[go: up one dir, main page]

WO2005090585A1 - ウイルスベクターによる固相遺伝子導入方法、その方法のための組成物、およびその方法のための装置 - Google Patents

ウイルスベクターによる固相遺伝子導入方法、その方法のための組成物、およびその方法のための装置 Download PDF

Info

Publication number
WO2005090585A1
WO2005090585A1 PCT/JP2005/004136 JP2005004136W WO2005090585A1 WO 2005090585 A1 WO2005090585 A1 WO 2005090585A1 JP 2005004136 W JP2005004136 W JP 2005004136W WO 2005090585 A1 WO2005090585 A1 WO 2005090585A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
cells
gene
protein
hvj
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2005/004136
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hitoshi Kotani
Toshihiro Nakajima
Akito Maeda
Kuniko Mizuhata
Yasufumi Kaneda
Shohei Akahane
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GenomIdea Inc
Original Assignee
GenomIdea Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GenomIdea Inc filed Critical GenomIdea Inc
Priority to JP2006519405A priority Critical patent/JPWO2005090585A1/ja
Publication of WO2005090585A1 publication Critical patent/WO2005090585A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • Solid phase gene transfer method using viral vector composition for the method, and device for the method
  • the present invention relates to a solid phase for introducing a desired substance into cells with high efficiency on a solid phase.
  • gene information is integrated using gene arrays and gene chips to analyze how gene expression patterns change during disease. It is used.
  • these devices can change gene expression patterns during disease (eg, determine the amount of messenger), but cannot identify the functions of those genes in actual cells.
  • Genetic analysis technology at the cell level is capable of analyzing functions at the actual cell level. Genetic analysis technology at the cell level using the conventional manual method is faster and more efficient. It is difficult to perform a dashi. Gene analysis techniques at the cell level can be broadly classified into (1) gene transfer techniques and (2) analysis techniques for transfected cells. Among these, in particular, the conventional gene transfer technique has problems in efficiency and high-speed dangling, and it is difficult to cope with many types of genes.
  • desired substances for example, peptides, compounds, nucleotide fragments, etc.
  • the present invention also provides a method for introducing a variety of desired substances, which can be performed at high speed and with high efficiency by using a virus envelope or a virus-derived protein, and is used for such a substance introduction method.
  • the challenge is to develop solid phases, compositions, and kits for performing these tasks.
  • the present invention has been achieved as a result of diligent studies on a solid-phase gene transfer method using a virus envelope or a virus-derived protein, and as a result, found a method for high-efficiency and high-speed gene transfer.
  • the present invention provides the following.
  • a device for introducing a desired substance into cells comprising:
  • a device wherein the viral vector and the surfactant having the sugar moiety are disposed on the solid phase.
  • the device according to item 1 further comprising (4) a substance to be introduced, wherein the substance to be introduced is disposed on the solid phase.
  • the substance to be introduced is a nucleic acid, a peptide, a sugar chain, or a nucleic acid encoding a gene to be introduced.
  • the device according to item 2 wherein the molecular compound, proteodarican, glycopeptide, lipid, and metal ion force are at least one substance selected from the group consisting of:
  • the substance to be introduced contains a nucleic acid selected from the group consisting of siRNA, antisense and decoy of the gene to be introduced.
  • the vinoresbatter comprises (i) a viral envelope, (ii) a ribosome containing at least one viral envelope protein, or (iii) a viral envelope, and a ribosome containing at least one viral envelope protein.
  • the virus envelope is retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, boxviridae, herpesviridae, baculovirus.
  • Item 7 The device according to Item 6, wherein the device is derived from a virus belonging to the family that is also selected from the family of viridae and hepadnaviridae.
  • virus envelope protein is an F protein, an HN protein, an NP protein, or a protein whose combination or group power is also selected.
  • the surfactant having a sugar moiety has the formula
  • A is a monosaccharide or a disaccharide. 14. The device according to item 13, wherein A is a disaccharide.
  • A is a dalcoside group or a maltoside group.
  • Surfactant power having the sugar moiety octyl maltoside, decyl maltoside, dodecyl maltoside, otatyl dalicoside, decyl darcoside, and dodecyl darcoside, as well as a mixture of these surfactants
  • the device according to item 1 further comprising (5) a protamine sulfate solution, wherein the protamine sulfate solution is disposed on the solid phase.
  • the stabilizing agent is trehalose, manoletose, raffinose, fructose, sucrose, glucose, ratatose, polyvinylinolebi mouth lidone, polyethylene glycol, methylcellulose, glycine, mannitol, dimethyl.
  • DMSO sulfoxide
  • the stabilizer is also selected from a group consisting of trehalose, maltose, raffinose, fructose or a mixture thereof.
  • a device for introducing a gene into a cell comprising:
  • An apparatus comprising:
  • Item 36 The apparatus according to Item 36, comprising:
  • a kit for introducing a gene into cells comprising:
  • a kit comprising:
  • kit according to item 38 further comprising (4) protamine sulfate.
  • kit according to item 38 further comprising (4) polyethyleneimine.
  • kit according to item 38 further comprising (5) a stabilizer.
  • kits according to item 42 wherein the stabilizing agent is trehalose, maltose, raffinose, fructose, sucrose, glucose, ratatose, polyvinylpyrrolidone K90, polyethylene glycol, methylcellulose, glycine, mannitol.
  • the strength of the group is selected from the group consisting of dimethyl sulfoxide (DMSO) or a mixture thereof.
  • kit according to item 38 or 42 further comprising (6) a step of freeze-drying.
  • Substances introduced into cells according to the present invention include not only nucleic acids such as nucleotide fragments, DNA, and RNA, but also proteins, sugar chains, low-molecular compounds, proteodaricans, glycopeptides, lipids, and metal ions. And the like.
  • this technology enables fast and highly efficient analysis of the functions of human genes and various biopolymers estimated to be 30,000 to 40,000 in actual cells.
  • a highly integrated device is provided.
  • a HVJ vector encapsulating biopolymers such as genes and proteins is immobilized on a device with micro-wells processed on a slide with high integration, and multiple samples are introduced after introduction into cells in micro-wells.
  • a detection device By analyzing with a detection device, it is possible to simultaneously evaluate the functions of a large number of human genes in living cells.
  • FIG. 1 is a graph showing the selection of surfactants for automation, showing the results of gene transfer using various surfactants at various concentrations according to the method of the present invention. .
  • FIG. 2 is a graph showing the selection of a surfactant for automation, and shows the results of gene transfer using various surfactants at various concentrations according to the method of the present invention. .
  • FIG. 3 is a view showing high reproducibility when a pGL3 expression plasmid was introduced according to the method of the present invention.
  • the X axis indicates the horizontal cell number (1-12), and the Y axis indicates the horizontal cell number (A-H).
  • FIG. 4A is a view showing high reproducibility when a pGL3 expression plasmid is introduced according to the method of the present invention.
  • the X-axis shows the horizontal shell number (1-12), and the Y-axis shows the horizontal shell number (A-H).
  • FIG. 4B is a diagram showing high reproducibility when a pGL3 expression plasmid was introduced according to the method of the present invention.
  • the X-axis shows the horizontal shell number (1-12), and the Y-axis shows the horizontal shell number (A-H).
  • FIG. 5 is a view showing a difference in gene transfer efficiency when plates coated with various substances are used.
  • FIG. 6 shows the results showing gene transfer efficiency when protamine sulfate and polyethylimine were used. "None" indicates the results of an experiment using neither protamine sulfate nor polyethylimine.
  • FIG. 7 shows the results showing gene transfer efficiency when protamine sulfate and polyethylimine were used.
  • FIG. 8 shows the results showing gene transfer efficiency when various polyethylimines were used.
  • FIG. 8A shows the gene transfer efficiency when PEI-L 25K was used.
  • the X-axis is the PEI-L 25K concentration at the time of introduction.
  • FIG. 8 shows the results of gene transfer efficiency when various polyethylimines were used. It is.
  • FIG. 8B shows the gene transfer efficiency when PEI-L2.5K was used.
  • the X-axis is the ⁇ —L2.5 ⁇ concentration at the time of introduction.
  • FIG. 8 shows the results showing gene transfer efficiency when various polyethylimines were used.
  • FIG. 8C shows the gene transfer efficiency when using ⁇ — ⁇ 25 ⁇ .
  • the X-axis is the ⁇ —L 25 ⁇ concentration at the time of introduction.
  • FIG. 8D shows the results of gene transfer efficiency when various polyethylimines were used.
  • FIG. 8D shows the gene transfer efficiency when ⁇ - ⁇ 750 ⁇ is used.
  • the X-axis is the concentration of L-750 at the time of introduction.
  • FIG. 9 ⁇ shows the results showing the cytotoxicity of various polyethylimines.
  • FIG. 9 ⁇ shows the results showing the cytotoxicity of various polyethylimines.
  • FIG. 10 shows the results showing stability by freeze-drying.
  • FIG. 11 shows the results showing that gene transfer efficiency is maintained when the cells are freeze-dried and stored for a long period of time.
  • Fig. 12 shows the results showing that gene transfer efficiency is maintained when lyophilized using different stabilizers and stored for a long period of time.
  • FIG. 13 shows the results showing that gene transfer efficiency is maintained when lyophilized using different stabilizers and stored for a long period of time.
  • FIG. 14 shows the results showing that the storage stability of each cell was uniform.
  • FIG. 15 shows the results showing that, even when siRNA was introduced, the gene introduction efficiency was maintained after long-term storage as in the case of DNA.
  • FIG. 16 shows the results showing that, even when siRNA is introduced, the gene introduction efficiency is maintained after long-term storage as in the case of DNA.
  • FIG. 17 shows the results showing that the freeze-drying method is not related to plate coating.
  • FIG. 18 shows the results of a gene transfer experiment using a plate obtained by lyophilizing a virus vector containing no nucleic acid to be introduced and lyophilizing it.
  • cell is defined in the same broad sense as used in the art, and is a constituent unit of a tissue of a multicellular organism, and is a membrane that isolates the outside world.
  • the term "stabilizer” refers to an agent that improves the storage stability of a cell culture container of the present invention containing a gene transfer vector when the container is stored by lyophilization.
  • the stabilizer of the present invention include trehalose, maltose, raffinose, fructose, sucrose, glucose, ratatose, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, methylcellulose, glycine, mannitol, dimethylsulfoxide (DMSO) or a mixture thereof. Examples include, but are not limited to, substances from which both force and group force are selected.
  • Stabilizers preferably include trehalose, maltose, raffinose, fructose or mixtures thereof. More preferably, the stabilizer of the present invention is trehalose.
  • polyethyleneimine includes both linear and branched types.
  • the structure of linear PEI is shown as-[NH-CH2-CH2] x-.
  • X is any integer.
  • preferable linear PEI include PEI-L (PEI-L2.5K) having a molecular weight of 2.5 kDa and PEI-L (PEI-L 25K) having a molecular weight of 25 kDa.
  • Branched PEI is — [NH-CH2-CH2] y- [N (CH 2—CH2—NH2) —CH2—CH2] z—.
  • y is any integer.
  • z is any integer independent of y.
  • preferred branched PEIs are PEI-B with a molecular weight of 25 kDa (PEI-B 25K) and PEI-B with a molecular weight of 750 kDa (PEI-B 750K).
  • viral envelope vector refers to a vector in which a foreign gene is encapsulated in a viral envelope, or a foreign gene is encapsulated in a component containing a protein derived from a viral envelope.
  • Vector ⁇ The virus used for the production of the virus vector may be a wild-type virus or a recombinant virus.
  • the virus used for the preparation of the virus envelope or the protein derived from the virus envelope includes retroviridae, togaviridae, coronaviridae, flaviviridae, and paramyxoviridae.
  • Viruses belonging to the family selected from the group consisting of: Orthomyxoviridae, Byadinores, La Grape Inenoles, Boxwinores, Henolesininoles, Noculoiviridae, and Hepadnaviridae. Listed powers are not limited to these.
  • a virus belonging to the family Nomyxoviridae is used, more preferably, HVJ (Sendai virus).
  • Virus envelope-derived proteins include, for example, HVJ F protein, HN protein, NP protein, and M protein.
  • HVJ HVJ
  • Sendai virus can be used interchangeably.
  • envelope of HVJ envelope of Sendai virus
  • envelope of Sendai virus are used as words having the same meaning.
  • Sendai virus refers to a virus that belongs to the genus Paramyxovirus in the family Paramyxovirus and has a cell fusion effect. Virus particles have an envelope and show a polymorphism of 150 to 300 nm in diameter. The genome is a minus-strand RNA of about 15500 bases in length. It has an RNA polymerase, is thermally unstable, agglutinates almost all types of red blood cells, and is hemolytic.
  • HAU refers to the activity of a virus capable of aggregating 0.5% of avian erythrocytes, and 1 HAU corresponds to approximately 24 million virus particles (Okada, Y. et al.). , Bike n Journal 4, 209—213, 1961).
  • animal cells used as host cells include mouse 'myeloma cells, rat's myeloma cells, mouse' hybridoma cells, Chinese'no cells, CHO cells as B. muster cells, BHK cells, and African green monkeys.
  • Examples include kidney cells, human leukemia cells, HBT5637 (JP-A-63-299), and human colon cancer cell lines.
  • African green monkeys such as ps20 and NSO for mouse myeloma cells, YB2Z0 for rat myeloma cells, HEK293 (ATCC: CRL-1573) for human fetal kidney cells, and BALL-1 for human leukemia cells
  • kidney cells include COS-1 and COS-7
  • human colon cancer cell lines include HCT-15.
  • solid phase As used herein, the terms “solid phase,” “substrate,” and “support” are used interchangeably herein and refer to the material from which the array of the present invention is constructed (preferably, Solid).
  • the material of the substrate may have the property of binding to the biomolecule used in the present invention, or may be derivatized to have such property, either covalently or non-covalently. , Any solid material.
  • any material that can form a solid surface can be used, and examples thereof include glass, silica, silicon, ceramic, silicon dioxide, plastic, and metal (alloy). ), Natural and synthetic polymers (eg, polystyrene, cellulose, chitosan, dextran, and nylon), including but not limited to:
  • the substrate may be formed from multiple layers of different materials.
  • inorganic insulating materials such as glass, quartz glass, alumina, sapphire, forsterite, silicon carbide, silicon oxide, and silicon nitride can be used.
  • nylon membrane In the present invention, nylon membrane, nitrocellulose membrane, PVDF membrane, etc.
  • a film used for blotting can also be used.
  • Nylon membranes are preferred. This is because, when a Nippon membrane is used, the results can be analyzed using a simple analysis system. However, when analyzing a high-density material, it is preferable to use a material having hardness, such as glass.
  • the term “chip” or “microchip” refers to a microminiature integrated circuit that has various functions and becomes a part of a system.
  • the “DNA chip” includes a substrate and DNA, and at least one DNA (eg, a cDNA fragment) is disposed on the substrate.
  • the term “protein chip” includes a substrate and a protein, and at least one protein (eg, polypeptide or oligopeptide) is disposed on the substrate.
  • “DNA chip” and “protein chip” are included herein as “microchip” or simply “chip”.
  • a “microarray” is one in which one or more biomolecules (eg, oligonucleotides such as cDNA fragments or peptides) are arranged and arranged on such a chip!
  • biomolecules for example, oligonucleotides such as DNA or peptides
  • those collected from a living body can be used, and the biomolecules can be obtained by a method known to those skilled in the art.
  • oligonucleotides can be prepared by automated chemical synthesis using either a DNA synthesizer or a peptide synthesizer, such as those marketed by Applied Biosystems. Compositions and methods for the synthesis of automated oligonucleotides are described, for example, in US Pat. No. 4,415,732, Caruthers et al. (1983); US Pat. Nos. 4,500,707 and Caruthers (1985). U.S. Patent No. 4,668,777, Caruthers et al. (1987).
  • the substrate any number of biomolecules (e.g., DNA or peptide) may be provided, usually, per one substrate 1, 10 to 8 biomolecule 10 7 In other embodiments until bIOLOGICAL molecule, 10 6 biological molecule, 10 to 5 biological molecules, no more than 10 4 biomolecules, 10 3 to biomolecules, or 10 up to two biomolecules number of biomolecules Can be arranged.
  • the size of the substrate is preferably smaller.
  • the spot size of a biomolecule eg, DNA or peptide
  • the minimum board area is V, in some cases, is determined by the number of biomolecules on the substrate.
  • surfactant having a sugar moiety includes a surfactant having a “sugar moiety” in the molecule.
  • Surfactants include ionic surfactants, cationic surfactants, non-ionic surfactants, and amphoteric surfactants.
  • Sugar moieties of surfactants having a sugar moiety include, but are not limited to, monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides, pentasaccharides, hexasaccharides, heptasaccharides, and octasaccharides. The sugar moiety may or may not be branched.
  • the sugar moiety is preferably a monosaccharide monopentasaccharide, more preferably a monosaccharide or disaccharide.
  • examples of the sugar moiety include, but are not limited to, dalcoside, galactoside, maltoside, thiomaltoside, and thiodarcoside.
  • a surfactant having a sugar moiety is, for example, a compound represented by A- (CH) 2 -CH, where A is a sugar n 3
  • And-(CH) -CH is a hydrophobic moiety other than the sugar moiety. Its hydrophobic part is n 3
  • n is 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, and 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 10 or less, 9 Below, 8 or less, or 7 or less.
  • the preferred range of n is 7-11.
  • the surfactant having the sugar moiety is selected from the group consisting of octyl maltoside, decyl maltoside, dodecyl maltoside, otatildaricoside, decyldarcoside, dodecyldarcoside, and mixtures thereof.
  • a preferred surfactant having a sugar moiety is decyl maltoside.
  • the preparation of the substance introduction device in which the virus vector is immobilized can be carried out by the following steps:
  • substances to be introduced include not only nucleic acids such as nucleic acids, proteins, peptides, nucleotide fragments, nucleotide fragments, DNA, RNA, nucleotides, nucleosides and derivatives thereof, but also proteins, sugar chains, Also included are low molecular weight compounds, proteodaricans, glycopeptides, lipids and metal ions.
  • nucleic acids such as nucleic acids, proteins, peptides, nucleotide fragments, nucleotide fragments, DNA, RNA, nucleotides, nucleosides and derivatives thereof, but also proteins, sugar chains, Also included are low molecular weight compounds, proteodaricans, glycopeptides, lipids and metal ions.
  • the introduced gene is derived from any organism. And can be DNA, RNA or nucleotide analogs.
  • the gene to be introduced may be one kind or plural kinds.
  • the cell into which the gene is introduced is not particularly limited, but is preferably an animal cell, and more preferably a mammalian cell including a human cell.
  • the virus used to prepare the viral envelope may be a retroviridae, a togaviridae, Group selection with coronaviridae, flaviviridae, paramyxoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae, rhabdoviridae, boxviridae, herpesviridae, baculoviridae, and hepadnaviridae It may be derived from a virus belonging to the family to be treated.
  • the virus is a Paramyxoviridae virus, especially HVJ.
  • a method for introducing a candidate nucleic acid into a cell using a ribosome containing at least one protein of a virus envelope is also available.
  • Proteins used in this method include, but are not limited to, F protein, HN protein, NP protein, M protein or a combination thereof.
  • the mixture of the virus vector and the substance to be introduced is prepared, for example, by centrifuging a solution containing the virus vector to form a precipitate, and suspending the precipitate using the substance solution to be introduced.
  • Conditions for this centrifugation include, for example, 15000 X g, 4 ° C, and 15 minutes.
  • centrifugation conditions of 15000 X g at 4 ° C for 60 minutes can be used.
