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WO2005094886A1 - Gpiアンカー蛋白質アゴニストによる調節性t細胞分化誘導・増殖方法およびそのための医薬組成物 - Google Patents

Gpiアンカー蛋白質アゴニストによる調節性t細胞分化誘導・増殖方法およびそのための医薬組成物 Download PDF

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WO2005094886A1
WO2005094886A1 PCT/JP2005/006119 JP2005006119W WO2005094886A1 WO 2005094886 A1 WO2005094886 A1 WO 2005094886A1 JP 2005006119 W JP2005006119 W JP 2005006119W WO 2005094886 A1 WO2005094886 A1 WO 2005094886A1
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regulatory
agonist
gpi anchor
antibody
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Tomoko Watanabe
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Kirin Brewery Co Ltd
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Kirin Brewery Co Ltd
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for regulating immunity, particularly a method for regulating immunity by inducing differentiation and promoting proliferation of regulatory ⁇ cells (sometimes called inhibitory ⁇ cells).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for use in a method.
  • ⁇ cells One cell group that plays a central role in the immune system as a host defense system against various pathogens is ⁇ cells.
  • ⁇ Cells are roughly divided into CD4-positive helpers ⁇ cells and CD8-positive cytotoxic ⁇ cells, the former mainly due to the pattern of cytokinin production at specific stages of differentiation and maturation after antigen stimulation.
  • -Th1 cells that produce ⁇
  • Th2 cells that produce IL-4, etc.
  • the former contributes to cell-mediated immunity and the latter contributes to the activation of the humoral immune system, and is deeply involved in host defense. Immune responses are deeply involved in the elimination of pathogens and the acquisition of infectious resistance under a subtle balance by the actions of T cells with these different properties.
  • the latter include induction of cell death or induction of non-responsiveness to autoantigens (Rocha, B., and H. von Boehmer. 1991. Science. 251: 1225-1228 .; Jenkins, MK, and RH Schwartz. 1987. J. Exp. Med. 165: 302-319.), Together with an active suppression mechanism by regulatory T cells (Shevach, EM 2000. Annu. Rev. Immunol. 18: 423- 449.) are known. Regulatory T cells are defined as having an inhibitory effect on other T cells. The immune response is based on a subtle balance, for example, it is known that the Thl cells and Th2 cells described above antagonize each other's immune response, and that one acts as a regulatory T cell for the other.
  • CD4 + CD25 + which is mainly used for mice and rats. It has been studied in non-human species. That is, CD4 positive spleen cell power of normal mice or rats is also CD25 positive, RT6.1 positive (expressed in most of mature rat T cells), CD5 strong positive, or CD45RB weak positive (mouse) or CD45RC weak positive (rat) It was found that removing cells from the cells and transferring the remaining T cells to immunodeficient animals induced organ-specific autoimmune disease.
  • CD4 + CD25 + regulatory T cells were identified in mice and rats as described above, while the presence of similar cells in humans was reported in 2001 by several groups (Jonuleit , H. et al "2001. J. Exp. Med. 193: 1285-1294; Levings, MK et al., 2001. J. Exp. Med. 193: 1295—1301; Dieckmann, D. et al., 2001. J. Exp. Med. 193: 1303-1310; Taama, LS et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31: 1122—1131; Stephens, LA et al "2001. Eur. J. Immunol. 31: 1247-1245; Baecher-Allan, C.
  • potent CD4 + CD25 + regulatory T cells can be stimulated by anti-CD3 antibody stimulation, stimulation by anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, stimulation by allogeneic mature DCs, etc. No DNA synthesis and no production of cytodynamics was observed, ie, CD4 + CD25 + regulatory T cells were in anergy to antigen stimulation.
  • CD4 + CD25 + regulatory T cells can increase their DNA synthesis ability by stimulating the site of cytokines such as IL-2, IL-4 and IL-15 in addition to anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Increasing powers Less than that of CD4 + CD25-negative T cells.
  • CD4 + CD25 + T cells are stimulated by anti-CD3 antibodies or allogeneic mature DCs to stimulate CD4 + CD25 + regulatory T cells.
  • the proliferation inhibitory effect of CD4 positive CD25 negative T cells is observed depending on the number of CD4 positive CD25 positive regulatory T cells.
  • CD4-positive CD25-positive regulatory T cells can produce inhibitory cytokins such as IL-10 and TGF-1, but the growth inhibitory effect on CD4-positive CD25-negative cells is It has been reported that the antibody is not released by the sum antibody, and that the inhibitory effect requires direct cell contact between CD4-positive CD25-negative ⁇ cells and CD4-positive CD25-positive regulatory ⁇ cells.
  • the existence of CD4 + CD25 + regulatory ⁇ cells in mice, rats and humans has been reported and their characterization has been advanced, but their detailed mechanisms of inhibition and inhibitory action have not yet been elucidated. No markers specific to the cells have been found.
  • Trl cells are also anergic, like CD4 + CD25 + regulatory T cells. T cells suppressive mechanisms are influenced by IL-10 and TGF-1 that they produce. May be explainable power Whether the Trl cells and the CD4 + CD25 + regulatory T cells are completely different T cell subsets, or whether they are the same cells at different stages of dyad activity. Tsu, and it is clarified.
  • CD4 + CD25 + T cells were isolated from CD4 + and CD25 + T cells. It was confirmed that CD4 + CD25 + T cells from which blood was separated had other cell surface markers and functions similar to those of the same cells in mice and rats. This suggested the existence of CD4 + CD25 + regulatory T cells in humans. These cells are a rare cell population that makes up only 5-10% of peripheral blood CD4-positive T cells and are unresponsive to activated 'proliferative stimuli.
  • Regulatory T cells can suppress an autoimmune disease (autoimmune encephalomyelitis, colitis) by transferring them to experimental animals (Kohm, AP et al., 2002. J. Immunol.
  • the proteins that make up biological membranes include the transmembrane type, which is present in the cell membrane by the hydrophobic portion contained in the amino acid sequence of its own, and the proteins that are modified by lipids, Some parts are connected to the membrane using the part as an anchor.
  • GPI anchor protein (A)
  • Glycosylphosphatidylinositol anchored protein belongs to the latter, in which the C-terminal part of the protein is modified, and the oligosaccharide chain and the inositol phospholipid complex lipid covalently bind, and bind to the membrane via the hydrophobic part of the lipid. Te ru.
  • GPI anchor proteins There are more than 200 GPI anchor proteins that have been reported so far, and their functions are diverse, such as antigens, enzymes, receptors, and cell adhesion factors (Hiroo Ikezawa, 1999. Protein Nucleic Acid Enzyme. 44: 1321-1328).
  • GPI anchor proteins are also expressed on T cells, and it has been reported that these GPI anchor proteins are involved in T cell activation (Horejsi, V. et al., 1998. Immunol. Letter 63: o3—73; Loertscher, R. ana Lavery, P. 2002. Transplant Immunol. 9: 93-96) o
  • the GPI anchor protein reported to be involved in T cell activation is Thy- 1 (Kroczek, RA et al., 1986. J. Immunol. 136: 4379-4384), Ly-6 (Malek, TR et al., 1986. J. Exp. Med., 164: 709—722), Qa — 2 (Hahn, AB et al., 1989. J.
  • lipid rafts present on T cell membranes play an important role in T cell receptor (TCR) signaling! /! (Xavier, R. et al., 1998) Immunity. 8: 723—732; Montixi, C. et al "1998.
  • GPI anchor proteins are thought to transmit a common signal via lipid rafts, regardless of their type (Hale, G. 2001. Cytotherapy. 3: 137-143). ). Indeed, it has been reported that signal transduction factors phosphorylated by GPI anchor protein cross-linking are highly common (Rosemarie, A, et al., 2000. Int. Immunol.
  • CD59 is a GPI anchor protein of about 20 kDa, structurally belongs to the Ly6 family, and is expressed in cells of various tissues including the blood system. CD59 binds to C9, one of the complement components, and inhibits the binding of C9 to C5b-8, the final stage of late complement assembly. This suppresses the formation of a membrane-damaging complex on the cell membrane and protects the cells from injury by the complement system. Furthermore, in T cells, in addition to the above-described inhibitory effect of the complement system, it is also known to be involved in adhesion by interacting with CD2 (Lovelan, B. 2002. "CD59” in Leukocyte Typing VII, Oxford University Press: 807-809).
  • CD55 is a GPI-anchored protein of about 70 kDa, and is widely expressed in systemic tissues including the blood system. CD55 binds to C3b and C4b, one of the complement components, to inhibit the formation of C3 convertase, and binds to C3bBb and C4b2a to promote the degradation of C3 convertase and regulate complement Injury by the complement system as a factor is known to protect cells! /, Ru (Loveian, B. 2002.'Shishi D5o in Leukocyte Typing VII, Oxford University
  • T cells like other GPI anchor proteins, act as costimulators by cross-linking of the CD59 antigen. Do not activate T cells alone. ⁇ When stimulated with low doses of PMA, anti-CD55 antibodies are used to crosslink CD55 to expand CD4 + and CD8 + T cells (Davis, LS et. al., 1988. J. Immunol. 141: 2246-2252) 0 In the costimulation with CD55, the presence of the GPI anchor is essential, and CD55 is fused with the transmembrane domain of CD46 instead of the GPI anchor.
  • CD48 is a 45 kDa GPI-anchored protein that belongs to the immunoglobulin superfamily. It is widely expressed on leukocytes, and its expression is enhanced in lymphocytes by activation. It is known that CD48 is involved in cell adhesion by binding to CD2 in mice. ⁇ The affinity between CD48 and CD2 is very low in humans. For the link to the disease, It is known that the frequency of CD48-positive lymphocytes decreases in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (Lo, MF, Sandrin, M. 2002. "CD48" in Leukocyte Typing VII, Oxford
  • CD48 expressed on T cells as a costimulatory molecule has been specifically investigated in mice.
  • CD48 When CD48 is cross-linked by anti-CD48 antibody when stimulated with anti-CD3 antibody, proliferation of T cells is enhanced (Kato, K. et al., 1992. J. Exp. Med. 176: 1241-1249)
  • T cell stimulating ability is enhanced in antigen presenting cells transfected with CD2, a ligand of CD48 (Moran, M. et al., 1998. Immunity 9: 787-796) and that costimulation from CD48 by binding of CD2 is important for induction of cytotoxic T cells (Musgrave, BL et al, 2003. J. Interferon Cytokine). Res.
