WO2005078082A1

WO2005078082A1 - 膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブｄｎａを作成する方法、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法、及びプローブｄｎａ固定化担体

Info

Publication number: WO2005078082A1
Application number: PCT/JP2005/001914
Authority: WO
Inventors: Masaharu Seno; Ya To; Hiroshi Okamura; Kouichi Hirayama
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2004-02-13
Filing date: 2005-02-09
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2006-08-13
Also published as: JP2005224189A

Abstract

　本発明は、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を迅速かつ網羅的に検出する方法を提供することを目的とする。膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の５％以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードするエキソン配列からなり、かつシトシンおよびグアニンを合計で４０～６０％の割合で含有する該部分領域を選択し、該部分領域の塩基配列または該部分領域に相補的な塩基配列からなるＤＮＡを作成することを含む、膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブＤＮＡを作成する方法。

Description

明細書

膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブ DNAを作成する方法、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法、及びプローブ DNA固定化担体

技術分野

[0001] 本発明は、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出するためのプローブ DN Aを作成する方法、該プローブ DNAを用いて該遺伝子の発現を検出する方法、該プローブ DNAが固定ィ匕された担体ならびに該担体を用いて該遺伝子の発現を検出する方法に関する。

背景技術

[0002] 膜タンパク質は、真核細胞の全タンパク質の約 30%にも及ぶ種類があり、レセプタ一、イオンチャンネル、トランスポーターなどとして、細胞膜を介する情報伝達や物質輸送において重要な機能を担っている。膜タンパク質は、その構造から大きく 2種類に分けられる。一つは細胞膜表面に結合した表在性膜タンパク質であり、他方は細胞膜の脂質二重層に埋め込まれた内在性膜タンパク質である。内在性膜タンパク質の構造は、細胞外領域、細胞内領域および膜貫通領域から構成される。膜貫通領域は疎水性アミノ酸に富み、膜内においては α—へリックスを形成すると考えられる。膜貫通領域を複数個有するタンパク質の場合、このドメインは、膜タンパク質が生合成される際、その C末端側に続く新生ペプチド鎖の膜透過を開始させるシグナル配列、またはその透過を停止させるストップトランスファー配列として機能する。多くの場合、それぞれの機能を持ったドメインが交互に配置されており、このドメインを介して細胞外領域と細胞内領域が交互に並んでいる。

[0003] ある種の膜タンパク質は癌細胞で特異的に発現しているものがあり、これらは腫瘍抗原として各種診断薬や抗癌剤を開発するうえで有用であると考えられている。そして、様々な病気や疾患の治療に使われる薬剤のターゲットの 70%は、膜タンパク質であると言われており、膜タンパク質の発現パターンを解析することで、組織特異的な治療薬の標的を明らかにすることが期待される。 [0004] 特定のタンパク質間の相互作用を検出する方法として、免疫沈降法、ウェスタンブロッテイング法等があるが、これらの方法は網羅的な解析には不向きである。酵母 Two- Hybrid解析は網羅的な解析を行うことができるが、偽陽性、偽陰性を多く検出してしまい、真陽性、真陰性を即座に判定することが困難である (非特許文献 1)。膜タンパク質の発現を解析する方法として、膜タンパク質自体を解析する方法が考えられる。しかし、膜タンパク質は、疎水性が高いため精製が困難であるとともに、細胞膜の脂質二重層に存在するという特殊な環境下にあるため立体構造が複雑で、細胞内に存在する水溶性タンパク質に比べその発現解析が非常に困難である。 RT— PCR法やノーザンプロット法により解析する方法は、網羅的解析には不向きで、上記のように極めて多様な膜タンパク質の発現解析には不十分である。また、 cDNAマイクロアレイを用いる方法は、 cDNAの単離に時間と手間が力かるとともに、固定化する DN A量が不安定になると、う問題がある。

[0005] 非特許文献 1：竹縛忠臣ら編、バイオマニュアル UPシリーズ、タンパク質の分子間相互作用実験法、羊土社、 1996

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を迅速かつ網羅的に検出する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードするェキソン配列の少なくとも一部を含み、かつシトシンおよびグァニンを一定量含む部分領域からなる DNA、または該部分領域に相補的な DNAをプローブとして用いることにより、膜タンパク質をコードする核酸を特異的に検出できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

[0008] すなわち、本発明は以下の発明を包含する。

(1)膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40— 60%の割合で含有する該部分領域を選択し、該部分領域からなる DNAまたは該部分領域に相補的な塩基配列からなる DNAを作成することを含む、膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブ DNAを作成する方法。