  • a mixture of the virus vector solution and the substance solution to be introduced may be prepared in another container in advance, and the mixture may be added to the solid phase.
  • a virus vector solution and a substance solution to be introduced may be separately added to the solid phase.
  • the substance introduction device which is a solid phase containing a virus vector, a substance to be introduced, and a surfactant having a sugar moiety is allowed to stand at room temperature.
  • the incubation time can preferably be 5 minutes, 7 minutes, 10 minutes, 12 minutes, 15 minutes, 17 minutes, 20 minutes, 25 minutes, 30 minutes.
  • protamine sulfate (PS) or polyethylenimine (PEI) is added to increase the gene transfer efficiency.
  • the concentration of protamine sulfate used is preferably 1 ⁇ g / ml-lmg / mU, more preferably 10 ⁇ g / ml-250 ⁇ g / m, most preferably 100 g / ml.
  • the concentration of polyethyleneimine used is preferably 0.1 g / ml-300 ⁇ g / ml, more preferably 0.5 g / ml-200 ⁇ g / ml, most preferably 1 ⁇ gZ One ml is 100 ⁇ gZ ml.
  • the substance introduction device is centrifuged.
  • the conditions for this centrifugation are, for example, 1643 X g, 4 ° C, and 30 minutes, but are not limited thereto.
  • a foreign gene can be introduced into cells by the following method.
  • the cell suspension is introduced into the substance introduction device in which the virus vector is immobilized. Centrifuge the device if necessary. The conditions of the centrifuge are typically, but not limited to, 182 ⁇ g, 32 ° C., for 30 minutes. Thereafter, if necessary, the device is shaken and centrifuged. The conditions of the centrifuge are typically, but not limited to, 182 ⁇ g, 32 ° C., 30 minutes. If necessary, two more centrifugations at 182 X g at 32 ° C for 30 minutes can be performed.
  • a large number of cell populations are prepared by introducing a large number of genes into the substance introduction device of the present invention, and the functions of the cell populations are analyzed to obtain a desired function.
  • Cells into which a nucleic acid having a specific property has been introduced are selected. As a result, a gene having a desired function is identified.
  • Desired functions include, for example, encoding a gene that induces angiogenesis, encoding a tumor suppressor gene, encoding a gene that enhances bone formation, encoding a gene that induces apoptosis, secreting cytoin.
  • a gene encoding a neurite-inducing gene for neurons, encoding an arterial stiffness inhibitor gene, encoding a diabetes suppressor gene, encoding an autoimmune disease suppressor gene, Alzheimer's disease suppressor gene , Encoding a Parkinson's disease suppressor gene, encoding a neuronal protection gene, and a combination of these.
  • this selection is preferably performed based on the characteristics of the host cell that are changed by the expression of the candidate nucleic acid. For example, when isolating a gene encoding a growth factor from a candidate nucleic acid, the desired functional property is to promote the growth of a particular cell or any cell.
  • the above analysis method can be applied to any functional property as long as the target functional property can be recognized.
  • the functional properties intended in the above analysis method include promotion or suppression of cell proliferation, cell differentiation or dedifferentiation, expression or suppression of marker protein expression, suppression of expression or expression of marker mRNA, change in membrane potential, Examples include, but are not limited to, depolarization, apoptosis, canceration, growth arrest, morphological changes, size changes, and the like.
  • the gene transfer method of the present invention can be applied to screening.
  • a substance introduction device comprising (1) a solid phase; (2) a viral vector; (3) a substance to be introduced; and (4) a surfactant having a sugar moiety
  • the (3) By using a gene library as a substance, it can be applied to screening.
  • a gene library By preparing a cell population containing a gene library on a device using a gene library, selecting cells having a desired function from the cells, and isolating and identifying nucleic acids in the cells A gene having a desired function can be screened. Also, If the cell population that is found to be positive by cleaning contains multiple types of genes, it is possible to isolate and identify a gene having a desired function by purifying the substance. is there.
  • This screening method can be applied not only to plasmid-like nucleic acids, but also to proteins, peptides, low molecular weight compounds, nucleotide fragments, and the like.
  • the substance introduction device can reduce the size of the immobilization region of the virus vector, screening of biomolecules can be performed not only in 96-well plates, but also in 384-well plates and 1536-well plates. It is possible to do.
  • the substance introduction device of the present invention is suitable for automation.
  • a kit for performing the method of the present invention is also provided in the present invention.
  • virus envelope vectors Various methods are known as virus envelope vectors.
  • the present inventors have developed a hybrid gene transfer vector by combining a virus and a non-viral vector, and have developed a fusion-forming virus having a fusion-forming envelope derived from Japanese hemagglutinating virus (HVJ; Sendai virus).
  • HVJ Japanese hemagglutinating virus
  • Ribosomes have been constructed (Kaneda, Biogenic Amines, 14: 553-572 (1998); Kaneda et al., Mol. Med. Today, 5: 298-303 (1999)).
  • HVJ ribosomes 400-500 nm in diameter
  • An advantage of fusion-mediated delivery is that transfatating DNA also protects endosomal and lysosomal degradation in recipient cells.
  • Up to 100 kb of DNA is incorporated into the HVJ ribosome and delivered to mammalian cells.
  • RNA, oligonucleotides and drugs are also efficiently introduced into cells in vitro and in vivo. The HVJ ribosome was not shown to induce significant cell damage in vivo.
  • Methods for preparing the above-listed viral envelope vectors are also known. Representative examples are shown below. The method for preparing a virus envelope vector described below is an exemplification, and the present invention is not limited to the vector prepared by the following method.
  • a viral vector containing a protein derived from the viral envelope includes a HVJ (Sendai virus) F fusion protein and a ribosome reconstituted with an HN fusion protein.
  • HVJ Sendai virus
  • Viral vectors that do not contain genomic RNA are included.
  • the F fusion protein and HN fusion protein used for the preparation of such a viral vector may be a natural HVJ-derived protein or a recombinantly expressed protein. Recombinantly produced fusion proteins are processed by proteases in vitro or by endogenous proteases in mammalian cell hosts.
  • a viral vector containing a protein derived from the viral envelope is prepared, for example, by a method comprising the following steps:
  • the surfactant used in the above method is not limited to a specific surfactant, but is preferably otatildaricoside, Triton-X100, CHAPS or NP-40, or these. Is a mixture of
  • the lipid used in the above method is not limited to a specific lipid, and (1) has a long-chain fatty acid or a similar hydrocarbon chain in a molecule, and (2) exists in a living body, or Any molecule derived from a living organism may be used.
  • Preferred lipids include, but are not limited to, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, cholesterol, sphingomyelin, and phosphatidic acid.
  • Ribosome preparation methods are well known, and for example, the following methods can be used.
  • the HVJ envelope protein can be purified using natural HVJ as a source, or the recombinantly expressed HVJ envelope protein can be purified.
  • Known methods for purifying proteins include, for example, ammonium sulfate precipitation, isoelectric focusing, Lam purification methods include, but are not limited to.
  • Lam purification methods include, but are not limited to.
  • purifying a protein using a column various columns are selected depending on the properties of the desired protein and the properties of contaminants. Columns for protein purification include, but are not limited to, anion exchange columns, cation exchange columns, gel filtration columns, and affinity columns.
  • a viral vector containing a protein derived from the viral envelope is prepared by a method comprising the following steps:
  • a viral vector containing a protein derived from the viral envelope is also prepared by a method comprising the following steps:
  • a method of preparing a virus vector having a foreign gene encapsulated in a virus envelope includes, for example, a method comprising the following steps:
  • a viral vector derived from the viral envelope is prepared by a method comprising the following steps:
  • a method for preparing an inactivated virus envelope vector for gene transfer comprising:
  • lipids generally used for lipofection can be used.
  • a lipid such as lipofect AMINE 2000 can be used.
  • various cells can be used as cells into which a substance is introduced.
  • a cell is preferably a mammal, more preferably a cell from the species from which the candidate nucleic acid is derived.
  • Example 1 Preparation and use of a virus vector in which a foreign gene is encapsulated in a component containing a protein derived from a virus envelope) (Preparation of virus)
  • HVJ hemagglutinin units
  • Nonidet P-40 (NP-40) and fermethylsulfur-fluoride (PMSF) dissolved in ethanol were purified to a final concentration of 0.5% and 2 mM, respectively, in 20 ml of HVJ suspension (l, 750, 000 HAU). The mixture was incubated at 4 ° C. for 30 minutes with no rotation. The suspension was then centrifuged at 100,000 g at 4 ° C. for 75 minutes to remove insoluble proteins and the viral genome (Uchida et al., 1979). The supernatant was dialyzed against 5 mM phosphate buffer (pH 6.0) for 3 days, and the buffer was changed every day to wash off residual NP-40 and PMSF.
  • the dialyzed solution was centrifuged at 100,000 g for 75 minutes at 4 ° C. to remove insoluble substances.
  • the supernatant was subjected to a 10 mM phosphate buffer (pH 5) containing 0.3% sucrose and ImM KC1 according to the method described previously (Yoshima et al., J. Biol. Chem., 256: 5355-5361 (1981)).
  • HVJ fusion proteins can also be prepared by incorporating the gene encoding the fusion protein into an expression vector and expressing it in a suitable host cell. F tongue The amino acid sequences of protein and HN protein are known.
  • Expression vectors that encode the fusion protein can be introduced into cells, and are any of a variety of methods known and described in the art (eg, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratoy Manual ⁇ 2nd Ed). , Vols 1 to 3, Cold Spring Harbor Laboratory
  • Methods for introducing a recombinant expression vector into prokaryotic or eukaryotic cells include, for example, a transformation or transfection method such as an electoporation method.
  • the polypeptide corresponding to the trypsin-treated activated F1 protein can be expressed in Escherichia coli using an expression vector containing a gene encoding the shortened amino acid sequence of activated F1.
  • the truncated F1 protein needs to include at least 26 amino acid residues from ferrule at position 117 to alanine at position 142. If the truncated protein forms an inclusion body, one skilled in the art can easily obtain the active protein by refolding the inclusion body (Robert F. Kelley and Marjorie E. Winkler). , Genetic Engineerings (1990) vol. 12, pages 11-19).
  • Cells capable of replicating HVJ are used as host cells.
  • HVJ eg, rodent tracheal epithelial cells; chicken embryos; primary cultured cells of monkey kidney; primary cultured cells of human fetal lung, kidney, and amnion
  • the expressed full-length F protein is Since it is cleaved by the mouth thease and as a result is activated, it is possible to express and isolate the active form F protein.
  • host cells that express Triptase clara can also be used.
  • Triptase clara eg, rat tracheal epithelial cells
  • hosts that express recombinantly Cells can also be used.
  • the lysate of HVJ treated with NP-40 was clarified by ultracentrifugation.
  • the protein in the supernatant was separated by SDS-PAGE before further purification.
  • This supernatant contained many proteins from HVJ.
  • this supernatant was applied to ion exchange chromatography.
  • the 52 kDa and 72 kDa proteins eluted primarily in the flow through fraction. These two proteins were identified as F1 and HN, respectively, by mobility on SDS-PAGE (Okada, Methods in Enzymology, N. Duzgnes (Ed.), Academic Press, Diegoan Diego, vol. 221). , pp. 18-41 (1993)).
  • the faint band below the 52 kDa protein was considered to be a degradation product of the fusion proteins (F1 and HN). This is because these proteins were not reproducible between different experiments.
  • the protein was further eluted with 0.2M NaCl. However, the fusion protein was not as efficient as it could be. Then, an additional 60 kDa protein appeared to be the NP protein of HVJ.
  • Densitometry showed that the concentration ratio of F1 to HN in the flow-through fraction was 2.3: 1. This was consistent with the ratio of both proteins in the virus envelope.
  • An earlier paper (Nakanishi et al., Exp. Cell Res., 142: 95-101 (1982)) reports that this ratio is necessary for efficient fusion of HVJ.
  • the dialyzed solution was agarose beads (Bio—Gel A—50 m) equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 5.2) containing 0.3 M sucrose and ImM KC1 (Bio—Rad Laboratories, Hercules , CA, USA). Fractions with an optical density at 540 nm greater than 1.5 were collected as reconstituted fusion particles and fused with a nucleic acid-filled liponome that was also prepared at 10 mg lipid force as described below to prepare a viral vector.
  • pCMV luciferase (7.4 kb)
  • pGEM luciferase gene from luc (Promega Corp., Madison, Wis., USA)
  • pcDNA3 5.4 kb (Invitrogen, San Diego, CA, USA)
  • a viral vector containing about 40 g of pCMV-luciferase was constructed as described above, and the viral vector (about 1.5 ⁇ 10 11 particles Zml, DNA concentration about 40 ⁇ g / ml) of 1Z10
  • the quantity (100 1) was incubated with 2 ⁇ 10 5 cells from the human 293 cell line (human fetal kidney: HEK).
  • luciferase DNA was transfected into 2 ⁇ 10 DNAEK293 cells using HVJ ribosomes. Twenty-four hours after transfection, the cells were collected, and the luciferase activity was confirmed as described elsewhere (Saeki et al., Hum. Gene Ther., 8: 1965-1972 (1997)).
  • the recombinant HVJ virus was freeze-thawed at various times and then transfected into cultured cells.
  • 500 ⁇ l of TE was mixed with 750 ⁇ g of luciferase expression vector pcOriPLuc (Saeki and Kaneda et al., Human Gene Therapy, 11, 471-479 (2000)) and various concentrations of HVJ virus.
  • the HVJ virus concentration was adjusted to 10, 25, 50, and 100 HAUZ1. This solution was divided into 12 parts, each of which was frozen with dry ice and then thawed up to 30 times.
  • the solution that has been frozen and thawed a predetermined number of times is added to the medium of BHK-21 cells (24 ⁇ eldish, 4 ⁇ 10 4 cells / dish, 0.5 ml DMEM, 10% FCS), and then added to the medium. After reacting with 5% CO for 20 minutes, wash with PBS and culture again
  • the solution was added to 0.5 ml and cultured for 24 hours.
  • luciferase activity was increased as the number of freeze-thaw cycles of the recombinant HVJ virus was increased, and luciferase expression was observed 10 times or more in 20 freeze-thaw cycles compared to 3 freeze-thaw cycles. . From these results, it was confirmed that, under the conditions used in this example, the number of freeze-thaw cycles of the recombinant HVJ virus was preferably 5 or more, and more preferably about 15 to 20 times.
  • the amount of the solution added with the virus concentration of 10 HAUZ ⁇ 1 is 50 ⁇ 1, and the amount of the solution of 100 HAU / ⁇ 1 is 5 ⁇ 1.
  • a solution with a virus concentration of 100 HAU / ⁇ 1 reduced the efficiency of gene expression by about 50% compared to a solution with a concentration of 10-50 HAUZ ⁇ 1. From these results, it was confirmed that the recombinant virus concentration is preferably in the range of 10-50 HAUZ ⁇ 1 under the conditions of this example.
  • the recombinant HVJ virus was thawed 29 times and then thirty times frozen. After preservation in the frozen state for 1 week, it was thawed and added to the cells. As a result, The surviving recombinant HVJ virus also showed the same level of luciferase gene expression as the virus that had been subjected to 30 consecutive freeze-thaw cycles.
  • the HVJ can be generally used by multiplying by inoculating a seed virus into fertilized eggs of chickens. (Added to the solution), and those obtained by infecting cultured cells with a cloned virus genome to cause persistent infection and then growing are all available.
  • HVJ was propagated as follows.
  • HVJ seed virus is propagated using fertilized eggs of SPF (Specific pathogen free), separated and dispensed.
  • SPF Specific pathogen free
  • the purified HVJ (species Z) is dispensed into a cell storage tube, and 10% DMSO is added to Stored and prepared in nitrogen.
  • Seed virus (removed from liquid nitrogen) with a polypeptone solution (mixed with 1% polypeptone and 0.2% NaCl, adjusted to pH 7.2 with 1M NaOH, sterilized by autoclave, and stored at 4 ° C) was diluted 500-fold and placed at 4 ° C.
  • Eggs are disinfected with isodine and alcohol, a small hole is drilled through the virus injection area with a 1000-thread penetrator, and 0.1 ml of diluted seed virus is injected into the allantoic cavity using an lml syringe with a 26-gauge needle. did.
  • the melted paraffin (melting point 50-52 ° C) was placed over the hole using a Pasteur pipette and closed.
  • the eggs were placed in an incubator and reared for 3 days at 36.5 ° C and a humidity of 40% or more.
  • the inoculated eggs were then placed overnight at 4 ° C.
  • divide the air chamber of the egg with tweezers put a 10 ml syringe with an 18 gauge needle into the chorioallantoic membrane, aspirate the allantoic fluid, collect in a sterile bottle, and keep at 4 ° C Existed.
  • HVJ can be purified by a purification method by centrifugation, a purification method by a column, or other purification methods known in the art.
  • the grown virus solution was recovered and the tissue and cell debris in the culture solution and chorioallantoic fluid were removed by low-speed centrifugation.
  • the supernatant was purified by high speed centrifugation (27,500 ⁇ g, 30 minutes) and ultracentrifugation (62,800 ⁇ g, 90 minutes) using a sucrose density gradient (30-60% wZv). Care should be taken to keep the virus as mild as possible during purification and store at 4 ° C.
  • HVJ was purified by the following method.
  • HVJ-containing chorioallantoic fluid collected the HVJ-containing avian eggs and store at 4 ° C
  • a wide-mouth Komagome pipette Saeki, Y , And Kan eda, Y: Protein modinea liposomes (HVJ—liposomes) for the delivery of genes, oligonucleotides and proteins.
  • HVJ Protein modinea liposomes
  • the precipitate was loosened by gentle pipetting using a wide-mouth Komagome pipette, collected in a single tube, and centrifuged at 27, OOOg for 30 minutes using an angle rotor. Except for the supernatant, about 10 ml of BSS was added to the precipitate, and the mixture was similarly allowed to stand at 4 ° C. Gently pipette with a wide-mouthed Komagome pipe to loosen the precipitate, centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes at 4 ° C with a low-speed centrifuge (brake off), and remove virulent tissue fragments ⁇ virus aggregation Look at the lumps, V. Put the supernatant in a new sterile tube and store at 4 ° C as purified virus.
  • HAU hemagglutination activity
  • the absorption value 1 at 540 nm corresponded to approximately 15, OOOHAU.
  • HAU is considered to be approximately proportional to the fusion activity.
  • Hemagglutination activity may also be measured using- ⁇ avian erythrocyte fluid (0.5%)! / ⁇ (Manual for practical use of animal cells, REALIZE INC. (Edited by Uchida, Oishi, Furuzawa) P259 — See 268, 1984).
  • purification of HVJ using a sucrose density gradient can be performed as necessary. Specifically, the virus suspension is placed on a centrifugal tube overlaid with 60% and 30% sucrose solutions (autoclave sterilization), and subjected to density gradient centrifugation at 62,800 ⁇ g for 120 minutes. After centrifugation, collect the band on the 60% sucrose solution layer. The collected virus suspension is dialyzed overnight at 4 ° C using BSS or PBS as an external solution to remove sucrose. If not used immediately, add glycerol (autoclave sterilized) and 0.5M EDTA solution (autoclave sterilized) to the virus suspension to a final concentration of 10% and 2-10 mM, respectively, at -80 ° C. C. Gently freeze in C, and finally store in liquid nitrogen (freeze storage is also possible with 10 mM DMSO instead of glycerol and 0.5 M EDTA).
  • purification of HVJ by a column is also applicable to the present invention.
  • purification was performed using concentration (approximately 10-fold) by ultrafiltration using a filter having a molecular weight cutoff of 50,000 and elution by ion exchange chromatography (0.3M to 1M NaCl).
  • HVJ was purified by a column using the following method.
  • chorioallantoic fluid After collecting the chorioallantoic fluid, it was filtered through an 80 m-10 m membrane filter. 0.006-0. 008% BPL (final concentration) was added to the chorioallantoic fluid (4 ° C, 1 hour) to inactivate the HVJ. BPL was inactivated by incubating chorioallantoic fluid at 37 ° C for 2 hours.