  • Patent Document 1 International Publication No. W099 / 12972
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 2
  • Non-Patent Document l Masuyama, J. et al. (2002) J. Immunol, 169, 3710
  • Non-Patent Document 2 Hale, G. et al., (1983) Blood, 62, 873
  • Non-Patent Document 3 Xia, M.Q., et al., (1991) European J. Immunol, 21,1677
  • Non-Patent Document 4 Kirchhoff, C et al., (1993) Molecular Reproduction and Development, 34,
  • Non-Patent Document 5 Pangolis GA et al., (2001) Medical Oncology, 18, 99
  • Non-Patent Document 6 Hederere RA et al., (2000) International Immunology, 12, 505
  • Non-Patent Document 7 Valentin H et al., (1992) Transplantation, 54, 97
  • Non-Patent Document 8 Rowan WC et al., (1994) International Immunology, 7, 69
  • Non-Patent Document 9 Kirchhoff C et al., (2001) Cells Tissues Organs, 168, 93
  • the object of the present invention is to provide regulatory T cells having immunoregulatory ability, a method for inducing the regulatory T cells, and a pharmaceutical composition containing the regulatory T cells. Specifically, a method for inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells via a GPI anchor protein including CD59, CD55 and CD48, regulatory T cells induced by the method, and regulatory T cells It relates to the use of cells for autoimmune diseases, allergic diseases or transplant immune response modulation.
  • the present inventors have found that regulatory T cells are induced to differentiate and / or promote proliferation by an antibody against CD52 (International Publication No. WO2004 / 087210 (Japanese Patent Application No. 2003-95765, Japanese Patent Application No. 413786)).
  • the present inventors focused on GPI anchor proteins expressed in T cells.
  • GPI-anchored proteins especially CD59, CD55 and CD48
  • they have an effect of inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells.
  • the present invention is as follows:
  • a method of promoting differentiation induction and / or proliferation of regulatory T cells which comprises stimulating a GPI anchor protein other than CD52 present on the surface of immune cells with an agonist of the protein;
  • CD3 agonist is an anti-CD3 antibody or a fragment thereof
  • the anti-CD3 antibody is a humanized antibody or a human antibody
  • the immune cells are peripheral blood mononuclear cells
  • a cell-containing substance containing regulatory T cells obtained by promoting induction and / or proliferation by the method according to any one of 1 to 10 above;
  • a pharmaceutical composition for immunosuppression comprising regulatory T cells obtained by promoting induction and / or proliferation by the method according to any one of 1 to 10 above;
  • the GPI anchor protein is selected from the group consisting of CD55, CD59 and CD48; 19.A method for screening a drug having a T cell differentiation-inducing and / or proliferation-promoting effect by using an interaction with a GPI-anchor protein other than CD52 as an index, comprising expressing a GPI-anchor protein other than CD52. The method comprising contacting the cells with the candidate conjugate and detecting these interactions or the GPI-anchored protein stimulation response;
  • GPI anchor protein is selected from the group consisting of CD55, CD59 and CD48;
  • a pharmaceutical composition for inducing and / or promoting proliferation of regulatory T cells comprising as an active ingredient an agonist of a GPI anchor protein other than CD52;
  • composition according to 27 above, wherein the above-mentioned agonist is an anti-GPI anchor protein antibody or a fragment thereof;
  • composition according to the above 30, wherein the antibody is a humanized antibody or a human antibody;
  • composition according to 27 further comprising a CD3 agonist
  • composition for preventing or treating an autoimmune disease, an allergic disease or a transplant immune response.
  • T cells activated by costimulation through GPI anchor proteins including CD59, CD55 and CD48 are induced to differentiate into regulatory T cells and / or promote proliferation.
  • These regulatory T cells are useful as active ingredients in pharmaceutical compositions for regulating autoimmune diseases, allergic diseases and transplant immune responses.
  • FIG. 1 shows the results of examining the inhibitory effect of regulatory T cells induced by anti-CD59 antibody on the proliferation of CD4-positive T cells stimulated by anti-CD3 antibodies.
  • FIG. 2 shows the results of examining the inhibitory effect of regulatory T cells induced by anti-CD55 antibody on the proliferation of CD4-positive T cells stimulated by anti-CD3 antibody.
  • FIG. 3 shows the results of examining the inhibitory effect of regulatory T cells induced by an anti-CD48 antibody on the proliferation of CD4-positive T cells stimulated by an anti-CD3 antibody.
  • the present invention relates to an effect of inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells, and an immunosuppressive effect through the effect of an agonist of a GPI anchor protein. Therefore, a pharmaceutical composition for the above-mentioned effect, which contains a GPI-anchored protein as an active ingredient, and induces and / or promotes the proliferation of regulatory T cells using the above-mentioned agonist.
  • the present invention relates to a method and an immunosuppressive method through the method. Stimulation of the GPI anchor protein on the cell surface of immune cells (especially T cells) by its agonist induces the induction of regulatory T cell differentiation, and the proliferation of regulatory T cells while maintaining their function is stimulated. As a result, an in vivo immunosuppressive effect is obtained.
  • the GPI-anchored protein agonist is a substance that interacts with the GPI-anchored protein, and stimulates the GPI-anchored protein present on the surface of immune cells to convert the protein.
  • GPI anchor proteins As described above, more than 200 types of GPI anchor proteins have been found, among which Thy-1, Ly-6 and Qa-2 in mice, and CD52, CD55, CD59, CD73, CD48 and BY55 / in humans. It has been reported that it is expressed on CD160 isotonic T cells and is involved in the activation of the cells.
  • the GPI anchor protein of the present invention is preferably CD55, CD59, CD73, CD48 and BY55 / CD160 when used for humans, regardless of which GPI anchor protein is present on the surface of T cells. It is not limited to these.
  • the signal induced by the stimulation of the GPI-anchored protein induces a response such as cell division into regulatory T cells and / or proliferation while retaining the characteristics of regulatory T cells.
  • GPI-anchored protein agonists include natural or synthetic ligands for GPI-anchored proteins, i.e., any molecule that induces intracellular signals through the GPI-anchored protein, antibodies to the GPI-anchored protein, and fragments thereof. Is also included. Such an antibody may recognize any site of the GPI anchor protein as long as it can induce an intracellular signal via the GPI anchor protein.
  • antibodies to CD55, CD59, or CD48 can also be included in the GPI anchor protein algorithm.
  • the antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody prepared by a method known to those skilled in the art, for example, as described in "New Chemistry Laboratory Course 1, Protein I, 389-406, Tokyo Chemical Doujinshi ").
  • the antibody used in the present invention can also be easily obtained by combining the steps of evaluating the ability to induce differentiation and proliferation of regulatory T cells described in Examples of the present invention. It is also possible to use commercially available products.
  • Preferred antibodies for use in the present invention include, by way of example, anti-CD55, anti-CD59, and anti-CD48 antibodies, various of which are commercially available, for example, from Serotec.
  • MEM-43 anti-CD59 antibody commercially available from Wako !, anti-CD55 antibody 1C6 clone, commercially available from Serotec !, anti-CD48 antibody MEM102 clone, and the like.
  • a so-called human iridase antibody obtained by transplanting the variable region of an antibody against the GPI anchor protein into the framework of a human antibody can be used as an agonist of the GPI anchor protein of the present invention.
  • a mouse that retains a human antibody gene that has not been rearranged and produces a human antibody specific to the antigen upon sensitization of the antigen eg, Tomizuka et al., 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 97: 722
  • the antibody can be used in the present invention.
  • the differentiation of regulatory T cells is induced by allowing the GPI anchor protein to act in addition to the CD3 agonist on immune cells that express the CD3 and GPI anchor proteins. And / or promote cell proliferation. That is, the CD3 signal transduction system, which is the main stimulus transmission pathway involved in T cell sorting, is the main stimulus pathway, and the pathway via the GPI anchor protein is the so-called accessory stimulation pathway.
  • causing stimulation through the GPI anchor protein in addition to stimulation through CD3 may be referred to as GPI anchor protein co-stimulation.
  • CD3 agonist refers to the action of a CD3 molecule expressed on the surface of an immune cell to induce signal transduction into a cell via CD3, and the signal transduction promotes differentiation of the cell. Then ⁇ ⁇ means any substance that can induce a reaction.
  • Examples of CD3 agonists include agonistic anti-CD3 antibodies such as OKT3 (ATCC CRL-8001), UCHT1 (BD PharMingen), and HIT3a (BD PharMingen).
  • agonists against various T cell antigen receptors in particular, antibodies having agonist action or fragments thereof also cause complex formation of ⁇ cell antigen receptor and CD3, and signal transduction into cells via CD3. Because , Can be used as a CD3 agonist in the present invention.
  • OT145 Pieris et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83 (20): 7888_92
  • a substance that recognizes a T cell antigen receptor and exerts an agonist action such as a soluble HLA molecule or a tetramer molecule of an HLA molecule and an antigen peptide, can also be used.
  • the pharmaceutical composition containing the agonist of the GPI anchor protein as an active ingredient and the pharmaceutical composition containing the agonist and the CD3 agonist as the active ingredients provided by the present invention can be used as immunosuppressants.
  • the pharmaceutical composition may further be useful as an agent targeting a specific mechanism of action of the immune system, or as an agent for inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells.
  • the pharmaceutical composition provided by the present invention may be administered in vivo, or may be an immune cell, particularly a T cell, or an immune cell collected from a patient or another human.
  • an immune cell particularly a T cell
  • an immune cell collected from a patient or another human for in vitro treatment of peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow cells, lymph fluid, lymph node cells, and thymocytes containing the same.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a known method. That is, a pharmaceutical preparation containing various additives acceptable for the therapeutic effect, for example, a carrier, a pH buffer, a stabilizer, an excipient and the like is produced. Such formulations preferably include a physiologically acceptable diluent or carrier, and suitable carriers include physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline. These include, but are not limited to, glucose solutions and buffered saline. Alternatively, the agonist of the GPI anchor protein may be provided in a freeze-dried (freeze-dried) state, and reconstituted by adding the above buffer aqueous solution when necessary. Examples of the dosage form of the above preparation include oral administration using tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like, and parenteral administration using injections, drops and suppositories.
