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WO2005063979A1 - 高機能化無細胞タンパク質合成用細胞抽出物及び該抽出物の調製方法 - Google Patents

高機能化無細胞タンパク質合成用細胞抽出物及び該抽出物の調製方法 Download PDF

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Publication number
WO2005063979A1
WO2005063979A1 PCT/JP2004/018928 JP2004018928W WO2005063979A1 WO 2005063979 A1 WO2005063979 A1 WO 2005063979A1 JP 2004018928 W JP2004018928 W JP 2004018928W WO 2005063979 A1 WO2005063979 A1 WO 2005063979A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
protein synthesis
extract
cell extract
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/018928
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yaeta Endo
Tomio Ogasawara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CellFree Sciences Co Ltd
Original Assignee
CellFree Sciences Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CellFree Sciences Co Ltd filed Critical CellFree Sciences Co Ltd
Priority to JP2005516572A priority Critical patent/JPWO2005063979A1/ja
Priority to US10/596,538 priority patent/US20070141661A1/en
Publication of WO2005063979A1 publication Critical patent/WO2005063979A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a cell extract for synthesizing a highly functional cell-free protein and a method for preparing the extract.
  • the present invention relates to a highly functionalized cell extract used for cell-free protein synthesis, a method for preparing the same, and the like. More specifically, the present invention relates to a highly functionalized cell extract characterized by blocking an endogenous protein synthesis inhibition-inducing system contained in a cell extract for cell-free protein synthesis, and a method for preparing the same. is there. More specifically, the present invention relates to a method for eliminating a gene information translation inhibitory system in a cell extract for cell-free protein synthesis, characterized in that at least a sugar phosphorylation metabolism system is controlled. Background art
  • Non-patent literature l Madin, K. et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559-564 (2000)
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-236896
  • the inventors have previously removed the wheat germ extract by using a regenerated cellulose membrane having a molecular weight of about 12,000 to 14,000 danorethone and performing dialysis, whereby low molecular substances ( Removal of a small protein synthesis inhibitor) has been found to significantly enhance the protein synthesis activity of the cell extract (
  • an object of the present invention is to prepare a cell extract for cell-free protein synthesis that has been further enhanced, and the metabolic system endogenous in a conventional cell extract for wheat embryo cell-free protein synthesis is provided.
  • Inhibition and destabilization of protein-synthesizing systems involving enzymes * Biochemical confirmation of destabilization phenomena * Cell-free protein synthesis method that retains even higher functions by proving and identifying and eliminating substances involved in this Is to establish.
  • a cell extract used for cell-free protein synthesis is obtained by removing low molecules from a S-30 fraction obtained by 30,000 xg centrifugation using a molecular sieve such as Sephadex G25. is there.
  • the purpose of this procedure is to eliminate endogenous low-molecular substances whose concentrations are unknown in advance in order to optimize the concentrations of components required for protein synthesis such as ions, amino acids and nucleotides in the synthesis reaction system. This was to remove high concentration potassium acetate and calcium chloride from the homogenizing solution.
  • the inventors set up the hypothesis of the sugar phosphorylation reaction by reacting with the sugar, and determined the effects of various sugar compounds on the cell-free protein synthesis system. investigated. That is, glucose, fructose, galactose, phosphorylated glucose, phosphorylated fructose, and the like were added to a cell extract for cell-free protein synthesis that was confirmed to be highly functional by advanced purification, and the effect was examined. As a result, all sugars induced a marked decrease in ATP, and at the same time showed strong inhibition of protein synthesis. In particular, glucose, fructose, and their phosphates had very strong cell-free protein synthesis inhibitory effects.
  • the present inventors have found that 1) the presence and function of an embryo-derived glycolytic enzyme system that degrades hexoses such as glucose in the cell extract for cell-free protein synthesis, The phosphorylation of ATP-consuming sugars is catalyzed by kinases (hexokinase and glycokinase) using gnorecose generated by hydrolysis as a substrate.
  • kinases hexokinase and glycokinase
  • the present invention examines means for preparing a highly functional extract for cell-free protein synthesis on the basis of such knowledge, and achieves control of the phosphorylation metabolism system of a sugar contained in the extract for cell-free protein synthesis. Thus, the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following.
  • a method for preparing a cell extract for use in a cell-free protein synthesis means, wherein the method for eliminating a cell-derived translation inhibition mechanism is excluded.
  • removing or inactivating the glycolytic enzyme is a means for forming a complex of the glycolytic enzyme and calcium and removing the complex.
  • a cell extract used in the cell-free protein synthesis means prepared by the preparation method according to any one of Items 1-1 to 1-18.
  • a reagent kit for use in a cell-free protein synthesis system comprising the cell extract according to any one of items 19 to 21.
  • the cell extract for cell-free protein synthesis of the present invention is produced by a novel method, and its function achieves unprecedented stability and high-function cell-free protein synthesis ability.
  • the cell extract used for preparing the cell extract for cell-free protein synthesis of the present invention is not limited as long as it has a protein synthesis ability in a cell-free protein synthesis system.
  • the cell-free protein synthesis system means that a component including ribosomes, which is a protein translation device provided in a cell, is extracted from an organism, and the resulting solution is transcribed or translated. In this method, amino acids, energy sources, various ions, buffers, and other effective factors are collected and tested in vitro.
  • RNA is used as type I (this is sometimes referred to as "cell-free translation system"), DNA is used, and enzymes necessary for transcription such as RNA polymerase are further added.
  • the cell-free protein synthesis system of the present invention includes both the above-mentioned cell-free translation system and cell-free transcription Z translation system.
  • Specific examples of the cell extract used in the present invention include E. coli and plant seed germ.
  • a known extract such as a cell extract such as a heron reticulocyte and an insect-derived cell is used. These may be commercially available ones, or a method known per se, specifically, the desire to extract E.
  • coli may be determined according to Pratt, JM et aM., Transcription and Translation, Hames, 179-209, BD & Higgins, It can also be prepared according to the method described in SJ, eds, IRL Press, Oxford (1984) and the like.
  • Examples of commercially available cell extracts include E. coli-derived E. coli S30 extract system (Promega) and RTS 500 Rapid Translation System (Roche). What is derived from wheat germ, such as Reticulocyte Lysate System (Promega)? ! ⁇ 71 ⁇ : 1 ⁇ 3 (Choose ⁇ 08 manufactured by O company). Among these, it is preferable to use an embryo extract of a plant seed.
  • a plant seed a plant of the family Poaceae such as wheat, oats, rice, and corn is preferable.
  • a cell extract using a wheat germ extract is preferable.
  • a cell extract derived from silkworm or the like can be used.
  • This system is an important metabolic system in the living body, and is involved in the control of glycolysis related to energy metabolism of cells and synthesis of ribose, a nucleic acid component, and ultimately leads to inhibition of cell-free protein synthesis.
  • the metabolic system from polysaccharides to small saccharides' disaccharides and monosaccharides, and also the generation of monosaccharide ATP-mediated phosphorylation are important regulatory elements in cell-free protein synthesis. Controlling the system results in a significant improvement in the protein synthesis function of the cell extract for cell-free protein synthesis.
  • Escherichia coli and reticulocytes like higher plants such as plant tissue cells, have a universal glycolysis system involved in cell energy metabolism and synthesis of ribose, a nucleic acid component.
  • glycolysis is active in Escherichia coli and reticulocytes. Therefore, it is an important control factor in the metabolic system from polysaccharides to small saccharides' disaccharides and monosaccharides, and also in the production of phosphates via ATP of monosaccharides, and in the synthesis of cell-free proteins from Escherichia coli and egret reticulocytes. Controlling this system would result in significant improvements in protein synthesis functions.
  • the elimination of the translation control mechanism of the present invention is achieved by controlling the ATP-mediated sugar phosphorylation system.
  • the control of the ATP-mediated sugar phosphorylation system is at least as follows. This can be achieved by introducing one means.
  • Controlling the production of monosaccharides from polysaccharides refers to controlling the reaction system from monosaccharides such as starch to monosaccharides such as fructose or saccharides through the conversion of small saccharides' disaccharides into starch and continuing cell extraction. This means eliminating the production of monosaccharides. For this elimination, it is possible to achieve substantial removal of polysaccharides and small saccharides' disaccharides from cell extracts. The Alternatively, it can also be achieved by removing and inactivating glycolytic enzymes, and by adding an inhibitor.
  • the method for removing polysaccharides and small saccharides ′ disaccharides can be carried out using a method known per se, such as molecular weight fractionation, affinity chromatography, and an inorganic adsorbent treatment method.
  • examples of the polysaccharide include starch and amylose
  • examples of the small and disaccharides include sucrose and maltose.
  • a known means for purifying the glycolytic enzyme such as affinity chromatography or ion exchange chromatography using an antibody can be used.
  • a complex of glycolytic enzyme and calcium can be formed and removed by centrifugation.
  • a carrier for chromatography such as bentonite, activated carbon, silica gel, and Sephadex, and an inorganic carrier such as sea sand are used as a precipitation aid. The addition of these precipitation aids makes it possible to substantially eliminate the contamination of the supernatant fraction with precipitates after centrifugation.
  • the glycolytic enzyme include enzymes that degrade polysaccharides, small saccharides, and disaccharides such as amylase, maltase, and glycosidase.
  • Inactivation is generally performed by selecting unreacted conditions corresponding to the optimal reaction conditions such as pH and temperature of each enzyme. It can also be achieved using selected treatment times at selected temperature and / or pH conditions, taking into account general enzyme inactivation conditions and other effects on cell-free protein synthesis systems. is there.
  • Monosaccharide removal refers to the substantial elimination of monosaccharides, especially hexoses, from cell extracts.
  • hexose include gnorecose, galactose, and fructose.
  • the removal can be carried out by using molecular weight fractionation, affinity chromatography, an inorganic adsorbent treatment method or the like known per se.
  • Phosphorylated sugar removal means that monosaccharide phosphate is contaminated in an existing cell-free protein synthesis cell extract, and itself has a strong ability to inhibit cell-free protein synthesis. This means that it is substantially eliminated from the cell extract.
  • Phosphorylated sugars include, for example, gnorecose monophosphate, fructose monophosphate, galactose monophosphate, ku, noreose 1,6 diphosphate, funolectose 1,6 diphosphate, galactose 1,6 nirin Acids and the like are exemplified.
  • the removal can be carried out by using a molecular weight fractionation known per se, affinity mouth chromatography, an inorganic adsorbent treatment method, or the like.
  • Inactivation of phosphorylated saccharide means that no further phosphorylation activity of phosphorylated saccharide occurs. These inactivations can be performed by a per se known enzyme reaction or the like.
  • Controlling the production of phosphorylated saccharides from monosaccharides refers to controlling monosaccharides in cell extracts, particularly hexoses, in a system that undergoes S phosphorylation, and substantially eliminating the production of phosphorylated saccharides.
  • Means that For this purpose there are means such as substantial removal of monosaccharides, inactivation of sugar kinase, removal of sugar kinase, and / or addition of sugar kinase inhibitor. Substantial removal of the monosaccharide is as described above.
  • the inactivation of the sugar kinase is generally carried out by selecting the non-reaction conditions corresponding to the optimum reaction conditions such as the pH and temperature of each sugar kinase.
  • the selected treatment time at the selected temperature and / or pH conditions in consideration of the general inactivation conditions of each sugar kinase and the effects on other cell-free protein synthesis systems. It is. It can also be inactivated using antibodies specific to these enzymes.
  • the sugar phosphorylating enzyme is exemplified by hexokinase, specifically, dalcokinase, fructokinase and the like.
  • Control of sugar phosphorylation can also be achieved by enzymatically and / or chemically modifying the sugar phosphorylation sites and modifying them. For example, there is a method of oxidizing the OH group at the 6-position of glucose using glucose oxidase.
  • the best cell extract of the present invention is a wheat germ extract from which endosperm components of wheat seeds and metabolites such as gnorecose, which have an effect of inhibiting protein synthesis in germinal tissue cells, are substantially removed. Therefore, a method for preparing a raw material will be described below using this as an example.
  • the germ portion is very small, and thus it is preferable to remove the portion other than the germ as much as possible in order to obtain the germ efficiently.
  • a mechanical force is applied to plant seeds to obtain a mixture containing embryos, crushed endosperm, and crushed seed coat, and from the mixture, the crushed endosperm, crushed seed coat, etc. are removed to obtain a crude germ image. (A mixture containing germ as a main component, crushed endosperm and crushed seed coat).
  • the force applied to the plant seed only needs to be strong enough to separate the embryo from the plant seed.
  • a plant seed is pulverized using a known pulverizer to obtain a mixture containing a germ, a crushed endosperm, and a crushed seed coat.
  • Pulverization of plant seeds can be performed using a known pulverizing apparatus. It is preferable to use a pulverizing apparatus such as a pin mill, a hammer mill, or the like, which can reduce the impact force on an object to be pulverized.
  • the degree of pulverization may be appropriately selected according to the size of the plant seed germ to be used.For example, in the case of wheat seeds, the pulverization is usually performed to a maximum length of 4 mm or less, preferably a maximum length of 2 mm or less. I do. Further, the pulverization is preferably performed in a dry manner.
  • a crude embryo fraction is obtained from the obtained plant seed crushed product using a generally known classification device, for example, a sieve.
  • a crude embryo fraction having a mesh size of 0.5 mm 2. Omm, preferably 0.7 mm to 1.4 mm is usually obtained.
  • seed coat, endosperm, dust and the like contained in the obtained crude germ fraction may be removed by using wind power or electrostatic force.
  • a crude embryo fraction can also be obtained by a method utilizing the difference in specific gravity between the embryo, the seed coat and the endosperm, for example, by heavy liquid sorting. To obtain a crude embryo fraction containing more embryos, a plurality of the above methods may be combined. Further, embryos are selected from the obtained crude embryo fraction using, for example, visual inspection or a color sorter.
  • the embryo fraction thus obtained may have endosperm components attached thereto, it is usually preferable to further carry out a washing treatment to purify the embryo normally.