(2) (1)記載の方法によって作成されたプローブ DNAと試料由来の核酸とをノ、イブリダィズさせることによって、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法

[0009] (3)膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40— 60%の割合で含有する該部分領域からなる DNA及び該部分領域に相補的な塩基配列からなる DNAから選択されるプローブ DNAが固定化されてなる担体。

[0010] (4)以下の (a)— (e)の DNAからなる群力選択されるプローブ DNAが固定化されてなるプローブ DNA固定化担体：

(a)配列番号 1一 385で表される塩基配列からなる DNA

(b)配列番号 1一 385で表される塩基配列と相補的な塩基配列力なる DNA

(c)配列番号 1一 385で表される塩基配列からなる DNAの一部を含む 10— 5000塩基の DNA

(d)配列番号 1一 385で表される塩基配列と相補的な塩基配列力なる DNAの一部を含む 10— 5000塩基の DNA

(e) (a)— (d)の DNAと相同性を有する塩基配列からなり、対応する膜タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダィズする DNA。

[0011] (5)担体が、基板上にプローブ DNAと共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体である、 (3)または (4)記載のプローブ DNA固定化担体。

(6) (3)—（5)のいずれかに記載のプローブ DNA固定ィ匕担体を用いて、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法。

[0012] (7) 以下の (a)— (e)の DNAからなる群から選択されるプローブ DNA: (a)配列番号 1一 385で表される塩基配列からなる DNA

図面の簡単な説明

[0013] [図 1]図 1は表 1に示した 385種のプローブ DNAの、担体上におけるスポット位置を示す。表 1の左 2列に示した記号が、図 1におけるスポット位置と対応している。

[図 2]図 2は実施例 1で、担体上に固定化されたプローブ DNAに、 Cy3蛍光標識した cDNAをノヽイブリダィズさせて、 FLA— 8000で蛍光画像を撮影した結果を示す。

[図 3]図 3は実施例 2で、担体上のプローブ DNAに蛍光標識した cDNAをノヽイブリダィズさせた後、 95°Cの超純水で 30分洗浄し、 FLA— 8000で蛍光画像を撮影した結果を示す。

[図 4]図 4は実施例 2で、担体上のプローブ DNAに蛍光標識した cDNAをノヽイブリダィズさせた後、 95°Cの超純水で 30分洗浄し、その後再ハイブリダィゼーシヨンを実施し、 FLA-8000で蛍光画像を撮影した結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0014] <プローブ DNAの作成 >

本発明の一態様において、プローブ DNAは、膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の通常 5%以上、好ましくは 60%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードするェキソン配列力なり、かつシトシンおよびグァニンを合計で通常 40— 60%、好ましくは 45— 55%の割合で含有する該部分領域からなる DNAである。本発明においては、該 DNAに相補的な DNAもプローブ DNAとして使用される。 [0015] 本発明において、膜タンパク質とは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、すなわち、生体膜を構成しているタンパク質を意味する。膜タンパク質としては、生体膜の表面に付着している膜表在性タンパク質、内部に埋もれている膜内在性タンパク質があり、例えば、受容体、輸送体、膜結合性酵素、サイト力イン受容体ファミリ一、イオンチャネル、細胞外マトリックスタンパク質、細胞接着因子、膜結合性細胞増殖因子、より具体的には、チロシンキナーゼ型増殖因子受容体、扁平上皮細胞癌抗原（SCCA1)、 CD34、 EGFファミリー、 EGF受容体ファミリー、 I型及び II型 TGF β受容体ファミリー、インターロイキン受容体ファミリー、 TNF受容体ファミリー、 Note hファミリー、 EGF— CFCファミリーなどが挙げられる。本発明では、好ましくは、上記のタンパク質の中でも細胞の表面の性質を特徴付ける膜タンパク質、すなわち対象となる細胞の細胞膜にぉ、て発現量の多、膜タンパク質をコードする核酸に対するプローブを作成する。

[0016] 膜結合に必須の領域とは、膜タンパク質における、該膜タンパク質と細胞膜との結合を担う領域を意味する。そのような領域としては、通常疎水性のアミノ酸で構成される膜貫通領域や、脂質を介して膜に結合する GPIアンカーが結合するアミノ酸を含む領域等が含まれるがこれらに限定されるものではない。