  • the administration method and dosage of the pharmaceutical composition are determined in the course of preclinical tests and clinical tests. Can be determined as appropriate.
  • the power varies depending on symptoms, age, body weight, etc.
  • Oral administration is usually about 0.01 mg to 1000 mg per day for an adult, and these can be administered once or in several divided doses.
  • about 0.01 mg to 1000 mg can be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection or intravenous injection.
  • the disease to be treated is a disease in which a treatment that produces an immunosuppressive effect is required, and specifically, a transplant immune response, ie, graft-versus-host disease (GvHD) or graft rejection, Allergic diseases, and autoimmune diseases such as rheumatism.
  • a transplant immune response ie, graft-versus-host disease (GvHD) or graft rejection, Allergic diseases, and autoimmune diseases such as rheumatism.
  • the pharmaceutical composition of the present invention and the method of the present invention can also be used for treatment before and after organ or cell transplantation for the treatment or prevention of graft versus host disease or transplant rejection.
  • immune cells collected from the patient or another human in need of the above treatment or prevention or peripheral blood, umbilical cord blood, bone marrow cells, lymph fluid, lymph containing the immune cells Treating node cells or thymocytes in vitro, with GPI-anchored protein agonists, or in some cases with the agonists and CD3 agonists to expand regulatory T cells and repopulate the expanded cells
  • GPI-anchored protein agonists or in some cases with the agonists and CD3 agonists to expand regulatory T cells and repopulate the expanded cells
  • the conditions for stimulating the immune cells with an agonist are as follows: when an intracellular signal is transmitted via a GPI anchor protein by a GPI anchor protein agonist and stimulation is also performed by a CD3 agonist, Stimulation may be performed with each agonist in an amount sufficient for the intracellular signal to be transmitted through the cell.
  • the amount varies depending on the type of the agonist, and an appropriate amount of the agonist to be used and the time for stimulating the agonist can be determined by those skilled in the art by a simple test.
  • the time for the stimulation is generally 12 hours or more, more preferably 24 hours or more, for example, preferably about 3 days.
  • the present invention also includes a method for in vitro differentiation and proliferation of regulatory T cells by the above method, and a regulatory T cell obtained thereby, provided that the same T cell is returned to the same person or another human. I do.
  • regulatory T cells derived from one individual that is, regulatory T cells having a uniform genetic trait, can be obtained in a therapeutically effective amount, which was difficult to obtain by conventional techniques. It is.
  • the present invention provides a method for contacting a cell expressing a GPI anchor protein with a candidate conjugate for the development of a drug having an effect of inducing differentiation and / or promoting proliferation of regulatory T cells. And detecting the interaction or the GPI-anchored protein stimulus response, and screening for a compound that becomes an agonist of the GPI-anchored protein using the interaction with the GPI-anchored protein as an index.
  • the GPI-anchored protein-stimulated response is, for example, the activity of inducing differentiation or promoting proliferation of regulatory T cells.
  • Example 1 Regulation of Tile CD59 Pile Secondary Stimulation Induction of T cells
  • CD4-positive T cells were prepared from peripheral blood mononuclear cells by negative selection using MACS CD4 + T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer's instructions. Got The CD4-positive T cells were suspended in RPMI 1640 medium (GIBCO) supplemented with 10% FCS and 15 mM HEPES buffer, and the plate was immobilized with the aforementioned anti-CD3 antibody and anti-CD59 antibody. Seed at 5 cells / well and in a CO incubator at 37 ° C / 5% CO environment
  • the inhibition was performed as follows. 1 x 10 5 cells / well of CD4-positive T cells were seeded together with 4 x 10 5 cells / well of peripheral blood mononuclear cells irradiated with X-rays (5,000 rads) on a 96-well U bottom plate (ICN). was added to a final concentration of 25 ng / ml and cultured for 3 days.
  • the regulatory T cells mosquitoes ⁇ Ena force ivy group was added mosquitoes ⁇ the X-ray irradiation (5,000 rads) anti CD59 antibodies co-stimulation cell as a control group and regulatory T cells in l ⁇ 2xl0 5 cells / well
  • the inhibitory activity was evaluated by comparing [] thymidine incorporation.
  • [ 3 H] thymidine incorporation was performed by adding 0.2 Ci / well of [ 3 H] thymidine on the third day of culture, collecting the cells 8 hours later, and counting the [ 3 H] thymidine incorporated in the cells by a beta plate. (PerkinElmer). All cells used for a single assay were from the same donor.
  • the anti-CD59 antibody costimulator cells suppressed the proliferation of CD4-positive T cells stimulated by the anti-CD3 antibody depending on the number of added costimulator cells. This revealed that regulatory T cells were induced by the anti-CD59 antibody costimulation.
  • Example 2 Pile CD55 Pellet regulation induced by co-stimulation T cell induction
  • CD25-negative non-activated cells showed no inhibitory activity, but CD25-positive activated cells. Inhibited the proliferation of CD4-positive T cells induced by anti-CD3 antibody stimulation depending on the number of activated cells. It was revealed that cells activated by anti-CD55 antibody costimulation acquired the properties of regulatory T cells.
  • An anti-CD48 antibody (clone MEM102, Serotec) was used instead of the CD59 antibody.
  • the anti-CD48 antibody costimulator cells suppressed the proliferation of CD4-positive T cells by anti-CD3 antibody stimulation in a cell-dependent manner, and the anti-CD48 antibody costimulated decreased the regulatory T cells. It was found to be induced.

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Abstract

　本発明は、調節性T細胞の分化誘導および/または増殖促進方法、ならびにこれらの方法による免疫を抑制する方法、さらに、これらの方法に用いるための医薬組成物を提供することを目的とする。 　GIPアンカー蛋白質のアゴニストをGIPアンカー蛋白質発現T細胞に作用させることによる、調節性T細胞の分化誘導および/または増殖促進方法、当該方法による免疫を抑制する方法が提供される。

Description

GPIアンカー蛋白質ァゴニストによる調節性 T細胞分ィヒ誘導 ·増殖方法お よびそのための医薬組成物
技術分野
[0001] 本発明は、免疫を調節する新しい方法、特に調節性 Τ細胞 (抑制性 Τ細胞と呼ばれ る場合もある）の分化誘導'増殖促進することにより免疫を調節する方法、および該方 法に使用するための医薬組成物に関する。
背景技術
[0002] 1.調節性 Τ細胞