  • the embryo fraction is dispersed and suspended in water or an aqueous solution, usually cooled to 10 ° C or less, preferably 4 ° C or less, specifically, an aqueous solution containing a surfactant as an aqueous solution. It is preferable to wash until no longer occurs.
  • the embryo fraction is dispersed and suspended in an aqueous solution containing a surfactant at a temperature of usually 10 ° C. or less, preferably 4 ° C. or less, and washing is performed until the washing solution does not become cloudy.
  • a nonionic surfactant can be widely used as long as it is a preferred nonionic surfactant.
  • preferable examples include polyoxyethylene derivatives such as bridge (Brij), triton (Triton), nonidet (Nonidet) P40, and Tween.
  • HNoni det) P40 is the most suitable.
  • These nonionic surfactants can be used at a concentration sufficient to remove the endosperm component and do not adversely affect the protein synthesis activity of the germ component.
  • the nonionic surfactant can be used at a concentration of 0.5%.
  • the washing treatment with water or an aqueous solution or the washing treatment with a surfactant may be either one of the washing treatments or both. Further, these cleaning treatments may be performed in combination with the ultrasonic treatment.
  • an intact (having germinating) embryo obtained by selecting and rinsing a plant embryo from a milled product obtained by milling a plant seed as described above, After fragmentation (in the presence of an extraction solvent), the obtained wheat germ extract is separated and further purified to obtain a wheat germ extract for cell-free protein synthesis.
  • a buffer an aqueous solution containing a potassium ion, a magnesium ion and / or a thiol group antioxidant can be used. Further, if necessary, potassium ion, L-type amino acid and the like may be further added.
  • a solution (HEPES—K ⁇ H, potassium acetate, magnesium acetate, calcium chloride, a solution containing L-type amino acid and / or dithiothreitol) obtained by partially modifying the method of n et al. can be used as an extraction solvent.
  • the composition and concentration of each component in the extraction solvent are known per se, and those used in the method for producing a wheat germ extract for cell-free protein synthesis may be used.
  • the embryo is mixed with an extraction solvent in an amount necessary for extraction, and the embryo is subdivided in the presence of the extraction solvent.
  • the amount of the extraction solvent is usually 0.1 ml or more, preferably 0.5 ml or more, more preferably 1 ml or more, based on the embryo lg before washing.
  • the upper limit of the amount of the extraction solvent is not particularly limited, it is usually 10 ml or less, preferably 5 ml or less, based on the embryo lg before washing.
  • Embryos to be subdivided may be those that have been frozen as in the past, those that have not been frozen, or those that have not been frozen, but those that have not been frozen. More preferred.
  • fragmentation by impact or cutting refers to the destruction of cell nuclei, mitochondria, chloroplasts, and other organelles (onoreganella), cell membranes and cell walls of plant embryos by conventional grinding or crushing. This means destroying plant germs under conditions that can be minimized.
  • the apparatus and method that can be used for subdivision are not particularly limited as long as the above conditions are satisfied.
  • an apparatus having a high-speed rotating blade such as a Warlinda blender.
  • the rotational speed of the blade is usually 1000 i "pm or more, preferably ⁇ 5000 rpm, and usually 30,000 i" pm or less, and preferably ⁇ 25,000 m or less.
  • the rotation time of the blade is usually 5 seconds or more, preferably 10 seconds or more.
  • the upper limit of the rotation time is not particularly limited, but is usually 10 minutes or less, preferably 5 minutes or less.
  • the temperature at which the crushing is performed is preferably within a range where the operation can be performed at 10 ° C or less, and particularly preferably about 4 ° C.
  • RNA and ribosomes By subdividing the embryo by impact or cutting in this way, at least a part of the embryo, which does not destroy all the cell nuclei and cell walls, remains without being destroyed. Immediately Since organelles such as cell nuclei of embryos, cell membranes and cell walls are not unnecessarily destroyed, DNA and lipids contained in them are less contaminated with impurities. The ability to efficiently generate high purity RNA and ribosomes from embryos with high purity.
  • the step of grinding the conventional plant germ and the step of mixing the crushed plant germ and the extraction solvent to obtain a wheat germ extract can be performed simultaneously as one step, so that the efficiency is improved.
  • a wheat germ extract can be obtained.
  • the above method may be hereinafter referred to as “Blender method”.
  • Such subdivision of the plant germ, particularly subdivision by impact or cutting, is preferably performed in the presence of an extraction solvent, but the extraction solvent may be added after the subdivision.
  • the wheat germ extract can be obtained by collecting the wheat germ extract by centrifugation or the like and purifying it by gel filtration or the like.
  • the gel filtration can be performed, for example, using a gel filtration device which has been equilibrated with an appropriate solution in advance.
  • the composition and concentration of each component in the gel filtration solution are known per se, and are used for the production of wheat germ extracts for cell-free protein synthesis (eg, HEPES-K ⁇ H, potassium acetate, magnesium acetate). , Dithiothreitol or a solvent containing an L-amino acid).
  • the cell extract thus obtained has extremely reduced RNase activity and phosphatase activity.
  • Microorganisms particularly spores such as filamentous fungi, may be mixed in the liquid containing the embryo extract after gel filtration, and it is preferable to exclude these microorganisms. It is important to prevent microbial growth, especially during long-term (1 day or more) cell-free protein synthesis reactions.
  • the means for eliminating microorganisms is not particularly limited, but it is preferable to use a filtration sterilization filter.
  • the pore size of the filter is not particularly limited as long as it can remove microorganisms that may be contaminated, but it is usually 0.11 micrometer, preferably 0.2-0.5 micrometer. Appropriate.
  • the spore size of a small class of Bacillus subtilis is 0.5 ⁇ 1 ⁇
  • the use of a 0.20 micrometer filter eg, Minisart TM from Sartorius
  • This is also effective.
  • a pore size filter that can remove potential microorganisms.
  • the cell extract obtained in this manner is a substance that suppresses the protein synthesis function contained in or retained by the wheat germ itself as a raw material (such as mRNA, tRNA, tritin, thionin, ribonuclease, etc.). Substances that act on translation protein factors and ribosomes to suppress their functions) have been almost completely removed. That is, the endosperm where these inhibitors are localized is almost completely removed and purified. The degree of endosperm removal can be evaluated by monitoring the activity of tritin contaminating the wheat germ extract, ie, the activity of deadeninating ribosomes.
  • the ribosome is not substantially deadenylated, it is determined that there is no contaminating endosperm-derived component in the embryo extract, that is, the endosperm has been almost completely removed and purified.
  • the degree to which the ribosome is not substantially deadenylated means that the ribosome has a deadenination rate of less than 7%, preferably 1% or less.
  • the present invention further provides a sugar, a phosphorylated sugar, a sugar-phosphorylating enzyme, for the above-mentioned "control of the phosphorylation system via ATP of the sugar”.
  • the outline of the treatment process is as follows.
  • the embryo extract of the raw material is centrifuged at 20,000 to 40,000 G, preferably 2.5 to 35,000 G, and more preferably 30,000 G to obtain a centrifuged supernatant.
  • an inorganic carrier as a precipitation aid in order to separate the precipitate and the supernatant.
  • the precipitate contains a complex of calcium such as an enzyme such as glycosidase. Eliminating glycosidases helps minimize the production of gnorecose from starch.
  • Suitable inorganic carriers include bentonite, activated carbon, silica gel, sea sand and the like. The introduction of the inorganic carrier can almost completely prevent the precipitate from being mixed into the supernatant.
  • the precipitation aid is not added during centrifugation, an insoluble slurry exists above the precipitate, and the S-30 fraction containing the insoluble slurry has low protein synthesis activity in the prepared extract. Therefore, when collecting the S-30 fraction from the centrifuge tube after centrifugation, extreme care must be taken to avoid contamination.
  • the resulting centrifuged supernatant is used as a translation reaction solution by exchanging the solution by gel filtration or adding necessary components, and then subjected to molecular weight fractionation with a molecular weight cut of 10 kDa to remove the low molecular weight fraction.
  • a substance having a molecular weight of 10 kDa or more can be fractionated and recovered.
  • This fractionation process is performed a plurality of times, and in particular, it is preferable to substantially remove substances having a molecular weight of 10 kDa or less.
  • the specific number of times is 110 times, preferably 29 times, more preferably 3-8 times, and most preferably 417 times.
  • the cell extract prepared in this manner has substantially reduced sugars and phosphorylated sugars to 6 mM or less (as the concentration of gnorecose in the extract having an absorbance at 260 nm of 200 D / ml).
  • the extract obtained by reducing the concentration of gnorecose obtained by force has an unprecedentedly high cell-free protein synthesis ability.
  • the cell extract of the present invention in which the phosphorylation system of ATP-mediated sugar in cells is controlled (ie, the translational inhibition mechanism in cells is eliminated) is as described above.
  • the above-prepared product can be used as it is, or even if such removal has not been completely performed, it will be the same as above if any one of the above-mentioned various inhibiting means and inactivating means has been applied. High cell-free protein synthesis ability can be achieved.
  • the cell extract of the present invention in which the phosphorylation system of the sugar via ATP is controlled also includes a cell extract into which at least one means selected from the following is introduced. Specific examples of these means are as described above.
  • the cell extract thus prepared provides an unprecedented high efficiency cell-free protein synthesis method, and the use of a cell-free protein synthesis system using this cell extract is It achieves high usefulness as various analysis and screening methods. Furthermore, a reagent kit for use in a cell-free protein synthesis system containing the cell extract provided by the present invention. Achieves a protein synthesis effect, a conventional means of cell-free protein synthesis
  • the translation reaction solution is prepared by adding components necessary for protein synthesis to the cell extract-containing solution prepared as described above.
  • the cell extract is passed through a Sephadex G25 column equilibrated with a solution containing the components necessary for protein synthesis, thereby replacing the eluted solution with the translation reaction solution.
  • the components required for protein synthesis include nuclease inhibitors, various ions, amino acids serving as substrates, energy sources, etc. (hereinafter, these may be referred to as “translation reaction solution additives”) and translation type I.
  • a stabilizing agent containing at least one component selected from the group consisting of inositol, trehalose, mannitol and sucrose-epichlorohydrin copolymer, if desired.
  • concentration of each component to be added can be achieved by a known mixing ratio.
  • Examples of the translation reaction solution additive include amino acids serving as substrates, energy sources, various ions, buffers, ATP regeneration systems, nuclease inhibitors, tRNAs, reducing agents, polyethylene glycol, 3 ', 5'- cAMP, folate, antibacterial agents and the like. Further, it is preferable to add the respective concentrations so that ATP contains 100 ⁇ -0.5 mM, GTP contains 25 ⁇ -lmM, and 20 kinds of amino acids each contain 25 / iM-5 mM. These can be appropriately selected and used in combination according to the translation reaction system.
  • RNA polymerase a region encoding a protein that can be synthesized in a cell-free protein synthesis system is linked to a sequence recognized by an appropriate RNA polymerase and downstream of a sequence having a function of activating translation. Any structure having the structure described above is acceptable.
  • the sequence recognized by RNA polymerase is the T3 or T7 RNA polymerase promoter And the like.
  • a sequence having a structure in which an ⁇ sequence, an E01 sequence (SEQ ID NO: 136 described in WO03Z056009) or the like is linked to the 5 ′ upstream side of a coding sequence is preferably used as a sequence for enhancing translation activity in a cell-free protein synthesis system.
  • the seeds of Hokkaido wheat or Ehime seeds were added to a mill (Fritsch: Rotor Speed Mill pulverisettel type 4) at a rate of 100 g per minute, and the seeds were gently ground at a rotation speed of 8,000 m.
  • This color sorter is a means for irradiating the crude germ fraction with light, a means for detecting reflected light and Z or transmitted light from the crude germ fraction, a means for comparing the detected value with a reference value, and a means for deviating from the reference value.
  • This is a device having a means for selectively removing a product within a reference value.
  • the crude embryo fraction was supplied so that Do and 1000 to 5000 grains ZCM 2 on beige belt color sorter, detects reflected light by irradiating light in a fluorescent lamp to the crude embryo fraction on the belt .
  • the conveying speed of the belt was 50 m / min.
  • a monochrome CCD line sensor (2048 pixels) was used as the light receiving sensor.
  • a reference value was set between the brightness of the embryo and the brightness of the seed coat, and those that deviated from the reference value were removed by suction.
  • a reference value was set between the brightness of the embryo and the brightness of the endosperm, and those deviating from the reference value were removed by suction.
  • Suction was performed using 30 suction nozzles placed at a position of about 1 cm above the conveyor belt (one suction nozzle per 1 cm length). By repeating this method, embryos were selected until the purity of the embryos (weight ratio of embryos contained per lg of any sample) reached 98% or more.
  • the obtained wheat germ fraction was suspended in distilled water at 4 ° C, and washed using an ultrasonic washing machine until the washing solution did not become cloudy. Next, it was suspended in a 0.5% by volume solution of Nonidet (Nonidet: manufactured by Nakarai 'Tester Co., Ltd.) P40, and washed with an ultrasonic washing machine until the washing solution did not become cloudy to obtain wheat germ.
  • Nonidet Nonidet: manufactured by Nakarai 'Tester Co., Ltd.
  • the components required for translation are added to the embryo extract and adjusted, and the translation reaction solution (30 mM
  • HEPES-KOH pH7.8, 100 mM potassium acetate, 2.7 mM magnesium acetate, 1.2 mM ATP, 19 kinds of L-type amino acids excluding 0.25mM GTP, 0.4mM splenoremidine, 16mM creatine phosphate, 40 ⁇ g / ml creatine kinase, 4mM dithiothreitol, and 0.3mM leucine, 0.005% sodium azide did.
