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WO2005120579A1 - 膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープの凍結乾燥組成物 - Google Patents

膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープの凍結乾燥組成物 Download PDF

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WO2005120579A1
WO2005120579A1 PCT/JP2005/010720 JP2005010720W WO2005120579A1 WO 2005120579 A1 WO2005120579 A1 WO 2005120579A1 JP 2005010720 W JP2005010720 W JP 2005010720W WO 2005120579 A1 WO2005120579 A1 WO 2005120579A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
freeze
cells
envelope
dried composition
virus envelope
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/010720
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takafumi Ueda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Original Assignee
Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ishihara Sangyo Kaisha Ltd filed Critical Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
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Priority to AT05749035T priority patent/ATE495760T1/de
Priority to DE602005026005T priority patent/DE602005026005D1/de
Priority to US11/629,289 priority patent/US20080102524A1/en
Priority to EP05749035A priority patent/EP1757312B1/en
Publication of WO2005120579A1 publication Critical patent/WO2005120579A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US12/582,115 priority patent/US8043610B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a freeze-dried composition of an inactive danivirus envelope having membrane fusion activity.
  • the present invention relates to a freeze-dried composition for introducing a nucleic acid, protein, drug or the like into cells and living tissues, a method for producing the composition, and a method for using the composition.
  • virus vector methods and non-viral (synthetic) vector methods have been developed for introducing foreign substances such as genes into cells or living tissues.
  • the viral vector method is more effective than the non-viral vector method in introducing foreign substances for gene delivery to cells.
  • viral vectors can raise safety issues due to the co-introduction of essential gene elements of parenteral virulence, leaky expression of viral genes, immunogenicity, and alteration of host genomic structure.
  • non-viral vectors are less cytotoxic and less immunogenic.
  • the non-viral vector method since a foreign substance is generally taken into cells by an endocytosis pathway, the ability to introduce genes and the like is lower than in the viral vector method. Holding
  • HVJ active HVJ envelope
  • Patent Document 2 Inactive in the presence of genes to be introduced into cells
  • the gene is encapsulated in the envelope by subjecting the envelope to freeze-thawing or treatment with a surfactant, and then the envelope is brought into contact with cells to be transfected, whereby the envelope is mediated through membrane fusion activity.
  • a gene or the like is introduced into cells.
  • Inactivated HVJ envelopes can be mass-produced and can be used to introduce genes, etc., by a relatively simple method. Therefore, they are used in a number of tests for introducing foreign substances into cells.
  • this inactive iDani HVJ envelope can be frozen and stored (70 ° C) while retaining its ability to introduce genes and the like. No report. It is presumed that the function or structure of the inactive HVJ envelope having membrane fusion activity due to lyophilization is impaired, but from the viewpoint of transportation and storage, the inactive HVJ envelope frozen by lyophilization can be stored at higher temperatures. There was a need for a dry composition.
  • Patent Document 1 U.S. Patent 5,631,237
  • Patent Document 2 WOOlZ57204
  • Non-patent document l Dzau, VJet al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 11421 to 11425 (1996)
  • Non-patent document 2 Kaneda, Y. et al. Molecular Medicine Today, 5, 298 to 303 (1999) ) Disclosure of the invention
  • the inventors of the present invention have intensively studied a method of freeze-drying an inactive iDani virus envelope having fusogenic activity. As a result, the addition of a protein hydrolyzate or a certain amino acid does not affect the fusogenic activity. It has been found that the active envelope is effective in retaining the ability to introduce foreign substances into the virus envelope. Further, they have found that reduction of salts is also effective in maintaining the ability to introduce a foreign substance into an inactive Gani virus envelope having membrane fusion activity, and completed the present invention. It has also been found that these treatments effectively maintain the membrane fusion activity of the above-described inactivated Giravirus virus envelope. Further, the obtained inactive iDani virus envelop having membrane fusion activity is obtained. A novel method for introducing foreign substances using a freeze-dried composition of a pump has been completed. That is, the present invention has the following features.
  • the invention comprises an inactive Giravirus virus envelope having fusogenic activity, and one or more stabilizers selected from the group consisting of protein hydrolyzate, leucine, L-arginic acid and polysaccharides. Freeze-dried composition.
  • Inactive iDani virus envelope with membrane fusion activity It is an inactive iDani virus envelope of viruses of the Noramyxoviridae, orthomyxoviridae, herpesviridae, hepadnaviridae, or flaviviridae. Lyophilized composition according to 1 above
  • the freeze-dried composition is the freeze-dried composition according to any one of the above 1 to 8, 9.
  • the previously reported inactive iDani virus envelopes with membrane fusion activity must be stored frozen (20 ° C), more preferably ultra-frozen (170 ° C or less).
  • the activity of introducing foreign substances was significantly reduced in about 2 weeks under refrigeration. Therefore, it was difficult to store in a place without freezing or ultra-freezing equipment, and it was also difficult to transport it which required a long time.
  • the freeze-dried composition of the inactive iDani virus envelope having the membrane fusion activity of the present invention can be stored at room temperature (25 ° C or lower), and the restrictions on the place of use and transportation which are convenient for use have been eliminated. .
  • the method for introducing a foreign substance according to the present invention has significantly improved introduction efficiency, is simpler, and has a wider range of applications such as high-throughput analysis.
  • inactivation refers to the inactivation of a gene when referring to a virus.
  • the term “inactivation” means that the gene is not replicated, Proliferation 'refers to those that have lost infectivity.
  • Examples of the method for inactivating viruses include UV irradiation, radiation irradiation, treatment with an alkylating agent, and the like. Forced UV irradiation and treatment with an alkylating agent are desired. Specifically, the method described in WO01Z57204 It can be performed according to. More desirably, treatment with an alkylating agent is performed.
  • the virus envelope is generally composed of a spike protein encoded by a viral gene, a small protrusion structure, and a host-derived double lipid membrane, and does not itself have a growth ability.
  • the spike protein which is a small projection, contains a certain type of membrane fusion protein, and its function causes membrane fusion. Show synergy.
  • the “inactivated virus envelope” includes an inactivated virus and Z or its envelope.
  • the term “inactive iridani virus envelope having membrane fusion activity” refers to an inactive iridani virus envelope in which a membrane fusion protein having membrane fusion activity functions in the inactivated viral envelope.
  • viruses containing a membrane fusion protein in the envelope include certain higher viruses such as Noramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, and Flaviviridae.
  • viruses By this membrane fusion activity, the cell membrane of the cell is fused and various cells are infected.
  • any virus having such properties can be used.
  • Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae viruses are more preferably Paramyxoviridae viruses, and even more preferably HVJ ( Sendai virus).
  • the method for culturing the virus described above is described in "Virus Experimental Protocol: Published by Medical View, 1995".
  • the Sendai virus of the family Noramyxoviridae is not only propagated in fertilized eggs such as -Avians, but also infects cultured cells and tissues of mammals (by adding a hydrolase such as trypsin to the culture solution). Culture).
  • a method for preparing an inactive Ganivirus envelope having membrane fusion activity for example, purification and reconstitution methods by ultracentrifugation or column chromatography can be used.
  • a more preferable purification method is a purification method including ion chromatography, and specifically, the method described in Example 1 (1) and Example 7 (1) to (5) of WO03 / 014338. Is mentioned.
  • the inactive iridase virus envelope is released from the ion chromatography with a high concentration of buffers. For example, this is concentrated with a tangential flow filter (TFF) module based on the dialysis principle. This dialysis concentration is repeated, and in the step of mixing with the next stabilizer, the concentration of the inactivated virus envelope suspension OD (turbidity: 558 nm; hereinafter, the same applies unless otherwise specified) force ⁇ ). 1 ⁇ 7.0, preferably ODOD force ⁇ ). 25 ⁇ 5.0, more preferably 0.3 ⁇ 2.5 Concentrate so that it can be adjusted.
  • TFF tangential flow filter
  • the concentration of the buffer or salt such as NaCl contained in the final suspension of the inert gel virus envelope after mixing with the stabilizer is 3 mM (mmol) or less, preferably ImM or less, more preferably Adjust to a salt concentration of 0.3 mM or less
  • the final salt concentration is adjusted to 3 mM or less, preferably ImM or less, more preferably 0.3 mM or less. I do.
  • examples of the protein hydrolyzate used as a stabilizer include polypeptone, bactopeptone, batatotryptone, caseinate hydrolyzate, and the like.
  • examples of the amino acid used as the stabilizer include L-one-isocyanate and L-arginine monohydrochloride, and preferably L-arginine monohydrochloride.
  • examples of the solvent for dissolving leucine and L-arginic acid include distilled water, UF water, and a buffer solution. Preferably, distilled water and UF water are used.
  • the protein hydrolyzate or leucine or L-arginic acid is 0.1% to 2.5% in the suspension of the inactivated virus envelope before lyophilization, preferably 0.2% to 1.5%. If you want to make it so that
  • examples of the polysaccharide used as a stabilizer include methylcellulose, 13-glucan, pectin, agarose, dextran, and dextrin. Preferably, it is methylcellulose.
  • examples of the solvent for dissolving the polysaccharide include distilled water, UF water, and a buffer. Preferably, distilled water and UF water are used.