種々の病原体に対する生体防御のシステムとしての免疫系の中心的役割を担う細 胞群の一つに Τ細胞がある。 Τ細胞は大別して CD4陽性のヘルパー Τ細胞と CD8陽 性の細胞傷害性 Τ細胞に分けられるが、前者は特に抗原刺激後の特定の分化成熟 段階でのサイト力イン産生パターンによって、主に IFN- γを産生する Thl細胞、 IL-4 を産生する Th2細胞などに分類可能である。一般的に前者は細胞性免疫、後者は液 性免疫系の活性ィ匕に寄与し、生体防御に深く関与している。免疫応答はこのような 性質の異なる T細胞の働きによって巧妙なバランスのもとに病原体の排除や感染抵 抗性の獲得に深く関与している。通常健全な免疫応答においては外来の非自己抗 原に対してはそれらを排除する機構が働き、生体を構成する自己抗原に対しては免 疫学的寛容が成立して排除機構が働力ないことが知られている。しかしながら、自己 抗原に対し過剰な免疫応答が働くことによって自己免疫疾患が生ずる。このように自 己抗原に対する免疫学的寛容は絶対的なものではないが、 T細胞レベルにおいても 種々の免疫学的寛容が誘導される仕組みが分力つている。一つは、中枢寛容（ central tolerance)と呼ばれる胸腺における自己反応性 T細胞クローンの排除の機構 (Kisielow, P.et al.， 1988. Nature. 333:742- 746.)、他方は末梢寛容（peripheral tolerance)と呼ばれる機構による自己反応性 T細胞の胸腺外での制御である。後者 には、細胞死の誘導または自己抗原に対する不応答性 (anergy)の誘導 (Rocha, B., and H. von Boehmer. 1991. Science. 251:1225-1228.; Jenkins, M.K., and R. H. Schwartz. 1987. J. Exp. Med. 165:302- 319.)と共に、調節性 T細胞（regulatory T cell ) による能動的な抑制機構（Shevach, E.M. 2000. Annu. Rev. Immunol. 18:423-449. )が知られている。調節性 T細胞とは、他の T細胞に対して抑制的な作用を示すという ことで定義付けられる。免疫応答は巧妙なバランスのもとに成り立っており、例えば上 述の Thl細胞および Th2細胞は、互いにそれぞれの免疫応答に拮抗的に働き、一方 が他方に対する調節性 T細胞として作用することが知られるようになった。その反面、 調節性 T細胞集団の存在の検証とその性状解析については免疫学の近年の歴史に おいても多くの議論があるところである。このような調節性 T細胞は in vitroまたは in vivoにおいて特定の免疫応答を抑制または調節する機能を有する細胞として研究さ れ、細胞表面マーカー、産生するサイト力インの種類およびその産生の抑制および 調節機構などによって、種々の細胞集団が報告されている（Roncarolo, M.G., and M.K. Levings. 2000. Curr. Opinion. Immunol. 12:676—683.)。
これらの調節性 T細胞の中で近年最もよく研究されている細胞集団は、以下に述べ る CD4陽性 CD25陽性であることをマーカーとする T細胞集団であり、主にマウスおよ びラットなどのヒト以外の生物種で研究されてきた。即ち、正常マウスまたはラットの CD4陽性脾臓細胞力も CD25陽性、 RT6.1陽性 (ラットの成熟 T細胞の大部分に発現） 、 CD5強陽性、または CD45RB弱陽性 (マウス)若しくは CD45RC弱陽性 (ラット）の細 胞を除去して、残りの T細胞を免疫不全の動物に移入することで臓器特異的自己免 疫疾患が誘導されることが明らかとなった。これまで、このような調節性 T細胞に特異 的なマーカーは見出されておらず、上記のマーカーは調節性 T細胞の機能とは直接 関連付けられない、細胞が活性化されている状態、抗原刺激を受けた状態または免 疫学的記憶状態にあることを表すマーカーにし力過ぎない。し力しながら、免疫不全 動物に臓器特異的自己免疫疾患を誘導する機能のみならず、逆に特定の細胞集団 を移入することで自己免疫疾患および自己免疫性炎症を抑制する機能を有すること を指標として調節性 T細胞集団の解析が進み、 CD4、 CD25共に陽性である T細胞集 団が調節性 T細胞のマーカーとなり得ることが知られるに至った（Sakaguchi, S., et al.， 1985. J. Exp. Med. 161:72; Itoh, M., et al, 1999. J. Immunol. 162:5317-5326; Sakaguchi. S.et al., 1995. J. Immunol. 155:1151-1164; Asano, M. et al" 1996. J. Exp. Med. 184:387-396; Read, S.et al., 2000. J. Exp. Med. 192:295—302; Salomon, B. et al" 2000. Immunity. 12:431-440; Stephens, L. A., and D. Mason. 2000. J. Immunol. 165:3105—3110.)。
上記のようにマウスおよびラットにおいて、 CD4陽性 CD25陽性の調節性 T細胞が同 定されたが、一方で、ヒトにおける同様の細胞の存在は、 2001年に複数のグループか ら報告された（Jonuleit, H.et al" 2001. J. Exp. Med. 193:1285-1294; Levings, M. K. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1295—1301; Dieckmann, D. et al., 2001. J. Exp. Med. 193:1303-1310; Taama, L. S. et al., 2001. Eur. J. Immunol. 31:1122—1131; Stephens, L. A. et al" 2001. Eur. J. Immunol. 31:1247-1245; Baecher- Allan, C. et al., 2001. J. Immunol. 167:1245-1253.)。これらの報告は、マウスで知られている CD4 および CD25の発現を指標にヒト末梢血力 分離された細胞集団を用いて種々の細 胞表面マーカー、細胞の活性ィヒ刺激に対する不応答性 (anergy)、産生されるサイト 力インの種類、 in vitroにおける通常の T細胞の増殖抑制機能およびその機構などの 点においてマウスでの報告と同等であることを根拠としている。即ち、ヒト末梢血から 分離された CD4陽性 CD25陽性 T細胞は、 CD45RO陽性のメモリー T細胞マーカーを 発現しており、 CD4陽性 CD25陰性 T細胞と比較して HLA-DRなどの活性ィ匕マーカー の発現が高ぐまた、細胞内には定常的に CTLA-4を発現しており、刺激によりその 発現量が上昇する。更に、力かる CD4陽性 CD25陽性の調節性 T細胞は、抗 CD3抗 体刺激、抗 CD3抗体と抗 CD28抗体とによる刺激、同種異系の成熟榭状細胞（ allogeneic mature DC)による刺激などでは、 DNA合成およびサイト力インの産生は見 られず、すなわち、 CD4陽性 CD25陽性の調節性 T細胞は、抗原刺激に対する不応 答状態 (anergy)となっている。 CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞は、抗 CD3抗体と抗 CD28抗体に加えて IL-2、 IL-4、 IL- 15などのサイト力インによる刺激をカ卩えることで、 その DNA合成能は高まる力 CD4陽性 CD25陰性 T細胞のそれには及ばない。 CD4 陽性 CD25陽性調節性 T細胞存在下で、 CD4陽性 CD25陰性 T細胞を抗 CD3抗体ま たは同種異系の成熟榭状細胞（allogeneic mature DC)によって刺激した場合、 CD4 陽性 CD25陽性調節性 T細胞非存在下の場合と比較して CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞細胞数に依存して CD4陽性 CD25陰性 T細胞の増殖抑制作用が認められる。 CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞は、 IL- 10、 TGF- 1のような抑制性のサイト力イン を産生し得るが、 CD4陽性 CD25陰性 Τ細胞に対する増殖抑制作用は、上記サイト力 インに対する中和抗体では解除されないこと、および、抑制作用には CD4陽性 CD25 陰性 Τ細胞と CD4陽性 CD25陽性調節性 Τ細胞との直接的な細胞接触が必要である ことが報告されている。マウス、ラットおよびヒトにおいて CD4陽性 CD25陽性調節性 Τ 細胞の存在が報告され、その性状解析が進められているが、いまだその詳細な分ィ匕 機構および抑制作用機構の解明には至っておらず、該細胞に特異的なマーカーも 見出されていない。
[0005] マウスおよびヒトにおいて、 IL- 10存在下での同種異系の（allogeneic)抗原刺激や 同種異系の未成熟榭状細胞（allogeneic immature DC)による繰り返し刺激によって 誘導される調節性 T細胞も報告されている（Groux, H. et al., 1997. Nature.
389:737-742; Jonuleit, H. et al" 2000. J. Exp. Med. 192:1213—1222.)。さらに、ある 種のウィルスの entry分子または補体活性ィ匕を抑制するとの報告がある CD46と CD3と で T細胞を同時刺激した場合、および CD58/LFA-3を強制発現させた細胞を APCと して T細胞を刺激した場合、調節性 T細胞が誘導されるとの報告もある（Kemper, C. et al" 2003. Nature. 421:388-392; Wakkach, A. et al" 2001. 167:3107-3113)。これ らの細胞は、 Thl、 Th2細胞とは異なり大量の IL- 10を産生するものの、 TGF- j8 1、 IFN- γ、 IL-5の産生量は多くなぐ低レベルの IL-2を産生し、 IL-4を産生しないこと を特徴としており、 Trl細胞と呼ばれている。 Trl細胞も CD4陽性 CD25陽性調節性 T 細胞と同様に anergicである力 T細胞抑制機構は、自ら産生する IL-10や TGF- 1に より影響を受けることに基づいて、説明可能である力もしれない。し力しながら、 Trl細 胞と CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞とが全く異なる T細胞サブセットであるの力、ま たは分ィ匕活性ィ匕段階の異なる同一の細胞であるかにっ 、ては明確にされて 、な 、。
[0006] その他、ヒト T細胞が血管内皮細胞に接着した後に内皮下への遊走する現象を阻 害するモノクローナル抗体である 4C8 mAb (Masuyama, J. et al" 1999. J. Exp. Med., 189:979-990)の新たな機能として調節性 T細胞誘導能が報告された (Masuyama, J. et al" 2002. J. Immunol. 169:3710-3716;特開 2003- 102471)。これは、抗 CD3抗体 (OKT3)と 4C8 mAbとの同時刺激により活性化した細胞力 in vitroにおいてポリクロー ナル抗体刺激による CD4陽性 T細胞の増殖に対して抑制活性を示すことに依拠して いる。
[0007] マウスおよびラットにおいて知られている調節性 Τ細胞マーカーである CD4、 CD25 の発現を指標として、ヒトにおいても末梢血など力も CD4陽性、 CD25陽性の T細胞を 分離したところ、ヒトの末梢血力も分離された CD4陽性 CD25陽性 T細胞は、マウスや ラットの同細胞と同様のその他の細胞表面マーカーおよび機能を有していることが確 認された。このことから、ヒトにおける CD4陽性 CD25陽性調節性 T細胞の存在が示唆 された。これら細胞は、末梢血 CD4陽性 T細胞の 5〜10%を占めるに過ぎない希少細 胞集団であり、活性化'増殖刺激に対して不応答状態にある。この場合、抗 CD3抗体 と抗 CD28抗体による刺激に IL- 2、 IL- 4または IL- 15などのサイト力インをカ卩えることで 細胞増殖を促すことができる力 力かる手法による増殖では、ヒトに移入して一定の 効果を得るほどの細胞増幅は得られず、臨床医学的に応用することは困難である。
[0008] 調節性 T細胞は、実験動物に移入することによって自己免疫疾患（自己免疫性脳 脊髄炎、大腸炎）に抑制的に働くこと（Kohm, A. P. et al.， 2002. J. Immunol.
169:4712-4716; Mottet, C, et al, 2003. J. Immunol. 170:3939- 3943)、ならびに移 植拒絶反応 (HvG)および移植片対宿主病（GvHD)に抑制的に働くこと (Hara, M. et al" 2001. J. Immunol. 166:3789-3796; van Maurik, A. et al" 2002. J. Immunol. 169:5401-5404; Taylor, P. A. et al" 2001. J. Exp. Med. 193:1311—1317; Taylor, P. A. et al., 2002. Blood. 99:3493—3499; Edinger, M. et al., 2003. Nature Med.
9:1144-1150; Trenado, A. 2003. J. Clin. Invest. 112:1688- 1696)がわかっている。し たがって、調節性 T細胞の免疫抑制作用を利用した細胞医療は、自己免疫疾患およ び臓器移植による拒絶反応に対する治療への応用が有望視されている。調節性 T細 胞の増殖を促進する医薬組成物、または患者もしくは別のヒトから採取した末梢血、 骨髄細胞を生体外で処理することにより、調節性 τ細胞を増殖させ、患者の体内に移 入するという療法の開発が期待されている。
[0009] 2. GPIアンカー蛋白質
生体膜を構成する蛋白質には、自己のアミノ酸配列に含まれる疎水性部分によつ て細胞膜に存在している膜貫通型と、脂質により蛋白質が修飾され、脂質の疎水性 部分をアンカーとして膜に結合して ヽるものがある。 GPIアンカー蛋白質（
Glycosylphosphatidylinositol anchored protein)は後者に属し、蛋白質の C末端部が 修飾を受け、オリゴ糖鎖とイノシトールリン脂質力もなる複合体脂質を共有結合し、そ の脂質の疎水性部分を介して膜に結合して 、る。これまで報告されて 、る GPIアンカ 一蛋白質は 200種類以上あり、その機能も分ィヒ抗原、酵素、受容体および細胞接着 因子等、多岐に渡っている（池澤宏郎， 1999.蛋白質核酸酵素. 44:1321-1328)。一 部の GPIアンカー蛋白質は T細胞にも発現しており、これらの GPIアンカー蛋白質が T 細胞の活性化に関与することが報告されている（Horejsi, V. et al., 1998. Immunol. Letter. 63:o3— 73; Loertscher, R. ana Lavery, P. 2002. Transplant Immunol. 9:93—96 ) o T細胞の活性ィ匕に関与すると報告されている GPIアンカー蛋白質は、マウスでは Thy-1 (Kroczek, R.A. et al., 1986. J.Immunol. 136:4379- 4384)、 Ly- 6 (Malek, T.R. et al., 1986. J. Exp. Med., 164:709— 722)、 Qa— 2 (Hahn, A.B. et al., 1989. J.
