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WO2005026353A1 - 癌化度評価方法 - Google Patents

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WO2005026353A1
WO2005026353A1 PCT/JP2004/013879 JP2004013879W WO2005026353A1 WO 2005026353 A1 WO2005026353 A1 WO 2005026353A1 JP 2004013879 W JP2004013879 W JP 2004013879W WO 2005026353 A1 WO2005026353 A1 WO 2005026353A1
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WO
WIPO (PCT)
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gene
mammal
cancer
derived
methylation
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/013879
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English (en)
French (fr)
Inventor
Toshikazu Ushijima
Atsushi Hagihara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
National Cancer Center Japan
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
National Cancer Center Japan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd, National Cancer Center Japan filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority to EP04773361A priority Critical patent/EP1679371B8/en
Priority to US10/572,383 priority patent/US8980559B2/en
Publication of WO2005026353A1 publication Critical patent/WO2005026353A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the degree of canceration of a mammal-derived specimen, and the like.
  • the present inventors have conducted intensive studies. As a result, in a cancer cell line and a cancer tissue sample, the Neurofilament 3 gene (hereinafter, sometimes referred to as the NEF3 gene) was replaced with an immortalized normal cell line. And that the expression level of the neurofilaments gene in the cancer cell line is significantly lower than that in the immortalized normal cell line. The present inventors have further found that the expression level of such a gene can be increased by allowing a DNA methylation inhibitor to act on a cancer cell line, and thus have accomplished the present invention.
  • the NEF3 gene the Neurofilament 3 gene
  • a nucleotide sequence whose methylation frequency is represented by one or more 5'-CG-3's present in the nucleotide sequence in the promoter overnight, untranslated or translated region of the gene The evaluation method according to item 1 or 4, wherein the methylation frequency of cytosine in the medium is;
  • a search method comprising a second step of determining the ability of a test substance to promote the expression of a Neurofilaments gene based on a difference obtained by comparing the measured amount of an expression product with a control.
  • this may be referred to as the present invention search method.
  • 21. The search method according to the above item 20, wherein the cancer cell is a viable cancer cell; 22. the active ingredient contains a substance having the ability found by the search method as described in item 20 above, and Is formulated into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • An anticancer agent comprising, as an active ingredient, a nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence of Neurofilament 3; An anticancer agent characterized by being formulated in a chemically acceptable carrier;
  • the neurofilaments gene methylation frequency is reduced in cells in a mammal that can be diagnosed as having cancer.
  • a method for suppressing canceration comprising a step of administering a substance;
  • Figure 1 shows human-derived immortalized (normal) ductal epithelial cell lines (HPDE-4 / E6E7 and PDE6-E6E7 c7) and seven types of knee cancer cell lines (BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2 PCR was performed using genomic DNA prepared from Hs766T, PANC-1 and D-PAC) and treated with sodium bisulfite, and the PCR reaction solution after PCR was analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • FIG. The names of the cells used are indicated at the top.
  • the figure described as HPDE4 / SssI shows the DNA obtained by treating the genomic DNA of HPDE-4 / E6E7 with methylase SssI. Lane U, PCR reaction using unmethylation-specific primer; Lane M, PCR reaction using methylation-specific primer.
  • FIG. 2 shows human-derived Teng cancer tissue and surrounding normal viscera tissue [obtained by obtaining informed consent from the patient]. Each sample was prepared from 12 specimens (Casel to Casel 2) and treated with sodium bisulfite.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of performing PCR using genomic DNAs as type III and analyzing the PCR reaction solution after PCR by agarose gel electrophoresis. Casel-Casel2 indicated the specimen. Cancer is a tunnel cancer tissue, Normal is a normal tissue around the lung is there. Lane U, PCR reaction using unmethylated specific primer; Lane M, PCR reaction using methylated specific primer.
  • FIG. 4 shows the results from humans to which immortalized (normal) ⁇ duct epithelial cell line (HPDE-4 / E6E7) and 5Aza-dC, a methylation inhibitor, were added at a concentration of 0, 0.5 IM or 1 / M.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of Neurofilaments gene obtained by amplifying DNA derived from the mRNA of Neurofilaments gene by Real Time PCR in the knee cancer cell line (PANC-1). The names of the cells used are shown at the bottom of the figure. The vertical axis indicates the value obtained by dividing the amount of Neurofilaments gene by the amount of GAPDH gene.
  • the present invention relates to the use of a methylated N eurofilament3 gene as a cancer marker (for example, an overlying cancer marker).
  • exon 1 the exon located at the most upstream 5 ′ (hereinafter referred to as exon 1) and the 5 ′ upstream
  • exon 1 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilaments gene is represented by nucleotide numbers 28307 to 29387.
  • the Neurofilaments gene used in the present invention includes, in addition to the above-mentioned gene having a known nucleotide sequence, a mutation naturally occurring due to a species difference, an individual difference or a difference between organs and tissues in the base sequence. It also includes a gene having a base sequence in which a base is deleted, substituted or added. In mammals, there is a phenomenon that among the four types of bases that make up a gene (genomic DNA), only cysteine is methylated. In a Neurofilament 3 gene derived from a mammal, for example, a part of cytosine in the genomic DNA of the gene is methylated.
  • methylation frequency refers to, for example, that the cytosine is methylated when a plurality of haploids are examined for the presence or absence of cytosine methylation in the CpG to be investigated. Of haploids.
  • an index value having a correlation with (methylation frequency) refers to, for example, the amount of the expression product of the neurofilaments gene (more specifically, The amount of the transcript and the amount of the translation product of the gene). In the case of such an amount of an expression product, there is a negative correlation such that the higher the methylation frequency, the lower the methylation frequency.
  • Examples of the mammal-derived specimen in the first step of the evaluation method of the present invention include, for example, Cancer cells such as cells or a tissue containing the same, and cells that may contain DNA derived from cancer cells such as a cancer cell, a tissue containing the same (the tissues here include blood, plasma, In a broad sense, it includes body fluids such as serum, lymph, and serum, and lymph nodes, etc.) or biological samples such as body secretions (urine, milk, etc.).
  • the cancer is arm cancer
  • a knee tissue including Teng's solution collected from a test animal can be mentioned.
  • biological samples may be used as samples as they are, or biological samples prepared by various operations such as separation, fractionation, and immobilization from such biological samples may be used as samples.
  • a method for measuring the methylation frequency of the Neurofilament 3 gene contained in a specimen derived from a mammal or an index value having a correlation with the methylation frequency can be performed, for example, as follows. Good.
  • a first method after contacting a DNA derived from a sample with a reagent that modifies unmethylated cytosine, the DNA is converted into a ⁇ type, and the presence or absence of cytosine methylated to be analyzed can be identified.
  • a method is available in which a polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR) is performed using primers to determine the amount of amplification product obtained.
  • PCR polymerase chain reaction
  • DNA is extracted from a mammal-derived specimen using, for example, a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a conventional method, and the prepared plasma or serum is used as a sample to prepare free DNA (such as kidney cancer cells).
  • free DNA such as kidney cancer cells.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the Neurofilaments gene includes exon 1 of the human-derived Neurofilaments gene. 5, the base sequence of genomic DNA containing the promoter region located upstream, and more specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (described in Genbank Accession No. AF106564). This corresponds to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 of the base sequence to be prepared.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilame nt3 gene is represented by nucleotide numbers 614 to 1694.
  • Cytosine in the nucleotide sequence represented by CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 has a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as 11 spleen cancer cells. ). More specifically, examples of cytosine having a high methylation frequency in kidney cancer cells include, for example, nucleotides 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a reagent that modifies unmethylated cytosine for example, first denature the DNA with an alkaline solution (pH 9 to 14) and then use a bisulfite such as sodium bisulfite ( bisulfite) (concentration in solution: for example, 3M final concentration), etc., and treat for about 10-16 hours (overnight) at 55. Denaturation at 95 ° C and 50 ° C to facilitate the reaction The reaction can be repeated 10-20 times. In this case, unmethylated cytosine is converted to peracyl, while methylated cytosine is not converted to peracyl and remains cytosine.
  • a bisulfite such as sodium bisulfite ( bisulfite) (concentration in solution: for example, 3M final concentration), etc.
  • methylation-specific PCR The PCR to be used (hereinafter also referred to as methylation-specific PCR) and the base sequence of the DNA treated with bisulfite and the like and the cytosine where methylation is not methylated (all PCR using a pair of non-methylidazole-specific primers selected from a base sequence complementary to the base sequence and a base sequence in which cytosine has become peracil (hereinafter referred to as non-methyl Sometimes also referred to as le-specific P C R.) And performing.
  • PCR primers specific to the sequence methylation-specific primers
  • PCR primers specific to non-methylated cytosine-containing base sequences primers specific to non-methylated. Since the design is based on the DN ⁇ chain that has been chemically converted by bisulfite treatment and is no longer complementary, methylation is performed based on each of the originally double-stranded DNA chains.
  • Specific primers and unmethylated specific plasmids can also be generated. Take -Is preferably designed to include cytosine in CpG near the 3 'end of the primer in order to increase the specificity of methyl and non-methyl. Further, one of the primers may be labeled to facilitate the analysis.
  • primers for measuring the methylation frequency of the Neuro0fUamen13 gene by methylation-specific PCR include, for example, a promoter region, a non-translated region or a translated region (coding region) of the Neuroii lament3 gene. ) Can be designed as described above based on the nucleotide sequence containing one or more cytosines in the CpG present in the nucleotide sequence described in (1).
  • cytosine in CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, specifically, in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580, etc., and can be designed based on a nucleotide sequence containing one or more cytosines. Examples of such primers are shown below.
  • reaction solution in the methylation-specific PCR for example, 50 ng of ⁇ -type DNA, and 1 ⁇ 1 of each primer solution of 1 Opmol / l were used. , 2. 4 ⁇ 1 5 mM dNTPs, and 10 X buffer (lOOmM Tr is-HCl pH8. 3, 500mM KCK 20mM MgCl 2) to 2.5 1, a heat-resistant DNA polymerase Ichize 5U / / 1 0 21 and mixed with sterile ultrapure water to obtain a reaction solution having a volume of 251.
  • reaction conditions for example, after keeping the above-mentioned reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, then at 55 to 65 ° C for 30 seconds, and further at 72 for 30 seconds
  • One cycle is a condition where the heat retention is performed for 30 to 40 cycles.
  • the amounts of the obtained amplification products are compared.
  • an analysis method denaturing polyacrylamide gel electrophoresis in which the amounts of amplification products obtained by PCR using methylation-specific primers and PCR using non-methylation-specific primers can be compared.
  • plasma or serum is prepared from the blood according to an ordinary method, and the prepared plasma or serum is used as a sample to prepare free DNA (such as victory cancer cells).
  • Analysis of cancer cell-derived DNA avoids blood cell-derived DNA. It is possible to analyze DNA derived from a cancer cell such as a pancreatic cancer cell, and it is possible to improve the sensitivity of detecting a cancer cell such as a vicinal cancer cell and a tissue containing the same.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the Neurofilaments gene includes a human-derived Neurofilaments gene.
  • the nucleotide sequence of a genomic DNA containing exon 1 of the genomic DNA and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession) This corresponds to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 of the base sequence described in No. AF106564.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilament 3 gene is represented by nucleotide numbers 614 to 1694.
  • Nucleotide sequence for primer design Is selected so as not to contain cytosine in CpG to be analyzed. If the nucleotide sequence selected for the primer design does not contain any cytosine, the selected nucleotide sequence and the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence are the same as the primer sequence of the primer. It can be. In addition, when the base sequence selected for primer design includes cytosines other than those to be analyzed, but the cytosine is not cytosine in CpG, it is necessary to consider that these cytosines are converted to peracil. Design one.
  • a pair of primers each having a base sequence in which all cytosines are peracyl and a base sequence complementary to the base sequence are designed. Furthermore, when the nucleotide sequence selected for primer design contains cytosine other than the analysis target and the cytosine is cytosine in CPG, unmethylated cytosine is converted to peracil and methyl Design primers in consideration of the fact that cytosine that has been converted is not converted to peracil.
  • a methylation-specific primer pair and an unmethylation-specific primer pair are mixed and used in equal amounts.
  • a reagent for modifying unmethylated cytosine for example, bisulfite such as sodium bisulfite can be used.
  • a reagent that modifies only methylated cytosine may be used.
  • the DNA is treated in an alkaline solution (pH 9 to 14) with a bisulfite such as sodium bisulfite.
  • concentration in solution For example, 3M final concentration
  • Degree process at 55 ° C.
  • denaturation at 95 ° C and reaction at 50 ° C can be repeated 10-20 times.
  • the unmethylated cytosine is converted to peracyl, while the methylated cytosine is not converted to peracyl and remains cytosine.
  • DNA (246 bp) is amplified.
  • the primer pair has a base number of 408, 421, 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. It can be used as a primer for examining the methylation frequency of cyto and syn shown by 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580, and 596.
  • reaction conditions for example, after keeping the above-mentioned reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, one cycle of 95 ° C for 30 seconds, then 57 ° C for 30 seconds, and further 72 ° C for 30 seconds
  • the conditions for performing the heat retention for 30 to 40 cycles are as follows.
  • the base at the position corresponding to the cytosine to be analyzed is cytosine or thymine (peracyl).
  • the peak area indicating cytosine detected at the position corresponding to the cytosine to be analyzed with the peak area indicating thymine (peracil) in the peak chart indicating bases in the obtained amplification product.
  • the frequency of methylation of cytosine to be analyzed can be measured.
  • plasma or serum is prepared from blood according to a conventional method, and the prepared plasma or serum is used as a sample to prepare free DNA (such as kidney cancer cells). (Including DNA derived from cancer cells) to avoid DNA derived from blood cells.
  • DNA derived from cancer cells such as pancreatic cancer cells can be analyzed, and the sensitivity for detecting cancer cells such as pancreatic cancer cells and tissues containing the same can be improved.
  • the cytosine to be analyzed is selected from cytosines in the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the neurofilaments gene. be able to.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the Neurofilaments gene includes the human-derived Neurofilaments gene.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the genomic DNA and the promoter region located 5 ′ upstream of the exon 1 can be mentioned. More specifically, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession) No. AF106564, which corresponds to the complementary sequence of base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 in the base sequence described in No. AF106564.
  • cytosine having a high methylation frequency in victory cancer cells includes, for example, nucleotides 428, 432, 443, 451, 471, 475, and 482 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. , 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580 and the like.
  • Unmethylated cytosine is converted to peracyl based on the base sequence containing cytosine to be analyzed, and methylated cytosine is converted to peracyl based on the base sequence containing cytosine to be analyzed. Designed not to be broken Good to do.
