Hatano
Junko Momose
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Universal Bio Research Co Ltd
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Universal Bio Research Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C1/00—Magnetic separation
    • B03C1/005—Pretreatment specially adapted for magnetic separation
    • B03C1/015—Pretreatment specially adapted for magnetic separation by chemical treatment imparting magnetic properties to the material to be separated, e.g. roasting, reduction, oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B03C—MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
    • B03C2201/00—Details of magnetic or electrostatic separation
    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical or biological applications

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating microorganisms or cells from a sample, and a method for extracting a microorganism or cellular force nucleic acid separated using the method.
  • hydroxyapatite crystals are converted to hydrochloric acid (pH 2.
  • hydroxyapatite gel is formed by adding sodium hydroxide and adjusting the pH to 8.0, and by applying magnetic particles to this and performing ultrasonic treatment Magnetic particles whose surface is coated with loxyapatite gel (hereinafter referred to as “surface-coated magnetic particles”
  • the surface-coated magnetic particles are added to the E. coli-containing solution to form a complex containing the surface-coated magnetic particles and E. coli, and the complex is separated by the action of a magnet.
  • a method of dissociating E. coli from the complex by treatment with a chelating agent such as EDTA is known (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-102465
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently separating microorganisms or cells from a sample containing microorganisms or cells, and a method for extracting microorganisms or cellular force nucleic acids separated using the method. To do.
  • the present invention provides a sample containing a microorganism or cells.
  • a method for separating microorganisms or cells wherein a liquid containing the sample, ion exchanger particles, and magnetic particles whose surfaces are coated with calcium phosphate compound hydrated gel is prepared, and a magnet is prepared.
  • a method is provided that separates a complex containing the microorganism or the cell, the ion-exchanged particle, and the magnetic particle from the liquid by acting.
  • the present invention also relates to a method for extracting nucleic acid from a microorganism or cell contained in a sample, wherein the microorganism or the cell is separated from the sample by using the method of the present invention and separated.
  • a method characterized by extracting nucleic acids from microorganisms or the cells is provided.
  • a method for efficiently separating a microorganism or cells containing a microorganism or cells and a method for extracting nucleic acids from the microorganisms or cells separated using the method.
  • a magnetic particle whose surface is coated with a calcium phosphate compound compound hydrated gel is used in combination with a magnetic particle whose surface is coated with a calcium phosphate compound compound hydrated gel and an ion exchanger particle.
  • Sample power Microorganisms or cells can be separated more efficiently than when using body particles alone.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of electrophoresis of genomic DNA from which high-temperature environmental soil force was also extracted.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of electrophoresis of extracted genomic DNA.
  • the sample contains one type or two or more types of microorganisms or cells.
  • the type of microorganism or cell contained in the sample may be known or unknown.
  • the microorganism contained in the sample may be either a prokaryotic microorganism or a eukaryotic microorganism.
  • the prokaryotic microorganism include gram-positive bacteria (for example, the genus Micrococcus, Staphylococcus genus, Bacillus ⁇ , Clostndium J3 ⁇ 4, Bacteria such as Lactobacillus genus, Corynebacterium, Streptomyces genus, etc.), Guhum's negative bacterium (e.g., Rhodopseudomonas genus, Pseudomonas genus, Esherichia genus, Salmonella genus, Nitrobacter genus, Thiobacillus genus, Neisseria genus etc.)
  • eukaryotic microorganisms include fungi such as filamentous fungi (molds) and yeasts.
  • prokaryotic cells which may be either prokaryotic cells or eukaryotic cells, include cells of prokaryotic microorganisms, and examples of eukaryotic cells include eukaryotic cells. Examples include nuclear microorganism cells, animal or plant cells, and the like.
  • sample for example, soil, water, mud, sediment, or a treated product thereof collected from various environments can be used.
  • Examples of the treatment of soil, water, mud, sediment, etc. collected from various environments include suspension or dilution with a buffer solution or the like, filtration with a filter, etc.
  • sample for example, a sample prepared by adding a buffer solution to soil, mud, sediment, etc. to be suspended and filtering with a filter etc. to remove solids such as pebbles can be used.
  • the ion exchanger particles are particles that also have an ion exchanger force.
  • the ion exchanger has an ion exchange group held on a water-insoluble substrate, and examples thereof include ion exchange resin and ion exchange cellulose.
  • ion exchange resin substrates include
  • the particle size of the ion exchanger particles is usually 0.1 ⁇ m to 1 mm, preferably 0.5 to 10 ⁇ m.
  • the ion exchanger particles may be force-indefinite, usually spherical.
  • a calcium phosphate compound hide-mouthed gel is a gel in which water molecules are held between calcium phosphate compounds aggregated in a network.
  • the Ca ZP molar ratio in the calcium phosphate compound is usually 0.5 to 2.0, preferably 1.0 to 1.7.
  • apatite particularly hydroxyapatite [Ca (PO) (OH)] is preferred.