Immunol. 143:407- 413)、および CD48 (Kato, K. et al" 1992. J. Exp. Med. 176: 1241—1249)、ヒトでは CD52 (Valentin, H. et al" 1992. transplantation. 54:97—104; Rowan, W.C. 1995. Int. Immunol. 7:69—77)、 CD55 (Davis, L.S. et al., 1988. J.
Immunol. 141:2246-2252; Shenoy-Scaria, A. M. et al" 1992. J. Immunol.
149:3535— 3541)、 CD59 (Korty, P.E. et al., 1991. J. Immunol. 146:4092—4098)、 CD73 (Thompson, L.F. et al., 1989. J. Immunol. 143:1815— 1821)、 BY55/CD160 ( Nikolova, M et al" 2002. Int. Immunol. 14:445-451)、および CD48 (Stefanov, I. et al" 1991. Science 254: 1016—1019、 Stulnig, T. M. et al., 1997. J. Biol. Chem. 272: 19242-19247)などがある。また、 GPIアンカー蛋白質は lipid raftと呼ばれるスフインゴ 脂質/コレステロールが豊富な細胞膜上の特定の部位に存在することが示唆されて いる（Varma, R. and Mayor, S. 1998. Nature. 394:798—801; Friedrichson, T. and Kurzchalia, T. V. 1998. Nature. 394:802-805)。 T細胞膜上に存在する lipid raftは、 T細胞受容体 (TCR)のシグナル伝達にぉ ヽて重要な働きをして!/ヽることが報告され ている（Xavier, R. et al., 1998. Immunity. 8:723—732; Montixi, C. et al" 1998.
EMBO J. 17:5334-5348; Brdicka, T. et al., 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 248:356-360; Kosugi, A. et al., 1999. Int. Immunol. 11:1395—1401; Zhang, W. et al, 1998. Immunity. 9:239-246;小杉厚， 2001.実験医学 (増刊). 19:94-101)。 CD3 刺激等により T細胞上の TCRが架橋されると、細胞骨格の変化が誘導され、 lipid raft は細胞膜上で TCR周辺に集積してくると考えられている。このような細胞膜上のダイ ナミックな変ィ匕により、 TCR力 lipid raftの細胞内ドメインに存在している srcファミリー に属するチロシンキナーゼ等のシグナル伝達因子にアクセスすることが可能になり、 シグナルを伝達していると考えられている（Horejsi, V. et al., 1999. Immunol. Today. 20:356-361; Simons, K. and Toomre, D. 2000. Nature Reviews Mol. Cell Biol.
1:31-39; Cherukuri, A. et al., 2001. Immunity. 14:657-660)。細胞内ドメインを持た な!、GPIアンカー蛋白質がどのように T細胞の活性ィ匕に寄与して 、るのかにつ ヽては 不明な点が多いが、一つには TCRを介した刺激と同様に、 GPIアンカー蛋白質が存 在する lipid raftの細胞内ドメインに存在する種々のシグナル伝達分子を介している可 能性が考えられる（Horejsi, V. et al., 1998. Immunology Letters. 63:63-73;
Loertscher, R. and Lavery, P. 2002. Transplant Immunol. 9:93-96)。また、 GPIアン カー蛋白質は、その種類に関わらず、 lipid raftを介して、共通なシグナルを伝達して いるのではないかと考えられている（Hale, G. 2001. Cytotherapy. 3:137-143)。実際 、 GPIアンカー蛋白質のクロスリンクによって、リン酸ィ匕されるシグナル伝達因子に共 通性が高いことが報告されている（Rosemarie, A, et al., 2000. Int. Immunol.
12:505-516; Tosello, A. et al" 1998. J. Mamma. 48:13-27)。 TCR刺激と同時に GPI アンカー蛋白質をクロスリンクさせた場合、 TCRからのシグナルが修飾を受けることは 十分に考えられる力 GPIアンカー蛋白質を介したシグナルにより、 T細胞から調節性 T細胞が誘導されるとの報告はこれまで全くない。
3. CD59抗原
CD59は約 20kDaの GPIアンカー蛋白質であり、構造的には Ly6ファミリーに属してお り、血液系を含む多様な組織の細胞で発現している。 CD59は、補体成分の 1つであ る C9に結合し、後期補体成分集合の最終段階である C5b-8への C9の結合を阻害す る。これにより、細胞膜上での膜傷害性複合体形成を抑制し、補体系による傷害から 細胞を保護している。更に T細胞においては、上記補体系の抑制作用以外に、 CD2 との相互作用による接着への関与も知られている (Lovelan, B. 2002. "CD59" in Leukocyte Typing VII, Oxford University Press:807— 809)。
[0011] また、 T細胞の活性ィ匕において、単独では T細胞を活性ィ匕しない低用量の PMAで 刺激する際に抗 CD59抗体を用いて CD59抗原をクロスリンクすることで、副刺激として 作用し、 T細胞を活性化'増殖させることが報告されている（Korty, P.E. et al, 1991. J. Immunol. 146:4092-4098)。ただし、 CD59の副刺激による T細胞の機能への影響 は明らかにされていない。
[0012] 4. CD55抗原
CD55は約 70kDaの GPIアンカー蛋白質であり、血液系を含む全身の組織で広く発 現している。 CD55は、補体成分の 1つである C3bと C4bとに結合して C3転換酵素の形 成を阻害するほか、 C3bBbと C4b2aとに結合して C3転換酵素の分解を促進し、補体 制御因子として補体系による傷害力 細胞を保護して 、ることが知られて！/、る ( Loveian, B. 2002. 'し D5o in Leukocyte Typing VII, Oxford University
Press:804- 805)。
[0013] また、 T細胞においては、他の GPIアンカー蛋白質同様に、 CD59抗原のクロスリンク によって副刺激として作用することが知られて 、る。単独では T細胞を活性ィ匕しな ヽ 低用量の PMAで刺激する際に抗 CD55抗体を用いて CD55をクロスリンクすることで CD4陽性 T細胞および CD8陽性 T細胞を増殖させる（Davis, L.S. et al., 1988. J. Immunol. 141:2246-2252) 0また、この CD55による副刺激において GPIアンカーの存 在は必須であり、 CD55を GPIアンカーではなく CD46の膜貫通ドメインと融合させた形 で発現させたキメラ CD55分子では、クロスリンクによる副刺激が認められないことが知 られている (Shenoy- Scaria, A. M. et al" 1992. J. Immunol. 149:3535-3541)。ただし、 CD55の副刺激を受けることによる T細胞の機能への影響にっ 、ては知られて ヽな ヽ
[0014] 5. CD48抗原
CD48は 45kDaの GPIアンカー蛋白質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属 する。白血球に広く発現されており、リンパ球では活性化によって発現の亢進がみら れる。マウスでは CD48は CD2と結合することで細胞の接着に関わる事が知られて ヽ る力 ヒトでは CD48と CD2のァフィ-ティは非常に低い。疾患との関連については、 発作性夜間血色素尿症患者で CD48陽性のリンパ球頻度が低下することが知られて いる（Lo, M.F., Sandrin, M. 2002. "CD48" in Leukocyte Typing VII, Oxford
University Press:797— 798)。
T細胞に発現する CD48の副刺激分子としての機能はマウスで特に調べられており 、抗 CD3抗体刺激で刺激する際に抗 CD48抗体によって CD48をクロスリンクすると T 細胞の増殖が亢進する（Kato, K. et al.， 1992. J. Exp. Med. 176:1241- 1249)他、 CD48のリガンドである CD2をトランスフエタトした抗原提示細胞では T細胞刺激能が 亢進すること（Moran, M. et al.， 1998. Immunity 9:787- 796)、また CD2の結合による CD48からの副刺激が細胞傷害性 T細胞の誘導に重要であること（Musgrave, B. L. et al, 2003. J. Interferon Cytokine Res. 23:67- 81)などが報告されている。ヒト T細胞 においても、他の GPIアンカー蛋白質同様に、抗 CD48抗体で CD48をクロスリンクする と細胞内シグナル蛋白質のチロシンリン酸化の亢進（Stefanov, I. et al., 1991.