  • the nucleotide sequence containing methylated cytosine [cytosine at the methylated position (cytosine in CpG) remains cytosine
  • unmethylated cytosine (cytosine not included in CpG) Is a base sequence that is a peracil) or a methylation-prohibiting probe having a base sequence complementary to such a base sequence, and a base sequence when cytosine is not methylated (all cytosines are peracil Base sequence) or a non-methylation-specific probe having a base sequence complementary to such a base sequence.
  • Such a probe may be labeled before use to facilitate analysis of the presence or absence of binding between the DNA and the probe! ⁇ .
  • the probe may be used by immobilizing it on a carrier according to a usual method.
  • a reagent for modifying unmethylated cytosine for example, bisulfite such as sodium bisulfite can be used.
  • a reagent that specifically modifies only methylated cytosine may be used.
  • the DNA is first denatured with an alkaline solution (pH 9 to 14), and then bisulfite (such as sodium bisulfite) is used.
  • a probe for measuring the methylation frequency of the eurofil amen 13 gene is, for example, a CpG present in the nucleotide sequence in the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the neurofilaments gene. It can be designed as described above based on a base sequence containing one or more cytosines.
  • cytosine in CpG present in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, specifically, in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, nucleotide numbers 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, 491, 499, 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580, and the like. Examples of such probes are shown below. ⁇ Set 1>
  • Hybridization is, for example, Sambrook J , Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory press (Cold Spring Harbor Laboratory pre ss). . Hybridization is usually performed under stringent end conditions.
  • stringent conditions refers to, for example, a method of preparing a hybrid at 45 ° C.
  • a solution containing 6 XSSC a solution containing 1.5 M NaCK 0.15 M trisodium citrate is referred to as 10 XSSC.
  • the salt concentration in the washing step can be, for example, from 2 x SSC at 50 ° C (low stringency conditions) to 0. With 2 X SSC, you can select from conditions up to 50 ° C (high stringency conditions).
  • the temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 (high stringency conditions). Also, both salt concentration and temperature can be varied.
  • the amount of DNA bound to the methylation-specific probe and the amount of DNA bound to the unmethylation-specific probe are compared to determine the cytosine (analyte) to be analyzed. That is, the frequency of methylation of cytosine in CpG contained in the base sequence on which the probe was designed can be measured.
  • a method may be used in which a restriction enzyme capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed is allowed to act on DNA derived from a sample, and then digestion by the restriction enzyme is examined. it can.
  • DNA is extracted from a mammal-derived specimen using, for example, a commercially available DNA extraction kit or the like.
  • plasma or serum is prepared from the blood according to an ordinary method, and the prepared plasma or serum is used as a sample to prepare free DNA (such as Teng's cancer cell).
  • free DNA such as Teng's cancer cell.
  • DNA derived from cancer cells such as kidney cancer cells can be analyzed while avoiding DNA derived from blood cells, and cancer cells such as victory cancer cells and the like can be analyzed. Can improve the sensitivity of detecting a tissue or the like containing.
  • a restriction enzyme capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation to be analyzed is allowed to act on the extracted DNA, and then the presence or absence of digestion by the restriction enzyme is examined.
  • the cytosine to be analyzed is selected from cytosines in the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the neurofilaments gene. You can choose.
  • the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the Neurofilaments gene includes a human-derived Neurofilaments gene.
  • the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 and the promoter region located 5 'upstream of And the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (corresponding to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF106564).
  • the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilament 3 gene is represented by nucleotide numbers 614 to 1694.
  • the “restriction enzyme capable of discriminating the presence or absence of cytosine methylation” refers to digestion of a recognition sequence containing methylated cytosine. And a restriction enzyme capable of digesting recognition sequences containing unmethylated cytosine.
  • DNA in which the cytosine contained in the recognition sequence is methylated is not cleaved by the action of a methylation-sensitive restriction enzyme, while DNA in which the cytosine contained in the recognition sequence is not methylated is treated.
  • the DNA is cleaved by the action of a methylation-sensitive restriction enzyme.
  • methylation-sensitive enzymes include, for example, HpaII, BstUI, Narl, SacII, and the like.
  • DNA treated with a methylation-sensitive restriction enzyme containing the cytosine to be analyzed in the recognition sequence is type II, and the cytosine to be analyzed is included.
  • a method is described in which PCR is performed using a primer pair capable of amplifying DNA containing a recognition sequence but not containing the recognition sequence of the restriction enzyme other than the recognition sequence, and the presence or absence of DNA amplification (amplification product) is examined. be able to. If the cytosine to be analyzed is methylated, an amplification product is obtained. On the other hand, If the cytosine is not methylated, no amplification product will be obtained.
  • cytosine represented by base numbers 544, 546, 737, 739, 1702, and 1704 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 the cytosine is included in the recognition sequence of Sac II, and the method described above. As a result, the methylation frequency of the cytosine can be measured.
  • DNA derived from the Neurofilaments gene may be applied to DNA that has been subjected to a methylation-sensitive restriction enzyme containing cytosine to be analyzed in the recognition sequence.
  • a method of performing Southern hybridization using DNA that does not contain the recognition sequence of the restriction enzyme as a probe and examining the length of the eight hybridized DNAs can also be mentioned.
  • the cytosine to be analyzed is methylated, a longer DNA is detected than when the cytosine is not methylated.
  • the frequency of cytosine methylation to be analyzed can be measured.
  • the methylation frequency of the Neurofilament3 gene contained in a specimen derived from a mammal is measured.
  • the measured methylation frequency is compared with the methylation frequency (control) of the Neurofilament3 gene contained in a sample derived from a healthy mammal that can be diagnosed as having no cancer cells such as victory cancer cells. Then, the degree of canceration of the sample is determined based on the difference obtained by the comparison. For example, Neu in mammalian samples If the methylation frequency of rofilament 3 gene is higher than that of the control (I: if the Neuroi 1 ament 3 gene is hypermethylated compared to the control), the degree of canceration of the specimen Is higher than the control and the control.
  • the term “degree of canceration” has the same meaning as generally used in the art. Specifically, for example, when a mammal-derived specimen is a cell, the degree of malignancy of the cell is determined. For example, when a mammal-derived specimen is a tissue, it means the amount of cancer cells present in the tissue.
  • the expression of the Neurofilaments gene is lower in cancer cells such as kidney cancer cells than in samples such as cells and tissues derived from healthy mammals. This is because the frequency of methylation of the gene is high in cancer cells such as kidney cancer cells, and the gene cannot be expressed normally. As a result, the amount of the expression product of the gene (more specifically, Transcripts and translation products). As described above, in the evaluation method of the present invention, instead of W: and methylation frequency, an index value having a correlation therewith (in the above case, an index value indicating the amount of an expression product and having a negative correlation) ) May be measured.
  • an index value for example, the amount of an expression product correlated with the methylation frequency of the Neurofilaments gene contained in a specimen derived from a mammal is measured, and the measured methyl value is measured.
  • the degree of canceration of the sample can be determined based on a difference obtained by comparing an index value (eg, the amount of an expression product) having a correlation with the frequency of transformation with a control.
  • an index value eg, the amount of an expression product
  • a method for measuring the amount of transcript mMA can be given.
  • the measurement includes, for example, RT-PCR method / Zan blot method [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)], in situ RT-PCR method [Nucleic Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)] ], In situ hybridization method, NASBA method [Nucleic acid sequence-based amplif ication, nature, 350, 91-92 (1991)] A method may be used.
  • a sample containing mRNA which is a transcription product of the Neuro 0 fi 1 amen 13 gene contained in a specimen derived from a mammal may be prepared by extracting, purifying, etc. from the specimen according to an ordinary method.
  • the detection probe may be the Neurofilaments gene or a part thereof (restriction enzyme cleavage of Neurofila Dient3 gene, Oligonucleotides of about lOObp to lOOOObp chemically synthesized based on the nucleotide sequence of the gene) may be used as long as the detection conditions used in the hybridization with the mRNA contained in the sample described above are used. There is no particular limitation as long as it gives detectable specificity below.
  • the primer used is one that can specifically amplify only the Neurofilaments gene.
  • the region to be amplified and the base length are not particularly limited.
  • Such primers include, for example, the following primers (S: sense, A: antisense).
  • S sense, A: antisense
  • the amount of transcripts can also be measured by the RT-PCR method as described in Examples below.
  • quantification high-precision quantification can be achieved by monitoring PCR reaction products in real time and performing force kinetic analysis, for example, to detect even a slight difference of about twice the gene amount.
  • the amount of each product can also be compared using real-time PCR, a PCR method.
  • Examples of a method for performing real-time PCR include a method using a probe such as a type-dependent nucleic acid polymerase probe and a method using an intercalator such as Cyber Green.
  • a probe such as a type-dependent nucleic acid polymerase probe
  • an intercalator such as Cyber Green.
  • a device and a reagent for the real-time PCR method commercially available devices and reagent kits can be used.
  • an index value correlated with the methylation frequency of the Neurofilament3 gene contained in a specimen derived from a mammal was measured.
  • the amount of Neurofilaments protein, which is a translation product of the Neurofilaments gene is determined. Methods for measuring can be given.
  • a specific antibody against the Neurofilaments protein can be produced according to a usual immunological method using the protein as an immunizing antigen.
  • an index value having a correlation with the methylation frequency of the Neurofilaments gene contained in the specimen derived from a mammal is determined.
  • An index value that correlates with the measured methylation frequency and, for example, methylation of the neurofilaments gene contained in a sample from a healthy mammal that can be diagnosed as having no cancer cells of the pancreatic cancer cell line By comparing with an index value (control) having a correlation with the frequency, the degree of canceration of the specimen is determined based on the difference obtained by the I: dari comparison.
  • primers, probes or specific antibodies that can be used in various methods for measuring the methylation frequency of the Neurofi 1 anient 3 gene or an index value having a correlation with the methylation frequency are victory cancer. It is useful as a reagent of a kit for detecting cancer cells such as cells.
  • the present invention provides a kit for detecting cancer cells such as kidney cancer cells containing these primers, probes or specific antibodies as reagents, or the primers, probes or specific antibodies immobilized on a carrier.
  • a chip for ttl detection of cancer cells such as kidney cancer cells, and the scope of the rights of the evaluation method of the present invention is a detection kit as described above utilizing the substantial principle of the method. This includes use in the form of chips.
  • Expression of the Neurofilaments gene is detected in samples of cells and tissues from healthy mammals. It is lower in cancer cells such as kidney cancer cells. On the other hand, as shown in the examples below, the amount of expression products of the gene is increased by causing a substance that inhibits DNA methylation related to the neurofilaments gene to act on cancer cells such as kidney cancer cells. Can be. It is a substance that can compensate for a decrease in neurofilaments gene expression levels in cancer cells, such as kidney cancer cells, or a concomitant decrease in function—for example, unmethylation (or abnormal methylation as observed in cancer).
  • Neurofilament 3 gene expression product of the gene, a substance capable of promoting the expression of the gene (for example, a substance that inhibits DNA methylation of the Neurofilame n13 gene, Neurofi1 amen 13 (A substance that reduces the frequency of methylation in the gene) means that it is useful for treating cancer such as S-extracted cancer or suppressing canceration of normal tissues such as kidney.
  • a substance capable of promoting the expression of the gene for example, a substance that inhibits DNA methylation of the Neurofilame n13 gene, Neurofi1 amen 13 (A substance that reduces the frequency of methylation in the gene) means that it is useful for treating cancer such as S-extracted cancer or suppressing canceration of normal tissues such as kidney.
  • canceration may be suppressed by administering a substance that reduces the methylation frequency of the Neurofilaments gene to cells in the body of a mammal that can be diagnosed with cancer.
  • a substance that inhibits DNA methylation related to the Neurofilaments gene to cancer cells such as Teng cancer cells
  • the substance is present in the nucleotide sequence in the promoter region or coding region of the Neurofilamen 13 gene.
  • the cytosine in the CpG is hypomethylated (Oiypomethylation) as in normal tissues, increasing the expression level of the mRNA that is a transcription product of the Neurofilaments gene, and consequently the Neurofi 1 ament3 protein, a translation product of the Neurofilament 3 gene.
  • the expression level could be increased. Further, for example, by introducing a cDNA comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the Neurofi 1 amen 13 gene or Neuro fi 1 amen 13 protein into a cancer cell such as a victory cancer cell, The expression of Neurofilaments protein in cancer cells could be increased.
  • the present invention is characterized in that (1) the active ingredient comprises a substance capable of promoting the expression of the Neurofilaments gene, and the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier. And (2) a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of Neurofilaments as an active ingredient, wherein the active ingredient is formulated in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the dosage form of the anticancer agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a normal preparation.
  • a preparation is pharmaceutically acceptable, for example, a water-soluble solvent, a non-water-soluble solvent, a buffer, a dissolution aid. It can be produced by mixing the active ingredient with carriers such as agents, isotonic agents and stabilizers. If necessary, auxiliary agents such as preservatives, suspending agents and emulsifiers may be added.
  • the anticancer agent can be used in the form of a usual liquid such as a solution.
  • An effective amount of the anticancer agent of the present invention can be parenterally administered to a mammal such as a human (for example, cells in a mammal that can be diagnosed with cancer).
  • parenteral administration methods include, for example, injection (subcutaneous, intravenous, topical).
  • the dose varies depending on the age, sex, body weight, degree of disease, type of the anticancer agent of the present invention, dosage form, etc. of the mammal to be administered, but usually, the active ingredient works effectively in the patient's cells. It is sufficient to administer an amount of the active ingredient that produces an intracellular level equal to the appropriate concentration level.
  • the above-mentioned daily dose can be administered once or divided into several times.
  • a gene transfer method using a viral vector As a method for introducing a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of Neurofilaments into a cell, a gene transfer method using a viral vector, a gene transfer method using a non-viral vector (Nikkei Science) , April 1994, pp. 20-45, Experimental Medicine Special Edition, 12 (15) (1994), Experimental Medicine Separate Volume, “Basic Technologies for Gene Therapy,” Yodosha (1996)), etc. .
  • the former gene transfer method includes, for example, TR virus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, polio virus, simbis virus, etc. Examples thereof include a method of incorporating and introducing DNA encoding 4 or mutant TR4. Examples of gene transfer methods using non-viral vectors include a method of directly administering an expression plasmid into muscle (DNA vaccine method), a ribosome method, and a lipofectin method. , A microinjection method, a calcium phosphate method, an electoral port polish method and the like.
  • a nucleic acid having a base sequence encoding the amino acid sequence of Neurofilaments can be administered by an appropriate administration route depending on the disease, condition, and the like.