  • HVJ was purified by a column chromatography method (buffer: 20 mM TrisHCl (pH 7.5), 0.2-1 M NaCl) using QSepharoseFF (Amersham Fanolemasia Biotech KK, Tokyo). The recovery was 40-50% and the purity was over 99%.
  • the HVJ fraction was concentrated by a tangential flow ultrafiltration method using 500KMWCO (A / G Technology).
  • HVJ suspension was placed in a 30 mm petri dish and irradiated with 99 or 198 millijoules Zcm 2 .
  • Gamma ray irradiation is also available (5-20 gray) but does not completely deactivate.
  • the suspension of HVJ was supplemented with ⁇ -propiolatatone to a final concentration of 0.01% and incubated on ice for 60 minutes. After that, the cells were incubated at 37 ° C for 2 hours. Dispense 10,000 HAU per tube into Eppendorf tubes, centrifuge at 15,000 rpm for 15 minutes, and store the precipitate at -20 ° C. Regardless of the inactivation method described above, the precipitate is not stored at -20 ° C, and the DNA is directly incorporated by detergent treatment to create a vector.
  • Triton—X100 t—t-octylphenoxypolyethoxyethanol
  • CHAPS [(3-cholamidopropyl) dimethylammo] —1—propanesulfonic acid
  • NP— Detergents such as 40 (noylphenoxypolyethoxyethanol) may also be used.
  • Preferred final concentrations of Triton-X100, NP-40 and CHAPS are 0.24-0.80%, 0.04-0.12% and 1.2-2.0%, respectively.
  • Cold BSS was supplemented with lml of calo, and immediately centrifuged at 15, OOOrpm for 15 minutes.
  • PBS or physiological saline was added to the resulting precipitate in a volume of 300 1 and suspended by vortexing and pipetting.
  • the suspension can be used directly for gene transfer, or can be used for gene transfer after storage at 20 ° C.
  • This HVJ envelope vector maintained comparable gene transfer efficiency after storage for at least 2 months.
  • a 1,000 HAU portion was placed in an Eppendorf tube (30 ⁇ l), and protamine sulfate (lmgZm1) 51 was added. Replace the medium with BHK-21 cells (previously 200,000 cells per well, spread over 6 wells) and add 0.5 ml of medium (10% FCS-DMEM) per well. did. To each well, add a mixture of the above vector (equivalent to 1,000 HAU) and protamine sulfate, shake the plate back and forth and left and right to mix the vector and cells well, and place in a 5% CO incubator at 37 ° C. Left for 10 minutes.
  • luciferase a luciferase gene having a CMV promoter
  • lyse the cells with 5 ml of Cell Lysis Buffer (Promega) O, and use the luciferase assay kit (Promega) to determine the activity in a 20 ⁇ l solution. It measured using.
  • pCMV-GFPE green fluorescent protein
  • the ribosome vector of the present invention is prepared by combining a cDNA derived from a cDNA library of 20 to 24; zg and a reagent of 24 to 72 ⁇ l of lipofect AMINE 2000 (Invitrogen life technologies (Carlsbad, California 92008)).
  • the host cells are added to each well of a 96-well plate with an appropriate medium, and cultured. If transfection is performed in the presence of serum, add 12.5 conjugate directly to each well of a 96-well plate and mix. When performing transfusion in the absence of serum, remove the serum-containing medium before adding the complex, and replace with a serum-free medium.
  • a substance introduction device was prepared by immobilizing an HVJ-E vector containing a desired nucleic acid on a solid phase using the following method.
  • BHK-21 cells (babyhamsterkidney cells) were purchased from the American Type Culture Collection (ATCCRockville, MD). The cells were cultured in Dulbecco's modified Idal medium supplemented with 10% FBS. To evaluate the transfusion efficiency, pGL3 (Promega), a luciferase expression vector, was used. Plasmids were prepared using Qiagen columns (Hilden, Germany). The HVJ virus was amplified and the HVJ-E vector was prepared as described in Example 3.
  • luciferase activity was detected when each of dodecyl maltoside, otatildaricoside, and digitonin was used.
  • the intensity of the activity was the strongest for dodecyl maltoside, followed by digitonin, which was the strongest for otatildaricoside.
  • the order of the highest activity was decyl maltoside, dodecyl maltoside, octyl maltoside, otatildaricoside, digitonin.
  • the gene transfer method of the present invention showed high reproducibility.
  • the mean values of the fluorescence intensity (RU) are 2080518 and 1667747, with a standard deviation of 377798.9 and And 324477.
  • the relative standard deviations (CV%) were 18.2% and 19.5%, indicating the high reproducibility of the present invention by numerical values (FIGS. 4A and B).
  • the plate shown in Fig. 5 was used.
  • the coating of each plate is as follows: Corning: no coating (manufactured by Corning),
  • PLL Poly L lysine coating (Sumitomo Bakelite),
  • Gelatin gelatin coating (Sumitomo Bakelite),
  • C-1 Collagen 1 coating (Sumitomo Bakelite),
  • PLO / LM Poly L-ol-tin Z laminin coating (manufactured by BD Bioscience)
  • PDL / LM Poly D lysine Z laminin coating (manufactured by BD Bioscience)
  • C-1 Collagen 1 coating (manufactured by BD Biosciences)
  • C 4 Collagen 4 coating (manufactured by BD Biosciences)
  • Fibronectin Fibronectin coating (manufactured by BD Biosciences).
  • Example 8 Isolation and analysis of a gene encoding a protein having a desired function
  • a target gene having a desired functional property can be isolated.
  • the cells are introduced into the cells on the device according to the method described in Example 5, and the By determining a cell having a desired function from the above, it is possible to isolate a gene encoding a protein having a desired function.
  • the method for isolating the gene exemplified in the present example includes not only the gene transfer vector prepared in Example 3 of the present specification but also any "viral envelope vector” and " “Ribosomal vectors” can be used.
  • a human heart cDNA library (GIBCO BRL; a plasmid in which human heart-derived cDNA was linked to a plasmid pSPORT having a CMV promoter) was introduced into E. coli DH12S, and a plasmid was prepared from the E. coli. I do. Plasmid 200 mu g, enclosed in HV JE gene transfer vectors 10000HAU (gene transfer vector prepared in Example 3 of the present invention, 3 X 1 0 9 particle) . As host cells, approximately 5000 human aortic endothelial cells HAEC (Sanko Junyaku) are added to each well of a 96-well microtiter plate together with a medium, and the cells are cultured overnight. To each cell containing the host cells, add 1/100 of the above HVJ-E, leave at 37 ° C for 30 minutes, and replace the medium.
  • the medium used is a low nutrient condition with a serum concentration of 1%, and culture is performed under this condition for one week. Under these conditions, HEAC growth is not confirmed.
  • the color depth of the well is an indicator of cell proliferation.
  • the darkest jewel is the jewel where the most actively growing cells are located. Therefore, the entire microtiter plate is read by a plate reader, and the cell growth is graphed by a computer. From this graph, nucleic acids are prepared from the cells in the two wells that have the highest proliferation activity, using the DNeasy Tissue Kit from Qiagen. Since the prepared nucleic acid contains plasmid DNA, this is introduced into E. coli (DH5 o; Takara Shuzo) using a heat shock method.
  • This E. coli is inoculated on a plate medium containing ampicillin to form a colony. About 20-200 colonies can be obtained from DNA prepared from one well. For each colony, plasmid DNA (pDNA) is extracted, and the presence of a gene fragment in the plasmid is confirmed by restriction enzyme treatment. Usually, the plasmid has about 60-70% of the plasmid force insert of the prepared plasmid.
  • pDNA plasmid DNA
  • the plasmid DNA was purified using Qiagen's Endo Free Plasmid Maxi Kit, the purified plasmid was encapsulated in HVJ-E, and introduced again into HAEC cells. Do.
  • a plasmid showing significantly higher cell growth is a plasmid expected to contain a nucleic acid encoding vascular endothelial growth factor.
  • Example 3 of the present specification Using the viral vector prepared in Example 3 of the present specification, a gene having a desired function is isolated.
  • the gene isolation method exemplified in this example not only the virus vector prepared in Example 3 of this specification but also any ⁇ virus envelope vector '' and ⁇ ribosome vector '' can be used. It is.
  • nucleic acid encoding a specific gene is selected.
  • the nucleic acid is then To produce a plasmid operably linked to a sequence that functions as a promoter.
  • the plasmid is introduced into a first host cell according to Example 3.
  • the first host cell into which the nucleic acid has been introduced is mutagenized, and about 5,000 cells are added to each well of a 96-well macrotiter plate together with a medium, and cultured overnight. After culturing, the mutant host cells in each cell are screened for the desired function. The cells exhibiting the desired function are removed, and nucleic acids are prepared from the cells in the wells exhibiting the most preferable properties using Qiagen's DNeasy Tissue Kit.
  • the prepared nucleic acid contains plasmid DNA, which is introduced into E. coli (DH5 o; Takara Shuzo) using a heat shock method.
  • This E. coli is seeded on a plate medium containing ampicillin to form a colony. Usually about 20-200 colonies can be obtained from DNA prepared from a single well. For each colony, plasmid DNA is extracted, and the presence of a gene fragment in the plasmid is confirmed by restriction enzyme treatment.
  • plasmid DNA was purified using Qiagen's Endo Free Plasmid Maxi Kit, the purified plasmid was encapsulated in HVJ-E, and introduced again into HAEC cells. test. In this cell growth experiment, it was revealed that the plasmid exhibiting preferable functional properties was a plasmid containing a mutant nucleic acid having the desired functional properties.
  • protamine sulfate PS was used for the conventional encapsulation in the HVJ, but in this embodiment, polyethyleneimine (PEI) was used instead of PS.
  • PEI polyethyleneimine
  • PEI known as a cationic polymer includes a linear type and a branched type.
  • PEI-L linear type
  • PEI-B branched type
  • the structure of linear PEI is shown as — [NH—CH—CH] — (X
  • PEI-L having a molecular weight of 2.5 kDa (PEI-L2.5K) and PEI-L having a molecular weight of 25 kDa (PEI-L 25K) were used.
  • Branched PEI is [NH— CH— CH
  • PEI-B having a molecular weight of 25 kDa PEI-B 25K
  • PEI-B having a molecular weight of 750 kDa PEI-B 750K
  • Example 6 For BAEC cells, the method of Example 6 above was modified as follows, and PEI was used instead of PS. Specifically, it is as follows.
  • HVJ-E was centrifuged at 15000g for 15 minutes at 4 ° C in order to add 4.5 HAU per 1-well of a 96-well plate. After removing the supernatant, suspend the cells in an appropriate amount of HBSS (Hank's Balanced Salt Solution). Dispensed to each well of the well plate. Each 96-well was mixed with a DNA solution (0.25 mg / mL pEGFP-C1 in 5 lZ-well) and mixed. Thereafter, each of 96 wells was mixed with 0.01% dodecyl maltoside in 31 / well and mixed, and the plate was incubated for 15 minutes.
  • HBSS Hort's Balanced Salt Solution
  • PEI was added at 12 ⁇ l (different in concentration and type depending on the cell and biopolymer used), and after mixing, 25 ⁇ l of HBSS was added and mixed. The plate was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes at 4 ° C and further incubated overnight at 4 ° C.
  • 6.7 ⁇ 10 4 cells Zml of BACE cell solution was prepared, and IX was placed on a plate supplemented with the vector containing the nucleic acid prepared above using a 96 auto dispenser machine.
  • 10 4 cells (150 1) were added to the mixture and centrifuged twice at 32 ° C. for 30 minutes at 100 rpm. The cells were cultured in a medium supplemented with 10% FBS at 34 ° C for 50 hours. Luciferase activity was detected using a luciferase assay kit (Promega) and fluorescence intensity was detected with an image reader ARVOmx (Wallac). The results are shown in Figs.
  • FIG. 8 shows the results.
  • PEI-L 25K proved to be most suitable for BAEC cells.
  • the optimal PEI type varies depending on the cell.
  • PEI-L linear type
  • PEI-B branched type
  • the width of the concentration range that shows high introduction efficiency is narrow. . Similar trends are seen in other cells.
  • cytotoxicity using the four types of PEI was compared. Specifically, the effects of various PEIs on cell proliferation when BAEC cells were cultured for 76 hours were measured. As a result, as shown in FIG. 9, when HVJ-E was used, PEI-B was more toxic to cells than PEI-L. The cytotoxicity increased as the molecular weight of PEI increased. Both PEI-L and PEI-B showed the highest transduction efficiencies near the limit concentration at which cytotoxicity appeared. This shows the same tendency in other cells.
  • Viral vectors that can introduce various substances into cells are very effective in elucidating the etiology and in drug discovery. Therefore, in particular, it is necessary to stably and efficiently introduce the virus vector containing the introduced substance into cells after storing it for a long period of time. Long-term storage requires technologies that maintain efficiency. Thus, according to the present invention, activity retention by long-term storage is achieved as follows.
  • HVJ-E virus vector containing a gene (reporter gene) and the like was freeze-dried in each well of a 96-well plate, and stored under each condition. Thereafter, the cells were dispensed into each well of the stored plate to introduce genes and the like into the cells. Using the reporter gene expressed in the cell as an indicator, the stability test of lyophilized HVJ-E was measured by a reporter assay (Luciferase Atsay).
  • An exemplary protocol is as follows.
  • ADS384 Equipment name: Multistage Dispense Station ADS-3 84-8, Manufacturer: Biotech (Tokyo)
  • Surfacts DNA or siRNA otherwise RNA, antibodies, peptides, functional proteins, sugar chains, lipids, semiconductors or their complexes
  • Vector suspension with the agent dodecyl maltoside other than Triton X-100 etc.
  • a plate type of plate coating: fibronectin, collagen I, collagen IV, tissue culture treatment, gelatin, poly D-lysine, laminin, Mix with poly-L-ortin.
  • Stabilizing agents trehalose, maltose, raffinose, fructose, sucrose, glucose, ratatose, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, methinolecellulose, glycine, mannitol, dimethyl sulfoxide (DMSO) or a mixture thereof
  • Stabilizers preferably include trehalose, maltose, raffinose, fructose or a mixture thereof), and the mixture is centrifuged at 3000 rpm. I do.
  • a lyophilized plate containing 14.4 HAU of HVJ-E per well and 0.25 g of plasmid was prepared by the following procedure.
  • HVJ-E was centrifuged at 15000 g for 15 minutes at 4 ° C, and the supernatant was removed. The suspension was suspended in distilled water to obtain an HVJ-E suspension. The subsequent operation was performed by automation using an ADS384 device.
  • the HVJ-E suspension (14.4 HAU) was added to each well of a 96-well microtiter plate (5 ⁇ l / well). Then, 0.25 ⁇ g (DNA (at a concentration of 0.05 mg / ml, 5 ⁇ l ) was added and mixed. Dodecyl maltoside (0.01%, 3Z, 10 times; in this example, 31) was added and mixed. Next, protamine sulfate (121 at a concentration of 0.125 mg Zml; 1.5 gZ well in this example) was added and mixed. Next, various stabilizers were added at the indicated concentrations and mixed. In this example, 51 was actually added.
  • Trehalose and maltose were used as stabilizers. As a result, as shown in FIG. 12, it was proved that even when stored for 6 months, the induction activity was sufficiently maintained when the stabilizer was added. By using 0.5% stabilizer at -20 ° C for 6 months, the activity could be maintained more than 70 times.
  • Fig. 13 shows the results.
  • each stabilizer a concentration of 0.001% to 3% is preferable, and particularly, the following concentrations are preferable.
  • Lyophilization was performed on the plate in which the same specimen was dispensed in all 96 wells, and the cells were introduced into cells. Graphs were prepared for all the specimens in each plate, and the results are shown in FIG. As shown in FIG. 14, even when stored at 20 ° C. for one month or at 80 ° C. for one month, the luciferase activity was almost equal to that of a 96-well sample. Was. As shown in the results, it was demonstrated that the difference between freeze-drying between gels was almost negligible and could be used for drug discovery and clinical development without any problems.
  • siRNA Using siRNA, we examined the retention of gene transfer activity on freeze-dried and preserved plates.
  • the virus vector (14.4 HAU) containing the siRNA (lOpmol) is freeze-dried on a fibronectin plate (Human Fibronectin Cellware 96-well Plate (Betaton Dickinson)), stored for one month, and then stored in a reporter assay. Was done.
  • As the cells 2.5 ⁇ 10 4 BHK cells were used.
  • siRNA siRNA against pGL2
  • pGL2 plasmid encoding firefly luciferase gene, Promega
  • a reporter assay a Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) was used.
  • FIG. 15 shows 16 is a graph showing, on the Y-axis, gene suppression activity immediately after plate preparation and after storage for one month at ⁇ 20 ° C. under the same conditions as in the experiment of FIG.
  • the suppression effect of the siRNA on the target gene itself did not show any deterioration due to freeze-drying.
  • the virus vector (14.4 HAU) containing the luciferase gene was freeze-dried on various plates, and a reporter assay was performed.
  • Three types of plates are used: collagen-treated 96 ⁇ L plate (Betaton Dickinson), fibronectin-treated 96 ⁇ L plate (Bettaton Dickinson), tissue culture treatment 96 ⁇ L plate (Bettaton Dickinson) Was.
  • As the cells 2.5 ⁇ 10 4 BHK cells were used.
  • luciferase activity was obtained in each plate. The activity after storage was higher in the order of collagen-treated 96-well plate, fibronectin-treated 96-well plate, and tissue culture-treated 96-well plate.
  • gene transfer agents that can transfer genes into cells have involved several steps to transfer genes into cells. Furthermore, gene-mixed gene transfer agents have been effective for long-term storage. Therefore, it is desired to develop a gene transfer array device that can be stably, efficiently, and easily introduced into cells after storage for a long period of time. According to the present invention, gene transfer is carried out by dropping a desired gene onto a plate on which a virus vector has been immobilized and seeding the cells to perform cell transfer. To be able to do.
  • the plate of this example is preferably prepared by the following procedure (A). This plate is preferably used as in the following procedure (B). The evaluation is performed, for example, as in a procedure (C).
  • the plate of this example is prepared as follows.
  • ADS384 automatic encapsulation device
  • a stabilizing agent trehalose, manoletose, raffinose, funolectose, sucrose, gnoleose, ratatose, polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, methinolecellulose, glycine, mannitol, dimethyl sulfoxide (DMSO) or a mixture thereof
  • Stabilizers include, but are not limited to, substances selected from the group consisting of mixtures, preferably trehalose, maltose, raffinose, fructose or mixtures thereof.
  • the plate of the present invention prepared as described above is used as follows.
  • DNA or siRNA on the stored plate with an automatic encapsulation device (ADS384) (just before gene transfer into cells) Is dropped into each well, the gene is encapsulated in a virus vector, and then the cells are seeded to introduce the gene into the cells.
  • ADS384 automatic encapsulation device
  • the plates of the present invention are evaluated as follows.
  • Lyophilized plates containing 14.4 HAU of HVJ-E per well were prepared by the following procedure. [0171] Using an automatic encapsulation device (ADS384), add 14.4 HAU of HVJ-E to a 96-well microtiter plate, centrifuge at 15000 g for 15 minutes at 4 ° C, and discard the supernatant. Removed. The suspension was suspended in distilled water to obtain an HVJ-E suspension. Next, the HVJ-E suspension was mixed with protamine sulfate (0.125 mg / ml at 121) on a fibronectin-coated plate. Next, a stabilizer (trehalose, concentration: 0.5%) was mixed. The plate was centrifuged at 4 ° C. for 30 minutes at 3,000 rotations to fix the plate. The plate was freeze-dried using a vacuum freeze-dryer FTS.
  • ADS384 automatic encapsulation device
  • Plasmid pGL3-CMV (0.05 mg / mL) (5 ⁇ l (0.25), 101 (0.5)) was added dropwise to a freeze-dried plate (including HVJ-E).
  • As a control 5 ⁇ l (0.25) and 10 ⁇ l (0.5) of the plasmid pGL3-CMV (0.05 mg / mL) were added dropwise to a well on a plate containing no HVJ-II.
  • the results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows the amount of plasmid (g), and the vertical axis shows luciferase activity (RLU).
  • the present invention provides a gene transfer technique capable of achieving high speed and high efficiency and capable of handling a large variety of genes.
  • the present invention also provides a technique for introducing not only genes but also desired substances (eg, peptides, compounds, nucleotide fragments, etc.) into cells.
  • the present invention provides a method for introducing a variety of desired substances using a virus envelope or a protein derived from a virus, which can achieve high speed and high efficiency, and is used for such a substance introducing method.
  • the present invention provides solid phases, compositions, and kits for

