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WO2005097999A1 - Procede d'amelioration des plantes - Google Patents

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Publication number
WO2005097999A1
WO2005097999A1 PCT/FR2005/000753 FR2005000753W WO2005097999A1 WO 2005097999 A1 WO2005097999 A1 WO 2005097999A1 FR 2005000753 W FR2005000753 W FR 2005000753W WO 2005097999 A1 WO2005097999 A1 WO 2005097999A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
starch
plant
gene
phosphorylase
grains
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2005/000753
Other languages
English (en)
Inventor
Christophe D'hulst
Véronique Planchot
Manash Chaterjee
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genoplante Valor SAS
Original Assignee
Genoplante Valor SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genoplante Valor SAS filed Critical Genoplante Valor SAS
Priority to US10/594,526 priority Critical patent/US20070209088A1/en
Priority to EP05744153A priority patent/EP1730283A1/fr
Priority to CA002560655A priority patent/CA2560655A1/fr
Priority to AU2005232009A priority patent/AU2005232009A1/en
Publication of WO2005097999A1 publication Critical patent/WO2005097999A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis

Definitions

  • starch phosphorylase The degradation of starch involves several enzymes, including ⁇ -amylase (endoamylase), ⁇ -amylase (exoamylase), amyloglucosidase, and alpha-glucan phosphorylase (starch phosphorylase).
  • ⁇ -amylase endoamylase
  • ⁇ -amylase exoamylase
  • amyloglucosidase alpha-glucan phosphorylase
  • starch phosphorylase alpha-glucan phosphorylase
  • Inactivation of the starch phosphorylase gene means that the gene is rendered non-functional, that is to say it no longer or practically no longer allows the expression of an active starch phosphorylase protein, the protein being no longer or practically no longer expressed, or else in a mutated non-functional form, incapable of exerting its enzymatic properties. Inactivation of the gene can be carried out by any means of those skilled in the art (see Torneycroft et al., 2001), in particular by interruption of the gene, or extinction of gene expression (“gene silencing").
  • a mutation is introduced into the gene coding for starch phosphorylase, which makes this gene non-functional, namely that it becomes unable to express the enzyme, or that the enzyme produced is inactive .
  • the mutation may consist of an insertion of nucleotide (s), for example between exon 6 and intron 6 of the starch phosphorylase gene. The extinction of the gene can thus be carried out by insertion of T-DNA.
  • the sequence SEQ ID No. 2 thus shows the starch phosphorylase gene from Arabidopsis thaliana in which a T-DNA sequence is inserted.
  • the invention also relates to the use of the polynucleotide sequence SEQ ID No.
  • One to two insertions are obtained on average per plant. Segregation analyzes show that 57% of the transformants contain 1 insertion locus, 25% 2 locus, 8% 3 locus and 2% more than 3. A molecular analysis of the labeled mutants shows that these insertions are done at random, are stable , maintained in the descendants and that there is little bias of insertions.
  • Inactivation of the endogenous starch phosphorylase gene can also be obtained by mutagenesis of plant cells, for example by UV irradiation, by a chemical mutagen, or by insertion of transposons. Transposable elements have the ability to disrupt the expression of genes into which they are inserted and to generate deletions, rearrangements, and mutations at the target locus.
  • transposable element If there is a transposable element near a gene of interest, it can therefore be remobilized to reinsert itself in the gene or nearby (Ito et al, 1999). It is thus possible to do local mutagenesis in a region of particular interest.
  • One technique of mutagenesis by transposons which can be advantageously used is mutagenesis by transposon Mutator confirmed by screening in reverse genetics (Bensen et al., 1995; Das et al., 1995). This technique implements the steps consisting in crossing a “Mutator” line with hybrids of the plants of interest and then in screening the F1 plants obtained by PCR with a primer specific for transposons and a primer specific for the nucleotide sequence coding for starch phosphorylase.
  • the viral molecules of positive and negative polarities produced during the replication cycle of the virus are recognized as double-stranded RNAs and degraded into small sense and antisense RNAs of 22 nucleotides which in turn will trigger the degradation of endogenous homologous mRNAs.
  • small RNAs of 22 nucleotides derived from viral RNAs suggests that the viruses that induce VIGS are also able to resist them.
  • the advantages of this method is above all its simplicity and the speed of its implementation. In addition, it suffices to clone 23 base pairs of a gene into the virus to specifically target its inactivation.
  • the extraction of the starch produced can be carried out according to standard techniques known to those skilled in the art.
  • the solubilization of starch is also known to a person skilled in the art and can be carried out by soaking and fractionating the starch grain, or for example by heating.
  • enzymes can be used to destruct starch, such as amylases.
  • the starch produced can also be used in many industries: paper and cardboard industry, adhesive industry, textile industry, pharmaceutical industry (for drug formulation), etc.
  • the starch produced can also undergo other modifications, in particular chemical modifications such as acid treatment, oxidation, esterification, etc. before its use. This starch can be used for the preparation of derived products, in particular food products.
  • Figure 1 is a diagram representing the genome of Arabidopsis thaliana.
  • Figure 2 is a graph showing the relative levels of starch accumulation in the mutant line compared to the wild-type reference line (WS).
  • FIG. 3 is a comparison of spectrophotometric analysis profiles of starch from the wild and mutant lines after steric exclusion chromatography on the CL-2B sepharose matrix.
  • FIG. 4 is a comparison of photographs of views with a transmission electron microscope of starch grains (enlargement x3000).