[0017] 膜タンパク質における膜貫通領域および GPIアンカーが結合するアミノ酸を含む領域については、既に公開されている情報力も特定することができ、あるいは公知の情報が得られない場合は、公知の予測プログラム等を用いて検索することができる。

[0018] 本発明のプローブ DNAの塩基長は、膜タンパク質をコードする核酸とハイブリダィズ可能な長さであり、通常 10— 5000塩基、好ましくは 15— 500塩基、より好ましくは 20— 100塩基、さらに好ましくは 40— 70塩基である。

本発明のプローブ DNAは、好ましくは、以下の (a)— (e)の DNA力なる群から選択される：

(a)配列番号 1一 385で表される塩基配列からなる DNA

(c)配列番号 1一 385で表される塩基配列からなる DNAの一部を含む 10— 5000塩基の DNA、より好ましくは 20— 100塩基の DNA (d)配列番号 1一 385で表される塩基配列と相補的な塩基配列力なる DNAの一部を含む 10— 5000塩基の DNA、より好ましくは 20— 100塩基の DNA

[0019] ここで DNAの一部とは、配列番号 1一 385で表される塩基配列力なる DNAにおける、少なくとも 15塩基長、より好ましくは少なくとも 20塩基長、最も好ましくは 30— 6 0塩基長の連続した塩基配列からなる部分を意味する。

[0020] DNAと相同性を有する塩基配列とは、通常約 70%以上、好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列力もなり、対応する膜タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダィズする塩基配列を意味する。膜タンパク質をコードする核酸には、 DNAおよび RNAの双方が含まれ、好ましくは cDNAである。

[0021] 特異的にハイブリダィズするとは、ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下で、膜タンパク質をコードする核酸とハイブリダィズした状態を保てることを意味する。ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件とは、例えば、ナトリウム濃度が 15— 40m M、好ましくは 15— 20mMで、温度が 50— 70°C、好ましくは 60— 65°Cの条件を示す。特に、ナトリウム濃度が 16— 17mMで温度が 65°Cの場合が最も好ましい。

[0022] <プローブ DNA固定化担体 >

本発明はまた、上記プローブ DNAが固定ィ匕されてなる担体に関する。当該プロ一ブ DNA固定ィ匕担体は、膜タンパク質の発現の検出において有用である。

[0023] プローブ DNAの担体への固定化は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。固定化するプローブ DNAやその PCR産物（DNAを PCR法によって増幅させた DNA断片）を溶媒に溶解または分散して、スポッティング溶液を調製する。このスポッティング溶液を、担体上にスポッティングした後インキュベートすることにより、プローブ DNAを担体上に固定化することができる。プローブ DNAを溶解または分散する溶媒としては、例えば、蒸留水、 SSC (saline- sodium citrate)、 PBS (phosphate buffered saline),重曹（NaHCO )など、極性有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシ

3

ド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、トリフルォロ酢酸、トリエチルァミン、 1ーメチルー 2—ピロリドン、ジォキサン、酢酸ェチルなどカゝら選ばれる 1以上の溶媒を使用できる。本発明においては、 PBSを使用するのが好ましい。

[0024] プローブ DNAの固定化には、 DNAチップ作成装置に備えられたスポッター装置を用いて、ポリ陽イオン (ポリリシン、ポリエチレンイミン等)で表面処理した担体表面にスポッティングして、 DNAの荷電を利用して担体上に静電結合させる方法が一般的に利用される。また、担体表面の処理方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤を用いる方法も利用される。この場合には、ァミノ基、アルデヒド基等は、共有結合により担体表面に導入されるため、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に担体表面に存在する。

[0025] 反応活性基を導入したプローブ DNAを合成し、表面処理した担体表面に該 DNA をスポッティグし、共有結合させることもできる。例えば、アミノ基を導入したスライドガラスに、 PDC (p—フエ-レンジイソチオシァネート）存在下、アミノ基導入 DNAを反応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド基導入 DNAを反応させる方法などがある。

[0026] スポッティングは、プローブ DNAを含むスポッティング溶液を、 96穴または 384穴等のプラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポット装置等を用いて担体上に滴下することによって行う。スポット装置としては通常は、ピンに試料溶液を保持させ、そのピンを担体表面に接触させ、そして溶液を担体表面に移行させてスポットを形成するピン方式による装置が用いられる。ピンの先端の形状には、ソリッドピンタイプ（特に、溝が切られていないもの）、タイルピンタイプ（万年筆のように溝が切られているもの）など様々なタイプがあり、いずれであっても使用することができる。好ましくは、クィルピンタイプである。また、ピン方式以外にも、インクジェットプリンタの原理を利用したインクジェット方式や、毛細管によるキヤビラリ方式などを利用したスポット装置も用いることがでさる。