  • the polysaccharide may be added to the suspension of the inactivated virus envelope before freeze-drying so that the concentration becomes 0.05% to 0.5%, preferably 0.1% to 0.2%. Good. Also, the addition of polysaccharides makes it easier to handle freeze-dried compositions that are produced with less friability of the freeze-dried composition. A similar effect of suppressing dusting can also be obtained by using added syrup such as trehalose.
  • one or more stabilizers selected from the group consisting of protein hydrolyzate, amino acid and polysaccharide can be used, and a single stabilizer or two or more stabilizers may be used in combination.
  • the combination of the protein hydrolyzate and the polysaccharide, the amino acid and the polysaccharide And more preferably a combination of the protein hydrolyzate and the polysaccharide, and more specifically, a combination of polypeptone or bactopeptone with methylcellulose.
  • a protein hydrolyzate, amino acids, or polysaccharide is added to a virus envelope having membrane fusion activity obtained by the above-mentioned preparation method at a predetermined concentration.
  • known pH adjusters, isotonic slurries, stabilizers, and preservatives may be mixed as necessary.
  • a protein hydrolyzate, an amino acid, or a polysaccharide may be dissolved in the above aqueous medium, and added to the prepared virus envelope having fusogenic activity to a predetermined concentration, followed by mixing. This mixture may be freeze-dried according to a standard method. Known methods such as tray freeze-drying, spray freeze-drying, and vial freeze-drying can be employed for the freeze-drying under conditions generally used.
  • the lyophilized composition of the inactive Ganivirus virus envelope having fusogenic activity of the present invention also includes the following.
  • A a foreign substance containing one or more substances selected from the group consisting of protein hydrolyzate, leucine, L-arginic acid and polysaccharides as an inactive virus-envelope having membrane fusion activity and a stabilizer;
  • a lyophilized composition for introduction a foreign substance containing one or more substances selected from the group consisting of protein hydrolyzate, leucine, L-arginic acid and polysaccharides as an inactive virus-envelope having membrane fusion activity and a stabilizer;
  • (C) A mixture of the inactive virus envelope and the stabilizing agent prepared in the step (A) (1), wherein the concentration of the inactive virus envelope is ODO.1 to 7.0, and the polysaccharide is The lyophilized composition according to the above (A), which is prepared so that the concentration of the lyophilized solution is 0.05% to 0.5%.
  • (D) a mixture of the inactive virus envelope and the stabilizing agent prepared in the step (A) (1), wherein the concentration of the inactive virus envelope is ODO. 1 to 7.0, and the protein The lyophilized composition according to (A), which is prepared so that the concentration of the hydrolyzate is 0.1% to 2.5% and the concentration of the polysaccharide is 0.05% to 0.5%.
  • a foreign substance can be retained in an inactivated virus envelope having membrane fusion activity, and a vector for introduction can be prepared.
  • the exogenous substance-introducing vector is added or administered to cells or living tissue to introduce the exogenous substance.
  • a rehydration method was found as a novel method for creating this foreign substance introduction vector.
  • a surfactant which has conventionally been required without using a surfactant is used.
  • an aqueous solution or aqueous suspension of a foreign substance and an inactive iridani virus having membrane fusion activity are used.
  • foreign substances can be introduced by adding or administering to cells or living tissues. Under the condition of 0 ° C. to 25 ° C., it is preferable to ripen immediately for 10 minutes, and when the number of samples is large, aging may be further performed for several hours or more.
  • the concentration and the mixing ratio are not particularly limited, and can be appropriately selected.
  • the concentration of the inoles envelope is OD: 0.05 to 5.0, more preferably OD: 0.05 to 2.0, and even more preferably OD: 1.0. ⁇ 2.0.
  • concentration of the inoles envelope is 0. 02 ⁇ 40 gZ 1, desirably from 0. 2 ⁇ 10 / ⁇ 8 ⁇ 1.
  • the inactive Giravirus virus envelope having membrane fusion activity retains the foreign substance and becomes a foreign substance introduction vector. This method is completely different from the freeze-thaw method in which freezing and thawing are repeated.
  • a foreign substance-introduced vector can be prepared by a conventional method using a surfactant.
  • the lyophilized composition is rehydrated with PBS (-) (phosphate-buffered saline) or a medium for gene introduction, which does not contain the target foreign substance, and the resulting mixture is inactivated.
  • Willsenberg Prepare a suspension to a concentration of 0.1 to 1.0 OD, and then mix the aqueous solution or suspension of the foreign substance to be introduced.
  • a surfactant such as Triton X-100 is added so that the force becomes 0.001% and 0.5%, more preferably 0.05% force becomes 0.3%, and it is added at low temperature for several seconds to several hours, preferably for 3 hours. Leave for ⁇ 10 minutes.
  • the temperature at the time of standing is preferably 0 ° C to 25 ° C, and more preferably 0 to 4 ° C. Further, the surfactant is removed by centrifugation or the like to prepare a foreign substance-introduced vector.
  • nucleic acids there is no particular limitation on the foreign substance to be introduced into cells or living tissues.
  • genes and the like are usually used. Specific examples include antibiotics, chemotherapeutics, antiallergic drugs, cardiovascular drugs, antiinflammatory drugs, antirheumatic drugs, hormones, vitamins, antineoplastic drugs, ribocontrast agents, magnetic resonance contrast agents,
  • nucleic acids etc. having activity, and more specifically, nucleic acids to be used include nucleic acids, ribozymes, antisense nucleic acids, and RNAi that encode target proteins that can be introduced into cells to express the target proteins.
  • DNA that expresses the RNA to be caused, siRNA, suicide gene, apoptosis-inducing gene, etc. can be selected. It is possible to create a foreign substance vector that holds these foreign substances alone or that carries two or more selected from them. As a foreign substance, a nucleic acid encoding a target protein capable of expressing the target protein by introducing the nucleic acid into a desired cell is more preferable.
  • the nucleic acid concentration after aging of a mixture of the nucleic acid and the inactive iridani virus envelope is 0: gZ 1 or less.
  • This prepared solution is added to the cultured cells as it is or after adding protamine sulfate.
  • Protamine sulfate is added to a concentration of 1 ⁇ g / ml or more: LOO ⁇ g / ml, preferably 10 ⁇ g / ml to 50 ⁇ g / ml. When protamine sulfate is not used, the above operation is not required.
  • the cells into which a foreign substance is to be introduced include eukaryotic cells, particularly animal cell lines, and may be either adherent cell systems or floating cell systems.
  • cell lines that are generally difficult to introduce such as early cell lines, stem cell lines, fibroblast cell lines, It can be applied to a wide range of cell lines, including large cell lines.
  • the exogenous substance introduction vector of the present invention can be administered by the in vivo method or can be administered systemically. That is, it can be administered by an appropriate route depending on the disease to be treated, the target organ, and the like.
  • it can be administered intravenously, arterially, subcutaneously, intramuscularly, etc., or can be administered to kidney, liver, lung, brain, nerve, etc.
  • Etc. can be directly administered to the target site of the disease. If administered directly to the disease site, organ-selective treatment can be achieved.
  • a foreign substance is introduced into the cells after a certain period of time under normal cell culture conditions or ordinary breeding conditions. It is also possible to administer the ex vivo method.
  • mammalian cells for example, lymphocytes, hematopoietic stem cells, etc.
  • the exogenous substance transfer vector of the present invention is added thereto. Sensitization, and then return the cells to the mammalian body.
  • Cells to be subjected to the cell fusion method of the present invention include animal cells, preferably mammalian cells. These cells include blood cells such as immune cells, bone marrow cells, and dendritic cells, embryonic stem cells, tissue stem cells, neural cells, glial cells, pituitary cells, liver cells, spleen cells, kidney cells, and cardiac muscle cells. Examples include cells, muscle cells, osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, vascular endothelial cells, fibroblasts, and cancer cells such as myeloma cells, HeLa cells, CHO cells, and COS cells. In these cell fusions, different cells such as immune cells and cancer cells can be fused. Furthermore, the lyophilized composition of the present invention can be used for nuclear replacement and fusion of micronuclei with target cells.
  • blood cells such as immune cells, bone marrow cells, and dendritic cells, embryonic stem cells, tissue stem cells, neural cells, glial cells, pituitary cells, liver
  • the concentration of the target cells at the time of cell fusion is 1 ⁇ 10 4 Zml to 1 ⁇ 10 1G Zml, and preferably 1 ⁇ 10 6 Zml to 1 ⁇ 10 8 Zml.
  • the Ca concentration is 0.1 to: LOmM, preferably 1 to 5 mM.
  • GenomOne registered trademark, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.
  • 120 1 OD: 0.25 total amount: 6000HAU
  • Neuanore Transfer, 10, OOOrpm, 30 min. Qing was removed.
  • the obtained precipitate was suspended in distilled water 401 and then centrifuged again at 10,000 rpm for 30 minutes to remove the supernatant.
  • Sample 1 a suspension in which the precipitate is added to be referred to as Sample 1; the same applies hereinafter; Tolu-Z distilled water solution (sample 2), 0.2% methylcellulose Z distilled water solution (sample 3), or 0.2% trehalose Z distilled water solution (sample 4) Quickly frozen.
