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WO2005005400A1 - スルホン酸エステル化合物およびそれを用いた蛍光プローブ - Google Patents

スルホン酸エステル化合物およびそれを用いた蛍光プローブ Download PDF

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WO2005005400A1
WO2005005400A1 PCT/JP2004/007751 JP2004007751W WO2005005400A1 WO 2005005400 A1 WO2005005400 A1 WO 2005005400A1 JP 2004007751 W JP2004007751 W JP 2004007751W WO 2005005400 A1 WO2005005400 A1 WO 2005005400A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
nitro
ester compound
sulfonic acid
acid ester
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/007751
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hatsuo Maeda
Norio Itoh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Osaka Industrial Promotion Organization
Original Assignee
Osaka Industrial Promotion Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka Industrial Promotion Organization filed Critical Osaka Industrial Promotion Organization
Priority to EP04735395A priority Critical patent/EP1650200A4/en
Publication of WO2005005400A1 publication Critical patent/WO2005005400A1/ja
Priority to US11/328,744 priority patent/US7465814B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase

Definitions

  • the present invention relates to a sulfonic acid ester compound and a fluorescent probe using the same.
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • Atsey methods such as acetylcholinesterase (AChE) are important in the biochemical and medical technical fields. It is considered that a compound capable of detecting a compound having a mercapto group (thiol group) (a compound for detecting a mercapto group) is useful for such an Atsei method.
  • thiol group a compound capable of detecting a compound having a mercapto group
  • thiol group a compound capable of detecting a compound having a mercapto group
  • thiol group a compound for detecting a mercapto group
  • some compounds having mercapto group detection ability have been actually developed, and they can be roughly classified into the following three types 1 to 3. That is, [type 1] is a reagent for introducing a fluorescent compound, [type 2] is a labeling agent for a mercapto group, and [type 3] is a coloring reagent based on a reaction with a mercapto group. Examples
  • Reagents belonging to type 1 such as compound 9 are used exclusively for the purpose of synthesizing fluorescently labeled proteins and nucleic acids, but have the following drawbacks when used for AChE attestation and the like. That is, first, compound 9 is a fluorescent compound like its product 10. Therefore, when the measurement of AChE Atsusei AChE inhibitory activity is performed using 9, the operation for separating 9 and 10 is necessarily required after the enzymatic reaction, which is complicated. The mercapto group in 9 The maleimide (Onaleimide), which is the reaction site with, reacts with other nucleophiles such as amines and alcohols, and therefore has a drawback in specificity (selectivity).
  • reagents belonging to type 2 such as compound 11 are exclusively used as labeling agents for separation and analysis.
  • Reagent 11 of type 2 is non-fluorescent and reacts with a mercapto group to give a fluorescent dye 12. Therefore, unlike in the case of 9, the separation operation of the reagent after the reaction is not required.
  • 11 since 11 also reacts with various nucleophiles and gives a fluorescent compound similar to 12, it is still difficult to use it for AChE Atsushi etc. in terms of specificity.
  • reacting with various nucleophiles is advantageous as a labeling agent for those nucleophiles, 11 is useful as a labeling agent in amines and thiols. I have.
  • Type 3 reagent 13 (Ellman's reagent) is the reagent actually used for AChE Atsushi. However, there is a problem in that 13 itself has poor stability in aqueous solution, that is, low sensitivity due to a large blank response.
  • an object of the present invention is to provide a novel organic compound which can be used for a fluorescent probe or the like which responds to a superoxide or a mercapto compound with high selectivity.
  • the present invention provides a sulfonic acid ester compound having a structure represented by the following general formula (I).
  • the atomic group A—O is an atomic group that forms a fluorescent compound by breaking a covalent bond with a sulfonyl group, and is bonded to the atomic group A.
  • Atomic B- S 0 3 _ may be a plurality, even one 1, B is one or more electronic aspirated ring substituted with a group, the electron withdrawing group, a halogen Kaa alkyl group, a nitro group, And at least one selected from the group consisting of a cyano group, and B may be the same or different when a plurality of B are present.
  • the sulfonic acid ester compound of the present invention has a structure represented by the general formula (I), for example, it does not respond to hydroxyl radicals and hydrogen peroxide, and responds only to superoxide only. It can be used for applications such as a typical fluorescent probe or a fluorescent probe which responds to a mercapto compound with high selectivity. Further, the fluorescent probe using the sulfonic acid ester compound of the present invention has extremely low response to other physiologically active substances in addition to intracellular reactive oxygen species other than superoxide, such as hydroxyl radical and hydrogen peroxide. It can also be used as a fluorescent probe that responds highly selectively to superoxide or mercapto compounds.
  • the other physiologically active substances include, for example, reducing compounds such as ascorbic acid and 1,4-hydroquinone, nucleophilic compounds such as dalkose, propylamine and getylamine, and cytochrome P450 reductase + NADPH system and Examples include a reductase system such as a diaphorase + NADH system.
  • the “mercapto compound” refers to all compounds having a mercapto group (_SH group), and the atom to which the mercapto group is bonded may be a carbon atom or any other atom such as nitrogen. , Phosphorus and the like.
  • FIG. 1 is a graph showing the superoxide detection performance of compound Id.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of a test in which compound Id was applied to a cell line.
  • FIG. 3 is another graph showing the results of a test in which compound Id was applied to a cell line.
  • FIG. 4 shows the superstructure for compounds 5a, 7, 6a, 8a and Id, respectively.
  • FIG. 4 is a graph showing specificity for oxide or daltathione.
  • FIG. 5 is a graph showing the fluorescence response to daltathione and cysteine.
  • FIG. 5A shows the measurement results for compound 6a
  • FIG. 5B shows the measurement results for compound 8a.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between acetylcholinesterase activity and the fluorescence response of compound 8a.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the inhibitory activity of neostigmine and pyridostigmine on acetylcholinesterase by compound 8a.
  • FIG. 8 is a graph showing the fluorescence response of compound 8a to a-S-ATP.
  • the conventional fluorescent probe HE is converted to a fluorescent compound by an oxidation reaction. Therefore, there is a problem with specificity as described above.
  • NBT there is no fluorescent probe that utilizes a fluorescence mechanism based on a reduction reaction, but there is NBT as an absorption probe.
  • NBT there is a reverse reaction, that is, a conversion reaction of the generated dye into NBT, because a simple reduction reaction is used as a fluorescence emission mechanism.
  • the fluorescence mechanism of the compound represented by the general formula (I) is not based on a simple redox reaction but is based on, for example, a desulfonylation reaction induced by an aromatic nucleophilic substitution reaction. That is, for example, Like room 4.
  • Scheme 4 is only an example and does not limit the present invention.
  • the sulfonate compound of the present invention belongs to the above-mentioned type 3 as a compound for detecting a mercapto group, but has the following characteristics as compared with the existing type 1-3 reagents.
  • the fluorescence mechanism of the mercapto compound-responsive fluorescent probe of the present invention is, for example, For example, it is presumed to be based on the aromatic nucleophilic substitution reaction according to Scheme 6 below. However, Scheme 6 is merely an example of the estimable mechanism and does not limit the present invention.
  • the compound of the present invention which is represented by the general formula (I), responds more specifically and more sensitively to a mercapto compound than an amino compound or the like. Furthermore, since a fluorescent compound is formed by cleaving the covalent bond between the atomic group A-0 and the sulfonyl group, the detection of the mercapto compound can be performed by a simple operation without separating the compound after the reaction. It is also possible to do.
  • the atomic group B in the formula (I) is a ring substituted with one or more electron-withdrawing groups as described above, but an aromatic ring or a heteroaromatic ring substituted with one or more electron-withdrawing groups. Is preferred. That is, if the ring forming the atomic group B is an aromatic ring or a heteroaromatic ring, the detection ability when used for a probe for detecting a peroxide or a mercapto compound is expected to be higher. . That is, for example, it is considered that the reaction is not a mere nucleophilic substitution reaction as in the above schemes 5 and 6, but an aromatic nucleophilic substitution reaction, so that it is expected that the detection ability is more excellent.
  • the electron withdrawing group is at least one selected from the group consisting of a linear or branched alkyl halide group having 1 to 6 carbon atoms, a nitro group, and a cyano group.
  • the electron withdrawing group is more preferable to include at least one of a nitro group and a trifluoromethyl group, and still more preferable to include a nitro group.
  • the atomic group B may be further substituted with an electron-withdrawing group other than a halogenated alkyl group, a nitro group, and a cyano group, if necessary, for example, a halogen atom or the like.
  • the ring is a benzene ring, a naphthalene ring, an anthracene ring, a pyrene ring, a pyridin ring, a pyrrole ring, a thiophene ring, a furan ring, a benzopyridine ring, a benzopyrrole ring, a benzothiophene ring, and a base ring. More preferably, it is at least one selected from the group consisting of nzofuran rings.
  • the atomic group B is selected from the group consisting of 2,4-jetrophenyl group, 412-trophenyl group, 2-ditrophenyl group, and 2-nitro- (4-trifluoromethyl) phenyl 2-nitro-4-methoxyphenyl, 4-nitro-2-methoxyphenyl, 2-nitro-4-methylphenyl, 4-nitro-2-methylphenyl, 2-nitro4- 6-dimethylphenyl, 4-nitro-2,6-dimethylphenyl, 2-nitro-14-chlorophenyl, 4-nitro-12-chlorophenyl, and 2-nitro It is more preferably at least one selected from the group consisting of 4-isopropylphenyl groups from the viewpoint of the sensitivity of the fluorescent probe and the specificity (selectivity) for the peroxide-mercapto compound, and the 2,4-dinitrophenyl group is preferred.
  • the sulfonic acid ester compound of the present invention can obtain a sulfonic acid ester compound having high specificity for either superoxide or mercapto compounds by appropriately designing the molecular weight within the range represented by the formula (I). .
  • the sulfo of the present invention The specificity (selectivity) of the fluorescent probe using the acid ester compound is not particularly limited, but is preferably, for example, as follows.
  • the fluorescence response to the superoxide or mercapto compound is preferably at least 10 times, more preferably at least 20 times, and more preferably at least 100 times the fluorescence response to hydrogen peroxide.
  • the upper limit of the fluorescence response to the superoxide or mercapto compound is not particularly limited, but is, for example, 100 times or less the fluorescence response to hydrogen peroxide.
  • the fluorescence response to the superoxide or mercapto compound is preferably at least 10 times the fluorescence response to hydroxyl radical, glucose, ascorbic acid, 1,4-hydroquinone, propylamine, or getylamine.
  • the fluorescence response to the superoxide or mercapto compound is preferably 4 times or more, more preferably 5 times or more, when compared with the fluorescence response to the cytochrome P450 reductase + NADPH system or diaphorase + NADH system.
  • the value is more preferably 0 times or more, particularly preferably 20 times or more, and the upper limit is not particularly limited, but is, for example, 100 times or less the fluorescence response to any of these systems.
  • the measurement temperature is 37 ° C
  • the excitation wavelength is 485 ⁇ 20 dishes
  • the emission wavelength shall be 530 ⁇ 20 nm.
  • the measurement conditions using the fluorescent probe of the present invention are not limited to these, and any measurement conditions are possible.
  • the formula (I) Atomic group bonded to the atomic group A B- S 0 3 _ sulfonic acid ester ether compound preferably more, in this case, the electron-withdrawing group is a nitro group in the atomic group B in the formula (I) and triflic More preferably, the electron-withdrawing group contains at least one of an orthomethyl group, and even more preferably, it contains a nitro group.
  • Atom group B is a 2,4-dinitrophenyl group, a 4-nitrophenyl group, a 2-nitrophenyl group, a 2-nitro- (4-trifluoromethyl) phenyl group, a 2-nitro-4-methoxyphenyl group, a 4-212 Toro-2-methoxyphenyl, 2-nitro-4-methylphenyl, 4-nitro-2-methylphenyl, tonitro-4,6-dimethylphenyl, 4-nitro-2,6-dimethylphenyl, It must be at least one selected from the group consisting of 2-nitro-1-chlorophenyl, 4-nitro-12-chlorophenyl, and 2-nitro-4-isopropylphenyl.
  • 2,4-dinitrophenyl 2-nitro-1- (4-trifluoromethyl) phenyl, 2-nitro-4-methoxyphenyl, 4-nitro-2-methoxyphenyl, 2-nitro -4-methylphenyl group, 4-nitro-2-methylphenyl group, 2-2tro-4,6-dimethylphenyl group, 412tro-2,6-dimethylphenyl group, 2-nitro-4-chlorophenyl
  • Particularly preferred is a phenyl group.
  • the superoxide selectivity is from the viewpoint of the above, in the atomic group B in the formula (I), the electron withdrawing group preferably contains only one nitro group.
  • examples of such an atomic group B include a 2-nitrophenyl group, a 4-212 trophenyl group, and And groups derived therefrom.
  • sulfonate compounds other than these in the present invention can naturally be used for the fluorescent probe for detecting superoxide.
  • the atomic group B—S bonded to the atomic group A in the formula (I) is used. It is preferable that 0 3 _ is one. In this case, in view of higher specificity and detectability of the mercapto compound, in the atomic group B in the formula (I), it is more preferable that the electron-withdrawing group contains a di-total group. It is particularly preferred to include a lip group.
  • the atomic group B is 2,4-dinitrophenyl group, 412-trophenyl group, 2-nitrophenyl group, 1-nitro- (4-trifluoromethyl) phenyl group, 2- Nitro-methoxyphenyl group, 4-nitro-12-methoxyphenyl group, 2-nitro-4-methylphenyl group, 4-212-2-methylphenyl group, 2-nitro-4,6-dimethylphenyl group, 4 12- 2,6-dimethylphenyl,-nitro 1-4-chloro, 4- nitro-2-chloro, and 2-nitro 4- 4-isopropyl More preferably, it is at least one selected from the group consisting of a phenyl group, 2,4-dinitrophenyl group, 2-nitro- (4-trifluoromethyl) phenyl group, 2-nitro-4- Methoxyphenyl group, 4-nitro- 2-methoxyphenyl group, 2-nitro-4-methylphenyl group, 412tro-2-methylphenyl group,
  • phonate compounds can also be used as probes for detecting mercapto compounds.
  • atomic group A- ⁇ in the above formula (I) in the sulfonic acid ester compound of the present invention for example, when the ⁇ atom is directly bonded to an aromatic ring or a heteroaromatic ring, It is more preferable from the viewpoint of higher detectability and the like.
  • the fluorescent compound formed by cleaving the covalent bond between the atomic group A—O and the sulfonyl group includes fluorescein, resorufin, 7-hydroxycoumarin, 1-naphthol, 2 —Naphthol, 1-hydroxyanthracene, 2-hydroxyanthracene, 9-hydroxyanthracene, 1-hydroxypyrene, 1-hydroxyacridine, 2-hydroxyacridine, 9-hydroxyacridine, 2-hydroxy It is preferably quinolone, 4-hydroxyquinolone, 5-hydroxyquinolone, 6-hydroxyquinolone, 8-hydroxyquinolone, 4-hydroxy-17-nitro-12-ox-1,1,3-diazole or a derivative thereof.
  • the fluorescent compound is 7-hydroxycoumarin or a 7-hydroxycoumarin derivative other than 7-hydroxy-4_ (trifluoromethyl) coumarin
  • the atomic group B is 2, 4-dinitrophenyl group, 2-nitro- (4-trifluoromethyl) phenyl group, 2-nitro-4-methoxyphenyl group, 4-nitro-2-methoxyphenyl group, 2-nitro-4-methylphenyl Group, 4-12-row 2-methylphenyl group, 2-nitro-1,4-dimethylphenyl group, 4-12-row 2,6-dimethylphenyl group, 2-nitro-14-chlorophenyl group, More preferably, it is a 4-nitro-2-chlorophenyl group or a 2-nitro-4-isopropylphenyl group.
  • the fluorescein derivative is a derivative in which at least one of the 2-, 4-, 5-, and 7-positions of fluorescein is substituted with a straight-chain or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or halogen.
  • the hydroxycoumarin derivative is more preferably a derivative in which the 4-position of 7-hydroxycoumarin is substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or a trifluoromethyl group.
  • fluorescent compounds formed by cleaving the covalent bond between the atomic group A-0 and the sulfonyl group include, for example, fluorescein, 2,7-dichlorofluorescein 2,7-difluorofluorescein, 4,5-difluorofluorescein, 2,4,5,7-tetrafluorofluorescein, 2,7-dimethylfluorescein, 4,5-dimethylfluorescein Olescein, 2,4,5,7-tetramethylfluorescein, 2,7-diisopropylpropylfluorescein, 2,7-di-tert-butylfluorescein, 2,7-dimethoxyfluor Oresin, 2,4-difluoro-5,7-dimethylfluorescein, resorufin, 2,8-dichlororesorufin, 7-hydroxy-41- (trifluoromethyl) coumarin, and 7-hydroxy-4-methylcou It is phosphorus.
  • X 1 , X 2 , Y 1 and Y 2 are each a hydrogen atom, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen, and may be the same or different;
  • X 3 is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or trifluoro A methyl group
  • R 1 and R 3 are each a hydrogen atom, a nitro group, a methyl group, a chloro group or a methoxy group, which may be the same or different,
  • R 2 and R 4 are a hydrogen atom, a nitro group, a trifluoromethyl group, a methyl group, an isopropyl group, a chloro group or a methoxy group, which may be the same or different,
  • R 1 and R 2 are a nitro group
  • at least one of R 3 and R 4 is a nitro group.
  • X 3 is a straight-chain having 1 to 6 carbon atoms. When it is a chain or branched alkyl group, R 1 and R 2 are both groups other than a hydrogen atom.
  • Particularly preferred examples of the sulfonic acid ester compound of the present invention include, for example, compounds represented by the following formulas 1 and 3 to 8.
  • X 1 , X 2 , and J are each a hydrogen atom, a methyl group, or a halogen, and may be the same or different.
  • R 1 is a hydrogen atom. , nitro group, methyl group, a black hole or methoxy
  • R 2 is a hydrogen atom, a nitro group, triflate Ruo Russia methyl group, a methyl group, an isopropyl group, black port group or a methoxy group
  • R 1 And at least one of R 2 is a nitro group.
  • sulfonic acid ester compounds when used as a probe for superoxide detection, it is represented by any of the following formulas la to ld, 3, 4a to 4e, 5a, 5b, 6a, and 6b Sulfonate compounds are particularly preferred, and when used for a probe for detecting a mercapto compound, sulfonic acid ester compounds represented by any of the following formulas 5a, 6a, 7, 8a, 8b and 8c Are particularly preferred.
  • the method for producing the sulfonic acid ester compound of the present invention represented by the general formula (I) is not particularly limited, and a known method for producing a sulfonic acid ester compound can be appropriately used.
  • the compound of the formula (III) and the compound of the following formula (III) can be produced by a production method including a step of combining the compound.
  • X 5 is a halogen
  • a and B are the same as those in the above formula (I).
  • the compound of the formula ( ⁇ ⁇ ⁇ ) for example, the above-mentioned fluorescent compound and the like can be used, and preferred fluorescent compounds are, for example, as described above. That is, as the compound of the formula (II), for example, fluorescein and its derivatives represented by the following formula, resorufin, 7-hydroxy-4- (trifluoromethyl) coumarin, 7-hydroxy-4-methylcoumarin and the like Fluorescent dyes include, but are not limited to, various compounds.
  • halogen refers to any halogen element, and includes, for example, fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • halogenated alkyl group include, but are not particularly limited to, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group. And a tert-butyl group, etc., each being halogenated, and a trifluoromethyl group is particularly preferred.
  • the salt is not particularly limited, and may be, for example, an acid addition salt or a base addition salt.
  • the acid forming the acid addition salt may be an inorganic acid or an organic acid
  • the base forming the base addition salt may be an inorganic base.
  • Organic bases may be used.
  • the inorganic acid examples include, but are not particularly limited to, sulfuric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, hydrobromic acid, and hydroiodic acid.
  • the organic acid is not particularly limited, examples thereof include p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p-bromobenzenesulfonic acid, carbonic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, and acetic acid.
  • Examples of the inorganic base include, but are not particularly limited to, for example, ammonium hydroxide, alkali metal hydroxide, alkaline earth metal hydroxide, carbonate, and hydrogen carbonate, and more specifically, for example, Examples include sodium hydroxide, potassium hydroxide, potassium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium bicarbonate, calcium hydroxide and calcium carbonate.
  • the organic base is not particularly limited, but examples include ethanolamine, triethylamine and tris (hydroxymethyl) aminomethane.
  • the method for producing the salt of the compound of the present invention is not particularly limited.
  • the salt of the compound of the present invention can be produced by appropriately adding an acid or a base to the compound of the present invention by a known method. .
  • the fluorescent probe of the present invention comprises the sulfonic acid ester compound of the present invention. By containing it, it shows high selectivity to superoxide-mercapto compounds. Therefore, the fluorescent probe of the present invention is excellent in sensitivity and precision, and the fluorescent probe of the present invention, or the method for detecting a superoxide or a mercapto compound using the same, is applicable to, for example, a bioimaging method. Suitable for. Therefore, the sulfonic ester compound of the present invention is suitable for use as a reagent for clinical analysis and the like.
  • the structure of the sulfonic acid ester compound of the present invention is not limited by its use, but it is preferable that the structure is appropriately selected and used according to the use.
  • preferred compounds for each application are as described above from the viewpoint of specificity (selectivity).
  • the fluorescent probe of the present invention can have high specificity (selectivity) and detectability for a superoxide or mercapto compound by including these compounds of the present invention.