Science 254:1016- 1019)や細胞内カルシウム濃度の上昇（Stulnig, T. M. et al.,
1997. J. Biol. Chem.272: 19242-19247)が起こることが知られている。ただし、 CD48副 刺激を受けることによるヒト T細胞の機能への影響にっ 、ては知られて 、な 、。
特許文献 1：国際公開 W099/12972号公報
特許文献 2：特許公報 特表平 2— 503514
非特許文献 l : Masuyama, J.ら、（2002) J. Immunol, 169, 3710
非特許文献 2 : Hale, G.ら、 (1983) Blood, 62, 873
非特許文献 3 : Xia, M. Q.ら、 (1991) European J. Immunol, 21,1677
非特許文献 4 : Kirchhoff, Cら、（1993) Molecular Reproduction and Development, 34,
8
非特許文献 5 : Pangolis GAら、 （2001) Medical Oncology, 18, 99
非特許文献 6 : Hederere RAら、（2000) International Immunology, 12, 505 非特許文献 7 : Valentin Hら、 (1992) Transplantation, 54, 97
非特許文献 8 : Rowan WCら、（1994) International Immunology, 7, 69
非特許文献 9 : Kirchhoff Cら、 (2001) Cells Tissues Organs, 168, 93
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0016] 本発明は、免疫調節能を有する調節性 T細胞、該調節性 T細胞を誘導する方法、 該調節性 T細胞を含む医薬組成物の提供を目的とする。具体的には、 CD59、 CD55 および CD48を含む GPIアンカー蛋白質を介した調節性 T細胞の分化誘導および/ま たは増殖促進方法、該方法により誘導された調節性 T細胞、ならびに該調節性 T細 胞の自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答調節のための使用に関す る。
課題を解決するための手段
[0017] 本発明者らは、 CD52に対する抗体で調節性 T細胞が分化誘導および/または増殖 促進されることを見出している（国際公開番号 WO2004/087210(特願 2003-95765、 特願 2003-413786))。さらに、調節性 T細胞の分化誘導について検討を進める中で、 本発明者らは、 T細胞に発現している GPIアンカー蛋白質に注目した。そして、驚くベ きことに、 T細胞活性ィ匕において副刺激として作用する GPIアンカー蛋白質 (特に CD59、 CD55および CD48)に対する抗体は、 T細胞の活性化を介して、 CD52に対す る抗体の場合と同様に、調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進効果を有 することを見出した。
[0018] GPIアンカー蛋白質からの副刺激を与えて T細胞を活性ィ匕することにより、調節性 T 細胞の分ィ匕誘導および/または増殖促進に寄与することは、従来の GPIアンカー蛋白 質に関する知見からは全く予測できな力つた。したがって、 GPIアンカー蛋白質の調 節性 T細胞分化誘導活性は、本発明において新規に見出されたものであり、この活 性は、自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答調節における免疫療法 に有用であり得る。
[0019] すなわち、本発明は以下の通りである：
1.免疫細胞の表面に存在する CD52以外の GPIアンカー蛋白質を、該蛋白質のァゴ 二ストで刺激することを含む、調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖を促進す る方法；
2.上記 GPIアンカー蛋白質力 細胞の活性ィ匕に関与するものである、上記 1記載の 方法； 3.上記 GPIアンカー蛋白質力 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたも のである、上記 1記載の方法；
4.上記ァゴ-ストが抗 GPIアンカー蛋白質抗体またはそのフラグメントである、上記 1 記載の方法；
5.抗 GPIアンカー蛋白質抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記 4記載の方法
6.免疫細胞の表面に存在する CD3を、 CD3ァゴ-ストで刺激することをさらに含む、 上記 1〜5のいずれかに記載の方法；
7. CD3ァゴニストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、上記 6記載の方法；
8.抗 CD3抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記 7記載の方法；
9.上記免疫細胞が T細胞である、上記 1〜8のいずれかに記載の方法；
10.上記免疫細胞が末梢血単核球である、上記 9記載の方法；
11.免疫細胞への CD3ァゴ-スト刺激および GPIアンカー蛋白質ァゴ-スト刺激が、 生体外で行われるものである上記 1〜10のいずれかに記載の方法；
12.免疫細胞への CD3ァゴ-スト刺激および GPIアンカー蛋白質ァゴ-スト刺激が、 生体内で行われるものである上記 1〜10のいずれかに記載の方法；
13.上記 1〜10のいずれかに記載の方法により分ィ匕誘導および/または増殖を促進 することにより得られた調節性 T細胞；
14.上記 1〜10のいずれかに記載の方法により分ィ匕誘導および/または増殖を促進 することにより得られた調節性 T細胞を含む細胞含有物；
15.上記 1〜10のいずれかに記載の方法により分ィ匕誘導および/または増殖を促進 することにより得られた調節性 T細胞を含む、免疫抑制のための医薬組成物；
16. 自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療のため の、上記 15記載の医薬組成物；
17.調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進効果を有する薬剤となる、 CD52以外の GPIアンカー蛋白質に対するヒト化抗体または抗体を作製する方法；
18. GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもの である、上記 17記載の方法； 19.調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進効果を有する薬剤を、 CD52 以外の GPIアンカー蛋白質との相互作用を指標にスクリーニングする方法であって、 CD52以外の GPIアンカー蛋白質を発現している細胞と候補ィ匕合物とを接触させ、こ れらの相互作用または GPIアンカー蛋白質刺激応答を検出することを含む、上記方 法；
20. GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもの である、上記 19記載の方法；
21.患者本人又は別のヒトの生体内から採取した免疫細胞を、その表面に存在する CD52以外の GPIアンカー蛋白質を該蛋白質のァゴ-ストで刺激することにより、調節 性 T細胞への分化を誘導し、かつその増殖を促して得られた、上記ヒトの免疫細胞由 来の調節性 T細胞；
22. GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもの である、上記 21記載の細胞；
23.上記 21または 22記載の調節性 T細胞であって、上記採取した免疫細胞を、上 記ァゴ-ストで刺激することにカ卩えて、さらに CD3ァゴ-ストで刺激することにより、調 節性 T細胞への分化を誘導し、かつその増殖を促して得られた、調節性 T細胞；
24.患者本人又は別のヒトの生体内から採取した免疫細胞を、その表面に存在する CD52以外の GPIアンカー蛋白質を該蛋白質のァゴ-ストで刺激することにより、調節 性 T細胞への分化を誘導し、かつその増殖を促し、上記ヒトの免疫細胞由来の調節 性 T細胞を産生する方法；
25. GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもの である、上記 24記載の方法；
26.上記 24または 25記載の調節性 T細胞を産生する方法であって、上記採取した 免疫細胞を、上記ァゴ-ストで刺激することに加えて、 CD3ァゴニストで刺激すること をさらに含む、方法；
27. CD52以外の GPIアンカー蛋白質のァゴニストを有効成分として含有する、調節 性 T細胞の分ィ匕誘導および/または増殖促進のための医薬組成物；
28.上記 GPIアンカー蛋白質力 細胞の活性ィ匕に関与するものである、上記 27記載 の医薬組成物；
29.上記 GPIアンカー蛋白質力CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたも のである、上記 27記載の医薬組成物；
30.上記ァゴ-ストが抗 GPIアンカー蛋白質抗体またはそのフラグメントである、上記 27記載の医薬組成物；
31.上記抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記 30記載の医薬組成物；
32. CD3ァゴ-ストをさらに含む、上記 27記載の医薬組成物；
33. CD3ァゴ-ストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、上記 32記載の医薬 組成物；
34.抗 CD3抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、上記 33記載の医薬組成物；なら びに、
35. 自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療のため の、上記 27〜34のいずれかに記載の医薬組成物。
発明の効果
[0020] 本発明により、 CD59、 CD55および CD48を含む GPIアンカー蛋白質を介した副刺激 を受けて活性化した T細胞は調節性 T細胞に分化誘導および/または増殖促進され ることが明らかとなった。これら調節性 T細胞は、自己免疫疾患、アレルギー疾患およ び移植免疫応答調節のための医薬品組成物の有効成分として有用である。
[0021] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-107494、
2004-235272号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]図 1は、 CD4陽性 T細胞の抗 CD3抗体刺激による増殖に対する、抗 CD59抗体 により誘導された調節性 T細胞による抑制効果を調べた結果である。
[図 2]図 2は、 CD4陽性 T細胞の抗 CD3抗体刺激による増殖に対する、抗 CD55抗体 により誘導された調節性 T細胞による抑制効果を調べた結果である。
[図 3]図 3は、 CD4陽性 T細胞の抗 CD3抗体刺激による増殖に対する、抗 CD48抗体 により誘導された調節性 T細胞による抑制効果を調べた結果である。
発明を実施するための最良の形態 [0023] 本発明は、 GPIアンカー蛋白質のァゴ-ストによる、調節性 T細胞の分化誘導効果 および/または増殖促進効果、ならびにこれを介した免疫抑制効果に関する。したが つて、 GPIアンカー蛋白質のァゴ-ストを有効成分として含有する上記効果のための 医薬組成物、該ァゴ-ストを用いた調節性 T細胞の分ィ匕誘導および/または増殖促 進方法、ならびにこれを介した免疫抑制方法に関する。免疫細胞 (特に T細胞）の細 胞表面上の GPIアンカー蛋白質をそのァゴニストで刺激することにより、調節性 T細胞 の分化誘導が誘起され、その機能を維持したままの調節性 T細胞の増殖が促進され 、その結果、生体内における免疫抑制効果が得られる。