[0027] スポット当たりのスポッティング溶液のスポッティング量は、当業者であれば適宜決定することができるが、通常、 lpL— 1 μ Lの範囲にあり、好ましくは lOOpL— lOOnL の範囲にある。スポットの大きさは、通常、直径が 50— 300 /z mの範囲にある。そして、スポット間の距離は、通常、 0— 1. 5mmの範囲にあり、好ましくは 100— 700 μ m の範囲にある。スポッティング後、通常、室温一 100°C、好ましくは 70— 80°Cにて、通常、 3時間以下、好ましくは 0. 5-1. 5時間インキュベートとすることが好ましい。

[0028] プローブ DNAを担体に固定化した後、固定化されていない DNA等を除去するため、担体を洗浄する。洗浄液としては、当技術分野で通常用いられているものを使用することができ、例えば、 2 X SSC、 0. 2%SDS (ドデシル硫酸ナトリウム）を含む水溶液を使用することができる。このようにして、数百一数万個のスポットを有する担体を得ることができる。

[0029] 本発明のプローブ DNA固定ィ匕担体は、通常、少なくとも 10スポット以上、好ましくは 50— 1000スポット、より好ましくは 1000— 2000スポットのプローブ DNAが固定化されている。 1種類のプローブ DNAについて、通常 1一 10スポット、好ましくは 3— 5スポットをスポッティングする。

[0030] <プローブ DNAを固定化するための担体 >

プローブ DNAを固定ィ匕する担体としては、当技術分野で通常用いられるものを使用できる。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラフアイト、カーボンファイバーに代表される炭素などの導電体材料;単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケィ素、酸化ケィ素、窒化ケィ素などに代表される半導体材料、 SOI (シリコン'オン'インシユレータ)などに代表されるこれら半導体材料の複合素材;ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミタス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料;ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素榭脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩ィ匕ビユリデン、ポリ酢酸ビュル、ポリビュルアルコール、ポリビュルァセタール、アクリル榭脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ァセタール榭脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フエノール榭脂、ユリア榭脂、エポキシ榭脂、メラミン榭脂、スチレン'アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル 'ブタジエンスチレン共重合体、ポリフエ-レンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。

[0031] 本発明においては、プローブ DNAを固定ィ匕する担体として、基板上に核酸と共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物力選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体を用いるのが好ましい。

[0032] 上記固体支持体に用いられる基板の材料としては、例えば、シリコーン、ガラス、繊維、木材、紙、セラミックス、プラスチック (例えば、ポリエステル榭脂、ポリエチレン榭脂、ポリプロピレン榭脂、 ABS榭脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene榭脂）、ナィロン、アクリル榭脂、フッ素榭脂、ポリカーボネート榭脂、ポリウレタン榭脂、メチルぺンテン樹脂、フエノール榭脂、メラミン榭脂、エポキシ榭脂、塩ィ匕ビニル榭脂)、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド (例えば、ダィャモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン；金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属;前記金属粉末、セラミック粉末等に、前記榭脂をバインダ一として混合、結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられる。

[0033] 本発明の固体支持体は、基板上に表面層を有する。この表面層により、核酸と共有結合しうる官能基を導入するための化合物を基板上に強固に固定ィ匕することができる。

[0034] 表面層は、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種カゝら形成される。ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物としては、例えば、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラフアイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたもの、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコユウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を挙げることができる。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC : Diamond Like Carbon)等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。本発明においては、軟ダイヤモンドを用いるのが好まし、。

[0035] 基板が、ダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の材料で形成されている場合は、基板上に新たに表面層を形成させる必要はないが、基板がそれ以外の材料で形成されている場合は、表面処理を施すことによりダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の材料で形成される表面層を形成させる。

[0036] 表面処理を施した基板の一例としては、スライドガラスに軟ダイヤモンドを製膜した基板が挙げられる。このような基板は、ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス 0— 9

9体積％、残りメタンガス 100— 1体積％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作成したものであることが好ま、。