  • the concentration of the embryo extract should be 40
  • mRNA (0.32 mg / ml) encoding dihydrofolate reductase (DHFR) and 14 C-leucine were added to the translation reaction solution, and protein synthesis was performed at 26 ° C. by a batch method. Protein synthesis was determined by measuring the incorporation of radioactivity into the acid-insoluble fraction of 14 C-labeled leucine as follows: spot 5 microliters of the reaction onto 3 MM Whatman filter paper and 10% ice After immersing in cold TCA (trichloroacetic acid) for 1 hour, the mixture was boiled in 5% TCA solution for 10 minutes. Remove the filter and remove TCA and water with ethanol / ether (50:50 volume). After drying, measure the radioactivity incorporated in the insoluble TCA fraction with a liquid scintillation counter (toluene scintillator). did.
  • TCA trihydrofolate reductase
  • Figure 1A shows the effect of the precipitation aid.
  • ⁇ indicates the amount of protein synthesized when the S-30 fraction prepared by a conventional method without using a precipitation aid was used.
  • Hata shows the amount of protein synthesized when the S-30 fraction prepared using sea sand as a precipitation aid was used.
  • Co-precipitation of insolubles during centrifugation using sea sand increased protein synthesis activity by 20-30% ( Figure 1A). That is, in the centrifugation in the absence of sea sand, it was considered that S-30 recovered from the supernatant was contaminated with a precipitate that inhibited protein synthesis. It was found that this effect can be replaced by a swelling of commercially available Cephadex particles (G25), not just sea sand, as long as it is a substance that shows a coprecipitation effect (Hata: Kore, black circle).
  • the protein synthesis reaction solution (containing the extract and other components required for protein synthesis other than mRNA, each containing the optimal concentration) prepared using the precipitation aid was centrifuged with an Amicon Penoletra centrifuge with a molecular weight of 10,000 cuts. By passing through a filter (Amicon Ultra-15 centrifugal filter device, 15 ml, 10K NMWL, manufactured by Millipore), a protein synthesis solution from which low molecular weight substances up to 10,000 daltons were further excluded was prepared. This filtration process was repeated six times. This protein synthesis solution is hereinafter referred to as a highly functionalized protein synthesis solution.
  • TLC thin layer chromatography
  • Figure 2A From the developed position (RF value) of the simultaneously developed standard, glucose, glucose 1_phosphate (or a mixture with glucose 6_phosphate), fructose phosphate (fructose 6-phosphate) , Sucrose, galactose, and a yellow substance (Y in FIG.
  • the extract filtered through the Amicon Ultra membrane maintains protein synthesis for at least 3 hours, as shown in Figure 1B, but the sucrose and gnorecose derived from the filtrate are retained.
  • the protein synthesis ability was already reduced one hour after the reaction, and the reaction was stopped after 2 hours. As a result, the yield of the synthetic product was reduced.
  • the presence of raffinose, sucrose, glucose, and phosphorylated saccharide in the filtrate detected in FIG. 2A was identified and confirmed by nuclear magnetic resonance measurement.
  • the total gnorecose concentration was 3 mM, of which the free glucose concentration was 0.4 mM, making it possible to produce an extract for wheat germ cell-free protein synthesis maintaining the same performance as when Amicon Ultra membrane was used. It was shown that it could be done.
  • the S-30 fraction which was subjected to gel filtration using a Sephadex G25 column, was further concentrated six times in the same manner as described above using a Vivaflow concentration membrane, and the total concentration, total aldhexose, and aldpentose were determined. Elimination effect was confirmed. That is, the total glucose concentration was 0.6 mM, and the free glucose concentration was 0.3 mM.
  • protein synthesis was performed in accordance with the method described in Example 1 under the conditions where the concentration of the extract was 40 OD260 nm, and the synthetic activities were compared.
  • the protein synthesis activity was determined by measuring the radioactivity of 14 C per 5 microliters of the reaction solution incorporated into the hot acid-insoluble fraction after 3 hours of reaction.
  • the concentration of dalcos in the extract was reduced with the gel filtration operation, and the protein synthesis activity was correspondingly increased, and at the same time, an extremely stable protein synthesis reaction solution could be produced. .
  • FIG. 3B shows the result of the reaction to which glucose was added.
  • a reaction in which commercially available D-dalcoose was added with ImM (together with the internal glucose, the final concentration was 1.082 mM)
  • almost all ATP in the reaction solution was consumed after 1 hour. (Fig. 3B, ⁇ )
  • L-glucose ImM about 50% of ATP remained as in the case without the sugar (Fig. 3B, small).
  • FIG. 2C shows that data are not shown, the increase in AMP / ADP concentration corresponding to the decrease in ATP concentration was confirmed as a spot on the thin-layer chromatographic plate.
  • FIG. 1 (A) is a view showing the effect of adding a precipitation aid during centrifugation when preparing an S-30 fraction.
  • ⁇ _ ⁇ is S-30 obtained without adding a precipitation aid.
  • ⁇ - ⁇ (Small) is the protein synthesis activity value of S-30 obtained by adding Sephadex G25 particles swollen with the extract as a precipitation aid.
  • (B) shows that an extract having high activity can be obtained by filtration with an Amicon Ultra membrane.
  • ⁇ - ⁇ S-30 prepared using sea sand as a sedimentation aid, applied to Sephadex G25, and then filtered six times with Amicon Ultra membrane, ⁇ _ ⁇ is the sample after filtration with Amicon Ultra membrane This is the value of protein synthesis activity obtained by adding an equivalent amount of the filtrate that has been concentrated to 1%.
  • ⁇ - ⁇ Sugar-free (control), KI-NADA: Glucose added, INA-MINA: Sucrose added.
  • C A diagram showing the protein synthesis inhibitory effect of a standard sugar molecular species. Final concentration, 0.5mM each, Large size: L-glucose, Qin small size: Phosphoenolpyruvate, Medium: Hatanore: Pinolevic acid, A—A: D-glucose, Mouth: Fructose , ⁇ — ⁇ : Galatatose, * — *: Sucrose, ⁇ _ ⁇ Small: Glucose—6-Phosphate, and the activity value when protein synthesis was performed by adding 3 mM glucose.
  • ⁇ _ ⁇ Control experiment without added sugar.
  • ⁇ _ ⁇ Large Activity value of protein synthesis by cell extract pre-incubated in the presence of 0.5 mM D-glucose.
  • FIG. 3 is a view showing a decrease in ATP concentration accompanying the metabolism of gnorecose during a protein synthesis reaction.
  • A The time course of the glucose concentration in the presence ( ⁇ _ ⁇ ) or absence ( ⁇ -) of creatine kinase, and the concentration at the start of the reaction was 0.082 mM (100%).
  • B is a diagram showing a change in ATP concentration accompanying a normal protein synthesis reaction (including creatine kinase).