[0024] 本明細書において、 GPIアンカー蛋白質のァゴ-ストとは、 GPIアンカー蛋白質と相 互作用する物質であって、免疫細胞表面に存在する GPIアンカー蛋白質を刺激する ことにより、該蛋白質を介して細胞内へシグナルを伝達し得る物質を意味する。上述 のとおり、 GPIアンカー蛋白質は、 200種類以上見出されており、その中でも、マウスで は Thy— 1、 Ly— 6および Qa— 2、ヒトでは CD52、 CD55、 CD59、 CD73、 CD48および BY55/CD160等力 T細胞上に発現し、該細胞の活性ィ匕に関与していることが報告さ れている。したがって、本発明の GPIアンカー蛋白質は、 T細胞表面に存在するいず れの GPIアンカー蛋白質であってもよぐヒトに関して用いる場合は、 CD55、 CD59、 CD73、 CD48および BY55/CD160が好ましいが、これらに限定されるものではない。 GPIアンカー蛋白質のァゴ-スト刺激により誘導されたシグナルは、細胞の調節性 T 細胞への分ィ匕および/または調節性 T細胞としての特性を保持した状態での増殖と いう応答を誘起し得る。 GPIアンカー蛋白質のァゴ-ストは、 GPIアンカー蛋白質に対 する天然または合成のリガンド、すなわち GPIアンカー蛋白質を介して細胞内シグナ ルを誘導するあらゆる分子を含み、 GPIアンカー蛋白質に対する抗体およびそのフラ グメントも包含する。かかる抗体は、 GPIアンカー蛋白質を介して細胞内シグナルを誘 導し得るものであれば、 GPIアンカー蛋白質のいずれの部位を認識するものであって もよい。例えば、 CD55、 CD59に対する抗体、または CD48に対する抗体も、 GPIアン カー蛋白質のァゴ-ストに含まれ得る。
[0025] 本発明に使用する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の 、ずれ でも良ぐ当業者に公知の方法 (例えば、「新生化学実験講座 1,タンパク質 I, 389-406,東京化学同人」参照）により調製することが可能である。本発明の実施例に 記載した調節性 T細胞の分化'増殖誘導能を評価する工程を組み合わせることによ つても、本発明に使用する抗体を容易に取得することができる。また、市販のものを 利用することも可能である。本発明に使用する好ましい抗体として、例としては、抗 CD55抗体、抗 CD59抗体、および抗 CD48抗体が挙げられ、これらは、種々のものが 市販されており、例えば、 Serotec社から市販されている MEM- 43抗 CD59抗体、 Wako 社から市販されて!、る抗 CD55抗体 1C6クローンおよび Serotec社から市販されて!、る 抗 CD48抗体 MEM102クローンなどが挙げられる。さらには、 GPIアンカー蛋白質に対 する抗体の可変領域を、ヒト抗体のフレームワークに移植して得られるいわゆるヒトイ匕 抗体を、本発明の GPIアンカー蛋白質のァゴ-ストとして用いることも可能である。ま た、再配列されていないヒト抗体遺伝子を保持し、抗原の感作により当該抗原に特異 的なヒト抗体を産生するマウス（例えば Tomizuka et al.， 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722)を使用して、ヒト抗体を取得し、その抗体を本発明に使用することも可 能である。
本発明の方法において、 CD3および GPIアンカー蛋白質を発現する免疫細胞に対 して、 CD3ァゴ-ストに加えて GPIアンカー蛋白質のァゴ-ストを作用させることにより 調節性 T細胞への分化誘導および/または細胞増殖を促進させることもできる。すな わち、 T細胞分ィ匕に関与する主たる刺激伝達経路である CD3シグナル伝達系が主刺 激経路であり、 GPIアンカー蛋白質を介した経路がいわゆる副刺激経路である。本明 細書において、 CD3を介した刺激に加えて GPIアンカー蛋白質を介した刺激をもたら すことを、 GPIアンカー蛋白質副刺激と称することがある。本明細書において CD3ァゴ 二ストとは、免疫細胞の表面に発現した CD3分子に作用して CD3を介した細胞内へ のシグナル伝達を誘導し、該シグナル伝達により当該細胞の分化が促進されると ヽぅ 反応を誘起しうるあらゆる物質を意味する。 CD3ァゴ-ストの例としては、ァゴニスティ ックな抗 CD3抗体、例えば OKT3 (ATCC CRL- 8001)、 UCHT1 (B. D. PharMingen) , HIT3a (B. D. PharMingen)が挙げられる。また、種々の T細胞抗原受容体に対するァ ゴニスト、特にァゴニスト作用を有する抗体またはそのフラグメントも、 Τ細胞抗原受容 体と CD3の複合体形成をもたらし、 CD3を介した細胞内への信号伝達をもたらすので 、本発明における CD3ァゴニストとして使用することができる。具体的には、ヒト T細胞 抗原受容体 Vbeta6.7に対する抗体である OT145 (Posnett et al.， 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,83(20):7888_92)などが挙げられる。また、可溶性の HLA分子あるい は HLA分子と抗原ペプチドのテトラマー分子のような、 T細胞抗原受容体が認識して ァゴニスト作用を及ぼす物質も使用し得る。
[0027] 上述のとおり、 CD3と GPIアンカー蛋白質とを共に刺激することによって調節性 T細 胞の分化誘導が促進され、かつ/または調節性 T細胞の増殖が促進されるため、この CD3と GPIアンカー蛋白質とを同時刺激することにより、生体内で起きている過剰な免 疫反応を制御できる可能性がある。したがって、本発明により提供される、 GPIアンカ 一蛋白質のァゴニストを有効成分として含有する医薬組成物、および該ァゴ二ストと CD3ァゴニストとを有効成分として含有する医薬組成物は、免疫抑制剤として有用で あり得る。該医薬組成物は、さらに特定の免疫系の作用機序を標的とする薬剤として 、調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進剤として有用であり得る。
[0028] また、本発明によって提供される、医薬組成物は、生体内に投与されるものであつ てもよいし、患者または別のヒトから採取した免疫細胞、特に T細胞、あるいは免疫細 胞を含む末梢血、臍帯血、骨髄細胞、リンパ液、リンパ節細胞、胸腺細胞を生体外で 処理するためのものであっても良い。
[0029] 本発明の医薬組成物は、周知の方法で製剤化されうる。すなわち治療効果上許容 される種々の添加物、例えば担体、 pH緩衝剤、安定化剤、賦形剤等を添加した医薬 製剤が製造される。このような製剤は、好ましくは、生理学的に許容され得る希釈剤ま たはキャリアを含んでおり、適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩 水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これ らに限定されるものではない。或いは、 GPIアンカー蛋白質のァゴニストは凍結乾燥（ フリーズドライ)状態で提供され、必要な時に上記の緩衝水溶液を添加することにより 再構成して使用されるものであってもよい。上記製剤の投与形態としては、錠剤、力 プセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、または、注射剤、点滴剤、 坐薬等による非経口投与を挙げることができる。
[0030] 上記医薬組成物の投与方法および投与量は、前臨床試験、臨床試験の過程にお いて適宜決定され得る。例えば、症状、年齢、体重などによって異なる力 通常、経 口投与では、成人に対して、 1日約 0.01mg〜1000mgであり、これらを 1回、または数回 に分けて投与することができる。また、非経口投与では、 1回約 0.01mg〜1000mgを皮 下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
[0031] 治療の対象となる疾患は、免疫抑制効果をもたらす処置が必要とされる疾患であり 、具体的には、移植免疫応答、すなわち移植片対宿主病 (GvHD)または移植片拒 絶、アレルギー性疾患、およびリウマチなどの自己免疫疾患が挙げられる。移植片対 宿主病または移植片拒絶の治療または予防を目的として、臓器又は細胞移植前後 における処置に、本発明の医薬組成物および本発明の方法を用いることもできる。
[0032] 本発明にお 、て、上記治療または予防を必要とする患者本人もしくは別のヒトから 採取した免疫細胞、または該免疫細胞を含む、末梢血、臍帯血、骨髄細胞、リンパ 液、リンパ節細胞もしくは胸腺細胞を生体外で、 GPIアンカー蛋白質のァゴ-ストで、 または場合によっては該ァゴ-ストおよび CD3ァゴニストで処理し、調節性 T細胞を増 殖させ、増殖した該細胞を、患者の体内に戻す療法を採用することができる。
[0033] 該免疫細胞のァゴニストによる刺激の条件は、 GPIアンカー蛋白質ァゴニストにより GPIアンカー蛋白質を介した細胞内シグナルが伝達され、かつ CD3ァゴ-ストによる 刺激も行う場合には、該刺激により CD3を介した細胞内シグナルが伝達されるのに充 分な量の、各ァゴ-ストで刺激を行えばよい。その量は、ァゴ-ストの種類によって異 なり、使用するァゴ-ストの適切な量およびァゴニスト刺激に供する時間は、当業者 であれば、簡単な試験により決定することができる。刺激に供する時間は、一般的に は、 12時間以上、より好ましくは 24時間以上、例えば 3日間程度が好ましい。
[0034] 本発明は、したがって、同一人または別のヒトに戻すことを前提として、上記方法で 調節性 T細胞を生体外で分化増殖させる方法、およびそれにより得られた調節性 T 細胞も包含する。本発明の方法によると、 1個体に由来する調節性 T細胞、すなわち 遺伝形質の均一な調節性 T細胞を、従来技術では得ることが困難であった治療に有 効な量で得ることが可能である。
[0035] 末梢血または骨髄細胞を生体より採取し、患者の体内に戻す幹細胞移植療法はす でに実施されている。また、免疫細胞の 1種である榭状細胞（dendritic cell)に人為的 処理を施し、患者の体内に戻す癌治療も行われている（M. Jefford, et al, The Lancet Oncology, 2: 343-353, June, 2001)。採取された免疫細胞に GPIアンカー蛋 白質のァゴ-ストおよび CD3ァゴ-ストを作用させることにより、調節性 T細胞の分ィ匕 誘導および/または増殖を促進することができ、該調節性 T細胞を増殖させた後に患 者の体内に戻すことにより治療または予防効果を奏することができる。このようないわ ゆるエタスビボ (ex vivo)の方法は、基礎研究の場において開発された実験系をほぼ そのまま治療の場において再現するものであるとも言える。薬剤の生体内への投与 力 体内吸収、代謝、または未知の因子による干渉作用などの影響により、期待した 治療効果を奏し得ない場合があり得ることと比較すると、実用化におけるリスクのより 低い方法である。
[0036] さらに、本発明は、調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進効果を有する 薬剤の開発のために、 GPIアンカー蛋白質を発現している細胞と候補ィ匕合物とを接 触させ、その相互作用または GPIアンカー蛋白質刺激応答を検出することにより、 GPI アンカー蛋白質との相互作用を指標として、 GPIアンカー蛋白質のァゴニストとなる化 合物をスクリーニングすることも包含する。ここで、 GPIアンカー蛋白質刺激応答とは、 例えば、調節性 T細胞の分化誘導活性または増殖促進活性であってょ 、。
実施例
[0037] 実施例 1 :杭 CD59杭体副刺激による調節件 T細胞の誘導
CD59を抗原とするモノクローナル抗体の副刺激によって CD4陽性 T細胞力も調節 性 T細胞が誘導されるかどうかを検討した。
[0038] プレートへの抗体の固相化は次のように行った。生理的リン酸緩衝液（PBS)中で