  • the frozen products of Samples 1 to 4 were immersed in a cool bath set at 15 ° C for 5 hours under the conditions of a vacuum of 0.1 mmHg or less and a trap temperature of 70 ° C or less for 5 hours. Lyophilization was performed. The temperature of the cool bath was raised to 4 ° C, and after secondary drying for 1 hour, dry nitrogen was introduced into the vacuum chamber to break the vacuum, sealed, and the freeze-dried composition of the sample was removed. Obtained.
  • a precipitate of GenomOne (registered trademark, manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.) 120 / z 1 (OD: 0.25, total amount: 6000 HAU) was obtained.
  • Each of the precipitates contains 601 each of a 0.5% aqueous solution of distilled polypeptone (added and suspended to obtain sample 5; the same applies hereinafter) and 0.1% of methylcellulose.
  • Add 5% distilled water solution of polypeptone (Sample 6), 1.0% distilled water solution of polypeptone (Sample 7), 1.5% distilled water solution of polypeptone (Sample 8), and add 2.5% distilled water solution of polypeptone (Sample 9). After turbidity, it was snap frozen in liquid nitrogen.
  • sample 10 A 1.0% distilled aqueous solution of polypeptone (to which a suspension is added with calorie, is referred to as sample 10; the same applies hereinafter); 0% bactopeptone distilled aqueous solution (sample 11), 1.0% pectotripton distilled aqueous solution (sample 12), 1.0% caseinic acid hydrolyzate distilled aqueous solution (sample 13), 0.3% L-leucine distillation Aqueous solution (Sample 14), 1.0% ⁇ -alanine distilled aqueous solution (Sample 15), 0.3% L-arginine monohydrochloride distilled aqueous solution (Sample 16), 1.0% L-aspartic acid distilled aqueous solution (Sample 17) ) was added and suspended, followed by rapid freezing in liquid nitrogen. Thereafter, the lyophilized compositions of Samples 10 to 17 were obtained in the same manner as in Example 1.
  • PGL3—CONTROL VECTOR Promega plasmid DNA encoding the improved firefly luciferase protein is digested with HindIII and XbaI, electrophoresed (1% agarose), and the fragment containing luciferase is gel-M Gel Extraction System (VIOGENE Purified.
  • Both fragments are transformed into ligation and Escherichia coli (DH5a) (45 ° C, 45 minutes) using DNA Ligation Kit (TaKaRa), and can express luciferase under the control of CMV promoter. Ampicillin resistance containing pCMV-GL3 plasmid DNA Bacteria were selected.
  • the selected bacteria obtained were cultured in LB medium (including ampicillin), and the culture was purified using EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN) and dissolved in TE buffer to obtain a pCMV-GL3ZTE solution.
  • Buffer 1 (PBS (1)) 1201 was added to each freeze-dried composition of Samples 1 to 17 obtained in Examples 1 to 3 and dispersed. 20 ⁇ l of each of these solutions was taken in an eppendorf tube and centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed, and the precipitate was suspended in PBS (-) 51, and 5 ⁇ l of a 4 ⁇ & ⁇ 1 concentration pGL3ZTE solution was added. 2% Triton X—100 / PBS (-) solution: l was added and centrifuged at 10, OOOrpm for 5 minutes.
  • Example 6 Preparation of freeze-dried composition of inactive iDani HVJ envelope having membrane fusion activity
  • the inactivated HVJ virus envelope was obtained by a method according to (1) of Example 1 and (1) to (4) of Example 7 of WO03Z014338.
  • a rope suspension was used. Briefly, HVJ grown using fertilized chicken eggs was inactivated by treatment with
  • TF F tangential flow filter
  • the solution was further concentrated at about 100 m using a TFF module. After repeating dilution with sterile water to TFF concentration 5 times, the mixture was concentrated at about 60 m. 25 ml of an aqueous solution containing 4.0% polypeptone and 0.4% methylcellulose, which were separately prepared and sterilized, were added to the concentrated solution. The concentration of the inactivated HVJ envelope suspension containing this stabilizer was OD 0.6. In addition, the concentration reduces the buffer concentration to 0.03 mM or less. 1. 65 1 aliquots were placed in 5 ml screw cap tubes and snap frozen in liquid nitrogen.
  • the frozen, inactivated HVJ envelope is suspended under a vacuum of 0.ImmHg or less and a trap temperature of 70 ° C or less. Lyophilization was performed for 15 hours in a vacuum chamber set at ° C. After the set temperature of the vacuum chamber 1 was raised to 4 ° C and secondary drying was further performed for 1 hour, dry nitrogen was introduced into the vacuum chamber 1 to break it in a vacuum, and then sealed.
  • a freeze-dried composition (freeze-dried product) of the inactive HVJ envelope obtained in Example 6 was added to a 4 / zg / zz1 concentration pCMV-GL3ZTE solution 301 prepared by the method described in Example 4.
  • 1 ⁇ liti (pGL3 / TE ⁇ 3 ⁇ 4120 ⁇ is dispersed in 0.25 g / 1 concentration of pGL3ZTE solution 480 1 and left on ice for 5 minutes.
  • Buffer (PBS (—)) 450 1 or 360 1 was added to make the total volume 480 1, and 150 mg of protamine Z PBS (-) solution with a concentration of lOmgZml was mixed with 151.
  • This 40 ⁇ l of this solution was mixed with CHO-K1 cells (Cyanine pupa ovary).
  • Cells ATCC NO.CCL-61, purchased from Dainippon Pharmaceutical
  • Cultured in 24 ⁇ plates 2.5 x 10 4 cells, Ham's F12 + 10% FCS 0.5 ml Z well, 37 ° C, (Cultured overnight at 5% CO), and cultured at 37 ° C, 5% CO for 24 hours
  • the results are shown in Table 2 (all are the average of the measured values of 3 ⁇ l).
  • the lyophilized composition of the present invention (the lyophilized product in Table 2) is simply dispersed in a solution of the exogenous gene, and the exogenous gene is produced by using a surfactant in the inactive iDani HVJ envelope produced by the conventional technique.
  • the transfection activity was about 10 times that of the sealed product (in Table 2, it was regarded as a conventional product).
  • the inactivated virus envelope was obtained by a method according to (1) of Example 1 and (1) to (4) of Example 7 of WO03Z014338.
  • the inactivated HVJ envelop suspension after buffer exchange was obtained.
  • the liquid was used. Briefly, HVJ grown using fertilized chicken eggs was inactivated by treatment with
  • TMF tangential flow filter
  • Inertani HVJ envelope solution After sterilizing water was added to the Inertani HVJ envelope solution after buffer exchange and diluted to 600 ml, it was further concentrated at about 200 m with a TFF module. After repeating dilution with sterile water to TFF concentration eight times, the mixture was concentrated at about 100 m. 26 ml of a separately prepared and sterilized aqueous solution containing 5.0% polypeptone and 0.5% methylcellulose was prepared and sterilized. The concentration of this inactivated HVJ envelope suspension was OD 0.6. In addition, this concentration reduces the buffer concentration to 0.03 mM or less. 1. Dispensed 210 1 each into a 5 ml screw cap tube and rapidly frozen with liquid nitrogen.
  • the freeze-inactivated HVJ envelope suspension was freeze-dried for 15 hours in a vacuum chamber set at 5 ° C under the conditions of a vacuum of 0.1 mmHg or less and a trap temperature of 70 ° C or less.
  • the set temperature of the vacuum chamber 1 was raised to 5 ° C, and secondary drying was further performed for 1 hour. Then, dry nitrogen was introduced into the vacuum chamber 1 to destroy the vacuum, and the container was sealed. (Example 9) (Measurement of cell fusion activity)
  • the cell fusion activity of both was measured using the obtained frozen Inertani HVJ envelope.
  • the measurement of the cell fusion activity was carried out with reference to the method of K. Hiraoka et al. (The Journal of Immunology, Vol. 173, pp. 4297-4307). That is, a cell line derived from Syrian hamster pup kidney stained with the fluorescent staining kit PKH26 (SIGMA, No. PKH-26-GL, red fluorescence) or PKH67 (SIGMA, No.
  • PKH-67-GL green fluorescence
  • BHK-21 purchased from Dainippon Pharmaceutical
  • a cell fusion buffer 10 mM Tris-HCL (pH 7.5), 137 mM NaCl, 5.5 mM KC1, 2 mM CaCl
  • Composition of the present invention 10.13 ⁇ 415.43 ⁇ 413.2%
  • the freeze-dried composition of the inactive Ganivirus envelope having membrane fusion activity of the present invention can be stored at room temperature (25 ° C. or less), and the restrictions on convenient places to use and transportation have been eliminated.
  • the method for introducing a foreign substance according to the present invention has a remarkably improved introduction efficiency, is simpler, and has a wider range of applications such as high-throughput analysis.