  • mutant line The inventors studied the phenotypes of a mutant line of Arabidopsis thaliana, produced by interruption of a gene for starch phosphorylase (locus designated AtPHO-1).
  • This line (DDS72) is one of 50,000 mutant lines produced by random insertion of T-DNA, as described by Balzuergue et al., 2001.
  • the mutant line DDS72 of Arabidopsis thaliana studied exhibits insertion of DNA- T at the junction of exon 6 and intron 6 (see Figure 1 and SEQ ID
  • the phosphorylases function in the direction of the synthesis of polysaccharides by adding a residue of glucose at the non-reducing end of the glycans available via an ⁇ -1, 4 bond. The activity is then revealed by coloring the gel with iodine. It is the form of rapid migration (on glycogen or starch) which disappears completely in the mutant at the AtPHO-1 locus.
  • ⁇ ma ⁇ of the iodine-polvsaccharide complex The length of the maximum absorbance of the complex formed by the iodine with the polysaccharides is determined by spectrophotometry. 100 ⁇ g of starch are dissolved in 100% DiMethylSulfOoxide (DMSO) for 10 minutes at 100 ° C. This solution is then brought to 10% in DMSO. To 400 ⁇ l of this solution are added 100 ⁇ l of a 0.02% l 2 and 0.2% Kl iodine solution. The absorption spectrum is produced between 400 and 700 nm. The quantities of polysaccharides present in each fraction can also be determined using the Enzytec assay kit. There does not seem to be any particular modification of the starch structure of the AtPHO-1 mutant line if a comparison is made between the two profiles presented in FIG. 3. 4. Analysis of the structure of the starch accumulated by the AtPHO-1 line by electron microscopy:
  • the pellet (containing the chloroplasts) was resuspended in 500 ⁇ l of the same buffer and loaded onto a discontinuous Percoll gradient: 2 ml of 65% Percoll (bottom of the tube), 2 ml of 45% Percoll, 2 ml of 20% Percoll (top of the tube).
  • the sample was centrifuged for 30 minutes at 4200 g and 4 ° C.
  • the pellet formed at the interface between the 45% and 65% Percoll layers was collected and diluted in two volumes of the purification buffer and then centrifuged at 1800 g at 4 ° C for 2 minutes. The pellet was then washed twice in the same buffer and resuspended in 200 ⁇ l of the purification buffer.

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour un procédé pour augmenter la taille des grains d'amidon et/ou la teneur en amidon d'une plante ou d'une partie de plante, dans lequel on inactive le gène d'une amidon phosphorylase dans les cellules de la plante.

Description

Procédé d'amélioration des plantes
La présente invention concerne un procédé pour augmenter la taille des grains d'amidon produits dans les plantes et/ou pour augmenter la teneur des plantes en amidon.
L'amidon est le polyoside de stockage énergétique chez les végétaux. Il constitue le principal apport calorique de l'alimentation animale et humaine et est également une source majeure de matière première végétale pour des utilisations non alimentaires. L'amidon est composé de deux fractions polysaccharidiques distinctes : l'amylose et l'amylopectine. L'amylose, qui représente la fraction minoritaire de l'amidon, est constitué de résidus glucose unis par des liaisons α-1 ,4, et présente moins de 1% de ramifications. L'amylopectine, qui représente la fraction majoritaire de l'amidon, est constituée de résidus glucose unis par des liaisons α-1 ,4, et présente environ 5% de ramifications, constituées par des résidus de glucose liés au polymère principal par une liaison α-1 ,6. La distribution asymétrique de la ramification de l'amylopectine est responsable de la croissance illimitée des molécules d'amidon et par conséquent des grains d'amidon, et rend également compte de la plupart des propriétés physico-chimiques de l'amidon. La biosynthèse de l'amidon dépend d'une voie métabolique dont les étapes biochimiques principales sont la synthèse d'ADP-glucose suivie par le transfert de ce précurseur en position α-1 ,4 sur un glucane par des (ADP- glucose :1 ,4-α-D-glucane 4-α-D-glucosyl)transférases, le polymère formé étant ramifié par l'action des enzymes dites de ramification ou de « branchement » : les 1,4-α-D-glucane 6-α-D-(1,4-α-D-glucano)-transférases. La dégradation de l'amidon implique plusieurs enzymes, dont l'α- amylase (endoamylase), la β-amylase (exoamylase), l'amyloglucosidase, et l'alpha-glucane phosphorylase (amidon phosphorylase). Le rôle de ces diverses enzymes de dégradation de l'amidon n'est pas clairement établi. Par exemple, il a été rapporté qu'une expression réduite d'une phosphorylase dans les feuilles, par répression par antisens, n'avait pas d'influence significative sur l'accumulation d'amidon, chez la pomme de terre (Sonnewald et al., 1995). Puisque la répression par antisens de l'activité α-glucane phosphorylase n'avait pas d'influence significative sur l'accumulation d'amidon dans les feuilles de pommes de terre transgéniques, les auteurs en ont conclu que la rupture de l'amidon n'était pas catalysée par les phosphorylases. Le brevet US 5,998,701 divulgue que la réduction de la teneur en phosphorylase dans les tubercules de pomme de terre a pour conséquence une diminution substantielle de l'accumulation des sucres, ce qui peut être mis à profit pour allonger les durées de stockage des tubercules. Le brevet US 6,353,154 propose, quant à lui, de modifier les activités de l'amidon phosphorylase chez les plantes, en particulier le maïs, dans le but d'obtenir une synthèse d'amidon qui serait modifié dans sa structure. Les inventeurs ont maintenant mis en évidence que l'inactivation du gène codant pour une amidon phosphorylase induit une augmentation significative de la taille des grains d'amidon produits dans les plantes, ainsi que de la quantité d'amidon accumulé. Sur cette base, la présente invention fournit un procédé pour augmenter la taille des grains d'amidon d'une plante ou d'une partie de plante, dans lequel on inactive le gène d'une amidon phosphorylase dans les cellules de la plante. Ce procédé est particulièrement avantageux pour augmenter les rendements lors de l'extraction et de la purification de l'amidon à l'échelle industrielle. En effet, les grains d'amidon les plus petits sont généralement perdus au cours des lavages lors des processus d'extraction et de purification. Une augmentation de la taille des grains permet d'éviter la perte d'une partie des grains d'amidon. La présente invention fournit également un procédé pour augmenter la teneur en amidon d'une plante ou partie de plante, dans lequel on inactive le gène d'une amidon phosphorylase dans les cellules de la plante. Il faut comprendre que l'augmentation de la taille des grains d'amidon et l'augmentation de la teneur en amidon ne sont pas nécessairement liées, à savoir qu'a priori l'augmentation de la teneur en amidon n'implique pas obligatoirement une augmentation de la taille des grains d'amidon, et vice versa. La présente demande montre l'existence d'une interaction entre l'amidon phosphorylase, l'amidon synthase, et les enzymes de branchement.