  • the calcium phosphate compound hide-mouthed gel can be prepared according to a conventional method.
  • apatite as the calcium phosphate-based compound
  • P H2 an acid such as hydrochloric acid
  • An apatite hydride mouth gel can be prepared.
  • a hide-mouth gel can be similarly prepared.
  • the magnetic particles are particles made of a magnetic material such as iron hydroxide and acid iron hydrate.
  • the particle size of the magnetic particles is usually 10 nm to 10 ⁇ m, preferably 40 nm to 1 ⁇ m.
  • the magnetic particles may be force-indefinite, usually spherical.
  • a magnetic particle whose surface is coated with a calcium phosphate compound compound or id gel (hereinafter sometimes referred to as "surface-coated magnetic particle") is dispersed in the calcium phosphate compound hide gel. Then, it can be prepared by separating the calcium phosphate-based compound gel and the gel in a lump by ultrasonic treatment or the like.
  • the surface-coated magnetic particles thus prepared may take a form in which one magnetic particle is held inside one lump of calcium phosphate compound hydrogel, but usually a plurality of magnetic particles are used. It takes the form that a child is held inside a lump of calcium phosphate-based hyde mouth gel.
  • the liquid containing the sample, the ion exchanger particles, and the surface-coated magnetic particles is a liquid in which microorganisms or cells contained in the sample can stably exist.
  • a liquid include: , Buffer solution, physiological saline, liquid medium or a mixture thereof.
  • the liquid containing the sample, the ion exchanger particles, and the surface-coated magnetic particles may contain a buffer, an isotonic agent, a pH adjuster, and the like. “The microorganism or cell can exist stably” means that the microorganism or cell does not have to be destroyed, and the microorganism or cell need not be able to survive.
  • a liquid containing a sample, ion exchanger particles, and surface-coated magnetic particles is, for example, a liquid sample. It can be prepared by adding ion exchanger particles (or a solution containing ion exchanger particles) and surface-coated magnetic particles (or a solution containing surface-coated magnetic particles) to the material.
  • the ion exchanger particles, and the surface-coated magnetic particles are bonded to each other.
  • a composite containing the particles and the surface-coated magnetic particles is formed.
  • the binding between the microorganism or cell and the ion exchanger particle is, for example, an ion exchange group possessed by the ion exchanger particle and a functional group on the microorganism or cell surface (the ion exchange group can exchange a cation).
  • the ion exchange group can exchange a cation
  • it is a functional group such as an amino group and the ion exchange group can exchange an anion, for example, it is a functional group such as a phosphate group or a carboxyl group. Conceivable.
  • the binding between the microorganism or cell and the surface-coated magnetic particle is, for example, a reaction between a functional group (for example, a phosphate group) on the microorganism or cell surface and a calcium site of the surface-coated magnetic particle, or a microorganism or cell.
  • a functional group for example, a phosphate group
  • This is considered to be caused by a reaction between a functional group on the surface (for example, an amino group) and the phosphoric acid portion of the surface-coated magnetic particles.
  • the binding between the surface-coated magnetic particles and the ion exchanger particles is, for example, a reaction between a nitrogen atom site of the anion exchanger and a functional group (for example, a phosphate group) on a microorganism or cell surface, or ion exchange. It is thought to be caused by a reaction between a hydrophobic part of the resin (for example, a styrenic rosin base) and a hydrophobic part (for example, a lipid part) on the surface of a microorganism or cell.
  • a hydrophobic part of the resin for example, a styrenic rosin base
  • a hydrophobic part for example, a lipid part
  • the order of mixing the sample, ion exchanger particles, and surface-coated magnetic particles is not particularly limited.
  • the surface-coated magnetic particles may be mixed after mixing the ion-exchanger particles! /, And the ion-exchanger particles may be mixed after mixing the sample and the surface-coated magnetic particles! /
  • the sample may be mixed after the ion exchanger particles and the surface-coated magnetic particles are mixed, and the sample, the ion exchanger particles, and the surface-coated magnetic particles may be mixed at the same time.
  • the microorganisms or cells can be separated more efficiently than when mixing in the other order. That is, when the surface-coated magnetic particles are mixed after mixing the sample and the ion exchanger particles, a large amount of microorganisms or cells are aggregated due to the binding between the ion exchanger particles and the microorganisms or cells, and a large amount of the aggregated microorganisms are formed. Since it is covered with the surface-coated magnetic particles, a complex containing a large amount of microorganisms or cells can be formed, and the complex force of the microorganisms or cells can be prevented from detaching.
  • the temperature at which a complex containing microorganisms or cells, ion exchanger particles and surface-coated magnetic particles is formed is usually 20 to 40 ° C, preferably 25 to 37 ° C, and the pH is usually pH 4-9, preferably pH 7-9.
  • the liquid force can also be separated by the action of a magnet.
  • a permanent magnet or an electromagnet can be used as the magnet.