  • Yuna-Qindai No addition of gnorecose (normal protein synthesis reaction), ⁇ _ ⁇ : ImM added Q to commercially available D-glucose, Qin_una: Results of addition of lmM non-metabolizable L-glucose Show.
  • AMP and GMP show that they do not inhibit wheat germ cell-free protein synthesis reaction. Hata-Large: control experiment, small-scale: AMP (0.5mM) and GMP (0.25m)

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Abstract

　本発明の課題は、さらなる高機能化した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物を調製することであり、これまでの各種無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中に存在する阻害・不安定性物質の特定と排除を達成することである。 　無細胞タンパク質合成手段に使用する細胞抽出物の調製法であって、細胞抽出物に存在する糖のＡＴＰを介するリン酸化系が制御されていることを特徴とする細胞抽出物の調製方法。特に、制御が以下から選ばれる少なくとも一の手段が導入される； 　１）単糖類の除去、 　２）リン酸化糖の除去、 　３）多糖類から単糖類の生成の制御、 　４）単糖類からリン酸化糖の生成の制御。

Description

明 細 書
高機能化無細胞タンパク質合成用細胞抽出物及び該抽出物の調製方法 技術分野
[0001] 本出願は、参照によりここに援用されるところ、 日本特許出願番号 2003-434080から の優先権を請求する。
本発明は、無細胞タンパク質合成に用いられる高機能化された細胞抽出物、およ びその調製方法等に関するものである。詳しくは、無細胞タンパク質合成用細胞抽 出物に含まれる細胞内因性のタンパク質合成阻害誘導系を遮断することを特徴とす る高機能化された細胞抽出物、およびその調製方法等に関するものである。さらに詳 しくは、少なくとも糖のリン酸化代謝系が制御されることを特徴とする無細胞タンパク 質合成用細胞抽出物中の遺伝子情報翻訳阻害系の排除方法に関するものである。 背景技術
[0002] 無細胞タンパク質合成系については、すり潰した細胞液にタンパク質合成能が残 存することが 40年前に報告されて以来、種々の方法が開発され、大腸菌、コムギ胚 芽、ゥサギ網状赤血球由来、昆虫由来の細胞抽出物はタンパク質合成等に現在も 広く利用されている。無細胞系における翻訳速度は in vivoとほぼ同等で、 10ぺプ チド結合 Z秒であり高速性および翻訳の正確性にも優れた反応特性を発揮するもの の、いずれの無細胞系においても合成持続時間が短ぐ得られる収量は反応容量 1 ml当り数 z g乃至数十 z gで生細胞の 1Z100から 1/1000程度と極端に低ぐタン パク質の合成法としては実用的でな力、つた。
[0003] 従来の無細胞タンパク質合成系の最大の欠点は、合成効率がきわめて低いことで あるが、この原因について正面から研究されたことはな力 た。細胞を物理的に破砕 し、人工の緩衝液で調製した細胞抽出物中の活性が低レ、のは生化学分野ではごく 常識のことであったからである。
[0004] 先に発明者らは、これまでのリボソーム不活性化毒素の研究から得た知見をもとに 、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系に見られる極端なタンパク質 合成活性の低下現象が対病原微生物防御機構として本来細胞にプログラムされた 自己リボソームの不活性化機構 (細胞自殺機構）のスィッチが、胚芽破砕が引き金と なって起動することに起因することを明らかにしている。そして、胚芽の単離操作中に 混入する、トリチン活性、チォニン活性、 RNA分解酵素活性、 DNA分解酵素活性や、 タンパク質分解酵素活性などの種子胚乳局在性のタンパク質合成阻害因子群を胚 芽組織力 排除する新規方法で調製したコムギ胚芽抽出液のタンパク質合成反応が 長時間に渡って高いタンパク質合成特性を発揮するようになることを実証した (非特 許文献 1) (特許文献 1)。
[0005] 非特許文献 l : Madin， K. et al. ， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 97, 559—56 4 (2000)
特許文献 1：特開 2000 - 236896号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] し力、しながら、上記方法により調製されたコムギ胚芽抽出液においても、 3万 gの遠 心上清画分 (S-30)中には、胚芽組織細胞内因性の解糖系などの代謝経路や翻訳 反応制御機構が存在するものと考えられる。これまでその現象と生化学的実態は知 られていないが、無細胞タンパク質合成反応時にそれらの反応経路が作動し、これ に伴ってタンパク質合成反応が負の影響を受け、その結果必ずしも十分な合成収量 が得られないことが推測される。すなわち、内因性の代謝経路の起動やこれに連動 する翻訳反応制御機構の存在を証明し、これを遮断することによって、既に開発に成 功しているコムギ胚芽無細胞タンパク質合成法の特性をさらに向上させることが期待 できる。
また、従来の無細胞タンパク質合成用細胞抽出物は、タンパク質合成に必要なアミ ノ酸、エネルギー源やイオン等を含む溶液を添加すると内因性因子の作用によるた め力、その保存性に問題が生じていた。そのため細胞抽出物とエネルギー源等を含 む溶液は別々に提供されており、実験者はそれらを実験の都度に翻訳铸型とともに 混合する必要があった。またその操作は低温で行う必要があること等から実験操作 全体が煩雑となり、しばしばタンパク質合成の失敗の原因となっていた。さらにこのよ うな無細胞タンパク質合成反応用試薬の提供方法は、多数の遺伝子からのタンパク 質の網羅的合成には不向きであり、将来のロボットィ匕に向けてこのような煩雑さといつ た欠点は解消しなければならない最大の課題であった。
さらに、発明者らは、先にコムギ胚芽抽出液を排除分子量 12, 000— 14, 000ダ ノレトン程度の再生セルロース膜を用レ、、透析を行うことによって、該抽出液から低分 子物質 (低分子タンパク質合成阻害物質と称することがある）を取り除いたところ、該 細胞抽出物のタンパク質合成活性が著しく促進されることを見出している（
WO03/064672号公報）。このことは、上記における推論を支持するものと思われる。
[0007] 以上により、本発明の課題は、さらなる高機能化した無細胞タンパク質合成用細胞 抽出物を調製することであり、従来のコムギ胚芽無細胞タンパク質合成用細胞抽出 物中に内在する代謝系酵素の関与するタンパク質合成系の阻害 ·不安定化現象を 生化学的に確認 *証明し、これに関与する物質の特定と排除を達成することによって 、さらなる高機能を保持した無細胞タンパク質合成法を確立することである。
課題を解決するための手段
[0008] 無細胞タンパク質合成用に用いられる細胞抽出物は、 3万 xg遠心によって得られる S-30画分からセフアデックス G25などの分子篩によって低分子を排除したものを利 用することが一般的である。この操作の目的は、合成反応系におけるイオン、アミノ酸 やヌクレオチド等のタンパク質合成に必要な成分の濃度を至適化するために、あらか じめそれら濃度不明の内因性低分子物質を排除することと、ホモゲナイズ溶液由来 の高濃度酢酸カリウムや塩化カルシウムを除くためであった。発明者は、このような方 法で得られた従来の細胞抽出物中には、まだ内因性のタンパク質合成阻害物質が 含まれていると考えた。そこで、従来法で得られた細胞抽出物から、さらに限外ろ過 膜を用いて 1万ダルトンまでの低分子量物質を徹底的に排除した。低分子物質が徹 底的に排除された無細胞タンパク質合成用細胞抽出物は、高いタンパク質合成能を 発揮した。さらに、限外ろ過膜処理におけるろ液を、高機能化された無細胞タンパク 質合成用細胞抽出物に当量添加するとタンパク質合成の阻害と不安定化現象が生 じた。発明者は、このこと力 、従来の無細胞タンパク質合成用細胞抽出物には、タ ンパク質合成を阻害する内因性阻害物質が存在することを、確認した。
[0009] この内因性阻害物質の同定のために、限外ろ過膜処理におけるろ液を薄層クロマ トグラフィー展開したところ、ラフイノース、ショ糖とグルコースの混合物、及びキシロー スを特定した。そして、当該阻害物質を含有する画分は、特にグルコース含量の高い ことを見出した。このうちグノレコースおよびショ糖力 無細胞タンパク質合成用細胞抽 出物への添加によって、強いタンパク質合成の阻害と不安定化現象をもたらすことを 確認した。
カロえて、発明者らは、無細胞タンパク質合成系における ATPの著しい低下現象に 着目し、その糖との反応による糖リン酸化反応仮説を立て、各種糖化合物の無細胞 タンパク質合成系への影響を検討した。つまり、高度精製によって、高機能が確認さ れた無細胞タンパク質合成用細胞抽出物にグルコース、フルクトース、ガラクトース、 リン酸化グルコース、リン酸化フルクトース等を添カ卩し、その影響を検討した。その結 果、いずれの糖においても ATPの著しい低下現象を誘発し、同時に強いタンパク質 合成阻害を示した。特に、グルコース、フルクトース、及びこれらのリン酸化物はきわ めて強力な無細胞タンパク質合成阻害作用を有した。一方、生体酵素が認識'代謝 できなレ、光学異性体である L型グノレコースの添加実験にぉレ、ては、 ATP低下とタンパ ク質合成の阻害、および翻訳反応系の不安定化の現象は全く生じなかった。
そして、本発明者らは、 1)無細胞タンパク質合成用細胞抽出物中にグルコース等 の六炭糖を分解する胚芽由来の解糖系酵素系が存在 ·機能していること、 2)澱粉の 加水分解によって生じるグノレコースを基質として、リン酸化酵素（へキソキナーゼ、グ ルコキナーゼ）の触媒作用によって、 ATPを消費する糖のリン酸化がおこること、 3)胚 芽抽出液中に存在する高濃度の基質グルコースとの反応によって、クレアチンリン酸 'クレアチンキナーゼによる ATP再生系の能力を上回る ATPが大量に消費され、タン パク質合成反応系内の著しい ATP濃度の低下状態がきたされること、 4) ATPの消費 に伴って生じる AMPひいては GTPの再生停止に伴う GMP濃度の上昇（つまり副生成 物）がタンパク質合成阻害をもたらすのではなぐ ATPの濃度低下が引き金となって、 タンパク質合成負制御系が起動し、いずれかのタンパク質合成反応因子が不活性化 され、タンパク質合成阻害と合成系の不安定化に至ること、などを実験的に確証した 。最近、植物においても翻訳反応開始因子（eIF2)のアルファサブユニットのリン酸化 反応と、これを触媒するリン酸化酵素 (pPKR)による生理的な翻訳反応制御（阻害） 機構が報告された（j.Biol.Chem. vol.271 4539-4544 (1996)、 Biochemistry vol.39 7521-7530 (2000))。この発明において見出された ATPを介した、グルコースなど糖 類における、解糖系酵素によるリン酸化→ATP濃度低下→蛋白質合成反応の阻害 の現象と、 pPKRによる eIF2のリン酸化機作が密接に関係している可能性も考えられ る。本発明は、このような知見を基礎として高機能な無細胞タンパク質合成用抽出物 の調製手段を検討し、無細胞タンパク質合成用抽出物に内在する糖のリン酸化代謝 系の制御を達成することで本発明を完成した。
すなわち本発明は以下よりなる。
「1.無細胞タンパク質合成手段に使用する細胞抽出物の調製法であって、細胞由 来の翻訳阻害機構を排除することを特徴とする細胞抽出物の調製方法。
2.細胞由来の翻訳阻害機構の排除が、 ATPを介する糖のリン酸化系の制御によ るものである、前項 1に記載の調製方法。
3.細胞由来の翻訳阻害機構が、胚芽細胞内因性のタンパク質合成阻害誘導系で ある前項 1又は 2に記載の調製方法。
4.細胞抽出物の原料が、混入する胚乳成分および低分子タンパク質合成阻害物 質が実質的に除去されたコムギ胚芽抽出物である前項 1一 3に記載のいずれか 1の 調製方法。
5.細胞抽出物の原料が、大腸菌抽出物、ゥサギ網状赤血球抽出物、又は昆虫由 来細胞抽出物である前項 1又は 2に記載の調製方法。
6. ATPを介する糖のリン酸化系の制御力 S、以下から選ばれる少なくとも一の手段 の導入である前項 2に記載の調製方法。
1)単糖類の除去、
2)リン酸化糖の除去、
3)多糖類から単糖類の生成の制御、
4)単糖類からリン酸化糖の生成の制御。
7.単糖類の除去における単糖類が、六炭糖である前項 6に記載の調製方法。
8.リン酸化糖の除去におけるリン酸化糖力 グルコース 1リン酸、フルクトース 1リン 酸、ガラクトース 1リン酸、グノレ ース 1 , 6二リン酸、フノレクトース 1 , 6二リン酸、ガラタト ース 1 , 6二リン酸から選ばれる少なくとも 1である前項 6に記載の調製方法。
9.単糖類及び/又はリン酸化糖の除去が、ゲルろ過及び/又は限外ろ過膜によ る分子量分画排除である前項 6に記載の調製方法。
10.ゲルろ過及び/又は限外ろ過膜による分子量分画排除を複数回繰り返すこと を特徴とする前項 9に記載の調製方法。
11.多糖類から単糖類の生成の制御力 澱粉からグノレコースの生成の制御である 前項 6に記載の調製方法。
12.多糖類から単糖類の生成の制御が、以下から選ばれる少なくとも一の手段の 導入である前項 11に記載の調製方法。
1)糖分解酵素の除去又は不活化、
2)多糖類及び Z又は小糖類'二糖類の排除、
3)糖分解酵素阻害剤の添加。
13.糖分解酵素の除去又は不活化が、糖分解酵素とカルシウムとの複合体を形成 させ、該複合体を除去する手段である前項 12に記載の調製方法。
14.沈殿助剤として、ベントナイト、活性炭素、シリカゲル、セフアデッタス、海砂から 選ばれる少なくとも 1を細胞抽出物に添加して、細胞由来の糖分解酵素を除去する 手段を導入することを特徴とする細胞抽出物の調製方法。
15.単糖類からリン酸化糖の生成の制御力 以下から選ばれる少なくとも一の手段 の導入である前項 6に記載の方法。
1)糖リン酸化酵素の阻害剤の導入、
2)糖リン酸化酵素の除去又は不活化、
3)六炭糖の酵素的分解による糖代謝系経路からの排除、
4)六炭糖の化学的'酵素学的修飾による糖リン酸化酵素反応の阻害、
5)糖類のリン酸化部位にリン酸基が結合できないように、酵素的及び/又は化学 的に改変及び Z又は修飾されている。
16.六炭糖が、グノレコースである前項 7に記載の調製方法。
17.細胞抽出物濃度が 200〇D260nmにおレ、て、細胞抽出物中のグルコース濃 度が 10mM以下である前項 16に記載の調製方法。 18.細胞抽出物濃度が 200 OD260nmにおレヽて、細胞抽出物中のグルコース濃 度が 6mM以下である前項 16に記載の調製方法。
19.前項 1一 18のいずれ力 1に記載の調製方法によって調製された無細胞タンパ ク質合成手段に使用する細胞抽出物。
20.無細胞タンパク質合成手段に使用する細胞抽出物であって、 ATPを介する糖 のリン酸化系が制御されている細胞抽出物。
21. ATPを介する糖のリン酸化系の制御が、以下から選ばれる少なくとも一の手段 の導入である前項 20に記載の細胞抽出物。
1)実質的にリン酸化糖が除去又は不活化されている、
2)実質的に多糖類、小糖類 ·二糖類、及び単糖類が除去されている、
3)実質的に糖分解酵素が除去又は不活化されている、
4)糖分解酵素阻害剤が添加されている、
5)実質的にリン酸化酵素が除去又は不活化されている、
6)リン酸化酵素阻害剤が添加されている、
7)糖類のリン酸化部位にリン酸基が結合できないように、酵素的及び/又は化学 的に改変及び/又は修飾されている。
22.前項 19一 21の何れか一に記載の細胞抽出物による無細胞タンパク質合成方 法。
23.前項 19一 21の何れか一に記載の細胞抽出物を使用する無細胞タンパク質合 成系の利用。
24.前項 19一 21の何れか一に記載の細胞抽出物を含む無細胞タンパク質合成 系に使用する試薬キット。」
発明の効果