La phosphorylase, le cas échéant en interaction avec une glycogénine
(WO 03/014365), amorcerait l'initiation de l'amidon en fournissant l'amorce appropriée vis à vis des enzymes de branchement et de l'amidon synthase. Sans pour autant être liés par cette théorie, on peut émettre une hypothèse pour expliquer l'augmentation de la taille moyenne des grains d'amidon dans les plantes dans lesquelles l'amidon phosphorylase est inactivée. Selon cette théorie, du fait de l'inactivation de la phosphorylase, seule l'amidon synthase (notamment SS 5 chez Arabidopis, SS I chez le maïs) pourrait interagir avec la glycogénine et initier la synthèse d'amidon. L'interaction plus faible avec la glycogénine, voire également une expression plus tardive, résulterait en un retard dans l'initiation de la synthèse de l'amidon, et donc du nombre de granules produits (initiés). Comme le nombre de molécules d'amidon initiées est moins important mais que les substrats nécessaires à la synthèse de l'amidon sont présents au même niveau, on obtient des grains plus gros car utilisant la même quantité de substrat pour un nombre réduit de granules. L'invention fournit également un procédé pour l'obtention de plantes ou parties de plante produisant des grains d'amidon de taille accrue, ledit procédé comprenant l'inactivation du gène d'une amidon phosphorylase dans les cellules de la plante. L'invention fournit par ailleurs un procédé pour l'obtention de plantes, de tissus de plante ou parties de plante à teneur élevée en amidon, ledit procédé comprenant l'inactivation du gène d'une amidon phosphorylase dans les cellules de la plante. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. L'invention concerne aussi tout tissu de plante susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention ainsi que les plantes transgéniques le comprenant. De plus, les graines issues des plantes obtenues selon l'un des procédés mentionnés selon l'invention caractérisées en ce qu'elles ont une taille accrue, et/ou une teneur en amidon modifiée rentrent dans le cadre de la présente invention. Les « amidon phosphorylases », également connues sous le nom de
« alpha-g lucane phosphorylases », ont été décrites dans de nombreuses plantes, par exemple la fève, la pomme de terre (Swissprot P04045), la betterave, l'épinard, le maïs (WO 98/40503), le petit pois ainsi que le riz (EMBL n° d'accès D23280 ou Q9AUV8), et le blé (EMBL AAQ73181). La séquence génomique (locus désigné AtPHO-1) codant pour l'amidon phosphorylase d'Arabidopsis thaliana est présentée en annexe (SEQ ID N° 1). L'amidon phosphorylase est soumise à un adressage vers le plaste de la cellule. L'homme du métier sait comment identifier les phosphorylases à inactiver par exemple par comparaison de séquences entre SEQ ID N°1 avec des séquences d'autres espèces en utilisant un programme informatique de comparaison de séquence tel que Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) et le programme FastDB avec les paramètres par défauts.. Ces algorithmes sont présentés dans Current Methods in Sequencing and synthesis Methods and Applications, pages 127-149, 1988, Ala. R. Liss, Inc, incorporé dans la description par référence. Une autre méthode possible repose par exemple sur l'hybridation sélective dans des conditions de fortes stringence telles que définies dans Sambrook et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) aux paragraphes 11.1 à 11.61. .En particulier il peut s'agir plus particulièrement de formes alleliques des enzymes citées ci- dessus. Les phosphorylases à inactiver sont de préférence adressées au plaste, c'est-à-dire dirigées vers le plaste. L'homme du métier est capable d'identifier sur la séquence le motif correspondant au peptide d'adressage au plaste. Pour ce faire, il peut utiliser par exemple le logiciel Génoplante®Predotar (Small I. et al., 2004, Proteomics, vol 4.(6) 1581-1590 et accessible sur le site http://www.genoplante.com). L'expression « teneur élevée en amidon » signifie que la plante transgénique obtenue fournit une quantité d'amidon supérieure à une plante de même espèce, non transformée. « L'inactivation du gène de l'amidon phosphorylase » signifie que le gène est rendu non fonctionnel, c'est-à-dire qu'il ne permet plus ou pratiquement plus l'expression d'une protéine amidon phosphorylase active, la protéine n'étant plus ou pratiquement plus exprimée, ou alors sous une forme mutée non fonctionnelle, incapable d'exercer ses propriétés enzymatiques. L'inactivation du gène peut être réalisée par tout moyen de l'homme du métier (voir Torneycroft et al., 2001), en particulier par interruption du gène, ou extinction de l'expression génique (« gène silencing »). Selon un mode de réalisation préféré, on introduit une mutation dans le gène codant pour l'amidon phosphorylase, qui rend ce gène non fonctionnel, à savoir qu'il devient incapable d'exprimer l'enzyme, ou que l'enzyme produite est inactive. En particulier, la mutation peut consister en une insertion de nucléotide(s), par exemple entre l'exon 6 et l'intron 6 du gène de l'amidon phosphorylase. L'extinction du gène peut ainsi être réalisée par insertion d'ADN-T. La séquence SEQ ID N° 2 montre ainsi le gène de l'amidon phosphorylase d'Arabidopsis thaliana dans lequel une séquence ADN-T est insérée. L'invention se rapporte également à l'utilisation de la séquence polynucléotidique SEQ ID N°2 pour la fabrication d'une plante avec une taille des grains d'amidon et/ou la teneur en amidon modifié. La plante obtenue selon l'invention est choisie parmi la pomme de terre, la fève, la betterave, l'épinard, le petit pois, le blé, le maïs ou le riz. L'ADN-T a été utilisé comme mutagène dès la fin des années 80. Chez Arabidopsis, qui ne possède pas de transposons