  • Complex power When dissociating microorganisms or cells, the complex can be reacted with a chelating agent solution such as potassium phosphate buffer, EDTA, or citrate, or the pH of the complex-containing solution can be lowered.
  • Nucleic acid extraction from a microorganism or cell separated from a sample can be performed according to a conventional method. For example, after a microorganism or cell is treated with a cell lysing agent such as lysozyme and lysed, the surface is coated with a substance that can bind to nucleic acid (for example, silica, alkyl silica, aluminum silicate (zeolite), etc.). Nucleic acids extracted from microorganisms or cells can be obtained by mixing body particles, forming a complex containing nucleic acid and magnetic particles, and separating the complex by applying a magnet.
  • a cell lysing agent such as lysozyme and lysed
  • Nucleic acids extracted from microorganisms or cells can be obtained by mixing body particles, forming a complex containing nucleic acid and magnetic particles, and separating the complex by applying a magnet.
  • a nucleic acid extraction apparatus using a dispenser for example, SX-6GC (manufactured by Precision System Science Co., Ltd.)
  • a dispenser for example, SX-6GC (manufactured by Precision System Science Co., Ltd.)
  • magnetic particles for separation of microorganisms or cells from a sample and nucleic acid extraction from separated microorganisms or cells
  • a series of steps from separation of microorganisms or cells to extraction of nucleic acids can be automated.
  • hydroxyapatite crystal powder manufactured by Sangi, for chromatography
  • 4 ml of 2N hydrochloric acid manufactured by Wako
  • pH becomes 2.0 or less
  • 4 ml of 2N sodium hydroxide manufactured by Wako
  • add 6g of 40-60nm magnetite particles US Army
  • further sterilized ultrapure water to make the total volume 200ml, and then ultrasonically treat for 5-10 minutes.
  • Magnetite particles (hereinafter referred to as “surface-coated magnetite particles”) whose surface was coated with a hydride gel were prepared.
  • the surface-coated magnetite particles thus prepared take a form in which a plurality of magnetite particles are held inside one lump of calcium phosphate-based hyde mouth gel.
  • the surface-coated magnetite particles were sterilized by autoclaving at 121 ° C for 15 minutes and then used.
  • anion exchange resin Amberlite, manufactured by Organo
  • anion exchange resin Amberlite, manufactured by Organo
  • the body is a styrenic polymer.
  • Example 3 Separation of microorganisms from a sample and extraction of genomic DNA of separated microorganisms
  • a complex containing microorganisms contained in the soil solution, ion exchanger particles, and surface-coated magnetite particles was formed.
  • ion exchanger particles were added to the soil solution and stirred using vortex, then surface-coated magnetite particles were added, and the mixture was stirred using vortex.
  • the complex was separated from the soil solution using a magnet. 800 mM potassium phosphate buffer (KPB, manufactured by Wako) 200 1 was added to the separated complex and stirred at room temperature for 20 minutes to dissociate microorganisms from the complex. The magnetite particles and the solution were separated using a magnet, and the solution was recovered.
  • KPB potassium phosphate buffer
  • FIG. 1 As a result, as shown in FIG. 1, it was confirmed that genomic DNA having a length of 10 kilobase pairs or more was recovered, although the amount was somewhat.
  • “ ⁇ ” represents a molecular weight marker (Wide range marker (Takara))
  • lanes 1 to 3 are the results of the nucleic acid extraction device (lanes 1 to 3 correspond to sample numbers 1 to 3, respectively).
  • Lanes 4 to 6 show the results of existing DNA extraction kits (lanes 4 to 6 correspond to sample numbers 1 to 3, respectively).
  • Fig. 2 shows the results of electrophoresis.
  • “ ⁇ ” represents the molecular weight marker ( ⁇ -HindIII)
  • lane 1 shows the result of direct DNA extraction from the E. coli culture solution
  • lane 2 shows the result of Example 4 (1)
  • Lane 3 shows the results of Example 4 (2).
  • Table 2 shows the quantification results of the extracted DNA. Quantification of DNA was measured using an absorbance meter DU530 (manufactured by Beckman).
  • the recovery rate of genomic DNA is higher when the surface-coated magnetite particles are used in combination with the ion exchanger than when the surface-coated magnetite particles are used alone. That is, it was confirmed that E. coli capture efficiency was high.