100 ng/mlに調製した抗 CD3抗体（ORTHOCLONE OKT3, Ortho Biotech)を 48- well プレート（Costar)に分注して 4°Cで 24時間インキュベートして、該抗体をプレートに固 相化した後、 30 μ g/ml PBSの抗 CD59抗体（MEM- 43, Serotec)で、さらに上記と同様 に固相化した。末梢血単核球は健常人ボランティア末梢血カゝら FicoU-Paque Plus ( Amersham Pharmacia)を用いた密度勾配遠心法により分離した。 CD4陽性 T細胞は、 末梢血単核球より MACS CD4+ T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec)を用いて試薬 製造者の操作手順書に従ってネガティブセレクションによって調製した。得られた CD4陽性 T細胞を、 10% FCSと 15 mMの HEPESバッファーを添カ卩した RPMI 1640培地 (GIBCO)に懸濁し、前述の抗 CD3抗体と抗 CD59抗体とを固相化したプレートに 8 x 105 cells/wellとなるように播種し、 COインキュベータ一中で 37°C/5% CO環境下にて
2 2
3日間培養した。培養 3日目に細胞を回収、洗浄し、培地に再懸濁して 24-wellプレー ト (Costar)に 1 x 106 cells/wellとなるように播種し、 4日間無刺激下で培養した。これに より細胞は休止状態となる。その後、該細胞を、抗 CD59抗体副刺激細胞として抑制 アツセィに供した。抗 CD59抗体による副刺激によって培養 3日目で 90%以上の細胞が 活性化し、 CD25陽性となった。また、培養 7日目の細胞数は播種時の 1.5倍程度に増 殖していた。
[0039] 抑制アツセィは次のように行った。 96- wellU底プレート（ICN)に、 CD4陽性 T細胞 1 X 105 cells/wellを X線照射（5,000 rads)した末梢血単核球 4 x 105 cells/wellと共に播 種し、抗 CD3抗体を最終濃度 25 ng/mlとなるように添加して 3日間培養した。このとき 、調節性 T細胞をカ卩えな力つた対照群と調節性 T細胞として X線照射 (5,000 rads)した 抗 CD59抗体副刺激細胞を l〜2xl05 cells/wellで添カ卩した群とで、 [ ]チミジン取り込 みを比較して抑制活性を評価した。 [3H]チミジン取り込みは、培養 3日目に 0.2 Ci/wellの [3H]チミジンを添加して 8時間後に細胞を回収し、細胞に取り込まれた [3H] チミジンのカウントをベータプレート（PerkinElmer)で測定することにより評価した。 1 回のアツセィに用 、た細胞は全て同一提供者由来である。
[0040] 図 1に示したように、抗 CD59抗体副刺激細胞は、抗 CD3抗体刺激による CD4陽性 T 細胞の増殖を、添加された該副刺激細胞の数に依存して抑制した。これより、抗 CD59抗体副刺激により調節性 T細胞が誘導されることが明らかとなった。
[0041] 実施例 2 :杭 CD55杭体副刺激による調節件 T細胞の誘導
CD55を抗原とするモノクローナル抗体の副刺激によって CD4陽性 T細胞力も調節 性 T細胞が誘導されるかどうかを検討した。
[0042] 副刺激細胞の調製、抑制アツセィは実施例 1に記載の方法で実施した。ただし、抗 CD59抗体の代わりに抗 CD55抗体（クローン 1C6, Wako)を用いた。ここで使用した抗 CD55抗体は副刺激能が低ぐ該刺激によっては一部の細胞し力活性ィヒし得なかつ たため、 FACS Vantage SE (Becton Dickinson)を用いて CD25の発現を指標として、 活性ィ匕細胞と非活性ィ匕細胞とに分離した。そのそれぞれにつ！/、て抑制アツセィを実 施した。
[0043] 活性ィ匕細胞と非活性ィ匕細胞の分離は次のように実施した。実施例 1に記載の方法 に準じて抗 CD3抗体と抗 CD55抗体を固相化したプレート上で、 CD4陽性 T細胞を培 養し、 3日目に細胞を回収 ·洗浄後、 2%自己血漿および 2 mM EDTA含有リン酸バッフ ァ一中で FITC標識抗 CD25抗体 (BD Pharmingen)を添カ卩して、 4°Cで 30分間反応さ せた。その後、細胞を洗浄して結合しな力つた抗体を除去し、細胞を 2%自己血漿およ び 2 mM EDTA含有リン酸バッファーに懸濁した。 1%の 7- AAD solution (BD
Pharmingen)を添カ卩して、死細胞を染色し、 7- AAD陰性の生細胞のうち CD25- FITC 陽性群と非陽性群とを FACS Vantage SE (Becton Dickinson)にて分離'回収した。回 収後の CD25陽性細胞群の CD25陽性率を指標とした純度は 94%以上であった。以降 、分離後の細胞を実施例 1と同様に 4日間無刺激下で培養した後、抑制アツセィに用 Vヽた。抑制アツセィは実施例 1に記載の方法で実施した。
[0044] 図 2に示したように、抗 CD55抗体副刺激を受けた細胞のうち、 CD25陰性の非活性 化細胞には抑制活性が見られなカゝつたが、 CD25陽性の活性ィ匕細胞は、抗 CD3抗体 刺激による CD4陽性 T細胞の増殖を、該活性ィ匕細胞数に依存して抑制した。抗 CD55 抗体副刺激によって活性ィ匕した細胞は調節性 T細胞の性質を獲得することが明らか となった。
[0045] ¾施例 3 :杭 CD48杭体副刺激による調節件 T細胞の謙導
CD48を抗原とするモノクローナル抗体の副刺激によって CD4陽性 T細胞力も調節 性 T細胞が誘導されるかどうかを検討した。
[0046] 副刺激細胞の調製、抑制アツセィは実施例 1に記載の方法で実施した。ただし、抗
CD59抗体の代わりに抗 CD48抗体（クローン MEM102, Serotec)を用いた。
[0047] 図 3に示したように、抗 CD48抗体副刺激細胞は CD4陽性 T細胞の抗 CD3抗体刺激 による増殖を添加細胞数依存的に抑制し、抗 CD48抗体副刺激により調節性 T細胞 が誘導されることが明らかとなった。
[0048] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[I] 免疫細胞の表面に存在する CD52以外の GPIアンカー蛋白質を、該蛋白質のァゴ 二ストで刺激することを含む、調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖を促進す る方法。
[2] 上記 GPIアンカー蛋白質力 細胞の活性ィ匕に関与するものである、請求項 1記載の 方法。
[3] 上記 GPIアンカー蛋白質力 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもの である、請求項 1記載の方法。
[4] 上記ァゴ-ストが抗 GPIアンカー蛋白質抗体またはそのフラグメントである、請求項
1記載の方法。
[5] 抗 GPIアンカー蛋白質抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項 4記載の方法
[6] 免疫細胞の表面に存在する CD3を、 CD3ァゴニストで刺激することをさらに含む、請 求項 1〜5のいずれ力 1項記載の方法。
[7] CD3ァゴニストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、請求項 6記載の方法。
[8] 抗 CD3抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項 7記載の方法。
[9] 上記免疫細胞が T細胞である、請求項 1〜8のいずれか 1項記載の方法。
[10] 上記免疫細胞が末梢血単核球である、請求項 9記載の方法。
[II] 免疫細胞への CD3ァゴ-スト刺激および GPIアンカー蛋白質ァゴ-スト刺激力 生 体外で行われるものである請求項 1〜10のいずれか 1項記載の方法。
[12] 免疫細胞への CD3ァゴ-スト刺激および GPIアンカー蛋白質ァゴ-スト刺激力 生 体内で行われるものである請求項 1〜10のいずれか 1項記載の方法。
[13] 請求項 1〜10のいずれか 1項記載の方法により分ィ匕誘導および/または増殖を促 進することにより得られた調節性 T細胞。
[14] 請求項 1〜10のいずれか 1項記載の方法により分ィ匕誘導および/または増殖を促 進することにより得られた調節性 T細胞を含む細胞含有物。
[15] 請求項 1〜10のいずれか 1項記載の方法により分ィ匕誘導および/または増殖を促 進することにより得られた調節性 T細胞を含む、免疫抑制のための医薬組成物。
[16] 自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療のための、 請求項 15記載の医薬組成物。
[17] 調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進効果を有する薬剤となる、 CD52 以外の GPIアンカー蛋白質に対するヒト化抗体または抗体を作製する方法。
[18] GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもので ある、請求項 17記載の方法。
[19] 調節性 T細胞の分化誘導および/または増殖促進効果を有する薬剤を、 CD52以外 の GPIアンカー蛋白質との相互作用を指標にスクリーニングする方法であって、 CD52 以外の GPIアンカー蛋白質を発現している細胞と候補ィ匕合物とを接触させ、これらの 相互作用または GPIアンカー蛋白質刺激応答を検出することを含む、上記方法。
[20] GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもので ある、請求項 19記載の方法。
[21] 患者本人又は別のヒトの生体内から採取した免疫細胞を、その表面に存在する
CD52以外の GPIアンカー蛋白質を該蛋白質のァゴ-ストで刺激することにより、調節 性 T細胞への分化を誘導し、かつその増殖を促して得られた、上記ヒトの免疫細胞由 来の調節性 T細胞。
[22] GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもので ある、請求項 21記載の細胞。
[23] 請求項 21または 22記載の調節性 T細胞であって、上記採取した免疫細胞を、上記 ァゴ-ストで刺激することにカ卩えて、さらに CD3ァゴ-ストで刺激することにより、調節 性 T細胞への分化を誘導し、かつその増殖を促して得られた、調節性 T細胞。
[24] 患者本人又は別のヒトの生体内から採取した免疫細胞を、その表面に存在する
CD52以外の GPIアンカー蛋白質を該蛋白質のァゴ-ストで刺激することにより、調節 性 T細胞への分化を誘導し、かつその増殖を促し、上記ヒトの免疫細胞由来の調節 性 T細胞を産生する方法。
[25] GPIアンカー蛋白質が、 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもので ある、請求項 24記載の方法。
[26] 請求項 24または 25記載の調節性 T細胞を産生する方法であって、上記採取した 免疫細胞を、上記ァゴ-ストで刺激することに加えて、 CD3ァゴニストで刺激すること をさらに含む、方法。
[27] CD52以外の GPIアンカー蛋白質のァゴニストを有効成分として含有する、調節性 T 細胞の分ィ匕誘導および/または増殖促進のための医薬組成物。
[28] 上記 GPIアンカー蛋白質力 細胞の活性ィ匕に関与するものである、請求項 27記載 の医薬組成物。
[29] 上記 GPIアンカー蛋白質力 CD55、 CD59および CD48からなる群より選択されたもの である、請求項 27記載の医薬組成物。
[30] 上記ァゴ-ストが抗 GPIアンカー蛋白質抗体またはそのフラグメントである、請求項
27記載の医薬組成物。
[31] 上記抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項 30記載の医薬組成物。
[32] CD3ァゴニストをさらに含む、請求項 27記載の医薬組成物。
[33] CD3ァゴニストが抗 CD3抗体またはそのフラグメントである、請求項 32記載の医薬 組成物。
[34] 抗 CD3抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項 33記載の医薬組成物。
[35] 自己免疫疾患、アレルギー疾患または移植免疫応答の予防または治療のための、 請求項 27〜34のいずれか 1項記載の医薬組成物。
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