endogènes ayant une activité permettant de faire de la mutagenèse insertionnelle, il a été utilisé préférentiellement aux transposons. La bactérie du sol Agrobacterium a la capacité de transférer un morceau de son ADN, l'ADN-T, dans le génome nucléaire des cellules de plantes. Cette propriété est très utile pour inactiver des gènes par mutagenèse d'insertion. Les seuls éléments nécessaires sont des répétitions de 24 paires de base, les séquences bordures, qui délimitent la région à transférer. L'accroissement de l'efficacité des méthodes de transformation a facilité le développement de la génétique inverse. L'infiltration sous vide de plantes entières a permis d'augmenter l'efficacité de transformation (4 à 5 transformants par plante traitée) de même que la reproductibilité. Récemment, la méthode a encore été simplifiée avec l'apparition du « floral dip ». Les inflorescences sont simplement trempées dans une suspension d'Agrobacterium en présence d'un surfactant, le Silwet L- 77 et de saccharose. Avec ces différentes méthodes, tous les transformants obtenus sont hémizygotes pour l'ADN-T, ce qui suggère une transformation tardive au cours du développement floral. La cible de transformation a été identifiée comme étant l'ovule en développement. Les mutations létales à l'état homozygote sont maintenues dans la population sous forme de plantes hétérozygotes. On obtient en moyenne une à deux insertions par plante. Les analyses de ségrégation montrent que 57 % des transformants contiennent 1 locus d'insertion, 25 % 2 locus, 8 % 3 locus et 2 % plus de 3. Une analyse moléculaire des mutants étiquetés montrent que ces insertions se font au hasard, sont stables, maintenues dans la descendance et qu'il y a peu de biais d'insertions. L'inactivation du gène de l'amidon phosphorylase endogène peut également être obtenue par mutagenèse des cellules de plante, par exemple par irradiation U.V, par un agent mutagène chimique, ou par insertion de transposons. Les éléments transposables ont la capacité de perturber l'expression de gènes dans lesquels ils sont insérés et de générer des délétions, réarrangements, et mutations au locus cible. Les transposons ont été les premiers agents insertionnels mutagènes utilisés chez le maïs puis chez le pétunia et Anthirrhinum. Contrairement à l'ADN-T, le transposon peut être excisé du gène disrupté en présence d'une transposase. La haute fréquence de réversion de la mutation qui en résulte permet de confirmer qu'elle est induite par le transposon. La remobilisation des transposons permet aussi de générer des mosaïques : un mutant homozygote qui porte une transposase active aura des secteurs somatiques qui ont perdu le transposon Ds et restauré la fonction du gène. Ceci permet de déterminer le site d'action d'un gène en combinaison avec son patron d'expression. D'autre part, pour les transposons de type Ac/Ds, la plupart des événements de transposition se produisent à des sites génétiquement liés. S'il existe un élément transposable près d'un gène d'intérêt, il pourra donc être remobilisé pour se réinsérer dans le gène ou à proximité (Ito et al, 1999). Il est ainsi possible de faire de la mutagenèse locale dans une région d'intérêt particulier. Une technique de mutagenèse par transposons qui peut être avantageusement utilisée est la mutagenèse par transposon Mutator confirmée par un criblage en génétique inverse (Bensen et al., 1995 ; Das et al., 1995). Cette technique met en œuvre les étapes consistant à croiser une lignée "Mutator" avec des hybrides des plantes d'intérêt puis à cribler les plantes F1 obtenues par PCR avec une amorce spécifique des transposons et une amorce spécifique de la séquence nucléotidique codant pour l'amidon phosphorylase. Les graines F2 obtenues à partir des plantes criblées F1 permettent d'obtenir des plantes dont le phénotype est alors analysé. Une autre méthode pour inactiver le gène de l'amidon phosphorylase est l'injection locale d'ARN double brin (RNA interférence : RNAi) (Fire, 1999). Les ARN double-brin sont clivés en petits ARN sens et antisens de 22 nucléotides environ qui vont cibler la dégradation des ARNm endogènes homologues (Zamore et al., 2000). L'expression constitutive d'ARN double brin par un transgène mettant en jeu des séquences inversées répétées placées sous le contrôle du promoteur 35S permet d'obtenir une inactivation efficace dans l'ensemble de la plante, y compris dans le méristème (Waterhouse et al., 1998). Cette stratégie est très efficace tout au long du développement des plantes. L'inactivation du gène d'une amidon phosphorylase endogène peut être par ailleurs réalisée selon le procédé comprenant les étapes consistant à : a) fournir un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique antisens du gène codant pour ladite amidon phosphorylase endogène; b) transformer une cellule de plante avec ledit vecteur d'expression ; c) régénérer la plante à partir de la cellule transformée à l'étape b, ladite plante transgénique ainsi obtenue présentant des grains d'amidon de taille accrue, d'une teneur en amidon élevée. Une autre possibilité pour réduire l'activité de l'amidon phosphorylase dans les cellules des plantes est d'exprimer des ribozymes qui sont des molécules d'ARN qui agissent comme des enzymes catalysant spécifiquement le clivage des transcrits codant pour l'amidon phosphorylase, par des techniques connues de l'homme du métier (EP 321 021). Il est également possible d'obtenir une plante présentant une altération de l'expression d'amidon phosphorylase par le procédé dit "transwitch" décrit dans WO90/12084. L'inactivation du gène de l'amidon phosphorylase peut également être obtenue en infectant les plantes par des virus recombinants dans lesquels une partie de