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Abstract

　外来物質の導入能を保持したまま、より高温で保存ができる膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープ凍結乾燥組成物を提供すること、また、より外来物質導入活性が高い、細胞内への外来物質導入方法を提供することが本発明の課題である。 　膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープと、蛋白質水解物、ロイシン、L-アルギニン酸および多糖類からなる群より選択される一つ以上の安定化剤と、を含有する外来物質導入のための凍結乾燥組成物が提供される。また、膜融合活性のある不活性化ウイルスエンベロープを含有する凍結乾燥組成物を用いる外来物質導入方法が提供される。

Description

明 細 書
膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープの凍結乾燥組成物 技術分野
[0001] 本発明は、細胞及び生体組織へ、核酸、蛋白質又は薬物等を導入するための凍 結乾燥組成物及びその製造方法、その使用方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、細胞または生体組織へ遺伝子などの外来物質を導入のために多くのウィル スベクター法及び非ウィルス (合成)ベクター法が開発されている。一般に、細胞への 遺伝子送達のための外来物質導入能において、ウィルスベクター法は、非ウィルス ベクター法より効果的である。しかし、ウィルスベクターは、親ウィルス力 の必須遺 伝子要素の同時導入、ウィルス遺伝子のリーキーな発現、免疫原性、及び宿主ゲノ ム構造の改変のため安全性での問題を生じ得る。これに対して、非ウィルスベクター は、細胞傷害性及び免疫原性がより少ない。しかし、非ウィルスベクター法では、一 般的にエンドサイト一シス経路により細胞内に外来物質が取り込まれるため、ウィルス ベクター法の 、くつかに比べ、遺伝子等の導入能が低 ヽと 、う課題を抱えて 、た。
[0003] この欠点を克服するため、センダイウィルス（sendai virus； hemagglutinating virus of Japan :HVJ)の膜融合活性をリボソームに付与したハイブリッドベクター、すなわ ちセンダイウィルスとリボソームの融合体（HVJ— liposome)が提案された。該ウィルス の膜融合活性により、細胞や生体組織の細胞の細胞内への遺伝子等の導入を可能 とし、世界的にもこの手法が動物実験レベルでは頻用されるようになった (特許文献 1 、非特許文献 1、 2)。この HVJ—リボソーム法では、蛋白質、化学物質、遺伝子等をリ ポソーム内に充填しておき、このリボソームと予め UV照射により不活性ィ匕された HVJ (不活性ィ匕 HVJエンベロープ）とを融合することにより構築される。しかしながら、不活 性化 HVJエンベロープの調製に加え、リボソームの調製、融合後の HVJ-リボソーム の精製等、煩雑な工程が必要であった。
[0004] そこで、不活性ィ匕 HVJエンベロープに直接、遺伝子等を封入する方法が提案され た (特許文献 2)。細胞内に導入すべき遺伝子等の存在下、不活性ィ匕 HVJェンベロ ープに、凍結融解または界面活性剤による処理を施すことにより、エンベロープ内に 該遺伝子等を封入し、次にこのエンベロープを導入の対象となる細胞と接触させるこ とにより、膜融合活性を介して、遺伝子等を細胞内へ導入する方法である。不活性化 HVJエンベロープは量産可能であり、比較的簡便な方法で遺伝子等の導入が可能 なため、多くの細胞内への外来物質導入試験に使用されている。
[0005] 一方、この不活性ィ匕 HVJエンベロープは、遺伝子等の導入能を保持したまま、その 懸濁液を凍結保存（ 70°C)することができるが、凍結乾燥による保存にっ 、ては報 告がな 、。凍結乾燥により膜融合活性のある不活性ィ匕 HVJエンベロープの機能或 ヽ は構造が損なわれるためと推察されるが、輸送及び保存の観点から、より高温で保存 できる凍結乾燥による不活性 HVJエンベロープ凍結乾燥組成物が求められていた。 特許文献 1 :米国特許 5,631, 237
特許文献 2 :WOOlZ57204
非特許文献 l : Dzau,V.J.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,11421〜11425(1996) 非特許文献 2 : Kaneda,Y.et al.Molecular Medicine Today,5,298〜303(1999) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] したがって、外来物質の導入能を保持したまま、より高温で保存ができる膜融合活 性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープ凍結乾燥組成物を提供すること、また、より 外来物質導入能が高い、細胞内への外来物質導入方法を提供することが本発明の 課題である。
課題を解決するための手段
[0007] 発明者らは、膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープを凍結乾燥する方 法を鋭意検討した結果、蛋白質水解物またはある種のアミノ酸の添加が、膜融合活 性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープの外来物質導入能の保持に有効であること を見出した。また、膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープの外来物質導 入能の保持に塩類の低減も有効であることを見出し、本発明を完成した。また、これ らの処理により、上記不活性ィ匕ウィルスエンベロープの膜融合活性が有効に維持さ れることを見出した。更に、得られた膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスェンベロー プの凍結乾燥組成物を用いた、外来物質導入のための新規な方法を完成した。 即ち、本発明は、以下を特徴とする要旨を有する。
1.膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープと、蛋白質水解物、ロイシン、 L- アルギニン酸および多糖類力 なる群より選択される一つ以上の安定化剤と、を含有 することを特徴とする凍結乾燥組成物。
2.膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープ力 ノ ラミクソウィルス科、オルト ミクソウィルス科、ヘルぺスウィルス科、へパドナウィルス科、またはフラビウィルス科 のウィルスの不活性ィ匕ウィルスエンベロープである上記 1に記載の凍結乾燥組成物
3.安定化剤が、蛋白質水解物及び多糖類である、上記 1又は 2に記載の凍結乾燥 組成物。
4. (1)膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープ懸濁液と安定化剤とを混合 する工程と、（2)前記（1)の工程により得られた混合物を凍結乾燥する工程、を含む 工程により調製される前記 1〜3のいずれかに記載の凍結乾燥組成物。
5.前記（1)の工程により得られた混合物における不活性ィ匕ウィルスエンベロープの 濃度が ODO. 1〜7. 0である上記 4に記載の凍結乾燥組成物。
6.前記（1)の工程により得られた混合物における蛋白質水解物、ロイシン、又は L- アルギニン酸の濃度が 0. 1〜2. 5%である上記 4又は 5に記載の凍結乾燥組成物。
7.前記（1)の工程により得られた混合物における多糖類の濃度が 0. 05〜0. 5%で ある上記 4〜6のいずれかに記載の凍結乾燥組成物。
8.前記（1)の工程により得られた混合物の塩濃度が 3mM以下である上記 4〜7の V、ずれかに記載の凍結乾燥組成物。
9.細胞または生体組織へ外来物質を導入する方法であって、
(1)外来物質と水とを含有する混合物を用いて、膜融合活性のある不活性化ウィル スエンベロープを含有する凍結乾燥組成物を再水和する工程と、
(2)前記（1)の工程により得られる組成物を細胞または生体組織と接触させる工程と 、を含む外来物質導入方法。
10.凍結乾燥組成物が、上記 1〜8のいずれかに記載の凍結乾燥組成物である、上 記 9に記載の外来物質導入方法。
11.細胞融合の方法であって、
(a)膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープを含有する凍結乾燥組成物を 再水和する工程と、
(b)前記 (a)の工程により得られる組成物を融合の対象となる細胞の懸濁液と混合す る工程と、を含む細胞融合方法。
12.凍結乾燥組成物が上記 1〜8のいずれかに記載の凍結乾燥組成物である、上 記 11に記載の細胞融合方法。
発明の効果