  • it can be administered by injection to vicinal cancer cells, veins, arteries, subcutaneous, intradermal, muscle, etc.
  • the dosage form of the gene therapy agent as the anticancer agent may be an injection, or may be a ribosome preparation such as a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated frozen agent.
  • a preparation may be pharmaceutically acceptable, for example, a carrier such as a water-soluble solvent, a non-water-soluble solvent, a buffer, a solubilizing agent, an isotonic agent, a stabilizer, or the like. Or a plasmid-type gene).
  • auxiliary agents such as preservatives, suspending agents and emulsifiers may be added.
  • the anticancer agent can be used in the form of a usual liquid such as a solution.
  • the search method of the present invention is a method for searching for a substance having an ability to promote the expression of a Neurofilaments gene, wherein (1) a first step of bringing a test substance into contact with cancer cells, (2) a first step ( 1) a second step of measuring the amount of the expression product of the Neurofilaments gene contained in the cancer cells, and (3) a test substance based on the difference obtained by comparing the measured amount of the expression product with a control. And a third step of determining the ability of the gene to promote the expression of the Neurofilaments gene.
  • the cancer cell in the first step of the search method of the present invention is not particularly limited, and may be selected from mammals. It may be a cancer cell isolated from a conventional cancer tissue or a mammalian cancer cell line established as a cell line. Examples of the mammal include human, monkey, mouse, rat, hamster and the like. Preferable examples of the type of cancer include kidney cancer. Specifically, for example, known human-derived Teng cancer cell lines such as BXPc3, HPAF-II, Capan-2, MiaPaCa-2, Hs766T, PANC-1, and HPAC (all available from ATCC) With
  • the amount of cancer cells for bringing the test substance into contact with the cancer cells in the first step of the search method of the present invention may be generally about 10 4 to 10 8 cells, and about 10 5 to 10 7 cells. Is preferred.
  • the concentration of the test substance may be generally about 0.1 ng / m1 to about 100 gZm1, preferably about 1 ngZm1 to about 50 gZm1.
  • the time for bringing the test substance into contact with the cancer cells is usually from 1 hour to about 5 days, preferably from several hours to about 2 days.
  • the number of times the test substance is brought into contact with the cancer cells may be one or more.
  • the environment in which the test substance is brought into contact with the cancer cells is preferably an environment in which the life activity of the cancer cells is maintained, and examples thereof include an environment in which the energy source of the cancer cells coexists.
  • the first step is performed in a medium.
  • the amount of the expression product of the Neurofilaments gene contained in the cancer cells is measured by the method described above in the first step of the evaluation method of the present invention.
  • a method for measuring an indicator value having a correlation with the methylation frequency of the included Neurofilaments gene ” may be used.
  • the test substance To determine the ability of the test substance to promote the expression of the Neurofilaments gene based on the difference obtained by comparing the amount of the expression product measured in the second step of the search method of the present invention with the control, When the measured amount of the expression product and the concentration of the test substance for bringing the test substance into contact with the cancer cells in the first step of the search method of the present invention are set to zero (that is, the test substance (If not in contact with) the expression product of the neurofilament3 gene (control) and determine the ability of the test substance to promote the expression of the Neurofilaments gene based on the difference obtained from the comparison. I do.
  • the amount of the expression product of the Neurofilaments gene contained in the cancer cells contacted with the test substance is a control (in this case, the amount of the expression product of the Neurofilament 3 gene contained in the cancer cells not contacted with the test substance). If it is relatively high, it can be determined that the test substance has the ability to promote the expression of the Neurofilaments gene.
  • the expression amount of the Neurofilament 3 gene when the cancer cell or another test substance is brought into contact may be used.In this case, the expression of the Neurofilaments gene of the other test substance is promoted in advance. Preferably, the ability to do so is known.
  • the expression amount of the Neurofilaments gene contained in a normal cell line such as a normal stomach cell line or a healthy mammal-derived sample that can be diagnosed as having no cancer cells such as victory cancer cells. Is preferably measured both when the test substance is contacted and when it is not.
  • Example 1 (Confirmation test of methylation status of Neurofilament 3Jt gene in hepatic cancer cell line
  • Tsao Ontario Cancer Institute and Department of Pathology, University of Toronto
  • a final concentration of 50 U / D1L penicillin, And Keratinocyte-SFM, liquid (Invitrogen) containing streptomycin at a final concentration of 5 Oug / mL ) was used as a medium, and cultured until subconfluent, and about lxlO 7 cells were collected respectively.
  • a 10-fold volume of a SEDTA buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 100 mM NaCl] was added, followed by homogenization.
  • the collected precipitate was dissolved in TE buffer (10 mM Tris, ImM EDTA, pH 8.0), RNase A (Sigma) was added thereto to a concentration of 40 g / ml, and the mixture was incubated at 37 for 1 hour. The incubated mixture was subjected to phenol-chloroform extraction. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added thereto to a concentration of 0.5N, followed by ethanol precipitation to recover a precipitate (genomic DNA). The collected precipitate was rinsed with 70% ethanol to obtain genomic DNA.
  • TE buffer 10 mM Tris, ImM EDTA, pH 8.0
  • RNase A Sigma
  • genomic DNA (about 500 ng) after restriction enzyme treatment was dissolved in distilled water to prepare a genomic DNA solution of 201, to which about 11 of 6M sodium hydroxide was added (to a final concentration of about 0.3 ng). M), the mixture was kept at 37 ° C for 15 minutes.
  • the obtained DNA was converted into type I, and the unmethylated specific primers U1 and U2 shown below, or Perform PCR using methylation specific primers Ml and M2; fc.
  • unmethylation-specific primers U1 and U2 were used, a 164 bp DNA having a base sequence obtained by subjecting a DNA having a base sequence represented by base numbers 423 to 586 of SEQ ID NO: 1 to biisuliite treatment was obtained.
  • the methylation-specific primers Ml and M2 are used, the DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 425 to 585 of SEQ ID NO: 1 has the nucleotide sequence obtained by subjecting the DNA to bisulfite treatment.
  • bp DNA is amplified.
  • the genome was obtained from an immortalized (normal) tubule epithelial cell line (HPDE-4 / E6E7) by a conventional method.
  • DNA DNA
  • NEB methylidase Sssl
  • Methylation-specific PCR and unmethylation-specific PCR were performed on these DNAs 1 and 2 as well.
  • PCR reaction solution 25 ng of type II DNA, 1 ⁇ 1 of each of the above-mentioned primer solutions of 20 pol / ⁇ 1, 2 ⁇ 51 mM of each 2 mM dNTP, 10X buffer (lOOmM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KC1, 2 ( «13 ⁇ 41 ⁇ 2 (: 1 2 ) 2.5 mixed with heat-resistant DM polymerase 5U / 1 0 ⁇ 21), sterile ultrapure water is added to this When the above-mentioned unmethylation-specific primer was used, the reaction solution was incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds. PCR was performed under the conditions of 32 cycles of incubation at 57 ° C.
  • PCR performed In either case, after performing PCR, PCR containing the amplification product The reaction mixture was subjected to 2% agarose gel electrophoresis.
  • Example 2 (Confirmation test of methylation status of Neuro fi 1 anient 3 gene in victory cancer tissue) Tissue derived from human victory cancer tissue and normal victory tissue around it [obtained by obtaining an informed outlet from a patient] ] To each of 12 samples (Casel to Casel 2), add 10 times the volume of SEDTA buffer [10 mM Tris-HC pIK. O) lOmM EDTA (pH 8.0), lOOmM NaCl], and add Homogenized.
  • the collected precipitate was dissolved in TE buffer (10 mM Tris, ImM EDTA, H 8.0), RNase A (Sigma) was added to this at 40 g / ml, and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. Incubated for hours. The incubated mixture was extracted with phenol and black-mouthed form. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added thereto to a concentration of 0.5N, followed by ethanol precipitation to recover a precipitate (genomic DM). Recovered The precipitate was rinsed with 70 ethanol to obtain genomic DNA.
  • TE buffer 10 mM Tris, ImM EDTA, H 8.0
  • RNase A Sigma
  • genomic DNA is digested with a restriction enzyme BamHI, and then Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996, and treated with sodium bisulfite. That is, genomic DNA (about 500 ng) after restriction enzyme treatment was dissolved in distilled water to prepare a 201 genomic DNA solution, and about 11 of 6M sodium hydroxide was added thereto (final concentration). (About 0.3M), the mixture was kept at 37 ° C for 15 minutes.
  • DNA was purified from the inked liquid using a Wizard DNA clean-up system (Proinega). The purified DNA was dissolved in 50 l of TE buffer, sodium hydroxide was added thereto to a final concentration of 0.3 M, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. Then, the precipitate (DNA) was recovered by ethanol precipitation of the left standing mixture. The collected precipitate was suspended in 20 l of TE buffer.
  • PCR was performed using the following unmethylation-specific primers U1 and U2 or the methylation-specific primers Ml and M2.
  • the unmethylation-specific primers U1 and U2 were used, a 164 bp DNA having a base sequence obtained by subjecting a DNA having a base sequence represented by base numbers 423 to 586 of SEQ ID NO: 1 to biisuifite treatment was amplified.
  • the methylation-specific primers Ml and M2 are used, the DNA having the nucleotide sequence obtained by bisulfite-treating DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 425 to 585 of SEQ ID NO: 1 bp DNA is amplified.
  • M2 5'-ACAACGTTCTACCGACCTCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • the specificity of the methylation-specific primer and the methylation-specific primer was determined using the genomic DNA (l) and the immortalized (normal) ⁇ duct epithelial cell line (HPDE-4 / E6E7). A part of this was treated with methylase Sssl (NEB) and confirmed in genomic DNA (2).
  • reaction solution for PCR 25 ng of type II DNA, 1 ⁇ 1 of each of the above-mentioned primer solutions at 20 pmol / 1, 2.5 ⁇ 1 of each 2 mM dNTP, 10 ⁇ buffer solution (100 mM TrN) were used. Is-HCl pH 8.3, 500 mM KC1, 20 mM MgCl 2 ) 2.51 and heat-resistant DNA polymerase 5 U / ⁇ 1 with 0.2 ⁇ 1 are mixed with sterile ultrapure water. A solution having a liquid volume of 25 1 was used.
  • the reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, and then at 57t for 30 seconds.
  • the PCR was performed under the condition that the incubation was performed 32 times per second.
  • the reaction solution is incubated at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 for 30 seconds, then at 66 t for 30 seconds and further at 72.
  • PCR was performed under the condition that 32 cycles of warming were performed with 30 cycles as one cycle. In each case, after performing the PCR, the PCR reaction solution containing the amplification product was subjected to 2% agarose gel electrophoresis.
  • RNA precipitate
  • a human-derived victory cancer cell line (PANC-1) was inoculated at a density of about 6 ⁇ 10 5 cells / 10 cm plate and cultured using a special medium.
  • a methylation inhibitor 5-aza-2'-deoxycytidine manufactured by Sigma
  • 5Aza-dC methylation inhibitor 5-aza-2'-deoxycytidine
  • RNA3 After treating the thus obtained RNA3 with DNasel (Ambion), it was converted into type III, and cDNA was synthesized using Superscriptll (Invitrogen) according to the protocol attached to the enzyme.
  • DNA derived from the mRNA of the Neurofilaments gene was amplified by performing Real Time PCR using the synthesized cDNA as a type I and the following Neurofilament S and Neurofilament 3A as a primer pair.
  • Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was obtained by performing PCR using the above cDNA as type I and the following GAPDH S and GAPDH A as a primer pair.
  • DNA derived from gene mRNA was amplified.
  • Neurofilaments S 5'-GCCACAACCACGACCTC-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • Neurofilaments A 5'-AGTGGCCCAGTGATGCTT-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • GAPDH S 5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • GAPDH A 5'-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • a PCR reaction solution 50 ng of type III cDNA, 1 liter of each of the above two 10 pmol / 1 primer solutions, and 2.5 mM each dNTP and 4 1, and a 5 mM dUTP, a 10XSYBR Gree n PCR Buffer 5 ⁇ 1 , 25mM 3 ⁇ 43 ⁇ 4 1 2 6 Mr thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) a 5 11/1 0.3 1, AmpEraseUNG mixed capital the Then, sterilized ultrapure water was added thereto to make the liquid volume 501.
  • AmpliTaq Gold thermostable DNA polymerase
  • Real Time PCR was performed using iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories). When amplifying DNA derived from the mRNA of the Neurofilaments gene and GAPDH gene, incubate the reaction solution at 95 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 30 seconds, and at 59 ° C for 30 seconds. Real Time PCR was performed for 30 seconds at 72 ° C for 30 seconds, and Neuro ofi 1 amen 13 gene and GAPDH gene were quantified.
  • a method for evaluating the degree of canceration of a specimen derived from a mammal can be provided. Sequence listing free text
  • Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 14
  • Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 15

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Abstract

本発明は．哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ３遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び（２）測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程を有することを特徴とする評価方法等に関する。

Description

明細書
癌化度評価方法
技術分野
本発明は、 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等に関する。 背景技術
癌が遺伝子異常を原因とする疾病であること等が次第に明らかになりつつあるが、 癌患者の死亡率は未だ高く、現在利用可能な診断方法や治療方法等が必ずしも十分に 満足できるものではないことを示している。癌を早期に発見し、発見された癌に対す る有効な治療方法を選択し、 さらに、治療後には癌再発の有無確認等のアフターケア を行うことは、 臨床的に重要である。
そこで、癌を早期に発見するための診断方法、癌に対する治療方法の有効性の評価 、癌再発の有無確認等に適する、遺伝子異常の検出に基づいた哺乳動物由来の検体の 癌化度評価方法の開発が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 かかる状況の下、鋭意検討した結果、癌細胞株及び癌組織検体にお いて Neurof i lament 3遺伝子 （以下、 NEF3遺伝子と記すこともある。 ） が、 不死化正常 細胞株及び正常組織検体と比較して有意に高い頻度でメチル化されていること、そし て、癌細胞株において、 Neurof i laments遺伝子の発現レベルが不死化正常細胞株と比 較して有意に低いことを見出し、 さらに、癌細胞株に D NAメチル化阻害剤を作用さ せることにより、かかる遺伝子の発現レベルを増加させ得ることを見出し、本発明に 至った。
即ち、 本発明は、
1 . 哺孚 L動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
( 1 )哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i laments遺伝子のメチル化頻度又はそれ に相関関係がある指標値を測定する第一工程、 及び
( 2 )測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比 較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程 を有することを特徴とする評価方法 （以下、 本発明評価方法と記すこともある。 ） ；
2 . 哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
3 . 哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする前項 1記載の評価方法； 4. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
( 1 )哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i laments遺伝子のメチル化頻度を測定す る第一工程、 及び
( 2 )測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に 基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
5 . 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌ィ匕度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
6 . 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする前項 4記載の評価方法；
7 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項 1記載の評価方法；
8 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項 4記載の評価方法；
9 . 組織が膳臓組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徴とする前項 8記載 の評価方法；
1 0 . 遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモ一夕一領域、非翻訳領域又は翻 訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の 5' - CG- 3'で示される塩基配列中のシ トシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項 1又は 4記載の評価方法；
1 1 . 組織が勝臓組織であって、 かつ、癌が勝臓癌であることを特徴とする前項 1 0 記載の評価方法；
1 2 .遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモータ一領域にある塩基配列内に 存在する一つ以上の 5' - CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であ ることを特徴とする前項 1又は 4記載の評価方法； 13.遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配 列内に存在する一つ以上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチクレ化頻 度であることを特徴とする前項 1又は 4記載の評価方法；
14.遺伝子のメチル化頻度が、配列番号 1で示される塩基配列内に存在する一つ以 上の 5' -CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴と する前項 1記載の評価方法； .