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Abstract

　微生物又は細胞を含有する試料から効率よく微生物又は細胞を分離する方法、及び該方法を用いて分離した微生物又は細胞から核酸を抽出する方法を提供することを目的し、この目的を達成するために、微生物又は細胞を含有する試料と、イオン交換体粒子と、リン酸カルシウム系化合物ハイドロゲルで表面が被覆された磁性体粒子とを含む液体を調製し、磁石を作用させて液体から微生物又は細胞とイオン交換体粒子と磁性体粒子とを含む複合体を分離することにより、試料に含有される微生物又は細胞を分離する。

Description

明 細 書
微生物又は細胞の分離方法
技術分野
[0001] 本発明は、試料から微生物又は細胞を分離する方法、及び該方法を用いて分離し た微生物又は細胞力 核酸を抽出する方法に関する。
背景技術
[0002] 各種環境には有用な遺伝子を有する多種類の微生物が存在している力 各種環 境からの微生物の取得が困難であるため、各種環境に存在する微生物の有用な遺 伝子につ 、てほとんど解析されて ヽな 、のが現状である。
このため、各種環境力 採取した試料 (例えば土壌、水、泥、堆積物等)から効率よ く微生物を分離する方法が求められている。
[0003] 試料力 の細菌類の分離方法としては、ハイドロキシアパタイト結晶を塩酸 (pH2.
0)で溶解した後、水酸ィ匕ナトリウムをカ卩えて pHを 8. 0に調整することによりハイドロキ シアパタイトゲルを形成させ、これに磁性粒子をカ卩えて超音波処理することによりハイ ドロキシアパタイトゲルで表面が被覆された磁性体粒子 (以下「表面被覆磁性体粒子
」という。）を調製し、表面被覆磁性体粒子を大腸菌含有液に加えて表面被覆磁性体 粒子と大腸菌とを含む複合体を形成させ、磁石を作用させて複合体を分離し、分離 された複合体を EDTA等のキレート剤で処理して複合体から大腸菌を解離させる方 法が知られて ヽる（特許文献 1)。
特許文献 1 :特開 2003— 102465号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、微生物又は細胞を含有する試料から効率よく微生物又は細胞を分離す る方法、及び該方法を用いて分離した微生物又は細胞力 核酸を抽出する方法を 提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 上記目的を達成するために、本発明は、微生物又は細胞を含有する試料から前記 微生物又は前記細胞を分離する方法であって、前記試料と、イオン交換体粒子と、リ ン酸カルシウム系化合物ハイド口ゲルで表面が被覆された磁性体粒子とを含む液体 を調製し、磁石を作用させて前記液体から前記微生物又は前記細胞と前記イオン交 換体粒子と前記磁性体粒子とを含む複合体を分離することを特徴とする方法を提供 する。
[0006] また、本発明は、試料に含有される微生物又は細胞から核酸を抽出する方法であ つて、本発明の方法を用いて前記試料から前記微生物又は前記細胞を分離し、分 離した前記微生物又は前記細胞から核酸を抽出することを特徴とする方法を提供す る。
発明の効果
[0007] 本発明によれば、微生物又は細胞を含有する試料力 効率よく微生物又は細胞を 分離する方法、及び該方法を用いて分離した微生物又は細胞から核酸を抽出する 方法が提供される。本発明の方法によれば、リン酸カルシウム系化合物ハイド口ゲル で表面が被覆された磁性体粒子とイオン交換体粒子とを併用することにより、リン酸 カルシウム系化合物ハイド口ゲルで表面が被覆された磁性体粒子を単独で使用する 場合よりも効率よく試料力 微生物又は細胞を分離することができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]高温環境土壌力も抽出したゲノム DNAの電気泳動結果を示す図である。
[図 2]大腸菌培養液力 抽出したゲノム DNAの電気泳動結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 試料は、 1種類又は 2種類以上の微生物又は細胞を含有する。試料に含有される 微生物又は細胞の種類は既知であってもよ 、し、未知であってもよ 、。
[0010] 試料に含有される微生物は、原核微生物及び真核微生物のいずれであってもよく 、原核微生物としては、例えば、グラム陽性菌（例えば、 Micrococcus属、 Staphylococ cus属、 Bacillus晨、 ClostndiumJ¾、 Lactobacillus属、 Corynebacterium為、 Streptomyc es属等)、グフム陰'性菌 (f列 ば、 Rhodopseudomonas属、 Pseudomonas属、 Esherichia 属、 Salmonella属、 Nitrobacter属、 Thiobacillus属、 Neisseria属等）等の細菌類が挙げ られ、真核微生物としては、例えば、糸状菌 (カビ類)、酵母等の真菌類が挙げられる [0011] 試料に含有される細胞は、原核細胞及び真核細胞のいずれであってもよぐ原核 細胞としては、例えば、原核微生物の細胞等が挙げられ、真核細胞としては、例えば 、真核微生物の細胞、動物又は植物の細胞等が挙げられる。