[0037] 表面処理によって形成される表面層の厚みは、 lnm— 100 mであることが好ましい。

[0038] 基板への表面処理は、公知の方法、例えば、マイクロ波プラズマ CVD (Chemical Vapor Deposit)法、 ECRCVD (Electric Cyclotron Resonance Chemical Vapor Deposit)法、 ICP (Inductive Coupled Plasma)法、直流スパッタリング法、 ECR( Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、イオンプレーティング法、アークィォンプレーティング法、 EB (Electron Beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法、イオン化蒸着法、アーク蒸着法、レーザ蒸着法などにより行うことができる。

[0039] また、前記の基板材料の積層体や複合体 (例えば、ダイヤモンドと他の物質との複合体、（例えば 2相体)）を形成することにより、表面層としてもよい。

[0040] 基板の形状およびサイズは特に限定されなヽが、形状としては、平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状などが挙げられ、サイズは、平板状のものを用いる場合、通常は、幅 0. 1— 100mm、長さ 0. 1— 100mm、厚み 0. 01— 10mm程度である。

[0041] また、基板の表面または裏面に、反射層として Ti、 Au、 Pt、 Nb、 Cr、 TiC、 TiN等の単層またはこれらの複合膜を製膜してもよい。反射層の厚みは、全体に均一であることが必要なため、好ましくは 10nm以上、更に好ましくは lOOnm以上である。

[0042] 基板としてガラスを用いる場合、その表面は、 Ra (jIS B 0601)で lnm— lOOOnm の範囲で意図的に粗面化されていることも好ましい。このような粗面化表面は基板の表面積が増えて、多量のプローブ DNAを高密度で固定化できる点で好都合である

[0043] 本発明の固体支持体には、核酸を静電的に引き寄せるために静電層が設けられていてもよい。

[0044] 静電層としては、核酸を静電的に引き寄せ、核酸の固定ィ匕量を向上させるものであれば、特に制限はないが、例えば、アミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。

[0045] 前記アミノ基含有ィ匕合物としては、非置換のアミノ基 (一 NH )、または炭素数 1

2 一 6 のアルキル基等で一置換されたァミノ基 (一 NHR;Rは置換基)を有する化合物、例えばエチレンジァミン、へキサメチレンジァミン、 n—プロピルァミン、モノメチルァミン、ジメチルァミン、モノェチルァミン、ジェチルァミン、ァリルァミン、アミノアゾベンゼン、ァミノアルコール (例えば、エタノールァミン）、アタリノール、ァミノ安息香酸、アミノアントラキノン、アミノ酸（グリシン、ァラニン、ノリン、ロイシン、セリン、トレオ-ン、システィン、メチォニン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、チロシン、プロリン、シスチン、グルタミン酸、ァスパラギン酸、グルタミン、ァスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、ァ二リン、またはこれらの重合体 (例えば、ポリアリルァミン、ポリリシン)や共重合体; 4, 4，， 4"—トリアミノトリフエ-ルメタン、トリアムテレン、スペルミジン、スペルミン、プトレシンなどのポリアミン（多価ァミン）が挙げられる。

[0046] 静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、例えば、表面処理する際に前記アミノ基含有化合物を製膜装置内に導入することによって、アミノ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。また、静電層を表面層と共有結合させずに形成する場合には、静電層と表面層との親和性、即ち密着性を高める点で、基板上に、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物および炭素化合物を蒸着させた後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。ここで用いる炭素化合物としては、気体として供給することができれば特に制限はな、が、例えば常温で気体であるメタン、ェタン、プロパンが好ましい。蒸着の方法としては、イオン化蒸着法が好ましぐイオンィ匕蒸着法の条件としては、作動圧が 0. 1— 50Pa、そして加速電圧が 2 00— 1000Vの範囲であることが好まし!/、。

[0047] 静電層を表面層と共有結合させて形成する場合には、例えば、表面層を有する基板に、塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し、次いで前記アミノ基含有ィ匕合物のうち、例えば、ポリアリルァミン、ポリリシン、 4, 4，， 4"—トリアミノトリフエ-ルメタン、トリアムテレン等の多価アミンを反応させて、基板と結合していない側の末端にアミノ基を導入することにより、静電層を形成することができる。

[0048] また、静電層が施された基板に核酸と共有結合しうる官能基を導入する反応 (例えば、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いるカルボキシル基の導入）を溶液中で行う場合には、基板を、前記の非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸潰した後、核酸と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。前記溶液の溶媒としては、例えば水、 N メチルピロリドン、エタノールが挙げられる。

[0049] 静電層が施された基板に、ジカルボン酸または多価カルボン酸を用いてカルボキシル基を導入する場合には、予め N—ヒドロキシスクシンイミドおよび Zまたはカルボジイミド類で活性化させたり、あるいは、反応を N—ヒドロキシスクシンイミドおよび/またはカルポジイミド類の存在下に行うことが好ましい。