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　本発明は、高速化、高効率化が可能であり、かつ多数種類の遺伝子に対応可能な遺伝子導入技術を開発することを課題とする。また、本発明は、遺伝子のみならず、所望の物質（例えば、ペプチド、化合物、ヌクレオチドフラグメントなど）の細胞への導入技術を開発することを課題とする。 　また本発明は、ウイルスエンベロープまたはウイルス由来タンパク質を利用した、高速化、高効率化が可能であり、かつ多数種類の所望の物質の導入方法、そのような物質導入方法に使用するための固相、組成物、およびキットを開発することを課題とする。 　上記課題は、細胞に所望の物質を導入するためのデバイスを作製する方法であって、固相に、ウイルスベクターと、導入される物質との混合物を添加する工程；および該固相に、糖部分を有する界面活性剤を含む溶液を添加する工程； を包含する方法によって解決される。

Description

明 細 書
ウィルスベクターによる固相遺伝子導入方法、その方法のための組成物 、およびその方法のための装置
技術分野
[0001] 本発明は、固相上において、高効率で所望の物質を細胞に導入するための、固相
、方法、組成物、およびキットに関する。
背景技術
[0002] ゲノムプロジェクトの成果により明ら力となるヒト遺伝子の情報を、迅速に疾患治療 や創薬に結びつけるためには、種々の疾患に対する原因遺伝子や治療用遺伝子の 同定を高速かつ高効率に行う必要がある。遺伝子や遺伝子によって産生されるタン パク質が、実際の細胞や生体の臓器でどのような機能を持つ力を高効率に同定する ことは、病因の解明や創薬を行う上で必須となっている。
[0003] 多数の遺伝子の機能解析のために、遺伝子アレイや遺伝子チップなどを利用して 遺伝子情報の集積化が行われ、疾患時に遺伝子の発現パターンがどのように変化 するのかを解析するために使用されている。しかし、それらのデバイスでは疾患時に おける遺伝子発現パターンの変化 (例えば、メッセンジャー量の決定）は出来るが、 それらの遺伝子が実際の細胞でどのような機能を持つのかを同定することは出来な い。
[0004] 細胞レベルでの遺伝子解析技術は、実際の細胞レベルでの機能を解析することは 可能である力 従来のマニュアル法を利用した細胞レベルでの遺伝子解析技術では 、高速化、高効率ィ匕を行うことは困難である。細胞レベルでの遺伝子解析技術は、 (1 )遺伝子導入技術、および (2)遺伝子導入した細胞の解析技術、に大きく分けられる 。これらの中でも、特に、従来の遺伝子導入技術は、効率化、および高速ィ匕に問題 があり、また、多数種類の遺伝子に対応することが困難である。
[0005] 従って、高速化、高効率ィ匕が可能であり、かつ多数種類の遺伝子に対応可能な遺 伝子導入技術の開発が望まれている。
[0006] 細胞内における、ペプチド、低分子化合物の機能を効率的かつ迅速に検出する技 術は、創薬において重要なツールとなり得る。しかし、従来技術では、多種類の物質 の細胞内での機能を高効率かつ迅速に検出技術が存在しな力つた。従って、遺伝 子のみならず、ペプチド、化合物などを細胞に導入して、その機能を検出するための 、迅速かつ高効率な技術の開発が望まれている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、高速化、高効率ィヒが可能であり、かつ多数種類の遺伝子に対応可能な 遺伝子導入技術を開発することを課題とする。また、本発明は、遺伝子のみならず、 所望の物質 (例えば、ペプチド、化合物、ヌクレオチドフラグメントなど）の細胞への導 入技術を開発することを課題とする。
[0008] また本発明は、ウィルスエンベロープまたはウィルス由来タンパク質を利用した、高 速化、高効率ィヒが可能であり、かつ多数種類の所望の物質の導入方法、そのような 物質導入方法に使用するための固相、組成物、およびキットを開発することを課題と する。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明は、ウィルスエンベロープまたはウィルス由来タンパク質を利用した固相で の遺伝子導入方法を鋭意研究した結果、高効率、かつ高速に遺伝子導入する方法 を見出したことにより達成された。
[0010] したがって、本発明は、以下を提供する。
1.細胞に所望の物質を導入するためのデバイスであって、以下：
(1)固相;
(2)ウィルスベクター；
(3)糖部分を有する界面活性剤、
を備え、ここで、該ウィルスベクター、および該糖部分を有する界面活性剤が、該固 相上に配置される、デバイス。
2.さらに、（4)導入される物質を備え、ここで、該導入される物質が前記固相上に配 置される、項目 1に記載のデバイス。
3.前記導入される物質が、導入される遺伝子をコードする核酸、ペプチド、糖鎖、低 分子化合物、プロテオダリカン、グリコペプチド、脂質、および金属イオン力 なる群 力も選択される少なくとも 1つの物質である、項目 2に記載のデバイス。
4.前記導入される物質が、導入される遺伝子の siRNA、アンチセンスおよびデコイ 力 なる群より選択される核酸を含む、項目 1に記載のデバイス。
5.前記導入される物質が、導入される遺伝子をコードする核酸である、項目 1に記載 のデバイス。
6.前記ウイノレスベタターが、（i)ウィルスエンベロープ、（ii)ウィルスエンベロープタン パク質の少なくとも 1つを含むリボソーム、または（iii)ウィルスエンベロープと、ウィル スエンベロープタンパク質の少なくとも 1つを含むリボソームとの混合物である、項目 1 に記載のデバイス。
7.前記ウィルスエンベロープ力 野生型ウィルスまたは組換え型ウィルス由来のウイ ルスエンベロープである、項目 6に記載のデバイス。
8.前記ウィルスエンベロープが、レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウィルス科 、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科、 ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科、バキュロウィルス科、およ びへパドナウィルス科力もなる群力も選択される科に属するウィルス由来である、項 目 6に記載のデバイス。
9.前記ウィルスがパラミクソウィルス科に属するウィルス由来である、項目 7に記載の デバイス。
10.前記ウィルスが HVJである、項目 8に記載のデバイス。
11.前記ウィルスエンベロープタンパク質が、 Fタンパク質、 HNタンパク質、 NPタン パク質、およびその組み合わせ力もなる群力も選択されるタンパク質である、項目 10 に記載のデバイス。
12.前記糖部分を有する界面活性剤が、式
A— (CH ) n-CH
2 3
を有し、ここで、 Aが単糖、二糖、三糖、四糖または五糖であり、 n= 7— 11である、項 目 1に記載のデノ イス。
13. Aが単糖、または二糖である、項目 12に記載のデバイス。 14. Aが二糖である、項目 13に記載のデバイス。
15. Aがダルコシド基、またはマルトシド基である、項目 13に記載のデバイス。
16. Aがマルトシド基である、項目 15に記載のデバイス。
17. n= 9— 11である、項目 12に記載のデバイス。
18. n= 9である、項目 17に記載のデバイス。
19.前記糖部分を有する界面活性剤力 ォクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデ シルマルトシド、オタチルダリコシド、デシルダルコシド、およびドデシルダルコシド、な らびにこれらの混合物力もなる群力も選択される界面活性剤である、項目 1に記載の デバイス。
20.前記糖部分を有する界面活性剤力 デシルマルトシドである、項目 19に記載の デバイス。
21.前記糖部分を有する界面活性剤の濃度が、 0. 0001容量％以上、 CMC未満 である、項目 1に記載のデバイス。
22.前記界面活性剤の濃度が、 0. 0009容量％—0. 28容量％である、項目 21に 記載のデバイス。
23.さらに、（5)硫酸プロタミン溶液を含有し、ここで、該硫酸プロタミン溶液が前記 固相上に配置される、項目 1に記載のデバイス。
24.さらに、（5)ポリエチレンイミンを含有し、ここで、該ポリエチレンィミンが前記固相 上に配置される、項目 1に記載のデバイス。
25.前記ポリエチレンィミンが直鎖型ポリエチレンィミンである、項目 24に記載のデ バイス。
26.さらに、（6)安定化剤を備え、ここで、該安定化剤が前記固相上に配置される、 項目 1に記載のデバイス。
27.項目 26に記載のデバイスであって、ここで、前記安定化剤が、トレハロース、マ ノレトース、ラフイノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラタトース、ポリビニノレビ 口リドン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マンニトール、ジメチル スルホォキシド (DMSO)またはこれらの混合物カゝらなる群カゝら選択される、デバイス 28.項目 27に記載のデバイスであって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース 、ラフイノース、フルクトースまたはこれらの混合物からなる群力も選択される、デバイ ス。
29.項目 28に記載のデバイスであって、前記安定化剤が、トレハロースである、デバ イス。
30.前記固相が、フイブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、ポリオル-チン およびポリリジン、ならびにこれらの混合物力もなる群力も選択されるタンパク質によ つてコートされている、項目 1に記載のデバイス。
31.前記固相が、フイブロネクチンによってコートされている、項目 30に記載のデバ イス。
32.前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目 1に記載のデバイス。
33.凍結乾燥されている、項目 1に記載のデバイス。
34.凍結乾燥されている、項目 24に記載のデバイス。
35.凍結乾燥されている、項目 26に記載のデバイス。
36.細胞に遺伝子を導入するための装置であって、以下：
(1)少なくとも 1500個のゥエルを有する物質導入デバイスを支持する手段；
(2)物質導入デバイスをインキュベートする手段；
(3)物質導入デバイスの所望のゥエルに所望の溶液を添加する手段；および
(4)遠心分離機；
を備える、装置。
37.さらに、
(5)所望のゥエルにおける、蛍光、吸光、発光、放射線および濁度力もなる群力も選 択される信号を測定する手段；
を備える項目 36に記載の装置。
38.細胞に遺伝子を導入するためのキットであって、以下：
(1)固相;
(2)ウィルスベクター；および
(3)糖部分を有する界面活性剤を含む溶液、 を備える、キット。
39.さらに、（4)硫酸プロタミンを含む、項目 38に記載のキット。
40.さらに、（4)ポリエチレンイミンを含む、項目 38に記載のキット。
41.前記ポリエチレンィミンが直鎖型ポリエチレンィミンである、項目 38に記載のキッ
42.さらに、（5)安定化剤を含む、項目 38に記載のキット。
43.項目 42に記載のキットであって、ここで、前記安定化剤が、トレハロース、マルト ース、ラフイノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラタトース、ポリビニルピロリ ドン K90、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マンニトール、ジメチ ルスルホォキシド（DMSO)またはこれらの混合物力もなる群力も選択される、キット。
44.項目 43に記載のキットであって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース、ラ フィノース、フルクトースまたはこれらの混合物力もなる群力 選択される、キット。
45.項目 44に記載のキットであって、前記安定化剤が、トレハロースである、キット。
46.さらに、（6)凍結乾燥する工程を包含する、項目 38または項目 42に記載のキッ
[0011] 従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な 説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白〖こなることが理解される。
発明の効果
[0012] 本発明によって、高速化、高効率ィ匕が可能であり、かつ多数種類の所望の物質の 導入技術が提供される。本発明によって細胞内に導入される物質としては、ヌクレオ チドフラグメント、 DNA、 RNAのような核酸のみならず、タンパク質、糖鎖、低分子化 合物、プロテオダリカン、グリコペプチド、脂質、金属イオンなどが挙げられる。さらに、 この技術によって、例えば、 3万一 4万種類と推定されているヒト遺伝子や様々な生体 高分子が実際の細胞中で、どのような機能を持つのかを、高速かつ高効率に解析で きる高集積型デバイスが提供される。例えば、スライド上に高集積でマイクロウェルを 加工したデバイス上に遺伝子やタンパク質などの生体高分子を封入した HVJベクタ 一を高集積で固定ィ匕し、マイクロウェル中で細胞への導入後に多検体検出装置で解 析することで、大量のヒト遺伝子の機能を生細胞中で同時評価することを可能にする 図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、自動化のための界面活性剤の選択を示すグラフであり、本発明の方法 に従って、種々の界面活性剤を種々の濃度で使用して遺伝子導入を行った結果を 示す。
[図 2]図 2は、自動化のための界面活性剤の選択を示すグラフであり、本発明の方法 に従って、種々の界面活性剤を種々の濃度で使用して遺伝子導入を行った結果を 示す。
[図 3]図 3は、本発明の方法に従って、 pGL3発現プラスミドを導入した場合の、高い 再現性を示す図である。 X軸は、横のゥ ル番号を示し（1一 12)、 Y軸は、横のゥェ ル番号 (A— H)を示す。
[図 4A]図 4Aは、本発明の方法に従って、 pGL3発現プラスミドを導入した場合の、高 い再現性を示す図である。 X軸は、横のゥ ル番号を示し（1一 12)、 Y軸は、横のゥ エル番号 (A— H)を示す。
[図 4B]図 4Bは、本発明の方法に従って、 pGL3発現プラスミドを導入した場合の、高 い再現性を示す図である。 X軸は、横のゥ ル番号を示し（1一 12)、 Y軸は、横のゥ エル番号 (A— H)を示す。
[図 5]図 5は、種々の物質でコートされたプレートを用いた場合の、遺伝子導入効率 の差を示す図である。
[図 6]図 6は、硫酸プロタミンとポリェチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示 す結果である。「ェンノヽンサ一なし」は、硫酸プロタミンもポリェチルイミンも用いない 実験の結果を示す。
[図 7]図 7は、硫酸プロタミンとポリェチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示 す結果である。
[図 8A]図 8は、種々のポリェチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果 である。図 8Aは、 PEI-L 25Kを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。 X軸は、導 入時の PEI— L 25K濃度である。
[図 8B]図 8は、種々のポリェチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果 である。図 8Bは、 PEI— L 2. 5Kを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。 X軸は、 導入時の ΡΕΙ— L 2. 5Κ濃度である。
[図 8C]図 8は、種々のポリェチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果 である。図 8Cは、 ΡΕΙ— Β 25Κを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。 X軸は、導 入時の ΡΕΒ— L 25Κ濃度である。
[図 8D]図 8は、種々のポリェチルイミンを用いた場合の遺伝子導入効率を示す結果 である。図 8Dは、 ΡΕΙ-Β 750Κを用いた場合の遺伝子導入効率を示す。 X軸は、 導入時の ΡΕΒ— L 750Κ濃度である。
[図 9Α]図 9Αは、種々のポリェチルイミンの細胞毒性を示す結果である。
[図 9Β]図 9Βは、種々のポリェチルイミンの細胞毒性を示す結果である。
[図 10]図 10は、凍結乾燥による安定性を示す結果である。
[図 11]図 11は、凍結乾燥後に長期保存した場合に、遺伝子導入効率が保持される ことを示す結果である。
[図 12]図 12は、異なる安定化剤を用いて凍結乾燥後に長期保存した場合に、遺伝 子導入効率が保持されることを示す結果である。
[図 13]図 13は、異なる安定化剤を用いて凍結乾燥後に長期保存した場合に、遺伝 子導入効率が保持されることを示す結果である。
[図 14]図 14は、各ゥ ルでの保存安定性が均一であることを示す結果である。
[図 15]図 15は、 siRNAを導入する場合にも、 DNAの場合と同様に長期保存後に遺 伝子導入効率が保持されることを示す結果である。
[図 16]図 16は、 siRNAを導入する場合にも、 DNAの場合と同様に長期保存後に遺 伝子導入効率が保持されることを示す結果である。
[図 17]図 17は、凍結乾燥法が、プレートのコーティングに関係しないことを示す結果 である。
[図 18]図 18は、導入する核酸を含まないウィルスベクターをカ卩えて凍結乾燥したプレ ートを用いた、遺伝子導入実験の結果である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及 しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形 の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきで ある。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で 通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義 されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本 発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛 盾する場合、本明細書 (定義を含めて)が優先する。
[0015] (用語の定義）
本明細書にぉ 、て使用される「細胞」は、当該分野にぉ 、て用いられる最も広義の 意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜 構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する 生命体をいう。
[0016] 本明細書において使用される「安定化剤」は、遺伝子導入ベクターを含む本発明 の細胞培養用容器を凍結乾燥によって保存した際に、その保存安定性を向上させる 薬剤をいう。本発明の安定化剤としては、トレハロース、マルトース、ラフイノース、フ ルクトース、スクロース、グルコース、ラタトース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリ コール、メチルセルロース、グリシン、マン-トール、ジメチルスルホォキシド（DMSO )またはこれらの混合物力もなる群力も選択される物質が挙げられるが、これらに限定 されない。安定化剤としては、好ましくはトレハロース、マルトース、ラフイノース、フル クトースまたはこれらの混合物が挙げられる。より好ましくは、本発明の安定化剤は、ト レハロースである。
[0017] 本発明の細胞培養容器 (アレイまたはプレートともいう）を凍結乾燥させる条件は、 当業者に周知である。
[0018] 本明細書において使用する場合、ポリエチレンィミン (PEIと略す）は、直鎖型およ び分岐型の両方を含む。直鎖型の PEIの構造は、— [NH— CH2— CH2]x—として示 される。ここで、 Xは任意の整数である。直鎖型の PEIとしては、例えば、好ましい直鎖 型の PEIとしては、分子量 2. 5kDaの PEI— L (PEI— L 2. 5K)および 25kDaの PEI -L (PEI-L 25K)が挙げられる。分岐型 PEIは、— [NH-CH2—CH2]y-[N (CH 2— CH2— NH2)— CH2— CH2]z—として示され。ここで、 yは任意の整数である。ここ で zは、 yとは独立する任意の整数である。例えば、好ましい分岐型 PEIは、分子量 2 5kDa (PEI-B 25K)の PEI— Bと 750kDaの PEI— B (PEI— B 750K)である。
[0019] 本明細書で使用される場合、「ウィルスエンベロープベクター」とは、ウィルスェンべ ロープ中に外来遺伝子を封入したベクター、またはウィルスエンベロープ由来のタン パク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したベクターを ヽぅ。ウィルスベクターの調 製のために使用されるウィルスとしては、野生型ウィルスであっても、組換え型ウィル スであってもよい。
[0020] 本発明にお 、て、ウィルスエンベロープまたはウィルスエンベロープ由来タンパク 質の調製のために使用されるウィルスとしては、レトロウイルス科、トガウィルス科、コ ロナウィルス科、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブ- ャゥイノレス科、ラブドウイノレス科、ボックスウイノレス科、へノレぺスゥイノレス科、ノ キュロウ ィルス科、およびへパドナウィルス科カゝらなる群カゝら選択される科に属するウィルスが 挙げられる力 これらに限定されない。好ましくは、ノ ミクソウィルス科に属するウイ ルスが、より好ましくは、 HVJ (センダイウィルス）力 用いられる。
[0021] ウィルスエンベロープ由来タンパク質としては、例えば、 HVJの Fタンパク質、 HNタ ンパク質、 NPタンパク質および Mタンパク質が挙げられる力 これらに限定されない
[0022] 本明細書において、「HVJ」および「センダイウィルス」は、互換可能に用いられ得る 。例えば、本明細書において「HVJのエンベロープ」と「センダイウィルスのェンベロ ープ」とは同一の意味を示す語句として用いられる。
[0023] 本明細書にぉ 、て「センダイウィルス」とは、パラミクソウィルス科パラミクソウィルス 属に属し、細胞融合作用をもつウィルスをいう。ウィルス粒子は、エンベロープをもち 、直径 150— 300nmの多形性を示す.ゲノムは、約 15500塩基長のマイナス鎖 RNAで ある。 RNAポリメラーゼを持ち、熱に不安定で、ほとんどあらゆる種類の赤血球を凝集 し、また溶血性を示す。
[0024] 本明細書において、「HAU」とは、 -ヮトリ赤血球 0. 5%を凝集可能なウィルスの活 性をいい、 1 HAUは、ほぼ 2400万ウィルス粒子に相当する（Okada, Y.ら、 Bike n Journal 4、 209— 213、 1961)。
[0025] 宿主細胞として使用される動物細胞としては、マウス'ミエローマ細胞、ラット 'ミエ口 一マ細胞、マウス'ハイプリドーマ細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO 細胞、 BHK細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒト白血病細胞、 HBT5637 (特開昭 63— 299)、ヒト大腸癌細胞株などを挙げることができる。マウス'ミエローマ細胞として は、 ps20、 NSOなど、ラット 'ミエローマ細胞としては YB2Z0など、ヒト胎児腎臓細胞 としては HEK293 (ATCC : CRL— 1573)など、ヒト白血病細胞としては BALL—1な ど、アフリカミドリザル腎臓細胞としては COS— 1、 COS— 7、ヒト大腸癌細胞株として は HCT-15などが例示される。
[0026] 本明細書において使用される用語「固相」「基板」および「支持体」は、本明細書に おいて、同じ意味で使用され、本発明のアレイが構築される材料 (好ましくは固体)を いう。基板の材料としては、共有結合力または非共有結合のいずれかで、本発明に おいて使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有す るように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
[0027] 基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の 材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プ ラスチック、金属 (合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレ ン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれら に限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば 、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、 窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロ ピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素 榭脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩ィ匕ビユリデン、ポリ酢酸ビュル、ポリビュルアルコール、 ポリビュルァセタール、アクリル榭脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ァセタール 榭脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール榭脂、ユリア榭脂、エポキシ榭脂、メラ ミン榭脂、スチレン'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重 合体、シリコーン榭脂、ポリフエ-レンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いる ことができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、 PVDF膜な ど、ブロッテイングに使用される膜を用いることもできる。ナイロン膜が好ましい。ナイ口 ン膜を用いた場合は、簡便な解析システムを用いて結果を分析することができるから である。しかし、高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料と して使用することが好ましい。
[0028] 本明細書にぉ 、て「チップ」または「マイクロチップ」とは、多様の機能をもち、システ ムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、「DNAチップ」とは、基 板と、 DNAとを含み、その基板には DNA (例えば、 cDNA断片）が少なくとも 1つ配 置されている。本明細書において、「プロテインチップ」とは、基板と、タンパク質とを 含み、その基板にはタンパク質 (例えば、ポリペプチドまたはオリゴペプチド）が少なく とも 1つ配置されている。「DNAチップ」および「プロテインチップ」は、本明細書では 、「マイクロチップ」または単に「チップ」に含まれる。「マイクロアレイ」とは、そのような チップ上に 1以上の生体分子 (例えば、 cDNA断片のようなオリゴヌクレオチド、また はペプチド）が整列されて配置されたものを!ヽぅ。
[0029] 本発明において使用される生体分子 (たとえば、 DNAのようなオリゴヌクレオチド、 またはペプチド）は、生体カゝら採取されたものを利用し得るほか、当業者に公知の方 法によって化学的に合成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、 Applied Biosys temsなどにより市販される DNA合成機もしくはペプチド合成機の何れかを用いて、 自動化学合成により調製され得る。 自動オリゴヌクレオチドの合成のための組成物お よび方法は、例えば、米国特許第 4, 415, 732号， Caruthers et al. (1983)；米 国特許第 4, 500, 707号および Caruthers (1985)；米国特許第 4, 668, 777号 , Caruthers et al. (1987)に開示される。
[0030] 基板には、任意の数の生体分子 (例えば、 DNAまたはペプチド）が配置され得るが 、通常、基板 1つあたり、 108個の生体分子まで、他の実施形態において 107個の生 体分子まで、 106個の生体分子まで、 105個の生体分子まで、 104個の生体分子まで 、 103個の生体分子まで、または 102個の生体分子までの個の生体分子が配置され 得る。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体 分子（例えば、 DNAまたはペプチド）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイ ズと同じ小さくあり得る（これは、 1 2nmの桁であり得る)。最小限の基板の面積は、 V、くつかの場合にぉ 、て基板上の生体分子の数によって決定される。