  • the fluorescent probe of the present invention is suitable for applications such as bioimaging as described above, but can be used for various other applications.
  • the use of the fluorescent probe for detecting peroxide in the present invention is not particularly limited.
  • Examples thereof include an atsey method using blotting (transcription), a method for quantifying superoxide dismutase, and a method for functional food or medicine. It is suitable for a method for measuring the ability to eliminate xide, a method for clinical analysis, and a method for screening drugs.
  • the use of the fluorescent probe for detecting a mercapto compound of the present invention is not particularly limited. Examples thereof include a kinase assay method, an acetylcholinesterase assay method, an assay method using blotting (transcription), a clinical analysis method, and a pharmaceutical. It is suitable for screening methods. Hereinafter, these methods will be described more specifically.
  • the assay method using blotting (transfer) is an assay method including a step of detecting a substance plotted (transferred) on a support using the fluorescent probe of the present invention.
  • the operation and the like are not particularly limited, and a known method can be appropriately used except that the substance is reacted with the fluorescent probe of the present invention on the support.
  • the support is also not particularly limited, and known supports such as agarose gel, polyacrylamide gel, nitrocell membrane, and nylon membrane can be used.
  • the kit can be used in the assay method using the above-mentioned plotting.
  • the method for quantifying a peroxide using the fluorescent probe for detecting a peroxide of the present invention comprises measuring the fluorescence response after reacting the fluorescent probe for detecting a superoxide of the present invention with a superoxide.
  • the reaction is performed by comparing the case where the reaction is carried out in the presence of a sample containing superoxide dismutase with the case where the reaction is carried out in the absence thereof.
  • concentration of peroxide dismutase in a body fluid of an animal can be measured.
  • the above-described method for quantifying superoxide dismutase can be applied to, for example, measurement of superoxide elimination ability of functional foods or pharmaceuticals. That is, a step of measuring the concentration of peroxide dismutase in a human or animal body fluid using the above-described method for quantifying superoxide dismutase, and then administering a functional food or a drug to the human or animal. Measuring the concentration of superoxide dismutase in the body fluid of the human or animal again using the method for quantifying superoxide dismutase after administration, the method comprising: The ability to eliminate superoxide of an acidic food or medicine can be measured.
  • kits suitable for these measurement methods can be obtained by appropriately designing a kit including the superoxide detection probe of the present invention.
  • a kinase assay method using the mercapto compound detection probe of the present invention includes, for example, Thiol oxidation of the substrate using quinase and ⁇ -S-ATP; and detecting the thiophosphorylated substrate using the mercapto compound detection probe of the present invention.
  • the substrate for example, a protein can be used.
  • the protein when a protein is phosphorylated by a kinase and ATP, the protein can be phosphorylated by using ⁇ -S-ATP instead of ATP.
  • the Kinase assay method can be performed.
  • the Kinase assay method further comprises a step of separating the kinase from a sample using an antibody.
  • a kit suitable for this kinase assay method can be obtained, for example, by appropriately designing a kit containing the probe for detecting a mercapto compound of the present invention, ⁇ -S-ATP and a substrate, and further comprising a kinase antibody. Is preferred.
  • the acetylcholinesterase assay method using the fluorescent probe for detecting a mercapto compound of the present invention includes, for example, a step of producing thiocholine by a reaction of acetylthiocholine with acetylcholinesterase; Detecting using a fluorescent probe for detecting a mercapto compound.
  • This acetylcholinesterase The kit for C is obtained by appropriately designing a kit containing the fluorescent probe for detecting a mercapto compound of the present invention and acetylthiocholine. '' Below, common kinases Acetate and acetylcholinesterase
  • the (AChE) assay will be described, and the advantages of the quinase and acetylcholinesterase (AChE) assays of the present invention will be described.
  • a method for measuring enzyme activity can be used not only as a diagnostic method for a disease state of a certain disease, but also as a screening method for an enzyme inhibitor that becomes a new drug seed.
  • the Atsey method is preferably an environmentally friendly method that is simple to operate, can be measured in a short time, and has been used for AChE or kinase, which has been used in the past.
  • Atsusi method a Rajioatsusi using a substrate labeled with RI ac e ty l cho li ne (3 H -labeled) or ATP (32 P-labeled).
  • RI ac e ty l cho li ne 3 H -labeled
  • ATP 32 P-labeled
  • Enzyme-Mimnoassy has been used as a non-radioactive technique for the kinase-assay method.
  • These operating procedures are of the following two types. (1) phosphorylation of immobilized substrate-antigen-antibody reaction with phosphorylated substrate by enzyme-modified antibody-washing-color development or chemiluminescence-detection by enzyme reaction; and (2) phosphorylation of immobilized substrate ⁇ Piotin repair Antigen-antibody reaction with phosphorylated substrate by decorated antibody Washing ⁇ complex formation with 7-vidin modifying enzyme-washing ⁇ color development or chemiluminescence by enzyme reaction-detection.
  • the problem with these techniques is that a modified antibody specific for the phosphorylated substrate is always required.
  • kinase and acetylcholinesterase are as follows. That is, first, the operation is simple. Specifically, the enzyme reaction and the fluorescence reaction can be performed simultaneously with the AChE assay, and the measurement can be performed with the simple operation of performing the fluorescence reaction after the enzyme reaction with the kinase assay, The measurement can be performed using only the enzyme substrate and the probe as reagents.
  • the detection sensitivity of the measurement method using the fluorescent probe for detecting a mercapto compound of the present invention can be expected to be comparable to that of chemiluminescence.
  • the human or the acetylethylcholinesterase assay method or the quinase assay method of the present invention can be used.
  • a drug By conducting an attestation on an animal, for example, a drug can be screened for treatment, prevention or reduction of symptoms associated with acetylcholine or kinase.
  • the disease relating to the acetylcholine or kinase is not particularly limited, and examples thereof include cancer, Alzheimer's disease, hypertension, angina pectoris, arteriosclerotic diseases such as myocardial infarction, inflammatory diseases such as arthritis, and various other diseases. Examples include metabolic diseases.
  • Various clinical analysis methods can be performed by performing an assay on humans or animals using the probe for detecting a peroxide and the probe for detecting a mercapto compound of the present invention as described above.
  • the sulfonic acid ester compound of the present invention is suitable for use as a reagent for clinical analysis as described above, and a kit containing the reagent for clinical analysis is suitable. With appropriate settings, a kit for clinical analysis suitable for various uses can be obtained. Further, the sulfonic acid ester compound of the present invention can be used for producing a fluorescent probe for detecting a mercapto compound.
  • the sulfonic acid ester compound of the present invention can be used for producing a fluorescent probe for kinase assay, producing a fluorescent probe for acetylcholinesterase assay, or producing a fluorescent probe used for blotting. is there.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, this embodiment is merely an exemplification of the present invention, and the present invention is not limited to this.
  • the compounds la-ld, 3, 4a, 4b, 5a, 5b, 6a and 6b were synthesized, and the function of these compounds as a fluorescent probe for detecting superoxide was evaluated.
  • application tests for cell lines were also performed.
  • NMR Nuclear magnetic resonance
  • EX-270 trade name, manufactured by JEOL, 270 MHz when measuring H
  • Chemical shifts are expressed in parts per million (ppm).
  • Tetramethylsilane (TMS) was used for the internal standard Oppm.
  • Coupling constants (J) are shown in Hertz, and the abbreviations s, d, t, q, m and br are singlet, doublet, doublet, triplet, and quadruple, respectively. Represents lines (quartet), multiple lines (mult iplet) and wide lines (broad).
  • Mass spectrometry was performed by high resolution (HRMS) Z fast atom bombardment (FAB) using JMS-700 (trade name) manufactured by JEOL.
  • Infrared absorption (IR) spectrum is It was performed by KBr method using VALOR-III (trade name) manufactured by the company.
  • Elemental analysis was performed using CHN CORDER MT-5 (trade name) manufactured by Yanaco Corporation.
  • the melting point was measured using MP-S3 (trade name) manufactured by Yanaco Corporation.
  • fluorescence intensity measurements were performed using a CytoFluor II multil 1 fluorescence plate reader (trade name ⁇ ) manufactured by PerSeptive Biosystems, USA, with excitation and emission filters of 485 each.
  • silica gel manufactured by Merck, silica gel 60 (trade name) was used. All chemicals were reagent grade and were purchased from any of Aldrich, Lancaster, Tokyo Kasei, Nacalai Tesque, and Wako Pure Chemical Co., unless otherwise indicated.
  • reaction solution was diluted with dichloromethane (200 mL), washed with 1M hydrochloric acid (200 mL ⁇ 2) and saturated saline (200 mL), and dried over magnesium sulfate.
  • the residue obtained by evaporating the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane) to obtain the desired product.
  • the yield and instrumental analysis values of compound la-Id are shown below. S la: 1.4 g (59%) as slightly ye 1 low powder.mp 131- 135 ° C.
  • 5a and 5b were synthesized by the same method.
  • resorufin sodium salt 2.0 g of pyridine corresponding to 5a or 5b (20 mL)
  • 2,4-dinitrobenzenesulfonyl chloride or 2-ditro 41- (trifluoromethyl) benzenesulfonyl chloride 1.1 eq
  • the obtained mixture was stirred at 140 to 120 ° C for 4 hours.
  • the reaction solution was diluted with dichloromethane (200 mL), washed with 1M hydrochloric acid (200 mL ⁇ 2) and saturated saline (200 mL), and dried over magnesium sulfate.
  • Both 6a and 6b were synthesized in a similar manner.
  • Triethylamine (1.1 eq) was added to the suspension of dimethoromethane (20 mL) at 0 ° C. Next, the obtained mixture was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was diluted with dichloromethane (200 mL), washed with 1M hydrochloric acid (200 mL) and saturated saline (200 mL), and dried over magnesium sulfate.
  • the residue obtained by evaporating the solvent under reduced pressure was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane) to obtain the desired product.
  • the yield and instrumental analysis values are shown below.
  • Figure 1 shows the test results.
  • the figure is a graph showing the results of the compound Id is reacted with H 2 0 2 or Super O key side which enzymatically produced was followed fluorescence, abscissa the reaction time (in seconds) and the vertical axis Represents the fluorescence intensity (au).
  • (a) represents HPX and X0 presence
  • (b) is HPX, X0 and SOD presence
  • (c) is HPX, existing anaerobic conditions X0 and SOD and
  • the H 2 0 The results when reacting with only 2 are shown.
  • the test results of FIG. 1 will be described in more detail.
  • Id was significantly reduced in a short period of time in response to superoxide generated from the hypoxanthine (HPX) / xanthinoxidase (X0) system. It was found to have high sensitivity to monooxide. More specifically, compound Id (16 xM), xanthine oxidase (X0, 0.01 U / mL), and hypoxanthine (HPX) at 37 ° C in HEPES buffer (H 7.4, 10 mM, 2.5 mL) , 40 M) was monitored at an excitation wavelength of 511 nm and an emission wavelength of 531 thighs.
  • HEPES buffer H 7.4, 10 mM, 2.5 mL
  • compound Id has an advantage as compared with nitro blue tetrazolium (NBT) which is a conventional superoxide detector. Specifically, it is as follows. NBT is scan one Paokisaido 0 2 - are utilized to probe such as spectrophotometric measurement since it has a property of being reduced by &. But Poko is a super A major problem is that it is reduced not only by oxides but also by the reductase present in biological systems. Therefore, whether or not the detection of O 2 — ⁇ by compound Id had the same problem was examined by an enzyme reaction using compounds ld, XO, HPX and SOD under anaerobic conditions.
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • Fluorescence intensity measurement was performed using ⁇ ASC0 FP-750 spectrofluorometer (trade name), JASC0 ETC-272 Peltier thermos tattooed single cell holder (trade name) or Molecular Devices SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader (trade name)
  • the excitation and emission wavelengths were set at 485 and 515 nm for la, lb and lc, respectively, and measured at 511 and 540 nm for Id.
  • Table 1 it was confirmed from the results for the X0-HPX system and the X0-HPX-S0D system that all of la to ld exhibited responses with excellent sensitivity to superoxide.
  • la, lb, lc and Id are, CH 3 CN- H 2 0 containing 0.1 M Et 4 NC10 4 (3 : 1) Oite in Pol evening Nmetori one measurement in - cathode response around 0.5 V vs.
  • the sensitivity and quantification of the fluorescence response of the probe (compound Id) in the HPX IX0 system was tested using a 96-well microplate assay. Specifically, a DMS0 solution (10 mM) of Id was diluted 400-fold with HEPES (pH 7.4, 10 mM) to prepare a probe solution, and this probe solution (150 2 L) was added to the HEPES solution (HPX). The mixture was mixed with HEPES solution (0.26 U / mL, 10 ill) of 10 and X0, and the fluorescence intensity was measured after standing at 37 for 10 minutes.
  • the fluorescence response of Id was determined by the amount of O 2 — ⁇ generated by the enzymatic reaction between HPX and X0. It was confirmed that good dependence was exhibited.
  • the correlation coefficient of this linear calibration curve was 1.000, and the slope was 0.58 au / pmol.
  • the concentration of the Id DMS0 solution was 5 mM, and this was diluted 400-fold with HEPES (pH 7.4, 10 mM) to prepare a probe solution.
  • HEPES pH 7.4, 10 mM
  • Spectrofluorometer (trade name) was equipped with; ETC-272 Peltier thermostated single cell holder (trade name) manufactured by TASC0 or SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader (trade name) manufactured by Molecular Devices.
  • the HPX showed a correlation coefficient of 0.9993 and a slope of 0.80 au / pino 1 from the detection limit to 2.0 nmol.
  • a good linear calibration curve was obtained. The difference of the slope of the linear calibration curve from the above is because the unit of the fluorescence intensity is an arbitrary unit and the measurement equipment is different.
  • PBS phosphate buffered saline i.e. phosphate-buffered saline, refers to PBS and PBS (+) containing CaCl 2 and 1.22 mM of MgSO 4 in 0.54 mM, PBS (-) and containing them Refers to PBS.
  • the results of the above test are shown in the graph of FIG.
  • the figure shows the results when the number of cells in each well is 1.0 ⁇ 10 4 or 1.0 ⁇ 10 5 in the presence or absence of PMA, respectively.
  • the horizontal axis is the incubation time (minutes), and the vertical axis is the fluorescence intensity (au).
  • Atsusi by Compound Id is clearly shown that PMA-stimulated neutrophils to release 0 2 It was.
  • Increased fluorescence intensity was also observed in unstimulated cells, according to previous studies, because the interaction of the cells with the surface of the tissue culture plate used resulted in neutrophil activation. Have been.
  • neutrophils 1.0 ⁇ 10 5 cells
  • PMA 0.016 M
  • the cells were incubated at 37 ° C for 120 minutes in the presence of either one or neither, and the cell viability after incubate before incubation was measured.
  • the cell viability after incubation was 98% of that before the incubation.
  • La-lc, 5a and 6a containing 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group were tested for their performance as fluorescent probes for superoxide detection in the same manner as compound Id, and all were deprotected by superoxide. It was found that each was converted to the corresponding fluorescent dye.
  • 3, 4a, 5b and 6b in which 4-trifluoromethyl-2-212 benzenesulfonyl group is introduced in place of 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group, and 4-12 trobenzenesulfonyl group It was also found that 4b, into which ⁇ was introduced, was similarly deprotected by superoxide and converted to a fluorescent dye.
  • any compound consisting of a combination of a phenolic dye and a 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group, a monotrifluoromethyl-2-nitrobenzenesulfonyl group or a 412-port benzenesulfonyl group is similarly treated. It can be used as a fluorescent probe for detecting superoxide. For example, as shown in Scheme 8 below.
  • these combinations The present invention is not limited to this, and by freely designing the compound of the present invention within the range of the general formula (I) and utilizing the fluorescent mechanism developed by the present inventors, the fluorescence having properties suitable for the intended use can be obtained. It can be expected that probe compounds can be freely designed and developed. A wide variety of uses of the compound of the present invention are conceivable, for example, application to micro-coloring technology using superoxide.
  • sulfonic acid ester compounds represented by the above formulas 4 (; to 4e, 7 and 8a to c were synthesized.
  • mercapto compound detection was performed. Unless otherwise indicated, measurement of fluorescence intensity was performed using FP-750 spectrofluorometer (trade name) manufactured by IASC0, and ETC-272 Peltier manufactured by iASCO. thermostatted single cell holder (brand name) or Molecular
  • the measurement was carried out using a SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader (trade name) manufactured by Devices, Inc. Other measurement conditions are the same as in Example 1.
  • 4d was obtained in the same manner as in the synthesis of 4c, except that 2-nitro-1-4-methoxybenzenesulfonyl cue lid was used instead of the 2-nitrobenzene sulfo-erc mouth lid. Further, 4e was obtained in the same manner as in the synthesis of 4c, except that 412 trough 2-methoxybenzenesulfonyl chloride was used instead of 2-nitrobenzenesulfonyl chloride. The yield and instrumental analysis values are shown below. 4d: 0.46 g (153 ⁇ 4) as dark orange powder.m.p.1U_125 °
  • the compound 5a, 6a, 7, 8a, 8b and 8c are, H 2 0 2 Ya Amin like, most because it does not respond to anti ⁇ other than the mercapto compound has been found that very high selectivity for the mercapto compound .
  • GSH glutathione
  • cysteine cysteine
  • FIG. 5 shows the measurement results of the fluorescence response.
  • Figure 5 5 is the figure for 6a
  • 5B is a graph showing the measurement results for 8a.
  • the detection limits of GSH and cysteine were both 7 pmol, and a good calibration curve was obtained in the concentration range of 7 pmol-1000 pmol.
  • the detection limits for GSH and cysteine were 2 and 1 pmol, respectively, and a good calibration curve was obtained in the concentration range of 1000 pmol from the detection limits.
  • 6a and 8a could be used as mercapto compound-responsive fluorescent probes. Specifically, it can be seen from the value of the correlation coefficient (r) that it has a very excellent quantitative property, and from the magnitude of the slope, it has a high sensitivity. In particular, 8a had high sensitivity.
  • a fluorescent probe containing 6a or 8a requires a very short reaction time, and since 6a and 8a themselves do not have fluorescence, only the colorants generated in the reaction have fluorescence, so before and after the reaction. It was characteristic that the separation operation of the reagent was unnecessary.
  • neostigmine and pyridostigmine (pyridostigmine).
  • the specific operation is as follows. That is, first, a probe solution containing 8a, an acetylthiocholine solution, and an acetylcholinesterase (AChE) solution were prepared in the same manner as described above. However, the concentration (activity) of the AChE solution was fixed at 5 U / mL. On the other hand, neostigmine solutions and pyridostigmine solutions of various concentrations (both dissolved in a pH 7.4 HEPES buffer) were prepared.
  • the probe solution 25 M, 150 ⁇
  • acetylthiocholine solution (1 mM, 10 L)
  • AChE solution (5 U / mL, 10 ill)
  • various concentrations of neostigmine or pyridostigmine solution were added.
  • the inhibition% value was calculated from the fluorescence intensity, and an inhibition activity curve was created.
  • FIG. 7 shows the inhibitory activity curve.
  • the horizontal axis is the concentration (mol) of neostigmine or pyridostigmine
  • the vertical axis is the percentage inhibition value calculated from the fluorescence intensity.
  • AChE Acetase Measurement of AChE inhibitory activity is very important for diagnosis of AChE-related diseases such as Alzheimer's disease and screening of new drug candidate compounds.
  • AChE inhibitors have recently attracted attention as therapeutic agents for Alzheimer's disease, and the sulfonate compounds of the present invention can be expected to be very useful for screening AChE inhibitors according to the above test results. [4. Use as a thiophosphate-responsive probe]
  • sulfonate ester compound of the present invention as a fluorescent probe for mercapto compounds other than thiol (a compound in which a —SH group is bonded to a carbon atom) was examined. More specifically, Compounds 5a, 6a, 7 and 8a-8c are converted to adenosine 5 '-[ r -thio] triphosphate (a-S-ATP) or adenosine 5'-[ r -thio] triphosphate. The so-called thiophosphoric acid group of adenosine thiophosphoric acid (adenosine monothiophosphate, S-AMP) It also revealed that it responded to the thiol group. The test results using Compounds 8a to 8c and ⁇ -STP are described below.
  • kinase is an enzyme that phosphorylates hydroxyl groups such as tyrosine residues of proteins in the presence of ATP.Thin-phosphorylated protein is produced when this enzyme reaction is performed using ⁇ -S-ATP instead of ATP. . If this thiophosphorylated protein is detected with a thiol-responsive fluorescent probe, kinase activity can be achieved.
  • the following two methods (1) and (2) can be considered.
  • a method using a microplate on which a kinase specific substrate is immobilized can be performed, for example, by performing the following operations (i) to (v) in order.
  • a method of blocking a kinase specific substrate can be performed, for example, by performing the following operations (i) to (V) in order. .
  • the enzyme reaction and the fluorescence reaction can be performed simultaneously with AChE Atssay, and the measurement can be performed with the simple operation of performing the fluorescence reaction after the enzyme reaction at Kinase Atssay.
  • the detection sensitivity of the measurement method using the fluorescent probe for detecting a mercapto compound of the present invention is considered to be comparable to that of chemiluminescence from the results of the above-mentioned Examples.
  • mercapto compound detection probe of the present invention can be easily constructed by designing molecules so that thiols are generated from those enzyme substrates by an enzyme reaction. For example, as shown in scheme 13 below.
  • mercapto compound-responsive fluorescent probes can be expected as reagents having various functions suitable for constructing various enzyme kits.