15. 組織が勝臓組織であって、 かつ、癌が塍臓癌であることを特徴とする fif項 14 記載の評価方法；
16. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1)哺乳動物由来の検体に含まれる Neurofilaments遺伝子のメチル化頻度に相関関 係がある指標値を測定する第一工程、 及び
(2)測定された前記メチルイ匕頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比 するこ とにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
17. Neurofilaments遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、 Neurofila ment3遺伝子の発現産物の量であることを特徴とする前項 16記載の評価方法；
18. Neurofilament 3遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の転写産物の量であるこ とを特徴とする前項 17記載の評価方法；
19. Neurofi lament 3遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の翻訳産物の量であるこ とを特徴とする前項 17記載の評価方法；
20. Neurofilaments遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって
(1) 癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
(2)第一工程 （1)後に、 前記癌細胞に含まれる Neurofilaments遺伝子の猪現産物 量を測定する第二工程、
( 3 )測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき 被験物質が有する Neurofilaments遺伝子の発現を促進する能力を判定する第≡工程 を有することを特徴とする探索方法 （以下、 本発明探索方法と記すこともある。 ） ； 21. 癌細胞が勝臓癌細胞であることを特徴とする前項 20記載の探索方法； 22.有効成分として、前項 20の探索方法により見出された能力を有する物質を含 み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする 抗癌剤： 23. 有効成分として、 Neurof ilament3のアミノ酸配列をコードする塩基配 列を有する核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてな ることを特徴とする抗癌剤；
24. 癌マーカーとしての、 メチル化された Neurofilaments遺伝子の使用；
25. 癌マーカーが勝臓癌マーカ一で ることを特徴とする前項 24記載の使用； 26.癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、 Neurofilaments遺伝子 のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする癌化抑 制方法；
27. 癌が勝臓癌であることを特徴とする前項 26記載の癌化抑制方法； 等を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト由来の不死化 （正常） 管上皮細胞株 （HPDE-4/E6E7及び PDE6-E6E7 c7) 及び膝臓癌細胞株 7種 （BXPc3、 HPAF-II, Capan- 2、 MiaPaCa- 2、 Hs766T、 PANC- 1及 D¾PAC)から調製され、 かつ、亜硫酸水素ナトリゥム処理されたゲノム DNAをそれ ぞれ铸型として PCRを行い、 PCR後の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動で分析した 結果を示した図である。使用した細胞の名前を上部に示した。 なお、 HPDE4/SssIと記 載された図は、 HPDE - 4/E 6E 7のゲノム DNAをメチル化酵素 S s s Iで処理して得られた DNA を示す。 レーン U、 非メチル化特異的プライマーを用いた PCRの PCR反応液； レーン M 、 メチル化特異的プライマ一を用いた PCRの PCR反応液。
図 2は、 ヒト由来の滕臓癌組織及びその周辺の勝臓正常組織 [患者からィンフォー ムドコンセントを得て入手] 各 12検体 （Casel〜Casel 2) から調製され、 かつ、 亜硫酸水素ナトリゥム処理されたゲノム DNAをそれぞれ铸型として PCRを行い、 PCR後 の PCR反応液をァガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した図である。 Casel〜C asel2は、 検体を示した。 Cancerは隧臓癌組織、 Normalはその周辺の塍臓正常組織で ある。 レーン U、 非メチル化特異的プライマーを用いた PCRの PCR反応液；レーン M、 メ チル化特異的プライマーを用いた PCRの PCR反応液。
図 3は、 ヒト由来の勝臓癌細胞株 7種 （BXPc3、 HPAF- II、 Capan- 2、 MiaPaCa-2, H s766T、 PANC- 1及び PAC) 及び不死化 （正常） 脬管上皮細胞株 （HPDE-4/E6E7及び HPD E6-E6E7c7) において Neurofilaments遺伝子の mRNAに由来する DNAを Real Time PCRで 増幅して得られた Neurofilaments遺伝子量を示した図である。使用した細胞の名前を 図の最下部に示した。 縦軸は、 Neurofilaments遺伝子量を GAPDH遺伝子量で除した値 を示す。
図 4は、 不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 （HPDE-4/E6E7) 、 及び、 メチル化阻害剤 である 5Aza- dCを、 0、 0.5 IM又は 1 / Mの濃度で添加したヒト由来の膝臓癌細胞株 (P ANC-1) において、 Neurofilaments遺伝子の mRNAに由来する DNAを Real Time PCRで増 幅して得られた Neurofilaments遺伝子量を示した図である。使用した細胞の名前を図 の最下部に示した。 縦軸は、 Neurofilaments遺伝子量を GAPDH遺伝子量で除した値を 示す。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、 癌マ一力一 （例えば、 睥臓癌マーカ一等） としての、 メチル化された N eurofilament3遺伝子の使用等に関連する発明である。
本発明においてマーカ一遺伝子として用いられる Neurofi lament3遺伝子としては、 例えば、 Neurofilament 3遺伝子の非翻訳領域 （non_coding region) 及び翻訳領域 （ コーディング領域） とその 5 '上流に位置するプロモーター領域とを含むヒト由来の 遺伝子をあげることができる。ヒト由来の Neurofilaments遺伝子の塩基配列とそれに コードされるアミノ酸配列は、例えば、 Genbank Accession Νο·ΝΜ_005382等に記載さ れている。 また、 ヒト由来の Neurofilaments遺伝子の非翻訳領域及び翻訳領域（コー デイング領域） を担うェクソンのうち、 最も 5 ' 上流側に位置するェクソン （以下、 ェクソン 1と記す。 ） と、 その 5 ' 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲ ノム DNAの塩基配列は、 例えば、 Genbank Accession No. AF106564等に記載されて いる。 Genbank Access ion No. AF106564に記載される塩基配列において、 例えば、 ヒ ト由来の Neurof i l aments遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、 塩基番号 28307〜29387 に示されている。本発明において利用される Neurof i l aments遺伝子には、上記の公知 の塩基配列を有する遺伝子のほか、 かかる塩基配列に、 生物の種差、 個体差若しくは 器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加 が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。 哺乳動物では、 遺伝子（ゲノム D NA) を構成する 4種類の塩基のうち、 シ のみがメチル化されるという現象がある。 哺乳動物由来の、 例えば、 Neurof i l ament 3遺伝子では、 当該遺伝子のゲノム D NAの一部のシトシンがメチル化されている。 そして、 D N Aのメチル化修飾は、 5' -CG-3'で示される塩基配列 （Cはシトシンを表 し、 Gはグァニンを表す。 以下、 当該塩基配列を CpGと記すこともある。 ) 中のシ卜シ ンに限られる。 シトシンにおいてメチル化される部位は、その 5位である。細胞分裂 に先立つ D NA複製に際して、 複製直後は铸型鎖の CpG中のシトシンのみがメチル化 された状態となるが、 メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の CpG中のシ卜シ ンもメチル化される。従って、 D NAのメチル化の状態は、 D NA複製後も、 新しい 2組の D N Aにそのまま引き継がれることになる。 本発明評価方法の第一工程において「メチル化頻度」 とは、 例えば、 調査対象とな る CpG中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、 当 該シトシンがメチル化されているハプロイドの割合で表される。
また本発明評価方法の第一工程において「（メチル化頻度） に相関関係がある指標値 」 とは、 例えば、 Neurof i l aments遺伝子の発現産物の量 （より具体的には、 当該遣伝 子の転写産物の量や、 当該遺伝子の翻訳産物の量）等をあげることができる。 このよ うな発現産物の量の場合には、上記メチル化頻度が高くなればそれに伴い減少するよ うな負の相関関係が存在する。 本発明評価方法の第一工程における哺乳動物由来の検体としては、例えば、滕臓癌 細胞等の癌細胞若しくはそれを含む組織、及び、滕臓癌細胞等の癌細胞由来の D N A が含まれる可能性のある、 細胞、 それを含む組織 （ここでの組織とは、 血液、 血漿、 血清、 リンパ液、 塍液等の体液、 リンパ節等を含む広義の意味である。 ) 若しくは体 分泌物 （尿や乳汁等） 等の生体試料をあげることができる。 具体的には、 例えば、 癌 が膊臓癌である場合、被験動物から採取された膝臓組織（滕液を含む）等をあげるこ とができる。
これらの生体試料はそのまま検体として用いてもよく、 また、かかる生体試料から 分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いても よい。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発 明評価方法の利用が期待できる。 本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i lame nt3遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する方法は、 例え ば、 以下のように行えばよい。 第一の方法として、検体由来の D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接 触させた後、該 D NAを铸型とし、解析対象とするシトシンのメチルイ匕の有無を識別 可能なプライマーを用いてポリメラーゼチェイン反応 （以下、 P C Rと記す。 ） を行 い、 得られる増幅産物の量を調べる方法をあげることができる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (脬臓癌細 胞等の癌細胞由来の D N Aが含まれる）を分析すると、血球由来の D N Aを避けて塍 臓癌細胞等の癌細胞由来の D N Aを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後 、該 DNAを铸型として、解析対象とするシ卜シンのメチル化の有無を識別可能なプ ライマーを用いて PCRを行い、得られる増幅産物の量を調べる。解析対象とするシ トシンは、 Neurofilaments遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コ 一ディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列中のシ トシンの中から選ぶことができる。
ここで、 Neurofilaments遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コ 一ディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列として は、 ヒト由来の Neurofilaments遺伝子のェクソン 1と、その 5，上流に位置するプロ モーター領域とが含まれるゲノム DNAの塩基配列をあげることができ、より具 #:的 には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Accession No. AF106564に記載され る塩基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Neurofilame nt3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 614〜1694に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシンは、 例えば 、 11萃臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高メチル化状態 （hyper methylation) ) を示す。 さらに具体的には、 腾臓癌細胞においてメチル化頻度が高 ぃシトシンとしては、 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列において、 塩基番号 4 28、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 5 44、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあげることができる。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 (bisulfite) 等を用いることができる。 因みに、 原理的には、 メチリレイ匕 シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シ卜シンを修飾する試薬と抽出された DNAとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （pH9〜14) で変性した後、 亜硫酸水素ナトリウム 等の重亜硫酸塩 (bisulfite) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時 間 （一晩） 程度、 55でで処理する。 反応を促進するため、 95°Cでの変性と、 50°Cでの 反応を 10- 20回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチル化されていないシトシンは ゥラシルに変換され、 一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シトシンのままである。
次いで、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを禁型とし、 かつ、 メチル化されたシトシ ンが含まれる場合の塩基配列 [メチルイ匕される位置のシトシン （CpG中のシトシン） はシトシンのままであり、 メチル化されてレ ないシトシン （CpGに含まれないシトシ ン）はゥラシルとなった塩基配列] とかかる 基配列に対して相補的な塩基配列から それぞれ選ばれる一対のメチル化特異的プライマーを用いる PCR (以下、 メチル化特 異的 P C Rとも記すこともある。 ） と、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを铸型とし、 かつ、 シトシンがメチル化されていない場^の塩基配列（全てのシトシンがゥラシル となつた塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれ る一対の非メチルイ匕特異的プライマーを用いる PCR (以下、 非メチル化特異的 P C R とも記すこともある。 ） とを行う。
上記 PCRにおいて、 メチル化特異的プライマーを用いる PCRの場合 （前者） には、 解 析対象とするシトシンがメチルイ匕されている DNAが増幅され、 一方、 非メチル化特異 的プライマーを用いる PCRの場合 （後者） に ま、 解析対象とするシトシンがメチル化 されていない DNAが増幅される。 これらの増幅産物の量を比較することにより、 対象 となるシトシンのメチル化の有無を調べる。 このようにしてメチル化頻度を測定する ことができる。 ここで、プライマーとしては、メチル化を受けていないシトシンがゥラシルに変換 され、かつ、 メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換されないことを考慮し て、 メチル化を受けているシトシンを含む塩基配列に特異的な PCRプライマー （メチ ル化特異的プライマー） を設計し、 また、 メチル化を受けていないシトシンを含む塩 基配列に特異的な PCRプライマー （非メチルイ匕特異的プライマー） を設計する。 重亜 硫酸塩処理により化学的に変換され相補的ではなくなつた D N Α鎖を基に設計する ことから、元来二本鎖であった D NAのそれぞれの鎖を基に、それぞれからメチル化 特異的プライマ一と非メチル化特異的ブラ fマーとを作製することもできる。かかる -は、 メチル、 非メチルの特異性を高めるために、 プライマーの 3'末端近傍 に CpG中のシトシンを含むように設計することが好ましい。 また、 解析を容易にする ために、 プライマーの一方を標識してもよい。 より具体的には、 Neur 0 f U amen 13遺伝子のメチル化頻度をメチル化特異的 P C Rで 測定するためのプライマーは、 例えば、 Neuroi i lament3遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領域） にある塩基配列内に存在する CpG中の シトシンを 1以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる 。 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpG中のシトシン、 具体的に は、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 47 5、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 58 0等で示されるシトシンを 1以上含む塩基配列を基に設計することができる。 かかる プライマーの例を以下に示す。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TGGAGTGGGTGTTGAATTATT-3' (配列番号 2 )
U2： 5' -CACAACATTCTACCAACCTCA-3' (配列番号 3 )
<メチル化特異的プライマー >
Ml： 5' -GAGCGGGCGTTGAATTATC-3' (配列番号 4 )
M2： 5' -ACAACGTTCTACCGACCTCG-3' (配列番号 5 ) メチル化特異的 PCRにおける反応液としては、 例えば、 铸型とする DNAを 50ngと、 1 Opmol/ lの各プライマー溶液を各 1 ^ 1と、 2. 5mM dNTPを 4^ 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tr is-HCl pH8. 3、 500mM KCK 20mM MgCl2)を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラ一ゼ 5U/ / 1を0. 2 1とを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反応液をあげ ることができる。