la séquence codante ou du promoteur du gène à inactiver a été introduite (virus-induced gène silencing ou VIGS) (Ratcliff et al., 2001). Pour expliquer ce phénomène, on pense que les molécules virales de polarités positives et négatives produites au cours du cycle de réplication du virus sont reconnus comme des ARN double brin et dégradées en petits ARN sens et antisens de 22 nucléotides qui vont à leur tour déclencher la dégradation des ARNm endogènes homologues. Toutefois, seuls les ARNm endogènes sont totalement dégradés alors que les ARN viraux restent détectables. La présence de petits ARN de 22 nucléotides dérivés des ARN viraux, suggère que les virus qui induisent le VIGS sont également capables d'y résister. Les avantages de cette méthode sont avant tout sa simplicité et la rapidité de sa mise en oeuvre. De plus, il suffit de cloner 23 paires de base d'un gène dans le virus pour cibler spécifiquement son inactivation. La construction des vecteurs d'expression utilisés (portant par exemple une séquence antisens du gène de l'amidon phosphorylase endogène) ou des ARNi est à la portée de l'homme du métier suivant les techniques standard. La transformation de cellules végétales peut être réalisée par transfert des vecteurs ou des acides nucléiques dans les protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca2+). La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de Fromm et a/., 1986. La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de Sanford, (1988). Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par biolistique, c'est-à-dire par projection, au moyen d'un canon à particules, de microparticules recouvertes des séquences nucléotidiques à transférer (J. Finner, 1992). Selon un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences d'ADN d'intérêt initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'An et al., 1986, ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Jouanin et al., 1987. De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extra- chromosomique inducteur de tumeurs Ti dx Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al.). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium. Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de Franck et al., (1980), ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d' 'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline (Depicker et al.,
1982). Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment : - le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrits dans l'article de Kay et al., 1987 ; - le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression des séquences associées uniquement dans les semences (ou graines) de la plante transgénique obtenue ; - les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et GEA6, respectivement, d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993) et permettant une expression spécifique dans les graines ; - le promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., 1995), constitué de la fusion d'une triple répétition d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de l'octopine synthase d' Agrobacterium tumefaciens, d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase et du promoteur mannopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens ; - le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-IAR) contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Me Elroy et al., 1991 ; - le promoteur HMGW (High Molecular Weight Glutenine) d'orge ; - le promoteur du gène de γzéine de maïs (Pγzéine) contenu dans le plasmide pγ63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs.
Parmi les cellules végétales susceptibles d'être transformées conformément à la présente invention, on peut citer celles de la pomme de terre, la fève, la betterave, l'épinard, le petit pois, le blé, le maïs ou le riz. La présente invention permet aussi d'obtenir une plante ou partie de plante telle que notamment la pomme de terre, le blé, le maïs ou le riz, produisant des grains d'amidons de taille accrue, ou une teneur élevée en amidon. Par « partie de plante », on entend notamment les organes de réserve naturellement riches en amidon, tels que les graines ou les tubercules. Par « partie de plante », on entend également les cellules de ladite plante.
L'extraction de l'amidon produit peut être réalisée selon les techniques standard connues de l'homme du métier. La solubilisation de l'amidon est également connue de l'homme du métier et peut être réalisée par trempage et fractionnement du grain d'amidon, ou par exemple par chauffage. De manière alternative, on peut utiliser des enzymes déstructurent l'amidon, telles que les amylases. L'amidon produit peut également être utilisé dans de nombreuses industries : industrie du papier et du carton, industrie des adhésifs, industrie textile, industrie pharmaceutique (pour la formulation des médicaments), etc. L'amidon produit peut également subir d'autres modifications, en particulier des modifications chimiques telles qu'un traitement acide, une oxydation, une estérification, etc avant son utilisation. Cet amidon peut être utilisé pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDE DES FIGURES :
La figure 1 est un schéma représentant le génome d'Arabidopsis thaliana. La figure 2 est un graphe montrant les niveaux relatifs d'accumulation d'amidon dans la lignée mutante par rapport à la lignée sauvage de référence (WS). La figure 3 est une comparaison de profils d'analyse spectro- photométrique d'amidon des lignées sauvage et mutante après chromatographie d'exclusion stérique sur matrice de sépharose CL-2B. La figure 4 est une comparaison de photographies de vues au microscope électronique à transmission, de grains d'amidon (agrandissement x3000).