  • the sulfonic acid ester compound of the present invention is suitable for use as a fluorescent probe that responds highly selectively to superoxide.
  • Fluorescent probes are important reagents in current cell physiology research, and further highlight the recent development of hard and soft surfaces in image analysis systems using fluorescence microscopy and flow cytometry (Celso, Inc.). Considering this, the market for fluorescent probes is likely to expand in the future.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is suitable for, for example, bioimaging / clinical analysis and the like, and can be favorably used for developing new therapeutic methods and drug discovery series for diseases associated with reactive oxygen species acetylcholinesterase.
  • the probe for detecting a mercapto compound can be expected to be useful for screening therapeutic agents for Alzheimer's disease, cancer, and the like through the detection of acetylcholinesterase activity and the use of acetic acid.
  • the use of the sulfonate compound of the present invention is not limited to a fluorescent probe, but can be used for any purpose.

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Description

明 細 書 スルホン酸エステル化合物およびそれを用いた蛍光プローブ 技術分野
本発明は、 スルホン酸エステル化合物およびそれを用いた蛍光プロ一 ブに関する。 背景技術
生体内で活性酸素種の発生が宂進されることにより、 様々な疾病が惹 起されることが明らかになってきている。 したがって、 活性酸素種の生 体内ダイナミック解析は、 病因や病態等の解明に不可欠である。 活性酸 素種の解析においては、 蛍光プローブによるバイオイメージング法が中 心的役割を担っている。 スーパ一ォキサイドの発生が全ての活性酸素種 生成の源流にあるため、 その解析は非常に重要である。 しかし、 スーパ 一オキサイドに対する蛍光プローブとしては、 ヒドロェチジン （HE) (下記スキーム 1 ) しか存在しない。 （HEについては、 例えば、 （1) M. Nakano, Cell. Mol. Neurobiol. 1998, 18， 565-579; (2) C. L.
Murrant, M. B. Reid, Microsc. Res. Tech. 2001, 55, 236-248; (3) M. M. Tarpey, I. Fridovich, Circ. Res. 2001, 89， 224-236; (4) T. Munzel, I. B. Af anas ' ev, A. L. Klescchyov, D. G. Harrison, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002, 22, 1761-1768; (5) M. D. Esposti, Methods, 2002, 26, 335-340; (6)G. Rothe, G. Valet, J. Leukoc. Biol. 1990， 47, 440-448; (7) W. 0. Carter, P. K.
Narayanan, J. P. Robinson, J. Leukoc. Biol. 1994， 55, 253-258; (8) V. P. Bindokas, J. Jordan, C. C. Lee, R. J. Miller, J. Neurosci. 1996, 16, 1324-1336; (9) A. B. Al-Me di, H. Shuman, A. B. Fisher, Am. J. Pysiol. 1997， 272, L294-L300; (10)L. Benov, L. Sztejnberg, I. Fridovich, Free Radic. Biol. Med. 1998, 25, 826- 831.等を参照のこと。 ）
Figure imgf000004_0001
(ェチジゥム）
スキーム さらに、 HEの発蛍光機構はスーパーォキサイドによる酸化反応に基 づくため、 特異性 （選択性） に問題がある。 すなわち、 活性酸素種の多 くが酸化剤として働く結果、 HE の酸化は他の活性酸素種によっても起 こり、 その程度は、 ペルォキシナイトライト >ヒドロキシルラジカル > スーパーオキサイド >過酸化水素の順である。 また、 HEは、 チトクロ ーム c によっても酸化を受けることが知られている。 したがって、 HE を用いて得た蛍光応答は、 スーパーオキサイド発生量ではなく、 "活性 酸素種を含む生体内酸化剤のトータル発生量" の指標として活用すべき であると考えられている。 一方、 スーパーオキサイドの還元力に基づく プローブとしては、 ニトロブルーテトラゾリゥム （NBT) がある。 NBT は、 スーパ一オキサイドにより還元を受け、 青色色素ジフオルマザンに 変換される。 しかし、 吸光プロ一ブ NBT には、 N0S 等の様々な還元酵 素により還元を受ける、 生成するジフオルマザンが不均化や酸化により NBT に変換される等の問題があるだけでなく、 フローサイトメトリー、 共焦点レーザー顕微鏡等の先端蛍光解析法には利用できない。 このよう な背景の下、 高選択的にスーパーォキサイドに応答する蛍光プローブの 開発が細胞生理学的観点等から待ち望まれている。
一方、 ァセチルコリンエステラーゼ（AChE)アツセィ等のアツセィ方法 は、 生化学や医療の技術分野において重要である。 そのようなアツセィ 方法には、 メルカプト基 （チオール基） を有する化合物を検出できる化 合物 （メルカプト基検出用化合物） が有用であると考えられる。 これま でにメルカプト基検出能を有する化合物が実際にいくつか開発されてお り、 それらはおおむね次の type l〜3の 3種類に分類できる。 すなわち、 [type 1]は蛍光性化合物の導入試薬、 [type 2]はメルカプト基のラベル 化剤であり、 [type 3]はメルカプト基との反応に基づく発色試薬である 。 これら typel〜3に属する化合物の例示およびそのメルカプト基検出機 構の概要を、 下記スキーム 2に示す。
Figure imgf000006_0001
9 10
DC
O
[type 2】
:N、 zヽ。
N02 N02
11 12
Figure imgf000006_0002
スキーム 2 化合物 9等の t ype 1 に属する試薬は、 専ら蛍光標識したタンパク質 や核酸の合成目的に用いられているが、 AChEアツセィ等に用いるには次 のような難点がある。 すなわち、 まず、 化合物 9は、 その生成物 1 0と同 様に蛍光性化合物である。 従って、 AChE アツセィゃ AChE 阻害活性の 測定を 9 を用いて行なった場合、 酵素反応後において 9 と 1 0 の分離 操作が必ず必要となるため煩雑である。 また、 9 におけるメルカプト基 との反応部位であるマレイミド Onaleimide)はアミン類ゃアルコール類 などの他の求核試薬とも反応するため、 特異性 （選択性） の点で難点が ある。
次に、 化合物 11 等の type 2 に属する試薬は、 専ら分離分析用のラ ベル化剤として利用されている。 type 2 の試薬 11 は非蛍光性であり 、 メルカプト基と反応することにより蛍光性色素である 12 を与える。 従って、 9 とは異なり反応後における試薬の分離操作は必要としない。 しかし、 11 も様々な求核剤と反応し、 12 と類似の蛍光性化合物を与え るため、 AChE アツセィ等に用いるにはやはり特異性の点で難点がある 。 ただし、 様々な求核剤と反応することはそれら求核剤のラベル化剤と して有利であるため、 11 は、 アミン類ゃチオール類の. HPLC 分析にお けるラベル化剤として重宝されている。
type 3 の試薬 13 (Ellman' s reagent) は、 AChE アツセィに実際使 用されている試薬である。 しかし、 13 自身の水溶液中での安定性が悪 いこと、 つまり、 ブランク応答が大きいことに起因する低感度という問 題点がある。
なお、 チオールに対し選択的に反応する化合物の例としては、 これら type 1〜3以外に、 スルホンアミド化合物 15 のチオールによる脱保護 反応も報告されている （Fukuyama, T.， et al. , Tetrahedron Lett., 1997, 38, 5831-5834)。 化合物 15 における芳香族求核置換反応は、 ァ ミノ化合物に比べてチオール化合物により、 より円滑に進行すること、 すなわち、 ァミノ化合物の場合、 15 に対して大過剰を用いて長い反応 時間が必要であることが報告されている。 しかし、 化合物 15およびその 生成物はともに蛍光を示さないため、 チオール検出用化合物としての利 用は全く望めない。 + S02
Figure imgf000008_0001
スキーム 3 以上の通り、 ァセチルチオコリン（acetyl thiochol ine)を基質として 用いる AChE アツセィ法をより一般的な手法として活用する等の観点 から、 化合物 13 等にとって代わる新しいメルカプト基検出用化合物の 開発が待ち望まれている。 発明の開示
したがって、 本発明は、 スーパ一オキサイドやメルカプト化合物に高 選択的に応答する蛍光プローブ等に使用可能な新規有機化合物を提供す ることを目的とする。 前記課題を解決するために、 本発明は、 下記一般式 （ I ) で表される 構造を含むスルホン酸エステル化合物を提供する。
Figure imgf000008_0002
( I )
式 （ I ) 中、 原子団 A— Oは、 スルホニル基との共有結合を切断する とにより蛍光性化合物を形成する原子団であり、 原子団 Aに結合する 原子団 B— S 0 3 _ は 1つでも複数でも良く、 Bは、 1個または複数 の電子吸引基で置換された環であり、 前記電子吸引基は、 ハロゲン化ァ ルキル基、 ニトロ基、 およびシァノ基からなる群から選択される少なく とも一つを含み、 Bは、 複数存在する場合は同一でも異なっていても良 い。 本発明のスルホン酸エステル化合物は、 前記一般式 （ I ) で表される 構造を有することにより、 例えば、 ヒドロキシルラジカルおよび過酸化 水素に応答せず、 スーパーォキサイドだけに対して応答する高選択的な 蛍光プローブ、 またはメルカプト化合物に対し高選択的に応答する蛍光 プローブ等の用途に使用することができる。 さらに、 本発明のスルホン 酸エステル化合物を用いた蛍光プローブは、 スーパーォキサイド以外の 細胞内活性酸素種例えばヒドロキシルラジカルおよび過酸化水素のみな らず、 他の生理学的活性物質に対する応答が極めて低く、 スーパーォキ サイドまたはメルカプト化合物に対して高選択的に応答する蛍光プロ一 ブとして使用することも可能である。 前記他の生理学的活性物質は、 例 えば、 ァスコルビン酸、 1， 4—ヒドロキノン等の還元性化合物、 ダル コース、 プロピルアミン、 ジェチルァミン等の求核性化合物、 ならびに チトクローム P450リダクタ一ゼ + NADPH系およびジァフオラーゼ + NADH 系等の還元酵素系が挙げられる。 なお、 本発明で 「メルカプト化合物」 とは、 メルカプト基 （_ S H基） を有する化合物全般を指し、 メルカプ ト基が結合している原子は炭素原子でも良いしそれ以外の任意の原子、 例えば窒素、 リン等であっても良いものとする。 図面の簡単な説明
図 1は、 化合物 I dのスーパーォキサイド検出性能を示すグラフである 図 2は、 化合物 I dを細胞系に応用した試験結果を示すグラフである。 図 3は、 化合物 I dを細胞系に応用した試験結果を示すその他のグラフ である。 '
図 4は、 化合物 5 a、 7、 6a、 8aおよび I dのそれぞれについて、 スーパ
—ォキサイドまたはダルタチオンに対する特異性を示すグラフである。 図 5は、 ダルタチオンおよびシスティンに対する蛍光応答を示すダラ フであり、 図 5 Aは化合物 6aについての、 図 5 Bは化合物 8aについての 測定結果を示す。
図 6は、 アセチルコリンエステラーゼ活性と化合物 8aの蛍光応答との 関係を示すグラフである。
図 7は、 化合物 8aによるネオスチグミンおよびピリドスチグミンのァ セチルコリンエステラーゼ阻害活性測定結果を示すグラフである。 図 8は、 化合物 8aのア -S-ATPに対する蛍光応答を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
まず、 スーパーォキサイド検出における本発明の化合物の特徴を説明 する。
従来の蛍光プローブ HE は酸化反応により蛍光化合物に変換される 。 したがって、 上述したように特異性に関して問題がある。 一方、 還元 反応に基づく発蛍光機構を利用する蛍光プローブは存在しないが、 吸光 プローブとしては NBT がある。 NBT の場合、 単純な還元反応を発蛍光 機構とするため、 逆反応つまり生成する色素の NBT への変換反応が存 在する。 それに対して、 前記一般式 （ I ) の化合物における発蛍光機構 は、 単純な酸化還元反応ではなく、 例えば芳香族求核置換反応により誘 起される脱スルホニル化反応に基いている。 すなわち、 例えば下記スキ ーム 4のようにである。 ただしスキーム 4は例示に過ぎず、 本発明を限 定するものではない。
Figure imgf000011_0001
1a: X=Y=H 2a: X=Y=H 1b: X=CI， Y=H 2b: X=CI, Y=H 1c: X=F, Y=H 2c: X=F, Y=H 1d: X=Y=F 2d: X=Y=F スキーム 4 従って、 前記一般式 （ I ) で表される本発明の化合物によれば、 HE における問題点を回避できるだけでなく、 NBT における逆反応も起こら ないと考えられる。 このような発蛍光反応に基づき蛍光プローブを設計 開発したのは本発明者らが初めてである。
なお、 スキーム 4の反応のより具体的なメカニズムは、 例えば下記ス キーム 5のように推定される。 ただし、 スキーム 5は推定可能なメカ二 ズムの一例を示すに過ぎず、 本発明を何ら限定しない。
1a~d
Figure imgf000012_0001
16b: X=CI, Y=H
16c: X=F, Y=H
16d: X=Y=F
Figure imgf000012_0002
17a: X=Y=H
17b: X=CI, Y=H
17c: X=F, Y=H
17d: X=Y=F
Figure imgf000012_0003
スキーム 5 次に、 メルカプト化合物検出における本発明のスルホン酸エステル化 合物の特徴を説明する。
本発明のスルホン酸エステル化合物は、 メルカプト基検出用化合物と しては、 前記 type 3 に属するが、 既存の type 1—3 の試薬に比べて以 下のような特徴を有する。
本発明のメルカプト化合物応答型蛍光プローブの発蛍光機構は、 例え ば、 下記スキーム 6による芳香族求核置換反応に基づくものと推定され る。 ただし、 スキーム 6は推定可能なメカニズムの一例を示すに過ぎず 、 本発明を限定するものではない。
Figure imgf000013_0001
8a: X=Y=H 16a: X=Y=H
8b: X=CH3> Y=H 16b: X=CH3, Y=H
8c: X=H, Y=CH3 16c: X=H, Y=CH3
Figure imgf000013_0002
このような反応による発蛍光は、 本発明の化合物のようなスルホン酸 エステル化合物については報告例がない。 そして、 本発明の化合物は、 前記一般式 （ I ) で表されることにより、 ァミノ化合物等と比較してメ ルカプト化合物に対し高特異的かつ高感度に応答する。 さらに、 前記原 子団 A— 0とスルホニル基との共有結合を切断することにより蛍光性化 合物を形成するため、 反応後における化合物の分離等を行なわず簡易な 操作でメルカプト化合物の検出を行なうことも可能である。 したがって 、 従来のメルカプト化合物検出用試薬では達成できなかったアツセィ系 の構築が、 本発明の化合物を用いて行えると期待できる。 以下、 本発明の実施形態について説明する。
前記式 （ I ) 中の原子団 Bは、 前記の通り 1個または複数の電子吸引 基で置換された環であるが、 1個または複数の電子吸引基で置換された 芳香環または複素芳香環が好ましい。 すなわち、 原子団 Bを形成する環 が芳香環または複素芳香環であれば、 スーパーォキサイド検出用プロ一 ブゃメルカプト化合物検出用プローブに用いる場合の検出能がより高く なることが期待される。 すなわち、 例えば反応が前記スキーム 5や 6の ように単なる求核置換反応ではなく芳香族求核置換反応になると考えら れるため、 より検出能に優れることが期待できる。
前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸引基は、 炭素数 1〜 6の直鎖もしくは分枝ハロゲン化アルキル基、 ニトロ基、 およびシァノ 基からなる群から選択される少なくとも一つが好ましく、 スーパ一ォキ サイドゃメルカプト化合物に対する検出能等の観点からは、 ニトロ基お よびトリフルォロメチル基の少なくとも一方を含むことがより好ましく 、 ニトロ基を含むことがさらに好ましい。 なお、 前記原子団 Bは、 必要 に応じ、 ハロゲン化アルキル基、 ニトロ基、 およびシァノ基以外の電子 吸引基、 例えばハロゲン原子等でさらに置換されていても良いし、 電子 吸引基以外の任意の基、 例えばメチル基、 イソプロピル基、 メ卜キシ基 等でさらに置換されていても良い。 また、 前記原子団 Bにおいて、 前記 環が、 ベンゼン環、 ナフタレン環、 アントラセン環、 ピレン環、 ピリジ ン環、 ピロール環、 チォフェン環、 フラン環、 ベンゾピリジン環、 ベン ゾピロール環、 ベンゾチォフェン環、 およびべンゾフラン環からなる群 から選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
前記原子団 Bは、 2, 4—ジェトロフエニル基、 4一二トロフエニル基、 2—二トロフエニル基、 2—二トロ— （4一トリフルォロメチル） フエ二 ル基、 2—ニトロ一 4—メトキシフエ二ル基、 4一二トロー 2—メトキシフ ェニル基、 2—二トロー 4一メチルフエニル基、 4一二トロ— 2—メチルフ ェニル基、 2—二トロー 4, 6—ジメチルフエニル基、 4—ニトロ— 2, 6—ジ メチルフエニル基、 2—ニトロ一 4 _クロ口フエ二ル基、 4_ニトロ一 2— クロ口フエ二ル基、 および 2—二トロー 4一イソプロピルフエニル基から なる群から選択される少なくとも一つであることが蛍光プローブの感度 およびス一パーォキサイドゃメルカプト化合物に対する特異性 （選択性 ) の観点からさらに好ましく、 2，4—ジニトロフエニル基、 2—ニトロ一 (4 -トリフルォロメチル) フエニル基、 2—二トロ一 4ーメトキシフエ ニル基、 4一二トロー 2—メトキシフエ二ル基、 2—ニトロ— 4—メチルフ ェニル基、 4一二トロ— 2—メチルフエニル基、 2 _ニトロ— 4, 6—ジメチ ルフエ二ル基、 4_ニトロ一 2, 6—ジメチルフエニル基、 2—ニトロ一 4— クロ口フエ二ル基、 4一二トロー 2—クロ口フエ二ル基、 および 2—二ト 口一 4一イソプロピルフエニル基からなる群から選択される少なくとも 一つであることが一層好ましく、 2, 4—ジニトロフエニル基であること が特に好ましいが、 これ以外にも種々の基が可能である。 なお、 特定の物質を検出するためのプローブに用いる場合、 特異性 （ 選択性） の観点から、 他の物質に対する応答をなるベく低く抑えること が好ましい。 ただし、 特定の物質以外に対して応答することが、 前記特 定の物質を検出するためのプローブに用いられる可能性を排除するもの ではなく、 測定条件を適宜設定すること等により、 前記特定の物質の検 出用に用いることが充分可能である。 本発明のスルホン酸エステル化合 物は、 前記式 （ I ) に示す範囲内で適宜分子設計することにより、 スー パーォキサイドおよびメルカプト化合物のいずれかに高い特異性を示す スルホン酸エステル化合物を得ることができる。 なお、 本発明のスルホ ン酸エステル化合物を用いた蛍光プローブの特異性 （選択性） は特に限 定されないが、 好ましくは、 例えば以下の通りである。 すなわち、 スー パーォキサイドまたはメルカプト化合物に対する蛍光応答が、 過酸化水 素に対する蛍光応答の 1 0倍以上であることが好ましく、 2 0倍以上で あることがより好ましく、 1 0 0倍以上であることが特に好ましい。 前 記スーパーォキサイドまたはメルカプト化合物に対する蛍光応答の上限 値は特に限定されないが、 例えば過酸化水素に対する蛍光応答の 1 0 0 0倍以下である。 また、 前記スーパ一オキサイドまたはメルカプト化合 物に対する蛍光応答は、 ヒドロキシルラジカル、 グルコース、 ァスコル ビン酸、 1， 4 —ヒドロキノン、 プロピルァミン、 またはジェチルアミ ンに対する蛍光応答の 1 0倍以上であることが好ましく、 2 0倍以上で あることがより好ましく、 1 0 0倍以上であることが特に好ましく、 上 限値は特に限定されないが、 例えばこれらいずれかの物質に対する蛍光 応答の 1 0 0 0倍以下である。 前記スーパーォキサイドまたはメルカプ ト化合物に対する蛍光応答は、 チトクローム P450リダクタ一ゼ + NADPH 系またはジァフオラーゼ + NADH系に対する蛍光応答と比較した場合は 、 4倍以上が好ましく、 5倍以上がより好ましく、 1 0倍以上がさらに 好ましく、 2 0倍以上が特に好ましく、 上限値は特に限定されないが、 例えばこれらいずれかの系に対する蛍光応答の 1 0 0倍以下である。 な お、 これらは、 スーパーオキサイドまたはメルカプト化合物と前記各物 質とを等モル量で比較した値であるものとし、 測定温度は 3 7 °Cであり 、 励起波長は 485 ± 20 皿であり、 放射波長は 530 ± 20 nmであるものとす る。 ただし、 本発明の蛍光プローブを用いた測定条件がこれに限定され るものではなく、 あらゆる測定条件が可能である。