[0012] 試料としては、例えば、各種環境から採取した土壌、水、泥、堆積物又はこれらの 処理物等を使用することができる。各種環境から採取した土壌、水、泥、堆積物等の 処理としては、例えば、緩衝液等の添カ卩による懸濁又は希釈、フィルタ一等によるろ 過等が挙げられる。試料としては、例えば、土壌、泥、堆積物等に緩衝液を加えて懸 濁し、フィルタ一等でろ過して小石等の固形物を除去することにより調製した試料を 使用することができる。
[0013] イオン交換体粒子は、イオン交換体力もなる粒子である。イオン交換体は、イオン交 換基が水不溶性の基体に保持されたものであり、例えば、イオン交換榭脂、イオン交 換セルロース等が挙げられる。イオン交換基は、陽イオンを交換可能な酸性基及び 陰イオンを交換可能な塩基性基のいずれであってもよぐ陽イオンを交換可能な酸 性基としては、例えば、 -SO M (M = H, Na等）（強酸性基）、—COOM (M = H,
3
Na等）（弱酸性基）、 -O-CH COOM (M = H, Na等）（弱酸性基）、—CH N+(C
2 2
H ) (C H OH) (強塩基性基）、 NX≡(CH ) (X=C1等）（強塩基性基）、 CH N+
3 2 2 4 3 3 2
H(CH ) (弱塩基性基)、 N+H (弱塩基性基)、 -N(CH ) (弱塩基性基)、 O—
3 2 3 3 2
C H -NH (弱塩基性基)等が挙げられる。イオン交換樹脂の基体としては、例え
2 4 2
ば、スチレン系、メタクリル系、アクリル系等の樹脂が挙げられる。イオン交換体粒子 の粒径は通常 0. 1 μ m〜lmm、好ましくは 0. 5〜10 μ mである。イオン交換体粒子 は通常球状である力 不定形であってもよい。
[0014] リン酸カルシウム系化合物ハイド口ゲルは、網目状に凝集したリン酸カルシウム系化 合物の間に水分子が保持されたものである。リン酸カルシウム系化合物における Ca ZPモル比は通常 0. 5〜2. 0、好ましくは 1. 0〜1. 7である。リン酸カルシウム系ィ匕 合物としては、例えば、アパタイト [Ca (PO ) X (X=OH, F, CI等)]、 Ca不足ハイド
10 4 6 2
ロキシアパタイト [Ca H (PO ) (OH) ]、リン酸 8カルシウム [Ca H (PO ) · 5Η O
10-X 2X 4 6 2 8 2 4 6 2
]、リン酸 4カルシウム [Ca P O ]、第三リン酸カルシウム [Ca (PO ) ]、ピロリン酸カル シゥム [Ca P O ]、メタリン酸カルシウム [Ca(PO ) ]、第一リン酸カルシウム [Ca(H PO
2 2 7 3 2 2
) ·Η 0]、第二リン酸カルシウム [CaHPO · 2Η Ο, CaHPO ]等が挙げられるが、こ
4 2 2 4 2 4
れらのうちアパタイト、特にヒドロキシアパタイト [Ca (PO ) (OH) ]が好ましい。ァパタ
10 4 6 2
イトハイド口ゲル、特にヒドロキシアパタイトハイド口ゲルは、その他のリン酸カルシウム 系化合物ハイド口ゲルに比べて水に対する溶解度が小さいからである。
[0015] リン酸カルシウム系化合物ハイド口ゲルは常法に従って調製することができる。リン 酸カルシウム系化合物としてアパタイトを使用する場合、アパタイト結晶を塩酸等の酸 (PH2以下)で溶解した後、水酸ィ匕ナトリウム等のアルカリをカ卩えて pHを 7以上に調整 することにより、アパタイトハイド口ゲルを調製することができる。その他のリン酸カルシ ゥム系化合物の場合も同様にハイド口ゲルを調製することができる。
[0016] 磁性体粒子は、水酸化鉄、酸ィ匕鉄水和物等の磁性体カゝらなる粒子である。磁性体 粒子の粒径は通常 10nm〜10 μ m、好ましくは 40nm〜l μ mである。磁性体粒子 は通常球状である力 不定形であってもよい。
[0017] リン酸カルシウム系化合物ノ、イド口ゲルで表面が被覆された磁性体粒子 (以下「表 面被覆磁性体粒子」という場合がある。）は、リン酸カルシウム系化合物ハイド口ゲル に磁性体粒子を分散させた後、超音波処理等によりリン酸カルシウム系化合物ノ、イド 口ゲルを複数個の塊に分離することにより調製することができる。こうして調製された 表面被覆磁性体粒子は、 1個の磁性体粒子が 1個のリン酸カルシウム系化合物ハイ ドロゲルの塊の内部に保持された形態をとる場合もあるが、通常、複数個の磁性体粒 子が 1個のリン酸カルシウム系ハイド口ゲルの塊の内部に保持された形態をとる。
[0018] 試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体は、試料に含有され る微生物又は細胞が安定して存在することができる液体であり、このような液体として は、例えば、緩衝液、生理食塩水、液体培地又はこれらの混合物等が挙げられる。 試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体は、緩衝剤、等張化剤 、 pH調整剤等を含有していてもよい。なお、「微生物又は細胞が安定して存在するこ とができる」とは、微生物又は細胞が破壊されなければよぐ必ずしも微生物又は細 胞が生存することができる必要はな 、。