[0031] 本発明において使用する場合、「糖部分を有する界面活性剤」とは、その分子内に 、「糖部分」を有する界面活性剤を有する。界面活性剤としては、ァ-オン界面活性 剤、カチオン界面活性剤、および非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が挙げら れる。糖部分を有する界面活性剤の糖部分としては、単糖、二糖、三糖、四糖、五糖 、六糖、七糖、および八糖が挙げられるがこれらに限定されない。糖部分は、分岐し ても、しなくてもよい。糖部分は、好ましくは、単糖一五糖、より好ましくは、単糖、また は二糖である。糖部分としては、例えば、ダルコシド、ガラクトシド、マルトシド、チォマ ルトシド、チォダルコシドが挙げられるが、これらに限定されない。また、糖部分を有 する界面活性剤は、例えば、 A-(CH) -CHで表される化合物であり、ここで Aが糖 n 3
部分であり、 - (CH) -CHが糖部分以外の疎水性部分である。その疎水性部分は n 3
、ここで、 nは、 5以上、 6以上、 7以上、 8以上、 9以上、または 10以上、であり、かつ 1 5以下、 14以下、 13以下、 12以下、 11以下、 10以下、 9以下、 8以下、または 7以下 であり得る。好ましい nの範囲は、 7— 11である。例えば、この糖部分を有する界面活 性剤は、ォクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、オタチルダリコシ ド、デシルダルコシド、およびドデシルダルコシド、ならびにこれらの混合物からなる群 カゝら選択される。好ましい糖部分を有する界面活性剤は、デシルマルトシドである。
[0032] (好ま 、実施形態の説明）
(物質導入デバイスの調製）
本発明において、ウィルスベクターを固定ィ匕した物質導入デバイスの調製は、以下 の工程によって実施することができる：
(1)固相に、ウィルスベクターと、導入される物質との混合物を添加する工程;および
(2)固相に、糖部分を有する界面活性剤を含む溶液を添加する工程。
上記の方法において、導入される物質としては、核酸、タンパク質、ペプチド、ヌクレ ォチドフラグメント、ヌクレオチドフラグメント、 DNA、 RNA、ヌクレオチド、ヌクレオシド およびこれらの誘導体のような核酸のみならず、タンパク質、糖鎖、低分子化合物、 プロテオダリカン、グリコペプチド、脂質、金属イオンも挙げられる。導入される物質が
、遺伝子をコードする核酸である場合、導入される遺伝子は、任意の生体由来であり 得、そして、 DNA、 RNAまたはヌクレオチドアナログであり得る。導入される遺伝子 は、 1種類であっても、複数種類であってもよい。
[0033] 上記方法において、遺伝子が導入される細胞は、特に限定されることはないが、好 ましくは、動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。ウィルスェ ンべロープを用いる導入法、またはウィルスエンベロープの少なくとも 1つのタンパク 質を含むリボソームを用いる導入法を用いる場合、そのウィルスエンベロープを調製 するために使用されるウィルスは、レトロウイルス科、トガウィルス科、コロナウィルス科 、フラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科、 ラブドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科、バキュロウィルス科、およ びへパドナウィルス科力もなる群力 選択される科に属するウィルス由来であり得る。 好ましくは、ウィルスは、パラミクソウィルス科のウィルス、特に HVJである。
[0034] ウィルスエンベロープの少なくとも 1つのタンパク質を含むリボソームを用いて、細胞 に候補核酸を導入する方法もまた、利用可能である。この方法において使用されるタ ンパク質としては、 Fタンパク質、 HNタンパク質、 NPタンパク質、 Mタンパク質または その組み合わせが挙げられるが、これらに限定されな 、。
[0035] ウィルスベクターと、導入される物質との混合物は、例えば、ウィルスベクターを含 む溶液を遠心分離して沈殿を生じさせ、導入される物質溶液を用いて該沈殿を懸濁 することによって調製され得る。この遠心分離の条件は、例えば、 15000 X g、 4°C、 15分間が挙げられる力 これに限定されない。例えば、大量調製の場合は、 15000 X g、 4°C、 60分間の遠心分離条件も使用可能である。
[0036] あるいは、予め、別の容器において、ウィルスベクター溶液と、導入される物質溶液 との混合物を調製し、その混合物を固相に添加してもよい。また、固相にウィルスべク ターと、導入される物質との混合物を添加する代わりに、ウィルスベクター溶液と、導 入される物質溶液とを別々に固相に添加してもよい。
[0037] 必要に応じて、ウィルスベクター、導入される物質、および糖部分を有する界面活 性剤を含む固相である物質導入デバイスを、室温にて、放置する。インキュベート時 間は、好ましくは、 5分、 7分、 10分、 12分、 15分、 17分、 20分、 25分、 30分であり 得る。 [0038] 必要に応じて、遺伝子導入効率を上昇させるために、硫酸プロタミン (PS)またはポ リエチレンィミン (PEI)を添加する。使用される硫酸プロタミンの濃度は、好ましくは、 1 μ g/ml- lmg/mUより好ましくは、 10 μ g/ml-250 μ g/m 最も好ましくは 、 100 g/mlである。使用されるポリエチレンィミンの濃度は、好ましくは、 0. 1 g /ml— 300 μ g/ml、より好ましくは、 0. 5 g/ml— 200 μ g/ml、最も好ましくは 、 1 μ gZ ml一 100 μ gZ mlである。
[0039] さらに、必要に応じて、硫酸プロタミンおよび Zまたはポリエチレンイミンを添加した 後、物質導入デバイスを遠心分離機にかける。この遠心分離の条件は、例えば、 16 43 X g、 4°C、 30分間であるが、これに限定されない。
[0040] (本発明の物質導入デバイスを用いた細胞への遺伝子導入）
上記のようにして調製した物質導入デバイスを用いて、以下の方法によって、細胞 に外来遺伝子を導入することができる。
[0041] ウィルスベクターを固定ィ匕した物質導入デバイスに、細胞懸濁液を導入する。必要 に応じて、デバイスを遠心分離機にかける。その遠心分離機の条件は、代表的には 、 182 X g、 32°C、 30分間であるが、これに限定されない。その後、必要に応じて、デ バイスを振盪し、そして遠心分離機にかける。その遠心分離機の条件は、代表的に は、 182 X g、 32°C、 30分間であるが、これに限定されない。必要に応じて、さらに 1 82 X g、 32°C、 30分間の遠心分離をさらに 2回行うことも可能である。
[0042] (本発明の物質導入デバイスを用いた細胞への遺伝子導入法の適用）
上記の遺伝子導入方法を用いて、多数種類の遺伝子の機能解析、およびスクリー ニングなどを行うことが可能である。
[0043] (A.遺伝子機能の解析）
ゲノムプロジェクト等の進展に伴い、多数の遺伝子が単離 '同定されている。しかし
、未だ多くの遺伝子については、その機能が未知である。そのため、機能が未知であ る遺伝子の機能を同定する簡便な方法を開発することは、非常に有用である。例え ば、本発明の遺伝子導入技術を用いて、本発明の物質導入デバイスに多数種類の 遺伝子を導入した多数種類の細胞集団を作製し、その細胞集団の機能を解析する ことによって、所望の機能的性質を有する核酸が導入された細胞が選択され、その 結果、所望の機能を有する遺伝子が同定される。所望の機能としては、例えば、血管 新生を誘発する遺伝子をコードすること、癌抑制遺伝子をコードすること、骨形成増 強遺伝子をコードすること、アポトーシス誘発遺伝子をコードすること、サイト力イン分 泌遺伝子をコードすること、神経細胞榭状突起誘導遺伝子をコードすること、動脈硬 化抑制遺伝子をコードすること、糖尿病抑制遺伝子をコードすること、自己免疫疾患 抑制遺伝子をコードすること、アルツハイマー病抑制遺伝子をコードすること、パーキ ンソン病抑制遺伝子をコードすること、神経細胞保護遺伝子をコードすること、および これらの組み合わせ力 なる群力 選択される。
[0044] また、この選択は、好ましくは、候補核酸の発現によって変化する宿主細胞の形質 に基づいて行われる。例えば、候補核酸から、増殖因子をコードする遺伝子を単離 する場合、その所望の機能的性質は、特定の細胞または任意の細胞の増殖の促進 である。
[0045] 上記の解析方法は、目的とする機能的性質が認識可能である限り、任意の機能的 性質に対して適用可能である。上記解析方法において意図される機能的性質として は、細胞増殖の促進もしくは抑制、細胞の分化もしくは脱分化、マーカータンパク質 の発現もしくは発現の抑制、マーカー mRNAの発現もしくは発現の抑制、膜電位の 変化、脱分極、アポトーシス、癌化、増殖の停止、形態の変化、大きさの変化などが 挙げられるが、これらに限定されない。
[0046] 上記解析方法において、遺伝子導入した細胞から核酸を抽出する方法としては、 種々の周知の方法、および市販のキットを用いることができる。
[0047] (B.スクリーニング)
本発明の遺伝子導入法は、スクリーニングに応用することができる。例えば、（1)固 相；（2)ウィルスベクター；（3)導入される物質；および (4)糖部分を有する界面活性 剤を備える物質導入デバイスを調製する際に、（3)導入される物質として、遺伝子ラ イブラリーを用いることによって、スクリーニングへの応用が可能である。遺伝子ライブ ラリーを用いてデバイス上に、遺伝子ライブラリーを含む細胞集団を調製し、その細 胞の中から所望の機能を有する細胞を選択し、その細胞中の核酸を単離、同定する ことによって、所望の機能を有する遺伝子をスクリーニングすることができる。また、ス クリーニングで陽性であることが判明した細胞集団が、複数種類の遺伝子を含む場 合は、その物質を純ィ匕することによって、所望の機能を有する遺伝子を単離'同定す ることが可能である。
[0048] このスクリーニング方法は、プラスミド状の核酸のみならず、タンパク質、ペプチド、 低分子化合物、ヌクレオチドフラグメントなども、その対象とすることが可能である。
[0049] また、物質導入デバイスは、ウィルスベクターの固定ィ匕領域を小さくすることが可能 であるため、 96ゥエルプレートのみならず、 384ゥエルプレート、および 1536ゥエルプ レートでも、生体分子のスクリーニングを行うことが可能である。
[0050] さらに、本発明の物質導入デバイスは、自動化に適している。本発明の方法を実施 するためのキットもまた本発明にお 、て提供される。
(1. ウィルスエンベロープベクターの調製）
ウィルスエンベロープベクターとして種々の方法が公知である。例えば、本発明者 らは、ウィルスおよび非ウィルスベクターを組み合わせることにより、ハイブリッド遺伝 子移入ベクターを開発し、 日本血球凝集性ウィルス (HVJ；センダイウィルス）由来の 融合形成性エンベロープを持つ融合形成性ウィルスリボソームを構築した (Kaneda 、 Biogenic Amines, 14 : 553-572 (1998)； Kanedaら、 Mol. Med. Today, 5 : 298— 303 (1999) )。この送達システムでは、 DNA充填リボソームを、 UV不活性ィ匕 HVJと融合させ、融合形成性ウィルス リボソームである HVJリボソーム（直径 400— 500nm)を形成する。融合媒介送達の利点は、 DNAをトランスフエタトすることが、受 容体細胞におけるエンドソーム分解およびリソソーム分解力も保護されることである。 lOOkbまでの DNAが HVJリボソーム中に取り込まれ、そして哺乳動物細胞に送達さ れる。 RNA、オリゴヌクレオチドおよび薬物もまた、インビトロおよび生体内で細胞中 に効率的に導入される。 HVJ リボソームは、生体内で有意な細胞損傷を誘導するこ とは示されなかった。
[0051] 繰り返したトランスフエクシヨン力 HVJの低い免疫原性のため生体内で成功してい る（Hiranoら、 Gene Ther. , 5 :459— 464 (1998) )。このベクターシステムは改良 され、そしてより効率的な遺伝子送達のためにァ-オンタイプおよびカチオンタイプ HVJ—リボソームが開発された（Saekiら、 Hum. Gene Ther. , 8 : 1965—1972 (1 997) )。この HVJ—リボソームシステムを用いて多くの遺伝子治療戦略が成功した (D zauら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 : 11421-11425 (1996)； Kanedaら、 Mol. Med. Today, 5 : 298—303 (1999) )。また、 HVJ由来の合成ビロソーム（vir osome)を構築するために 、くつかの試みがなされて 、る (Wuら、 Neuroscience Lett. , 190 : 73-76 (1995)； Ramani¾, FEBS Lett. , 404 : 164-168 (1997 )； Ramaniら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 : 11886—11890 (1998) ) ベクターの調製のためにウィルスを不活ィ匕する必要がある場合、種々の公知の方 法を使用する事ができる。代表的な不活化法としては、 UVの照射、アルキル化剤で の処理、 j8—プロピオラタトンでの処理、界面活性剤での処理、酵素処理によるェン ベロープの部分的分解が挙げられる力 S、これらに限定されない。
[0052] 上記に列挙したウィルスエンベロープベクターを改良した調製方法もまた公知であ る。その代表的な例を以下に示す。以下に説明するウィルスエンベロープベクターの 調製方法は、例示であって、本発明は以下の調製方法によって調製されたベクター に限定されない。
(1. 1.ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入し たウィルスベクターの調製）
ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウィルスベクターとしては、 HVJ (セン ダイウィルス）の F融合タンパク質および HN融合タンパク質を再構成したリボソーム からなる、ウィルスベクターであって、 RT— PCRによって検出可能な量の HVJゲノム RNAを含まない、ウィルスベクターが挙げられる。
[0053] そのようなウィルスベクターの調製に用いられる F融合タンパク質および HN融合タ ンパク質は、天然の HVJ由来のタンパク質であっても、組換え発現したタンパク質で あってもよい。組換え産生される融合タンパク質は、インビトロでプロテアーゼによつ てプロセシングされる力、または哺乳動物細胞宿主内において、内在性プロテア一 ゼによってプロセシングされる。
[0054] ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウィルスベクターは、例えば、以下の 工程を包含する方法によって調製される：
•UV照射をして 、な 、HVJウィルスから、融合タンパク質を単離する工程、 •融合タンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して、再構成粒子を調 製する工程、
•所望の核酸を充填したリボソームを調製する工程、および
'再構成粒子および該リボソームを調製する工程。
[0055] 上記方法にぉ 、て使用される界面活性剤は、特定の界面活性剤に限定されな 、 力 好ましくは、オタチルダリコシド、 Triton— X100、 CHAPSまたは NP— 40、あるい はこれらの混合物である。
[0056] 上記方法において使用される脂質は、特定の脂質に限定されず、（1)分子中に長 鎖脂肪酸または類似の炭化水素鎖を持ち、かつ（2)生体内に存在するか、または生 体に由来する分子であればよい。好ましい脂質としては、ホスファチジルコリン、ホス ファチジルセリン、コレステロール、スフインゴミエリン、およびホスファチジン酸が挙げ られる力 これらに限定されない。
[0057] リボソームの調製法は周知であり、例えば、以下の方法を使用することも可能である
： (A)第 1の試験管内にリン脂質薄膜をあらかじめ作っておく。この試験管に、 55°Cの 水を飽和させた窒素ガスを導入し、十分に水和させる。水和が完了すると、薄膜は透 明になる；
(B)第 2の試験管の緩衝液を静かに試験管 Aに加え、窒素ガスを導入後、密封し (例 えば、パラフィルムによる）、 37°Cの恒温槽 (一定の温度で実験を行うための装置です )中で約 2時間放置する；
(C)静かに振り動かすことにより巨大リボソームを調製する。リボソームが生成すると 液が薄く濁る。これを用いて、次の測定を行う。
(D)試料を一滴スライドグラス上に採り、蛍光顕微鏡（1000倍）によりその形態を確認 する。
[0058] ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を封入したウイ ルスベクターを作製するために必要とされるタンパク質の調製方法は周知である。
[0059] 例えば、天然の HVJを供給源として HVJのエンベロープタンパク質を精製するか、 または組換え発現した HVJのエンベロープタンパク質を精製することができる。周知 のタンパク質の精製方法としては、例えば、硫安沈殿法、等電点電気泳動、および力 ラムによる精製法が挙げられるが、これらに限定されない。カラムによるタンパク質の 精製を行う場合、所望のタンパク質の性質および夾雑物の性質に応じて、種々の力 ラムを選択する。タンパク質精製のためのカラムとしては、陰イオン交換カラム、陽ィ オン交換カラム、ゲルろ過カラム、ァフィユティーカラムが挙げられるが、これらに限定 されない。
[0060] あるいは、ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウィルスベクターは、以下 の工程を包含する方法によって調製される：
•HVJの Fタンパク質および HNタンパク質を組換え発現する工程、
• Fタンパク質をプロテアーゼでプロセシングする工程、
•Fタンパク質および HNタンパク質を単離する工程、
•Fタンパク質および HNタンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して 、再構成粒子を調製する工程、
'核酸を充填したリボソームを調製する工程、および
'再構成粒子および該リボソームをする工程。
[0061] また、ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含むウィルスベクターは、以下のェ 程を包含する方法によっても調製される：
•Fタンパク質をプロセシングするプロテアーゼを発現する宿主細胞内において、 Fタ ンパク質および HNタンパク質を組換え発現する工程、
•Fタンパク質および HNタンパク質を単離する工程、
•Fタンパク質および HNタンパク質を界面活性剤および脂質の存在下で再構成して 、再構成粒子を調製する工程、
•所望の核酸を充填したリボソームを調製する工程、および
'再構成粒子および該リボソームを融合する工程。
(1. 2.ウィルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したウィルスベクターの調製） ウィルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したウィルスベクターの調製法として は、例えば、以下の工程を包含する方法が挙げられる：
1)ウィルスを外来遺伝子と混合する工程、および
2)この混合液を凍結融解するか、もしくはこの混合液を、さらに界面活性剤と混合す る工程。
[0062] あるいは、ウィルスエンベロープ由来のウィルスベクターは、以下の工程を包含する 方法によって調製される：
•ウィルスを不活性化する工程、
•不活性ィ匕ウィルスを外来遺伝子と混合する工程、および
•混合液を凍結融解する工程、
を包含する、方法が提供される。
[0063] 本発明のさらなる局面において、遺伝子導入のための不活性化ウィルスェンベロ ープベクターの調製方法であって、以下；
•ウィルスを不活性化する工程、および
•不活性化ウィルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、 を包含する、方法が提供される。
(1. 3.リボソームベクター）
リボソームベクターは、リポフエクシヨンに一般的に用いられる脂質力 調製したリポ ソームを用いることができる。例えば、 lipofect AMINE 2000のような脂質を用い ることがでさる。
(細胞の選択）
本発明において、種々の細胞が、物質を導入される細胞として使用され得る。その ような細胞は、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、候補核酸が由来する種 由来の細胞である。
[0064] 以上、好ましい実施形態を例示して本発明を説明してきた。以下に、図面を参照し ながら、実施例に基づいて本発明を説明する力 以下の実施例は、例示の目的のみ に提供されることに留意されるべきである。従って、本発明の範囲は、説明に用いた 特定の実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によ つてのみ限定される。
実施例
[0065] (実施例 1：ウィルスエンベロープ由来のタンパク質を含む成分中に外来遺伝子を 封入したウィルスベクターの調製および使用） (ウィルスの調製）
HVJ、 Z株を、先に記載のように（Kaneda、 Cell Biology: A
Laboratory Handbook, J. E. Cells (Ed. ) , Academic Press, Orlando, Fl orida, vol. 3, pp. 50— 57 (1994) )差示的遠心分離により精製した。精製 HVJを平 衡化塩溶液（BSS : 137mM NaCl、 5. 4mM KC1、 lOmM Tris— HC1、 pH7. 5 )中に再懸濁し、そしてウィルス力価を、 540nmにおける吸光度を測定することにより 決定した。 540nmにおける光学的密度は、 15, 000血球凝集単位 (HAU)に対応 し、融合活性と相関する。
[0066] (HVJからの Fおよび HN融合タンパク質の抽出）
エタノール中に溶解した、 Nonidet P— 40 (NP— 40)およびフエ-ルメチルスルホ -ルフルオライド (PMSF)を、それぞれ 0. 5%および 2mMの最終濃度で精製 HVJ 懸淘液の 20ml (l, 750, 000 HAU)に添カロした。この混合物を、回転しな力ら、 4 °Cで 30分間インキュベートした。次いで、この懸濁液を、 100, 000g、 4°Cで 75分間 遠心分離し、不溶性タンパク質およびウィルスゲノムを除去した (Uchidaら、 1979) 。上清液を、 5mMリン酸緩衝液 (pH6. 0)に対して 3日間透析し、緩衝液を毎日交 換することにより、残存 NP— 40および PMSFを洗い流した。透析した溶液を、 100, 000g、 75分間 4°Cで遠心分離し、不溶性物質を取り除いた。上清液を、先に記載し た方法 (Yoshimaら、 J. Biol. Chem. , 256 : 5355— 5361 (1981) )に基づき 0. 3 Μ スクロースおよび ImM KC1を含む 10mM リン酸緩衝液（pH5. 2)で平衡化し 7こ CM— sepharose CL6B (Pharmacia Fine し hemicals、 Uppsala ^ Sweden )のイオン交換カラムにアプライした。素通り画分および 0. 2M NaCl溶出液を集め た。両画分を、ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— P AG E)にかけ、タンパク質成分を分析した。ゲルをクマシ一ブリリアントブルーで染色し、 そして各タンパク質の比率を、コンピューター化デンシトメトリー（NIH Image ;Appl e Computers, Cupertino, CA、 USA)を用いて評価した。
[0067] (組換え発現）
HVJの融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターに 組み込み、適切な宿主細胞において発現することによつても、調製され得る。 Fタン パク質および HNタンパク質のアミノ酸配列は公知である。
[0068] 種々の宿主細胞に使用され得る発現ベクターとしては、市販の各種のベクターを使 用し得る。
[0069] 融合タンパク質をコードする発現ベクターは、細胞に導入され得、当該分野におい て公知でありそして記載される任意の種々の方法（例えば、 Sambrookら、 Molecul ar Cloning： A Laboratoy Manual^ 2nd Ed、 Vols 1 to 3、 Cold Spring Harbor Laboratory
Press、 New York (1989)、および Ausubelら、 Current Protocols in Mole cular Biology, John Wiley and Sons、： Baltimore、 MD (1994)、これらの各 々は、本明細書において参考として援用される））によって、本発明の融合タンパク質 を産生し得る。組換え発現ベクターを原核生物または真核生物細胞中に導入する方 法として、例えば、エレクト口ポーレーシヨン法などの、形質転換またはトランスフエク シヨン法が挙げられる。
[0070] 組換え Fタンパク質を大腸菌で発現した場合、不活性な F0形態として発現された。
大腸菌で発現された不活性な F0形態のタンパク質を活性な F1形態に変換するため には、 0. 0004—0. 001%トリプシンを用いる 37°C30分間のトリプシン処理が必要 とされた。
[0071] トリプシン処理された活性ィ匕 F1タンパク質に対応するポリペプチドは、短縮された 活性化 F1のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む発現ベクターを用いて、大腸菌 で発現され得る。短縮された F1タンパク質は、少なくとも、 117番目のフエ-ルァラ- ンから 142番目のァラニンまでの 26アミノ酸残基を含む必要がある。短縮型タンパク 質が封入体を形成する場合は、封入体をリフォールデイングすることにより、活性型タ ンパク質を得ることが当業者にとって容易に可能である (Robert F. Kelleyおよび Marjorie E. Winkler、 Genetic Engineerings (1990) vol. 12、 1一 19頁 参 照のこと)。
[0072] HVJが複製し得る細胞 (例えば、げっ歯類の気管上皮細胞;ニヮトリ胚;サル腎臓の 初代培養細胞;ヒト胎児肺、腎臓、羊膜の初代培養細胞)を宿主細胞として使用して Fタンパク質を発現させる場合、発現された全長 Fタンパク質が宿主細胞の内在性プ 口テアーゼにより切断され、その結果として活性ィ匕されるため、活性型 Fタンパク質を 発現および単離することが可能である。あるいは、 Triptase clara (Kidoら、 Molec ular Cells 9, 235— 244 (1999) )を、内在性の酵素として発現する宿主細胞（例 えば、ラットの気管上皮細胞）、または組換え的に発現する宿主細胞もまた使用され 得る。
[0073] これら発現ベクターの選択および構築方法、宿主細胞への導入方法、宿主細胞で の発現方法、ならびに発現タンパク質の回収方法は、当業者にとって周知である。
[0074] (HVJからの融合タンパク質の精製）
融合タンパク質の精製のために、 NP-40処理した HVJの溶解物を、超遠心によつ て明澄ィ匕した。上清のタンパク質を、さらなる精製の前に、 SDS-PAGEによって分 祈した。この上清は、 HVJ由来の多くのタンパク質を含んでいた。次に、この上清を、 イオン交換クロマトグラフィーにアプライした。 52kDaおよび 72kDaタンパク質が主に 、素通り画分に溶出された。 SDS— PAGEでの移動度によって、これら 2つのタンパク 質を、それぞれ F1および HNであると同定した（Okada、 Methods in Enzymolo gy, N. Duzgnes (Ed. ) , Academic Press, ¾an Diego, vol. 221, pp. 18— 41 (1993) )。 52kDaタンパク質の下のかすかなバンドは、融合タンパク質（F1およ び HN)の分解産物であると考えられた。なぜなら、これらのタンパク質は、異なる実 験間で再現性がなかったからである。タンパク質を、さらに 0. 2M NaClによって溶 出した。しかし、融合タンパク質は、効率よくは得られな力つた。そして HVJの NPタン ノ ク質であると推測されるさらなる 60kDaタンパク質が出現した。結果として、素通り 画分のみを、さらなる実験の融合タンパク質の供給源として使用した。デンシトメトリー は、素通り画分の F1対 HNの濃度比が 2. 3 : 1であることを示した。このことは、ウィル スエンベロープ中の両タンパク質の比と一致した。以前の論文（Nakanishiら、 Exp. Cell Res. , 142 : 95— 101 (1982) )は、この比が HVJの効率的な融合に必要であ ると報告している。