本発明のスルホン酸エステル化合物をスーパ一ォキサイド検出用プロ ーブに用いる場合は、 特異性 （選択性） の観点から、 前記式 （ I ) 中の 原子団 Aに結合する原子団 B— S 0 3 _ が複数であるスルホン酸エス テル化合物が好ましく、 この場合において、 前記式 （ I ) 中の原子団 B における前記電子吸引基がニトロ基およびトリフルォロメチル基の少な くとも一方を含むことがより好ましく、 前記電子吸引基はニトロ基を含 むことがさらに好ましい。 原子団 Bは、 2, 4—ジニトロフエニル基、 4一 ニトロフエニル基、 2 _ニトロフエニル基、 2—二トロ— （4一トリフル ォロメチル） フエニル基、 2—二トロー 4—メトキシフエニル基、 4一二 トロ— 2—メトキシフエ二ル基、 2 _ニトロ—4—メチルフエニル基、 4一 二トロー 2—メチルフエニル基、 トニトロー 4， 6—ジメチルフエニル基 、 4一二トロー 2， 6—ジメチルフエニル基、 2—ニトロ一 4—クロ口フエ二 ル基、 4—ニトロ一 2—クロ口フエ二ル基、 および 2—ニトロ _ 4 _イソ プロピルフエニル基からなる群から選択される少なくとも一つであるこ とが一層好ましく、 2, 4—ジニトロフエニル基、 2—ニトロ一 （4一トリ フルォロメチル） フエニル基、 2—二トロー 4ーメトキシフエ二ル基、 4 —ニトロ— 2—メトキシフエ二ル基、 2—二トロー 4—メチルフエニル基 、 4—ニトロ— 2—メチルフエニル基、 2—二トロー 4， 6—ジメチルフエ二 ル基、 4一二トロー 2， 6—ジメチルフエニル基、 2—二トロ— 4—クロロフ ェニル基、 4—ニトロ一 2—クロ口フエ二ル基、 および 2—ニトロ一 4 _ イソプロピルフエニル基からなる群から選択される少なくとも一つであ ることがより一層好ましく、 2， 4ージニトロフエニル基であることが特 に好ましい。 また、 前記式 （ I ) 中の原子団 Aに結合する原子団 B— S〇3— が 1つであるスルホン酸エステル化合物をスーパ一ォキサイド 検出用プローブに用いる場合は、 スーパーォキサイド選択性の観点から 、 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸引基がニトロ基を 1 個のみ含むことが好ましい。 このような原子団 Bとしては、 例えば上記 のような、 2 _ニトロフエニル基、 4一二トロフエニル基またはこれらか ら誘導される基等がある。 ただし、 本発明におけるこれら以外のスルホ ン酸エステル化合物もスーパーォキサイド検出用蛍光プローブに当然使 用可能である。
また、 本発明のスルホン酸エステル化合物は、 メルカプト化合物検出 用プローブに用いる場合は、 特異性 （選択性） の観点からは、 前記式 （ I ) 中の原子団 Aに結合する原子団 B— S 0 3 _ が 1つであることが 好ましい。 この場合において、 より高い特異性およびメルカプト化合物 検出能等の観点から、 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸 引基が二ト口基を含むことがより好ましく、 複数の二ト口基を含むこと が特に好ましい。 例えば、 前記式 （ I ) において、 原子団 Bが、 2， 4一 ジニトロフエニル基、 4一二トロフエニル基、 2—二トロフエニル基、 1 —ニトロ— ( 4一トリフルォロメチル) フエニル基、 2—ニトロ—トメ トキシフエ二ル基、 4 _ニトロ一 2—メトキシフエ二ル基、 2—ニトロ— 4 —メチルフエニル基、 4一二トロー 2—メチルフエニル基、 2—二トロー 4, 6—ジメチルフエニル基、 4一二トロ— 2 , 6—ジメチルフエニル基、 - ニトロ一 4一クロ口フエ二ル基、 4—ニトロ— 2—クロ口フエ二ル基、 お よび 2—二トロー 4—ィソプロピルフエニル基からなる群から選択され る少なくとも一つであることがさらに好ましく、 2， 4—ジニトロフエ二 ル基、 2—ニトロ一 （4—トリフルォロメチル） フエニル基、 2—ニトロ —4—メトキシフエ二ル基、 4—ニトロ— 2—メトキシフエ二ル基、 2—二 トロ— 4—メチルフエニル基、 4一二トロー 2—メチルフエニル基、 2—二 トロ一 4, 6—ジメチルフエニル基、 4—ニトロ— 2， 6—ジメチルフエニル 基、 2—ニトロー4一クロ口フエ二ル基、 4—ニトロ一 2—クロ口フエニル 基、 および 2—ニトロ— 4—イソプロピルフエニル基からなる群から選 択される少なくとも一つであることが一層好ましく、 2 , 4—ジニトロフ ェニル基であることが特に好ましい。 しかしながら、 これら以外のスル ホン酸エステル化合物も、 当然メルカプト化合物検出用プローブに使用 可能である。 本発明のスルホン酸エステル化合物における前記式 （ I ) 中の原子団 A—〇においては、 例えば、 〇原子が芳香環または複素芳香環に直接結 合していることが、 蛍光プローブに使用する場合のより高い検出能等の 観点からさらに好ましい。 本発明のスルホン酸エステル化合物において 、 前記原子団 A— Oとスルホニル基との共有結合を切断することにより 形成される蛍光性化合物は、 フルォレセィン、 レゾルフィン、 7—ヒド ロキシクマリン、 1 一ナフトール、 2—ナフトール、 1—ヒドロキシァ ン卜ラセン、 2—ヒドロキシアントラセン、 9ーヒドロキシアントラセ ン、 1—ヒドロキシピレン、 1ーヒドロキシァクリジン、 2—ヒドロキ シァクリジン、 9ーヒドロキシァクリジン、 2—ヒドロキシキノロン、 4ーヒドロキシキノロン、 5—ヒドロキシキノロン、 6—ヒドロキシキ ノロン、 8—ヒドロキシキノロン、 4ーヒドロキシ一 7 —ニトロ一 2— ォキサ一 1， 3 —ジァゾ一ルまたはそれらの誘導体であることが好まし いが、 これらには限定されず、 あらゆる蛍光性化合物が可能である。 な お、 前記蛍光性化合物が 7 _ヒドロキシクマリンであるか、 または 7— ヒドロキシ— 4 _ (トリフルォロメチル) クマリン以外の 7—ヒドロキ シクマリン誘導体である場合は、 前記原子団 Bは、 2, 4—ジニトロフエ ニル基、 2—ニトロ— （4 _トリフルォロメチル） フエニル基、 2—二ト ロー 4ーメトキシフエ二ル基、 4—ニトロ—2—メトキシフエニル基、 2— ニトロ— 4一メチルフエニル基、 4一二トロー 2—メチルフエニル基、 2— ニトロ一 4， 6—ジメチルフエニル基、 4一二トロー 2， 6—ジメチルフエ二 ル基、 2—ニトロ一 4—クロ口フエ二ル基、 4—ニトロー2—クロ口フエ二 ル基、 または 2—ニトロ— 4一イソプロピルフエニル基であることがより 好ましい。 前記フルォレセイン誘導体は、 フルォレセインの 2位、 4位 、 5位および 7位のうち少なくとも一つが炭素数 1〜6の直鎖もしくは 分枝アルキル基、 またはハロゲンで置換された誘導体であり、 前記 7— ヒドロキシクマリン誘導体は、 7—ヒドロキシクマリンの 4位が炭素数 1〜6の直鎖もしくは分枝アルキル基、 またはトリフルォロメチル基で 置換された誘導体であることがより好ましい。 前記原子団 A— 0とスル ホニル基との共有結合を切断することにより形成される蛍光性化合物と して特に好ましい化合物の具体例は、 例えば、 フルォレセイン、 2 , 7 ージクロロフルォレセィン、 2， 7ージフルオロフルォレセィン、 4， 5—ジフルオロフルォレセイン、 2， 4 , 5 , 7—テトラフルオロフル ォレセイン、 2 , 7ージメチルフルォレセィン、 4， 5ージメチルフル ォレセイン、 2 , 4 , 5， 7—テトラメチルフルォレセイン、 2， 7 - ジィソプロピルフルォレセィン、 2， 7 _ジー t—ブチルフルォレセィ ン、 2 , 7—ジメトキシフルォレセィン、 2， 4—ジフルオロー 5， 7 ージメチルフルォレセィン、 レゾルフィン、 2 , 8—ジクロロレゾルフ イン、 7—ヒドロキシー 4一 (卜リフルォロメチル) クマリン、 および 7—ヒドロキシー 4ーメチルクマリンである。 次に、 本発明のスルホン酸エステル化合物は、 例えば下記式（i；)〜 (iv)のいずれかで表されることがより好ましい。
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000021_0003
Figure imgf000021_0004
式（i)〜（iv)中、
X1、 X2、 Y1および Y2は、 それぞれ水素原子、 炭素数 1〜6の直鎖 もしくは分枝アルキル基、 またはハロゲンであり、 同一でも異なってい ても良く、
X 3は炭素数 1〜 6の直鎖もしくは分枝アルキル基、 またはトリフルォ ロメチル基であり、
R1および R3は、 それぞれ水素原子、 ニトロ基、 メチル基、 クロ口 基またはメトキシ基であり、 同一でも異なっていても良く、
R2および R4は、 それぞれ水素原子、 ニトロ基、 トリフルォロメチ ル基、 メチル基、 イソプロピル基、 クロ口基またはメトキシ基であり、 同一でも異なっていても良く、
かつ、 R1および R2のうち少なくとも一方はニトロ基であり、 R3およ び R4のうち少なくとも一方はニトロ基であり、 式（iv)中、 X3が炭素数 1〜6の直鎖もしくは分枝アルキル基である場合は、 R1および R 2はい ずれも水素原子以外の基である。
メルカプト化合物検出用プローブに用いる場合は、 前記式（ii)〜（iv) のいずれかで表され、 R1および R2のうちいずれもがニトロ基であるこ とがさらに好ましい。
本発明のスルホン酸エステル化合物の特に好ましい例としては、 例え ば、 下記式 1および 3〜 8のいずれかで表される化合物がある。
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
Figure imgf000023_0004
Figure imgf000023_0005
OO'SOO/S I OAV lSZ,L00^00Zdf/13d 式 1および 8中、 X1、 X2、 ェぉょび ま、 それぞれ水素原子、 メチル基またはハロゲンであり、 同一でも異なっていても良く、 式 4、 5および 6中、 R1は水素原子、 ニトロ基、 メチル基、 クロ口基または メトキシ基であり、 R2は水素原子、 ニトロ基、 トリフルォロメチル基 、 メチル基、 イソプロピル基、 クロ口基またはメトキシ基であり、 かつ 、 R1および R2のうち少なくとも一方はニトロ基である。
これらのうち、 スーパーォキサイド検出用プローブに用いる場合は、 下記式 l a〜 l d、 3、 4 a〜4 e、 5 a、 5 b、 6 aおよび 6 bのう ちいずれかで表されるスルホン酸エステル化合物が特に好ましく、 メル カプト化合物検出用プローブに用いる場合は、 下記式 5 a、 6 a、 7、 8 a、 8 bおよび 8 cのうちいずれかで表されるスルホン酸エステル化 合物が特に好ましい。
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000025_0003
8a: X=Y=H
8b: X=CH3， Y=H 8c: X=H, Y=CH3 前記一般式 （I) で表される本発明のスルホン酸エステル化合物の製 造方法は特に限定されず、 公知のスルホン酸エステル化合物の製造方法 等を適宜用いることができるが、 例えば、 下記式 （Π) の化合物と下記 式 （III) の化合物とを化合させる工程を含む製造方法により製造する ことができる。
Figure imgf000026_0001
(II) (III) 式 （III) 中、 X5はハロゲンであり、 Aおよび Bは前記式 （I) と 同じである。 また、 前記式 （Π) の化合物としては、 例えば前記蛍光性 化合物等が使用でき、 好ましい蛍光性化合物は例えば前述の通りである 。 すなわち、 式 （II) の化合物としては、 例えば、 下記式で表されるフ ルォレセインおよびその誘導体、 レゾルフイン、 7—ヒドロキシ—4— (トリフルォロメチル) クマリン、 7—ヒドロキシ— 4ーメチルクマリ ン等の蛍光色素があるが、 これらに限定されず、 種々の化合物を使用で さる。
、ゝ
、 ―ノ し ΌΗ
蛍光色素
Figure imgf000027_0001
フノレ才レセイン
(fluorescein)
7—ヒドロキシー 4一
(トリフノレオロメチノレ)クマリン
Figure imgf000027_0002
[7-hydroxy-4- (tnfluoromethyl)
coumarm]
Figure imgf000027_0003
7—ヒドロキシ一 4_
メチルクマリン
[7-hydroxy-4-methylcouraarinj
なお、 本発明で 「ハロゲン」 とは、 任意のハロゲン元素を指すが、 例 えば、 フッ素、 塩素、 臭素およびヨウ素があげられる。 ハロゲン化アル キル基としては、 特に限定されないが、 例えば、 メチル基、 ェチル基、 n -プロピル基、 イソプロピル基、 n-ブチル基、 イソブチル基、 sec-プチ ル基および t er t-ブチル基等をそれぞれハロゲン化した基があげられ、 トリフルォロメチル基が特に好ましい。
前記式 （ I ) で表される化合物に互変異性体、 立体異性体、 光学異性 体等の異性体が存在する場合は、 それら異性体も本発明の化合物に含ま れる。 さらに、 前記式 （ I ) の化合物およびその他本発明に係る化合物 が塩を形成し得る場合は、 その塩も本発明の化合物に含まれる。 前記塩 は特に限定されず、 例えば酸付加塩でも塩基付加塩でも良く、 さらに、 前記酸付加塩を形成する酸は無機酸でも有機酸でも良く、 前記塩基付加 塩を形成する塩基は無機塩基でも有機塩基でも良い。 前記無機酸として は、 特に限定されないが、 例えば、 硫酸、 リン酸、 塩酸、 臭化水素酸お よび、 ヨウ化水素酸等があげられる。 前記有機酸も特に限定されないが 、 例えば、 p—トルエンスルホン酸、 メタンスルホン酸、 シユウ酸、 p 一ブロモベンゼンスルホン酸、 炭酸、 コハク酸、 クェン酸、 安息香酸お よび酢酸等があげられる。 前記無機塩基としては、 特に限定されないが 、 例えば、 水酸化アンモニゥム、 アルカリ金属水酸化物、 アルカリ土類 金属水酸化物、 炭酸塩および炭酸水素塩等があげられ、 より具体的には 、 例えば、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウム、 炭酸カリウム、 炭酸ナ トリウム、 炭酸水素ナトリウム、 炭酸水素カリウム、 水酸化カルシウム および炭酸カルシウム等があげられる。 前記有機塩基も特に限定されな いが、 例えば、 エタノールァミン、 トリェチルァミンおよびトリス （ヒ ドロキシメチル） ァミノメタン等があげられる。
前記本発明の化合物の塩の製造方法も特に限定されず、 例えば、 本発 明の化合物に、 前記のような酸や塩基を公知の方法により適宜付加させ る等の方法で製造することができる。
本発明の蛍光プローブは、 前記本発明のスルホン酸エステル化合物を 含むことにより、 スーパ一ォキサイドゃメルカプト化合物に対し高い選 択性を示す。 したがって、 本発明の蛍光プロ一ブは感度および精度に優 れ、 本発明の蛍光プローブ、 またはそれを用いたスーパーオキサイド検 出方法もしくはメルカプト化合物検出方法は、 例えばバイオイメージン グ方法等への応用に適している。 したがって、 本発明のスルホン酸エス テル化合物は臨床分析用試薬等の用途にも適する。
なお、 本発明のスルホン酸エステル化合物の構造はその用途により限 定されないが、 用途に応じて構造を適宜選択して使用することが好まし い。 スーパ一ォキサイド検出用蛍光プローブまたはメルカプト化合物検 出用プローブに本発明の化合物を用いる場合、 それぞれの用途に好まし い化合物は、 特異性 （選択性） の観点から前述の通りである。 本発明の 蛍光プローブは、 これら本発明の化合物を含むことにより、 スーパーォ キサイドまたはメルカプト化合物に対し高い特異性 （選択性） と検出能 を有することが可能である。 本発明の蛍光プローブは、 前記の通りバイオイメージング等の用途に 適しているが、 これ以外にも種々の用途に使用可能である。 本発明のス —パ一ォキサイド検出用蛍光プローブの用途は特に限定されないが、 例 えば、 ブロッテイング （転写） を用いたアツセィ方法、 スーパ一ォキサ イドジスムターゼ定量方法、 機能性食品または医薬のスーパーォキサイ ド消去能測定方法、 臨床分析方法、 および医薬のスクリーニング方法等 に適している。 また、 本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブの 用途は特に限定されないが、 例えば、 キナーゼアツセィ方法、 ァセチル コリンエステラーゼアツセィ方法、 ブロッテイング (転写) を用いたァ ッセィ方法、 臨床分析方法、 および医薬のスクリーニング方法に適して いる。 以下、 これらの方法についてより具体的に説明する。 ブロッテイング （転写） を用いたアツセィ方法とは、 支持体上にプロ ッティング （転写） した物質を本発明の蛍光プロ一ブを用いて検出する 工程を含むアツセィ方法である。 その操作等は特に限定されず、 前記物 質を前記支持体上で本発明の蛍光プローブと反応させる以外は公知の手 法を適宜用いることができる。 前記支持体も特に限定されず、 例えばァ ガロースゲル、 ポリアクリルアミドゲル、 ニトロセル口一ス膜、 ナイ口 ン膜等の公知の物が使用可能である。 例えば本発明の蛍光プローブおよ び前記支持体を含むキットを適宜設計することにより、 前記プロッティ ングを用いたアツセィ方法に使用することができる。
次に、 本発明のス一パーオキサイド検出用蛍光プローブを用いたス一 パーォキサイド定量方法は、 本発明のスーパーォキサイド検出用蛍光プ ローブをスーパーォキサイドと反応させた後の蛍光応答を、 前記反応を スーパーォキサイドジスムタ一ゼ含有試料の存在下で行なった場合と非 存在下で行なった場合とで比較することにより行なう。 例えば、 前記ス ーパ一オキサイドジスムタ一ゼ含有試料として、 ヒトもしくは動物の体 液またはその体液から抽出した試料を用いて前記スーパーォキサイドジ スム夕ーゼ定量方法を行なうことにより、 前記ヒトまたは動物の体液中 のス一パーォキサイドジスムタ一ゼ濃度を測定することができる。 さら に、 前記スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法は、 例えば、 機能性 食品または医薬のスーパ一ォキサイド消去能測定にも応用することがで きる。 すなわち、 前記スーパーオキサイドジスムターゼ定量方法を用い てヒトまたは動物の体液中におけるス一パーォキサイドジスムターゼ濃 度を測定する工程と、 その後前記ヒトまたは動物に機能性食品または医 薬を投与する工程と、 投与後に再び前記スーパーォキサイドジスム夕ー ゼ定量方法を用いて前記ヒトまたは動物の体液中におけるスーパ一ォキ サイドジスムターゼ濃度を測定する工程とを含む方法により、 前記機能 性食品または医薬のスーパ一ォキサイド消去能を測定することができる 。 例えばこれらの測定方法を用いてヒトまたは動物に対するアツセィを 行なうことにより、 スーパ一オキサイドに関連する疾患の治療、 予防ま たは症状の軽減のための医薬のスクリーニングを行なうことも可能であ る。 そして、 これら測定方法に適したキットは、 本発明のスーパーォキ サイド検出用プローブを含むキットを適宜設計することにより得られる 次に、 本発明のメルカプト化合物検出用プローブを用いたキナーゼァ ッセィ方法は、 例えば、 キナ一ゼおよびァ- S-ATPを用いて基質をチオリ ン酸化する工程と、 前記チォリン酸化された基質を本発明のメルカプ卜 化合物検出用プローブを用いて検出する工程とを含む。 前記基質として は、 例えばタンパク質が使用できる。 すなわち、 キナーゼおよび ATPに よりタンパク質をリン酸化するところ、 ATPに代えてァ- S-ATPを用いれ ば、 タンパク質をチォリン酸化することができる。 そのチォリン酸化夕 ンパク質を本発明のメルカプト化合物検出用プローブにより検出するこ とでキナーゼアツセィ方法を行なうことができるのである。 前記キナー ゼアツセィ方法は、 抗体を用いて前記キナーゼを試料から分離する工程 をさらに含むことが好ましい。 このキナーゼアツセィ方法に適したキッ トは、 例えば、 本発明のメルカプト化合物検出用プローブ、 ァ -S-ATPお よび基質を含むキットを適宜設計することで得られ、 キナーゼの抗体を さらに含むことが好ましい。
次に、 本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブを用いたァセチ ルコリンエステラーゼアツセィ方法は、 例えば、 ァセチルチオコリンと ァセチルコリンエステラーゼとの反応によりチォコリンを生じさせるェ 程と、 前記チォコリンを本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブ を用いて検出する工程とを含む。 このァセチルコリンエステラーゼアツ セィ用キットは、 本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブおよび ァセチルチオコリンを含むキットを適宜設計することで得られる。 ' 以下、 一般的なキナーゼアツセィおよびァセチルコリンエステラーゼ
(AChE)ァッセィについて説明するとともに、 前記本発明のキナ一ゼァッ セィおよびァセチルコリンエステラーゼ（AChE)アツセィの利点について 述べる。
AChE やキナーゼ等の酵素の場合、 その発現量よりむしろ活性量が生 命現象と深く関与する。 それらの簡便な酵素活性アツセィ法の開発は、 臨床的観点から非常に重要であるとともに、 新薬開発という視点からも 非常に意義深い。 すなわち、 酵素活性の測定法は、 ある疾病に対する病 態の診断法として利用できるだけでなく、 新薬シーズとなる酵素阻害剤 のスクリーニング法としても活用できる。 診断法およびスクリーニング 法のどちらの目的に利用する場合においても、 アツセィ法は、 操作的に 簡便で、 短時間で測定できる、 環境に優しい手法であることが好ましい 従来用いられてきた AChE またはキナーゼのアツセィ法の一つに、 RI で標識した基質 ac e ty l cho l i ne (3H 標識） または ATP (32P 標識） を 用いるラジオアツセィがある。 この手法には高感度という利点があるが 、 RI を使用するため、 環境に対する影響という観点から問題がある。 AChE アツセィについては別法として E l lman ' s reagent を使う方法が あるが、 前述の通り感度に関する問題点がある。
さらに、 キナーゼアツセィ法について非放射性手法として、 ェンザィ ムィムノアッセィが従来から用いられている。 これらの操作手順は以下 の 2種類がある。 すなわち、 （1 ) 固定化基質のリン酸化—酵素修飾抗 体によるリン酸化基質との抗原抗体反応—洗浄—酵素反応による発色ま たは化学発光—検出、 および （2 ) 固定化基質のリン酸化→ピオチン修 飾抗体によるリン酸化基質との抗原抗体反応 洗浄→ 7ビジン修飾酵素 との複合体形成—洗浄→酵素反応による発色または化学発光—検出、 と いう手順である。 これらの手法には、 リン酸化された基質に対して特異 的な修飾抗体が必ず必要である、 という問題点がある。
前記本発明のキナーゼアツセィおよびァセチルコリンエステラーゼ (AChE)アツセィの利点について述べれば、 以下の通りである。 すなわち 、 まず、 操作が簡便である。 具体的には、 AChE アツセィでは、 酵素反 応と発蛍光反応を同時に行なうこともでき、 キナーゼアツセィでは、 酵 素反応の後発蛍光反応を行なうという簡単な操作で測定することも可能 であり、 試薬として酵素基質とプロ一ブのみを用いて測定することもで きる。 さらに、 本発明のメルカプト化合物検出用蛍光プローブを用いる 測定方法の検出感度は、 化学発光のそれに匹敵し得ることも期待できる 前記本発明のァセチルコリンエステラーゼアツセィ方法またはキナー ゼアツセィ方法を用いてヒトまたは動物に対するアツセィを行なうこと により、 例えば、 アセチルコリンまたはキナーゼに関連する疾患の治療 、 予防または症状の軽減のための医薬のスクリーニングを行なうことも できる。 前記アセチルコリンまたはキナーゼに関連する疾患は、 特に限 定されないが、 例えば、 癌、 アルツハイマー病、 高血圧症、 狭心症、 心 筋梗塞等の動脈硬化性疾患、 関節炎等の炎症性疾患、 および種々の代謝 性疾患等が挙げられる。