[0019] 試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体は、例えば、液体試 料にイオン交換体粒子 (又はイオン交換体粒子含有液)及び表面被覆磁性体粒子（ 又は表面被覆磁性体粒子含有液)を加えることにより調製することができる。
[0020] 試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体中では、微生物又は 細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とが互いに結合し合い、微生物又は 細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む複合体が形成される。
[0021] 微生物又は細胞とイオン交換体粒子との結合は、例えば、イオン交換体粒子が有 するイオン交換基と、微生物又は細胞表面の官能基 (イオン交換基が陽イオンを交 換可能である場合、例えば、アミノ基等の官能基であり、イオン交換基が陰イオンを 交換可能である場合、例えば、リン酸基、カルボキシル基等の官能基である。 )との反 応等により生じると考えられる。
[0022] 微生物又は細胞と表面被覆磁性体粒子との結合は、例えば、微生物又は細胞表 面の官能基 (例えばリン酸基)と、表面被覆磁性体粒子のカルシウム部位との反応、 微生物又は細胞表面の官能基 (例えばアミノ基)と表面被覆磁性体粒子のリン酸部 位との反応等により生じると考えられる。
[0023] 表面被覆磁性体粒子とイオン交換体粒子との結合は、例えば、陰イオン交換体が 有する窒素原子部位と微生物又は細胞表面の官能基 (例えばリン酸基)との反応、ィ オン交換樹脂の疎水性部分 (例えばスチレン系の榭脂基体)と微生物又は細胞表面 の疎水性部分 (例えば脂質部分)との反応等により生じると考えられる。
[0024] 微生物又は細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む複合体の形 成効率を向上させる点から、微生物又は細胞とイオン交換体との接触効率、微生物 又は細胞と表面被覆磁性体粒子との接触効率、及びイオン交換体粒子と表面被覆 磁性体粒子との接触効率を攪拌等により向上させることが好ま ヽ。
[0025] 試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む液体を調製する際、試料 とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを混合する順序は特に限定されるもの ではなぐ試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性体粒子を混合し てもよ!/、し、試料と表面被覆磁性体粒子とを混合した後にイオン交換体粒子を混合し てもよ!/、し、イオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを混合した後に試料を混合し てちよ ヽし、試料とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを同時に混合してもよ いが、試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性体粒子を混合するこ とが好まし!/ヽ。試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性体粒子を混 合する場合、その他の順序で混合する場合よりも効率よく微生物又は細胞を分離す ることができる。すなわち、試料とイオン交換体粒子とを混合した後に表面被覆磁性 体粒子を混合すると、イオン交換体粒子と微生物又は細胞との結合により多量の微 生物又は細胞が凝集し、凝集した多量の微生物が表面被覆磁性体粒子によって覆 われるので、多量の微生物又は細胞が含まれる複合体を形成することができるととも に、微生物又は細胞が複合体力 離脱することを防止することができる。
[0026] 微生物又は細胞とイオン交換体粒子と表面被覆磁性体粒子とを含む複合体を形 成させる際の温度は通常 20〜40°C、好ましくは 25〜37°Cであり、 pHは通常 pH4〜 9、好ましくは pH7〜9である。
[0027] こうして形成された複合体は磁性体粒子を含むので、磁石を作用させることにより 液体力も分離することができる。磁石としては、例えば、永久磁石、電磁石等を使用 することができる。複合体力 微生物又は細胞を解離させる際には、複合体をリン酸 カリウムバッファー、 EDTA、クェン酸等のキレート剤溶液と反応させるか、又は複合 体含有液の pHを降下させればょ 、。