[0050] 基板を、非置換または一置換されたアミノ基を有する化合物を含有する溶液中に浸漬することにより、静電層を形成する場合に、アミノ基含有化合物としてポリアリルアミンを用いると、基板との密着性に優れ、核酸の固定ィ匕量がより向上する。静電層の厚みは、 lnm— 500 mであることが好ましい。

[0051] 本発明の固体支持体は、核酸と共有結合しうる官能基を有する。該官能基は、基板表面に化学修飾を施すことにより形成することができる。

[0052] 前記官能基としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基、ハロホルミル基、水酸基、硫酸基、シァノ基、ニトロ基、チオール基、ァミノ基が挙げられる。

[0053] 官能基としてカルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式: X— R¹— COOH (式中、 Xはハロゲン原子、 R¹は炭素数 1一 12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロ口酢酸、フルォロ酢酸、ブロモ酢酸、ョード酢酸、 2—クロ口プロピオン酸、 3 クロ口プロピオン酸、 3—クロ口アクリル酸、 4 クロ口安息香酸;式: HOOC— R²— COOH (式中、 R²は単結合または炭素数 1一 12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシユウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式: R³— CO— R⁴— COOH ( 式中、 R³は水素原子または炭素数 1一 12の 2価の炭化水素基、 R⁴は炭素数 1一 12 の 2価の炭化水素基を表す。 )で示されるケト酸またはアルデヒド酸;式: X— OC— R⁵— COOH (式中、 Xはハロゲン原子、 R⁵は単結合または炭素数 1一 12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シユウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。

[0054] 前記のようにして導入されたカルボキシル基は、シアナミドゃカルポジイミド (例えば、 1— [3— (ジメチルァミノ)プロピル] 3 ェチルカルポジイミド)などの脱水縮合剤と N ーヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステルイ匕することができる。

[0055] 官能基としてハロホルミル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式: X— OC— R⁶— CO— X(式中、 Xはハロゲン原子、 R⁶は単結合または炭素数 1一 12 の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のジノ、ライド、例えばコハク酸クロリド、マロン酸クロリドが挙げられる。

[0056] 官能基として水酸基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式: HO

R⁷— COOH (式中、 R⁷は炭素数 1一 12の 2価の炭化水素基を表す。）で示されるヒドロキシ酸またはフエノール酸が挙げられる。

[0057] 官能基としてアミノ基を導入するために用いられる化合物としては、例えばアミノ酸が挙げられる。

[0058] 前記の化合物のうち、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラ力ルボン酸などの多価カルボン酸は親水性を向上させるために使用することもできる。

[0059] 担体として上記のような固体支持体を用いることにより、プローブ DNAを強固に固定ィ匕することができるため、検出感度と信頼性の高い診断が可能になる。

[0060] <膜タンパク質をコードする遺伝子の発現検出 >

本発明の膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法は、本発明のプローブ DNAと膜タンパク質をコードする核酸とのハイブリダィゼーシヨンに基づくものであれば特に制限されず、当技術分野において公知の方法を使用できる。例えば、ノーザンブロッテイング、 RNaseプロテクションアツセィ、 cDNAクローニングにおけるサザンブロッテイングやコロニー Zプラークハイブリダィゼーシヨン、マイクロアレイなどが挙げられる。

[0061] 本発明の検出方法の一実施形態では、担体上に固定ィヒされた上記プローブ DNA と、試料由来の mRNAを逆転写することにより得られる試料 cDNAとを接触させ、プローブ DNAとハイブリダィズする試料 cDNAを検出することによって、試料中の対応する膜タンパク質をコードする mRNAレベルを測定し、それによつて膜タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを検出する。

[0062] 本発明において膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出するとは、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現の有無を検出すること、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの変化を検出すること、および膜タンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを定量することの、ずれも包含する。

[0063] 試料 cDNAは、当技術分野で公知の方法によって調製できる。例えば、試料から単離された全 RNAを RTプライマーおよび適当なバッファーを含む反応混合物中に添カロする。プライマーアニーリングのためのインキュベート後、 RTバッファー、 dNTP 、 DTT、アミノアリル dUTP、 RNaseインヒビターおよび逆転写酵素をさらに添加する。 RNAの逆転写が完了するようにインキュベーション後、 RT産物を反応性標識試薬と反応させる。別法では、プライマーを標識せずに、標識ィヒ dNTPを PCR反応混合物中でインキュベートしてもよい。 PCR増幅は、従来の技術に従って、 DNAサーマルサイクラ一中で行うことができる。

[0064] 標識としては、核酸に取り込むことが可能なものであれば特に限定されないが、例えば、蛍光標識（Cy3および Cy5などの CyDye、 FITC、 RITC、ローダミン、テキサスレッド、 TET、 TAMRA、 FAM、 HEX, ROXなど）、放射能標識（ α— 32P、 y—3 2P、 35Sなど）などが挙げられる。

[0065] 試料溶液は、溶液中の核酸濃度が通常 0. 01— 100 g、好ましくは 1一 50 gとなるようにバッファーに溶解することによって調製する。この溶液を、上記で調製したプローブ DNAが固定化された担体上に滴下し、インキュベーションを行うことによりハイブリダィズさせる。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法またはそれに準じる方法、例は、 Molecular Cloning 2 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行うことができる。 [0066] 本発明の検出方法において、インキュベーションは、通常 50— 70°C、好ましくは 5 5— 65°Cで、通常 1一 20時間、好ましくは 5— 16時間で行う。最後に、担体を洗浄し、乾燥後、ハイブリダィズした核酸に由来する標識を読みとることによりハイブリダィゼーシヨンを検出することができる。

[0067] 本発明のプローブ DNA固定ィ匕担体は、試料由来の核酸とハイブリダィズさせた後、担体を洗浄することにより、一度ハイブリダィズした核酸を解離させることができ、さらに、再度核酸をハイブリダィズさせることができる。基板上に DNAと共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物から選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体を担体として用いることにより、核酸の解離およびノヽイブリダィゼーシヨン反応の再現性を向上させることができる。

[0068] ハイブリダィズした核酸の解離は、通常、室温一 100°C、好ましくは 90— 100°C、より好ましくは 95— 100°Cのナトリウム濃度が 1一 15mMの溶液で、通常 10— 60分、好ましくは 10— 40分、より好ましくは 30— 35分洗浄することにより実施できる。洗浄のための水性溶液としては、超純水、炭酸水素ナトリウム溶液、 SSC溶液、 PBS溶液等を使用することができる。本発明においては 95— 100°Cの超純水を用いて、 10— 30分洗浄を実施するのが好ま、。

実施例

[0069] (実施例 1)プローブ DNA固定化担体の作成及びハイブリダィゼーシヨンの検出

3mm角のシリコン基板にダイヤモンドライクカーボン層をコ一ティングし、アンモ- ァプラズマ処理によりアミノ基を導入し、カルボキシル基で修飾後、 N—ヒドロキシスクシンイミドで活性エステルイ匕し、プローブ DNA固定化用の担体を作成した。この担体に、マイクロアレイ用スポッター SPBIO2000 (日立ソフト）を使用して、 5pmol/ μ L に調整した 385種の 5'末端をァミノ化した 60merの DNAをプローブ DNAとしてスポットした。最終濃度 20% PEG (ポリエチレングリコール)溶液に DNA断片を 5 Mの濃度で溶解し、スポッティング溶液とした。

[0070] 担体上に固定化した 385種のプローブ DNAについて、以下の表 1に示す。遺伝子名と記載した列は、その遺伝子がコードするタンパク質の一般的名称であり、遺伝子データベースに遺伝子配列と共に登録された名称、あるいはタンパク質配列データ一ベースにそのアミノ酸配列とともに登録されている名称である。一番右の「作成方法」と記載した列に示す A— Dの記号は、プローブ DNAの作成方法を示しており、各記号が示す意味は以下のとおりである。

A:各膜タンパク質をコードする遺伝子における膜貫通領域をコードする領域力もシトシンおよびグァニンの含有率力 0— 60%の領域を選択して作成したもの

B :各膜タンパク質をコードする遺伝子における膜貫通領域をコードする領域およびその周辺の領域からシトシンおよびグァニンの含有率力 0— 60%の領域を選択して作成したもの

C :各膜タンパク質をコードする遺伝子における膜貫通領域をコードする領域を、膜貫通領域予測プログラム（TMpred, (K. Hoftnann & W. Stoffel (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374, 166) )で検索し、得られた領域からシトシンおよびグァニンの含有率が 40— 60%の領域を選択して作成したもの

D：各膜タンパク質における GPIアンカーが結合するアミノ酸を含む領域をコードする領域力シトシンおよびグァニンの含有率力 0— 60%の領域を選択して作成したもの：ポシティブコントローノレ

n：ネガティブコントローノレ

また、これらプローブ DNAの担体上におけるスポット位置を図 1に示す。

[表 1]

[0072] 4 μ gの BALBZcマウスの肝臓から抽出した PolyA+RNAから逆転写反応を行つて cDNAを合成し、 Cy3蛍光標識およびカラム精製を行った。その後、カラム溶出液 20 /z L中 16 /z Lの cDNAを使用して、 5 X SSCZ0. 5%SDS溶液をバッファーとして試料溶液を調製した。これをプローブ DNA固定ィ匕担体上に滴下し、チャンパ一内でで、 55°Cにて 16時間にわたりハイブリダィゼーシヨンを実施した。

[0073] 室温の 2 X SSC/0. 2%SDS溶液で 5分間洗浄後、 2 X SSCでリンスし、遠心乾燥した。その後、蛍光スキャナー（FLA— 8000、富士写真フィルム社）にて蛍光画像を観察した。結果を図 2に示す。 [0074] その結果、同一遺伝子でほぼ等しいシグナルが得られた。また、ハウスキーピング遺伝子のシグナルはすべて確認できた。

[0075] (実施例 2)再ノヽイブリダィゼーシヨン

実施例 1で蛍光画像を観察した後の担体を 95°Cの超純水で洗浄し (5分、 30分）、 cDNAを解離させ、再び蛍光スキャナーで蛍光画像を観察した。 30分洗浄後の結果を図 3に示す。一度ハイブリダィズした cDNAの解離が確認されたので、再び上記と同様の手順で cDNAをハイブリダィズさせ、蛍光画像を観察した。結果を図 4に示す。また、上記表 1の Rの列（右から 2番目の列）に、 2回目のハイブリダィゼーシヨンにおける蛍光強度の、 1回目のハイブリダィゼーシヨンにおける蛍光強度に対する比を示した。

[0076] 一度担体上のプローブ DNAにハイブリダィズした cDNAは、 95°Cの超純水を用い、 30分間洗浄することで、解離させることができた。再ノヽイブリダィゼーシヨンでは、バックグラウンドの上昇は観察されず、スポットシグナルのパターンの再現性も良好であつた。上記 Rの値力 0. 5以上、好ましくは 0. 5-2. 0、より好ましくは 0. 6-1. 5のプローブ DNAが特に好適であり、このようなプローブ DNAを固定化するのが好ましい産業上の利用可能性

[0077] 以上から、本発明のプローブ DNA固定化担体は、繰り返し使用することができ、コストの面力も非常に有利であることが明ら力となった。また、本発明により、膜タンパク質をコードする核酸を特異的に検出することができ、従って膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を迅速かつ網羅的に検出することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40— 60%の割合で含有する該部分領域を選択し、該部分領域からなる DNAまたは該部分領域に相補的な塩基配列カゝらなる DNAを作成することを含む、膜タンパク質をコードする核酸に対するプロ一ブ DNAを作成する方法。

[2] 請求項 1記載の方法によって作成されたプローブ DNAと試料由来の核酸とをノ、ィブリダィズさせることによって、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法。

[3] 膜タンパク質をコードする遺伝子の部分領域であって、その塩基配列の 5%以上が膜タンパク質における膜結合に必須の領域をコードする部分を含むェキソン中の配列からなり、かつシトシンおよびグァニンを合計で 40— 60%の割合で含有する該部分領域からなる DNA及び該部分領域に相補的な塩基配列からなる DNAから選択されるプローブ DNAが固定化されてなる担体。

[4] 以下の (a)— (e)の DNAからなる群力選択されるプローブ DNAが固定化されてなるプローブ DNA固定化担体：

(a)配列番号 1一 385で表される塩基配列からなる DNA

[5] 担体が、基板上にプローブ DNAと共有結合しうる官能基、ならびにダイヤモンド、軟ダイヤモンド、炭素系物質および炭化物力選ばれる少なくとも 1種の表面層を有する固体支持体である、請求項 3または 4記載のプローブ DNA固定ィ匕担体。

[6] 請求項 3— 5のいずれ力 1項記載のプローブ DNA固定化担体を用いて、膜タンパク質をコードする遺伝子の発現を検出する方法。

[7] 以下の (a)— (e)の DNAからなる群から選択されるプローブ DNA:

(a)配列番号 1一 385で表される塩基配列からなる DNA