[0075] (ウィルスベクターの調製）
3. 56mgホスファチジルコリンおよび 0. 44mgコレステロールの脂質混合物を、クロ 口ホルム中に溶解し、そしてこの脂質溶液を、ロータリーエバポレーター中で蒸発さ せた（Uchidaら、 J. Cell. Biol. 80 : 10—20 (1979) )。乾燥脂質混合物を、 0. 85% NP— 40を含む 2. 0mlの上記素通り画分からのタンパク質溶液（1. 6mg)中にボル テックスにより完全に溶解した。次いで、この溶液を 0. 3M スクロースおよび ImM KC1を含む 10 mMリン酸緩衝液 (pH7. 2)に対して透析し、 NP— 40を除去した。 透析は、毎日緩衝液を交換して 6日間実施した。この透析された溶液を、 0. 3M ス クロースおよび ImM KC1を含む 10mMリン酸緩衝液（pH5. 2)で平衡化したァガ ロースビーズ（Bio— Gel A— 50m) (Bio— Rad Laboratories, Hercules, CA, U SA)にアプライした。 540nmにおける光学的密度が 1. 5を超える画分を再構成融合 粒子として集め、そして以下に記載のように 10mg脂質力も調製された核酸充填リポ ノームと融合し、ウィルスベクターを調製した。
[0076] (ヒト HEK293株由来のトランスフエタト細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子発現） 上記の方法で調製したウィルスベクターの遺伝子導入活性を確認するために、ヒト HEK293株およびルシフェラーゼ遺伝子を、以下のように用いた。
[0077] pCMV—ルシフェラーゼ（7. 4kb)を、 pGEM— luc (Promega Corp.、 Madison 、 WI、 USA)からのルシフェラーゼ遺伝子を、 pcDNA3 (5. 4kb) (Invitrogen、 Sa n Diego, CA、 USA)中に、 Hindlllおよび BamHI部位でクロー-ングすることに より構築した。約 40 gの pCMV—ルシフェラーゼを含むウィルスベクターを、先に記 載のように構築し、そしてこのウィルスベクター（約 1. 5 X 1011粒子 Zml、 DNA濃度 は約 40 μ g/ml)の 1Z10量（ 100 1)を、ヒト 293細胞株（ヒト胎児腎臓： HEK)由 来の 2 X 105細胞とインキュベートした。 HVJリボソームを用いて、また同量のルシフエ ラーゼ DNAを 2 X 10¾EK293細胞に導入した。導入 24時間後、細胞を回収し、そ して他【こ記載のよう【こ（Saekiら、 Hum. Gene Ther. , 8 : 1965—1972 (1997) )、 ルシフェラーゼ活性アツセィを確認した。
[0078] (実施例 2：凍結融解による HVJエンベロープベクターの調製および使用）
(ウィルスベクターの調製およびその使用）
(1：凍結融解による HVJエンベロープベクターの調製）
外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、組換え HVJウィルスを様々な回数 で凍結融解した後、培養細胞に遺伝子導入した。 [0079] TE500 μ 1に、 750 μ gのルシフェラーゼ発現ベクター pcOriPLuc (Saekiおよび Kanedaら、 Human Gene Therapy、 11、 471— 479 (2000) )と様々な濃度の HVJウィルスを混合した。 HVJウィルス濃度は、 10、 25、 50、 100HAUZ 1に調製 した。この溶液を 12分割し、それぞれをドライアイスによって凍結させた後、融解する ことを最大 30回まで繰り返した。所定回数の凍結融解を終えた溶液を、 BHK— 21細 胞（24ゥエルディッシュ、 4 X 104細胞/ディッシュ、 0. 5ml DMEM, 10%FCS)の 培地に添カ卩し、 37°C、 5%COにて 20分間反応後、 PBSにより洗浄し、新たに培養
2
液を 0. 5ml加えて 24時間培養した。
[0080] 培地を除去し、 1 X Cell Culture Lysis Reagent (Promega社） 500 1を細胞 上に加えて細胞を溶解した後、マイクロチューブに移して遠心し、得られた上清 20 1力ら、 Promega Luciierase Assay Systemと Lumat LB9501 Lummopho tometerを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定は各溶液にっ 、て 3回行 、、 平均値を求めた。
[0081] この結果、組換え HVJウィルスの凍結融解の回数が増加するに従ってルシフェラー ゼ活性が上昇し、 3回の凍結融解に比べ 20回の凍結融解では 10倍以上のルシフヱ ラーゼ発現が観察された。この結果から、この実施例に用いた条件では、組換え HV Jウィルスの凍結融解の回数は好ましくは 5回以上、さらに好ましくは 15— 20回程度 であることが確認された。
[0082] (2：凍結融解により調製された HVJエンベロープベクターの遺伝子導入効率） 上記 1と同様の組換え HVJウィルスを 30回凍結融解した後、宿主細胞に添加する ウィルス数を同一条件として、細胞への遺伝子導入効率を調べた。
[0083] その結果、例えば X軸が 500HAUの場合では、ウィルス濃度 10HAUZ μ 1の溶 液の添加量は 50 μ 1であり、 100HAU/ μ 1の溶液は 5 μ 1となる。ウィルス濃度が 10 0HAU/ μ 1の溶液は 10— 50HAUZ μ 1濃度の場合に比較して遺伝子発現の効 率が約 50%低下した。この結果から、この実施例の条件では、組換えウィルス濃度 は 10— 50HAUZ μ 1の範囲とすることが好ましいことが確認された。
[0084] また、組換え HVJウィルスを 29回凍結融解した後、 30回目の凍結を行!、、その凍 結状態で 1週間保存した後、融解して細胞に添加した。その結果、この 1週間冷凍保 存した組換え HVJウィルスも、 30回の凍結融解を連続で行ったウィルスと同程度の ルシフェラーゼ遺伝子発現を示した。
[0085] (実施例 3：界面活性剤を用いる不活性ィ匕 HVJエンベロープベクター (HVJ— E)の 調製および使用）
(1 :HVJの増殖）
HVJは鶏の受精卵への種ウィルスの接種により増殖されたものが一般に使用され 得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウィルスの持続感染系（トリプシン などの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローユングさ れたウィルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全 てが利用可能である。
[0086] 本実施例において、 HVJの増殖を以下のようにおこなった。
[0087] HVJの種ウィルスを、 SPF (Specific pathogen free)の受精卵を使って増殖さ せ分離'精製した HVJ (Z種)を細胞保存用チューブに分注し、 10% DMSOを加え て液体窒素中に保存し、調製した。
[0088] 受精直後の-ヮトリ卵を入荷し、インキュベーター（SHOWA— FURANKI P— 03 型;約 300鶏卵収容）にいれ、 36. 5°C、湿度 40%以上の条件で 10— 14日飼育した 。暗室中で、検卵器 (電球の光が口径約 1. 5cmの窓を通して出るようになつているも の）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約 5mm上方に鉛筆 でウィルス注入箇所の記しをつけた (太、、血管を除 、た場所を選定する)。ポリぺプト ン溶液（1%ポリペプトン、 0. 2% NaClを混合し、 1M NaOHで pH7. 2に調整し てオートクレープ滅菌し、 4°C保存したもの）で種ウィルス (液体窒素からとりだしたも の）を 500倍に希釈し、 4°Cにおいた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウィル ス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウィルス 0. 1mlを 26ゲージの針付 き lmlシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶力したパラフィン (融点 5 0— 52°C)をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュ ベータ一にいれ、 36. 5°C、湿度 40%以上の条件で 3日飼育した。次に、接種卵を 一晩 4°Cにおいた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、 18ゲージの針を付けた 10mlシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、 4°Cに保 存した。
[0089] (2 :HVJの精製）
HVJは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野におい て公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
(2. 1 :遠心分離による精製方法）
手短には、増殖させたウィルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織. 細胞片を除去した。その上清を高速遠心（27, 500 X g、 30分間）とショ糖密度勾配（ 30— 60%wZv)を利用した超遠心（62, 800 X g、 90分間）により精製した。精製の 間にウィルスをできるだけ穏和に扱い、 4°Cで保存することに注意すべきである。
[0090] 本実施例において、具体的には、以下の方法によって HVJを精製した。
[0091] HVJ含有漿尿液 (HVJ含有の-ヮトリ卵の漿尿液を集め 4°Cにて保存）の約 100m 1を広口の駒込ピペットで 50mlの遠心チューブ 2本に入れ（Saeki, Y. ,および Kan eda, Y： Protein modinea liposomes (HVJ— liposomes) for the delivery of genes, oligonucleotides and proteins. Cell Biology ; A laboratory handbook (第 2版) J. E. Celis編（Academic Press Inc. , SanDiego)第 4卷、 1 27— 135、 1998を参照のこと）、低速遠心機で 3000rpm、 10分、 4。Cで遠心し（ブ レーキはオフ）、卵の組織片を除去した。
[0092] 遠心後、上清を 35ml遠心チューブ 4本（高速遠心用）に分注し、アングルローター で 27, OOOg, 30分遠心した（アクセル、ブレーキはオン)。上清を除き、沈殿に BSS (10mM Tris— HCl(pH7. 5)、 137mM NaCl、 5. 4mM KC1 ;オートクレーブ し、 4°C保存）（BSSのかわりに PBSでも可能）をチューブ当たり約 5mlカ卩え、そのまま 4°Cでー晚静置した。広口の駒込ピペットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐ し 1本のチューブに集め、同様にアングルローターで 27, OOOg, 30分遠心した。上 清をのぞき沈殿に BSS約 10mlをカ卩え、同様に 4°Cでー晚静置した。広口の駒込ピぺ ットでゆるやかにピペッティングして沈殿をほぐし、低速遠心機で 3000rpm, 10分、 4°Cで遠心し (ブレーキはオフ）、除ききれな力つた組織片ゃウィルスの凝集塊をのぞ V、た。上清を新 、滅菌済みチューブに入れ精製ウィルスとして 4°Cで保存する。
[0093] このウィルス液 0. 1ml〖こ BSSを 0. 9ml加え、分光光度計で 540nmの吸収を測定し 、ウィルス力価を赤血球凝集活性 (HAU)に換算した。 540nmの吸収値 1がほぼ 15 , OOOHAUに相当した。 HAUは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際に -ヮトリ赤血球液 (0. 5%)を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよ!/ヽ（動物細胞利 用実用化マニュアル、 REALIZE INC. (内田、大石、古沢編集） P259— 268、 19 84を参照のこと)。
[0094] さらにショ糖密度勾配を用いた HVJの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、 ウィルス懸濁液を 60%、 30%のショ糖溶液 (オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チ ユーブにのせ、 62, 800 X gで 120分間密度勾配遠心を行う。遠心後、 60%ショ糖 溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウィルス懸濁液を BSSもしくは PBS を外液として 4°Cで透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ゥ ィルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と 0. 5M EDTA液（オートクレー ブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が 10%と 2— 10mMになるように加えて- 80°Cで穏ゃ かに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロールと 0. 5M E DTA液の代わりに 10mM DMSOでも可能）。
(2. 2 :カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによる HVJの精製も本発明に適用可能 である。
[0095] 手短には、分子量カットオフが 50, 000のフィルターによる限外濾過による濃縮 (約 10倍）とイオン交換クロマトグラフィー（0. 3M— 1M NaCl)による溶出を用いて精製 した。
[0096] 具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、 HVJをカラムによって精 製した。
[0097] 漿尿液を採集した後、 80 m— 10 mのメンブランフィルターにてろ過した。 0. 0 06-0. 008% BPL (最終濃度）を漿尿液に加え (4°C、 1時間）、 HVJを不活性ィ匕 した。漿尿液を 37°C、 2時間インキュベートすることによって、 BPLを不活性ィ匕した。
[0098] 500KMWCO (A/G Technology、 Needham、 Massachusetts)を用いたタ ンジェンシャルフロー限外ろ過法により約 10倍濃縮した。緩衝液として、 50mM Na Cl、 ImM MgCl 、 2%マン-トール、 20mM Tris (pH 7. 5)を用いた。 HAUァ ッセィにより、ほぼ 100%の HVJ回収率であり優れた結果がえられた。
[0099] QSepharoseFF (アマシャムファノレマシアバイオテク KK、 Tokyo)によるカラムクロ マトグラフィ一法（緩衝液： 20mM TrisHCl (pH7. 5)、0. 2— 1M NaCl)で HVJ を精製した。 40— 50%の回収率であり、純度は 99%以上であった。
[0100] 500KMWCO (A/G Technology)を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法 により HVJの画分を濃縮した。
[0101] (3 :HVJの不活性化）
HVJの不活性ィ匕が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキ ル化剤処理により行った。
[0102] (3. 1 :紫外線照射法）
HVJ懸濁液 lmlを 30mm径のシャーレにとり、 99または 198ミリジュール Zcm2を 照射した。ガンマ一線照射も利用可能である（5— 20グレイ）が完全な不活性ィ匕がお こらない。
[0103] (3. 2 :アルキル化剤による処理）
使用直前に、 10mM KH PO中に 0. 01% j8—プロピオラタトンの調製をした。
2
作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。
[0104] 精製直後の HVJの懸濁液に最終 0. 01%になるように β プロピオラタトンを添カロし 、氷上で 60分間でインキュベートした。その後 2時間、 37°Cでインキュベートした。ェ ッペンドルフチューブにチューブあたり 10, 000HAU分ずつ分注し、 15, 000rpm、 15分遠心し、沈殿を - 20°Cで保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を - 20°C で保存せず、そのまま界面活性剤処理により DNAを取り込ませ、ベクターを作成す ることち可會である。
[0105] (4 :HVJエンベロープベクターの作成）
保存してあった HVJに外来 DNA200— 800 μ gを含む溶液 92 μ 1を加えてピぺッ ティングでよく懸濁した。この溶液は、 20°Cで、少なくとも、 3ヶ月保存可能である。 HVJとの混合前に DNAに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が 2倍以上増強し た。
[0106] この混合液を氷上に 1分間置き、オタチルダリコシド（10%)を 8 μ 1カ卩えて 15秒氷上 でチューブを振盪し、 45秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、 1一 5分 間が好ましい。オタチルダリコシド以外に、 Triton— X100 (t—才クチルフエノキシポリ エトキシエタノール）、 CHAPS (3— [ (3—コラミドプロピル) ジメチルアンモ-ォ ]—1— プロパンスルホン酸）、 NP— 40 (ノユルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面 活性剤も使用し得る。 Triton-X100、 NP—40および CHAPSの好ましい最終濃度 は、それぞれ、 0. 24—0. 80%、 0. 04—0. 12%および 1. 2—2. 0%である。
[0107] 冷 BSSを lml添カロし、すぐ〖こ 15, OOOrpmで 15分遠心した。生じた沈殿に PBSま たは生理食塩水などを 300 1カ卩えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸 濁液は直接遺伝子導入に使用することも、 20°Cで保存後に遺伝子導入に使用す ることも可能である。この HVJエンベロープベクターは、少なくとも 2ヶ月間の保存後、 同程度の遺伝子導入効率を維持した。
[0108] (5 :HVJエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）
(遺伝子導入方法）
1, 000HAU分をエツペンドルフチューブにとり（30 μ 1)、硫酸プロタミン（lmgZm 1) 5 1を加えた。 BHK— 21細胞（前曰に、ゥエルあたり 200, 000個で、 6つのゥエル にまいたもの）の培地を交換し、 1ゥエルあたり 0. 5mlの培地（10%FCS— DMEM) を添カ卩した。各ゥエルに、上記のベクター（1, 000HAU相当）と硫酸プロタミンの混 合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、 37°Cで 、 5%COインキュベータ一中に 10分間放置した。
2
[0109] 培地交換し、 37°Cで、 5%COインキュベータ一中でオーバーナイト（16hr— 24hr
2
)放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ (pcLuci;CMVプロモーターを有す るルシフェラーゼ遺伝子）の場合は、 Cell Lysis Buffer (Promega) O. 5mlで細 胞を溶解し、その 20 μ 1溶液中の活性をルシフェラーゼアツセィキット（Promega)を 用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質 (pCMV— GFPE ;Promega)の場合は、そ のまま蛍光顕微鏡で観察し、 400倍率で 5— 8視野を観察し、蛍光を発する細胞の割 合を算出した。
[0110] (実施例 4 :リボソームベクターの調製および使用）
(リボソームベクターの調製） 本発明のリボソームベクターを、 20— 24 ;z gの cDNAライブラリー由来の cDNAと、 24—72 μ 1の lipofect AMINE 2000 (リポフエクタミン 2000 (Invitrogen life technologies (Carlsbad, California 92008))試薬をそれぞ
れ 1. 2mlの無血清培地に希釈し、速やかに混合し、 20分間常温でインキュベートす ることにより、リボソームと核酸との複合体を形成する。
[0111] (リボソームベクターによるトランスフエクシヨン）
宿主細胞を、適切な培地とともに、 96ゥエルプレートの各ゥエルに添カ卩し、培養する 。血清存在下でトランスフエクシヨンする場合、複合体 12. 5 1を 96ゥエルプレートの 各ゥエルに直接添加し混合する。血清非存在下でトランスフエクシヨンする場合は複 合体を添加する前に血清を含んだ培地を除去し、血清を含まな 、培地に交換する。
4一 12時間 COインキュベーターで培養後、培地交換を行う。所定の時間の培養
2
後、アツセィを行う。
[0112] (実施例 5：種々の界面活性剤を用いて調製した物質導入デバイスを用いる遺伝子 導入）
以下の方法を用いて、固相に所望の核酸を含む HVJ— Eベクターを固定ィ匕すること により、物質導入デバイスを調製した。
[0113] (細胞、プラスミド DNAおよび HVJ— Eの調製）
BHK- 21細胞（babyhamsterkidney cell)は、アメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCCRockville, MD)より購入した。細胞を、 10%FBSを添カ卩したダルベッコ改変ィ 一ダル培地で培養した。トランスフエクシヨン効率を評価するために、ルシフェラーゼ 発現ベクターである pGL3(Promega)を用いた。プラスミドは、 Qiagenカラム (Hilden,ドィ ッ)を用いて調製した。 HVJウィルスを、増幅し、そして HVJ— Eベクターを実施 例 3に記載のように調製した。
[0114] (核酸を含む HVJ-Eの調製）
16. 7HAUの HVJ— Eを、 15000g、 15分、 4。Cで遠心した。上清除去後、 1. 33 g (0. 67 μ 1)の pGL3プラスミド溶液に懸淘し、さらに、 49. 33 μ 1の PBS (—）を添カロ した。この混合物を 96ウェルマイクロタイタ一プレートの 1ゥエルに添カ卩し、図 1、 2に 示した 15 1の界面活性剤を混合物に添加した。混合物を 15分間インキュベートし、 次に、 0. 21mgZmlの硫酸プロタミン（PBS (—）中に溶解） 85 μ 1を添カ卩した。このプ レートを、 3000rpm (1643 X g)、 30分、 4°C、遠心分離機にかけ、さらに 4°C、ォー バーナイトでインキュベートした。
[0115] (トランスフエクシヨン）
トランスフエクシヨンのために、上記で調製した核酸を含むベクターを添加したプレ 一トのゥエル中の上清を 80 1除去し、 2. 5 X 104細胞を添カ卩後、 lOOOrpmで 30分 間、 32°Cで 2回遠心分離機にかけた。細胞を、 10%FBSを補充した培地を用い、 34 。C、オーバーナイトで培養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアツセィキット (Promega)を用いて検出し、そして蛍光強度をイメージリーダー ARVOmx(Wallac)で 検出した。その結果を図 1、および図 2に示す。
[0116] 図 1に示すように、ドデシルマルトシド、オタチルダリコシド、およびジギトニンの各々 を用いた場合、ルシフェラーゼ活性が検出された。活性の強度は、ドデシルマルトシ ドが最も強ぐ次にオタチルダリコシドが強ぐジギトニンが最も弱力つた。
[0117] 図 2に示すように、オタチルダリコシド、ォクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデ シルマルトシド、ジギトニン、および Triton— Xを用いた。オタチルダリコシド、ォクチル マルトシド、デシルマルトシド、ドデシルマルトシド、およびジギトニンを用いた場合、 ルシフェラーゼ活性が検出された。これに対して、 Triton— Xを用いた場合、ルシフエ ラーゼ活性が検出されな力つた。この結果から、遺伝子導入のためには、界面活性 剤が糖部分を有することが必要であると考えられる。これに対して、疎水性部分は、 アルキル基であってもステロイドであっても、遺伝子導入活性が確認されたことから、 疎水性部分に必須の構造的特徴はないと考えられる。しかし、疎水性部分がアルキ ル基の場合は、ステロイドの場合よりも、高い遺伝子導入効率をもたらした。疎水性部 分力 式 (CH ) n-CHで表されるアルキル基の場合、 n= 7— 11の場合に、高い
2 3
遺伝子導入効率がもたらされた。最も遺伝子導入効率が高カゝつたのは、 n= 9の場合 であった。また、使用した個々の界面活性剤の中で、活性の強い順番は、デシルマ ルトシド、ドデシルマルトシド、ォクチルマルトシド、オタチルダリコシド、ジギトニンであ つた o
[0118] 図 1に関して CMC以下の濃度について検討を行った。この方法において有効な界 面活性剤はドデシルマルトシドであり、 1Z4CMCにおいてピークが見られた。そこで 図 2において、図 1で設定された 1Z4CMCにおいて類以の界面活性剤を検討した 。ォクチルダルコシド、ジギトニンについては細胞毒性が観察されたのでその効果が 最小である濃度を選んだ。また、従来法との比較を行うために TritonX-lOOは従来 法で使用して 、た濃度を用 、た。
[0119] (実施例 6：種々の界面活性剤を用いて調製した物質導入デバイスを用いる遺伝子 導入）
全体として 4208HAUの HVJ-Eを、 15000g、 15分間、 4°Cで遠心した。上清を除去し た後、 2mg/mlの pGL3 (167.8 1)を添カ卩して、ベクターを懸濁した。 4.05mlの PBS (-)を 混合物
に添加し、そして 16.7 μ 1の pGL3/HVJ- E/PBS混合液を、 96オートディスペンサーマ シン (ADS-384、 Biotech)を用いて、 96ゥエルプレートの各ゥエルに分注した
(HVJ-E:16.7HAU/
ゥエル、 pGL3:1.33ug/ゥエル)。 96ゥエルの各々に 0. 01%のドデシルマルトシドを 、 5 1/ゥエルになるように添カ卩した。プレートを 15分間インキュベートし、次に 22.3 1/ゥエルになるように PBS (-)を添カ卩し、そして 6.0 1/ゥエルになるように、 lmg/ml硫 酸プロタミン/ PBS (-)を添カ卩した。溶液をプレートに添カ卩し、そのプレートを 3000rpm、 30分間、 4°Cで遠心分離機にかけ、さらに 4°C、オーバーナイトでインキュベートした
[0120] トランスフエクシヨンのために 1. 67 X 105cel ls/mlの細胞溶液を調製し、 96ォ ートディスペンサーマシン (ADS— 384、 Biotech)を用いて、上記で調製した核酸を 含むベクターを添カ卩したプレートに 2. 5 104細胞（150 1)を添加し、 lOOOrpm で 30分間、 32°Cで 2回遠心分離機にかけた。細胞を、 10%FBSを補充した培地を 用い、 34°C、オーバーナイトで培養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアツ セィキット (Promega)を用いて検出し、そして蛍光強度をイメージリーダー
ARVOmx(Wallac)で検出した。その結果を図 3、および図 4に示す。
[0121] 図 3に示すように、本発明の遺伝子導入方法は、高い再現性を示した。蛍光強度（ RU)の平均値は、 2080518、および 1667747であり、標準偏差は、 377928. 9お よび 324477であった。相対標準偏差 (C.V.%)は、 18. 2%および 19. 5%であり、 本発明の再現性の高さが数値で示されて 、る（図 4Aおよび B)。