[0011] 本発明の無細胞タンパク質合成用の細胞抽出物は、新規な方法で生産され、その 機能は従来にない安定性と高機能の無細胞タンパク質合成能を達成した。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明の無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の調製に用いられる細胞抽出物とし ては、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成能を有するものであれば如 何なるものであってもよレ、。ここで、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内に備わるタ ンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分を生物体から抽出し、この抽出液に 転写、または翻訳铸型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝 液、およびその他の有効因子をカ卩えて試験管内で行う方法である。このうち、铸型と して RNAを用レ、るもの（これを以下「無細胞翻訳系」と称することがある）と、 DNAを 用レ、、 RNAポリメラーゼ等転写に必要な酵素をさらに添加して反応を行うもの（これ を以下「無細胞転写 Z翻訳系」と称すること力 Sある）がある。本発明における無細胞タ ンパク質合成系は、上記の無細胞翻訳系、無細胞転写 Z翻訳系のいずれをも含む 本発明に用いられる細胞抽出物として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ゥ サギ網状赤血球、昆虫由来細胞等の細胞抽出物等の既知のものが用いられる。これ らは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽 出欲は、 Pratt, J. M. et a丄. , Transcription and Translation, Hames, 179 -209, B. D. &Higgins, S. J. , eds, IRL Press, Oxford (1984)に記載の方 法等に準じて調製することもできる。
市販の細胞抽出物としては、大腸菌由来のものは、 E. coli S30 extract syste m (Promega社製）と RTS 500 Rapid Translation System (Roche社製）等 が挙げられ、ゥサギ網状赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyte Lysate Sys tem (Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものは？!^71^：1〇3 (丁〇¥08 O社製)等が挙げられる。このうち、植物種子の胚芽抽出液を用いることが好ましぐ 植物種子としては、コムギ、ォォムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物のものが好まし レ、。本発明の細胞抽出物としては、このうちコムギ胚芽抽出液を用いたものが好適で ある。また、昆虫由来細胞では、カイコ由来等の細胞抽出液を用いることができる。
[0013] コムギ胚芽抽出液の作製法としては、例えば Johnston, F. B. et al. , Nature, 179, 160— 161 (1957)、あるレヽは Erickson, A. H. et al.， (1996) Meth. In Enzymol. , 96, 38—50等に記載の方法を用いることができる。
[0014] 本発明では、このような既知の無細胞タンパク質合成用細胞抽出物から、従来法で は確認できず除去できなかった無細胞タンパク質合成の阻害系を排除する。つまり、 従来はコムギ種子胚乳由来の夾雑物の排除をその原理 ·手段としていた。しかし本 法は、胚芽組織細胞中に内在する酵素群の機能と翻訳反応の負制御に関する機能 すなわち胚芽細胞内因性のタンパク質合成阻害誘導系を遮断することにあり、抽出 物に共存する糖の ATPを介するリン酸化系が制御されていることを特徴とする。この 系は、生体内における重要な代謝系であり、細胞のエネルギー代謝や核酸成分であ るリボース合成に関わる解糖系の制御と複雑にからみあい最終的に無細胞タンパク 質合成の阻害へと導くものであった。つまり、多糖類から、小糖類'二糖類、単糖類へ の代謝系とさらに単糖類の ATPを介するリン酸化物の生成が、無細胞タンパク質合 成における重要なる制御要素であることを見出し、この系を制御することが無細胞タ ンパク質合成用細胞抽出物のタンパク質合成機能の大幅な改良をもたらす。
さらには、大腸菌、網状赤血球でも、植物組織細胞のような高等植物同様に、細胞 のエネルギー代謝や核酸成分であるリボース合成に関わる解糖系の存在は普遍的 である。特に大腸菌、網状赤血球では解糖系が活発である。よって、多糖類から、小 糖類'二糖類、単糖類への代謝系とさらに単糖類の ATPを介するリン酸化物の生成 、大腸菌 ·ゥサギ網状赤血球由来無細胞タンパク質合成における重要な制御要素 であり、この系を制御することがタンパク質合成機能の大幅な改良をもたらすと考えら れる。
[0015] 本発明の、翻訳制御機構を排除するとは、 ATPを介する糖のリン酸化系を制御す ることによって達成され、 ATPを介する糖のリン酸化系が制御するとは、以下のような 少なくとも 1の手段を導入することで達成できる。
1)多糖類から単糖類の生成の制御、
2)単糖類の除去、
3)リン酸化糖の除去、
4)単糖類からリン酸化糖の生成の制御。
[0016] 多糖類から単糖類の生成の制御とは、多糖類であるスターチから小糖類'二糖類を へてグノレコース、或いは果糖等の単糖類への反応系をコントロールし、細胞抽出物 が継続的に単糖類を作り出すことを排除することを意味する。この排除のためには、 細胞抽出物から多糖類及び小糖類 '二糖類の実質的な除去を達成すれば可能であ る。あるいは、糖分解酵素の除去、不活化、さらには阻害剤の添カ卩によっても達成可 能である。
多糖類及び小糖類'二糖類の除去方法は、自体公知の分子量分画、ァフィ二ティ 一クロマトグラフィー、無機吸着体処理法などを利用しておこなうことが可能である。こ こで、多糖類は、澱粉、アミロース等が例示され、また小糖類 ·二糖類は、ショ糖、麦 芽糖等が例示される。
糖分解酵素の除去には、抗体を使った自体公知のァフィ二ティークロマトグラフィー 、イオン交換クロマトグラフィー等の公知の糖分解酵素の精製手段が利用できる。ま た、糖分解酵素とカルシウムの複合体を形成させ、遠心によって除去することも出来 る。遠心に際しては、沈殿助剤として、ベントナイト、活性炭素、シリカゲル、セフアデ ックスなどのクロマトグラフィー用担体、海砂等の無機担体をカ卩える。これらの沈殿助 剤の添加により、遠心後に、上清画分への沈殿物の混入を実質的に排除することが 可能となる。沈殿助剤を遠心時に加えない場合は、沈殿物の上部に不溶性スラリー が存在し、これが混入した S-30画分力も調製した抽出液のタンパク質合成活性は低 くなる。そこで、遠心後の遠心管からの S-30画分の回収に当たっては混入を避ける ために細心の注意が必要となる。ここで、糖分解酵素とは、アミラーゼ、マルターゼ、 グリコシダーゼ等の多糖類、小糖類.二糖類を分解する酵素が例示される。
不活化には、一般的には各酵素の pH、温度等の反応至適条件に対応する不反応 条件の選択によって行われる。また、酵素の一般的な失活条件とその他の無細胞タ ンパク質合成系への影響を考慮し選択された温度及び/又は pHの条件における選 択された処理時間を用いることで達成可能である。
糖分解酵素の阻害剤は広く公知の物質が適用可能である。その添加量は、実験的 繰り返しによって、糖分解酵素の阻害には有効であるが、その他の無細胞タンパク質 合成系への影響は無視できる条件が選定される。
単糖類の除去とは、細胞抽出物から単糖類特に六炭糖類を実質的に排除すること を意味する。六炭糖としては、グノレコース、ガラクトース、及びフルクトース等が例示さ れる。その除去は、自体公知の分子量分画、ァフィ二ティークロマトグラフィー、無機 吸着体処理法などを利用しておこなうことが可能である。 [0018] リン酸化糖の除去とは、単糖類のリン酸化物が既存の無細胞タンパク質合成用細 胞抽出物中に夾雑しており、そのもの自体が強力な無細胞タンパク質合成の阻害能 を有することを見出したことから、細胞抽出物からこれを実質的に排除することを意味 する。リン酸化糖としては、例えばグノレコース 1リン酸、フルクトース 1リン酸、ガラクトー ス 1リン酸、ク、、ノレ ース 1， 6二リン酸、フノレクトース 1， 6二リン酸、ガラクトース 1， 6ニリ ン酸等が例示される。その除去は、自体公知の分子量分画、ァフィ二ティーク口マト グラフィー、無機吸着体処理法などを利用しておこなうことが可能である。
単糖類、リン酸化糖の除去は、一般的に無細胞タンパク質合成用細胞抽出物の調 製時に用いられているセフアデックス G25などの分子篩によって、ある程度排除する こと力 S出来る。しかし、より効率的に単糖類、リン酸化糖を除去するためには、さらに ゲルろ過、限外ろ過膜などによる徹底した分画を行うことが望ましぐ例として、分子 量 1万カットのアミコンゥノレトラ遠心ろ過器（Amicon Ultra- 15 centrifugal filter device, 15 ml, 10K NMWL, MILLIPORE社製）による低分子の分画が挙げられる。さらには、 この分画操作を複数回繰り返すことが望ましい。複数回の具体的回数としては、 1一 10回、好ましくは 2— 9回、さらに好ましくは 3— 8回、最も好ましくは 4一 7回である。 また、リン酸化糖の不活化とは、リン酸化糖のさらなるリン酸化活性が起こらないこと を意味する。これらの不活化は、 自体公知の酵素反応等によって行うことができる。
[0019] 単糖類からリン酸化糖の生成の制御とは、細胞抽出物中での単糖類特に六炭糖類 力 Sリン酸化を受ける系を制御し、リン酸化糖の生成を実質的に排除することを意味す る。そのためには、単糖類の実質的除去、糖リン酸化酵素の不活化、糖リン酸化酵素 の除去、及び/又は糖リン酸化酵素阻害剤の添加等の手段がある。単糖類の実質 的除去は、上記のとおりである。糖リン酸化酵素の不活化には、一般的には各糖リン 酸化酵素の pH、温度等の反応至適条件に対応する不反応条件の選択によって行 われる。また、各糖リン酸化酵素の一般的な失活条件とその他の無細胞タンパク質 合成系への影響を考慮し選択された温度及び/又は pHの条件における選択された 処理時間を用いることで達成可能である。また、これらの酵素に特異的な抗体を用い て不活化することもできる。
各糖リン酸化酵素の阻害剤は広く公知の物質が適用可能である。その添加量は、 実験的繰り返しによって、各糖リン酸化酵素の阻害には有効である力 その他の無細 胞タンパク質合成系への影響は無視できる条件が選定される。ここで、糖リン酸化酵 素としては、へキソキナーゼが例示され、具体的にはダルコキナーゼ、フルクトキナー ゼ等である。
糖のリン酸化の制御は、糖のリン酸化部位を酵素的及び/又は化学的に修飾、並 びにそれらを改変することによつても達成することができる。例えば、グルコースォキ シダーゼを用いてグルコースの 6位の OH基を酸化する方法などが挙げられる。
[0020] 本発明の最良の細胞抽出物は、コムギ種子の胚乳成分や胚芽組織細胞中のタン パク質合成阻害効果をもたらすグノレコースなどの代謝物質が実質的に除去されたコ ムギ胚芽抽出物であるので、これを例にとって原料の調製方法を以下説明する。
[0021] 通常、胚芽の部分は非常に小さいので胚芽を効率的に取得するためには胚芽以 外の部分をできるだけ除去しておくことが好ましい。通常、まず植物種子に機械的な 力をカ卩えることにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む混合物を得、該混合物 から、胚乳破砕物、種皮破砕物等を取り除いて粗胚芽画分 (胚芽を主成分とし、胚乳 破砕物、種皮破砕物を含む混合物）を得る。植物種子に加える力は、植物種子から 胚芽を分離することができる程度の強さであればよい。具体的には、公知の粉碎装 置を用いて、植物種子を粉碎することにより、胚芽、胚乳破砕物、種皮破砕物を含む 混合物を得る。
植物種子の粉碎は、通常公知の粉碎装置を用いて行うことができる力 ピンミル、 ハンマーミル等の被粉砕物に対して衝撃力をカ卩えるタイプの粉碎装置を用いることが 好ましい。粉砕の程度は、使用する植物種子胚芽の大きさに応じて適宜選択すれば よいが、例えばコムギ種子の場合は、通常、最大長さ 4mm以下、好ましくは最大長さ 2mm以下の大きさに粉砕する。また、粉砕は乾式で行うのが好ましい。
次いで、得られた植物種子粉砕物から、通常公知の分級装置、例えば、篩を用い て粗胚芽画分を取得する。例えば、コムギ種子の場合、通常、メッシュサイズ 0. 5m m 2. Omm、好ましくは 0. 7mm— 1. 4mmの粗胚芽画分を取得する。さらに、必 要に応じて、得られた粗胚芽画分に含まれる種皮、胚乳、ゴミ等を風力、静電気力を 利用して除去してもよい。 また、胚芽と種皮、胚乳の比重の違いを利用する方法、例えば重液選別により、粗 胚芽画分を得ることもできる。より多くの胚芽を含有する粗胚芽画分を得るために、上 記の方法を複数組み合わせてもよい。さらに、得られた粗胚芽画分から、例えば目視 や色彩選別機等を用いて胚芽を選別する。
[0022] このようにして得られた胚芽画分は、胚乳成分が付着している場合があるため、通 常胚芽純化のために更に洗浄処理することが好ましい。洗浄処理としては、通常 10 °C以下、好ましくは 4°C以下に冷却した水または水溶液、具体的に水溶液として界面 活性剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散 '懸濁させ、洗浄液が白濁しなくなるま で洗浄することが好ましい。また、通常 10°C以下、好ましくは 4°C以下で、界面活性 剤を含有する水溶液に胚芽画分を分散'懸濁させて、洗浄液が白濁しなくなるまで 洗浄することがより好ましい。界面活性剤としては、非イオン性のものが好ましぐ非ィ オン性界面活性剤であるかぎりは、広く利用ができる。具体的には、例えば、好適な ものとして、ポリオキシエチレン誘導体であるブリッジ（Brij)、トリトン (Triton)、ノニデ ット（Nonidet) P40、ツイーン (Tween)等が例示される。なかでも、ノニデッ HNoni det) P40が最適である。これらの非イオン性界面活性剤は、胚乳成分の除去に十分 且つ胚芽成分のタンパク質合成活性に悪影響を及ぼさない濃度で使用され得るが、 例えば 0. 5%の濃度で使用することができる。水もしくは水溶液による洗浄処理又は 界面活性剤による洗浄処理は、どちらか一方の洗浄処理でもよいし、両方実施しても よい。また、これらの洗浄処理は、超音波処理と組み合わせて実施してもよい。
[0023] 本発明においては、上記のように植物種子を粉碎して得られた粉碎物から植物胚 芽を選別した後洗浄して得られた無傷 (発芽能を有する）の胚芽を (好ましくは抽出 溶媒の存在下に)細分化した後、得られるコムギ胚芽抽出液を分離し、更に精製する ことにより無細胞タンパク質合成用コムギ胚芽抽出液を得る。
[0024] 抽出溶媒としては、緩衝液、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよび/またはチ オール基の酸化防止剤を含む水溶液を用いることができる。また、必要に応じて、力 ノレシゥムイオン、 L型アミノ酸等をさらに添カ卩してもよレ、。例えば、 N_2_ヒドロキシェ チルピペラジン— Nし 2_エタンスルホン酸（HEPES) _KOH、酢酸カリウム、酢酸マ グネシゥム、 L型アミノ酸および Zまたはジチオスレィトールを含む溶液や、 Patterso nらの方法を一部改変した溶液（HEPES— K〇H、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、 塩化カルシウム、 L型アミノ酸および/またはジチオスレィトールを含む溶液）を抽出 溶媒として使用することができる。抽出溶媒中の各成分の組成 ·濃度はそれ自体既 知であり、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを 採用すればよい。
胚芽と抽出に必要な量の抽出溶媒とを混合し、抽出溶媒の存在下に胚芽を細分化 する。抽出溶媒の量は、洗浄前の胚芽 lgに対して、通常 0. 1ミリリットル以上、好まし くは 0. 5ミリリットル以上、より好ましくは 1ミリリットル以上である。抽出溶媒量の上限は 特に限定されないが、通常、洗浄前の胚芽 lgに対して、 10ミリリットル以下、好ましく は 5ミリリットル以下である。また、細分化しようとする胚芽は従来のように凍結させたも のを用いてもよいし、凍結させていなレ、ものを用いてもょレ、が、凍結させていないもの を用いるのがより好ましい。