[0009] これまで報告された膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープは冷凍（ 2 0°C)、より望ましくは超冷凍（一 70°C以下)での保存が必須であり、たとえば不活性 化 HVJエンベロープの場合、冷蔵下では 2週間程度で外来物質導入活性が著しく 低下する場合があった。したがって、冷凍または超冷凍設備のない場所での保存が 困難であり、長時間を要する輸送も困難であった。本発明の膜融合活性のある不活 性ィ匕ウィルスエンベロープの凍結乾燥組成物は、室温（25°C以下)での保存ができ 、使い勝手が良ぐ使用する場所や輸送に関する制限が解消された。さらに、本発明 の外来物質導入方法は、導入効率が著しく向上し、より簡便であり、ハイスループット 解析などの応用範囲が増大して 、る。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明おいて「不活性化」とは、ウィルスについて言及されるとき、遺伝子が不活性 ィ匕されることをさし、不活性ィ匕ウィルスとは、遺伝子の複製がおこなわれず、増殖'感 染能を失ったものをさす。ウィルスの不活性ィ匕の方法としては、 UV照射、放射線照 射、アルキル化剤による処理などが挙げられる力 UV照射、アルキル化剤による処 理が望ましぐ具体的には WO01Z57204に記載の方法に準じて行うことができる。 より望ましくはアルキル化剤による処理である。また、ウィルスエンベロープは、概して ウィルス遺伝子によりコードされたスパイク蛋白質力 なる小突起構造物と宿主由来 の 2重脂質膜で構成されており、それ自体は増殖能力を有していない。この小突起 物であるスパイク蛋白質にある種の膜融合蛋白質を含んでおり、その機能により膜融 合作用を示す。本発明において「不活性ィ匕ウィルスエンベロープ」とは、不活性化さ れたウィルス及び Z又はそのエンベロープを包含するものである。本発明にお 、て「 膜融合活性がある不活性ィ匕ウィルスエンベロープ」とは、不活性ィ匕したウィルスェン ベロープに膜融合活性のある膜融合蛋白質が機能している不活性ィ匕ウィルスェンべ ロープをさす。
[0011] エンベロープに膜融合蛋白質を含むウィルスとして、ノ ラミクソウィルス科、オルトミ クソウィルス科、ヘルぺスウィルス科、へパドナウィルス科、フラビウィルス科等のある 種の高等なウィルスが挙げられる。この膜融合活性により細胞の細胞膜を融合し、各 種細胞に感染する。本発明においては、このような性質を示すウィルスであればどの ようなウィルスでも使用できる。従って、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、 ヘルぺスウィルス科、へパドナウィルス科、フラビウィルス科のウィルスが望ましぐよ り望ましくはパラミクソウィルス科のウィルスであり、さらにより望ましくは HVJ (センダイ ウィルス）である。
[0012] 上記記載のウィルスの培養方法は、「ウィルス実験プロトコール： 1995年 メジカル ビュー社発行」に記載されている。例えば、ノ ラミクソウィルス科のセンダイウィルスで は、 -ヮトリなどの受精卵で増殖させたもののほか、哺乳類の培養細胞、培養組織へ の持続感染系（培養液にトリプシンなどの加水分解酵素を添加する）を利用して培養 増殖させる。
[0013] 膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープの調製方法は、例えば、超遠心 法、カラムクロマトグラフィー法により精製、再構成法等が可能である。より望ましい精 製法としてはイオンクロマトグラフィーを含む精製法であり、具体的には、 WO03/0 14338の実施例 1の（1)、及び実施例 7の（1)〜（5)に記載の方法が挙げられる。
[0014] イオンクロマトグラフィーを含む精製法で調製する場合には、不活性ィ匕ウィルスェン ベロープは、イオンクロマトグラフィーから高濃度の緩衝液類で遊離する。例えば、こ れを透析原理に基づくタンジェンシャルフローフィルター（TFF)モジュールで濃縮す る。この透析濃縮を繰返し、次の安定化剤と混合する工程において、不活性化ウィル スエンベロープ懸濁液の濃度 OD (濁度 558nm、以下、特に言及しない場合も同様 である。）力^). 1〜7. 0、好ましく ίま OD力^). 25〜5. 0、より好ましく ίま 0. 3〜2. 5に 調整することができるように濃縮する。安定化剤と混合した後の最終の不活性ィ匕ウイ ルスエンベロープ懸濁液中に含まれる緩衝剤や NaCl等の塩の濃度は、 3mM (ミリ モル)以下、好ましくは ImM以下、より好ましくは 0. 3mM以下の塩濃度に調製する
[0015] 超遠心法、再構成法などで、不活性化ウィルスエンベロープを調製する場合でも、 最終の塩濃度は、 3mM以下、好ましくは ImM以下、より好ましくは 0. 3mM以下の 塩濃度に調製する。
[0016] 本発明において、安定化剤として使用される蛋白質水解物としては、例えば、ポリ ペプトン、バクトペプトン、バタトトリプトン、カゼイン酸加水分解物等が挙げられ、好ま しくはポリペプトン、バクトペプトン、カゼイン酸加水分解物であり、より好ましくはポリ ペプトン、ノタトペプトンである。また、安定化剤として使用されるアミノ酸としては、例 えば、 L一口イシン、 L—アルギニン一塩酸塩が挙げられ、好ましくは、 L—アルギニン 一塩酸塩である。 蛋白質水解物或!、はロイシン、 L-アルギニン酸を溶解する溶媒と して、蒸留水、 UF水、緩衝液が例示される。好ましくは、蒸留水、 UF水である。上記 蛋白質水解物或いはロイシン、 L-アルギニン酸は、凍結乾燥前の不活性化ウィルス エンベロープの懸濁液中の濃度力 0. 1%〜2. 5%、好ましくは、 0.2%〜1. 5%に なるように添カ卩すればょ 、。
[0017] 本発明において、安定化剤として使用される多糖類としては、例えば、メチルセル口 ース、 13 -グルカン、ぺクチン、ァガロース、デキストラン、デキストリンが挙げられる。 好ましくは、メチルセルロースである。多糖類を溶解する溶媒として、蒸留水、 UF水、 緩衝液が例示される。好ましくは、蒸留水、 UF水である。多糖類は、凍結乾燥前の 不活性化ウィルスエンベロープの懸濁液中の濃度力 0. 05%〜0. 5%、好ましくは 、 0. 1%〜0. 2%になるように添加すればよい。また、多糖類を添加すると、凍結乾 燥組成物の粉立ちが少なぐ製造される凍結乾燥組成物を取扱やすくなる。同様な 粉立ち抑制の効果は、トレハロースなどの添カ卩によっても得られる。
[0018] また、安定化剤は、これらの蛋白質水解物、アミノ酸及び多糖類力 なる群より選択 される一つ以上のものを使用することができ、単独又は 2種以上を併用してもよい。望 ましくは、前記蛋白質水解物及び前記多糖類の併用、前記アミノ酸及び前記多糖類 の併用であり、より望ましくは前記蛋白質水解物及び前記多糖類の併用であり、具体 的には、ポリペプトンまたはバクトペプトンにさらにメチルセルロースを併用するもので ある。
[0019] 本発明の凍結乾燥組成物を製造するには、例えば、上記の調製法で入手した膜 融合活性のあるウィルスエンベロープに、蛋白質水解物またはアミノ酸類、或いは多 糖類を所定濃度になるように添加するが、必要に応じて適宜公知の pH調製剤、等張 ィ匕剤、安定化剤、防腐剤を混合しても良い。蛋白質水解物またはアミノ酸類、或いは 多糖類をそれぞれ上記の水性媒体に溶解し、調製した膜融合活性のあるウィルスェ ンべロープに所定濃度になるように添加し混合しても良い。この混合液を定法に基づ いて凍結乾燥すればよい。この凍結乾燥には、通常用いられている条件下で、トレー 凍結乾燥、スプレー凍結乾燥、バイアル凍結乾燥など公知の方法が採用できる。
[0020] 本発明の膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープの凍結乾燥組成物に は以下のようなものも含まれる。
(A)膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープ及び安定化剤として、蛋白質 水解物、ロイシン、 L-アルギニン酸および多糖類力もなる群より選択される一つ以上 のものを含有する外来物質導入のための凍結乾燥組成物であって、
(1)該不活性ィ匕ウィルスエンベロープ懸濁液と該安定化剤とを混合する工程、およ び
(2)得られた混合物を凍結乾燥する工程、を含む工程により調製される凍結乾燥組 成物。
(Β)前記 (A) (1)の工程において調製される不活性ィ匕ウィルスエンベロープと安定 ィ匕剤の混合物を、不活性化ウィルスエンベロープの濃度が OD(Optical Density)0. 1〜7. 0であり、蛋白質水解物の濃度が 0. 1%〜2. 5%となるように調製する (A)に 記載の凍結乾燥組成物。
(C)前記 (A) (1)の工程において調製される不活性ィ匕ウィルスエンベロープと安定 ィ匕剤の混合物を、不活性ウィルスエンベロープの濃度が ODO. 1〜7. 0であり、多糖 類の濃度が 0. 05%〜0. 5%となるように調製する前記 (A)に記載の凍結乾燥組成 物。 (D)前記 (A) (1)の工程において調製される不活性ィ匕ウィルスエンベロープと安定 ィ匕剤の混合物を、不活性ウィルスエンベロープの濃度が ODO. 1〜7. 0であり、蛋白 質水解物の濃度が 0. 1%〜2. 5%であり、多糖類の濃度が 0. 05%〜0. 5%となる ように調製する前記 (A)に記載の凍結乾燥組成物。
(E)前記（1)の工程の不活性ィ匕ウィルスエンベロープ懸濁液の塩濃度が 3mM以下 である前記 (A)〜（D)の 、ずれか一つに記載の凍結乾燥組成物。
[0021] 本発明の凍結乾燥組成物を使用して、膜融合活性のある不活性化ウィルスェンべ ロープに外来物質を保持させ、導入のためのベクターを作製することができる。この 外来物質導入ベクターを細胞若しくは生体組織に、添加若しくは投与して、外来物 質を導入する。この外来物質導入ベクターを作成する新規な方法として、再水和化 法を見出した。
[0022] 再水和化法では、従来必要とされてきた、界面活性剤を使用せず、例えば、外来 物質の水溶液または水性懸濁液と、膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスェンベロー プを含む凍結乾燥組成物とを混合し、再水和化する。再水和化後、直ちに、細胞若 しくは生体組織に添加または投与することで外来物質を導入することができる。また、 0°C〜25°Cの条件下であれば、直後〜 10分間熟成させることが好ましぐサンプル 数が多数である場合には、さらに数時間以上熟成させてもよい。その濃度および混 合比は、特に限定されず、適宜選択することができる。膜融合活性のある不活性化ゥ イノレスエンベロープの濃度は OD: 0. 05〜5. 0であり、より望ましくは OD : 0. 05〜2 . 0であり、さらに望ましくは OD : l. 0〜2. 0である。例えば外来物質が DNAの場合 、その濃度は 0. 02〜40 gZ 1であり、望ましくは 0. 2〜10 /ζ 8Ζ 1である。熟成 後、膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープは、該外来物質を保持し、外 来物質導入ベクターとなる。凍結と融解を繰り返す凍結融解法とも全く異なる方法で ある。
[0023] また本発明の凍結乾燥組成物を用いて、界面活性剤を利用した従来の方法によつ ても、外来物質導入ベクターを作成することが可能である。界面活性剤を用いる方法 では、目的の外来物質を含まない PBS (-) (リン酸緩衝生理食塩水)もしくは遺伝子 導入用の培地などで該凍結乾燥組成物を再水和化し、不活性ィ匕ウィルスェンベロー プの OD0.1〜 1.0の濃度になるように懸濁液を調製し、次に導入すべき外来物質の 水溶液または水性懸濁液を混合する。得られた混合物に、例えばトライトン X— 100 などの界面活性剤を 0.001%力も 0.5%、より好ましくは 0.05%力も 0.3%になるよう に添加し、低温度下で数秒〜数時間、好ましくは 3〜10分間放置する。放置時の温 度としては、望ましくは 0°C〜25°Cであり、さらに望ましくは 0〜4°Cの条件で、実施す る。更に、遠心操作等により、界面活性剤を取り除き、外来物質導入ベクターを調製 する。
[0024] 本発明にお ヽて細胞又は生体組織へ導入される外来物質として、特に制限はな!/ヽ 力 薬物、遺伝子等の使用が普通である。その具体例としては、抗生物質、化学療 法剤、抗アレルギー薬、循環器官用薬、抗炎症薬、抗リウマチ薬、ホルモン、ビタミン 、抗悪性腫瘍薬、リボ造影剤、磁気共鳴造影剤、生理活性を有する蛋白質、核酸等 があり、使用する核酸として更に具体的には、細胞内に導入されて目的の蛋白質を 発現させることのできる目的蛋白質をコードした核酸、リボザィム、アンチセンス核酸 、 RNAiを起す RNAを発現する DNA、 siRNA,自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝 子等力 選択することができる。これらの外来物質を単独で保持する、またはこれらか ら選択される 2つ以上のものを保持する外来物質ベクターを作成することが可能であ る。外来物質としては、核酸が望ましぐ細胞内に導入されて目的の蛋白質を発現さ せることのできる目的蛋白質をコードした核酸がより望ましい。
[0025] 細胞や生体組織への核酸などの外来物質の導入において、硫酸プロタミンを使用 する場合は、核酸と不活性ィ匕ウィルスエンベロープとの混合物の熟成後、核酸濃度 が 0.： gZ 1以下になるように PBS (-)もしくは遺伝子導入用培地で希釈する。こ れは、以後に添加する硫酸プロタミンにより該酸が共沈することを防ぐためである。こ の調製液を、そのまま、若しくは硫酸プロタミンを加え培養細胞に添加する。硫酸プロ タミンは 1 μ g/ml〜： LOO μ g/ml、好ましくは 10 μ g/ml〜50 μ g/mlになるよう に添加する。硫酸プロタミンを使用しない場合は、特に、上記操作を必要しない。
[0026] 本発明にお 、て、外来物質を導入すべき細胞としては、真核細胞、特に動物細胞 系を挙げることが出来、接着細胞系と浮遊細胞系のいずれであってもよい。また、一 般には導入の困難な細胞系である初期細胞系、幹細胞系、線維芽細胞系、マクロフ ァージ細胞系等を含め、広範囲な細胞系に適用できる。これらの細胞の培養条件下 、上述の外来物質導入ベクターを添加し、細胞と接触させる。また、本発明の外来物 質導入ベクターは in vivo法で投与する力、または全身的な投与を行うことも可能で ある。すなわち、治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与 することが出来、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与するか、又は腎臓、 肝臓、肺、脳、神経等の疾患の対象部位に直接投与することができる。疾患部位に 直接投与すれば、臓器選択的に治療することができる。上述の添加後、若しくは投 与後、常法の細胞培養の条件、若しくは通常の飼育条件等で、一定時間経過させれ ば、外来物質が細胞へ導入される。なお、 ex vivo法で投与することも可能であり、こ の場合には、常法に準じ、哺乳類の細胞 (例えば、リンパ球、造血幹細胞等)を採取 し、それに本発明の外来物質導入ベクターで処理、感作を行い、その後に当該細胞 を哺乳類の体へ戻せばょ 、。
本発明の細胞融合法の対象となる細胞としては、動物細胞、好ましくは哺乳類の細 胞が挙げられる。それらの細胞としては、免疫細胞、骨髄細胞、榭状細胞などの血球 系細胞、胚性幹細胞、組織幹細胞、神経系細胞、グリア細胞、下垂体細胞、肝臓細 胞、脾臓細胞、腎臓細胞、心筋細胞、筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、 血管内皮細胞、線維芽細胞などやミエローマ細胞、 HeLa細胞、 CHO細胞、 COS細 胞などの癌細胞が挙げられる。これらの細胞融合は、例えば免疫細胞と癌細胞という ように異なる細胞の融合を行うことができる。さらに、本発明の凍結乾燥組成物を用い て核置換や微小核と標的細胞の融合にも利用できる。
本発明において細胞融合の際の対象細胞の濃度は、 1 X 104個 Zml〜l X 101G個 Zmlであり、好ましくは 1 X 106個 Zml〜l X 108個 Zmlである。また、 Ca濃度は、 0. 1 〜： LOmMであり、好ましくは l〜5mMである。
以下に実施例を揚げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の 説明のため、その具体的な態様の参考のため提供されているものである。これらの例 示は本発明の特定の具体的な態様を説明するものであるが、本願で開示する発明 の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明 細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であると理解されるべきである。 実施例
[0028] (実施例 1)
不活性ィ匕 HVJエンベロープとして、 GenomOne (登録商標、石原産業社製） 120 1 (OD : 0. 25 総量： 6000HAU)を取り、ノィァノレ【こ移し、 10, OOOrpm、 30分 f¾遠 心し、上清を除去した。洗浄のため、得られた沈殿物を蒸留水 40 1で懸濁した後、 再度 10, 000rpm、 30分間遠心し、上清を除去した。洗浄された該沈殿物に、 60 1の、 0. 2%ポリペプトン Z蒸留水溶液 (これを添加し、沈殿物を懸濁させたものを試 料 1とする。以下同様）、 0. 2%マン-トール Z蒸留水溶液 (試料 2)、 0. 2%メチルセ ルロース Z蒸留水溶液 (試料 3)、または 0. 2%トレハロース Z蒸留水溶液 (試料 4)を それぞれ添加し、懸濁した後、液体窒素中で急速凍結した。
これらの試料 1から 4の凍結物を、真空度 0. ImmHg以下、トラップ温度— 70°C以 下の条件下、 15°Cに設定したクールバスに浸して温度調整した真空デシケーター 内で 5時間凍結乾燥を行なった。クールバスの設定温度を 4°Cに昇温し、更に 1時間 二次乾燥を行った後、真空チャンバ一内に乾燥窒素を導入して真空破壊し、密栓し 、試料の凍結乾燥組成物を得た。
メチルセルロース或いはトレハロースを添加せず、凍結乾燥を実施すると、おそらく 静電気を帯びたと思われる粉立ちが発生し、バイアルでの密栓時或!、は開封時に凍 結乾燥物が飛散するため、取扱操作を慎重に行う必要があった。メチルセルロース 或いはトレハロースを添加すると、この粉立ちが抑制された。
[0029] (実施例 2)
実施例 1と同様の方法で、 GenomOne (登録商標、石原産業社製） 120 /z 1 (OD : 0. 25 総量： 6000HAU)の沈殿物を得た。この沈殿物に、以下それぞれに 60 1の、 0. 5%ポリペプトン蒸留水溶液 (これを添加し、懸濁したものを試料 5とする。以下同 様）、 0. 1%のメチルセルロースを含む 0. 5%ポリペプトン蒸留水溶液 (試料 6)、 1. 0%ポリペプトン蒸留水溶液 (試料 7)、 1. 5%ポリペプトン蒸留水溶液 (試料 8)、 2. 5 %ポリペプトン蒸留水溶液 (試料 9)を添加し、懸濁した後、液体窒素中で急速凍結し た。
以後は実施例 1と同様の方法で試料 5から 9の凍結乾燥組成物を得た。 [0030] (実施例 3)
実施例 1と同様の方法で、 GenomOne (登録商標、石原産業 (株)製） 120 1 (OD： 0. 25 総量： 6000HAU)の沈殿物を得た。この沈殿物に、以下それぞれに 60 1 の、 0. 1 %のメチルセルロースを含む 1. 0%ポリペプトン蒸留水溶液（これを添カロし、 懸濁したものを試料 10とする。以下同様)、 1. 0%バクトペプトン蒸留水溶液 (試料 1 1)、 1. 0%パクトトリプトン蒸留水溶液 (試料 12)、 1. 0%カゼイン酸加水分解物蒸留 水溶液 (試料 13)、 0. 3%L—ロイシン蒸留水溶液 (試料 14)、 1. 0% β—ァラニン 蒸留水溶液 (試料 15)、 0. 3%L—アルギニン一塩酸塩蒸留水溶液 (試料 16)、 1. 0 %L—ァスパラギン酸蒸留水溶液 (試料 17)を添加し、懸濁した後、液体窒素中で急 速凍結した。以後は、実施例 1と同様の方法で試料 10から 17の凍結乾燥組成物を 得た。
[0031] (実施例 4) (pCMV— GL3の調製）
改良型ホタルルシフェラーゼ蛋白質をコードする pGL3— CONTROL VECTOR (P romega社）プラスミド DNAを HindIII,XbaIで切断し、電気泳動（1 %ァガロース）し、ル シフェラーゼを含む断片を Gel— M Gel Extraction System (VIOGENE社）で精製し た。 CMVプロモーターを含む pcDNA3. 1 ( + )ベクター（Invitrogene社)も同じ手順 で切断、精製し CMVプロモーター領域を含む断片を得た。両断片を DNA Ligatio n Kit (TaKaRa社)でライゲーシヨン、大腸菌（DH5 a )に形質転換 (45°C、 45分)し、 CMVプロモーター制御でルシフェラーゼを発現できる pCMV— GL3プラスミド DN Aを含むアンピシリン耐性菌を選抜した。
得られた選抜菌を LB培地（アンピシリン含）で培養し、培養液を EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN社)で精製、 TE緩衝液に溶解し pCMV— GL3ZTE溶液とした
[0032] (実施例 5) (従来方法による遺伝子の導入方法）
前記実施例 1〜3で得られた試料 1〜試料 17の各凍結乾燥組成物に緩衝液 (PBS (一）） 120 1をカ卩えて分散した。これらの液 20 μ 1をそれぞれエツペンドルフチュー ブに取り、 10, 000rpm、 5分遠心した。上清を除去し、沈殿物を PBS (― ) 5 1で懸 濁した後、 4 μ & μ 1濃度の pGL3ZTE溶液 5 μ 1を加えた。 2%トライトン X— 100/ PBS (-)溶液: lを加え、 10, OOOrpm、 5分間遠心した。上清を除去し、沈殿物を PBS (—） 15 1で懸濁した後、 lOmgZml濃度の硫酸プロタミン ZPBS ( )溶液 2 . 5 μ 1をカ卩ぇ混合した。この溶液 8 μ 1を HeLa S3細胞（24ゥエルディッシュ、 6 X 104 細胞 Zディッシュ、 0. 5ml DMEM、 10%FCS)の培地に添カ卩し、 37°C、 5%CO
2 にて 24時間培養した。
培養後に、培地を除去し、 PBS (-) 100 μ 1を加え、ルシフェラーゼアツセィキット L uclite (Perkin Elmer社）の Lyophilized Substrate Solution 100 1を加えて細胞を 溶解し、蛍光 Ζ発光 Ζ吸光マルチファンクションリーダー GENios (TECAN社）でルシ フェラーゼ活性 (発光強度)を測定した。 試験結果は、表 1に示す。
(実施例 6) (膜融合活性のある不活性ィ匕 HVJエンベロープの凍結乾燥組成物の調 製）
不活性化 HVJウィルスエンベロープは、 WO03Z014338の実施例 1の（1)、及び 実施例 7の（1)〜 (4)に準ずる方法で得られた緩衝液交換後の不活性ィ匕 HVJェンべ ロープ懸濁液を使用した。手短には、受精鶏卵を用いて増殖させた HVJを |8—プロ ピオラタトンで処理することにより不活性ィ匕したのち、前処理工程 (フィルター濾過）、 濃縮工程を経て、次いでカラムクロマトグラフィー（Q Sepharose FF)で得られた不 活性化 HVJエンベロープのカラム分画 10Lをタンジェンシャルフローフィルター（TF F)モジュールを用いて 100mほで濃縮した。濃縮液 100mlに緩衝液（20mM Tris- HCl(pH7.5)、 150mM NaCl、 ImM MgC12) 100mlを添加し、更に 100mlまで濃縮し た。更にこの操作 (緩衝液交換)を 2回行った。
緩衝液交換後の不活性ィ匕 HVJエンベロープ液に滅菌水をカ卩えて 500mlに希釈し た後、更に TFFモジュールで 100mほで濃縮した。滅菌水で希釈〜 TFF濃縮を 5回 繰り返した後、 60mほで濃縮した。この濃縮液に、別途調製し滅菌した 4. 0%のポリ ペプトンと 0. 4%のメチルセルロースを含む水溶液 25mlをカ卩えた。この安定化剤を 含む不活性化 HVJエンベロープ懸濁液の濃度は、 OD 0. 6であった。また、この濃 縮により、緩衝液濃度は、 0. 03mM以下になる。 1. 5ml容スクリューキャップチュー ブに 65 1ずつ分注し、液体窒素で急速凍結した。凍結した不活性化 HVJェンベロ ープ懸濁液を、真空度 0. ImmHg以下、トラップ温度 70°C以下の条件下、 15 °Cに設定した真空チャンバ一内で 15時間凍結乾燥を行なった。真空チャンバ一の 設定温度を 4°Cに昇温し、更に 1時間二次乾燥を行った後、真空チャンバ一内に乾 燥窒素を導入して真空破壊し、密栓した。
(実施例 7) (再水和化による遺伝子導入）
実施例 6で得られた不活性ィヒ HVJエンベロープの凍結乾燥組成物（凍結乾燥品） に、実施例 4に記載の方法で調製した 4 /z g/ zz 1濃度の pCMV—GL3ZTE溶液 3 0 1、 1 μ Ε μ liti ( pGL3/TE^ ¾120 μ ある ヽは 0. 25 g/ 1濃度の p GL3ZTE溶液 480 1で分散し、 5分間氷上に静置した。緩衝液 (PBS (— ) ) 450 1、あるいは 360 1を加えて総量を 480 1とし、 lOmgZml濃度の硫酸プロタミン Z PBS (―)溶液 15 1をカ卩ぇ混合した。この溶液 40 μ 1を CHO— K1細胞（チヤィニー ズノヽムスター卵巣細胞、 ATCC NO.CCL— 61、大日本製薬より購入)を培養した 2 4ゥエルプレート（2. 5 X 104細胞 Ζゥエル、 Ham's F12+ 10%FCS 0. 5mlZゥェ ル、 37°C、 5%COで一夜培養）の培地に添カ卩し、 37°C、 5%COにて 24時間培養
2 2 した。
培地を除去し、 PBS ( + ) 125 μ 1を加え、ルシフェラーゼアツセィキット Luclite (Perki n Elmer社）の Substrate Solution 125 1をカ卩えて細胞を溶解し、溶解液 50 1の ルシフェラーゼ活性（発光強度）を MICROPLATE SCINTILLATION & LUMINES CENCE COUNTERトップカウント（PACKARD社）で測定した。
比較として従来技術により製造、界面活性剤を用いる従来方法で調製した不活性 化 HVJエンベロープベクターを用いた実験を実施した。 WO03Z013348の実施例 1の（1)及び実施例 7の（1)〜（5)に記載の方法で得られた凍結された不活性化 HV Jエンベロープ懸濁液 40 μ 1 (実施例 6で得られた凍結乾燥品の 1/3の不活性ィ匕 HVJ エンベロープ量に相当）を 1. 5mL容マイクロチューブに取り（従来品とよぶ）、 10, 0 00G、 5分遠心した。上清を除去し、沈殿物を PBS (—） 10 1で懸濁した後、 4/z gZ μ 1濃度の pCMV— GL3ZTE溶液 10 μ 1をカ卩えた。 2%トライトン X— 100/PBS ( -)溶液 2 1をカ卩え、 10, 000G、 5分遠心した。上清を除去し、沈殿物を PBS (— ) 3 0 1で懸濁した後、 lOmgZml濃度の硫酸プロタミン ZPBS (—）溶液 5 1を力卩ぇ混 合した。この溶液 8 1を CHO— K1細胞の培地に添加し、 24時間培養後、同じ手順 でルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を表 2に示した (全て 3ゥエルの測定値の平均である)。本発明の凍結乾燥組 成物 (表 2で凍結乾燥品とした)は外来遺伝子の溶液で分散するだけで、従来技術 により製造した不活性ィ匕 HVJエンベロープに界面活性剤を用いて外来遺伝子を封 入したとき (表 2では従来品とした)の凡そ 10倍の導入活性を示した。
(実施例 8) (膜融合活性のある不活性ィ匕 HVJエンベロープの凍結乾燥組成物の調 製）
不活性化ウィルスエンベロープは、 WO03Z014338の実施例 1の (1)、及び実施 例 7の（1)〜 (4)に準ずる方法で得られた緩衝液交換後の不活性ィヒ HVJェンベロー プ懸濁液を使用した。手短には、受精鶏卵を用いて増殖させた HVJを |8—プロピオ ラタトンで処理することにより不活性ィ匕したのち、前処理工程 (フィルター濾過）、濃縮 工程を経て、次いでカラムクロマトグラフィー（Q Sepharose FF)で得られた不活性 化 HVJエンベロープのカラム分画 5Lをタンジェンシャルフローフィルター（TFF)モジ ユールを用いて 200mほで濃縮した。濃縮液 200mlに緩衝液（20mM Tris- HCl(pH7 .5)、 150mM NaCl、 ImM MgC12) 200mlを添カ卩し、更に 200mlまで濃縮した。更にこ の操作（緩衝液交換）を 2回行 、、フィルター (Millipore MILLIPAK 200、 0.45 μ m) で濾過した。
緩衝液交換後の不活性ィ匕 HVJエンベロープ液に滅菌水をカ卩えて 600mlに希釈し た後、更に TFFモジュールで 200mほで濃縮した。滅菌水で希釈〜 TFF濃縮を 8回 回繰り返した後、 100mほで濃縮した。この濃縮液に、別途調製し滅菌した 5. 0%の ポリペプトンと 0. 5%のメチルセルロースを含む水溶液 26mlをカ卩えた。この不活性化 HVJエンベロープ懸濁液の濃度は、 OD 0. 6であった。 また、この濃縮により、緩 衝液濃度は、 0. 03mM以下になる。 1. 5ml容スクリューキャップチューブに 210 1 ずつ分注し、液体窒素で急速凍結した。凍結不活性化 HVJエンベロープ懸濁液を、 真空度 0. ImmHg以下、トラップ温度 70°C以下の条件下、 5°Cに設定した真空 チャンバ一内で 15時間凍結乾燥を行なった。真空チャンバ一の設定温度を 5°Cに昇 温し、更に 1時間二次乾燥を行った後、真空チャンバ一内に乾燥窒素を導入して真 空破壊し、密栓した。 [0036] (実施例 9) (細胞融合活性の測定）
不活性ィ匕 HVJエンベロープ懸濁液として、前記実施例 8と同様にして得られた本発 明の凍結乾燥組成物と、比較例として前記 WO03Z013348の実施例 1に記載の方 法と同様にして得られた凍結された不活性ィ匕 HVJエンベロープとを用いて両者の細 胞融合活性を測定した。細胞融合活性の測定は、 K. Hiraokaらの方法 (The Jour nal of Immunology, 173卷、 4297〜4307頁）を参考に行った。即ち、蛍光染色用 キット PKH26 (SIGMA、 No. PKH— 26— GL、赤色蛍光）又は PKH67 (SIGMA 、 No. PKH— 67— GL、緑色蛍光）にて、それぞれ染色したシリアンハムスター仔腎 由来細胞株 BHK— 21 (大日本製薬より購入)を細胞融合用緩衝液 [10mM Tris— HCL (pH7. 5)、 137mM NaCl、 5. 5mM KC1、 2mM CaCl ]用いて 8 X 106
2
個 Zmlに調製した。それぞれの色素で染色された細胞懸濁液を 25 /z Lずつ取り、 2 mL用マイクロチューブ内で混合した。この混合液中に、緩衝液 (PBS (―) )にて所 定の濃度（OD560nm)に調製した不活性ィ匕 HVJエンベロープ懸濁液 3 μ Lを添加し 、氷上で 5分間静置した後、 37°C恒温槽内で 15分間 (途中、 5分間隔でタッピング） 融合処理を行った。引続き、氷冷した 1%BSA含有 PBS ( + )緩衝液 300 /z Lを添カロ し、フローサイトメーター（ベタトンディッキンソン製 FACSCalibur™)にて、赤色および 緑色蛍光の両陽性を示す細胞の割合を測定した。バックグランドを測定するため、不 活性エンベロープ懸濁液に替えて緩衝液 (PBS (—））のみを添加すること以外は処 理区と同様に操作した対照区について、同様に測定し、各処理区の測定値を補正し た。尚、融合効率は、以下の式により算出した。
融合効率 (％) =
(処理区の赤色および緑色蛍光の両陽性の細胞数) Z (処理区の全細胞数） X 100 （対照区の赤色および緑色蛍光の両陽性の細胞数) Z (対照区の全細胞数） X 10 0
結果を表 3に示した (本発明の凍結乾燥組成物、比較例とも異なる 2ロットの測定値 の平均である）。比較例に比し、本発明の凍結乾燥組成物による処理区では、高い 融合効率が見られた。
[0037] [表 1] 安定化剤 ルシフェラ一 ゼ活性 蛋白質水解物 糖類 (TOP 或いはアミノ酸 COUNT)
1 0. 2 % ポリペプトン ― 10 568
2 ― 0. 2 % マンニトール 1 337
3 ― 0. 2 % メチルセルロース 542 1
4 ― 0. 2 % トレハロース 3 762
5 0. 5 % ポリペプトン ― 8629
6 0. 5 % ポリペプトン 0. 1 % メチルセルロース 9820
7 1. 0 % ポリペプトン 0. 1 % メチルセルロース 1 5248
8 1. 5 % ポリペプトン 0. 1 % メチルセルロース 606 5
9 2. 5 % ポリペプトン 0. 1 % メチルセルロース 4562
1 0 1. 0 % ポリペプトン 0. 1 % メチルセルロース 98 1 0
1 1 1. 0 % パクトペプトン 0. 1 % メチルセルロース 1 1 075
1 2 1. 0 % バク卜 トリプトン 0. 1 % メチルセルロース 4529
1 3 1. 0 % カゼィン酸加水分解物 0. 1 % メチルセルロース 8254
14 0. 3 % L ロイシン 0. 1 % メチルセルロース 6620
1 5 1. 0 % β—ァラニン 0. 1 % メチルセルロース 1 8 1 9
16 0. 3 % L アルギニン一塩酸塩 0. 1 % メチルセルロース 8086
1 7 1. 0 % L—ァスパラギン酸 0. 1 % メチルセルロース 2049
[0038] [表 2]
Figure imgf000018_0001
[0039] [表 3] 融合効率
使用した不活化 HVJエンベロープ懸濁濁液の濃度（OD)
0. 20 0. 10 0. 05
本発明組成物 10. 1¾ 15. 4¾ 13. 2%
比較例 9. 0¾ 2. 7¾ 3. 2% 産業上の利用可能性
本発明の膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープの凍結乾燥組成物は、 室温 (25°C以下)での保存ができ、使い勝手が良ぐ使用する場所や輸送に関する 制限が解消された。さらに、本発明の外来物質導入方法は、導入効率が著しく向上 し、より簡便であり、ハイスループット解析などの応用範囲が増大している。 なお、 2004年 6月 14日に出願された日本特許出願 2004— 176105号の明細書 、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開 示として、取り入れるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープと、蛋白質水解物、ロイシン、 L- アルギニン酸および多糖類力 なる群より選択される一つ以上の安定化剤と、を含有 することを特徴とする凍結乾燥組成物。
[2] 膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープ力 ノ ラミクソウィルス科、オルトミ クソウィルス科、ヘルぺスウィルス科、へパドナウィルス科、またはフラビウィルス科の ウィルスの不活性ィ匕ウィルスエンベロープである請求項 1に記載の凍結乾燥組成物
[3] 安定化剤が、蛋白質水解物及び多糖類である請求項 1又は 2に記載の凍結乾燥 組成物。
[4] (1)膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープ懸濁液と安定化剤とを混合 する工程と、（2)前記（1)の工程により得られた混合物を凍結乾燥する工程と、を含 む工程により調製される請求項 1〜3のいずれかに記載の凍結乾燥組成物。
[5] 前記（1)の工程により得られた混合物における不活性ィ匕ウィルスエンベロープの濃 度が ODO. 1〜7. 0である上記 4に記載の凍結乾燥組成物。
[6] 前記（1)の工程により得られた混合物における蛋白質水解物、ロイシン、又は L-ァ ルギニン酸の濃度が 0. 1〜2. 5%である請求項 4または 5に記載の凍結乾燥組成物
[7] 前記（1)の工程により得られた混合物における多糖類の濃度が 0. 05〜0. 5%で ある請求項 4〜6のいずれかに記載の凍結乾燥組成物。
[8] 前記（1)の工程により得られた混合物における塩濃度が 3mM以下である請求項 4
〜7の 、ずれかに記載の凍結乾燥組成物。
[9] 細胞または生体組織へ外来物質を導入する方法であって、
(1)外来物質と水とを含有する混合物を用いて、膜融合活性のある不活性化ウィル スエンベロープを含有する凍結乾燥組成物を再水和する工程と、
(2)前記（1)の工程により得られる組成物を細胞または生体組織と接触させる工程 と、を含む外来物質導入方法。
[10] 凍結乾燥組成物が、請求項 1〜8の ヽずれかに記載の凍結乾燥組成物である、請 求項 9に記載の外来物質導入方法。
[11] 細胞融合の方法であって、
(a)膜融合活性のある不活性ィ匕ウィルスエンベロープを含有する凍結乾燥組成物を 再水和する工程と、
(b)前記 (a)の工程により得られる組成物を融合の対象となる細胞の懸濁液と混合す る工程と、を含む細胞融合方法。
[12] 凍結乾燥組成物が請求項 1〜8のいずれかに記載の凍結乾燥組成物である、請求 項 11に記載の細胞融合方法。
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