[0122] (実施例 7 :種々のタンパク質でコートした固相を用いた場合の、遺伝子導入効率） 全体として 20995HAUの HVJ— Eを、 15000g、 15分、 4。Cで遠心した。上清除去 後、 2mgZmlの pGL3プラスミド溶液 157 1でベクターを懸濁した。 1% TritonX —100を 47. 1 μ 1添加し、 15000g、 15分、 4。Cで遠心した。上清除去後、 1662. 4 μ 1の PBS (-)でベクターを懸濁し、 lmgZmlの硫酸プロタミン（PBS (-)中に溶解) 237. 5 1を添加した。次に、 6. 1mlの PBS (—）を添カ卩し、この溶液を図 5に示した 2 4ゥエルプレートの各々に添カ卩した（200 1/ゥエル）。プレートを、 3000rpm (164 3 X g)、 30分、 4°C、遠心分離機にかけ、さらに 4°C、オーバーナイトでインキュベート した。
[0123] トランスフエクシヨンのために、上記で調製した核酸を含むベクターを添カ卩したプレ 一トのゥエル中の上清を 100 1除去し、 2. 5 X 105細胞（lml)を添カ卩後、 lOOOrp mで 30分間、 32°Cで 2回遠心分離機にかけた。細胞を、 10%FBSを補充した培地 を用い、 34°C、オーバーナイトで培養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼァ ッセィキット (Promega)を用 、て検出し、そして蛍光強度をイメージリーダー
ARVOmx(Wallac)で検出した。
[0124] 図 5に示すプレートを用いた。各プレートのコーティングは、以下のとおりである： Corning：コーティングなし（コ一-ング社製）、
SUMILON：コーティングなし（住友ベークライト社製）、
PLL：ポリ Lリシンコーティング (住友ベークライト社製）、
Gelatin:ゼラチンコーティング (住友ベークライト社製）、
C— 1：コラーゲン 1コーティング (住友ベークライト社製）、
B.D.:コーティングなし (BDバイオサイエンス社製）、
PLO/LM：ポリ Lオル-チン Zラミニンコーティング（BDバイオサイエンス社製）、 PDL/LM：ポリ Dリジン Zラミニンコーティング（BDバイオサイエンス社製）、
Laminin:コーティング（BDバイオサイエンス社製）、
C—1：コラーゲン 1コーティング（BDバイオサイエンス社製）、 C 4：コラーゲン 4コーティング（BDバイオサイエンス社製）、および
Fibronectin：フイブロネクチンコーティング（BDバイオサイエンス社製）。
[0125] 図 5に示されるように、フイブロネクチンでコートしたプレートを用いた場合に、遺伝 子導入効率が最も高カゝつた。
[0126] (実施例 8 :所望の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の単離および解析） 本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する目的遺伝子を分離するこ とが可能である。例えば、本明細書の実施例 3で調製した遺伝子導入ベクター、およ び発現プラスミドライブラリーを使用して、実施例 5に記載の方法に従ってデバイス上 の細胞に導入し、ゥエル中の細胞の中から所望の機能を有する細胞を決定すること によって、所望の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することが可能 である。
[0127] この場合、本実施例に例示される遺伝子の単離法には、本明細書の実施例 3で調 製した遺伝子導入ベクターのみならず、任意の「ウィルスエンベロープベクター」およ び「リボソームベクター」が使用可能である。
[0128] 本実施例の方法を用いて、血管内皮増殖因子をコードする遺伝子を単離する方法 を以下に例示する。
[0129] ヒト心臓 cDNAライブラリー（GIBCO BRL社；ヒト心臓由来 cDNAを、 CMVプロモ 一ターを有するプラスミド pSPORTに連結したプラスミド）を E. coli DH12Sに導入 し、その E. col ら、プラスミドを調製する。プラスミド 200 μ gを、 10000HAUの HV J E遺伝子導入ベクター (本発明の実施例 3で調製した遺伝子導入ベクター、 3 X 1 09particle)に封入する。宿主細胞として、ヒト大動脈内皮細胞 HAEC (三光純薬)約 5000細胞を、 96ウェルマイクロタイタ一プレートの各ゥエルに培地とともに添加して、 一晩培養した細胞を用いる。宿主細胞を含んだ各ゥヱルに対して、上記 HVJ— Eの 1 00分の 1量を添加し、 37°C 30分間放置した後、培地交換をする。
[0130] 使用した培地は、血清濃度を 1%とした低栄養状態のもので、この状態下で、 1週 間培養を行う。この条件下では、 HEACの増殖は確認されない。
[0131] 2週間後、細胞増殖アツセィを行う。試薬として、 Cell Titer96 (Promega社)を用 い、ミトコンドリアの酸ィ匕還元状態を試薬の色調の変化として捉えて、細胞増殖の指 標とする。
[0132] ゥエルの色の濃さは細胞増殖の指標である。最も色が濃いゥエルは、最も活発に細 胞増殖が行われた細胞が存在するゥエルである。そこで、マイクロタイタープレート全 体をプレートリーダーで読み取り、その細胞増殖を、コンピュータによりグラフ化する。 このグラフから、最も増殖作用を示す 2つのゥエル内の細胞から、 Qiagen社の DNea sy Tissue Kitを用いて、核酸を調製する。調製される核酸には、プラスミド DNA が含まれるので、これをコンビテントな E. coli (DH5 o;；宝酒造）に熱ショック法を用 いて導入する。
[0133] この E. coliをアンピシリン含有プレート培地に播種し、コロニーを形成させる。 1つ のゥエルより調製した DNAから、約 20— 200個のコロニーを得ることができる。各コロ ニー力もプラスミド DNA (pDNA)を抽出し、制限酵素処理によって、プラスミド内の 遺伝子フラグメントの存在を確認する。通常、調製したプラスミドのうち、約 60— 70% のプラスミド力 挿入物を有するプラスミドである。
[0134] 次に、 Qiagen社の Endo Free Plasmid Maxi Kitを用いて、プラスミド DNA を精製し、その精製したプラスミドを HVJ— Eに封入して、再度 HAEC細胞に導入し、 同様の細胞増殖実験を行う。この細胞増殖実験において、有意に高い細胞増殖を 示したプラスミドが、血管内皮増殖因子をコードする核酸を含むことが予想される候 ネ ΐプラスミドである。
[0135] 以上の結果は、本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する遺伝子 の単離を迅速かつ簡便に行うことができたことを実証する。
[0136] (実施例 9：所望の機能的性質を有する変異核酸の単離方法）
本発明を用いることによって、所望の機能的性質を有する変異遺伝子を分離するこ とが可能である。
[0137] 本明細書の実施例 3で調製したウィルスベクターを使用して、所望の機能を有する 遺伝子を単離する。なお、本実施例に例示される遺伝子の単離法には、本明細書の 実施例 3で調製したウィルスベクターのみならず、任意の「ウィルスエンベロープべク ター」および「リボソームベクター」が使用可能である。
[0138] 出発物質として、特定の遺伝子をコードする核酸を選択する。その核酸を、細胞内 でプロモーターとして機能する配列に、作動可能に連結したプラスミドを作製する。そ のプラスミドを、実施例 3に従って、第 1の宿主細胞に導入する。
[0139] 核酸を導入した第 1の宿主細胞に変異誘発をし、約 5000個の細胞を、 96ウェルマ クロタイタープレートの各ゥエルに培地とともに添加して、一晩培養する。培養後、各 ゥ ル内の変異宿主細胞を、所望の機能について、スクリーニングする。所望の機能 を示す細胞を取り出し、最も好ましい性質を示したゥエル内の細胞から、 Qiagen社の DNeasy Tissue Kitを用いて、核酸を調製する。調製される核酸には、プラスミド DNAが含まれるので、これをコンビテントな E. coli (DH5 o;；宝酒造）に熱ショック法 を用いて導入する。
[0140] この E. coliをアンピシリン含有プレート培地に播種し、コロニーを形成させる。 1つ のゥエルより調製した DNAから、通常約 20— 200個のコロニーを得ることができる。 各コロニー力もプラスミド DNAを抽出し、制限酵素処理によって、プラスミド内の遺伝 子フラグメントの存在を確認する。
[0141] 次に、 Qiagen社の Endo Free Plasmid Maxi Kitを用いて、プラスミド DNA を精製し、その精製したプラスミドを HVJ— Eに封入して、再度 HAEC細胞に導入し、 同様の機能的性質について試験する。この細胞増殖実験において、好ましい機能的 性質を示したプラスミドが、所望の機能的性質を有する変異核酸を含むプラスミドで あることが半 U明する。
[0142] (実施例 10 : HVJへの所望の物質の封入効率の改良）
上記実施例においては、 HVJへの従来封入ェンハンサ一には硫酸プロタミン (PS) を用いていたが、本実施例においては、 PSの代わりにポリエチレンィミン（PEI)を用 いた。その結果、 PSと比較して、（1)細胞への生体高分子導入効率の上昇、（2)細 胞汎用性の拡大、が実証された。また、 PEIは直鎖型と分岐型があるが、（1)直鎖型 の方が幅広い濃度で高い導入効率が維持される、（2)直鎖型の方が細胞毒性が低 い、ことが実証された。その結果を以下に示す。
[0143] カチォニックポリマーとして知られる PEIは直鎖型と分岐型が存在する。今回は分 子量の異なるものを直鎖型 (PEI— L)と分岐型 (PEI-B)それぞれ 2種類ずつ、計 4種 類の PEIを用いた。直鎖型の PEIの構造は、— [NH— CH— CH ]—として示され (X は任意の整数）、本実施例においては、分子量 2. 5kDaの PEI— L (PEI— L 2. 5K) と 25kDaの PEI— L (PEI— L 25K)を使用した。分岐型 PEIは、 [NH— CH— CH
2 2
] ~[N (CH CH— NH )— CH—CH ]一として示され (yおよび zは任意の整数）、 y 2 2 2 2 2 z
本実施例においては、分子量 25kDa (PEI— B 25K)の PEI— Bと 750kDaの PEI— B (PEI-B 750K)を使用した。
[0144] BAEC細胞に対して、上記実施例 6の方法を以下のとおりに改変し、そして、 PSを 使用した代わりに、 PEIを用いた。具体的には、以下のとおりである。
[0145] HVJ— Eを 96ゥエルプレートの 1ゥエルあたり 4. 5HAUを添カ卩するために、 15000g 、 15分間、 4°Cにて遠心した。上清を除去した後、適量の HBSS (Hank' s Balance d Salt Solution;ハンクス平衡塩溶液）中に懸濁し、 5 1(4. 5HAU)の HVJ— Ε ZHBSS混合液を 96オートディスペンサーマシンで 96ゥエルプレートの各ゥエルに 分注した。 96ゥエルの各々に DNA溶液（0. 25mg/mL pEGFP— C1を 5 lZゥ エル）添カ卩して、混合した。その後、 96ゥエルの各々に 0. 01%ドデシルマルトシドを 3 1/ゥエル添カ卩し、混合してプレートを 15分間インキュベートした。次に、 PEIを 12 ΐΖゥエル (使用する細胞、生体高分子により、濃度 ·種類が異なる)で添加し、混合 後に、 HBSSを 25 μ 1Ζゥエル添加し、混合した。そのプレートを 3000rpm、 30分間 、 4°Cで遠心分離機にかけ、さらに、 4°C、オーバーナイトでインキュベートした。
[0146] トランスフエクシヨンのために、 6. 7 X 104細胞 Zmlの BACE細胞溶液を調製し、 9 6オートディスペンサーマシンを用いて、上記で調製した核酸を含むベクターを添カロ したプレートに I X 104細胞（150 1)を添カ卩し、 lOOOrpmで 30分間、 32°Cで 2回遠 心分離機にかけた。細胞を、 10%FBSを補充した培地を用い、 34°C、 50時間で培 養した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアツセィキット（Promega)を用いて検 出し、そして蛍光強度をイメージリーダー ARVOmx(Wallac)で検出した。その結果を 図 6、および図 7に示す。
[0147] 図 6に示されるように、今回使用した全ての PEIにおいて PSを用いた場合よりも細胞 に対するプラスミド DNAの導入効率が向上した。さらに、図 7に示されるように、 PSを 用いた場合には検出可能な遺伝子導入ができなカゝつた GB— 1細胞および SK— BR— 3細胞に対する遺伝子導入も実証された。また、 PEIを用いると、浮遊細胞への遺伝 子導入も同様に高効率である。
[0148] 次に、上記条件にぉ 、て 4種類の PEIを用いた遺伝子導入効率を比較した。その 結果を図 8に示す。 PEIを HVJ— Eと用いる場合、 BAEC細胞では PEI— L 25Kが最 も適することが実証された。細胞によって最適な PEIの種類は異なる。 PEI— L (直鎖 型)を用いた場合、高い導入効率を示す PEI濃度の幅が広ぐ PEI— B (分岐型)を用 いた場合は高い導入効率を示す濃度範囲の幅が狭力つた。他の細胞でも同様の傾 向が見られる。
[0149] 次に、 PEI 4種類を用いた細胞毒性を比較した。具体的には、 BAEC細胞を 76時 間培養した際の、細胞増殖に対する各種 PEIの影響を測定した。その結果、図 9に 示されるように、 HVJ— Eと用いる場合、 PEI— Lと比較して PEI— Bの方が細胞に対す る毒性が強力つた。 PEIの分子量が大きくなるに従って細胞毒性が強くなつた。 PEI- Lも PEI— Bも細胞毒性が表れる限界の濃度付近において最も導入効率が高くなつた 。このことは他の細胞でも同様の傾向が見られる。
[0150] (実施例 11：凍結乾燥プロトコール）
様々な物質を細胞に導入することのできるウィルスベクターは、病因の解明、創薬 を行う上で非常に有効である。そのため、特に、導入物質を封入したウィルスベクタ 一を長期にわたり保存した後、安定に効率良く細胞に導入する必要がある。長期保 存によって、効率を保持する技術が必要となる。そこで、本発明により、以下のように 、長期保存による活性保持を達成する。
[0151] (凍結乾燥プロトコール）
遺伝子（レポーター遺伝子)等を封入したウィルスベクター (HVJ-E)を 96穴プレー トの各ゥ ル中で凍結乾燥し、各条件に従い保存を行った。その後、保存していたプ レートの各ゥエルに細胞を分注することで、細胞に遺伝子等を導入した。細胞内で発 現されたレポーター遺伝子を指標に、凍結乾燥を施した HVJ— Eの安定試験をレポ 一ターアツセィ (ルシフェラーゼアツセィ）によって測定した。例示的なプロトコールは 、以下のとおりである。
1、ウィルスベクターを蒸留水で懸濁する。
2、自動封入装置（ADS384 (装置名： Multistage Dispense Station ADS— 3 84-8、製造業者:バイオテック株式会社 (東京)））にて DNAまたは siRNA (他に、 R NA、抗体、ペプチド、機能性タンパク質、糖鎖、脂質、半導体もしくはその複合体） を界面活性剤ドデシルマルトシド (他にトライトン X— 100等）と共にウィルスベクター懸 濁液をプレート上（プレートコーティングの種類：フイブロネクチン、コラーゲン I、コラ 一ゲン IV、組織培養処置、ゼラチン、ポリ Dリシン、ラミニン、ポリ Lオル-チン）で混合 する。
3、安定化剤（トレハロース、マルトース、ラフイノース、フルクトース、スクロース、グル コース、ラタトース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、メチノレセルロース、 グリシン、マン-トール、ジメチルスルホォキシド（DMSO)またはこれらの混合物から なる群力も選択される物質が挙げられるが、これらに限定されない。安定化剤として は、好ましくはトレハロース、マルトース、ラフイノース、フルクトースまたはこれらの混 合物が挙げられる。）を添加し、 3000回転で遠心を行う。
4、凍結乾燥プログラムに従!、真空凍結乾燥装置 (FTS社)を用いて凍結乾燥を行う
5、凍結乾燥済みのプレートを脱酸素剤と乾燥剤 (近江化学)と共にポリエチレン製の 袋に密封し、さらにアルミパックに密封し、各温度で保存を行う。
6、保存後、レポーターアツセィ (ルシフェラーゼアツセィ（プロメガ社)）により活性 (R LU)をプレートリーダー（パーキンエルマ一社)で測定することで評価を行った。
[0152] その際、安定化剤の種類と濃度、保存温度、保存期間の条件を設定し評価を行つ た。
[0153] (凍結乾燥プレートの作製）
ゥエルあたり 14. 4HAUの HVJ— E、および 0. 25 gのプラスミドを含有する凍結 乾燥プレートを、以下の手順で作製した。
[0154] 15000g、 15分間、 4°Cにて HVJ— Eを遠心し、上清を除去した。蒸留水にて懸濁し て、 HVJ— E懸濁液とした。そして、以後の操作を、 ADS384装置を用いて、自動化 にて行った。
[0155] HVJ— E懸濁液（14. 4HAU)を 96ゥエルのマイクロタイタープレートの各ゥエルに、 添カ卩した（5 μ 1 /ウエノレ；)。そして、 0. 25 μ g( DNA (0. 05mg/mlの濃度で、 5 μ 1 )を含む溶液を添加し、混合した。ドデシルマルトシド (0. 01%を 3Z10倍量;本実施 例では、 3 1)を添加し、混合した。次に、硫酸プロタミン (0. 125mgZml濃度で 12 1;本実施例では、 1. 5 gZゥエル)を添加し、混合した。次に、種々の安定化剤 を示された濃度で添加し、混合した。本実施例では、実際には、 5 1添加した。トレ ハロースの場合には、 3%溶液を 5 1添加して、最終濃度を 0. 5%とした。真空凍結 乾燥装置 FTS (FTS Systems, Inc. 3538 Main Street, P. O. Boxl58 Sto neRidge, NY 12484 USA)にて、プレートを凍結乾燥した。
[0156] (1.凍結乾燥化による安定性）
安定化剤であるトレハロース (濃度: 0. 5%)を用いて、 pGL3プラスミドの BHK細胞 への導入効率を、凍結乾燥しない場合と、凍結乾燥した後とで、比較した。その結果 、図 10に示すように、凍結乾燥未処理の標本と凍結乾燥で処理された標本を、ルシ フェラーゼ活性 (RLU)によって比較すると、凍結乾燥 ·保存処理によってほとんど劣 化してな力つた。このことから、凍結乾燥は長期保存の安定性に有効であることが示 された。
[0157] (2.保存温度と期間についての試験）
2. 5 gのプラスミド pGL3、 14. 4HAUの HVJ— E :JP49、および 0. 5%のトレハロ ースを用い、種々の保存温度および保存期間の後、 2. 5 X 104個の BHK細胞への 遺伝子導入を行い 24時間、 34°Cで培養し、遺伝子導入効率を測定した。保存温度 を、—80度、—20度、 4度、 25度（60%Rh)とし、保存期間を 1ヶ月、および 6ヶ月とし た。その結果、図 11に示されるように、 6ヶ月間各温度で保存しても、ルシフェラーゼ 活性 (RLU)が全く劣化しな力つた。このことから、凍結乾燥によって保存温度に関わ らず長期に渡り安定に保存できることが示された。
[0158] (3.安定化剤と保存期間についての試験）
安定化剤の種類として、トレハロース、およびマルトースを用いた。その結果、図 12 に示されるように、 6ヶ月保存した場合であっても、安定化剤添加していれば十分導 入活性を保持していることが実証された。 6ヶ月の— 20度保存で 0. 5%安定剤を用い ることで、活性を 70倍以上保持できた。
[0159] (4.安定化剤についての試験） 種々の安定化剤（トレハロース、マルトース、ラフイノース、フルクトース）を、種々の 濃度 (0. 03%から 1. 5%)で用いて、 20°Cでの 1ヶ月保存での保存安定性を評価 した。その安定化剤についての評価は、凍結乾燥前の標本濃度を 0. 03%から 1. 5
%で行った。その結果を、図 13に示す。
[0160] それぞれの安定化剤において、 0. 001 %から 3%の濃度が好ましいが、特に以下 の濃度が好ましかった。
[0161] 濃度 （％)
卜レノヽロース 0. 1 - 0. 25
マルトース 0. 1 — 0. 25
ラフイノース 0. 03 0. 13
フノレクトース 0. 1 — 0. 5
(5.本発明の安定ィ匕によって提供される均一な安定性）
96ゥエル全てに同じ標本を分注したプレートに対し凍結乾燥を行 、、細胞に導入し 、各プレート内の標本全てに対しグラフを作成し、その結果を図 14に示した。図 14に 示されるように、 20°Cでの 1ヶ月保存であっても、 80°Cでの 1ヶ月保存であっても、 96ゥエルの標本にぉ 、てほぼ等し 、ルシフェラーゼ活性を得た。この結果に示され るように、ゥエル間における凍結乾燥による差はほとんどなぐ創薬や臨床開発に問 題なく使用できることが実証された。
[0162] (6. DNA以外の導入物質例）
siRNAを用い、凍結乾燥'保存したプレートでの遺伝子導入の活性の保持を検討 した。 siRNA (lOpmol)を封入したウィルスベクター（14. 4HAU)をフイブロネクチ ンプレート（Human Fibronectin Cellware 96— well Plate (ベタトンデッキンソ ン社)）上で凍結乾燥し、 1力月保存後、レポーターアツセィを行った。細胞として、 2. 5 X 104個の BHK細胞を用いた。
[0163] この実験では、 siRNA (pGL2に対する siRNA)および pGL2 (ホタルルシフェラー ゼ遺伝子をコードするプラスミド、プロメガ社)を用いた。レポーターアツセィは、 Dual -Glo Luciferase Assay System (プロメガ社）を用いた。その結果、図 15に示さ れるように、—20度一 25度での保存において発現抑制活性が保持された。図 16は、 図 15の実験と同様の条件を用いて、プレート調製直後と- 20°Cでの 1ヶ月保存後の 各々について、遺伝子抑制活性を Y軸に示したグラフである。 siRNAのターゲット遺 伝子に対する抑制効果そのものに対して、凍結乾燥による劣化はみられな力つた。こ の結果から、 siRNAを含む HVJ— Eを長期保存できることが実証された。
[0164] (7.固相化用プレートの種類）
ルシフェラーゼ遺伝子を封入したウィルスベクター（14. 4HAU)を各種プレートに 凍結乾燥し、レポーターアツセィを行った。プレートとして、コラーゲン処理 96ゥエル プレート（ベタトンデッキンソン社製）、フイブロネクチン処理 96ゥエルプレート（ベタトン デッキンソン社製）、組織培養処理 96ゥエルプレート（ベタトンデッキンソン社製）の 3 種類を用いた。細胞として、 2. 5 X 104個の BHK細胞を用いた。その結果、図 17に 示されるように、いずれのプレートでもルシフェラーゼ活性が得られた。保存後の活性 は、コラーゲン処理 96ゥエルプレート、フイブロネクチン処理 96ゥエルプレート、組織 培養処理 96ゥエルプレートの順に高かった。
[0165] (実施例 12 :凍結乾燥法の応用）
遺伝子を細胞に導入することのできる従来の遺伝子導入剤は、幾つかのステップを 踏み、細胞に遺伝子を導入するものであった。さらに、遺伝子を混ぜた遺伝子導入 剤は、長期にわたる保存が効力な力つた。そのため、長期にわたり保存した後、安定 に効率良く簡便に細胞に導入することが可能な遺伝子導入用アレイ ·装置の開発が 望まれる。本発明はウィルスベクターを固相化したプレート上に所望の遺伝子を滴下 し、細胞を播種することで細胞導入を行う、今までには無い画期的な簡単明瞭な操 作のみで遺伝導入を行うことを可能にする。
[0166] (1.本実施例のプレートの調製および使用）
本実施例のプレートは、好ましくは、以下の手順 (A)によって、調製される。このプ レートは、好ましくは、以下の手順 (B)のように使用される。また、その評価は、例えば 、手順 (C)のように行われる。
[0167] (A.プレートの調製）
本実施例のプレートを以下のように調製する。
1、ウィルスベクターを蒸留水で懸濁する。 2、 自動封入装置 (ADS384)にて硫酸プロタミンと共にウィルスベクター懸濁液を、プ レート上（プレートコーティングの種類：フイブロネクチン、コラーゲン I、コラーゲン IV、 組織培養処理、ゼラチン、ポリ Dリシン、ラミニン、ポリ Lオル二チンのうちの一つまた は、これらを混合したもの。好ましくは、フイブロネクチン)で混合する。次に、安定ィ匕 剤（トレハロース、マノレトース、ラフイノース、フノレクトース、スクロース、グノレコース、ラタ トース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、メチノレセルロース、グリシン、マ ン-トール、ジメチルスルホォキシド（DMSO)またはこれらの混合物からなる群から 選択される物質が挙げられるが、これらに限定されない。安定化剤としては、好ましく はトレハロース、マルトース、ラフイノース、フルクトースまたはこれらの混合物が挙げら れる）を混合する。
3、 3000回転で遠心を行いプレートに固相化を行う。
4、凍結乾燥プログラムに従!、真空凍結乾燥装置 (FTS社)を用いて凍結乾燥を行う
5、凍結乾燥済みのプレートを脱酸素剤と乾燥剤 (近江化学)と共にポリエチレン製の 袋に密封し、さらにアルミパックに密封し、各温度で保存を行う。
[0168] (B.プレートの使用方法）
上記のように調製された本発明のプレートを以下のように使用する。
6、保存したプレートに対して、（細胞への遺伝子導入直前に）自動封入装置（ ADS384)にて DNAまたは siRNA (他に、 RNA、抗体、ペプチド、機能性タンパク質、糖 鎖、脂質、半導体)を各ゥエルに滴下し、遺伝子をウィルスベクターに封入したのち、 細胞を播種することで、細胞への遺伝子導入を行う。
[0169] (C.遺伝子導入効率の評価）
本発明のプレートを以下のように評価する。
7、レポーターアツセィ (ルシフェラーゼアツセィ（プロメガ社)）により活性をプレートリ ーダー (パーキンエルマ一社)で測定することで評価を行う。
[0170] (2.本実施例のプレートの調製および使用）
ゥエルあたり 14. 4HAUの HVJ— Eを含有する凍結乾燥プレートを、以下の手順で 作製した。 [0171] 自動封入装置（ADS384)を用いて、 96ゥエルのマイクロタイタープレートに、 14. 4HAUの HVJ— Eを添カ卩し、 15000g、 15分間、 4°Cにて遠心し、上清を除去した。 蒸留水にて懸濁して、 HVJ— E懸濁液とした。次に、硫酸プロタミン（0. 125mg/ml 濃度で 12 1)と共に、 HVJ— E懸濁液をフイブロネクチンコートしたプレート上で混合 した。次に、安定化剤（トレハロース、濃度: 0. 5%)を、混合した。プレートを、 3000回 転、 30分間、 4°Cにて遠心して、固定ィ匕した。真空凍結乾燥装置 FTSにて、プレート を凍結乾燥した。
[0172] 凍結乾燥したプレート（HVJ- Eを含む）にプラスミド pGL3- CMV(0.05mg/mL)を 5 μ 1(0.25)、 10 1(0.5)滴下した。また、コントロールとして、 HVJ- Εを含まないプレート上 のゥエルに対して、プラスミド pGL3- CMV(0.05mg/mL)を 5 μ 1(0.25)、 10 μ 1(0.5)滴下し た。その結果を、図 18に示す。横軸はプラスミド量 ( g)、縦軸はルシフェラーゼ活性 (RLU)を示す。
[0173] ウィルスベクターが無い場合、遺伝子を滴下してもルシフェラーゼ活性は全くみられ な 、が、ウィルスベクターを固相化した凍結乾燥プレートにプラスミド溶液を滴下した 場合、最大で約 40倍のルシフェラーゼ活性が、確認された。このことは、導入される 核酸を含まないプレートを保存し、核酸を導入する直前に、 HVJ - Eを含む凍結乾燥 プレートに核酸溶液を添加するだけで、高効率な遺伝子導入が可能になったことを 実証する。本発明によって、プラスミド溶液を加えるだけで行える簡便な遺伝子導入 プレートが作製され得る。
[0174] 以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきた力 本発 明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求 の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、 本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に 基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引 用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載さ れているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであるこ とが理解される。
産業上の利用可能性 [0175] 本発明は、高速化、高効率ィヒが可能であり、かつ多数種類の遺伝子に対応可能な 遺伝子導入技術を提供する。また、本発明は、遺伝子のみならず、所望の物質 (例 えば、ペプチド、化合物、ヌクレオチドフラグメントなど）の細胞への導入技術もまた提 供される。
[0176] また本発明は、ウィルスエンベロープまたはウィルス由来タンパク質を利用した、高 速化、高効率ィヒが可能であり、かつ多数種類の所望の物質の導入方法、そのような 物質導入方法に使用するための固相、組成物、およびキットを提供する。