反応条件としては、 例えば、 前記のような反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 9 5°Cにて 30秒間次いで 55〜65°Cにて 30秒間さらに 72 にて 30秒間を 1サイクルとする 保温を 30〜40サイクル行う条件があげられる。 かかる PCRを行った後、 得られた増幅産物の量を比較する。 例えば、 メチル化特異 的プライマーを用いた P C Rと非メチル化特異的プライマ一を用いた P C Rで得ら れた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法（変性ポリアクリルアミド ゲル電気泳動ゃァガロースゲル電気泳動）である場合には、電気泳動後のゲルを D N A染色して増幅産物のバンドを検出し、検出されたバンドの濃度を比較する。 ここで D N A染色の代わりに予め標識されたプライマ一を使用してその標識を指標として バンドの濃度を比較することもできる。 また、 定量を必要とする場合には、 PCR反応 産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、例え ば、遺伝子量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が 可能な PCR法であるリアルタイム PCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することも できる。 リアルタイム PCRを行う方法としては、 例えば铸型依存性核酸ポリメラーゼ プローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のイン夕一カレータ一 を用いる方法等が挙げられる。 リアルタイム PCR法のための装置及び試薬としては、 市販の装置及び試薬キットを利用することができる。 このような方法は、 一般にメチル化特異的 P C Rとも呼ばれ、 Hermanら（Herman e t al .， Proc. Nat l . Acad. Sci USA, 93， 9821-9826, 1996)等により報告されてい る方法であって、シトシンと 5-メチルシトシンとの化学的性質の違いを利用する方法 である。 第二の方法として、検体由来の D NAを非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触 させた後、該 D NAを铸型として解析対象とするシトシンを含む D NAを P C Rで増 幅し、 得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する方法をあげることができる。 まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (勝臓癌細 胞等の癌細胞由来の D NAが含まれる）を分析すると、血球由来の D NAを避けて滕 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D N Aを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後 、該 D NAを铸型として、 Neurof i laments遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又 は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される 塩基配列中のシトシンを含む塩基配列を基にして後述するように設計されるプライ マーを用いて P C Rを行うことにより、解析対象とするシトシンを含む D N Aを増幅 し、 得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する。
ここで、 Neurof i l aments遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コ 一ディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列として は、 ヒト由来の Neurof i laments遺伝子のェクソン 1と、その 5 '上流に位置するプロ モーター領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、より具体的 には、 配列番号 1で示される塩基配列 (Genbank Access i on No. AF106564に記載され る塩基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Neurof i l ame nt3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 614〜1694に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ 配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密に存在する領域中に存在する CpG中 のシトシンは、 例えば、塍臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、 高 メチル化状態 (hyperiethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌細胞におい てメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される塩基配列に おいて、 塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514 、 519、 532, 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあげるこ とができる。 当該 P C Rに用いられるプライマ一としては、解析対象とするシトシンの 5 '上流 の塩基配列と 3 '下流の塩基配列を基にして当該シトシンを含む塩基配列を有する D N Aを増幅可能なプライマー対を設計するとよい。プライマー設計のための塩基配列 は、 解析対象とする CpG中のシトシンを含まないように選定する。 そして、 プライマ 一設計のために選定された塩基配列が、 シトシンを全く含まない場合には、選定され た塩基配列及びかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれそのままブラ イマ一の塩基配列とすることができる。また、プライマ一設計のために選定された塩 基配列が解析対象以外のシトシンを含むが当該シトシンは CpG中のシトシンでない場 合には、これらシトシンがゥラシルに変換されることを考慮してプライマ一を設計す る。即ち、全てのシトシンがゥラシルとなった塩基配列とかかる塩基配列に対して相 補的な塩基配列をそれぞれ有する一対のプライマーを設計する。さらに、 プライマー 設計のために選定された塩基配列が解析対象以外のシトシンを含み当該シトシンは C PG中のシトシンである場合には、メチル化を受けていないシトシンがゥラシルに変換 され、かつ、 メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変換されないことを考慮し てプライマーを設計する。即ち、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列 [メチル化される位置のシトシン （CpG中のシトシン） はシトシンのままであり、 メ チル化されていないシトシン （CpGに含まれないシトシン） はゥラシルとなった塩基 配列]とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選定された一対のメ チル化特異的プライマーと、 シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全て のシトシンがゥラシルとなつた塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配 列をそれぞれ有する一対の非メチル化特異的プライマーとを設計する。 この場合、上 記の P C Rには、メチル化特異的プライマー対と非メチル化特異的プライマー対とを 等量ずつ混合して用いる。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 (bisul f i te) 等を用いることができる。 因みに、 原理的には、 メチル化 シトシンのみを修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シ卜シンを修飾する試薬に抽出された D NAを接触させるには、例えば 、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （pH9〜14) 中で亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸 塩 (bisul f i te) (溶液中の濃度：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時間 （一晩） 程 度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95°Cでの変性と、 50°Cでの反応を 10-20 回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチルイ匕されていないシトシンはゥラシルに変 換され、 一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シトシンのま まである。
次いで、 重亜硫酸塩等で処理された DNAを録型とし、 かつ、 上述するように設計さ れるプライマ一を用いる PCRを行う。 得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較 からメチル化頻度を測定することができる。 より具体的には、 Neurof i lament 3遺伝子のメチル化頻度を塩基配列の直接的解析で 測定するためのプライマーは、 例えば、 Neurof i l aments遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域 （コーディング領驟） にある塩基配列内に存在する CpG中の シトシンを 1以上含む塩基配列を基にして、 _L記のようにして設計することができる 。 例えば、 配列番号 1で示される塩基配列^に存在する CpG中のシトシン、 具体的に は、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 408、 421、 428、 432、 443、 45 1、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 56 6、 572、 580、 596等で示される 1以上のシトシンを解析対象として設計することがで きる。例えば、 以下に示すプライマ一 B 1及び B 2を用いると、 配列番号 1の塩基番 号 378〜623で示される塩基配列を有する D NT Aの bi sul f i te処理後の塩基配列を有す る D NA (246bp) が増幅される。 該プライマー対は、 配列番号 1で示される塩基配 列において塩基番号 408、 421、 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 50 3、 506、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580、 596で示されるシト , シンのメチル化頻度を調べるためのプライ 一として用いることができる。
<プライマー >
B1： 5' -GTTTAGGGTAGAAAAGTTTAGGT-3' (g己列番号 6 )
B2： 5 ' -TATAACTCATCTTAAAAACCTTAAAA-3 ' (酉己列番号 7 )
PCRにおける反応液としては、例えば、铸型とする DNAを 25ngと、 20pmol/ 1の各プ ライマ一溶液を各 l lと、 2mM dNTPを 3 ^ 1と、 10 X緩衝液（lOOmM Tr is-HCl H 8. 3 、 500mM KC1、 15mM MgCl2 )を 2. 5 1と、耐熱性 DNAポリメラ一ゼ 5U/ 1を 0. 2 ^ 1とを 混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1とした反応液をあげることができる 。 反応条件としては、 例えば、 前記のような反応液を、 95 にて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次いで 57°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保 温を 30〜40サイクル行う条件があげられる。
かかる PCRを行つた後、 得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル 化頻度を測定する。
即ち、当該増幅産物の塩基配列を直接的に解析することにより、解析対象とするシ トシンに相当する位置の塩基がシトシンであるかチミン（ゥラシル）であるかを判定 する。得られた増幅産物における塩基を示すピークのチャートにおいて、解析対象と するシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミン（ゥ ラシル）を示すピークの面積とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメ チル化の頻度を測定することができる。また、塩基配列を直接的に解析する方法とし て、 P C Rで得られた増幅産物を一旦大腸菌等を宿主としてクローニングして得られ た複数のクローンから、それぞれクローニングされた D N Aを調製し、当該 D NAの 塩基配列を解析してもよい。解析される試料のうちの解析対象とするシトシンに相当 する位置に検出された塩基がシトシンである試料の割合を求めることにより、解析対 象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することもできる。 第三の方法として、検体由来の D N Aを非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触 させた後、該 D NAと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプロ 一ブとをハイブリダィゼーションさせ、プローブの結合の有無を調べる方法をあげる こともできる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (塍臓癌細 胞等の癌細胞由来の D NAが含まれる）を分析すると、血球由来の D NAを避けて塍 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、塍臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出された D NAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後 、該 D NAと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとを ハイプリダイゼーションさせ、 前記 D N Aと当該プローブとの結合の有無を調べる。 解析対象とするシトシンは、 Neurof i laments遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域 又は翻訳領域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示され る塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、 Neurof i l aments遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コ 一ディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列として は、 ヒト由来の Neurof i l aments遺伝子のェクソン 1と、 その 5 '上流に位置するプロ モーター領域とが含まれるゲノム D N Aの塩基配列をあげることができ、より具体的 には、 配列番号 1で示される塩基配列 （Genbank Acce ss i on No. AF106564に記載され る塩基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配冽の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Neurof i l ame nt3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 614〜1 694に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ 配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密に存在する領域中に存在する CpG中 のシトシンは、 例えば、 勝臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高 メチル化状態 （hypermethyl at i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌細胞におい てメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される塩基配列に おいて、 塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514 、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあげるこ とができる。 当該ハイブリダィゼ一シヨンに用いられるプローブ ま、解析対象とするシトシンを 含む塩基配列を基にして、 メチル化を受けていないシ トシンがゥラシルに変換され、 かつ、メチル化を受けているシトシンはゥラシルに変渙されないことを考慮して設計 するとよい。
即ち、 メチル化されたシトシンが含まれる場 の塩基配列 [メチル化される位置のシ トシン （CpG中のシトシン） はシトシンのまま あり、 メチル化されていないシトシ ン （CpGに含まれないシトシン） はゥラシルと った塩基配列] 又はかかる塩基配列 に対して相補的な塩基配列を有するメチル化待異的プローブと、シトシンがメチル化 されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがゥラシルとなった塩基配列）又はか かる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する非メチル化特異的プローブを設計 する。 尚、 このようなプローブは、 D NAとプローブとの結合の有無についての解析 を容易にするために標識してから用いてもよ!^。またプローブを通常の方法に準じて 担体上に固定して用いてもよいが、 この場合には、哺乳動物由来の検体から抽出され た D NAを予め標識しておくとよい。 非メチル化シトシンを修飾する試薬としてほ、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の 重亜硫酸塩 (bisul f i te) 等を用いることがで る。 因みに、 原理的には、 メチル化 シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。 非メチル化シトシンを修飾する試薬と抽出された D N Aとを接触させるには、例え ば、 まず当該 DNAをアルカリ溶液 （pH9〜14) で変性した後、 亜硫酸水素ナトリウム 等の重亜硫酸塩 (bisul f i te) (溶液中の濃度 ：例えば、 終濃度 3M) 等で約 10〜16時 間 （一晩） 程度、 55°Cで処理する。 反応を促進するため、 95ででの変性と、 50 での 反応を 10-20回繰り返すことも出来る。 この場合、 メチル化されていないシトシンは ゥラシルに変換され、 一方、 メチル化されているシトシンはゥラシルに変換されず、 シ卜シンのままである。
必要に応じて、重亜硫酸塩等で処理された D W Aを铸型として第二の方法と同様に P C Rを行うことにより当該 D NAを予め増幢させておいてもよい。
次いで、重亜硫酸塩等で処理された D NA又は前記 P C Rで予め増幅された D N A と、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプロ一ブとのハイプリダ ィゼーシヨンを行う。メチル化特異的プローブと結合する D NAの量と、非メチル化 特異的プローブと結合する DNAの量とを比較することにより、解析対象となるシト シンのメチル化の頻度を測定することができる。 より具体的には、 eurofil amen 13遺伝子のメチル化頻度を測定するためのプローブ は、 例えば、 Neurofilaments遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（ コーディング領域） にある塩基配列内に存在する CpG中のシトシンを 1以上含む塩基 配列を基にして、 上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号 1で示 される塩基配列中に存在する CpG中のシトシン、 具体的には、 配列番号 1で示される 塩基配列において塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 5 06、 514、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンを 1 以上含む塩基配列を基に設計することができる。 かかるプローブの例を以下に示す。 <セッ卜 1>
非メチル化特異的プローブ： 5' -TATGTGGAGTGGGTGTTGAATTATTG-3' (配列番号 8 ) メチル化特異的プロ一ブ ： 5 ' -TACGTGGAGCGGGCGTTGAATTATCG -3 ' (配列番号 9 ) <セット 2>
非メチル化特異的プロ一ブ： 5' - TGTGGTGAGGTTGGTAGAATGTTG- 3' (配列番号 10) メチル化特異的プローブ ： 5 ' -TGCGGCGAGGTCGGTAGAACGTTG -3 ' (配列番号 11 ) ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 Sambrook J., Frisch E. F. , Maniatis T. 著、 モレキュラークローニング第 2版（Molecular Cloning 2nd edition) 、 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行 （Cold Spring Harbor Laboratory pre ss)等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。ハイブリダィゼーシヨン は、通常ストリンジエンドな条件下に行われる。 ここで「ストリンジェントな条件下 」 とは、 例えば、 6 XSSC (1. 5M NaCK 0. 15M クェン酸三ナトリウムを含 む溶液を 10 XSSCとする） を含む溶液中で 45°Cにてハイプリッドを形成させた後 、 2XSSCで 50 にて洗浄するような条件 （Molecular Biology, John Wiley & Son s， N. Y. (1989)， 6.3.卜 6.3.6)等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩 濃度は、 例えば、 2 XSSCで 50 °Cの条件 （低ストリンジエンシーな条件） から 0. 2 X SSCで 5 0 °Cまでの条件 （高ストリンジエンシーな条件） から選択することがで きる。 洗浄ステップにおける温度は、 例えば、 室温 （低ストリンジエンシーな条件） から 6 5 （高ストリンジエンシーな条件）から選択することができる。 また、塩濃 度と温度との両方を変えることもできる。
かかるハイブリダィゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合した D N Aの量と、非メチル化特異的プローブと結合した D N Aの量とを比較することによ り、解析対象となるシトシン（即ち、 プローブの設計の基となった塩基配列に含まれ る CpG中のシトシン） のメチル化の頻度を測定することができる。 第四の方法として、検体由来の D N Aに、解析対象とするシトシンのメチル化の有 無を識別可能な制限酵素を作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる方 法をあげることもできる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販の D NA抽出用キット等を用いて D N Aを抽出する。
血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調 製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離 D NA (滕臓癌細 胞等の癌細胞由来の D N Aが含まれる）を分析すると、血球由来の D N Aを避けて塍 臓癌細胞等の癌細胞由来の D NAを解析することができ、勝臓癌細胞等の癌細胞、そ れを含む組織等を検出する感度を向上させること力できる。
次いで、抽出された D N Aに、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可 能な制限酵素を作用させた後、 当該制限酵素による消化の有無を調べる。解析対象と するシトシンは、 Neurof i laments遺伝子のプロモータ一領域、非翻訳領域又は翻訳領 域 （コーディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列 中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、 Neurof i laments遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻訳領域（コ 一ディング領域） の塩基配列中に存在する一つ以上の CpGで示される塩基配列として は、 ヒト由来の Neurof i laments遺伝子のェクソン 1と、 その 5 ' 上流に位置するプロ モータ一領域とが含まれるゲノム D NAの塩基配列をあげることができ、より具体的 には、 配列番号 1で示される塩基配列 (Genbank Access ion No. AF106564に記載され る塩基配列の塩基番号 28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。 ） があげられる。 配列番号 1で示される塩基配列においては、 ヒト由来の Neurof i l ame nt3遺伝子のェクソン 1の塩基配列は、塩基番号 614〜1694に示されている。配列番号 1で示される塩基配列中に存在する CpGで示される塩基配列中のシトシン、 とりわけ 配列番号 1で示される塩基配列において CpGが密に存在する領域中に存在する CpG中 のシトシンは、 例えば、 降臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度 （即ち、 高 メチル化状態 (hypermet ylat i on) ) を示す。 さらに具体的には、 勝臓癌細胞におい てメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号 1で示される塩基配列に おいて、 塩基番号 428、 432、 443、 451、 471、 475、 482、 491、 499、 503、 506、 514 、 519、 532、 541、 544、 546、 563、 566、 572、 580等で示されるシトシンをあげるこ とができる。 当該方法で用いられる「シトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素」 （以下 、 メチル化感受性制限酵素と記すこともある。 ） とは、 メチル化されたシトシンを含 む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化するこ とのできる制限酵素を意味する。認識配列に含まれるシトシンがメチル化されている DNAの場合、 メチル化感受性制限酵素を作用させても当該 DNAは切断されず、一方、認 識配列に含まれるシトシンがメチル化されていない DNAの場合、 メチル化感受性制限 酵素を作用させれば当該 DNAは切断される。 メチル化感受性酵素の具体的な例として は、 例えば、 HpaI I、 Bs tUI、 Nar l、 Sac I I等をあげることができる。 当該制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、例えば、解析対象とするシ トシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させた D N Aを铸型とし、解 析対象とするシトシンが含まれる認識配列を含み、当該認識配列以外には前記制限酵 素の認識配列を含まない D N Aを増幅可能なプライマー対を用いて P C Rを行い、 D NAの増幅（増幅産物） の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とする シトシンがメチル化されている場合には、 増幅産物が得られる。一方、解析対象とす るシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。 このようにし て、増幅された D NAの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル 化の頻度を測定することができる。 定量を必要とする場合には、 PCR反応産物をリア ルタイムでモニタリングし力イネティックス分析を行うことにより、例えば、遺伝子 量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量が可能な PCR 法であるリアルタイム： PCRを用いて、 それぞれの産物の量を比較することもできる。 リアルタイム： PCRを行う方法としては、 例えば铸型依存性核酸ポリメラーゼプローブ 等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターカレー夕一を用いる 方法等が挙げられる。 リアルタイム PCR法のための装置及び試薬としては、 市販の装 置及び試薬キット等を利用することができる。
例えば、 配列番号 1で示される塩基配列において塩基番号 544、 546、 737、 739、 1 702、 1704で示されるシトシンの場合には、当該シトシンは Sac I Iの認識配列に含まれ ており、 上記方法により当該シトシンのメチル化頻度を測定することができる。 また、 当該制限酵素による消化の有無を調べる他の方法としては、例えば、解析対 象とするシトシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させた D N Aに 対して、 Neurof i l aments遺伝子に由来し、 かつ、 当該制限酵素の認識配列を含まない D NAをプローブとしたサザンハイブリダイゼ一シヨンを行い、八イブリダイズした D N Aの長さを調べる方法をあげることもできる。解析対象とするシトシンがメチル 化されている場合には、当該シトシンがメチル化されていない場合よりも長い D N A が検出される。検出された長い D NAの量と短い D NAの量とを比較することにより 、 解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。 以上のような各種方法を用いて、 哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i l ament3 遺伝子のメチル化頻度を測定する。測定されたメチル化頻度と、例えば、勝臓癌細胞 等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i l ament3遺伝子のメチル化頻度 （対照） とを比較して、 当該比較により得られる差異 に基づき前記検体の癌化度を判定する。 例えば、 哺乳動物由来の検体に含まれる Neu rof i l ament 3遺伝子のメチル化頻度が対照と I：匕較して高ければ （Neur o f i 1 ament 3遺伝 子が対照と比較の上で高メチル化状態であれぱ）、 当該検体の癌化度が対照と比較の 上で高いと判定することができる。
ここで 「癌化度」 とは、 一般に当該分野において使甩される意味と同様であって、 具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を 意味し、 また、例えば、哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における 癌細胞の存在量等を意味している。
Neurof i laments遺伝子の発現は、健常な哺轧動物由来の細胞や組織等の検体におい てよりも塍臓癌細胞等の癌細胞において低い。 これは、塍臓癌細胞等の癌細胞におい て当該遺伝子のメチル化頻度が高いために、当該遺伝子が正常に発現できずその結果 として当該遺伝子の発現産物の量 （より具体白勺には、 転写産物の量や翻訳産物の量） が減少する。 このように本発明評価方法等で W：、 メチル化頻度の代わりに、それに相 関関係がある指標値（上記の場合には、発現産物の量であって、 負の相関関係がある 指標値である。 ） を測定してもよい。
つまり、本発明評価方法では、哺乳動物由 ¾の検体に含まれる Neurof i laments遺伝 子のメチル化頻度に相関関係がある指標値 （例えば、 発現産物の量） を測定し、 測定 された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値（例えば、 発現産物の量） と対照と を比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定することがで きる。 本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i lame nt3遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある旨標値を測定する方法としては、 例えば . Neurof i lament 3遺伝子の転写産物である mMAの量を測定する方法をあげることがで きる。 当該測定には、 例えば、 RT—PCR法、 /ザンブロット法 [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) 〕 、 in s i tu RT— PCR法 [Nucleic Acids R es. , 21, 3159-3166 (1993) 〕 、 in s i tuハイブリダィゼ一シヨン法、 NASBA法 [Nuc l eic acid sequence-based ampl i f icat ion, nature, 350, 91 -92 (1991)〕等の公知な 方法を用いればよい。
哺乳動物由来の検体に含まれる Neur 0 f i 1 amen 13遺伝子の転写産物である mRNAを含 む試料は、 通常の方法に準じて当該検体から抽出、 精製等により調製すればよい。 調製された試料中に含まれる mRNAの量を測定するためにノザンブロット法が用い られる場合には、 検出用プローブは Neurof i l aments遺伝子又はその一部 （Neurof i l a Dient3遺伝子の制限酵素切断、 Neurof i l ameiit3遺伝子の塩基配列に基づき化学合成さ れた約 lOObp〜約 lOOObp程度のオリゴヌクレオチド等） を含むものであればよく、 前 記試料中に含まれる mRNAとのハイブリダィゼーシヨンにおいて用いられる検出条件 下に検出可能な特異性を与えるものであれば特に制限はない。
また調製された試料中に含まれる mRNAの量を測定するために RT—PCR法が用いられ る場合には、使用されるプライマ一は、 Neurof i l aments遺伝子のみを特異的に増幅で きるものであればよく、その増幅する領域や塩基長等には特に制限はない。かかるプ ライマーとしては、 例えば、 以下に示すプライマー （S : sense、 A: ant i sense) 等をあ げることができる。 これらのプライマーを用いて後述の実施例に示すようにして RT- PCR法による転写産物の量を測定することもできる。 定量を必要とする場合には、 PC R反応産物をリアルタイムでモニタリングし力イネティックス分析を行うことにより 、例えば、遺伝子量に関して 2倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の 定量が可能な PCR法であるリアルタイム PCRを用いて、それぞれの産物の量を比較する こともできる。 リアルタイム PCRを行う方法としては、 例えば铸型依存性核酸ポリメ ラーゼプローブ等のプローブを用いる方法又はサイバーグリーン等のインターカレ 一ターを用いる方法等が挙げられる。 リアルタイム PCR法のための装置及び試藥とし ては、 市販の装置及び試薬キッ卜等を利用することができる。
S： 5' -GCCACAACCACGACCTC-3 ' (配列番号 12)
A: 5' -AGTGGCCCAGTGATGCTT-3' (配列番号 13) また本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i l ament3遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する他の方法としては 、例えば、 Neurof i l aments遺伝子の翻訳産物である Neurof i l amentsタンパク質の量を 測定する方法をあげることができる。 当該測定にま、例えば、 Neurof i l amentsタンパ ク質に対する特異的抗体 （モノクロナル抗体、 ポリクロナル抗体） を用いた、 細胞ェ 学ハンドブック、 羊土社、 207 (1992)等に記載されるィムノブロット法、 免疫沈降に よる分離法、 間接競合阻害法 （ELISA法） 等の公知な方法を用いればよい。
因みに、 Neurof i lamentsタンパク質に対する特異的抗体は、当該タンパク質を免疫 抗原として用いる通常の免疫学的な方法に準じて製造することができる。 以上のような各種方法を用いて、 哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i laments 遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を测定する。測定されたメチルイ匕頻度 に相関関係がある指標値と、例えば、塍臓癌細胞筝の癌細胞を持たないと診断され得 る健常な哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i laments遺伝子のメチル化頻度に相 関関係がある指標値（対照） とを比較して、 当該 I：匕較により得られる差異に基づき前 記検体の癌化度を判定する。 仮に、 哺乳動物由来の検体に含まれる Neurof i laments 遺伝子のメチル化頻度に正の相関関係がある指標値が対照と比較して高ければ又は 負の相関関係がある指標値が対照と比較して低ければ (Neurof i l aments遺伝子が対照 • と比較の上で髙メチル化状態であれば）、当該検 ίおの癌ィヒ度が対照と比較の上で高い と判定することができる。 本発明評価方法における、 Neurof i 1 anient 3遺伝チのメチル化頻度又はそれに相関関 係がある指標値を測定するための各種方法で使用乙得るプライマー、プローブ又は特 異的抗体は、勝臓癌細胞等の癌細胞の検出用キットの試薬として有用である。本発明 は、 これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等を試薬として含有する滕臓癌細胞 等の癌細胞の検出用キットや、 これらプライマー、 プローブ又は特異的抗体等が担体 上に固定化されてなる脬臓癌細胞等の癌細胞の検 ttl用チップも提供しており、本発明 評価方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理 £利用してなる前記のような検出用 キットゃ検出用チップのような形態での使用も含 ものである。
Neurof i laments遺伝子の発現は、健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体におい てよりも塍臓癌細胞等の癌細胞において低い。 一方、 後述の実施例でも示すように、 Neurofilaments遺伝子に係る DN Aメチル化を阻害する物質を塍臓癌細胞等の癌細 胞に作用させることにより、 当該遺伝子の発現産物の量を増加させることができる。 これは、塍臓癌細胞等の癌細胞における Neurofilaments遺伝子の発現レベルの低下又 はそれに伴う機能低下を補うことのできる物質—例えば、 非メチル化（又は、癌で認 められるようなメチル化異常を起こしていない） Neurofi lament 3遺伝子、当該遺伝子 の発現産物、 当該遺伝子の発現を促進する能力を有する物質 （例えば、 Neurofilame n 13遺伝子に係る D N Aメチル化を阻害する物質、 Neur 0 f i 1 amen 13遺伝子のメチルイ匕 頻度を低下させる物質） —等は、 S萃臓癌等の癌の治療や、塍臓等正常組織の癌化抑制 に有用であることを意味している。
例えば、 Neurofilaments遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を癌であると診断 されうる哺乳動物の体内にある細胞に投与することにより癌化は抑制されるだろう。 また例えば、 Neurofilaments遺伝子に係る DN Aメチル化を阻害する物質を滕臓癌細 胞等の癌細胞に提供することにより、 Neurofil amen 13遺伝子のプロモー夕一領域又は コーディング領域にある塩基配列中に存在する CpG中のシトシンを正常組織と同様に 低メチル化状態 Oiypomethylation) とし、 Neurofilaments遺伝子の転写産物である m RNAの発現量を増大させ、 ひいては Neurofi lament 3遺伝子の翻訳産物である Neurofi 1 ament3タンパク質の発現量を増大させることができるだろう。 また例えば、 Neurofi 1 amen 13遺伝子又は Neur 0 f i 1 amen 13夕ンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列 からなる cDNAを勝臓癌細胞等の癌細胞に導入することにより、勝臓癌細胞等の癌細胞 における Neurofilamentsタンパク質の発現量を増大させることができるだろう。 つまり、 本発明では、 （1)有効成分として、 Neurofilaments遺伝子の発現を促進 する能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化さ れてなることを特徴とする抗癌剤や、 （2)有効成分として、 Neurofilamentsのアミ ノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容さ れる担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤も提供している（以下総じて 、 本発明抗癌剤と記すこともある。 ） 。 本発明抗癌剤の剤型としては通常の製剤であれば特に制限はないが、このような製 剤は、 薬学的に許容される、 例えば、 水溶性溶剤、 非水溶性溶剤、 緩衝剤、 溶解補助 剤、等張剤、安定剤等の担体に有効成分を配合することにより製造することができる 。 必要に応じて、 防腐剤、 懸濁化剤、 乳化剤等の補助剤を添加してもよい。 また、 非 経口的に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。 ) には、 当該抗癌剤を溶液等 の通常の液剤の形態で使用することができる。
本発明抗癌剤は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物（例えば、癌であると 診断されうる哺乳動物の体内にある細胞） に対し投与することができる。例えば、 非 経口的に投与する方法としては、 例えば、 注射（皮下、 静脈内、 局所） 等を挙げるこ とができる。
投与量は、 投与される哺乳動物の年令、 性別、 体重、 疾患の程度、 本発明抗癌剤の 種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において有効成分が細胞内で 有効に働くような濃度レベルと等しい細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与す ればよい。また、前記の 1日の投与量を 1回又は数回に分けて投与することができる'
ここで、 Neurof i lamentsのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を細胞 に導入する方法としては、ウィルスベクターを利用した遺伝子導入方法、非ウィルス 性べクタ一を利用した遺伝子導入方法（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20- 45頁、実験 医学増刊， 12 (15) (1994)、 実験医学別冊 「遺伝子治療の基礎技術」 ，羊土社 (1996) ) 等の方法をあげることができる。
前者の遣伝子導入方法としては、 例えば、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデ ノ関連ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニアウィルス、 ボックスウィルス、 ポリ ォウィルス、シンビスウィルス等の D N Aウィルス又は R N Aウィルスに、 T R 4又 は変異 T R 4をコードする D NAを組み込んで導入する方法等があげられる。また非 ウィルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法としては、例えば、発現プラスミドを 直接筋肉内に投与する方法 （D NAワクチン法） 、 リボソーム法、 リポフエクチン法 、 マイクロインジェクション法、 リン酸カルシウム法、 エレクト口ポレーシヨン法等 があげられる。
また、 Neur 0 Π 1 amen 13のァミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を坊癌剤 としての遺伝子治療剤の有効成分として利用する方法としては、当該核酸を直接体内 に導入する in vivo法、 ヒトから特定な細胞を！ ¾り出し体外で当該核酸を当該細胞に 導入し、 その細胞を体内に戻す ex vivo法 （日經サイエンス， 1994年 4月号， 20- 45頁、 月刊薬事， 36 (1)， 23-48 (1994) 、 実験医学増刊， 12 (15) (1994) ) 等をあげることがで さる。
前者の in vivo法の場合には、 Neurof i lamentsのアミノ酸配列をコードする塩基配 列を有する核酸が疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば 、 勝臓癌細胞、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉 f¾等に注射により投与することができ る。
前記抗癌剤としての遺伝子治療剤の剤型としては、注射剤、 他には懸濁剤、凍結剤 、 遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤とすることもできる。 このような製剤は、 薬学的に許容される、 例えば、 水溶性溶剤、 非水溶性溶剤、 緩衝剤、 溶解補助剤、 等 張剤、安定剤等の担体に前記遺伝子（ベクター型もしくはウィルス型、 又はプラスミ ド型の前記遺伝子の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要 に応じて、 防腐剤、 懸濁化剤、 乳化剤等の補助剤を添加してもよい。 また、 非経口的 に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。 ） には、 当該抗癌剤を溶液等の通常 の液剤の形態で使用することができる。 本発明探索方法は、 Neurof i laments遺伝子の ¾現を促進する能力を有する物質の探 索方法であって、 ( 1 ) 癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、 （2 ) 第一工程 （ 1 )後に、前記癌細胞に含まれる Neurof i laments遺伝子の発現産物量を測定する第二 工程、 （3 )測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に 基づき被験物質が有する Neurof i laments遺伝子の発現を促進する能力を判定する第 三工程を有する。
本発明探索方法の第一工程における癌細胞としては、特に制限はなく、哺乳動物由 来の癌組織から分離された癌細胞であってもよいし、またセルラインとして確立され た哺乳動物由来の癌細胞株であってもよい。 前記哺乳動物としては、 例えば、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 ハムスター等をあげることができる。癌の種別としては、 塍 臓癌等が好ましくあげられる。 具体的には、 例えば、 BXPc3、 HPAF- I I、 Capan-2, Mi aPaCa-2, Hs766T、 PANC - 1、 HPAC (全て ATCCから入手可能） 等の公知なヒト由来の滕 臓癌細胞株をあげることがで
きる。
本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための、癌細胞 の量としては、通常約 1 0 4 〜1 0 8細胞あればよく、 約 1 0 5 〜1 0 7細胞が好ま しい。 また被験物質の濃度としては、通常約 0 . 1 n g /m 1〜約 1 0 0 gZm 1 であればよく、約 1 n gZm 1〜約 5 0 g Zm 1が好ましい。癌細胞に被験物質を 接触させる時間は、通常 1時間以上 5日程度であり、好ましくは数時間から 2日程度 である。癌細胞に被験物質を接触させる回数は、 一回であってもよいし、複数回であ つてもよい。
癌細胞に被験物質を接触させる環境としては、癌細胞の生命活動を維持させるよう な環境が好ましく、例えば、当該癌細胞のエネルギー源が共存するような環境をあげ ることができる。 具体的には、 培地中で第一工程が行なわれることが好都合である。 本発明探索方法の第二工程において癌細胞に含まれる Neurof i l aments遺伝子の発 現産物量を測定するには、前述にある 「本発明評価方法の第一工程において、 哺乳動 物由来の検体に含まれる Neurof i l aments遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指 標値を測定する方法」 等に準じて測定すればよい。
本発明探索方法の第二工程において測定された発現産物の量と対照とを比較する ことにより得られる差異に基づき被験物質が有する Neurof i laments遺伝子の発現を 促進する能力を判定するには、 前述のように、 測定された発現産物量と、 例えば、 本 発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための被験物質の 濃度をゼロとした場合 （即ち、 癌細胞に被験物質を接触させてない場合） での Neuro f i l ament3遺伝子の発現産物量 （対照） とを比較して、 当該比較により得られる差異 に基づき被験物質が有する Neurof i l aments遺伝子の発現を促進する能力を判定する。 仮に、被験物質を接触させた癌細胞に含まれる Neurofilaments遺伝子の発現産物量が 対照 （この場合には、 被験物質を接触させていなレ 癌細胞に含まれる Neurofi lament 3遺伝子の発現産物量） と比較して高ければ、 当詨被験物質は Neurofilaments遺伝子 の発現を促進する能力を有すると判定することができる。 もちろん対照として、癌細 胞 他の被験物質を接触させた際の Neurofi lament 3遺伝子の発現産物量を用いても よく、 この場合には、予め当該他の被験物質が有する Neurofilaments遺伝子の発現を 促進する能力が判っていることが好ましい。
このようにして、 Neurofilaments遺伝子の発現を促進する能力を有する物質を探索 することが可能である。 尚、バックグランド又はコントロールとして、正常胃細胞株 等の正常細胞株や、勝臓癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物 由来の検体に含まれる Neurofilaments遺伝子の発現産物量を、被験物質を接触させた 場合及び接触させない場合の両者において測定することが好ましい。 実施例
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるもの ではない。 実施例 1 (脖臓癌細胞株における Neurofilament3Jt伝子のメチル化状態の確認試験
)
ヒト由来の勝臓癌細胞株 7種 [BXPc3、 HPAF-IK Capan- 2、 MiaPaCa- 2、 Hs766T、 PA NC - 1及び HPAC (全て ATCC製） ] を ATCC (American Type Culture Collection) の力夕 ログに記載された、それぞれの細胞株のための専用培地でサブコンフルェントになる まで培養した後、 各々約 lxlO7細胞を集めた。 一般的な不死化の方法 [： Am. J. Patho 1., 148, 1763-1770 (1996) 〕 によって得られた不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 2種 (HPDE- 4/E6E7及び ¾PDE6 - E6E7c7) [これらは、 Dr.Tsao (Ontario Cancer Institute and Department of Pathology, Unversity of Toronto) により、 保存 '管理され、 当該研究者から譲受可能である]を、終濃度で 50U/D1Lのペニシリン、 及び、 終濃度で 5 Oug/mLのストレプトマイシンを加えた Keratinocyte— SFM， liquid (Invi trogen社製 ) を培地として、 サブコンフルェントになるまで培養した後、 各々約 lxlO7細胞を集 めた。 集められた細胞に、 SEDTAバッファー [10mM Tr is- HC1 (pH8.0)、 lOmM EDTA (p H8.0) 、 lOOmM NaCl] を 10倍容量加えた後、 これをホモジナイズした。 得られた混 合物に、 proteinase K (Sigma) を 500 g/ml、 ドデシル硫酸ナトリウムを 1 0/v)に なるように加えた後、 これを 55 で約 16時間振とうした。振とう終了後、 当該混合物 をフエノール [1M Tris- HCl(pH8.0)にて飽和] ·クロ口ホルム抽出処理した。 水層を 回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈澱することによ り沈澱を回収した。 回収された沈澱を TEバッファ一 （lOmM Tris、 ImM EDTA、 pH 8.0 ) に溶解し、 これに 40 g/mlになるように RNase A (Sigma) を加えて 37 で 1時間ィ ンキュペートした。インキュベートされた混合物をフエノール 'クロロホルム抽出処 理した。水層を回収し、 これに NaClを 0.5Nとなるよう加えた後、 これをエタノール沈 澱することにより沈澱（ゲノム DNA) を回収した。 回収された沈澱を 70%エタノールで リンスしてゲノム DN Aを得た。
得られたゲノム DNAを、 制限酵素 BamHIにて消化後、 Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。 即ち、 制 限酵素処理後のゲノム D N A (約 500ng)を蒸留水に溶解して 20 1のゲノム D N A溶 液を調製し、 これに 6M水酸化ナトリウムを約 1 1加えた後 （終濃度約 0.3M) 、 当該混 合物を 37°Cで 15分間保温した。 この混合物に、 0.6 ヒドロキノン（Sigma)を終濃度 0 .5mM、 亜硫酸水素ナトリウム（Sigma)を終濃度 3.1Mになるように加えた後、 これを 95 30秒間、 次いで 5(TCで 15分間を 1サイクルとする保温を 15サイクル行った。 保温さ れた液から Wizard DNA clean-up system(Promega)を用いて DNAを精製した。精製され た DNAを 50 1の TEバッファーに溶解し、これに水酸化ナトリゥムを終濃度 0.3Mになる ように加えた後、 当該混合物を室温で 5分間放置した。 次いで、 放置された混合物を エタノール沈澱することにより沈澱 (DNA) を回収した。 回収された沈澱を 20 Iの T Eバッファーに懸濁した。 得られた DNAを铸型とし、 以下に示す非メチル化特異的プライマ一 U1と U2、 又は、 メチル化特異的プライマー Mlと M2を用いて PCRを行つ; fc。 非メチル化特異的プライマ 一 U1と U2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番号 423〜586で示される塩基配列 を有する DNAを biisuliit e処理した後の塩基配列を有する 164bpの DNAが増幅され、 一方、メチル化特異的プライマー Mlと M2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番 号 425〜585で示される塩基配列を有する DNAを bisulfite処理した後の塩基配列を 有する 161 bpの DNAが増幅される。
<非メチル化特異的プライマー >
U1： 5' -TGGAGTGGGTGTTGAATTATT-3' (配列番号 2)
U2： 5' -CACAACATTCTACCAACCTCA-3' (配列番号 3)
<メチル化特異的プライマー〉
Ml： 5' -GAGCGGGCGTTGAATTATC-3' (配列番号 4)
M2： 5'-ACAACGTTCTACCGACCTCG -3' (配列番号 5)
メチルイ匕特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマ一に、特異性があるこ とを確認するため、 まず、 不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 (HPDE-4/E6E7) から通常 の方法でゲノム DNA(DNAl)を抽出し、 この一部をメチルイ匕酵素 Sssl (NEB社） により処 理しゲノム DNAの 5'-CG- 3' 全てをメチル化した（DNA2)。 これら DNA1およ につい ても、 メチル化特異的 PCRおよび非メチル化特異的 PCRを行った。
PCRの反応液としては、铸型とする DNAを 25ngと、 20p ol/^ 1の上記プライマー溶液 を各 1^1と、 each 2mM dNTPを 2·5 1と、 10X緩衝液（lOOmM Tris-HCl pH8.3、 500mM KC1、 2(«1 ¾½(：12)を2.5 と、 耐熱性 DMポリメラ一ゼ 5U/ 1を 0· 2 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1としたものを用 た。 上記の非メチル化特異 的プライマーを使用した場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 57 にて 30秒間さらに 72°Cにて 30沙間を 1サイクルとする保温 を 32サイクル行う条件で PCRを行った。 また、上記のメチル化特異的プライマーを 使用した場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95°Cにて 30秒間次い で 66°Cにて 30秒間さらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温を 32サイクル行う 条件で PCRを行った。 いずれの場合も、 PCRを行った後、 増幅産物を含む PCR の反応液を 2% ァガロースゲル電気泳動に供した。
その結果を図 1に示した。 ヒト由来の不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 (HPDE-4/E6 E7及び HPDE6- E6E7c) の場合において、 非メチル化特異的プライマーを使用した場合 (レーン U)には増幅された DNAのバンドが認められ、 メチル化特異的プライマーを使 用した場合 （レーン M) には増幅された DNAのバンドが検出されなかった。従って、 ヒ ト由来の不死化 （正常）滕管上皮細胞株（HPDE- 4/E6E7及び ¾PDE6-E6E7c) の場合にお いて、 少なくとも、 配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 428、 432、 443、 566 た、 勝臓癌細胞株 7種 （BXPc3、 HPAF-I K Capan- 2、 Mi aPaCa- 2、 Hs766T、 PANC-1及び HPAC) の場合において、 非メチル化特異的プライマーを使用した場合 （レーン U) に は増幅された DNAのバンドが検出されず、 メチル化特異的プライマ一を使用した場合 (レーン M) には増幅された DNAのバンドが認められた。従って、 当該条件においては 、 配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 428、 432、 443、 566、 572及び 580でそれ ぞれ示されるシトシンはメチル化されていると判断された。 実施例 2 (勝臓癌組織における Neuro f i 1 anient 3遺伝子のメチル化状態の確認試験） ヒト由来の勝臓癌組織及びその周辺の勝臓正常組織 [患者からィンフォームドコン セントを得て入手] 各 12検体 （Case l〜Casel 2) に、 SEDTAバッファ一 [10mM Tr i s- HC pIK. O) lOmM EDTA (pH8. 0) 、 l OOmM NaCl] を 1 0倍容量加えた後、 これをホモ ジナイズした。 得られた混合物に、 proteinase K (Sigma) を 500 g/ml、 ドデシル硫 酸ナトリゥムを l% (w/v)になるように加えた後、 これを 55°Cで約 16時間振とうした。 振とう終了後、 当該混合物をフエノール [1M Tr i s- HCl (pH8. 0)にて飽和] ·クロロホ ルム抽出処理した。水層を回収し、 これに NaClを 0. 5Nとなるよう加えた後、 これをェ 夕ノール沈澱することにより沈澱を回収した。 回収された沈澱を TEバッファー （10m M Tr i s, ImM EDTA、 H 8. 0) に溶解し、 これに 40 g/mlになるように RNase A (S igm a) を加えて 37°Cで 1時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフエノ ール，クロ口ホルム抽出処理した。水層を回収し、 これに NaClを 0. 5Nとなるよう加え た後、 これをエタノール沈澱することにより沈澱 （ゲノム DM) を回収した。 回収さ れた沈澱を 70 エタノールでリンスしてゲノム D N Aを得た。
得られたゲノム DNAを、 制限酵素 BamHIにて消化後、 Clark et al.， Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al.， Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 98 21-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。 即ち、 制 限酵素処理後のゲノム DN A (約 500ng)を蒸留水に溶解して 20 1のゲノム DN A溶 液を調製し、 これに 6M水酸化ナトリウムを約 1 1加えた後（終濃度約 0.3M) 、 当該混 合物を 37°Cで 15分間保温した。 この混合物に、 0.6mMヒドロキノン（Sigma)を終濃度 0 • 5mM、 亜硫酸水素ナトリウム（Sigma)を終濃度 3.1Mになるように加えた後、 これを 95 °C30秒間、 次いで 50°Cで 15分間を 1サイクルとする保温を 15サイクル行った。 インキ ュペートされた液から Wizard DNA clean-up system(Proinega)を用いて DNAを精製し た。精製された DNAを 50 lの TEバッファーに溶解し、 これに水酸化ナトリウムを終濃 度 0.3Mになるように加えた後、 当該混合物を室温で 5分間放置した。 次いで、 放置さ れた混合物をエタノール沈澱することにより沈澱 (DNA) を回収した。 回収された沈 澱を 20 lの TEバッファーに懸濁した。 得られた DNAを铸型とし、 以下に示す非メチル化特異的プライマー U1と U2、 又は、 メチル化特異的プライマ一 Mlと M2を用いて PCRを行った。 非メチル化特異的プライマ 一 U1と U2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番号 423〜586で示される塩基配列 を有する DNAを biisuifite処理した後の塩基配列を有する 164bpの DNAが増幅され、 一方、メチル化特異的プライマー Mlと M2とを使用した場合には、配列番号 1の塩基番 号 425〜585で示される塩基配列を有する DN Aを bisulfite処理した後の塩基配列を 有する 161 bpの DNAが増幅される。
ぐ非メチル化特異的プライマ一 >
U1： 5' -TGGAGTGGGTGTTGAATTATT-3' (配列番号 2)
U2： 5' -CACAACATTCTACCAACCTCA-3' (配列番号 3)
<メチル化特異的プライマー >
Ml： 5' -GAGCGGGCGTTGAATTATC-3' (配列番号 4)
M2： 5' -ACAACGTTCTACCGACCTCG-3' (配列番号 5) メチル化特異的プライマ一および メチル化特異的プライマ一の特異性は、実施例 1に記載の通り、 不死化 （正常） 鹧管上皮細胞株 (HPDE-4/E6E7) のゲノム DNA (l)お よび、 この一部をメチル化酵素 Sss l (NEB社） により処理しゲノム DNA (2)において確 認済みである。
PCRの反応液としては、铸型とする DNAを 25ngと、 20pmo l/ 1の上記プライマー溶液 を各 1 ^ 1と、 each 2mM dNTPを 2. 5 ^ 1と、 10 X緩衝液（l OOmM Tr i s-HCl pH8. 3、 500mM KC1、 20mM MgCl2 )を 2. 5 1と、 耐熱性 DNAポリメラーゼ 5U/ ^ 1を 0. 2 ^ 1とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液量を 25 1としたものを用いた。 上記の非メチル化特異 的プライマーを使用した場合には、 当該反応液を、 95 にて 10分間保温した後、 95 °Cにて 30秒間次いで 57tにて 30秒間ざらに 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとする保温 を 32サイクル行う条件で P C Rを行った。また、上記のメチル化特異的プライマーを 使用した場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 95 にて 30秒間次い で 66tにて 30秒間さらに 72でにて 30沙間を 1サイクルとする保温を 32サイクル行う 条件で P C Rを行った。 いずれの場合も、 P C Rを行った後、 増幅産物を含む P C R の反応液を 2% ァガ口一スゲル電気泳動に供した。
その結果を図 2に示した。 ヒト由来の正常勝 S蔵組織 1 2検体では、非メチル化特異的 プライマーを使用した場合（レーン U) には増幅された DNAのバンドが認められ、 メチ ル化特異的プライマ一を使用した場合（レーン M) には増幅された DNAのバンドが検出 されなかった。従って、 ヒト由来の正常勝臓組織の場合において、 少なくとも、 配列 番号 1で示される塩基配列の塩基番号 428、 432、 443、 566、 572及び 580でそれぞれ示 されるシトシンはメチル化されていないと判断された。 膝臓癌組織 1 2検体中 9検体 で、 非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーン U) に増幅された DNAのバン ドに加え、 メチル化特異的プライマ一を使用した場合 （レ一ン M) にも増幅された DN Aのバンドが認められた。 従って、 当該条件においては、 少なくとも配列番号 1で示 される塩基配列の塩基番号 428、 432、 443、 566、 572及び 580でそれぞれ示されるシト シンは、 組織の一部が； ®化することによりメチルイ匕されたものと判断された。 実施例 3 (塍臓癌細胞株における Neurofilaments遺伝子の発現状態の確認試験と当 該遺伝子の発現に対するメチル化阻害剤の効果）
ヒト由来の塍臓癌細胞株 7種 (BXPc3、 請- II、 Capan- 2、 MiaPaCa - 2、 Hs766T、 P ANC- 1及ぴ ¾PAC) 及び不死化 （正常） 脖管上皮細胞株 （HPDE- 4/Ε6Ε7及ぴ PDE6- E6E7c 7) を専用培地で 70%コンフルェントになるまで培養した後、 各々の細胞を集めた。集 められた各々の細胞（約 lOOmg湿重量） を lmlの IS0GEN溶液（二ツボンジーン） を混合 してホモジナイズ後、 これに 0.2mlのクロ口ホルムを加えて懸濁した。 懸濁後、 当該 混合物を遠心分離 （4°C、 15000xg、 15分間） することにより、 上清を回収した。 回収 された上清に 0.5mlのイソプロパノールを加えて懸濁した後、 遠心分離 （4 ：、 15000 xg、 15分間） することにより、 沈澱 (RNA) を回収した。 回収された沈澱を 75%ェタノ ールでリンスした後、 DEPC (ジェチルピロカーボネート） 処理水に溶解した。
また、 ヒト由来の勝臓癌細胞株 （PANC- 1) を約 6x 105細胞/ 10cmプレートの密度で 接種し、 専用培地を用いて培養した。 接種後 1日目に、 メチル化阻害剤である 5-aza - 2'-deoxycytidine (Sigma製) (以下、 5Aza- dCと記す。 ) を 0.5 M又は I Mの濃度と なるよう培地に添加した。 5Aza-dCの添加から 24時間後に、 5Aza- dCが添加されていな い上記の培地に交換し、 培養を継続した。 次いで、 接種後 3日目に、 同様に 5Aza-dC を培地に添加した。接種後 4日目に細胞を回収し、回収された細胞から上記と同様な 方法で RNAを抽出 ·回収した。
このようにして得られた RNA3 を DNasel (Ambion)で処理した後、 これを錡型と し Superscriptll (Invitrogen) を用いて当該酵素に添付されたプロトコールに従い c DNAを合成した。合成された cDNAを錡型として、かつ、以下に示した Neurofilament Sと Neurofilament 3 Aとをプライマー対として用いた Real Time PCRを行うことによ り、 Neurofilaments遺伝子の mRNAに由来する DNAを増幅した。 この際、 コント口一レ として、 上記の cDNAを铸型として、 かつ、以下に示した GAPDH Sと GAPDH Aとをプライ マー対として用いた PCRを行うことにより、 Glyceraldehyde 3- phosphate dehydroge nase (GAPDH) 遺伝子の mRNAに由来する DNAを増幅した。
くプライマー (S:sense、 Arantisense) >
Neurofilaments S:5' -GCCACAACCACGACCTC-3' (配列番号 12) Neurofilaments A: 5' -AGTGGCCCAGTGATGCTT-3' (配列番号 13)
GAPDH S: 5' -AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3' (配列番号 14)
GAPDH A: 5' -AGGGGTCATTGATGGCAACA-3' (配列番号 15) PCRの反応液としては、 铸型とする cDNAを 50ngと、 10pmol/ 1の上記プライマー溶 液 2種を各 1 lと、 each 2.5mM dNTPを 4 1と、 5mM dUTPを と、 10XSYBR Gree n PCR Bufferを 5^1、 25mM ¾¾ 12を6 し 耐熱性 DNAポリメラーゼ （AmpliTaq Gold ) 5 11/ 1を0.3 1、 AmpEraseUNGを とを混合し、 これに滅菌超純水を加えて液 量を 50 1としたものを用いた。 Real Time PCRは、 i Cycler Thermal Cycler (Bio-R ad Laboratories)を用いて実施した。 Neurofilaments遺伝子および GAPDH遺伝子の mR NAに由来する DNAを増幅する場合には、 当該反応液を、 95°Cにて 10分間保温した後、 9 5°Cにて 30秒間、 59°Cにて 30秒間、 72°Cにて 30秒間を 1サイクルとして Real Time PC Rを行い、 Neur o f i 1 amen 13遺伝子および GAPDH遺伝子を定量した。
その結果を図 3及び図 4に示した。 ヒト由来の不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 （H PDE-4/E6E7及び HPDE6- E6E7c7)の場合には、 Neurofi 1&1^1^3遺伝子の1^ に由来する DNAが検出されたのに対し、 勝臓癌細胞株 7種のいずれの場合においても、 当該 DNA は検出されなかった。 即ち、 ヒト由来の不死化 （正常） 滕管上皮細胞株 （HPDE-4/E6 E7及 ¾PDE6-E6E7c7)では、 Neurofilaments遺伝子の発現が確認されたのに対し、塍 臓癌細胞株 7種のいずれにおいても、 Neurofi lament 3遺伝子の発現が認められなかつ た。
0.5 ¾1又は1 ¾1 5Aza- dCの存在下に培養された PANC- 1の場合には、 Neurofilaments 遺伝子の mRNAに由来する DNAが検出された。 尚、 GAPDH遺伝子の mRNAに由来する DNAは 、 不死化 （正常） 塍管上皮細胞株 （HPDE-4/E6E7及ぴ ¾PDE6- E6E7c7) の場合及び 5Aza -dC非存在下に培養された滕臓癌細胞株 PANC- 1の場合あるいは、 0.5 M又は I M 5AZ a- dC存在下に培養された PANC-1の場合のいずれにおいても同様に検出された。 即ち、 勝 fl蔵癌細胞株 PANC- 1の場合には、メチル化阻害剤の存在下に Neurof i lament3遺伝子の 発現が認められた。
以上の結果から、塍臓癌細胞株における上記シトシンのメチル化は、メチル化阻害 剤により阻害され、 かつ、 メチル化阻害剤の存在下で Neurof i laments遺伝子が発現 することが明らかとなった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等が提供可能となる。 配列表フリーテキスト
配列番号 2
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 6
PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー
配列番号 7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一
配列番号 8
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 9
プローブのために設計されたォリゴヌクレオチド
配列番号 1 0
プローブのために設計されたォリゴヌクレオチド
配列番号 1 1
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号 1 2 PCRのために設計されたォリゴヌクレオチドプライマー 配列番号 1 3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 1 4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマ一 配列番号 1 5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー

Claims

請求の範囲
1. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1)哺乳動物由来の検体に含まれる Neurofilaments遺伝子のメチル化頻度又はそれ に相関関係がある指標値を測定する第一工程、 及び
(2)測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比 較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程 を有することを特徴とする評価方法。
2. 哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
3. 哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
4. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1)哺乳動物由来の検体に含まれる Neurofilaments遺伝子のメチル化頻度を測定す る第一工程、 及び
(2)測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に 基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。
5. 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
6. 哺乳動物由来の検体が細胞であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 細胞の悪性度であることを特徴とする請求項 4記載の評価方法。
7. 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項 1記載の評価方法。
8 . 哺乳動物由来の検体が組織であって、 かつ、 当該検体の癌化度が哺乳動物由来の 組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項 4記載の評価方法。
9 . 組織が腾臓組織であって、かつ、 癌が膝臓癌であることを特徴とする請求項 8記 載の評価方法。
1 0 . 遺伝子のメチル化頻度が、 当該遺伝子のプロモーター領域、 非翻訳領域又は翻 訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の 5' - CG- 3'で示される塩基配列中のシ トシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項 1又は 4記載の評価方法。
1 1 . 組織が踡臓組織であって、かつ、癌が滕臓癌であることを特徴とする請求項 1 0記載の評価方法。
1 2 .遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域にある塩基配列内に 存在する一つ以上の 5' -CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であ ることを特徴とする請求項 1又は 4言己載の評価方法。
1 3 .遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配 列内に存在する一つ以上の 5' _CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻 度であることを特徴とする請求項 1又は 4記載の評価方法。
1 .遺伝子のメチル化頻度が、配列番号 1で示される塩基配列内に存在する一つ以 上の 5' -CG- 3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴と する請求項 1記載の評価方法。
1 5 . 組織が膳臓組織であって、かつ、癌が塍臓癌であることを特徴とする請求項 1 4記載の評価方法。
16. 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1)哺乳動物由来の検体に含まれる Neurofilaments遺伝子のメチル化頻度に相関関 係がある指標値を測定する第一工程、 及び
(2)測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比較するこ とにより得られる差異に基づき前記検体の癌ィ匕度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。
17. Neurofilaments遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、 Neurofila ment3遺伝子の発現産物の量であることを特徴とする請求項 16記載の評価方法。
18. Neurofilaments遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の転写産物の量であるこ とを特徴とする請求項 17記載の評価方法。
19. Neurofi 1 amen 遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の翻訳産物の量であるこ とを特徴とする請求項 17記載の評価方法。
20. Neurofilaments遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって
(1) 癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
(2) 第一工程 （1) 後に、 前記癌細胞に含まれる Neurofilaments遺伝子の発現産物 量を測定する第二工程、
( 3 )測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき 被験物質が有する Neurofilaments遺伝子の発現を促進する能力を判定する第三工程 を有することを特徴とする探索方法。
21. 癌細胞が膝臓衛細胞であることを特徴とする請求項 20記載の探索方法。
22. 有効成分として、請求項 20の探索方法により見出された能力を有する物質を 含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とす る抗癌剤。
23.有効成分として、 Neurofilamentsのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す る核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを 特徴とする抗癌剤。
24. 癌マーカーとしての、 メチル化された Neurofilament 3遺伝子の使用。
25. 癌マ一カーが勝臓癌マーカ一であることを特徴とする請求項 24記載の使用。
26.癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、 Neurofilament 3遺伝子 のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする癌化抑 制方法。
27. 癌が勝臓癌であることを特徴とする請求項 26記載の癌化抑制方法。
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