[0028] 試料から分離した微生物又は細胞からの核酸抽出は、常法に従って行うことができ る。例えば、微生物又は細胞をリゾチーム等の細胞溶解剤で処理して溶解した後、 核酸が結合可能な物質 (例えば、シリカ、アルキルシリカ、ケィ酸アルミニウム (ゼオラ イト)等)で表面が被覆された磁性体粒子を混合し、核酸と磁性体粒子とを含む複合 体を形成させ、磁石を作用させて複合体を分離することにより、微生物又は細胞から 抽出した核酸を取得することができる。この際、分注機を利用した核酸抽出装置 (例 えば SX— 6GC (プレシジョン ·システム ·サイエンス株式会社製) )を使用することがで きる。試料からの微生物又は細胞の分離及び分離した微生物又は細胞からの核酸 抽出に磁性体粒子を利用することにより、微生物又は細胞の分離から核酸抽出に至 る一連の工程を自動化することができる。
実施例
[0029] 〔実施例 1〕ハイドロキシアパタイトハイド口ゲルで表面が被覆されたマグネタイト粒子 の調製
滅菌した超純水 100mlにハイドロキシアパタイト結晶粉末 (サンギ製、クロマトグラフ ィー用） 0. 4gを懸濁し、 2Nの塩酸 (和光製)を 4ml加え、完全に溶解した。この際、 p Hが 2. 0以下となる。次いで、 2Nの水酸化ナトリウム（和光製）を 4mlカ卩えて pHを 8. 0に調整し、ハイドロキシアパタイトハイド口ゲルを調製した。次いで、 40〜60nmのマ グネタイト粒子（US Army) 6gをカ卩え、さらに滅菌した超純水をカ卩えて全体量を 200 mlにした後、超音波で 5〜10分処理し、ハイドロキシアパタイトハイド口ゲルで表面が 被覆されたマグネタイト粒子 (以下「表面被覆マグネタイト粒子」と ヽぅ。 )を調製した。 こうして調製された表面被覆マグネタイト粒子は、複数個のマグネタイト粒子が 1個の リン酸カルシウム系ハイド口ゲルの塊の内部に保持された形態をとる。表面被覆マグ ネタイト粒子はオートクレープにより 121°Cで 15分間滅菌処理した後、使用した。
[0030] 〔実施例 2〕イオン交換体粒子の調製
陰イオン交換榭脂 (オルガノ製、アンバーライト)約 lgを乳鉢で粉末状にすりつぶし 、 5mlの滅菌した超純水に懸濁した。なお、使用した陰イオン交換榭脂におけるィォ ン交換基は第 4ァミン（—NX≡(CH )、 X=C1)であり、イオン交換基を保持する基
3 3
体はスチレン系ポリマーである。
[0031] 〔実施例 3〕試料からの微生物の分離及び分離した微生物力 のゲノム DNAの抽出
(1)高温環境土壌の採取
各種環境に存在する微生物の有用な酵素を利用するためには、その環境に存在 する微生物の DNAを取得することが重要である。そこで、高温環境の代表として性 質 (pH)の異なる九州鹿児島県霧島温泉郷の温泉地帯を選択した。
温泉地域内の特定の領域には、マッドポット（泥が煮立っているような穴）が天然の 状態 (人手の入らない状態)で幾つも存在している。これらの地点から、採取地点ごと に、温度、 pH等のデータとともに採取試料の色、水分量等の状態を映像等により記 録した。その結果、表 1に示すような環境の異なる土壌が採取できた。各地点からは 、十分量の DNAが回収できるように、 lOOg程度の土壌を採取した。
[0032] [表 1] 試料 ¾" /皿 3^ P H
1 9 7。C 4
2 9 0 °C 5
3 9 4 °C 5
[0033] (2)高温環境土壌に存在する微生物の捕獲
採取された土壌 10gを 50mlの遠心管に分取した後、懸濁 Buffer(100mMのTris —HC1緩衝液（pH8. 0、和光製）、 0. 05%の Tween20 (和光製）） 5mlをカ卩え、ボ ルテックスを用いて室温でよく攪拌した。次いで、大きな石等を取り除く目的で、この 土壌溶液をフィルターで分離した。石等を取り除いた土壌溶液 5mlに、実施例 1で調 製した表面被覆マグネタイト粒子 500 μ 1と実施例 2で調製したイオン交換体粒子 10 0 1とをカロえ、ボルテックスを用いてよく攪拌した。これにより、土壌溶液に含有される 微生物とイオン交換体粒子と表面被覆マグネタイト粒子とを含む複合体が形成され た。なお、複合体を形成させる際、まず土壌溶液にイオン交換体粒子を添加し、ボル テックスを用いて攪拌した後、表面被覆マグネタイト粒子を添加し、ボルテックスを用 いて携拌した。
磁石を用いて土壌溶液から複合体を分離した。分離した複合体に 800mMのリン 酸カリウムバッファー (KPB、和光製） 200 1をカ卩え、室温で 20分間攪拌し、複合体 カゝら微生物を解離させた。磁石を用いてマグネタイト粒子と溶液とを分離し、溶液を 回収した。
[0034] (3)高温環境土壌に存在する微生物の DNA抽出
回収した溶液 200 μ 1に、超純水で調製した 70mgZmlのリゾチーム（和光製） 20 1を加え、 37°Cで 10分間処理して微生物を溶解した後、小型核酸抽出装置 SX— 6GC (プレシジョン'システム 'サイエンス製）を用いて、 DN A抽出を行った。抽出操 作は、プロトコル ICカード「Genomic DNA whole blood」（プレシジョン'システ ム.サイエンス製）に従い、プレパック試薬「GC series Magtration Genomic D NA whole blood」（プレシジョン'システム 'サイエンス製）を用いて行った。また別 に、 Ultra clean Soil kit (Mo社製）を用いて DNA抽出を行った。