以上説明したような本発明のス一パーォキサイド検出用プローブおよ びメルカプト化合物検出用プローブを用いてヒトまたは動物に対するァ ッセィを行なうことにより、 様々な臨床分析方法を実施することができ る。 このため、 本発明のスルホン酸エステル化合物は、 前記の通り臨床 分析用試薬の用途に適し、 また、 この臨床分析用試薬を含むキットを適 宜設定することで、 様々な用途に適した臨床分析用キッ卜が得られる。 また、 本発明のスルホン酸エステル化合物は、 メルカプト化合物検出 用蛍光プローブの製造のために使用することもできる。 さらに、 本発明 のスルホン酸エステル化合物は、 キナーゼアツセィ用蛍光プローブの製 造、 アセチルコリンエステラーゼアツセィ用蛍光プローブの製造、 また はブロッティング法に用いる蛍光プローブの製造のために使用すること も可能である。 以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。 しかし、 この実 施例は本発明の例示に過ぎず、 本発明はこれに限定されない。
(実施例 1 )
本実施例では、'前記化合物 la— ld、 3、 4a, 4b、 5a、 5b、 6aおよび 6bを合 成し、 さらに、 これら化合物のスーパーオキサイド検出用蛍光プローブ としての機能を評価した。 また、 細胞系への応用試験も行なった。
(測定条件等）
核磁気共鳴 （NMR) スペクトルは、 測定機器として、 JE0L社製 EX- 270 (商品名） H測定時 270 MHz) を用いて測定した。 ケミカルシ フトは百万分率 （p pm) で表している。 内部標準 O p pmには、 テト ラメチルシラン （TMS) を用いた。 結合定数 （J) は、 ヘルツで示し ており、 略号 s、 d、 t、 q, mおよび b rは、 それぞれ、 一重線 (singlet), 二重線（doublet)、 三重線（triplet)、 四重線（quartet)、 多 重線（mult iplet)および広幅線（broad)を表す。 質量分析 （MS) は、 JE0L 社製 JMS-700 (商品名） を用い、 高分解能 （HRMS) Z高速原子衝撃法 （ FAB) により行った。 赤外吸収 （ I R) スペクトルは、 日本分光株式会 社製 VALOR- III (商品名） を用い、 KB r法により行った。 元素分析は 、 ャナコ株式会社製 CHN CORDER MT-5 (商品名） を用いて行った。 融点 は、 ャナコ株式会社製 MP- S3 (商品名） を用いて測定した。 蛍光強度測 定は、 特に示さない限り、 米国 PerSeptive Biosystems社製の機器 CytoFluor II mul t i el 1 fluorescence plate reader (商品名^) を用レ ^ 、 励起 （excitation) および放射 （emission) フィルターをそれぞれ 485±20 および 530±25 Mにセットして行なった。 カラムクロマトグ ラフィー分離には、 シリカゲル （メルク社製、 シリカゲル 6 0 (商品名 ) ) を用いた。 全ての化学物質は、 試薬級であり、 特に示さない限り、 アルドリツチ社、 ランカスター社、 東京化成株式会社、 ナカライテスク 株式会社、 および和光純薬株式会社のいずれかから購入した。
(合成）
[la—Id の合成]
化合物 la— Idは全て同様の方法により合成した。 すなわち、 まず、 それ ぞれに対応するフルォレセイン 2a— 2d を準備した。 具体的には、 2aおよ び 2bは市販品を使用し、 2cおよび 2dは W.- C. Sun, K. R. Gee, D. H. Klaubert, R. P. Haungland, J. Org. Chem. 1997, 62, 6469- 6475.に 記載の方法で合成した。 次に、 このフルォレセイン （1.0 g) と 2, 4 ージニトロベンゼンスルホニルクロリ ド (2.2 eq) のジクロロメタン (20 mL) 懸濁液に 0 で 2, 6—ルチジン （5.0 mL) を加えた。 得られ た混合液を室温で 4〜 6時間撹拌した。 反応液をジクロロメタン （200 mL) で希釈し、 1M塩酸 （200 mL X 2) および飽和食塩水 （200 mL) で洗 浄し、 硫酸マグネシウムにより乾燥した。 減圧下溶媒を留去し得た残渣 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン) により精製 して目的物を得た。 以下に、 化合物 la— Idの収量および機器分析値を示 す la: 1.4 g (59%) as slightly ye 1 low powder. m. p. 131- 135° C. 'H-薩 R (270 MHz, d6-DMSO, TMS)： δ = 9.11 (d, H,H = 2.3 Hz, 2H; aromatic), 8.62 (dd, 3JH，H = 8.6 Hz, 4JH,H = 2.3 Hz, 2H; aromatic), 8.36 (d, 3JH,H = 8.6 Hz, 2H; aromatic), 8.05 (d, 3JH,H = 7.3 Hz, IH; aromatic), 7.85-7.73 (m, 2H, aromatic), 7.39-7.36 (m, 3H; aromatic), 7.00-6.98 (m, 4H; aromatic). FTIR (KBr)： リ = 1770 (CO, s), 1557 (N02, s)， 1541 (N02, s) cm—1. FAB HRMS calcd for C32H17N4017S2 (MH+) : 793.0030; found: 793.0017. lb: 1.0 g (47%) as slightly yellow powder. m. p. 199- 202。 C. 'H-NMR (270 MHz, d6— DMSO, TMS)： δ = 9.12 (d, 4JHiH = 2.1 Hz, 2H; aromatic), 8.66 (dd, 3JH,H = 8.7 Hz JH,H = 2.1 Hz, 2H;
aromatic), 8.43 (d， 3JH;H = 8.7 Hz, 2H; aromatic), 8.05 (d, 3JH>H = 7.4 Hz, IH; aromatic), 7.86-7.74 (m, 2H, aromatic), 7.59 (s, 2H; aromatic), 7.43 (d, 3JH;H = 7.4 Hz, IH; aromatic), 7.23 (s， 2H; aromatic). FTIR (KBr)： リ = 1773 (CO, s), 1558 (N02, s), 1541 (N02, s) cm-1. Elemental analysis (%) calcd for C32H14C12N4017S2: C 44.61, H 1.64, N 6.50; found: C 44.54, H 1.82, N 6.27. FAB HRMS calcd for C32H15C12N4017S2 (MH+)： 860.9251; found: 860.9221. lc: 1.5 g (67¾) as a white crystal. m. p. 140—146° C (from AcOEt). 'H-匪 R (270 MHz, d6_DMS0, TMS)： δ = 9.13 (d, JH;H = 2.0 Hz, 2H; aromatic), 8.66 (dd, 3JHiH = 8.7 Hz,4JH,H = 2.0 Hz, 2H;
aromatic), 8.43 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 2H; aromatic), 8.04 (d, 3JH,H = 7.3 Hz, 1H; aromatic), 7.85-7.32 (m, 2H, aromatic), 7.58 (d, JH;F = 6.3 Hz, 2H; aromatic), 7.43 (d, 3JH,H= 7.4 Hz, 1H; aromatic), 7.13 (d， 3JHiF = 10.2 Hz, 2H; aromatic). FTIR (KBr)： v = 1774 (CO, s)， 1557 (N02, s), 1542 (N02, s) cm一1. Elemental analysis (%) calcd for C32H14F2N4017S2-C4H802: C 47.17, H 2.42, N 6.11; found: C 47.20, H 2.47, N 6.03. FAB HRMS calcd for C32H15F2N4017S2 (MH+)： 828.9842; found: 828.9847.
Id: 1.1 g (51%) as a white crystal. m.p. 155-160° C (from AcOEt-hexane). -薩 R (270 MHz, CDC13， TMS)： δ = 8.74 (d, 4JH,H = 2.1 Hz, 2H; aromatic), 8.63 (dd， 3JH,H = 8.7 Hz , 4JH，H = 2.1 Hz, 2H; aromatic), 8.40 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 2H; aromatic), 8.09 (d, 3JH,H= 6.9 Hz, 1H; aromatic), 7.83-7.72 (m, 2H, aromatic), 7.21 (d，
Figure imgf000037_0001
2.1 Hz, 2H; aromatic). FTIR (KBr)： v = 1775 (CO, s)， 1558 (N02, s) , 1542 (N02, s) cm—1. Elemental analysis (%) calcd for C32H12F4N4017S2: C 44. 5, H 1.64, N 6. 8; found: C 44.35, H 1.64, N 6.24. FAB HRMS calcd for C32H13F4N4017S2 (MH+)： 864.9653; found: 864.9625.
[3 の合成]
テトラフルオロフルォレセイン 2d (1.0 g) と 2—ニトロ一 4一 （トリ フルォロメチル) ベンゼンスルホニルクロリ ド (2.2 eq) のジクロロメ タン （20 mL) 懸濁液に 0°Cで 2, 6—ルチジン （5.0 mL) を加えた。 得られた混合液を室温で 4時間撹拌した。 反応液をジクロロメタン (200 mL) で希釈し、 1M塩酸 （200 mL x 2) および飽和食塩水 （200 mL) で洗浄し、 硫酸マグネシウムにより乾燥した。 減圧下溶媒を留去し 得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ジクロロメタン） に より精製して目的物を得た。 以下にこの化合物の収量および機器分析値 を示す。
3: 2.1 g (92%) as a white crystal. m. p. 138-142° C (from AcOEt). Ή-NMR (270 MHz, d6- DMS0， TMS)： δ = 8.84 (s, 2H;
aromatic), 8.47 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 2H; aromatic), 8.40 (d， 3JH,H = 8.4 Hz, 2H; aromatic), 8.05 (d, 3JHiH = 6.9 Hz, 1H; aromatic), 7.86-7.74 (m, 2H, aromatic), 7.46 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H;
aromatic), 7.15 (dd, 3JHjF = 10.2 Hz, 4JH>F = 2.1 Hz, 2H; aromatic). FTIR (KBr)： ソ = 1776 (CO, s) , 1557 (N02, s) cm—1. Elemental analysis (%) calcd for C34H12F10N2013S2-C4H802 : C 45.70, H 2.02, N 2.81; found: C 45.56, H 1.82, N 2.73. FAB HRMS calcd for C34H!3F10N2013S2 (MH+)： 910.9699; found: 910.9674.
[4a および 4b の合成]
4aおよび 4bはいずれも同様の方法により合成した。 すなわち、 まず、 テ トラフルオロフルォレセイン 2d (2.0 g) と 2—二トロ一 4 _ (トリフ ルォロメチル） ベンゼンスルホニルクロリ ドまたは 4一二トロベンゼン スルホニルクロリ ド（1.1 eq) とのジクロロメタン （20 mL) 懸濁液に 0 °Cで 2， 6—ルチジン （1.1 eq) を加えた。 次に、 得られた混合液を室 温で 4時間撹拌した。 反応液をジクロロメタン （200 mL) で希釈し、 1M 塩酸 （200 mL) および飽和食塩水 （200 mL) で洗浄し、 硫酸マグネシゥ ムにより乾燥した。 減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲルカラムク 口マトグラフィー （ジクロロメタン一アセトン =20 ： 1) により精製 して目的物を得た。 以下に化合物 4aおよび 4bの収量および機器分析値を 示す。
4a: 0.72 g (22%) as yellow powder. m.p. 118-135° C (from AcOEt-hexane). 匪 R (270 MHz, CD3CN, TMS)： δ = 8.36 (d, 4JH>H = 1.2 Hz, 1H; aromatic), 8.32 (d, 3JH,H = 8.2 Hz, 1H; aromatic), 8.19-7.99 (m， 1H; aromatic), 7.82-7.70 (m, 2H; aromatic), 7.27- 7.24 (m， 1H, aromatic), 6.68 (dd, 3JH，F = 10.1, 3JH,H = 2.4 Hz, 1H; aromatic), 6.49 (dd, 3JH,F = 10.1 Hz, 4JH,F = 2.4 Hz, 2H; aromatic) . FTIR (KBr)： v = 3208 (OH, br), 1766 (CO, s)， 1557 (N02, s) cm"1. FAB HRMS calcd for C27HUF7N09S (MH+) : 658.0043; found: 658.0040.
4b: 0.6 g (21%) as yellow powder. m.p. 245-250° C (from AcOEt-hexane). Ή-NMR (270 MHz, CD3CN, TMS)： 6 = 8.45-8.40 (m, 2H; aromatic), 8.24-8.20 (m, 2H; aromatic), 8.02-7.99 (m, 1H; aromatic), 7.82-7.70 (m, 2H; aromatic), 7.27-7.23 (m， 1H, aromatic), 6.64 (dd, 3JH,F = 10.1, 3JHiH = 2.3 Hz, 1H; aromatic), 6.47 (dd, 3JH>F = 10.9 Hz, 4JH,F = 2.3 Hz, 2H; aromatic)). FTIR (KBr)： y = = 3183 (OH, br), 1747 (CO, s), 1538 (N02, s) cm"1. Elemental analysis (%) calcd for C26HuF4N09S : C 52.98, H 1.88, N 2.38; found: C 53.01, H 2.15, N 2.23. FAB HRMS calcd for C26H12F4N09S (MH+)： 590.0169; found: 590.0161.
[5a および 5b の合成]
5aおよび 5bはいずれも同様の方法により合成した。 すなわち、 まず、 5a または 5bに対応するレゾルフイン ·ナトリウム塩 （2.0 g) のピリジン (20 mL) 懸濁液に一 40 °Cで 2, 4—ジニトロベンゼンスルホニルクロ リ ドまたは 2—二トロー 4一 （トリフルォロメチル） ベンゼンスルホ二 ルクロリ ド （1.1 eq) を加えた。 次に、 得られた混合液を一 40〜一 2 0°Cで 4時間撹拌した。 反応液をジクロロメタン （200 mL) で希釈し、 1M 塩酸 （200 mL x 2) および飽和食塩水 （200 mL) で洗浄し、 硫酸マ グネシゥムにより乾燥した。 減圧下溶媒を留去し得た残渣をシリカゲル カラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン一アセトン = 2 0 ： 1 ) に より精製して目的物を得た。 以下に収量および機器分析値を示す。 5a: 0.9 g (24%) as an orange crystal. m. p. 213-215° C
(from benzene). 'H-匪 R (270 MHz, [D] 6DMS0, TMS)： δ = 9.13(s, 1H; aromatic), 8.62 (d, 3JH>H = 8.7 Hz, 1H; aromatic), 8.34 (d, 3JH'H= 8.7 Hz, 1H; aromatic), 7.90 (d， 3JH,H = 8,7 Hz, 1H;
aromatic), 7.55 (d, 3JH，H = 9.8 Hz, 1H; aromatic), 7.47 (s， 1H, aromatic), 7.25 (d， 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; aromatic), 6.85 (d， 3JH>H = 9.8 Hz, 1H; aromatic), 6.29 (s， 1H; aromatic). FTIR (KBr)： リ = 1622 (CO, s), 1558 (N02, s), 1517 (N02, s) cm— Elemental analysis (%) calcd for C18H9N309S: C 48.76, H 2.05, N 9.48, S 7.23; found: C 48.88, H 2.27, N 9.26, S 7.17.
5b: 1.2 g (30 ) as an orange crystal. m. . 204-207° C (from AcOEt). 'H-醒 R (270 MHz, CDC13, TMS)： δ = 8.35 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 1H; aromatic), 8.15 (s， 1H; aromatic), 8.01 (d, 3JH,H = 8.1 Hz, 1H; aromatic), 7.81 (d, 3JH,H = 8.4 Hz, 1H; aromatic), 7.42 (d， 3JH,H= 9.7 Hz, 1H; aromatic), 7.27-7.23 (m, 2H,
aromatic), 6.87 (dd， 3JH,F = 9.7， 3JH,H = 2.0 Hz, 1H; aromatic), 6.33 (d, 4JH>H - 2.0 Hz, 1H; aromatic). FTIR (KBr)： v = 1647 (CO, s), 1561 (N02, s) cm—1. Elemental analysis (¾) calcd for C19H9F3N207S: C 48.93, H 1.95, N 6.01; found: C 48.75, H 2.05, N 5.76. FAB HRMS calcd for C19H10F3N207S (MH+)： 467.0161; found: 467.0149.
[6a および 6b の合成]
6a および 6bはいずれも同様の方法で合成した。 すなわち、 まず、 7— ヒドロキシ一 4一 （トリフルォロメチル） クマリン（1.0 g) と 2， 4一 ジニトロベンゼンスルホニルクロリ ドまたは 2—二トロー 4— (トリフ ルォロメチル） ベンゼンスルホニルクロリ ド (1.1 eq) とのジク口ロメ タン （20 mL) 懸濁液に 0°Cでトリエチルァミン （1.1 eq) を加えた。 次に、 得られた混合液を室温で 1時間撹拌した。 反応液をジクロ口メタ ン （200 mL) で希釈し、 1M塩酸 （200 mL) および飽和食塩水 （200 mL) で洗浄し、 硫酸マグネシウムにより乾燥した。 減圧下溶媒を留去し得た 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン) により 精製して目的物を得た。 以下に収量および機器分析値を示す。
6a: 1.9 g (95%) as a white crystal. m.p. 123-124.5° C (from benzene). Ή-NMR (270 MHz, [D]6- DMS0, TMS)： δ = 9.13 (d, 4JH,H= 2.3 Hz, 1H; aromatic), 8.64 (dd, 3JH,H = 8.7 Hz, 4JH>H = 2.3 Hz, 1H; aromatic), 8.35 (d, 3JHjH = 8.7 Hz, 1H; aromatic), 7.79 (dd, 3JH,H= 8.9 Hz, 3JH,H= 1.5 Hz, 1H; aromatic), 7.54 (d, 4JH,H = 2.5 Hz, 1H, aromatic), 7.32 (dd, 3JH,H= 8.9， 4JH,H = 2.5 Hz, 1H; aromatic), 7.15 (s, 1H; aromatic). FTIR (KBr)： v = 1751 (CO, s), 1558 (N02, s)， 1542 (N02, s) cm—1. Elemental analysis (%) calcd for C16H7 F3N209S: C 41.75, H 1.53, N6.09; found: C 41.74, H 1.63, N 5.92. FAB HRMS calcd for C16H8F3N209S (MH+)： 460.9903; found: 460.9888. 6b: 2.0 g (95¾) as a white crystal. m.p. 134.5-136° C
(from AcOEt-hexane). Ή-NMR (270 MHz, [D] 6-DMS0, TMS)： δ =
8.82 (s, 1H; aromatic), 8.33 (d, 4JH,H = 1.5 Hz, 2H; aromatic),
7.83 (dd, 3JHiH= 8.9 Hz, 4JH，H = 1.8 Hz, 1H; aromatic), 7.57 (t, 4JH,H= 2.2 Hz, 1H; aromatic), 7.34 (dt, 3JH,H = 8.9 Hz, 4JH,H = 2.2 Hz, 1H, aromatic), 7.15 (s, 1H; aromatic). FTIR (KBr)： v = 1752 (CO, s), 1557 (N02, s) cm—1. Elemental analysis (%) calcd for C17H7F6N07S: C 42.25, H 1.46, N 2.90; found: C 42.24, H 1.55, N 2.72. FAB HRMS calcd for C17HsF6N07S (MH+) : 483.9926; found: 483.9925.
(スーパーォキサイド選択性蛍光プローブとしての評価）
化合物 la〜ldについてス一パーォキサイドとの反応性を調べたところ、 いずれもスーパーォキサイドと反応して蛍光応答を示すが、 Idが感度等 の点で特に優れていることが分かった。 そこで次に、 主として前記化合 物 Idを試験用化合物として用いてスーパ一ォキサイド選択性蛍光プロ一 ブとしての性能を評価し、 さらに細胞系での試験も行なった。 以下、 こ れらの試験について説明する。
[ 1 - 1. スーパーオキサイドに対する反応性]
以下のようにして、 化合物 Idとスーパーオキサイドとの反応性を試験し た。 すなわち、 化合物 Id (0.25 匪 ol)を、 K02 (5 eq)とともに、 DMS0と H 7. 4の 10 mM HEPES緩衝液との混合液（1 : 1) 中、 室温で 10分間反応さ せたところ、 フルォレセイン誘導体 2dに由来する蛍光が確認された。 生 成物を調べたところ、 I dは完全に消費されていることが分かり、 さらに 0. 24 腿 o lの 2, 4—ジニトロフエノールが単離された。 生成物の同定は、 -醒1、 IRおよびマススぺクトルを市販の化合物と比較することにより 行なった。 この反応機構は明らかではないが、 例えば下記スキーム 7の ように推定される。 K02が大過剰存在したにも関わらず 2， 4—ジニトロフ ェノ一ルの発生量は I dに対しほぼ 1等量であったことから、 二度目の脱 離反応 （17dから 2dへの変換反応） はスーパーオキサイドとの反応では なくむしろ別の機構により起こっているとも思われる。 ただし、 スキー ム 7は、 あくまでも化合物 I dに対し上記の条件で推定されるメカニズム の一例に過ぎず、 本発明を限定するものではない。
1d
Figure imgf000044_0001
16d
Figure imgf000044_0002
OH-
17d 2d + 0ク N- -S03H
Figure imgf000044_0003
スキーム 7
[ 1 - 2 . スーパ一オキサイド選択性 （1 ) ]
まず、 化合物 Idのスーパーォキサイド選択性蛍光プロ一ブとしての性能 を試験したところ、 Id はスーパーオキサイドに対して優れた特異性を 有することが分かった。 図 1にその試験結果を示す。 同図は、 化合物 Id を H202または酵素的に生成させたスーパーォキサイドと反応させて蛍光 発光を追跡した結果を示すグラフであり、 横軸は反応時間 （秒） 、 縦軸 は蛍光強度 （au) を表す。 図中、 （a)は HPXおよび X0存在下、 （b)は HPX、 X0および SOD存在下、 （c)は HPX、 X0および SODの存在する嫌気性条件下、 そして（d)は H202のみと反応させたときの結果をそれぞれ示す。 以下、 図 1の試験結果についてさらに詳細に説明する。
まず、 図 1 (a)に示す通り、 Idは、 ヒポキサンチン (HPX)/キサンチ ンォキシダーゼ (X0) 系から発生したスーパーオキサイドに反応して蛍 光応答が短時間に顕著に増加したことから、 スーパ一ォキサイドに対し 高い感度を有していることが分かった。 より具体的には、 HEPES緩衝液 ( H 7.4, 10 mM, 2.5 mL)中、 37°Cにおける化合物 Id (16 xM)、 キサン チンォキシダ一ゼ（X0, 0.01 U/mL) , およびヒポキサンチン（HPX, 40 M)の酵素反応を、 励起 （excitation) 波長 511 nmおよび放射 （ emission) 波長 531 腿で追跡したところ、 化合物 2dの形成 （前記スキー ム 4) に由来する蛍光応答が観測され、 図 1 (a)に示すお上がりの （ progressive) 曲線が得られた。 なお、 スーパーオキサイドジスム夕ー ゼ（S0D) (40 U/mL)をさらに添加する以外は同様にして試験したところ、 図 1 (b)に示す通り蛍光応答が顕著に阻害されたことから、 図 1 (a)の蛍 光応答はスーパ一ォキサイドに起因することが確認された。
そして、 図 1 (d)に示す通り、 化合物 Idと H202 (40 M)との反応は、 無 視できるほど小さな蛍光強度増加を引き起こしたのみであった。 すなわ ち、 Id は、 過酸化水素に対しほとんど応答せず、 スーパ一オキサイド に対して優れた特異性を有することが示された。
さらに、 図 1 (c)に示す結果から、 化合物 Idは、 従来のスーパーォキ サイド検出剤であるニトロブルーテトラゾリゥム（NBT)と比較して利点 を有していることが分かる。 具体的には以下の通りで.ある。 NBTは、 ス 一パーォキサイド 02—·により還元される性質を有していることから分光 光度測定等のプローブ等に利用されている。 しかし、 ΝΒΠこは、 スーパ ーォキサイドのみならず生体系に存在するリダクタ一ゼによっても還元 されてしまうという大きな問題がある。 そこで、 化合物 Idによる 02—·の 検出が同様の問題を有するか否か、 嫌気性条件下で化合物 ld， XO, HPX および SODを用いた酵素反応により試験したところ、 図 1 (c)に示す通 り、 X0還元体に起因する Idから 2dの生成は非常に低速度であった。 この 結果は、 キサンチン- X0系による NBTからホルマザンへの還元では好気性 条件下よりも嫌気性条件下の方がより高速度で還元されたという観測結 果とはっきり対照的である。 このように、 化合物 Idを用いた蛍光に基づ く 02_·の検出では、 細胞内リダクタ一ゼによる複雑化は排除されるかま たは顕著に低減されることが示された。
[ 1 - 3 . スーパーオキサイド選択性 （2 ) ]
さらに、 上記と異なる条件で、 化合物 la〜ldの全てについて、 H202お よびそれ以外の各種求核剤、 還元剤等との反応性も試験した。 より具体 的には、 XO- HPX系、 XO- HPX-S0D系、 H202、 ァスコルビン酸、 1 , 4 —ヒ ドロキノン、 プロピルァミン、 ジェチルァミン、 ダルコ一ス、 エステラ ーゼ、 チトクローム P450リダクタ一ゼ + NADPH系およびジァフオラ一 ゼ + NADH系のそれぞれについて蛍光応答を測定した。 操作は以下の通 りである。 すなわち、 まず、 la〜ldおよび上記各試薬を、 それぞれ pH 7.4の 10 mM HEPESに溶かし、 溶液を調製した。 次に、 96ゥエルミクロ プレートを準備し、 各ゥエルに、 前記 la〜ldのうちいずれかの溶液（25 (i , 170 L)を入れ、 さらに、 ブランク溶液 30 n または反応させ ようとする試薬の溶液 30 il を加えた。 ゥエル中における最終的な濃 度は、 la〜dについては 21.3 M、 X0については 13. 1 mU/mL, HPX, H202、 ァスコルビン酸、 1 , 4ーヒドロキノン、 プロピルァミン、 ジェ チルァミン、 グルコース、 NADPHおよび NADHについてはそれぞれ 50 M each、 チトクローム P450リダクターゼは 68 mU/mL、 ジァフオラー ゼは 65 mU/iL, エステラーゼは 0.5 U/mLとなるように調製した。 そし て、 そのままゥエル中で 37°Cで 10分間反応させた後に蛍光応答を測定 した。 蛍光強度測定は、 〗ASC0社製 FP- 750 spectrofluorometer (商品 名） に、 JASC0社製 ETC- 272 Peltier thermos tat ted single cell holder (商品名) または Molecular Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader (商品名） を装備して用い、 励起波長およ び放射波長は、 la, lbおよび lcについてはそれぞれ 485および 515 nm に、 Idについては 511および 540 nmに設定して測定した。 その結果、 下記表 1に示す通り、 la〜ldのいずれも、 X0- HPX系および X0- HPX- S0D 系に対する結果から、 ス一パーォキサイドに対しては優れた感度で応答 を示すことが確認されたが、 H202、 ァスコルビン酸、 1， 4ーヒドロキ ノン、 プロピルァミン、 ジェチルァミン、 およびグルコースに対しては まったく応答せず、 エステラーゼに対しても無視できるほど小さな応答 を示したのみであった。 なお、 チトクローム P450リダクターゼ + NADPH 系およびジァフオラ一ゼ + NADH系においても、 スーパーオキサイド検 出に影響するほどの応答はないことが分かった。 la、 lb、 lcおよび Id は、 0.1 M Et4NC104を含む CH3CN- H20 (3: 1)でのポル夕ンメトリ一測定に おいて- 0.5 V vs. SCE付近で陰極応答を示すことから、 スーパーォキ サイド以外の細胞内リダクターゼによる還元でスーパーォキサイド検出 が阻害されることも予想されたが、 その予想に反して上記の通りスーパ —ォキサイドに対し高い選択性を示した。 (表 1) la、 lb、 lcまたは Idの、 各種生物学的反応剤または酵素系に対 する蛍光応答比較 反応剤または酵素系 蛍光応答
la lb lc Id ブランク 10 10 10 10
X0-HPX 70 288 797 554
AU nr Λ UJJ 12 22 4o DU
H202 10 11 11 11 ァスコルビン酸 10 11 11 11
1,4一ヒドロキノン 10 11 10 11 プロピルアミン 10 10 10 10 ジェチルァミン 11 10 10 11 グルコース 10 10 10 10
17 20 23 15
(※上記表 1の数値は、 ブランク時の蛍光応答強度を 10として算出した 相対的な蛍光強度値である。 ） [2. 定量性]
96ゥエルミクロプレートアツセィにより、 HPX I X0系における前記プロ ーブ （化合物 Id) の蛍光応答における感度および定量性を試験した。 具 体的には、 Idの DMS0溶液 （10 mM) を HEPES(pH 7.4, 10 mM)で 400倍に希 釈してプローブ溶液を調製し、 このプローブ溶液（150 2L)を HPXの HEPES溶液 （10 および X0の HEPES溶液 （0.26 U/mL, 10 ill) と混 合し、 37 で 10分間静置した後に蛍光強度を測定した。 HPX濃度を様々 に変化させて測定を行なったところ、 HPX濃度の検出限界値は 5.0 mol (RSD, n=8; 2.7%) であり、 細胞レベルの解析に対応可能な値であるこ とが分かった。 さらに、 HPXが前記検出限界値から 10.0 nmolまでの間で 良好な直線較正曲線が得られたことから、 Idの蛍光応答は HPXと X0との 酵素反応により生成した 02—·の量に対し良好な依存性を示すことが確認 された。 この直線較正曲線の相関係数は 1.000、 傾きは 0.58 au/pmolで めった。
また、 蛍光強度の測定機器およびアツセィ条件を変える以外は上記と 同様にして定量性を試験したところ、 やはり優れた定量性を示すことが 確認された。 すなわち、 アツセィ条件については、 Idの DMS0溶液濃度を 5 mMとし、 これを HEPES(pH 7.4, 10 mM)で 400倍に希釈してプローブ溶 液を調製することと、 プローブ溶液使用量を 180 zLとすること以外は 上記と同様に行なった。 蛍光強度測定は、 】ASC0社製 FP- 750
spectrof luorometer (商品名） に、 ； TASC0社製 ETC- 272 Peltier thermostat ted single cell holder (商品名） または Molecular Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader (商品 名） を装備して行なった。 その結果、 HPX濃度の検出限界値は 1.0 pmol (RSD, n=8; 2.9%) であり、 HPXが前記検出限界値から 2.0 nmolまでの間 で相関係数 0.9993および傾き 0.80 au/pino 1の良好な直線較正曲線が得ら れた。 直線較正曲線の傾きが上記と異なるのは、 蛍光強度の単位が任意 単位であり、 測定機器が異なることに由来する。
[3. 細胞系への応用]
好中球 (neutrophils) をフオルポールエステルで刺激するとス一パ一 ォキサイドを産生することが知られている。 この現象を測定する蛍光プ ローブとしての Idの可能性を、 フオルボール ミリステート アセテート (PMA)で刺激した好中球を用いて試験したところ、 Idは細胞系において もス一パーォキサイドを感度よく検出できることが明らかになった。 具 体的な試験方法は以下の通りである。
まず、 健康なポランティアの提供による全血をへパリン化し、 大日本 製薬株式会社製モノポリ分離溶液 （Mono- Poly resolving medium) を加 えて遠心分離した。 分離後、 細胞を PBS (-) で二回洗浄し、 PBS (+)を 用いて 1X106個または 1X105個 細胞/ mL濃度で再懸濁させ、 これを使用 時まで氷冷条件下で保存した。 なお、 PBSとは phosphate buffered salineすなわちリン酸緩衝生理食塩水であり、 PBS (+)とは 0.54 mMの CaCl2 および 1.22 mMの MgS04を含む PBSを指し、 PBS (—）とはそれらを含 まない PBSを指す。 このようにして得た細胞懸濁液（100 L)と、 プロ一 ブ溶液（25 M in PMS (+)， 50 L)と、 PMA溶液（0. 64 fiU in PBS (+), 50 L)またはブランク溶液（PBS (+)， 50 L)とを、 96ゥエル平 底ミクロタイ夕プレート （旭テクノグラス株式会社製） 中に添加した。 直ちに蛍光強度測定 （タイム 0時点での測定） を行ない、 その後 37°Cで 120分間インキュベートした。 インキュベーションの間、 前記細胞の蛍 光強度の変化を 30分ごとに測定した。 全ての測定は、 米国 PerSeptive Biosystems社製の機器 CytoFluor II multiwell fluorescence plate reader (商品名） を用い、 励起 （excitation) および放射 （emission) フィルターをそれぞれ 485±20 および 530±25 nmにセットして行なつ た。
図 2のグラフに、 上記試験の結果を示す。 同図は、 各ゥエル中の細胞 数が 1.0X104個または 1.0X105個である場合について、 それぞれ PMAの存 在下または非存在下での結果を示す。 横軸はインキュベーション時間 （ 分） 、 縦軸は蛍光強度 （au) である。 同図から分かる通り、 化合物 Idに よるアツセィは、 PMA刺激好中球が 02 を放出することをはっきりと示し た。 蛍光強度増加は無刺激細胞においても観測されたが、 これは、 従来 の研究によれば、 使用した組織培養プレート表面と細胞との相互作用に より好中球の活性化が起こるためであるとされている。
なお、 蛍光強度測定機器を変えて、 すなわち、 IASC0社製 FP-750 spectrofluorometer (商品名） に、 ； fASCO社製 ETC- 272 Peltier thermostatted single cell holder (商品名) または Molecular Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader (商品 名） を装備して用いることと、 蛍光強度の変化を 15分ごとに測定するこ と以外は上記と同様に試験を行なったところ、 やはり同様の結果が確認 された。 図 3のグラフに、 その結果を示す。 各ゥエル中の細胞数は 1.0 X105個であり、 横軸はインキュベーション時間 （分） である。 縦軸は 蛍光強度 （au) であり、 8ゥエルについて得た実測値の平均値土標準偏 差で表している。 蛍光強度の数値が図 2と図 3とで異なるのは、 単位が 任意単位であり、 測定機器が異なることに由来する。
さらに、 化合物 Idの好中球に対する毒性を、 トリパンブルー染色法で 細胞生存率 （cell viability) を見積もることにより評価した。 すなわ ち、 好中球 （1.0X105個細胞） を、 ヒト血清アルブミンによりコートさ れたガラス製試験管中、 化合物 Id (6.25 /ιΜ) および PMA (0.16 M) の両方が存在する条件下、 どちらか一方のみの存在下、 ならびにどちら も存在しない条件下において、 37 で 120分間インキュベートし、 イン キュベート前に対するィンキュベート後の細胞生存率を測定した。 その 結果、 Idおよび PMAのどちらも存在しない存在下では、 インキュベート 後の細胞生存率はィンキュベ一ト前に対して 98%であった。 これに対し 、 1のみの存在下ではインキュベート後の細胞生存率は 95%、 PMAのみの 存在下では 93%、 1および PMAがともに存在する条件下では 97%であった 。 すなわちいずれの条件下でも好中球の死滅はほとんど起こっていない ことが分かる。 このように、 PMAのみならず化合物 Idも、 120分間のイン キュベーシヨンにおいて好中球に対し毒性を示さないことが確認された 上述の結果は、 化合物 Idから 2dへの還元的脱保護が 02—·により効果的 に誘起されることをも示し、 したがって、 化合物 Idが、 PMA刺激好中球 から放出される 02_·検出用新規蛍光プローブとして機能する上にィンキ ュベーション中細胞に損傷を与えないことをも示した。 このプローブお よびその同族体は、 細胞由来 02—'の測定を容易にし、 ミトコンドリアの みならず、 食細胞 （phagocytes) や脈管細胞 （vascular cells) により 発現される酸化的ストレスの動的機能 （dynamic functions) の解明に も役立つことが期待できる。
[4. その他の化合物についての試験]
化合物 Idと同様に 2, 4—ジニトロベンゼンスルホ二ル基を含む la— lc、 5aおよび 6aについてスーパ一ォキサイド検出用蛍光プローブとしての性 能を試験したところ、 いずれもスーパーォキサイドにより脱保護され、 各々対応する蛍光色素へ変換されることが明らかになった。 さらに、 2， 4—ジニトロベンゼンスルホニル基に代えて 4一トリフルォロメチルー 2 一二トロベンゼンスルホ二ル基を導入した 3、 4a、 5bおよび 6b、 ならび に 4一二トロベンゼンスルホ二ル基を導入した 4bも同様にスーパーォキ サイドにより脱保護され、 蛍光色素に変換されることも分かった。 した がって、 フエノール性色素と 2, 4—ジニトロベンゼンスルホニル基、 一トリフルォロメチルー 2—二トロベンゼンスルホニル基または 4一二ト 口ベンゼンスルホニル基の組み合わせからなる化合物は、 いずれも同様 にスーパ一ォキサイド検出用蛍光プローブとして利用できると考えられ る。 例えば下記スキーム 8のようにである。 さらに、 これらの組み合わ せに限定されず、 前記一般式 （ I ) の範囲内で本発明の化合物を自由に 設計して本発明者らの開発した発蛍光機構を活用することにより、 使用 目的に適う特性を有する蛍光プローブ用化合物を自在に設計開発できる と期待できる。 本発明の化合物の用途としては、 例えば、 スーパ一ォキ サイドを用いた微少着色技術への応用等、 多種多様な用途が考えられる
プローブの合成
Figure imgf000053_0001
スーパーオキサイドの検出
(還元的脱スルホニル化）
スキーム 8 (実施例 2)
本実施例では、 実施例 1で合成した化合物に加え、 前記式 4(；〜 4e、 7お よび 8a〜cで表されるスルホン酸エステル化合物を合成した。 そして、 これら化合物について、 メルカプト化合物検出用蛍光プローブとしての 機能性を試験した。 蛍光強度測定は、 特に示さない限り、 ； IASC0社製 FP-750 spectrofluorometer (商品名） に、 ； iASCO社製 ETC-272 Peltier thermostatted single cell holder (商品名) または Molecular
Devices社製 SpectraMax GeminiEM fluorescence plate reader (商品 名） を装備して用い、 測定した。 それ以外の測定条件等は実施例 1と同 様である。
[4cの合成]
まず、 テトラフルオロフルォレセイン （2.0 g) と 2 _ニトロベンゼン スルホニルクロリ ド （1.1 eq) のジクロロメタン （20 mL) 懸濁液を調 製した。 次に、 この懸濁液を 0°Cに冷却し、 その温度で 2 , 6 _ルチジ ン （1.1 eq) を加えた。 得られた混合液を室温で 4時間撹拌した。 その 反応液をジクロロメタン （200 mL) で希釈し、 1M塩酸 （200 mL) およ び飽和食塩水 （200 mL) で洗浄し、 硫酸マグネシウムにより乾燥した。 さらに、 減圧下溶媒を留去し、 得られた残渣をシリカゲルカラムクロマ 卜グラフィ一 (ジクロロメタン一アセトン = 2 0 ： 1 ) により精製して 、 目的の化合物 4cを得た。 以下にこの化合物の収量および機器分析値を 示す。
4c: 0.66 g (22%) as a dark yellow crystal. m.p. 234-246° C (from AcOEt-hexane). lH -匪 R (270 MHz, [D]6DMS0, TMS)： δ =11.33 (s, 1H, C00H), 8. 7 (t, 3JH,H = 8.9 Hz, 2H; aromatic), 8.17 (t, 3JH,H = 7.7 Hz, 1H; aromatic), 8.05-7.97 (m, 2H; aromatic), 7.85- 7.73 (m, 2H; aromatic), 7.43 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H， aromatic), 7.02 (d， 3jH F = io.1 Hz, 1H; aromatic), 6.59 (d, 3JH,F = 10.9 Hz, 2H; aromatic). FTIR (KBr)： v = 3254 (OH, br), 1752 (CO, s), 1553 (N02, s) cm"1. FAB HRMS calcd for C26H12F4N09S (MH+)：
590.0169; found: 590.0167. [4dおよび 4e の合成]
2一二トロベンゼンスルホエルク口リ ドに代えて 2—二トロ一 4—メト キシベンゼンスルホニルク口リ ドを用いる以外は 4cの合成と同様にして 4dを得た。 さらに、 2—二トロベンゼンスルホニルクロリ ドに代えて 4 一二トロー 2—メトキシベンゼンスルホニルクロリドを用いる以外は 4c の合成と同様にして 4eを得た。 以下に、 これらの収量および機器分析値 を示す。 4d: 0.46 g (15¾) as dark orange powder. m. p. 1U_125°
Ή-NMR (270 MHz, CD3CN, TMS)： δ = 8.07-8.01 (m, 2H; aromatic), 7.79-7.68 (m, 2H; aromatic), 7.36 (s, 2H; OH and aromatic), 7.20-7.16 (m, 2H; aromatic), 6.41 (dd, 3JH,F = 9.5, 3JH，H = 2.2 Hz, 1H; aromatic), 6.34 (dd, 3JH,F = 10.2 Hz, 4JH,F = 2.0 Hz, 1H;
aromatic), 3.99 (s, 3H; 0CH3) . FTIR (KBr)： y = = 3227 (OH, br), 1755 (CO, s), 1552 (N02, s) cm—1. Elemental analysis (%) calcd for C26HuF4N09S : C 52.98, H 1.88, N 2.38; found: C 53.01, H 2.15, N 2.23. FAB HRMS calcd for C27H14F4N010S (MH+)： 620.0275; found: 620.0280.
4e: 0.52 g (17%) as dark orange powder. in. p. 127-144° C. 1H-匪 R (270 MHz, CD3CN, TMS)： δ = 8.10-8.05 (m, 2H; aromatic), 7.95-7.90 (m, 2H; aromatic), 7.79-7.68 (m, 2H; aromatic), 7.18 (d, 3JH'H= 6.9 Hz, , 1H; aromatic), 6.39 (dd, 3JH,F = 9.6, 3JH，H = 2.0 Hz, 1H; aromatic), 6.33 (dd, 3JH,F = 10.3 Hz, 4JH,F = 1.9 Hz, 1H; aromatic), 4.12 (s, 3H; 0CH3) . FTIR (KBr)： v = 3222 (OH, br), 1763 (CO, s), 1538 (N02, s) cm— FAB HRMS calcd for C27H14F4N010S (MH+) : 620.0275; found: 620.0280.
[7の合成]
まず、 4-メチルー 7-ヒドロキシクマリン（4- methy卜 7- hydroxycoumarin) (1.0 g) の 2ジクロロメタン （20 mL) 懸濁液を調製し、 0°Cに冷却し 、 その温度でトリェチルァミン （1.2 eq) を加えた。 これを 5 分間撹拌 した後、 2， 4-ジニトロベンゼンスルホニルクロリド （1.2 eq) を更に加 えた。 得られた混合液を室温で 4—6 時間撹拌した。 その反応液をジク ロロメタン （200 mL) で希釈し、 1M塩酸 （200 mL) および飽和食塩水 (200 mL) で洗浄し、 硫酸マグネシウムにより乾燥した。 減圧下溶媒を 留去し得た残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ジクロロメタ ン—アセトン = 2 0 ： 1) により精製して目的の化合物 7を得た。 以下 にこの化合物の収量および機器分析値を示す。
7: 2.2 g (95%) as white needles, m.p.188-190° C (from benzene). Ή-NMR (270 MHz, CDC13, TMS)： δ = 8.75 (d, JH,H = 2.0 Hz, 1H; aromatic), 8.45 (dd, 3JH;H = 8.6 Hz, "H,H = 2.0 Hz, 1H; aromatic), 8.16 (d, 3JH，H = 8.6 Hz, 1H; aromatic), 7.75 (d, 3JH>H = 8.6 Hz, 1H; aromatic), 7.21-7.16 On, 2H; aromatic), 6.31 (s, 1H; aromatic), 2.41 (S, 3H; CH3) . FTIR (KBr)： v = 1732 (CO, s), 1560 (N02, s), 1537 (N02, s) cm"1. FAB HRMS calcd for C16HnN209S (MH+)： 407.0185; found: 407.0184. [8a〜c の合成]
4 -メチル _ 7-ヒドロキシクマリンに代えて 8a〜(：の構造にそれぞれ対応 するフルォレセイン（fluorescein)誘導体（1.0 g)を用いる以外は化合物 7の合成と同様にして、 化合物 8a〜cをそれぞれ合成した。 以下にこれら の化合物の収量および機器分析値を示す。 8a: 0.63 g (37¾) as a yellow solid, m.p. 125—147° ;H- 醒 R (270 MHz, CD30D, TMS)： δ 8.87 (d, 4JH,H = 2.8 Hz, 1H;
aromatic), 8.44 (dd, 3JH，H = 9.2 Hz, 4JH,H = 2.8 Hz, 1H; aromatic), 8.03-7.98 (m, 1H; aromatic), 7.81-7.69 (m, 2H; aromatic), 7.33- 7.16 (m, 3H; aromatic), 6.90-6.81 (m, 2H; aromatic), 6.69-6.55 (m, 3H; aromatic). FTIR (KBr)： v = 3438 (OH, br) 1736 (CO, s)， 1539 (N02, s) cm-1. FAB HRMS calcd for C26H15N20nS (MH+) :
563.0397; found: 563.0396.
8b: 0.75 g (46%) as a yellow solid. m.p. 131-156° に 'Η- 醒 R (270 MHz, CDCl3, TMS)： <5 8.70 (s, 1H; aromatic), 8.58 (d, 3JH;H = 8.4 Hz, 1H; aromatic), 8.32 (d， 3JH>H = 8.4 Hz, 1H, aromatic), 8.06 (d, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H; aromatic), 7.71-7.66 (m, 2H; aromatic), 7.15 (d, 3JH,H = 6.8 Hz, 1H; aromatic), 7.05 (s， 1H; aromatic), 6.66 (s, 1H; aromatic) , 6.63 (s, 1H; aromatic), 6. 7 (s, 1H; aromatic), 5.67 (s, 1H; OH), 2.06 (S, 6H; CH3 x 2). FTIR (KBr)： v = 3318 (OH, br), 1735 (CO, s), 1557 (N02， s)， 1542 (N02, s) cur1. FAB HRMS calcd for C28H19N20nS (MH+)： 590.0710; found: 599.0698. 8c: 0.62 g (38%) as a yellow solid, m.p. 143-158° C (from
CHCI3). Ή-NMR (270 MHz, CDC13, TMS)： δ 8.67 (d, JH>H = 2.1 Hz, 1H; aromatic), 8.55 (dd, 3JH,H = 8.6 Hz, JH;H = 2.1 Hz, 1H;
aromatic), 8.25 (d, 3JH,H = 8.6 Hz， 1H, aromatic), 8.01 (d, 3JH,H = 7.1 Hz, 1H; aromatic), 7.72-7.60 (m, 2H; aromatic), 7.16 (d, 3JH,H = 7.4 Hz, 1H; aromatic), 6.73 (d， 3JH,H = 7.4 Hz, 1H;
aromatic), 6.60 (d， 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; aromatic), 6.55 (d, 3JH,H = 8.7 Hz, 1H; aromatic), 6. 8 (d， 3JH，H = 8.7 Hz, 1H; aromatic), 5.50 (s, 1H; OH), 2.44 (S, 3H; CH3)， 2.38 (S, 3H; CH3) . FTIR (KBr)： v - 3266 (OH, br), 1735 (CO, s) , 1558 (N02, s), 1541 (N02, s) cm— FAB HRMS calcd for C28HlgN2OnS (MH+) : 590.0710; found: 599.0705.
(メルカプト化合物応答型蛍光プローブとしての評価）
[ 1. メルカプト化合物に対する特異性]
化合物 ld、 5a、 6a、 7および 8aについて、 実施例 1の [ 1— 3. スーパ 一オキサイド選択性 （2) ] と同じ条件で、 スーパ一オキサイドおよび チオールの一種であるダルタチオン （glutathione, GSH)に対する反応 性をそれぞれ試験した。 図 4に、 その結果を示す。 縦軸は蛍光強度であ り、 対照に対する％(% of control)で表している。 図示の通り、 Idはス ーパ一ォキサイド選択性 （特異性） に優れ、 5a、 6a、 7および 8aは、 ス —パーォキサイドに対する応答も示すもののメルカプト化合物選択性に 優れていることが分かった。 また、 化合物 8bおよび 8cも、 ダル夕チオン に対し高感度に応答することを確認した。 これらのことから、 フエノー ル性水酸基を有する蛍光性化合物である 7—ヒドロキシクマリン、 レゾ ルフィンおよびフルォレセィンならびにそれらの誘導体の〇一 2 , 4一 ジニトロベンゼンスルホ二ル化体は、 ダル夕チオンやシスティンなどの メルカプト化合物に対して短時間にかつ高感度に応答するプ ϋーブとし て特に好ましいと思われる。 さらに、 5a、 6a、 7、 8a、 8bおよび 8cにつ いて、 前記表 1 (実施例 1の [ 1一 3 . スーパーオキサイド選択性 （2 ) ] ) に示した各化合物に対する応答を実施例 1と同条件で試験した結 果、 全くと言って良いほど応答を示さなかった。 すなわち、 化合物 5a、 6a、 7、 8a、 8bおよび 8cは、 H202ゃァミン等、 メルカプト化合物以外の反 応剤にほとんど応答しないことから、 メルカプト化合物に対する選択性 がきわめて高いことが分かった。
[ 2 . メルカプト化合物応答型蛍光プローブとしての評価]
次に、 化合物 6aおよび化合物 8aについて、 メルカプト化合物応答型蛍光 プローブとしての性能を評価した。
チオールの一種であるグル夕チオン （gl u t a th i one, GSH) および シ スティン（cys t e i ne) を用い、 化合物 6aおよび 8aの、 メルカプト化合物 に対する定量性等を評価した。 すなわち、 まず、 化合物 6aの E tOH 溶液 (10 mM) を調製し、 それをさらに pH 7. 4の HEPES緩衝液で 500 倍希釈 し、 化合物 6aを含むプローブ溶液を調製した。 次に、 このプローブ溶液 200 il l および様々な濃度のダル夕チオンまたはシスティン溶液（pH 7. 4の HEPES緩衝液に溶かしたもの） 10 μ を 96 穴マイクロプレート の各ゥエルに加え、 37 ° C で 10 分間放置して反応させた。 さらに、 ィ匕 合物 6aに代えて 8aを用いる以外は同様にして 8aを含むプローブ溶液を調 製し、 このプローブ溶液についても 6aを含むプローブ溶液と同様にして チオール溶液と反応させた。 そして、 反応後それぞれのゥエルについて 蛍光応答を測定した。 測定は、 6a の場合 λ βχ = 383 nmおよび λ em = 500 nm、 8a の場合 λ ex = 483 nmおよび λ em = 515 腦で行なった。 な お、 A ex は励起波長を、 λ„ は放射波長をそれぞれ示す。
図 5に、 上記蛍光応答の測定結果を示す。 図 5 Αは 6aについての、 図 5 Bは 8aについての測定結果を示すグラフである。 同図に示す通り、 6a を用いた場合、 GSH および cysteine の検出限界はどちらも 7 pmol で あり、 7 pmol ― 1000 pmol の濃度範囲で良好な検量線が得られた。 な お、 GSHについては、 傾き = 0.37 au I pmoK 相関係数 （r) = 0.9998 であり、 cysteineについては、 傾き = 0.66 au I pmoK r = 0.9995で あった。 一方、 8a を用いた場合、 GSH および cysteine め検出限界は 各々 2 および 1 pmol であり、 その検出限界から 1000 pmol の濃度範 囲で良好な検量線が得られた。 GSHについては傾き = 4.25 au I pmoK 相関係数 （r) = 1.0000であり、 cysteineについては傾き = 4.82 au I pmoK r = 0.9999であった。
これらの結果から、 6a および 8a が、 メルカプト化合物応答型蛍光 プローブとして利用できることが示された。 具体的には、 前記相関係数 (r)の値から非常に優れた定量性を持つことが分かり、 傾きの大きさか ら高い感度を有することが分かる。 特に 8aは感度が高かった。
さらに、 6a または 8aを含む蛍光プローブは、 反応時間が非常に短く て済むことと、 6a および 8a自体は蛍光性を持たず、 反応で生成する色 素のみが蛍光性を有するため反応の前後で試薬の分離操作が不必要であ ることが特徴的であった。
さらに、 上記の 6a または 8aを含む蛍光プローブを、 チオールに代え て水酸基ゃァミノ基などを含む他の求核剤を用いる以外は同様の条件で 反応させたところ、 まったく蛍光を示さないことが確認された。 すなわ ち、 これらの蛍光プロ一ブは、 水酸基ゃァミノ基等に応答せず、 メルカ ブト化合物に対し高い特異性 （選択性） を有することが分かった。
なお、 化合物 5a、 7、 8bおよび 8cについても同様に試験を行ない、 同 様の結果を確認した。 [ 3 . アセチルコリンエステラーゼアツセィ]
下記スキーム 9に示す通り、 ァセチルチオコリンを基質、 ァセチルコリ ンエステラーゼを酵素として酵素反応させるとメルカプト化合物 （チォ ール） の一種であるチォコリンが生じる。 このチォコリンを、 例えば下 記スキーム 1 0のように本発明のスルホン酸エステル化合物により検出 すれば、 アセチルコリンエステラーゼ（ace tyl cho l ines t erase, AChE) の活性が短時間で測定できると期待できる。 なお、 スキーム 1 0は可能 なメカニズムの一例を示すに過ぎず、 本発明を限定するものではない。 ァセチルコリンエステラーゼ SH
Figure imgf000061_0001
ァセチルチオコリン チォコリン
(acetyl thiocholine) (thiocholine)
スキーム 9
Figure imgf000062_0001
スキーム 1 0 本発明者らは、 実際に上記各化合物がァセチルコリンエステラーゼの 活性測定に使用できることを確認した。 化合物 8aについて具体的な操作 を以下に示す。 すなわち、 まず、 化合物 8aの EtOH溶液 （10 mM) を調製 し、 それをさらに pH 7. 4の HEPES緩衝液で 500 倍希釈し、 化合物 8aを 含むプローブ溶液（20 M)を調製した。 一方、 市販のァセチルチオコリ ンを pH 7. 4の HEPES緩衝液に溶かした溶液（1 mM)を調製した。 さらに、 様々な濃度 （活性量） のアセチルコリンエステラーゼ（AChE) 溶液（pH 7.4の HEPES緩衝液に溶かした溶液） を調製した。
次に、 前記プロ一ブ溶液 200 L, ァセチルチオコリン溶液 10 L、 および様々な濃度 （活性量） のアセチルコリンエステラーゼ（AChE) 溶 液 10 Lを 96ゥエルミクロプレートの各ゥエルに加え、 37° C で 1 0 分間酵素反応を行なった。 その直後に、 λ6Χ (励起波長） = 83 およ び λ (放射波長） = 515 nmで蛍光応答を測定した。 図 6に蛍光応答の 測定結果を示す。 同図において、 横軸は AChE活性量 U)であり、 縦軸 は蛍光強度 （au) である。 図示の通り、 各ゥエルについて得られた蛍光 応答は AChE の活性量に対して良好な依存性を示した。 さらに、 0.1 " 0.5 の範囲では、 AChE 活性と蛍光応答の間に良好な直線関 係が観察された （傾き = 28.8 au / U、 r = 0.9998) 。 本 AChE アツ セィは、 バックグランド応答が小さいことに起因する感度の良さだけで なく、 反応時間が 10 分と非常に短いことが特徴であった。
さらに、 上記アツセィ法が AChE 阻害薬の活性測定にも活用できるこ とを、 良く知られている抗コリン薬であるネオスチグミン （
neostigmine) およびピリ ドスチグミン （pyridostigmine) を用いて確 認した。 具体的な操作は以下の通りである。 すなわち、 まず、 8aを含む プローブ溶液、 ァセチルチオコリン溶液、 およびアセチルコリンエステ ラーゼ（AChE)溶液を上記と同様にして調製した。 ただし、 AChE溶液の濃 度 （活性量） は 5 U/mLに固定した。 一方、 様々な濃度の ネオスチグミ ン溶液およびピリドスチグミン溶液 （いずれも pH 7.4 HEPES緩衝液に溶 かしたもの）を調製した。 そして、 このプローブ溶液 （25 M， 150 βί)、 ァセチルチオコリン溶液 （1 mM, 10 L)、 AChE溶液 （5 U/mL, 10 ill) および様々な濃度のネオスチグミン溶液またはピリ ドスチグミ ン溶液を、 96ゥエルミクロプレートの各ゥエルに加え、 37° C で 10 分 間酵素反応を行なった後、 各ゥエルについて蛍光応答を測定した。 測定 は、 λ。χ (励起波長） = 483 nmおよび λ em (放射波長） = 515 nmで行な つた。 そして、 蛍光強度から阻害％値を算出し、 阻害活性曲線を作成し た。 図 7に、 その阻害活性曲線を示す。 横軸はネオスチグミンまたはピ リ ドスチグミンの濃度 （ mol) であり、 縦軸は蛍光強度から算出した 阻害％値である。
図 7の阻害曲線からネオスチグミンおよびピリ ドスチグミンの IC50 値を見積もったところ、 0.18 および 0.29 M となった。 これら の値は、 ネオスチグミンおよびピリドスチグミンの IC5。 値として周知 の文献値と一致していないが、 それは測定条件等が異なるためである。 しかしながら、 これら両抗コリン薬の IC5。 値間の相対的な程度差は文 献値と良い相関を示した。 すなわち、 化合物 8aが、 AChE阻害薬に対し精 度の良い活性測定剤として使用可能であることが分かった。
AChEアツセィゃ AChE阻害活性の測定は、 AChEが関与する疾患、 例えば アルツハイマー病等の診断や新薬候補化合物のスクリーニングに非常に 重要である。 特に、 AChE阻害薬は、 近年アルツハイマー病治療薬として 注目を集めており、 本発明のスルホン酸エステル化合物は、 上記の試験 結果によれば AChE阻害薬のスクリーニングに大いに役立つことが期待で きる。 [4. チォリン酸基応答型プローブとしての活用]
さらに、 チオール （— SH基が炭素原子に結合した化合物） 以外のメル カプト化合物に対する蛍光プローブとしての、 本発明のスルホン酸エス テル化合物の可能性を検討した。 より具体的には、 化合物 5a、 6a、 7お よび 8a〜8cが、 アデノシン 5' -[ァ -チォ]三リン酸（adenosine 5' -[r- thio] triphosphate, ァ- S-ATP) やアデノシンーチォリン酸（adenos ine monothiophosphate, S-AMP) が有するいわゆるチォリン酸基中のチォ一 ル基に対しても応答することを明らかにした。 化合物 8a〜8cおよびァ S-ATP を用いた試験結果について以下に述べる。
Figure imgf000065_0001
8aの溶液（20 Μ, 200 n l) および様々な濃度の ァ- S- ATP の溶液 ( いずれも pH 7. 4のイミダゾール緩衝液に溶かした溶液） を 96-穴マイク 口プレートの各ゥエルに加え、 37° C で 180 分間反応を行なった後、 各ゥエルについて蛍光応答を測定した。 測定は、 λ εχ (励起波長） = 83 nmおよび λ (放射波長） = 515 nmで行なった。 図 8にその結果を示す 。 図示の通り、 反応後に観察された応答は、 ァ- S-ATP 濃度に対して良 好な依存性を示した。 また、 検出限界は 5 pmo lと、 8aが T - S- ATPに対 して高感度であることを示した。 また、 8b および 8c において同様に 試験を行なったところ、 8aよりもさらに高感度にァ- S- ATP を検出でき ることも明らかになった。
このように、 チォリン酸基に対し 8a〜8c が応答を示したことから、 これらの化合物をメルカプト化合物応答型蛍光プローブを用いることに より、 下記スキーム 1 1および 1 2に示す概念に基づいてキナーゼアツ セィが構築できると期待される。 実際に 8aを用い、 チォリン酸基の導入 程度が異なるチォリン酸化タンパク質 （シスメックス株式会社から提供 ) に対する蛍光応答を測定したところ、 導入程度に応じた蛍光応答が得 られた。 ーゼ
Figure imgf000066_0001
スキーム
Figure imgf000066_0002
スキーム 1 2 上記スキーム 1 1および 1 2についてより具体的に説明すると以下の 通りである。 キナーゼは ATP 存在下タンパク質のチロシン残基等の水 酸基をリン酸化する酵素であるが、 ATP の代わりに ァ- S-ATP を用いて 本酵素反応を行なうとチオリン酸化されたタンパク質が生成する。 この チオリン酸化タンパク質をチオール応答型蛍光プローブで検出すればキ ナ一ゼアツセィがおこなえる。 このキナーゼァッセィを臨床診断に使用 する時の実際の方法としては、 例えば下記 （1 ) および （2 ) の二通り が考えられる。 ( 1 ) キナーゼの特異的基質を固定化したマイクロプレートを用いる 方法は、 例えば下記（i)〜（v)の操作を順番に行なうことで実施できる。 (i)試料 （血液または組織） からの分析対象キナーゼの抗体を用いた分 離、 すなわち免疫沈降 (immunoprecipitation)
(ii)分離したキナーゼおよびァ -S- ATP による固定化基質のチオリン酸 ィ匕、 すなわちキナ一ゼによる酵素反応（enzyme reaction with kinase) (iii)添加物の洗浄除去（wash- out)
(iv)チォリン酸基応答型プローブとの反応による発蛍光（fluorescing process)
(v)蛍光プレ一トリ一ダ一による検出（detection) (2) キナーゼの特異的基質をブロッテイングする方法は、 例えば下 記（i)〜（V)の操作を順番に行なうことで実施できる。
(i)試料 （血液または組織） からの分析対象キナーゼの抗体を用いた分 離、 すなわち免疫沈降（immunoprecipitation)
(ii)分離したキナーゼおよび T-S-ATP による基質のチォリン酸化、 す なわちキナ一ゼによる酵素反応（enzyme reaction with kinase)
(iii)チオリン酸化された基質の分離とそのメンブレン（膜）上へのプロ ッティング (separat ion and blotting on a membrane)
(iv)チオリン酸基応答型プローブとの反応による発蛍光（fluorescing process)
(v)蛍光イメージアナライザーによる検出（detection) 上記 （1) または （2) の方法によれば、 特異的な抗体ならびに基質 を用いることにより、 様々な生命現象 （細胞の分化、 分裂および増殖、 ならびに周期） に関する数多くのキナーゼの中から、 ある特定のキナー ゼを特異的に検出できると考えられる。 従って、 チォリン酸基応答型プ ローブは、 キナーゼ活性量を測定するための研究用試薬としてだけでな く、 癌診断等の臨床への応用も期待される。 以上説明した通り、 本実施例の結果から、 本発明のァセチル AChE ァ ッセィおよびキナーゼアツセィでは、 環境に影響を及ぼす放射性同位体 ラベルを用いることなく、 簡便な測定が行なえることが分かった。 具体 的には、 AChE アツセィでは、 酵素反応と発蛍光反応を同時に行なうこ ともでき、 キナーゼアツセィでは、 酵素反応の後発蛍光反応を行なうと いう簡単な操作で測定することも可能であり、 試薬として酵素基質とプ ローブのみを用いて測定することもできた。 さらに、 本発明のメルカプ ト化合物検出用蛍光プローブを用いる測定方法の検出感度は、 前述の実 施例の結果から、 化学発光のそれに匹敵し得ると考えられる。
さらに、 本発明のメルカプト化合物検出用プローブを用いたその他の 酵素活性測定法も、 酵素反応によりそれらの酵素基質からチオールが生 成するように分子設計することで、 簡単に構築できる。 例えば下記スキ ーム 1 3のようにである。 このような利点を考慮すると、 メルカプト化 合物応答型蛍光プローブは、 様々な酵素アツセィキットの構築に適した 多様な機能を持つ試薬として期待できる。
Figure imgf000068_0001
スキーム 1 3 産業上の利用の可能性
'以上説明した通り、 本発明のスルホン酸エステル化合物は、 スーパー ォキサイドに対して高選択的に応答する蛍光プローブの用途に適する。 蛍光プローブは、 現在の細胞生理学研究において重要な試薬であり、 さ らに、 蛍光顕微鏡を用いる画像解析システムやフローサイトメトリー （ セルソ一夕一） における最近のハ一ドおよびソフト面の著しい発展を考 慮すると、 今後益々蛍光プローブの市場は広がると考えられる。 本発明 は、 例えばバイオイメージングゃ臨床分析等に適し、 活性酸素種ゃァセ チルコリンエステラーゼと関連のある疾患に対する新しい治療法や創薬 シ一ズを開発するために良好に用いることができる。 特に、 メルカプト 化合物検出用プロ一ブは、 ァセチルコリンエステラーゼ活性の検出や力 イネ一スアツセィへの利用を通じて、 アルツハイマー病や癌等の治療薬 のスクリーニング等に役立つことが期待できる。 さらに、 本発明のスル ホン酸エステル化合物の用途は蛍光プローブに限定されず、 あらゆる用 途に使用可能である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記一般式 （ I ) で表される構造を含むスルホン酸エステル化 合物。
Figure imgf000070_0001
(I )
式 （ I ) 中、 原子団 A— Oは、 スルホニル基との共有結合を切断する ことにより蛍光性化合物を形成する原子団であり、 原子団 Aに結合する 原子団 B— S〇3_ は 1つでも複数でも良く、 Bは、 1個または複数 の電子吸引基で置換された環であり、 前記電子吸引基は、 ハロゲン化ァ ルキル基、 ニトロ基、 およびシァノ基からなる群から選択される少なく とも一つを含み、 Bは、 複数存在する場合は同一でも異なっていても良 い。
2. 前記式 （ I) 中の原子団 Bが、 1個または複数の電子吸引基で 置換された芳香環または複素芳香環である請求の範囲 1に記載のスルホ ン酸エステル化合物。
3. 前記式 （ I) 中の原子団 Aに結合する原子団 B— S03— が 複数である請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
4. 前記式 （ I) 中の原子団 Aに結合する原子団 B— S〇3— が 1つである請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
5. 前記ハロゲン化アルキル基が炭素数 1〜 6の直鎖または分枝ハ ロゲン化アルキル基である請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化 合物。
6. 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸引基がニトロ 基およびトリフルォロメチル基の少なくとも一方を含む請求の範囲 1に 記載のスルホン酸エステル化合物。
7. 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸引基がニトロ 基を含む請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
8. 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸引基がニトロ 基を含む請求の範囲 4に記載のスルホン酸エステル化合物。
9. 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸引基が複数の 二ト口基を含む請求の範囲 4に記載のスルホン酸エステル化合物。
1 0. 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記電子吸引基がニト 口基を 1個のみ含む請求の範囲 4に記載のスルホン酸エステル化合物。
1 1. 前記式 （ I ) 中の原子団 Bにおいて、 前記環が、 ベンゼン環 、 ナフ夕レン環、 アントラセン環、 ピレン環、 ピリジン環、 ピロール環
、 チォフェン環、 フラン環、 ベンゾピリジン環、 ベンゾピロ一ル環、 ベ ンゾチォフェン環、 およびべンゾフラン環からなる群から選択される少 なくとも一つである請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
1 2. 前記式 （ I ) において、 原子団 Bが、 2,4—ジニトロフエ二 ル基、 4一二トロフエニル基、 2—二トロフエニル基、 2—二トロ— （4— トリフルォロメチル） フエニル基、 2_ニトロ— 4—メトキシフエニル基 、 4_ニトロ— 2—メトキシフエ二ル基、 2_ニトロー4一メチルフエニル 基、 4一二トロ— 2—メチルフエニル基、 2—二トロー 4, 6—ジメチルフエ ニル基、 4一二トロ— 2，6—ジメチルフエニル基、 2—ニトロ— 4一クロ口 フエニル基、 4一二トロ _2—クロ口フエニル基、 および 2—ニトロ— 4— イソプロピルフエニル基からなる群から選択される少なくとも一つであ る請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
1 3 . 前記式 （ I ) において、 原子団 Bが、 2, 4—ジニトロフエ二 ル基、 4—ニトロフエニル基、 2—ニトロフエニル基、 2—ニトロ— （4一 トリフルォロメチル） フエニル基、 2 _ニトロ一 4ーメトキシフエニル基 、 4一二トロー 2—メトキシフエ二ル基、 2—二トロー 4一メチルフエニル 基、 4一二トロ— 2—メチルフエニル基、 2—二トロー 4，6—ジメ.チルフエ ニル基、 4一二トロ— 2, 6—ジメチルフエニル基、 2—ニトロ— 4一クロ口 フエニル基、 4—ニトロ一 2—クロ口フエ二ル基、 および 2—ニトロ— 4一 イソプロピルフエニル基からなる群から選択される少なくとも一つであ る請求の範囲 4に記載のスルホン酸エステル化合物。
1 4 . 前記式 （ I ) において、 原子団 Bが、 2， 4—ジニトロフエ二 ル基、 2 _ニトロ一 （4一トリフルォロメチル） フエニル基、 2—ニトロ 一 4ーメトキシフエ二ル基、 4_ニトロ一 2—メトキシフエ二ル基、 2 _二 トロー 4 _メチルフエニル基、 4一二トロー 2—メチルフエニル基、 2—二 トロ— 4， 6—ジメチルフエニル基、 4—ニトロー2， 6—ジメチルフエニル 基、 2—ニトロ一 4—クロ口フエ二ル基、 4一二トロー 2—クロ口フエニル 基、 および 2—二トロー 4一イソプロピルフエニル基からなる群から選択 される少なくとも一つである請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル 化合物。
1 5 . 前記式 （ I ) において、 原子団 Bが、 2, 4—ジニトロフエ二 ル基、 2 _ニトロ— （4一トリフルォロメチル） フエニル基、 2—二トロ 一 4ーメトキシフエ二ル基、 4一二トロ一 2—メトキシフエ二ル基、 2—二 トロ— 4一メチルフエニル基、 4—ニトロ _ 2 _メチルフエニル基、 2—二 トロー 4, 6—ジメチルフエニル基、 4—ニトロー2， 6—ジメチルフエニル 基、 2—ニトロ一 4一クロ口フエ二ル基、 4一二トロー 2—クロ口フエニル 基、 および 2—二トロー 4一イソプロピルフエニル基からなる群から選択 される少なくとも一つである請求の範囲 4に記載のスルホン酸エステル 化合物。
1 6 . 前記式 （ I ) 中の原子団 A—〇において、 〇原子が芳香環ま たは複素芳香環に直接結合している請求の範囲 2に記載のスルホン酸ェ ステル化合物。
1 7 . 前記原子団 A— Oとスルホニル基との共有結合を切断するこ とにより形成される蛍光性化合物が、 フルォレセィン、 レゾルフィン、 7—ヒドロキシクマリン、 1 一ナフトール、 2 —ナフトール、 1—ヒド ロキシアン卜ラセン、 2 —ヒドロキシアントラセン、 9—ヒドロキシァ ントラセン、 1ーヒドロキシピレン、 1ーヒドロキシァクリジン、 2 - ヒドロキシァクリジン、 9ーヒドロキシァクリジン、 2—ヒドロキシキ ノロン、 4—ヒドロキシキノロン、 5—ヒドロキシキノロン、 6—ヒド 口キシキノロン、 8—ヒドロキシキノロン、 4ーヒドロキシー 7—二卜 ロー 2—ォキサ一 1， 3—ジァゾールまたはそれらの誘導体である請求 の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
1 8 . 前記原子団 A—〇とスルホニル基との共有結合を切断するこ とにより形成される蛍光性化合物が、 7—ヒドロキシクマリンであるか 、 または 7—ヒドロキシー 4一 (卜リフルォロメチル) クマリン以外の 7—ヒドロキシクマリン誘導体であり、 前記原子団 Bが、 2，4一ジニト 口フエニル基、 2—二トロ— （4一トリフルォロメチル） フエニル基、 2 一二トロー 4ーメトキシフエ二ル基、 4一二トロー 2—メトキシフエニル 基、 2—ニトロ一 4一メチルフエニル基、 4—ニトロ一 2—メチルフエニル 基、 2 _ニトロ一 4， 6—ジメチルフエニル基、 4—ニトロ— 2, 6—ジメチル フエニル基、 2—二トロ— 4一クロ口フエニル基、 4一二トロー 2—クロ口 フエニル基、 または 2—二トロー 4—イソプロピルフエニル基である請求 の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
1 9 . 前記フルォレセイン誘導体は、 フルォレセインの 2位、 4位 、 5位および 7位のうち少なくとも一つが炭素数 1〜6の直鎖もしくは 分枝アルキル基、 またはハロゲンで置換された誘導体であり、 前記 7— ヒドロキシクマリン誘導体は、 7—ヒドロキシクマリンの 4位が炭素数 1〜6の直鎖もしくは分枝アルキル基、 またはトリフルォロメチル基で 置換された誘導体である、 請求の範囲 1 7に記載のスルホン酸エステル 化合物。
2 0 . 前記原子団 A—〇とスルホニル基との共有結合を切断するこ とにより形成される蛍光性化合物が、 フルォレセイン、 2 , 7—ジクロ 口フルォレセイン、 2 , 7—ジフルオロフルォレセイン、 4 , 5—ジフ ルオロフルォレセイン、 2 , 4， 5 , 7 —テトラフルオロフルォレセィ ン、 2， 7ージメチルフルォレセィン、 4 , 5—ジメチルフルォレセィ ン、 2 , 4 , 5 , 7—テトラメチルフルォレセイン、 2， 7—ジイソプ 口ピルフルォレセィン、 2， 7—ジー t 一ブチルフルォレセィン、 2， 7—ジメトキシフルォレセィン、 2 , 4—ジフルオロー 5， 7 —ジメチ ルフルォレセィン、 レゾルフィン、 2， 8ージクロロレゾルフィン、 7 ーヒドロキシ一 4一 （トリフルォロメチル） クマリン、 または 7—ヒド 口キシ— 4ーメチルクマリンである請求の範囲 1 7に記載のスルホン酸 エステル化合物。
2 1 . 下記式 ）〜（iv)のいずれかで表される請求の範囲 1に記載 のスルホン酸エステル化合物。
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000075_0002
Figure imgf000075_0003
式（i)〜（iv)中、
X1、 X2、 Y1および Y2は、 それぞれ水素原子、 炭素数 1〜6の直 鎖もしくは分枝アルキル基、 またはハロゲンであり、 同一でも異なって いても良く、
X 3は炭素数 1〜 6の直鎖もしくは分枝アルキル基、 またはトリフル ォロメチル基であり、
！^ェぉょび！^は、 それぞれ水素原子、 ニトロ基、 メチル基、 クロ口 基またはメトキシ基であり、 同一でも異なっていても良く、
R2および R4は、 それぞれ水素原子、 ニトロ基、 トリフルォロメチ ル基、 メチル基、 イソプロピル基、 クロ口基またはメトキシ基であり、 同一でも異なっていても良く、
かつ、 R1および R2のうち少なくとも一方はニトロ基であり、 R3お よび R4のうち少なくとも一方はニトロ基であり、 式（iv)中、 X3·が炭 素数 1〜6の直鎖もしくは分枝アルキル基である場合は、 R1および R 2はいずれも水素原子以外の基である。
22. 前記式（ii；)〜（iv)のいずれかで表され、 R1および R2のう ちいずれもがニトロ基である請求の範囲 2 1に記載のスルホン酸エステ ル化合物。
23. 下記式 1および 3〜 8のいずれかで表される請求の範囲 1に 記載のスルホン酸エステル化合物。
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000077_0003
Figure imgf000077_0004
式 1および 8中、 X1、 X2、 Y1および Y2は、 それぞれ水素原子、 メチル基またはハロゲンであり、 同一でも異なっていても良く、 式 4、 5および 6中、 R1は水素原子、 ニトロ基、 メチル基、 クロ口基または メトキシ基であり、 R2は水素原子、 ニトロ基、 トリフルォロメチル基 、 メチル基、 イソプロピル基、 クロ口基またはメトキシ基であり、 かつ 、 R1および R2のうち少なくとも一方はニトロ基である。
24. 下記式 l a〜 l d、 3、 4 a〜4 e、 5 a、 5 b、 6 aおよ び 6 bのうちいずれかで表される請求の範囲 1に記載のスルホン酸エス テル化合物。
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000078_0002
4a: R1=N02， R2=CF3
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000079_0002
Figure imgf000079_0003
25. 下記式 5 a、 6 a、 7、 8 a、 8 bおよび 8 cのうちいずれ かで表される請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物。
Figure imgf000079_0004
Figure imgf000079_0005
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000080_0002
26. 下記式 （II) の化合物と下記式 （III) の化合物とを化合さ せる工程を含む、 請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物の製 造方法。
Figure imgf000080_0003
(II) (III) 式 （III) 中、 X5は八ロゲンであり、 Aおよび Bは前記式 （I) と 同じである。
27. 請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物を含む蛍光 プローブ。
28. スーパーオキサイド検出に用いる、 請求の範囲 27に記載の 蛍光プローブ。
2 9 . メルカプト化合物検出に用いる、 請求の範囲 2 7に記載の蛍 光プローブ。
3 0 . 請求の範囲 1〜2 1、 2 3および 2 4のうちいずれかに記載 のスルホン酸エステル化合物を含む、 請求の範囲 2 8に記載の蛍光プロ ーブ。
3 1 . 請求の範囲 4、 8、 9、 1 3、 1 5、 2 2および 2 5のうち いずれかに記載のスルホン酸エステル化合物を含む、 請求の範囲 2 9に 記載の蛍光プローブ。
3 2 . バイオイメージングに用いる請求の範囲 2 7に記載の蛍光プ ローブ。
3 3 . 請求の範囲 2 7に記載の蛍光プローブを含むバイオイメージ ング用キッ卜。
3 4 . ブロッテイング （転写） を用いたアツセィ方法、 スーパ一ォ キサイドジスム夕ーゼ定量方法、 機能性食品または医薬のスーパ一ォキ サイド消去能測定方法、 臨床分析方法および医薬のスクリーニング方法 からなる群から選択される少なくとも一つの方法に使用する、 請求の範 囲 2 8に記載の蛍光プローブ。
3 5 . キナーゼアツセィ方法、 ァセチルコリンエステラーゼアツセ ィ方法、 ブロッテイング （転写） を用いたアツセィ方法、 臨床分析方法 および医薬のスクリーニング方法からなる群から選択される少なくとも 一つの方法に使用する、 請求の範囲 2 9に記載の蛍光プローブ。
3 6 . キナーゼおよびァ- S-ATPを用いて基質をチォリン酸化するェ 程と、 前記チオリン酸化された基質を請求の範囲 2 9に記載の蛍光プロ ーブを用いて検出する工程とを含むキナーゼアツセィ方法。
3 7 . 抗体を用いて前記キナーゼを試料から分離する工程をさらに 含む、 請求の範囲 3 6に記載のキナーゼアツセィ方法。
3 8 . 請求の範囲 2 9に記載の蛍光プローブ、 τ - S-ATPおよび基質 を含むキナーゼアツセィ用キット。
3 9 . キナーゼの抗体をさらに含む請求の範囲 3 8に記載のキナ一 ゼアツセィ用キット。
4 0 . ァセチルチオコリンとァセチルコリンエステラーゼとの反応 によりチォコリンを生じさせる工程と、 前記チォコリンを請求の範囲 2 9に記載の蛍光プローブを用いて検出する工程とを含むァセチルコリン エステラーゼアツセィ方法。
4 1 . 請求の範囲 2 9に記載の蛍光プローブおよびァセチルチオコ リンを含むァセチルコリンエステラーゼアツセィ用キット。
4 2 . 支持体上にブロッテイング （転写） した物質を請求の範囲 2 7に記載の蛍光プローブを用いて検出する工程を含むアツセィ方法。
4 3 . 請求の範囲 2 7に記載の蛍光プローブおよび前記支持体を含 む、 請求項 4 2に記載のアツセィ方法に用いるためのキット。
4 4 . 請求の範囲 2 8に記載の蛍光プローブをスーパ一ォキサイド と反応させた後の蛍光応答を、 前記反応をスーパーォキサイドジスムタ ーゼ含有試料の存在下で行なった場合と非存在下で行なった場合とで比 較することにより、 スーパーォキサイドジスムタ一ゼを定量する方法。
4 5 . 前記スーパ一オキサイドジスム夕一ゼ含有試料として、 ヒト もしくは動物の体液またはその体液から抽出した試料を用いて請求の範 囲 4 4に記載の定量方法を行なう、 前記ヒトまたは動物の体液中のスー パーォキサイドジスム夕一ゼ濃度の測定方法。
4 6 . 請求の範囲 4 5に記載の方法を用いてヒトまたは動物の体液 中におけるスーパーオキサイドジスムターゼ濃度を測定する工程と、 そ の後前記ヒトまたは動物に機能性食品または医薬を投与する工程と、 投 与後に再び請求の範囲 4 5に記載の方法を用いて前記ヒトまたは動物の 体液中におけるスーパーォキサイドジスムターゼ濃度を測定する工程と を含む、 前記機能性食品または医薬のスーパーォキサイド消去能測定方 法。
4 7 . 請求の範囲 2 8に記載のスーパーオキサイド検出用プローブ を含む、 請求の範囲 4 5に記載の測定方法を実施するためのキット。
4 8 . 請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物を含む臨床 分析用試薬。
4 9 . 請求の範囲 4 8に記載の臨床分析用試薬を含む臨床分析用キ ッ卜。
5 0 . 請求の範囲 3 6、 3 7、 4 0、 4 2および 4 4〜 4 6のいず れかに記載の方法を用いてヒトまたは動物に対するアツセィを行なうこ とを含む臨床分析方法。
5 1 . 請求の範囲 4 4〜4 6のいずれかに記載の方法を用いてヒト または動物に対するアツセィを行なうことを含む、 スーパ一オキサイド に関連する疾患の治療、 予防または症状の軽減のための医薬のスクリー エング方法。
5 2 . 請求の範囲 3 6、 3 7または 4 0に記載の方法を用いてヒ卜 または動物に対するアツセィを行なうことを含む、 ァセチルコリンまた はキナーゼに関連する疾患の治療、 予防または症状の軽減のための医薬 のスクリーニング方法。
5 3 . 前記ァセチルコリンまたはキナーゼに関連する疾患が、 癌、 アルツハイマー病、 高血圧症、 狭心症、 心筋梗塞、 動脈硬化性疾患、 関 節炎、 炎症性疾患および代謝性疾患からなる群から選択される少なくと も一つである請求の範囲 5 2に記載のスクリーニング方法。
5 4 . メルカプト化合物検出用蛍光プローブの製造のための、 請求 の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物の使用。
5 5 . キナーゼアツセィ用蛍光プロ一ブの製造のための、 請求の範 囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物の使用。
5 6 . ァセチルコリンエステラーゼアツセィ用蛍光プローブの製造 のための、 請求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物の使用。
5 7 . ブロッテイング法に用いる蛍光プロ一ブの製造のための、 請 求の範囲 1に記載のスルホン酸エステル化合物の使用。
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