EXEMPLES :
1. Description de la lignée mutante: Les inventeurs ont étudié les phénotypes d'une lignée mutante d'Arabidopsis thaliana, produit par interruption d'un gène de l'amidon phosphorylase (locus désigné AtPHO-1). Cette lignée (DDS72) est l'une des 50 000 lignées mutantes produites par insertion aléatoire d'ADN-T, comme décrit par Balzuergue et al., 2001. La lignée mutante DDS72 d'Arabidopsis thaliana étudiée présente une insertion d'ADN-T à la jonction de l'exon 6 et de l'intron 6 (cf figure 1 et SEQ ID
N° 2). 2. Analyse enzymologique de la lignée mutante : Afin de déterminer l'impact de l'insertion de l'ADN-T au locus AtPHO-1 sur l'activité des amidon-phosphorylases, les inventeurs ont effectué des zymogrammes à partir d'extraits cellulaires de diverses lignées mutantes et sauvages (WS). Les zymogrammes ont été réalisés dans deux conditions différentes. - Extraction des protéines des feuilles Les feuilles sont broyées à 4°C à l'aide du Polytron Blender dans le tampon suivant : 50 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCI. Le broyât est centrifugé 5 minutes à 13000 rpm à 4°C et on récupère le surnageant contenant les protéines solubles. - Electrophorèse en gel de pol acrylamide Les gels sont réalisés avec les chambres d 'electrophorèse MiniProtean Il commercialisés par BioRAD (Richmond, CA, USA). Les gels ont une épaisseur de 1 ,5 mm. La concentration finale en monomère est de 7,5% (p/v) pour le gel de séparation, il contient également 0,45% de glycogène de foie de lapin ou 0,2% d'amidon de pomme de terre. Il est tamponné par le Tris/HCl 110mM pH 7,2. Le gel de concentration à 2,5% final en monomère est tamponné par le Tris/H3PO4 60mM pH 7,3. Le tampon de migration utilisé pour l'électrophorèse est le Glycine/Tris 40mM pH 8,5. A 100 μg d'extrait protéique, sont ajoutés 10 μl de Tris/H3PO460mM pH 7,3 et 20 μl de tampon de chargement : saccharose 25% (p/v), bleu de bromophénol 0,001%. La migration se déroule à 4°C durant 2h30 à 15mA et 250V. A l'issue de celle-ci, le gel est équilibré dans le Citrate/NaOH 100mM pH 7,0 pendant 10 minutes avant d'être incubé toute la nuit à température ambiante dans le citrate/NaOH 100mM pH 7,0, Glucose-1 -phosphate 50 mM. A cette concentration, les phosphorylase fonctionnent dans le sens de la synthèse des polysaccharides en ajoutant un résidu de glucose en extrémité non-réductrice des glycanes disponibles par l'intermédiaire d'une liaison α-1 ,4. L'activité est ensuite révélée par coloration du gel à l'iode. C'est la forme de migration rapide (sur glycogène ou amidon) qui disparaît totalement dans le mutant au locus AtPHO-1.
3. Impact de la mutation sur le polysaccharide de réserve : - Extraction d'amidon des feuilles d'Arabidopsis thaliana Les feuilles d'A thaliana sont prélevées en fin de photopériode puis rincées deux fois dans un grand volume d'eau désionisée (afin de retirer les débris non désirés). Dans la glace, on broie le matériel dans 15-25 ml de tampon d'extraction (MOPS 100 mM pH 7.2, EDTA 5 mM, Ethylène glycol 10%) à l'aide du Polytron Blender (broyeur de tissus) jusqu'à obtenir un extrait bien homogène sans aucun tissu intact. On passe l'extrait 4 x 15 secondes au sonicateur « continu » et entre chaque sonication, on plonge le tube dans la glace. Centrifuger 15 minutes à 3200 g à 4°C. Le culot est repris dans 20 ml de Percoll (Amersham Biosciences) à 90% et centrifugé 40 minutes à 10000 g dans un tube en verre de type Corex. On retire les débris en surface et le surnageant. Le culot d'amidon est rincé cinq fois par de l'eau désionisée avant son analyse. - Dosage de l'amidon L'amidon est dosé à l'aide du kit Enzytec commercialisé par Diffchamb
(Lyon, France). Les glucanes sont digérés par une amyloglucosidase qui hydrolyse les liaisons O-glycosidiques α-1 ,4 et α-1 ,6. Les molécules de glucose ainsi libérées sont ensuite phosphorylées en position 6 par une hexokinase. Le glucose-6-phosphate produit est ensuite oxydé en gluconate-6- P par une G6P déshydrogénase en réduisant le NADP en NADPH. Cette dernière réaction est suivie au spectrophotomètre à 365 nm. La quantité d'amidon dosée est présente au tableau 1 :
Tableau 1
Lignée Quantité d'amidon (en mg/g de feuilles) WS (liαnée sauvaqe 1 ,16 AtPHO-1 (lignée DDS72) 2,78 La figure 2 présente les niveaux relatifs d'accumulation d'amidon dans les différentes lignées par rapport à la lignée sauvage de référence (WS). La structure de l'amidon est ensuite analysée par chromatographie d'exclusion stérique sur matrice de sépharose CL-2B. - Fractionnement de l'amidon Le fractionnement est réalisé par chromatographie d'exclusion stérique sur matrice de sépharose CL-2B (Amersham-Biosciences, Suède). La colonne possède un diamètre interne de 0,5 cm et une hauteur de 65 cm. Equilibrée dans la soude 10 mM, son débit est de 12 ml/heure. La préparation de l'échantillon d'amidon est effectuée comme suit : on dissout 1 ,5mg d'amidon natif dans 200 μl de DMSO 100% à 100°C pendant 10 minutes. Le polysaccharide est ensuite précipité par 4 volumes d'éthanol pur à -20°C pendant 30 min. Après centrifugation à 5000 g pendant 5 minutes, le culot d'amidon est dissous dans 500 μl de soude 10 mM puis déposé sur la colonne. Les fractions de 300 μl sont analysées par spectrophotometrie à l'iode. - Détermination de la λmaχ du complexe iode-polvsaccharide : La longueur du maximum d'absorbance du complexe formé par l'iode avec les polysaccharides est déterminée par spectrophotometrie. 100 μg d'amidon sont dissous dans le DiMéthylSulfOxyde (DMSO) 100% durant 10 minutes à 100°C. Cette solution est ensuite ramenée à 10% en DMSO. A 400 μl de cette solution, sont rajoutés 100 μl d'une solution d'iode 0,02% l2 et 0,2% Kl. Le spectre d'absorption est réalisé entre 400 et 700 nm. On peut également déterminer les quantités de polysaccharides présentes dans chaque fraction à l'aide du kit de dosage Enzytec. Il ne semble pas y avoir de modification particulière de la structure de l'amidon de la lignée mutante AtPHO-1 si on fait la comparaison entre les deux profils présentés à la figure 3. 4. Analyse de la structure de l'amidon accumulé par la lignée AtPHO-1 par microscopie électronique :
- Préparation des échantillons pour la microscopie électronigue à transmission Les échantillons sont inclus dans l'agar à 3% dans l'eau. Ils sont ensuite traités au PATAg : acide périodique-thiosemicarbazide-argent avec un temps d'incubation de 20 minutes dans l'acide périodique. On réalise ensuite une inclusion dans une résine hydrophile (nanoplast) pendant 10 jours avant de consolider la préparation par une inclusion dans une résine LR-White Hard grade. Les coupes sont effectuées à l'ultramicrotome (microme MT-7000) avec une épaisseur de 60 à 100 nm. Les observations sont effectuées au MET (Jeol 100S) à 80keV (fjgure_4). Les images obtenues ont été analysées en repérant les paramètres suivants : - surface totale, - diamètre équivalent, - rapport des différentes longueurs. Les valeurs sont traitées grain par grain. S'agissant de la lignée sauvage, les tailles sont très variées : on note la présence importante d'assez gros grains mais aussi de quelques très petits. Sur 556 grains analysés, le diamètre équivalent moyen est de 1.27 μm. Les grains de forme allongée semblent majoritaires. S'agissant de la lignée mutante, les grains sont de grosse taille et de formes plus arrondies (convexes) avec une présence de grains anguleux. 256 grains ont été analysés. L'analyse statistique montre que les grains d'amidon de la lignée mutante au locus AtPHO-1 sont en moyenne plus gros que ceux de la lignée sauvage. Ainsi, deux modifications majeures sont observées en ce qui concerne l'amidon dans la lignée mutante au locus AtPHO-1 chez A. thaliana : 1) une augmentation de la taille moyenne des grains d'amidon dans la lignée mutante, 2) une augmentation significative de la quantité d'amidon accumulée dans les feuilles.
5. Interaction entre l'amidon phosphorylase, l'amidon synthase, et les enzymes de branchement : La phosphorylase est l'une des premières enzymes impliquées dans la biosynthèse de l'amidon ; qui apparaît dans les amyloplastes de l'endosperme du maïs. L'enzyme continue à présente tout au long du processus de biosynthèse de l'amidon et est la seconde enzyme la plus abondante dans ce processus (après l'enzyme llb de branchement). Des études de zymogrammes sur gels natifs ont permis d'identifier une zone où trois activités différentes sont présentes (amidon synthase soluble SSS ou SS ; enzymes de branchement SBE, et phosphorylase), suggérant l'existence d'un complexe incluant les enzymes responsables de ces activités. De plus le fractionnement enzymatique couplé à des zymogrammes a montré une interaction entre l'amidon phosphorylase et les enzymes de branchement.
Ces zymogrammes ont fait appel aux conditions suivantes : Le principe des zymogrammes est de soumettre les enzymes à une séparation par electrophorèse, les gels d'electrophorese étant ensuite trempés dans une solution déclenchant la réaction enzymatique là où l'enzyme a migré. Pour révéler l'amidon phosphorylase, la solution mise en contact avec le gel contient du glucose 1 -phosphate, substrat de l'enzyme. La réaction enzymatique produit la génération et l'élongation de glucane linéaire. Les bandes bleues apparaissent là où l'enzyme a migré. Pour révéler l'amidon synthase, la solution mise en contact avec le gel contient de l'amylopectine et de l'ADP-glucose, substrats de l'enzyme. La réaction enzymatique produit l'élongation des chaînes d'amylopectine avec l'ADP-glucose. Les bandes bleues apparaissent là où l'enzyme a migré. Pour révéler les enzymes de branchement (SBE), la solution mise en contact avec le gel contient du glucose 1 -phosphate, substrat de l'enzyme, et une phosphorylase b exogène (de lapin). La réaction enzymatique produit la génération et l'élongation de glucanes linéaires avec le glucose 1 -phosphate, glucanes qui sont branchés par les SBE. Des bandes brunes apparaissent là où l'enzyme a migré.
D'autres études chez des mutants du maïs et des maïs doubles transgéniques (a/aSBE2b et a/s SSI) ont montré que le domaine des activités enzymatiques multiples observé sur les gels natifs était composé d'au moins la SSI, SBE2b et la phosphorylase. Sans être liés par cette théorie, il est probable au vu de l'interaction de la phosphorylase avec les enzymes directement impliquées dans la biosynthèse d'amidon, que l'amidon phosphorylase est impliquée également dans la biosynthèse de l'amidon. En raison de l'existence de ce complexe et parce que la phosphorylase apparaît de manière précoce par rapport à l'AGPase ou la SSI dans l'endosperme de maïs, on peut émettre l'hypothèse que l'amidon phosphorylase, en utilisant la glucose 1 -phosphate, génère une chaîne naissante de polymère de glucose qui agirait comme amorce pour les activités des enzymes SBE2b et SSI dans l'amyloplaste du maïs.
6. Vérification de la compartimentation subcellulaire de PHO1 : Il existe, outre PHO1, une deuxième phosphorylase chez Arabidopsis thaliana : PHO2. D'après les prédictions bioinformatiques, la localisation subcellulaire de PHO2 serait restreinte au cytosol de la cellule, tandis que PHO1 serait dirigée vers le chloroplaste. Pour confirmer la localisation subcellulaire de PHO1 , les inventeurs ont procédé à une purification des chloroplastes, suivie d'un zymogramme des activités phosphorolytiques, c'est-à-dire en suivant l'activité d'une forme cytosolique de β-amylase (Zeeman et al., 1998) correspondant au gène At4g15210 (gène ram-7 décrit dans Laby et al., 2001). a) purification des chloroplastes : La purification des chloroplastes a été réalisée en suivant un protocole standard : Des plantes âgées de trois à quatre semaines ont été laissées dans le noir complet à 4°C pendant 48 heures. Les feuilles (10 g) ont été recueillies à 4°C et homogénéisées dans 200 ml de sorbitol 330 mM, MES 25 mM, pH 6,5, MgCI2 5 mM, isoascorbate 2 mM (tampon de purification). L'homogénat a été filtré à travers trois couches de Miracloth et centrifugé 3 minutes à 2500 g à 4°C. Le supernageant correspond à la fraction enrichie en cytosol (CytoEF). Le culot (contenant les chloroplastes) a été resuspendu dans 500 μl du même tampon et chargé sur un gradient discontinu de Percoll : 2 ml de Percoll 65% (fond du tube), 2 ml de Percoll 45%, 2 ml de Percoll 20% (haut du tube). L'échantillon a été centrifugé pendant 30 minutes à 4200 g et 4°C. Le culot formé à l'interface entre les couches de Percoll à 45% et 65% a été recueilli et dilué dans deux volumes du tampon de purification puis centrifugé à 1800 g à 4°C pendant 2 minutes. Le culot a ensuite été lavé deux fois dans le même tampon et resuspendu dans 200 μl du tampon de purification. b) Zymogramme : Le gel de polyacrylamide (7,5%) contient du glycogène de foie de lapin
(0,6%). Les puits ont été chargés avec 100 μg de protéines et l'extrait a été soumis à une migration à 4°C en conditions natives à raison de 15 mA/gel pendant 2 heures. Le gel a ensuite été incubé pendant une nuit à température ambiante dans un milieu tamponné (Citrate de sodium 100 mM pH 7,0 + Glucose 1 -phosphate 20 mM). Le gel a enfin été immergé dans une solution d'iode qui permet de révéler les zones où des activités enzymatiques ont modifié la structure de l'amidon (les zones non soumises à l'action d'enzymes de modification se colorent en orange). Les résultats confirment que PHO1 est localisée dans le stroma du chloroplaste tandis que PHO2 est une protéine exclusivement cytosolique. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour augmenter la taille des grains d'amidon et/ou la teneur en amidon d'une plante ou d'une partie de plante, dans lequel on inactive le gène d'une amidon phosphorylase dans les cellules de la plante.
2. Procédé pour l'obtention de plantes ou parties de plante produisant des grains d'amidon de taille accrue ou à teneur élevée en amidon, ledit procédé comprenant l'inactivation du gène d'une amidon phosphorylase dans les cellules de la plante.
3. Procédé selon la revendication 2, comprenant les étapes consistant à inactiver, par insertion de nucléotide(s), le gène codant pour ladite amidon phosphorylase endogène dans une cellule de plante, et régénérer la plante à partir de la cellule transformée, ladite plante transgénique ainsi obtenue présentant des grains d'amidon de taille accrue, et/ou une teneur en amidon élevée.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel la plante est la pomme de terre, la fève, la betterave, l'épinard, le petit pois, le blé, le maïs ou le riz.
5. Cellule végétale susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendication 2 à 4.
6. Plante transgénique comprenant une cellule végétale selon la revendication 5.
7. Graine issue de la plante selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle a sa taille accrue, et/ou une teneur en amidon modifiée.
8. Utilisation de la séquence polynucléotidique SEQ ID N°2 pour la fabrication d'une plante avec une taille des grains d'amidon et/ou la teneur en amidon modifiée.
9. Utilisation selon la revendication 8 caractérisée en ce que la plante obtenue est choisie parmi la pomme de terre, la fève, la betterave, l'épinard, le petit pois, le blé, le maïs ou le riz.
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