[0035] 実際に抽出した DNA溶液の 1Z20量である 5 μ 1を分取し、 1 μ 1の電気泳動用濃 縮染色液（0. 25%ブロモフエノールブルー， 0. 25%キシレンシァノール， 30%グリ セロール）を加え、 1. 0%ァガロースゲル電気泳動で確認した。
その結果、図 1に示すように、量の多少は有るが、 10キロ塩基対以上の長さのゲノ ム DNAが回収されていることが確認できた。なお、図 1中、「Μ」は分子量マーカー（ Wide range marker (Takara) )を表し、レーン 1〜3は核酸抽出装置による結果（レー ン 1〜3はそれぞれ試料番号 1〜3に対応する）を示し、レーン 4〜6は既存の DNA 抽出キットによる結果 (レーン 4〜6はそれぞれ試料番号 1〜3に対応する）を示す。
[0036] 〔実施例 4〕イオン交換体粒子の有無に基づく大腸菌の捕獲効率の比較
(1)ハイドロキシアパタイトハイド口ゲルで表面が被覆されたマグネタイト磁性粒子を 用いた大腸菌の捕獲
LB培養液を用いて 37°Cで 15時間培養した大腸菌 (E. Coli)溶液 lmlに、実施例 1に調製した表面被覆マグネタイト粒子 100 1をカ卩え、ボルテックスを用いて室温で よく攪拌し、大腸菌と表面被覆マグネタイト粒子とを含む複合体を形成させた。磁石 を用いて複合体を分離し、分離した複合体に EDTA' 2Na (和光製)を 200 μ 1加え、 室温で 20分間攪拌した。磁石を用いてマグネタイト粒子を分離し、溶液を回収した。
[0037] (2)ハイドロキシアパタイトハイド口ゲルで表面が被覆されたマグネタイト磁性粒子及 びイオン交換体粒子を用いた大腸菌の捕獲
LB培養液を用いて 37°Cで 15時間培養した大腸菌 (E. Coli)溶液 lmlに、実施例 1で調製した表面被覆マグネタイト粒子 100 μ 1と実施例 2で調製したイオン交換体粒 子 100 1とをカ卩え、ボルテックスを用いて室温でよく攪拌し、大腸菌とイオン交換体 粒子と表面被覆マグネタイト粒子とを含む複合体を形成させた。なお、複合体を形成 させる際、まず大腸菌溶液にイオン交換体粒子を添加し、ボルテックスを用いて攪拌 した後、表面被覆マグネタイト粒子を添加し、ボルテックスを用いて攪拌した。磁石を 用いて複合体を分離し、分子した複合体に 800mMの ΚΡΒ (和光製)を 200 μ 1カロえ 、室温で 20分間攪拌した。磁石を用いて磁性粒子を分離し、溶液を回収した。
[0038] (3)菌体溶液からの DNA抽出 回収した 200 μ 1の溶液に、超純水で調整した 70mgZmlのリゾチーム（和光製）を 20 1加え、 37°Cで 10分間処理し、小型核酸抽出装置 SX— 6GC (プレシジョン 'シ ステム.サイエンス製)を用いて、 DNA抽出を行った。抽出操作は、プロトコル ICカー ド「Genomic DNA whole blood」（プレシジョン.システム.サイエンス製）に従い 、プレノヽック試薬「GC series Magtration Genomic DNA whole bloodj ( プレシジョン ·システム ·サイエンス製）を用いて行った。
[0039] 実際に抽出した DNA溶液の 1Z20量である 5 1 (分子量マーカーは 3 μ 1)を分取 し、 1 1の電気泳動用濃縮染色液（0. 25%ブロモフエノールブルー， 0. 25%キシ レンシァノール， 30%グリセロール）を加え、 1. 0%ァガロースゲル電気泳動（100V , 30分)で確認した。
電気泳動の結果を図 2に示す。図 2中、「Μ」は分子量マーカー（λ—HindIII)を表 し、レーン 1は、大腸菌培養液カゝら DNAを直接抽出した結果を示し、レーン 2は実施 例 4 (1)の結果を示し、レーン 3は、実施例 4 (2)の結果を示す。また、抽出した DNA の定量結果を表 2に示す。 DNAの定量は、吸光度計 DU530 (Beckman製）を用い て測定した。
[0040] [表 2]
Figure imgf000011_0001
[0041] 図 2及び表 2に示すように、表面被覆マグネタイト粒子を単独で使用する場合よりも 表面被覆マグネタイト粒子とイオン交換体とを併用する場合の方がゲノム DNAの回 収量が多いこと、すなわち大腸菌の捕獲効率が高いことが確認できた。

Claims

請求の範囲
[1] 微生物又は細胞を含有する試料から前記微生物又は前記細胞を分離する方法で あって、
前記試料と、イオン交換体粒子と、リン酸カルシウム系化合物ハイド口ゲルで表面が 被覆された磁性体粒子とを含む液体を調製し、
磁石を作用させて前記液体から前記微生物又は前記細胞と前記イオン交換体粒 子と前記磁性体粒子とを含む複合体を分離することを特徴とする方法。
[2] 試料に含有される微生物又は細胞から核酸を抽出する方法であって、
請求項 1記載の方法を用いて前記試料から前記微生物又は前記細胞を分離し、 分離した前記微生物又は前記細胞から核酸を抽出することを特徴とする方法。
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