細分化の方法としては、摩砕、圧砕等粉碎方法として従来公知の方法を採用する ことができるが、本発明者が開発した衝撃または切断により胚芽を細分化する方法（ WO03/064671号公報）が好ましい。ここで、「衝撃または切断により細分化する」 とは、植物胚芽の細胞核、ミトコンドリア、葉緑体等の細胞小器官 (オノレガネラ）、細胞 膜や細胞壁等の破壊を、従来の摩砕または圧砕と比べて最小限に止めうる条件で 植物胚芽を破壊することを意味する。
細分化する際に用いることのできる装置や方法としては、上記条件を満たすもので あれば特に限定されないが、例えば、ワーリンダブレンダ一のような高速回転する刃 状物を有する装置を用いることが好ましい。刃状物の回転数は、通常 1000i"pm以上 、好まし <は 5000rpm以上であり、また、通常 30000i"pm以下、好まし <は 25000卬 m以下である。刃状物の回転時間は、通常 5秒以上、好ましくは 10秒以上である。回 転時間の上限は特に限定されないが、通常 10分以下、好ましくは 5分以下である。 細分化する際の温度は、好ましくは 10°C以下で操作が可能な範囲内、特に好ましく は 4°C程度が適当である。
このように衝撃または切断により胚芽を細分化することにより、胚芽の細胞核や細胞 壁を全て破壊してしまうのではなぐ少なくともその一部は破壊されることなく残る。即 ち、胚芽の細胞核等の細胞小器官、細胞膜や細胞壁が必要以上に破壊されることが ないため、それらに含まれる DNAや脂質等の不純物の混入が少なぐ細胞質に局 在するタンパク質合成に必要な RNAやリボソーム等を高純度で効率的に胚芽から 由出すること力 Sできる。
このような方法によれば、従来の植物胚芽を粉砕する工程と粉砕された植物胚芽と 抽出溶媒とを混合してコムギ胚芽抽出液を得る工程とを同時に一つの工程として行う ことができるため効率的にコムギ胚芽抽出液を得ることができる。上記の方法を、以 下「ブレンダ一法」と称することがある。
このような植物胚芽の細分化、特に衝撃または切断による細分化は、抽出溶媒の 存在下に行うことが好ましいが、細分化した後に抽出溶媒を添加することもできる。
[0026] 次いで、遠心分離等によりコムギ胚芽抽出液を回収し、ゲルろ過等により精製する ことによりコムギ胚芽抽出液を得ることができる。ゲルろ過としては、例えば予め適当 な溶液で平衡化してぉレ、たゲルろ過装置を用いて行うことができる。ゲルろ過溶液中 の各成分の組成 ·濃度はそれ自体既知であり、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚 芽抽出液の製造法に用いられるもの（例えば、 HEPES— K〇H、酢酸カリウム、酢酸 マグネシウム、ジチオスレィトールまたは L型アミノ酸を含む溶媒）を採用すればよい。 好ましくはこのようにして得られた細胞抽出物は、 RNase活性およびホスファターゼ 活十生が極めて低減されたものである。
[0027] ゲルろ過後の胚芽抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌 (力ビ)などの胞子が混 入していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましい。特に長期（1日以 上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これ を阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、ろ過滅菌 フィルターを用いるのが好ましレ、。フィルターのポアサイズとしては、混入の可能性の ある微生物が除去可能なものであれば特に制限はなレ、が、通常 0. 1 1マイクロメ一 ター、好ましくは 0. 2-0. 5マイクロメーターが適当である。ちなみに、小さな部類の 枯草菌の胞子のサイズは 0. 5 μ πιχ1 μ ΐηであること力、ら、 0. 20マイクロメーターのフ ィルター（例えば Sartorius製の Minisart™等）を用いるのが胞子の除去にも有効で ある。ろ過に際して、まずポアサイズの大きめのフィルターでろ過し、次に混入の可能 性のある微生物が除去可能であるポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが好ま しい。
[0028] このようにして得られた細胞抽出物は、原料であるコムギ胚芽自身が含有するまた は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チォニン、リボヌクレア一 ゼ等の、 mRNA、 tRNA、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を 抑制する物質） 、ほぼ完全に取り除かれている。すなわち、これらの阻害物質が局 在する胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。胚乳の除去の程度は、コムギ 胚芽抽出物中に夾雑するトリチンの活性、すなわちリボソームを脱アデニン化する活 性をモニターすることにより評価できる。リボソームが実質的に脱アデニン化されてい なければ、胚芽抽出物中に夾雑する胚乳由来成分がない、すなわち胚乳がほぼ完 全に取り除かれ純化されていると判断される。リボソームが実質的に脱アデニン化さ れていない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が 7%未満、好ましくは 1%以下に なっていることをいう。
[0029] このような胚芽抽出物を原料にして、本発明では、さらに上記の「糖の ATPを介す るリン酸化系の制御」のために糖、リン酸化糖、糖のリン酸化酵素、糖分解酵素等が 制御された無細胞タンパク質合成用の細胞抽出物調製のための処理を行う。処理工 程の概要は以下である。
原料の胚芽抽出液を 2— 4万 G、好ましくは 2. 5— 3. 5万 G、さらに好ましくは 3万 G の遠心分離で遠心上清を取得する。この際、沈殿助剤として無機担体をいれておく ことは、沈殿物と上清の分離のためにより好ましい。この沈殿物中には、グリコシダー ゼなどの酵素とカルシウムの複合体が含まれている。グリコシダーゼをあら力じめ除い ておくことは、澱粉からグノレコースの生成を最小限に抑えることに役立つ。好適な無 機担体としては、ベントナイト、活性炭素、シリカゲル、海砂等が例示される。この無機 担体の導入により、沈殿物が上清へ混入することをほぼ完全に防ぐことが出来る。沈 殿助剤を遠心時に加えない場合は、沈殿物の上部に不溶性スラリーが存在し、これ が混入した S-30画分力 調製した抽出液のタンパク質合成活性は低くなる。そこで 、遠心後の遠心管からの S-30画分の回収に当たっては混入を避けるために細心の 注意が必要となる。 得られた遠心上清を、ゲルろ過による溶液の交換あるいは必要成分の添加などに より翻訳反応液としたものを、分子量 lOkDaカットで分子量分画し、低分子画分を排 除する。あるいは、分子量 lOkDa以上の物質を分子量分画し、回収することも可能 である。この分画処理は複数回行レ、、特に分子量 lOkDa以下の物質を実質的に除 去することが好ましレ、。複数回の具体的回数としては、 1一 10回、好ましくは 2 9回 、さらに好ましくは 3— 8回、最も好ましくは 4一 7回である。このように調製された細胞 抽出物は、実質的に糖、リン酸化糖が 6mM以下まで低減されている（260nmにおけ る吸光度 200 〇D/mlの抽出液中のグノレコース濃度として）。力べして得られたグノレコ ース濃度が低減された抽出液は、従来にない高い無細胞タンパク質合成能を保有し ている。
[0030] 本発明の、細胞に内在する糖の ATPを介するリン酸化系が制御されている（すな わち細胞に内在する翻訳阻害機構が排除されている）細胞抽出物としては、このよう に調製されたものはそのまま利用できるが、あるいはこのような除去が完全におこな われていなくとも、上記の各種の阻害手段、不活化手段のいずれか 1の手段が施さ れていれば従来にない高い無細胞タンパク質合成能を達成できる。
本発明の糖の ATPを介するリン酸化系の制御がされた細胞抽出物としては、少な くとも以下から選ばれる一の手段が導入されている細胞抽出物をも対象とする。それ らの手段の具体例は上述のとおりである、
1)実質的にリン酸化糖が除去又は不活化されている、
2)実質的に多糖類、小糖類'二糖類、及び単糖類が除去されている、
3)実質的に糖分解酵素が除去又は不活化されている、
4)糖分解酵素阻害剤が添加されている、
5)実質的にリン酸化酵素が除去又は不活化されている、
6)リン酸化酵素阻害剤が添加されている。
[0031] このようにして調製された細胞抽出物は、従来にない高い効率の無細胞タンパク質 合成方法を提供するものであり、また、この細胞抽出物を使用する無細胞タンパク質 合成系の利用は、各種分析、スクリーニング法として高い有用性を達成する。さらに、 本発明で提供される細胞抽出物を含む無細胞タンパク質合成系に使用する試薬キ ットは、無細胞タンパク質合成手段として従来になレ、タンパク質合成効果を達成する
[0032] 以上のように調製された細胞抽出物含有液に、タンパク質合成に必要な成分を添 加して、翻訳反応液を調整する。あるいは細胞抽出物を、タンパク質合成に必要な 成分を含む溶液で平衡ィ匕したセフアデックス G25カラムに通すことによって、溶出溶 液から翻訳反応液に置換する。タンパク質合成に必要な成分とは、核酸分解酵素阻 害剤、各種イオン、基質となるアミノ酸、エネルギー源等 (以下、これらを「翻訳反応溶 液添加物」と称することがある）及び翻訳錡型となる特定タンパク質をコードする mRN A、加えて所望によりイノシトール、トレハロース、マンニトールおよびスクロースーェピ クロロヒドリン共重合体からなる群から選択される少なくとも 1種の成分を含有する安 定化剤などである。各成分の添加濃度は、自体公知の配合比で達成可能である。
[0033] 翻訳反応溶液添加物として、具体的には、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種 イオン、緩衝液、 ATP再生系、核酸分解酵素阻害剤、 tRNA、還元剤、ポリエチレン グリコール、 3', 5 '— cAMP、葉酸塩、抗菌剤等が挙げられる。また、それぞれの濃度 は、 ATPとしては 100 β Μ— 0· 5mM、 GTPは 25 μ Μ— lmM、 20種類のアミノ酸 としてはそれぞれ 25 /i M— 5mM含まれるように添加することが好ましい。これらは、 翻訳反応系に応じて適宜選択して組み合わせて用いることができる。具体的には、 細胞抽出物含有液としてコムギ胚芽抽出液を用いた場合には、 30mM HEPES-KOH (pH7. 8)、 lOOmM酢酸カリウム、 2. 7mM酢酸マグネシウム、 0. 4mMスペルミジン (ナカライ 'テスタ社製）、各 0. 3mM L型アミノ酸 20種類、 4mMジチオスレィトール 、 1. 2mM ATP (和光純薬社製）、 0. 25mM GTP (和光純薬社製）、 16mMタレ ァチンリン酸（和光純薬社製）、 40 a g/mlクレアチンキナーゼ（Roche社製）、 0.005% アジィ匕ナトリウムを加え、十分溶解した後に、適量の翻訳铸型 mRNAを入れたもの等 が例示される。
[0034] ここで、 mRNAは、無細胞タンパク質合成系において合成され得るタンパク質をコー ドする領域が、適当な RNAポリメラーゼが認識する配列と、さらに翻訳を活性化する 機能を有する配列の下流に連結された構造を有していれば如何なるものであっても よレ、。 RNAポリメラーゼが認識する配列とは、 T3または T7RNAポリメラーゼプロモータ 一等が挙げられる。本発明の無細胞タンパク質合成用試薬を用いてタンパク質チッ プ、あるいはライブラリ一等を作製する場合には、それぞれの目的に応じて適宜選択 される。また、無細胞タンパク質合成系において翻訳活性を高める配列として Ω配列 、 E01配列（WO03Z056009号公報に記載の配列番号 136)等をコーディング配列 の 5 '上流側に連結させた構造を有するものが好ましく用いられる。
[0035] 以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施 例により限定されるものではなレ、。
実施例 1
[0036] 沈殿助剤を用いた高機能化コムギ胚芽抽出液の調製
(1)コムギ胚芽の調製
北海道産チホクコムギ種子または愛媛産チクゴィズミ種子を 1分間に 100gの割合 でミル（Fritsch社製： Rotor Speed Mill pulverisettel4型）に添カロし、回転数 8, 000 卬 mで種子を温和に粉碎した。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分 (メッシュサイ ズ 0. 7— 1. 00mm)を回収した後、四塩化炭素とシクロへキサンの混合液 (容量比 =四塩化炭素：シクロへキサン = 2. 4 : 1)を用いた浮選によって、発芽能を有する胚 芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風に よって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機 BLM - 300K (製造元:株式会社安西製作所、発売元:株 式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽 を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分から の反射光及び Z又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基 準値より外れたもの又は基準値内のものを選別除去する手段を有する装置である。 色彩選別機のベージュ色のベルト上に粗胚芽画分を 1000乃至 5000粒 Zcm2とな るように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。 ベルトの搬送速度は、 50m/分とした。受光センサーとして、モノクロの CCDラインセ ンサー（2048画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分 (種皮等）を除去するために、胚芽の輝度と種皮の輝 度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、 胚乳を選別するために、胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値か ら外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約 lcm位置に設置し た吸引ノズノレ 30個（長さ 1 cm当たり吸引ノズノレ 1個並べたもの）を用レ、て行った。 この方法を繰り返すことにより胚芽の純度 (任意のサンプル lg当たりに含まれる胚 芽の重量割合）が 98%以上になるまで胚芽を選別した。
得られたコムギ胚芽画分を 4°Cの蒸留水に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液 が白濁しなくなるまで洗浄した。次いで、ノニデット（Nonidet :ナカライ 'テスタ社製） P4 0の 0. 5容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで 洗浄してコムギ胚芽を得た。回収した胚芽湿重量に対して 2倍容量の抽出溶媒（80 mM HEPES_K〇H、 pH7. 8、 200mM酢酸カリウム、 10mM酢酸マグネシウム、 8mMジチオスレィトール、 4mM塩化カルシウム、各 0. 6mM 20種類の L型ァミノ 酸）を加え、ワーリングブレンダーを用い、 5， 000— 20, OOCkpmで 30秒間ずつ 3回 の胚芽の限定破砕を行つた。
[0037] (2)沈殿助剤を用いた S-30画分の調製
上記得られたホモゲネート (破砕物）に、 20%重量の海砂あるいは膨潤させたセフ アデックス G25粒子をカ卩え、混合した。海砂は、ホモゲネート添加前にあらかじめ以下 の処理を行った：水洗→5容の 0. 1規定の NaOH又は KOH洗浄→水洗→0. 1規定 の HC1洗浄→水洗→100— 120°Cの加熱により RNase失活処理後、乾燥処理。 海砂を混合したホモゲネートを 3万 xg、 30分で 2回遠心、続いて 12分間 1回の遠心 で、半透明な遠心上清を得た（S-30画分)。海砂あるいはセフアデックス粒子を遠心 前に加えない場合は、沈殿物の上部に不溶性スラリーが存在し、これが混入した S- 30画分から調製した抽出液のタンパク質合成活性は低くなつた。得られた S-30画分 を、溶出溶液（40mM HEPES_KOH、 pH7.8、 200mM酢酸カリウム、 10mM酢酸マグネ シゥム、 4mM DTT)で平衡化したセフアデックス G25にかけ、ゲルろ過し、分子量 1000ダルトン以下の低分子物質を排除した胚芽抽出液を調製した。
[0038] (3)タンパク質合成
胚芽抽出液に、翻訳に必要な成分を添加調整し、翻訳反応液（30mM
HEPES-KOH、 pH7.8、 lOOmM酢酸カリウム、 2.7mM酢酸マグネシウム、 1.2mM ATP、 0.25mM GTP、 0.4mMスぺノレミジン、 16mMクレアチンリン酸、 40 μ g/mlクレアチンキ ナーゼ、 4mMジチオスレィトール、各 0.3mM ロイシンを除く 19種類の L型アミノ酸、 0.005%アジィ匕ナトリウム）とした。胚芽抽出液の濃度は、翻訳反応液 lmlに 40
〇D260nmとした。この反応液にジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR)をコードする mRNA ( 0.32 mg/ml)、 14C -ロイシンを翻訳反応液に加えて、 26°Cにてバッチ法によりタンパク 質合成を行った。タンパク質合成量は、以下のように14 C標識ロイシンの酸不溶性画 分への放射能の取り込みを測定することによって行った：反応液 5マイクロリツターを 3 MMワットマン濾紙にスポットし、 10%氷冷 TCA (トリクロ口酢酸）に 1時間浸した後、 5 %の TCA液中で 10分間煮沸した。このフィルターを取り出しエタノール.エーテル（5 0 : 50容）で TCAと水分を除去し、乾燥後、液体シンチレーシヨンカウンター（トルエン シンチレ一ター）で、熱 TCA不溶画分へ取り込まれた放射能を計測した。
図 1Aに沈殿助剤の効果を示した。〇は、沈殿助剤を用いない、従来法で調製した S-30画分を用いた場合のタンパク質の合成量を示す。秦（大）は、沈殿助剤として海 砂を用いて調製した S-30画分を用いた場合のタンパク質の合成量を示す。海砂を用 いた遠心中における不溶物の共沈操作によって、タンパク質合成活性が 20— 30% 上昇した（図 1A)。すなわち、海砂非存在下における遠心においては上清から回収 した S-30にタンパク質合成を阻害する沈殿物質が混入しているものと考えられた。 本効果は共沈効果を示す物質であれば海砂でなくとも、市販のセフアデックス粒子（ G25)を膨潤させたもので代用可能であることがわかった（秦：小さレ、黒丸）。
実施例 2
アミコンウルトラ膜ろ過処理による阻害物質の除去
上記のように、沈殿助剤を用いて調製したタンパク質合成反応液 (抽出液の他、 mRNA以外のタンパク質合成に必要な成分を各至適濃度含む）を分子量 1万カットの アミコンゥノレトラ遠心ろ過器（Amicon Ultra- 15 centrifugal filter device, 15 ml, 10K NMWL, MILLIPORE社製）を通すことによって、さらに、 1万ダルトンまでの低分子量 物質を排除した、タンパク質合成液を調製した。このろ過処理は 6回繰り返して行つ た。このタンパク質合成液を以下、高機能化タンパク質合成液と称する。図 1B (秦） に示したように、このろ過によって、約 2時間で停止した合成反応が少なくとも 3時間 まで持続するとともに、翻訳活性も上昇した。 （図 1Β·を図 1Aの秦大、秦小との比較 による）。すなわち、アミコンウルトラ遠心ろ過処理によって、翻訳活性の上昇と同時 に翻訳反応系の安定性が顕著に向上することがわかった。さらに、アミコンウルトラ遠 心ろ過処理時に排除したろ液をその反応系にもどすと、アミコンウルトラ遠心ろ過未 処理と同様に、タンパク質合成活性の低下と合成反応持続時間が約 2時間となり、不 安定性を誘起した。これにより、このアミコンウルトラ排除画分中には、コムギ胚芽無 細胞タンパク質合成反応の阻害と不安定化を生じせしめる分子量 1万以下の内因性 阻害因子が存在することがわかった（図 1Β、〇）。ここで図 1の結果に再度注目すベ きは、アミコンウルトラ遠心ろ過処理しない反応液では、反応 1時間後から合成速度 の低下が始まり、約 2時間後にはタンパク質合成活性が停止するにもかかわらず（図 1Α、〇）、アミコンウルトラ遠心ろ過処理反応液では、反応が少なくとも 3時間まで持 続する（図 1Β、秦）ことである。
次に、タンパク質合成の不安定化についてさらなる検討をおこなった。すなわち、ァ ミコンウルトラ遠心ろ過前とろ過後の試料について、上記と同様（ただし、 mRNAと14 C- ロイシンを含まず）に 3時間、 26°Cの保温 (以下、前保温と記す）の後、両種の反応液 を別々に翻訳溶液（アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液を含む）で平衡化し たセフアデックス G25スピンカラムを通すことによって、新鮮な翻訳溶液と置換した後 に、 mRNAと14 C-ロイシンを添加することによって、タンパク質合成活性を測定した。ァ ミコンウルトラ遠心ろ過を行っていないものでは、前保温によってタンパク質合成活性 がほぼ消失する（図 1B、△)ものの、アミコンウルトラ膜によって低分子を排除した反 応液においては、前保温による活性の低下は殆どみられない（図 1B、口）。すなわち 、これらの結果は、アミコンウルトラ膜を用いて得たろ液中には、タンパク質合成因子 のいずれ力、を不可逆的に不活性化を誘起する成分 (機作)が存在することを示して おり、同膜を利用したろ過操作によって、抽出液中の阻害因子が排除され、反応液 の著しレ、安定化が達成されることが示された。
実施例 3
アミコンウルトラ膜で排除される画分中の阻害因子の同定
アミコンウルトラ膜ろ過処理によって排除したろ液を薄層クロマトグラフィー (TLC ( シリカゲルプレート（10cmxl0cm、メルク社製品）により、メタノール：濃アンモニア水 (22%) = 1： 1容量比、展開は室温で 5分間） )を展開溶媒として展開し、濃硫酸酸化 によって分離スポットを検出した（図 2A)。同時に展開した標準物質の展開位置 (RF 値）から、このろ液中には、グルコース、グルコース 1_リン酸（又は、グルコース 6_リン 酸との混合物）、フルクトースリン酸（フルクトース 6-リン酸、同 1 , 6二リン酸の混合物） 、ラフイノース、ショ糖、ガラクトースおよび黄色物質（図 2A中の Y)が含まれていること 、中でもグノレコース濃度が高いことが明らかになった。この分画前のろ液を、高機能 化タンパク質合成液に当量添加したところ、強いタンパク質合成の阻害が確認できた (図 1B、〇）。次に、各成分を別々に抽出し、各実験操作段階における容量力 算出 した当量を添加したところ、グノレコースとショ糖に強いタンパク質阻害作用と不安定化 作用が確認されたが（図 2B、き大：グノレコース添加、 ·小：ショ糖添加）、ラフイノース 、および黄色物質は阻害作用を示さなかった（データは示していない)。反応のカイ ネチタスからわかるように、アミコンウルトラ膜によってろ過した抽出液は、図 1Bに示し たと同様に、少なくとも 3時間に至るまでタンパク質合成が持続するが、ろ液由来のシ ョ糖とグノレコースの添加によって、反応 1時間後において既にタンパク質合成能の低 下がみられ、 2時間で反応は停止した。その結果、合成産物の収量が低下した。図 2 Aに検出したろ液中の、ラフイノース、ショ糖、グルコース、リン酸化糖については、核 磁気共鳴測定法によってその存在を同定確認した。
さらに幾つかの糖類の標準品を用いて、それらがタンパク質合成に及ぼす影響を 調べた（図 2C)。各糖を終濃度 0. 5mMとなるように合成反応系に添加したところ、 D -グルコース（△_△)、フルクトース（□_□)、ガラクトース — ）、グルコース— 6—リ ン酸（▲_▲小）、ショ糖（* _ * )については、いずれも強いタンパク質合成阻害作用 を示し、且つ反応持続時間の短縮、すなわち、不安定化が認められた。このような効 果は、 0. 3mMのグルコースにも見られた（△_△)。ショ糖（* _ * )、ガラクトース（ _☆)、グルコース _6_リン酸（▲_▲小）、 0. 3mMグルコース（△_△)の値はほぼ同 じであった（図中では敢えて、離して示した）。
次にグルコース添加と前保温によるタンパク質合成系の不安定化現象を確認する 目的で、 0. 5mMグルコース存在下（系には mRNAと14 C-ロイシンが含まず）に保温し 、図 IBで説明したと同様の、安定性を調べた。図 2〇の （大）で示したように、 0. 5 mMのグノレコース存在下の保温によって、タンパク質合成能が不可逆的に不活性化 すること力 Sわ力る。すなわち、上記で示した、コムギ胚芽抽出液中（S-30)に見いだし たタンパク質阻害と不安定化を生じせしめる少なくともそれら因子の一つ力 ダルコ ースであることが示された。ガラクトースの添カ卩によっても阻害が認められるものの、生 体酵素には認識されないグルコースの立体異性体である L-グノレコースの添カ卩では、 0. 5mMにおいても阻害作用は見られな力、つた（図 2C、 ·_き大）。解糖系の終末 側代謝産物である、ホスホェノールピルビン酸（図 2C、き— ·小）とピルビン酸（図 2C 、 ·_·中）には、タンパク質合成阻害作用は見られなかった。
実施例 4
グルコース濃度の定量
総グルコース濃度（遊離型とリン酸化型（主にグノレコース 1リン酸））を測定する前処 理方法として、 1. 0規定塩酸下に 5分間煮沸の後、水酸化ナトリウムで中和し、この 試料を Glucose oxidase/Mutarotase法および 0-トノレイジン ·ホウ酸法の両方法による 測定に供した。
表 1に示したように、 Glucose oxidase/Mutarotase法によって定量したところ、 S-30 画分中（200 OD260nm)には 30mMを越える高濃度の総グルコースが存在する（酸 熱未処理試料を用いて測定した遊離グルコース濃度は 7. 8mMであった）力 セファ デッタス G25カラムやアミコンウルトラ膜 (表中： A.U.と略記）を通すことによってこれを 低減させることができる。セフアデックス G25カラムによるゲルろ過では、総グルコース 濃度が 5. 5mMに低下した。また、アミコンウルトラ膜を用いて遠心ろ過を繰り返すこ とによって段階的に総グノレコース濃度が低下し、同ろ過 6回操作後の試料において は 3. 4mM (遊離グルコース濃度は 0. 4mM)にまで低下した。一方、それらの画分 の 0 -トルイジン ·ホウ酸法による定量では、酵素法の 2. 3倍を超える 72. 2mMを越え る総アルドへキソースやアルドペントースが S— 30画分に検出された。ゲルろ過操作 を 6回繰り返すことによって、 6 · 9mMにまで総グノレコース濃度が低下することがわか つた。この時の遊離グルコース濃度は 0. 4mMであった。ビバフロー濃縮膜（
Sartorius社製、 VIVAFLOW 50，分子量カットオフ値は 10, 000ダノレトン）とペリスタポ ンプを用いることによって、遠心ろ過操作をすることなく大容量の抽出液でのダルコ ースの排除が可能になる。ビバフロー濃縮膜を用いることによつても、アミコンウルトラ 膜を利用した場合と同様の性能を保持したコムギ胚芽無細胞タンパク質合成用抽出 液を製造することができることが示された。この方法では、抽出液と等容量の基質液 で 6回濃縮操作のろ過操作をおこなった。その結果、総グノレコース濃度は 3mMで、 このうちの遊離グルコース濃度は 0. 4mMとなり、アミコンウルトラ膜を利用した場合と 同様の性能を保持したコムギ胚芽無細胞タンパク質合成用抽出液を製造することが できることが示された。セフアデックス G25カラムとビバフロー濃縮膜を用いることによ つて、更なる単糖類の排除が期待できる。セフアデックス G25カラムによってゲルろ過 をおこなった S-30画分を、さらにビバフロー濃縮膜を用い上記と同様に 6回の濃縮 操作をおこなったところ、総グルコース、総アルドへキソース、アルドペントースに著し い排除効果を確認した。即ち、総グルコース濃度は 0. 6mMとなり、遊離グルコース 濃度は 0. 3mMとなった。
これらの胚芽抽出物を用いて、実施例 1に記載した方法に従って、抽出液の濃度を 40 OD260nmとした条件でタンパク質合成を行い、その合成活性を比較した。タンパ ク質合成活性は、 3時間反応後に熱酸不溶画分へ取り込まれた反応液 5マイクロリツ ター当たりの14 Cの放射能を計測した。ゲルろ過操作にともなって抽出液中のダルコ ース濃度が低下し、これと完全に対応して、タンパク質合成活性が上昇し、同時に極 めて安定なタンパク質合成反応液を製造することができた。
[表 1]
グルコース タンパク質合成活性
(200A260中の mM) d D m
Glucose oxidase法 0- トノレイ シン
S— 3 0 3 1. 2 ( 7. 8) 7 2. 2 測定せず
G-2 5 5. 5 1 2. 8 3 1 1 1
A.U.ろ過 (回数)
( 1 ) 1 6. 4 4 3. 9 2 1 4 5
[ 2] 1 3. 5 2 7. 2 2 5 7 4
(3) 1 0. 9 1 9. 8 2 7 7 2
(4) 7 , 1 1 4. 9 2 9 7 0
( 5) 5. 3 1 0. 2 3 1 3 5
( 6) 3. 4 (0. 4) 6. 9 3 2 3 4
( 7) 3. 3 6. 1 3 3 0 0 ビバフロ一濃縮膜 3. 0 (0. 4) 3. 4 3 3 1 3
S 3 0→ピノ フロ -濃縮膜
0. 5 (0. 3) 0. 6 3 8 2 4 透析保温処理 8. 7 (0. 8) 2 6 4 0
0-トルイジン ·ホウ酸法 （和光純薬工業株式会社、 コード番号 4 3 9-9 0 9 0 1 )
Glucose oxidase Mutarotase (和光純薬工業株式会社、 コード番号 2 7 3-1 3 9 0 1 )
括弧内の数字は遊離グルコース濃度を示す。 実施例 5
ATPの低下に依存するタンパク質合成反応の阻害と不安定化
反応液中に存在するグノレコースなどの六炭糖と ATP濃度の低下現象との関係につ いて実験的に検証した。すなわち、タンパク質合成反応時におけるグルコース濃度 の経時的変化を測定した。 6回のアミコンウルトラ膜によるろ過処理の後に残存する グノレコース濃度は、タンパク質合成反応時にエネルギー再生系が存在する場合、保 温 1時間でその大半が代謝される（図 3A、〇）。一方、エネルギー再生系非存在下（ クレアチンキナーゼ非存在下であり、 ATPは反応開始時に添加している 1.2mMの み）では、代謝により減少するグノレコース量は少なレ、（図 3A、き）。すなわち、（1)グ ルコース代謝に ATPの供給が必須であること、および、（2)図 2Aにおけるリン酸化糖 の存在から、タンパク質合成反応溶液中の ATPの消費に解糖系のリン酸化反応が深 く関与しているものと考えられた。
次に、 ATP濃度低下とタンパク質合成反応の阻害と不安定化機作の関係を調べる 目的で、グノレコース存在 ·非存在下における ATP濃度の保温経時変化を測定した。 実験は、セルロース薄層プレート（アビセル：フナコシカも購入）を用いたクロマトダラ フィ一で、展開溶媒としてはイソ酪酸： 0. 5Mアンモニア（5 : 3)を用いた。 6回のアミコ ンウルトラ膜処理した抽出液で調製した合成系を用い、グルコース添カ卩（ImM)ある いは非添加のタンパク質合成反応をおこなレ、、経時的に分取した試料に当量の冷ェ タノールを加えた後に 1万 xg遠心で得た上清を薄層プレート上でヌクレオチドを分画 した。常法により標準ヌクレオチドを分画マーカーとして、紫外線照射によって可視化 できる蛍光スポットからかき取った画分から ATPを抽出し、 260nmの紫外部吸収値を 測定することによって、反応液中の ATP濃度の経時変化を求めた。グルコース非添 加実験においては、反応とともに、反応液中の ATPの濃度低下がみられ（図 3B、 · 大）、反応 3時間後には 60%程度になった。この ATP濃度低下の力イネチクスは、グ ルコース濃度の低下とよく一致している（図 3A、秦）。さらにそれらは、図 1 , 2などに 示したアミコンウルトラ膜を用いて糖を低減化した抽出液を用いたタンパク質合成反 応力イネチクスとよく一致している。データは示していないが、タンパク質合成反応を 25 OD260醒の抽出液を用いて行った場合には、反応 4時間まで ATP濃度の低下 はほとんどみられず、同時にタンパク質合成反応はほぼ直線的に 4時間に至るまで 合成が持続した。
図 3Bには、グルコースを添加した反応についての結果を示した。市販の D-ダルコ ースを ImM添カ卩した反応においては（内在するグルコースと合わせて、終濃度は 1.082mMとなっている）、 1時間後には反応液中のほとんどすべての ATPが消費され る（図 3B、〇）が、 L-グルコース ImMの添加では、糖の非添加同様に約 50%の ATPが残っており（図 3B、 ·小）、このような ATP濃度の経時変化もまた、図 2Cに示し たタンパク質合成反応力イネチクスとよく一致している。データは示していないが、 ATPの濃度低下に見合った AMP/ADP濃度の上昇を薄層クロマトプレート上のスポッ トとして確認した。これらの結果から、反応液中のグルコースやフルクトースなどの六 炭糖が ATPの消費の基質として直接的に関与していることがわかった。 実施例 6
[0044] タンパク質合成活性に与える AMP、 GMPの影響
通常の無細胞タンパク質合成反応液中に含まれる 1. 26mM ATPと 0. 25mM GTPに加えて、高濃度の AMPもしくは GMP、および両者を同時に添加した場合のタ ンパク質合成活性を測定した。コントローノレとして、アミコンウルトラ膜 6回のろ過を行 つて得た抽出物を 40 OD260nmの濃度で用いたタンパク質合成を行った（図 4、秦大 )。このタンパク質合成反応に 0. 5mM AMPと 0. 25mM GMPを添加しても、タンパ ク質合成の阻害は見られなかった（図 4、秦小）。図には示さないが、それぞれ 0. 5m M AMPあるいは 0. 25mM GMPの単独の添加によっても、タンパク質合成の阻害は みられなかった。すなわち、タンパク質合成反応阻害は副生産物である AMPや GMP の系内での蓄積に起因するものではないことが示された。 0. 5mMのフルクトース、 ショ糖、ガラクトースの添カ卩によっても反応後 1時間で系内の ATP濃度は検出限界以 下となった（データは示さない）。これらの結果は、 ATP濃度の低下が何らかの機作を 介して、タンパク質合成因子を不可逆的に不活性化していることを示唆している。 図面の簡単な説明
[0045] [図 1] (A) S-30画分調製にあたって、遠心時に沈殿助剤を添加することの効果を示 した図である。〇_〇は、沈殿助剤を添加せずに得た S-30、き— ·（大）は海砂、き
-· (小）は抽出液で膨潤させたセフアデックス G25粒子を沈殿助剤として添加して 得られた S-30によるタンパク質合成活性値である。 (B) アミコンウルトラ膜によるろ 過によって活性の高い抽出液が得られることを示した図である。拿-きは海砂を沈殿 助剤として調製した S-30をセフアデックス G25にかけた後、アミコンウルトラ膜による 6回のろ過を行ったもの、〇_〇は、アミコンウルトラ膜によるろ過後の試料に濃縮し たろ液を当量もどし添加したものによるタンパク質合成活性値である。 は、アミ コンウルトラ膜によるろ過を行わない抽出液を前保温したもの、□_□はアミコンウルト ラ膜によるろ過を行った抽出液を前保温したものによるタンパク質合成活性値である 園 2] (A) アミコンウルトラ膜によるろ過液中の糖類成分の薄層クロマトグラムを示す 。濃硫酸発色スポットを転写したものである。 (B) ろ過液中のショ糖、グノレコースによ るタンパク質合成反応の阻害。分画した図 2 (A)のショ糖とグルコースを単離し、各々 をタンパク質合成反系に添加し、図 1に述べた方法で合成阻害作用を調べた。〇- 〇：糖類非添加（対照）、き-拿大：グルコース添加、拿ー拿小：ショ糖添加。 (C) 標 準糖分子種によるタンパク質合成阻害作用を示した図である。終濃度、各 0. 5mM の、 ·—き大： L -グルコース、秦—き小：フォスフォェノールピルビン酸、き—秦中：ピ ノレビン酸、 A—A : D-グルコース、口一口：フルクトース、☆—☆：ガラタトース、 *— *： ショ糖、▲_▲小：グルコース— 6-リン酸、 3mMグルコースを添加してタン パク質合成を行った場合の活性値を示した。〇_〇：糖を添加しない対照実験である 。▲_▲大： 0.5mM D -グルコース存在下に前保温した細胞抽出液によるタンパク質 合成活性値。
園 3]タンパク質合成反応中のグノレコースの代謝に伴う ATP濃度の低下を示した図で ある。 (A) クレアチンキナーゼ存在下（〇_〇）、又は非存在下（き- ）におけるグ ルコース濃度の経時的変化で、反応開始時の濃度は 0. 082mM (100%)であった 。 （B) 通常のタンパク質合成反応（クレアチンキナーゼを含む）に伴う ATP濃度の変 化を示した図である。拿-秦大：グノレコース非添加（通常のタンパク質合成反応）、〇 _〇：市販の D—グルコースを ImM添力 Q、秦_拿小：非代謝性の L-グルコースを lm M添加した結果を示す。
園 4]AMPおよび GMPはコムギ胚芽無細胞タンパク質合成反応を阻害しないことを示 した図である。秦ー ·大：対照実験、拿-き小： AMP (0. 5mM)および GMP (0. 25m
M)添加。

Claims

請求の範囲
[I] 無細胞タンパク質合成手段に使用する細胞抽出物の調製法であって、細胞由来の 翻訳阻害機構を排除することを特徴とする細胞抽出物の調製方法。
[2] 細胞由来の翻訳阻害機構の排除が、 ATPを介する糖のリン酸化系の制御によるも のである、請求項 1に記載の調製方法。
[3] 細胞由来の翻訳阻害機構が、胚芽細胞内因性のタンパク質合成阻害誘導系である 請求項 1又は 2に記載の調製方法。
[4] 細胞抽出物の原料が、混入する胚乳成分および低分子タンパク質合成阻害物質が 実質的に除去されたコムギ胚芽抽出物である請求項 1一 3に記載のいずれ力 1の調 製方法。
[5] 細胞抽出物の原料が、大腸菌抽出物、ゥサギ網状赤血球抽出物、又は昆虫由来細 胞抽出物である請求項 1又は 2に記載の調製方法。
[6] ATPを介する糖のリン酸化系の制御力 以下から選ばれる少なくとも一の手段の導 入である請求項 2に記載の調製方法。
1)単糖類の除去、
2)リン酸化糖の除去、
3)多糖類から単糖類の生成の制御、
4)単糖類からリン酸化糖の生成の制御。
[7] 単糖類の除去における単糖類が、六炭糖である請求項 6に記載の調製方法。
[8] リン酸化糖の除去におけるリン酸化糖力 グノレコース 1リン酸、フルクトース 1リン酸、 ガラクトース 1リン酸、グノレ ース 1， 6二リン酸、フノレクトース 1， 6二リン酸、ガラクトー ス 1 , 6二リン酸から選ばれる少なくとも 1である請求項 6に記載の調製方法。
[9] 単糖類及び/又はリン酸化糖の除去が、ゲルろ過及び/又は限外ろ過膜による分子 量分画排除である請求項 6に記載の調製方法。
[10] ゲルろ過及び/又は限外ろ過膜による分子量分画排除を複数回繰り返すことを特徴 とする請求項 9に記載の調製方法。
[II] 多糖類から単糖類の生成の制御が、澱粉からグルコースの生成の制御である請求項
6に記載の調製方法。
[12] 多糖類から単糖類の生成の制御が、以下から選ばれる少なくとも一の手段の導入で ある請求項 11に記載の調製方法。
1)糖分解酵素の除去又は不活化、
2)多糖類及び/又は小糖類 *ニ糖類の排除、
3)糖分解酵素阻害剤の添加。
[13] 糖分解酵素の除去又は不活化が、糖分解酵素とカルシウムとの複合体を形成させ、 該複合体を除去する手段である請求項 12に記載の調製方法。
[14] 沈殿助剤として、ベントナイト、活性炭素、シリカゲル、セフアデッタス、海砂から選ば れる少なくとも 1を細胞抽出物に添加して、細胞由来の糖分解酵素を除去する手段 を導入することを特徴とする細胞抽出物の調製方法。
[15] 単糖類からリン酸化糖の生成の制御が、以下から選ばれる少なくとも一の手段の導 入である請求項 6に記載の方法。
1)糖リン酸化酵素の阻害剤の導入、
2)糖リン酸化酵素の除去又は不活化、
3)六炭糖の酵素的分解による糖代謝系経路からの排除、
4)六炭糖の化学的'酵素学的修飾による糖リン酸化酵素反応の阻害、
5)糖類のリン酸化部位にリン酸基が結合できないように、酵素的及び/又は化学 的に改変及び/又は修飾されている。
[16] 六炭糖が、グルコースである請求項 7に記載の調製方法。
[17] 細胞抽出物濃度が 200 OD260nmにおいて、細胞抽出物中のグノレコース濃度が 10 mM以下である請求項 16に記載の調製方法。
[18] 細胞抽出物濃度が 200 OD260nmにおいて、細胞抽出物中のグノレコース濃度が
6mM以下である請求項 16に記載の調製方法。
[19] 請求項 1一 18のいずれ力 4に記載の調製方法によって調製された無細胞タンパク質 合成手段に使用する細胞抽出物。
[20] 無細胞タンパク質合成手段に使用する細胞抽出物であって、 ATPを介する糖のリン 酸化系が制御されている細胞抽出物。
[21] ATPを介する糖のリン酸化系の制御が、以下から選ばれる少なくとも一の手段の導 入である請求項 20に記載の細胞抽出物。
1)実質的にリン酸化糖が除去又は不活化されている、
2)実質的に多糖類、小糖類'二糖類、及び単糖類が除去されている、
3)実質的に糖分解酵素が除去又は不活化されている、
4)糖分解酵素阻害剤が添加されている、
5)実質的にリン酸化酵素が除去又は不活化されている、
6)リン酸化酵素阻害剤が添加されている、
7)糖類のリン酸化部位にリン酸基が結合できないように、酵素的及び/又は化学 的に改変及び Z又は修飾されている。
[22] 請求項 19一 21の何れか一に記載の細胞抽出物による無細胞タンパク質合成方法。
[23] 請求項 19一 21の何れか一に記載の細胞抽出物を使用する無細胞タンパク質合成 系の利用。
[24] 請求項 19一 21の何れか一に記載の細胞抽出物を含む無細胞タンパク質合成系に 使用する試薬キット。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006043675A1 (ja) * 2004-10-22 2006-04-27 Cellfree Sciences Co., Ltd. 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液及び該抽出液の調製方法。
US7674593B2 (en) 2005-12-28 2010-03-09 Cellfree Sciences Co., Ltd. Preparation method of biotinylated protein and detection method using the same
EP2392658A2 (en) 2010-05-13 2011-12-07 Takara Bio Inc. Centrifugation method
WO2013080811A1 (ja) 2011-11-28 2013-06-06 国立大学法人名古屋大学 リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のバイオマーカー及びその用途
CN109847729A (zh) * 2017-11-30 2019-06-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种多孔金属氧化物-硅胶液相色谱填料及其制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107488672A (zh) * 2017-07-18 2017-12-19 天津大学 一种可常温储存的无细胞蛋白合成系统及其制备方法
US11673921B2 (en) 2017-11-10 2023-06-13 Northwestern University Cell-free protein synthesis platform derived from cellular extracts of Vibrio natriegens
CN110964736A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 康码（上海）生物科技有限公司 一种体外蛋白合成体系及其用于提高蛋白合成效率的方法、试剂盒
WO2020176522A1 (en) 2019-02-25 2020-09-03 Northwestern University Cell-free protein synthesis platforms derived from clostridia
WO2022182883A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Ardent Mills, Llc Systems and methods for extracting and isolating purified wheat embryo products

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000236896A (ja) * 1999-02-24 2000-09-05 Mitsubishi Chemicals Corp 無細胞タンパク質合成用胚芽抽出液及びその製造方法並びにそれを用いるタンパク質の合成方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2483332A1 (en) * 2002-01-31 2003-08-07 Yaeta Endo Cell extract for cell-free protein synthesis and process for producing the same

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000236896A (ja) * 1999-02-24 2000-09-05 Mitsubishi Chemicals Corp 無細胞タンパク質合成用胚芽抽出液及びその製造方法並びにそれを用いるタンパク質の合成方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANG S.H. ET AL: "An efficient cell-free protein synthesis system using periplasmic phosphatase-removed S30 extraxt", J MICROBIOL, vol. 43, 2000, pages 91 - 96, XP002985987 *
KWARASAKI Y. ET AL: "Phosphatase-immunodepleted cell-free protein synthesis system", J BIOTECHNOL, vol. 61, 1998, pages 199 - 208, XP004128064 *
MADIN K. ET AL: "A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 97, 2000, pages 559 - 564, XP002286586 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006043675A1 (ja) * 2004-10-22 2006-04-27 Cellfree Sciences Co., Ltd. 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液及び該抽出液の調製方法。
US7674593B2 (en) 2005-12-28 2010-03-09 Cellfree Sciences Co., Ltd. Preparation method of biotinylated protein and detection method using the same
EP2392658A2 (en) 2010-05-13 2011-12-07 Takara Bio Inc. Centrifugation method
WO2013080811A1 (ja) 2011-11-28 2013-06-06 国立大学法人名古屋大学 リンパ球性漏斗下垂体後葉炎のバイオマーカー及びその用途
CN109847729A (zh) * 2017-11-30 2019-06-07 中国科学院大连化学物理研究所 一种多孔金属氧化物-硅胶液相色谱填料及其制备方法

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