Claims

請求の範囲 [1] 細胞に所望の物質を導入するためのデバイスであって、以下：
(1)固相;
(2)ウィルスベクター；
(3)糖部分を有する界面活性剤、
を備え、ここで、該ウィルスベクター、および該糖部分を有する界面活性剤が、該固 相上に配置される、デバイス。
[2] さらに、 (4)導入される物質を備え、ここで、該導入される物質が前記固相上に配置 される、請求項 1に記載のデバイス。
[3] 前記導入される物質が、導入される遺伝子をコードする核酸、ペプチド、糖鎖、低分 子化合物、プロテオダリカン、グリコペプチド、脂質、および金属イオン力 なる群から 選択される少なくとも 1つの物質である、請求項 2に記載のデバイス。
[4] 前記導入される物質が、導入される遺伝子の siRNA、アンチセンスおよびデコイから なる群より選択される核酸を含む、請求項 1に記載のデバイス。
[5] 前記導入される物質が、導入される遺伝子をコードする核酸である、請求項 1に記載 のデバイス。
[6] 前記ウイノレスベタターが、（i)ウィルスエンベロープ、（ii)ウィルスエンベロープタンパ ク質の少なくとも 1つを含むリボソーム、または（iii)ウィルスエンベロープと、ウィルス エンベロープタンパク質の少なくとも 1つを含むリボソームとの混合物である、請求項
1に記載のデバイス。
[7] 前記ウィルスエンベロープ力 野生型ウィルスまたは組換え型ウィルス由来のウィル スエンベロープである、請求項 6に記載のデバイス。
[8] 前記ウイノレスエンベロープが、レトロウイノレス科、トガウイノレス科、コロナウイノレス科、フ ラビウィルス科、パラミクソウィルス科、オルトミクソウィルス科、ブニヤウィルス科、ラブ ドウィルス科、ボックスウィルス科、ヘルぺスウィルス科、バキュロウィルス科、および へパドナウィルス科力もなる群力も選択される科に属するウィルス由来である、請求 項 6に記載のデバイス。
[9] 前記ウィルスがパラミクソウィルス科に属するウィルス由来である、請求項 7に記載の デバイス。
[10] 前記ウィルスが HVJである、請求項 8に記載のデバイス。
[11] 前記ウィルスエンベロープタンパク質力 Fタンパク質、 HNタンパク質、 NPタンパク 質、およびその組み合わせ力もなる群力も選択されるタンパク質である、請求項 10に 記載のデバイス。
[12] 前記糖部分を有する界面活性剤が、式
A— (CH ) n-CH
2 3
を有し、ここで、 Aが単糖、二糖、三糖、四糖または五糖であり、 n= 7— 11である、請 求項 1に記載のデバイス。
[13] Aが単糖、または二糖である、請求項 12に記載のデバイス。
[14] Aが二糖である、請求項 13に記載のデバイス。
[15] Aがダルコシド基、またはマルトシド基である、請求項 13に記載のデバイス。
[16] Aがマルトシド基である、請求項 15に記載のデバイス。
[17] n= 9— 11である、請求項 12に記載のデバイス。
[18] n= 9である、請求項 17に記載のデバイス。
[19] 前記糖部分を有する界面活性剤が、ォクチルマルトシド、デシルマルトシド、ドデシル マルトシド、オタチルダリコシド、デシルダルコシド、およびドデシルダルコシド、ならび にこれらの混合物力もなる群力も選択される界面活性剤である、請求項 1に記載のデ バイス。
[20] 前記糖部分を有する界面活性剤が、デシルマルトシドである、請求項 19に記載のデ バイス。
[21] 前記糖部分を有する界面活性剤の濃度が、 0. 0001容量％以上、 CMC未満である
、請求項 1に記載のデバイス。
[22] 前記界面活性剤の濃度が、 0. 0009容量％— 0. 28容量％である、請求項 21に記 載のデバイス。
[23] さらに、（5)硫酸プロタミン溶液を含有し、ここで、該硫酸プロタミン溶液が前記固相 上に配置される、請求項 1に記載のデバイス。
[24] さらに、（5)ポリエチレンイミンを含有し、ここで、該ポリエチレンィミンが前記固相上に 配置される、請求項 1に記載のデバイス。
[25] 前記ポリエチレンィミンが直鎖型ポリエチレンィミンである、請求項 24に記載のデバイ ス。
[26] さらに、（6)安定化剤を備え、ここで、該安定化剤が前記固相上に配置される、請求 項 1に記載のデバイス。
[27] 請求項 26に記載のデバイスであって、ここで、前記安定化剤が、トレハロース、マルト ース、ラフイノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラタトース、ポリビニルピロリ ドン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マン-トール、ジメチルス ルホォキシド (DMSO)またはこれらの混合物カゝらなる群カゝら選択される、デバイス。
[28] 請求項 27に記載のデバイスであって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース、 ラフイノース、フルクトースまたはこれらの混合物力もなる群力も選択される、デバイス
[29] 請求項 28に記載のデバイスであって、前記安定化剤が、トレハロースである、デバイ ス。
[30] 前記固相が、フイブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、ポリオル-チンおよ びポリリジン、ならびにこれらの混合物からなる群力も選択されるタンパク質によってコ ートされている、請求項 1に記載のデバイス。
[31] 前記固相が、フイブロネクチンによってコートされている、請求項 30に記載のデバイ ス。
[32] 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項 1に記載のデバイス。
[33] 凍結乾燥されて!、る、請求項 1に記載のデバイス。
[34] 凍結乾燥されている、請求項 24に記載のデバイス。
[35] 凍結乾燥されている、請求項 26に記載のデバイス。
[36] 細胞に遺伝子を導入するための装置であって、以下：
(1)少なくとも 1500個のゥエルを有する物質導入デバイスを支持する手段；
(2)物質導入デバイスをインキュベートする手段；
(3)物質導入デバイスの所望のゥエルに所望の溶液を添加する手段；および
(4)遠心分離機； を備える、装置。
[37] さらに、
(5)所望のゥエルにおける、蛍光、吸光、発光、放射線および濁度力もなる群力も選 択される信号を測定する手段；
を備える請求項 36に記載の装置。
[38] 細胞に遺伝子を導入するためのキットであって、以下：
( 1)固相;
(2)ウィルスベクター；および
(3)糖部分を有する界面活性剤を含む溶液、
を備える、キット。
[39] さらに、（4)硫酸プロタミンを含む、請求項 38に記載のキット。
[40] さらに、（4)ポリエチレンイミンを含む、請求項 38に記載のキット。
[41] 前記ポリエチレンィミンが直鎖型ポリエチレンィミンである、請求項 38に記載のキット
[42] さらに、（5)安定化剤を含む、請求項 38に記載のキット。
[43] 請求項 42に記載のキットであって、ここで、前記安定化剤が、トレハロース、マルトー ス、ラフイノース、フルクトース、スクロース、グルコース、ラタトース、ポリビニルピロリド ン K90、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、グリシン、マン-トール、ジメチル スルホォキシド (DMSO)またはこれらの混合物力 なる群力 選択される、キット。
[44] 請求項 43に記載のキットであって、前記安定化剤が、トレハロース、マルトース、ラフ ィノース、フルクトースまたはこれらの混合物力 なる群力 選択される、キット。
[45] 請求項 44に記載のキットであって、前記安定化剤が、トレハロースである、キット。
[46] さらに、（6)凍結乾燥する工程を包含する、請求項 38または請求項 42に記載のキッ
PCT/JP2005/004136 2004-03-19 2005-03-09 ウイルスベクターによる固相遺伝子導入方法、その方法のための組成物、およびその方法のための装置 Ceased WO2005090585A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006519405A JPWO2005090585A1 (ja) 2004-03-19 2005-03-09 ウイルスベクターによる固相遺伝子導入方法、その方法のための組成物、およびその方法のための装置

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-081728 2004-03-19
JP2004081728 2004-03-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005090585A1 true WO2005090585A1 (ja) 2005-09-29

Family

ID=34993711

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/004136 Ceased WO2005090585A1 (ja) 2004-03-19 2005-03-09 ウイルスベクターによる固相遺伝子導入方法、その方法のための組成物、およびその方法のための装置

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2005090585A1 (ja)
WO (1) WO2005090585A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001286282A (ja) * 2000-02-02 2001-10-16 Japan Science & Technology Corp 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター
WO2003014338A1 (en) * 2001-08-02 2003-02-20 Anges Mg, Inc. Process for producing inactivated virus envelope

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001286282A (ja) * 2000-02-02 2001-10-16 Japan Science & Technology Corp 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター
WO2003014338A1 (en) * 2001-08-02 2003-02-20 Anges Mg, Inc. Process for producing inactivated virus envelope

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANEDA Y. ET AL: "Hemagglutinating virus of Japan (HVJ) envelope vector as a versatile gene delivery system", MOLECULAR THERAPY, vol. 6, no. 2, August 2002 (2002-08-01), pages 219 - 226, XP002957356 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2005090585A1 (ja) 2008-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2236378C (en) Recombinant sendai virus
JP7196104B2 (ja) 増強された改変ウイルスカプシドタンパク質
ES2349046T3 (es) Métodos para purificar virus.
KR100847385B1 (ko) 유전자 전달을 위한 바이러스 엔벨로프 벡터
EP0864645A1 (en) (-)-strand rna virus vector having autonomously replicating activity
KR102542752B1 (ko) 바이러스에 대한 무균 정제 방법
Olshevsky et al. Herpes simplex virus structural proteins
JP2005523709A (ja) インフルエンザおよびパラインフルエンザウイルスの検出のための細胞
JP2007523621A (ja) ウイルスを精製するための方法
WO2003059292A2 (en) Composition and method for maintaining non-enveloped viral vectors
CN103074305A (zh) 重组水痘－带状疱疹病毒
KR100478429B1 (ko) 핵 이행 시그널 결합 파지
WO2005090549A1 (ja) 細胞培養用マイクロウェル
WO2005090585A1 (ja) ウイルスベクターによる固相遺伝子導入方法、その方法のための組成物、およびその方法のための装置
US8765666B2 (en) Adenovirus dodecahedron particles for delivery of pharmaceutical agents
JP2002065278A (ja) Ｈｖｊの融合タンパク質を含有する遺伝子移入ビヒクル
JPWO2004046353A1 (ja) 所望の機能的性質を有する核酸の単離方法およびそのためのキット
Kordyukova et al. Filamentous versus Spherical Morphology: A Case Study of the Recombinant A/WSN/33 (H1N1) Virus
JP2013165669A (ja) 変異型逆転写酵素
RU2745307C1 (ru) Способ очистки рекомбинантного аденовируса 26 серотипа (Ad26)
CN113025631A (zh) 一种表达双报告标签的重组副流感病毒5型
US20100040580A1 (en) Freeze-dried composition of inactivated virus envelope with membrane fusion activity
ES2563678T3 (es) Ensayo de agentes extraños
Murphy et al. Characterization of human parainfluenza virus 3 recovered from persistently infected cells
Fuller et al. Nucleotide sequence of the major structural protein genes of the tick-borne, orthomyxo-like Dhori/Indian/1313/61 virus

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006519405

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase