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WO2005063293A1 - Sr蛋白質のリン酸化制御方法、および、sr蛋白質の活性制御剤を有効成分とする抗ウイルス剤 - Google Patents

Sr蛋白質のリン酸化制御方法、および、sr蛋白質の活性制御剤を有効成分とする抗ウイルス剤 Download PDF

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WO2005063293A1
WO2005063293A1 PCT/JP2004/019393 JP2004019393W WO2005063293A1 WO 2005063293 A1 WO2005063293 A1 WO 2005063293A1 JP 2004019393 W JP2004019393 W JP 2004019393W WO 2005063293 A1 WO2005063293 A1 WO 2005063293A1
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WO
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group
protein
virus
substituent
srpk
Prior art date
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PCT/JP2004/019393
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English (en)
French (fr)
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Masatoshi Hagiwara
Takeshi Fukuhara
Masaaki Suzuki
Takamitsu Hosoya
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
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Priority to CN200480042165XA priority patent/CN1921885B/zh
Priority to US10/584,482 priority patent/US7569536B2/en
Priority to KR1020067014944A priority patent/KR101122708B1/ko
Priority to JP2005516655A priority patent/JP4771468B2/ja
Priority to CA2551602A priority patent/CA2551602C/en
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Priority to EP04807749.9A priority patent/EP1712242B1/en
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to the regulation of phosphorylation of an SR protein involved in a splicing reaction in a gene expression process. Furthermore, the present invention relates to a method for controlling the activity, control of expression and stabilization of SR protein useful for treatment and prevention of chronic and acute diseases caused by infection with a virus and the like, and an antiviral agent containing an SR protein activity regulator as an active ingredient. Furthermore, the present invention relates to compounds useful for controlling the activity of SR proteins and for antiviral therapy, and uses thereof.
  • HIV virus a technique that targets the characteristics of the HIV genome is used. HIV is converted from HIV RNA genome into DNA (provirus) by reverse transcriptase and integrated into the host chromosome, and then viral proteins are produced from the proviral DNA by the transcription and translation machinery of the host cell. The protein is transcribed as a large polyprotein precursor and proteolytically digested by a protease before the virus is reconstituted and matures. Therefore, HIV inhibitors are targeted at each of these HIV maturation processes, and (1) AZT etc. targeting non-retroviral reverse transcriptase (Non-Patent Document 1) and (2) Protease Protease inhibitors that inhibit (Non-Patent Document 2) have been researched and developed.
  • Non-patent document 1 Proc Natl Acad Sci USA Vol. 86, No. 21, pp. 8333-7
  • Non-Patent Document 2 Antimicrob Agents Chemother. 1995 Jul; 39 (7): 1559_64
  • Viruses especially RNA viruses, have a high mutation rate, and thus the antiviral agents targeting the reverse transcriptase and the like possessed by the viral protease II virus may lose efficacy. There is an urgent need to develop even more effective antiviral agents.
  • SRPK2 Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 357-364
  • SPK1 Mechanism. Dev .. 99, 51-64
  • hPRP4 J. Biol. Chem. 277, 44220-44228
  • CLASP regulator of SR protein kinase Clk4 J. Biol. Chem. 276,
  • SR protein is an RNA-binding protein rich in Serine and Arginine, and is usually rich in one or two RNA recognition motifs (RNA_recognition motifs; RRM) and a continuous sequence of RS
  • RS Arginine / Serine-rich domain
  • RNA-binding proteins Ten types of RNA-binding proteins, SC35 / PR264 / SRp30b, SRp30c, 9G8, HRS / SRp40, SRp46, SRp55, SRp75, and p54, have been reported. Many SR proteins have been shown to be phosphorylated intracellularly.In particular, one of the SR proteins, SF2 / ASF, has been analyzed at several sites in the RS domain by peptide mapping analysis. It has been confirmed that it has been oxidized (J. Cell. Biol. (1991) 115: 587-596). It is known that the ability of SF2 / ASF to selectively bind to UlsnRNP is enhanced by phosphorylation (Genes & Dev.
  • RS domains are not only RNA-binding proteins, but also various functional proteins that are expected to function in the nucleus. Found in white, they have been named the SR-related protein family (Biochem. Cell Biol. (1999) 77: 277-291).
  • the SR protein binds to UlsnRNP and U2AF and is required for spliceosome formation. It is thought that the RS domain plays a major role in the interaction between proteins. In addition, the SR protein () affects the selection of splice sites and promotes the selection of the 3 'splice site proximal to the intron, whereas heteronuclear such as hnRNP Al, A2, and B1
  • Ribonucleoproteins facilitate the selection of distal 3 'splice sites.
  • SR protein and hnRNP protein in cells a possible force s splice sites are determined.
  • the present inventors have developed and provided an antiviral agent for an SR protein that has been found to play an important role in virus replication.
  • SRPIN-1 SR protein phosphorylation inhibitor 1
  • the present inventors have synthesized a plurality of SRPIN-1 analogs and examined the effects thereof. As a result, they have been shown to exhibit SRPK inhibitory activity and antiviral activity similarly to SRPIN-1. Therefore, SRPIN-1 and their analogs are useful as SRPK inhibitors and can be further used as antiviral agents.
  • the present invention provides an antiviral agent containing an SR activity controlling agent that controls the activity of an SR protein as an active ingredient, a method for screening an antiviral agent, a compound having SRPK inhibitory activity, and its use. More specifically, the present invention relates to the invention described in each claim. That is, the present invention
  • an antiviral agent containing as an active ingredient an SR activity controlling agent that controls the activity of an SR protein
  • SR protein is any one of SF2 / ASF / SRp30a, SC35 / PR264 / SRp30b, SRp30c, HRS / SRp40, SRp46, or SRp75.
  • the antiviral agent according to the above (1) or (2) wherein the SR activity regulator is a substance or a composition that promotes dephosphorylation of an SR protein;
  • an anti-viral agent according to (3) which is an activator that activates phosphatase 2A (Phosphatase 2A);
  • the antiviral agent according to (4) which is an expression vector for gene therapy carrying the HIV tat gene, the adenovirus E4-ORF4 gene, or the vaccinia virus VH1 gene;
  • the antiviral agent according to (1) or (2) wherein the SR activity regulator is a substance that inhibits SRPK;
  • Viruses (1) Human immunodeficiency virus (HIV), severe acute respiratory syndrome (SARS), poliovirus, human rhinovirus, adult T-cell leukemia virus (HTLV_I), type A, type C, type D Or any RNA-type virus of hepatitis E virus, vaccinia virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, human coronavirus, Ebola virus, influenza virus, or Sindbis virus, or (2) simple herpes virus Hepatitis B virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, Herpes innores, human herpes virus, smallpox virus, poliovirus virus, or human papilloma virus, including human adenovirus.
  • the antiviral agent according to any one of the above (1) to (11),
  • SR protein or Arg- Ser (RS) or Ser-Arg (SR) The screening method according to the above (13), which comprises a step of assaying the ability to phosphorylate an SR protein using the tide as a substrate for SRPK.
  • R 1 is a hydrogen atom, an optionally substituted C alkyl group
  • Loxy group, having a substituent may be, c alkoxy group, having a substituent, may be,
  • R 2 has a hydrogen atom, a substituent, a substituent, a C alkyl group, or a substituent
  • R 3 is an optionally substituted C alkyl group, an optionally substituted C
  • R 4 represents a hydrogen atom or a halogen atom
  • Q is one C ( ⁇ ) one, -C (S)-, -SO-, -C (S) NHC (O)-, one C ( ⁇ ) NHC (O)-,
  • W represents a hydrogen atom, a substituent having a substituent, a C alkyl group, a substituent having a substituent,
  • R 5 and R 6 are the same or different from each other, and each independently represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted C alkyl group, a substituted or unsubstituted nitrogen-containing group.
  • R 5 and R 6 together with a nitrogen atom which is in contact with P form a heterocyclic ring which may have a substituent.
  • the heterocyclic ring which may be substituted may be a condensed aromatic compound ring which may have a substituent;
  • R 5 and R 6 may be a cycloalkylideneamino group which may have a substituent or an aromatic ring-fused cycloalkylidene group which may have a substituent.
  • a diphosphorus derivative, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, [17] is a hydrogen atom, a C alkyl group which may have a substituent,
  • aniline derivative described above or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, (19) wherein the aniline derivative has a C aryl group which may have a substituent, or
  • W is a hydrogen atom, a halogen atom, or the following general formula (II) ( ⁇ )
  • R 5 and R 6 are the same or different from each other, and may have a substituent.
  • 1-6 represents a alkyl group
  • R 5 and R 6 may form a heterocyclic group which may have a substituent together with the nitrogen atom which is in contact with P, and the heterocyclic group may have a substituent.
  • an SRPK inhibitor comprising, as an active ingredient, the aniline derivative according to any one of (16) to (21), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof;
  • the present invention relates to an antiviral agent comprising, as an active ingredient, the aniline derivative according to any one of [16] to [21], a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • Inventions composed of one or more combinations of the inventions described in the claims claiming the same claim are already intended for expression in the claims.
  • C alkyl group refers to an aliphatic hydrocarbon having 1 to 6 carbon atoms.
  • a monovalent group derived by removing one arbitrary hydrogen atom which means a linear or branched alkyl group having 116 carbon atoms, specifically, for example, a methyl group, Ethyl group, 1-propyl group, 2_propyl group, 2-methyl-1_propyl group, 2-methyl-2_propynole group, 1 butyl group, 2 butyl group, 1 pentyl group, 2 pentyl group, 3 pentyl group, 2 —Methinole_1_butyl group, 3-Methinole_1_butyl group, 2-Methinole_2_butyl group, 3_methyl_2_butyl group, 2,2_dimethyl-1_propyl group, 1_hexyl group, 2_to Xyl group, 3-hexinole group, 2-methylinole_1_pentyl group, 3-methinole_1_pentyl group, 4-methinole_1_pentinole group, 2-methino
  • C alkenyl group refers to a linear or branched C2-C6 group.
  • chain alkenyl group specifically, for example, a bier group, an aryl group, a 1-propenyl group, a 2_propenyl group, a 1-buturyl group, a 2-buturyl group, a 3-butyl group Pentenyl group, hexenyl group and the like.
  • C alkynyl group refers to a straight or branched chain having 26 carbon atoms.
  • C alkylthio group refers to a “C alkyl group” defined above.
  • thio group it means a combined thio group, and specific examples include a methylthio group, an ethylthio group, a 1-propylthio group, a 2-propylthio group, a butylthio group, and a pentylthio group.
  • C alkoxycarbonyl group refers to “C alkoxy
  • 1-6 group '' means a bonded carbonyl group, specifically, for example, methoxycarbo Examples thereof include a benzyl group, an ethoxycarbonyl group, a 1-propyloxycarbonyl group, and a 2-propyloxycarbonyl group.
  • C alkyl sulfonyl group is the above-defined “C alkyl group”.
  • Is a bonded sulfonyl group and specific examples include a methylsulfonyl group, an ethylsulfonyl group, a 1-propylsulfonyl group, and a 2-propylsulfonyl group.
  • halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom.
  • C aryl group refers to an aromatic hydrocarbon having 6 to 10 carbon atoms.
  • heterocycle refers to a non-aromatic ring containing one to two heteroatoms in the atoms constituting the ring and having a double bond in the ring. Or an aromatic ring.
  • nitrogen-containing heterocyclic ring refers to a non-aromatic compound containing one to two nitrogen atoms in the atoms constituting the ring and having a double bond in the ring.
  • a ring of aromaticity or an aromatic ring is meant.
  • hetero atom means a sulfur atom, an oxygen atom or a nitrogen atom.
  • the "5- to 10-membered nitrogen-containing heteroaryl ring" in the present specification refers to a compound having a number of atoms of 10 to 10 and at least one nitrogen atom in the atoms constituting the ring. Further, it means an aromatic ring which may further contain one or more hetero atoms other than a nitrogen atom.
  • a pyridine ring preferably, a pyrrole ring or an imidyl ring is used.
  • a dazole ring can be mentioned, and more preferably a pyridine ring can be mentioned.
  • the term "5-10 membered nitrogen-containing heteroaryl group” refers to one derived by removing one or two hydrogen atoms at any position from the "5-10 membered heteroaryl ring”. Means a divalent or divalent group. Specifically, pyridyl, pyrrolyl, oxazolyl, isooxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, indolyl, isoindolyl, imidazolyl, triazolyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazuryl, quinolyl Group, isoquinolyl group and benzimidazolyl group.
  • the number of atoms constituting the ring is eight or eight
  • the ring may contain one or two double bonds
  • a 418-membered nitrogen-containing hetero ring containing a nitrogen atom as a hetero atom is preferable.
  • the 4- to 8-membered hetero ring include an azetidine ring, a pyrrolidine ring, a piperidine ring, an azepan ring, an azocan ring, a tetrahydropyran ring, a morpholine ring, a thiomorpholine ring, a piperazine ring, Examples include a thiazolidine ring, a dioxane ring, an imidazoline ring, and a thiazoline ring.
  • Preferable examples of the "418-membered hetero ring" include a pyrrolidine ring, a piperidine ring, a monoreforin ring, and a piperazine ring.
  • the term "418-membered heterocyclic group” refers to a monovalent group derived by removing one or two hydrogen atoms at any position from the aforementioned "418-membered heterocyclic ring". Or a divalent group.
  • Specific examples of the 4- to 8-membered heterocyclic group include azetidyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, azepanyl, azocanyl, tetrahydropyranyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, piperazinyl, and thiazolidinyl groups. , A dioxanyl group, an imidazolyl group, a thiazolyl group and the like.
  • fused aromatic heterocycle refers to a cyclic structure in which the heterocyclic moiety is ortho-fused to an aromatic ring such as a benzene ring, and the heterocyclic moiety is a heterocyclic moiety as defined above.
  • aromatic ring such as a benzene ring
  • fused aromatic heterocyclic group refers to a cyclic structure in which the heterocyclic moiety is ortho-condensed with an aromatic ring such as a benzene ring.
  • the formula moiety is a heterocyclic group as defined above.
  • indolinyl group isoindolinyl group, 1,2,3,4-tetrahydroquinoline and the like can be mentioned.
  • halogenated C alkyl group is defined in the above-mentioned "C alkyl group”.
  • a trifluoromethyl group, a difluoromethyl group, a monofluoromethyl group and the like can be mentioned.
  • the term "may have a substituent" in the present specification means that the substitutable site may have one or more substituents in any combination.
  • Specific examples of the substituent include a group selected from the following substituent group A.
  • Halogen atom hydroxyl group, mercapto group, nitro group, cyano group, formyl group, carboxyl group, trifluoromethyl group, trifluoromethoxy group, amino group, oxo group, imino group, C
  • salt in the present specification is not particularly limited as long as it forms a salt with the compound of the present invention and is pharmacologically acceptable.
  • inorganic base salts organic base salts, acidic or basic amino acid salts, and the like.
  • Preferred examples of the inorganic acid salt include, for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate, and the like.
  • Preferred examples of the organic acid salt include, for example, acetate And succinate, fumarate, maleate, tartrate, citrate, lactate, stearate, benzoate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate and the like.
  • Preferred examples of the inorganic base salt include an alkali metal salt such as a sodium salt and a potassium salt, an alkaline earth metal salt such as a calcium salt and a magnesium salt, an aluminum salt, and an ammonium salt.
  • Preferred examples of the base salt include, for example, getylamine salt, diethanolamine salt, megnolemine salt, N, N, -dibenzylethylenediamine salt. And so on.
  • Preferable examples of the acidic amino acid salt include, for example, aspartate and glutamate, and preferable examples of the basic amino acid salt include, for example, arginine, lysine, and onorenitine.
  • the compound of the present invention may absorb water when left in the air to form adsorbed water or form a hydrate. Included in the present invention.
  • the compounds of the present invention may absorb some other solvents and form solvates, and such salts are also included in the present invention.
  • gene refers to DNA or RNA that encodes a transcription unit in a sense or antisense manner.
  • a transcription unit refers to a sequence that is transcribed in succession.
  • a nucleic acid (DNA or RNA) encoding a certain protein is also referred to as a gene of the protein in the present invention.
  • SRPIN-1 SR protein phosphorylation inhibitor 1
  • SRPIN-1 or its analog SRPIN-1
  • SRPIN-1 or its analog the enzyme activity of SRPK is inhibited by SRPIN-1 or its analog
  • the phosphorylation of SR protein is inhibited and the ubiquitin / proteasome pathway is inhibited.
  • HIV infection experiments revealed that these compounds had an antiviral effect in suppressing virus replication.
  • the present invention exerts an effect of providing an effective antiviral agent against a wide range of viruses by the same mechanism by controlling the activity of the SR protein.
  • FIG. 1A “Phosphorylation of SR protein in HIV-infected cells” Phosphorylated SR protein in Flp-In_293 cells transfected with the pNL4_3 genome was converted to anti-phosphorylated SR protein mouse monoclonal antibody (Mabl04), Examination was made by Western analysis using SC35 mouse antibody and anti-SF2 mouse antibody.
  • FIG. 1B "Degradation of SR protein" A plasmid gene of the SRp75, SRp55, and SRp40 genes fused with an HA tag was introduced into Flp-In-293 cells, and MG132 (474790; purchased from CALBIOCHEM) was added to the final concentration (10 / M ) Lyse the cells and heat denature to obtain protein sump
  • SRPK2 stably expressing cells obtained by introducing mouse SRPK2 gene into Flp-In-293 cells and parent strain
  • Figure 2B “Presence of SR protein in SRPK2 stably expressing cells”
  • the same mock and SRPK2-2 cells as in Figure 2A were transfected with the HIVpNL4_3 genome and the SRp75, SRp55, and SRp40 plasmids fused with the HA tag. 36 hours later, the sample was collected and subjected to Western analysis.
  • FIG. 2C “Measurement of HIV production amount” The culture supernatant in the case of FIG. 2A above was collected and the HIV production amount was measured.
  • FIG. 3B "Study on the effect of hnRNPAl on HIV production in vivo"
  • the amount of hnRNPAl expression plasmid The gene was transfected into Flp-In293 cells. After 36 hours, the culture supernatant was collected, and the amount of HIVp24 was measured using a Noremi pulse ELISA system.
  • FIG. 4B "Study on inhibition of SRPK1 phosphorylation activity using SRPIN-1" RS peptide corresponding to the RS domain of SF2 was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) to 10 (/ 011 did.
  • Reaction buffer 250 MgCl, 0.25 mM ATP, 1 mCi
  • FIG. 4C "Study on inhibition of SR protein phosphorylation in vivo using SRPIN-1 and accompanying induction of SR protein degradation" 36 hours after transfection of HA-SRp75 plasmid into Flp-In293 cells MG132 (10 ⁇ M final concentration) and SRPIN_1 (10, 20, 50 ⁇ M) were added, respectively, and incubated for 15 hours. Thereafter, the cells were lysed, subjected to SDS-PAGE, and subjected to Western analysis using an anti-III antibody. Western analysis was performed using an anti-actin antibody as a control for the amount of protein.
  • FIG. 4D “Study on inhibition of HIV infection by addition of SRPIN_1” Simultaneously with addition of HIV virions prepared with 293T cells to MT-4 cells, SRPIN-1 (final concentration 0.5, 10, 20 ⁇ ) was added. I added the calories. After incubating for 2 hours at 37 ° C and 5% CO culture conditions, the cells were centrifuged and replaced with a culture solution. After 48 hours, the culture supernatant was collected and the amount of HIVp24 was measured by a Lumipulse ELISA system.
  • FIG. 5A "Study on SRPK inhibitory activity by SRPIN-1 and its analogs" [0113] SRPIN-1 (Compound No. 340) and its analogs (Compound Nos. 341 349, 608-626) on SRPK1 and SRPK2 phosphorylation The inhibitory effect was quantified.
  • FIG. 5B "Suppressive effect of SRPIN-1 and its analogs on HIV replication" The results of the inhibition of HIV replication by SRPIN-1 and its analogs on MT-4 cells are shown.
  • FIG. 5C "SRPIN-1 and its analogs suppress HIV replication" Using Jurkat cells 5B shows the results of measuring the inhibitory effect of SRPIN-1 and its analogs on HIV replication in the same manner as in FIG. 5B.
  • FIG. 6A "Antiviral effect of SRPIN-1 on Sindbis virus" A phase-contrast microscope image of cells infected with Sindbis virus was shown. In SRPIN-1 untreated cells, cytotoxicity due to the growth of Sindbis virus was remarkably observed, but administration of SRPIN-1 dramatically suppressed cell damage.
  • FIG. 6B Antiviral effect of SRPIN-1 on Sindbis virus.
  • FIG. 7 "Antiviral effect of SRPIN-1 and its analogs on cytomegalovirus" A phase-contrast microscope image of cells infected with cytomegalovirus is shown. In the control cells (1 and 2 in the figure), morphological changes and cell death specific to cytomegalovirus infection were observed at a high rate, whereas SRPIN-1 or its analog (Compound No. 349) was observed. In the cells added (20 / il) (3 and 5 in the figure), abnormal morphological changes and cell death due to cytomegalovirus infection were suppressed.
  • FIG. 8 “Antiviral activity of SRPIN-1 and its analogs against SARS virus” The results of plaque assay of cells infected with SARS virus were shown. The number of plaques that died due to infection with SARS virus was counted, and the antiviral activity of SRPIN-1 and its analogs was examined (plaque assay). As a result, as shown in FIG. 8A, 40 ⁇ M of SRPIN-1 and its analogous compound (Dragon Compound No. 349) significantly suppressed the growth of SARS virus. Further, as shown in FIG. 8B, it was found that SRPIN-1 inhibited the growth of SARS virus in a concentration range of 1 ⁇ M to 40 ⁇ M in a concentration-dependent manner.
  • the present inventors have been able to inhibit the replication of HIV by inhibiting the SRPK enzyme that phosphorylates the SR protein. And whether it could provide an antiviral agent.
  • the inventors of the present application reported that infection of cells with HIV virus and phosphorylation status of SR protein And the presence or absence of SR proteins in cells. Specifically, after infecting 293 cells with the NL4-3 type HIV virus, the phosphorylated protein in the cells and the cells in the cells are stimulated by an antibody against the SR protein and an antibody against the phosphorylated SR protein. Was examined for SR protein (total amount).
  • the SR protein has the ability to stabilize in cells by being phosphorylated, and conversely, the SR protein can be degraded by dephosphorylating the SR protein.
  • the present inventors expressed the SR-HA fusion protein in 293 cells, and reacted with anti-HA-antibody depending on the presence or absence of MG132, a ubiquitin 'proteasome inhibitor.
  • MG132 a ubiquitin 'proteasome inhibitor.
  • SR protein is dephosphorylated and degraded via the ubiquitin 'proteasome. Since SR protein is essential for gene transcription, it was found that dephosphorylation of SR protein can inhibit virus growth.
  • hnRNPAl which is known to act synergistically with SR protein, which promotes splicing in vitro. It was found for the first time in vivo that HIV production was further enhanced and HIV production was inhibited in a dose-dependent manner on hnRNPAl.
  • dephosphorylation of the SR protein is a defense reaction against a virus in a living body (human body).
  • a virus in a living body human body
  • an adenovirus and a vaccinia virus they have already been infected in animal cells and then infected in the animal cells.
  • has been confirmed to be dephosphorylated (Nature Vol. 393, pp. L85-187, EMBO R mark Vol. 3, pp. 1088-1093), and is dephosphorylated as described above.
  • the SR protein is rapidly degraded and becomes unavailable for the expression of viral genes, and it is thought that these viruses cannot be propagated after all.
  • the present inventors have also found that the SRPK inhibitor suppresses the activity of SR protein in Sindbis virus, cytomegalovirus, and SARS coronavirus, which are different viruses from HIV. Make sure you do. Therefore, the antiviral effect by controlling the activity of SR protein is effective against a wide range of viruses.
  • the present invention includes an antiviral agent, a method for inhibiting virus production, and a method for treating a viral disease by controlling the activity of the SR protein.
  • the present invention includes an antiviral agent containing an SR protein activity regulator as an active ingredient.
  • the regulation of the activity of the SR protein includes regulation of expression and regulation of stabilization.
  • the activity of the SR protein can be reduced by suppressing the transcription or translation of the SR protein, or by decreasing the stability of the mRNA encoding the SR protein or the stability of the SR protein.
  • an SR protein activity inhibitor which directly or indirectly reduces the activity or expression level of the SR protein is used.
  • SRPK In order to reduce the activity or expression level of SR protein, besides directly targeting SR protein, it is also preferable to suppress the phosphorylation of SR protein by SRPK and / or promote the dephosphorylation.
  • activation of protein phosphatase 2A also referred to as phosphatase 2A
  • phosphatase 2A promotes dephosphorylation of SR proteins. Therefore, virus growth can be suppressed by using a compound that increases the expression and / or activity of protein phosphatase 2A.
  • SRPK inhibitors are suitable antiviral agents in the present invention.
  • the SR protein whose activity should be reduced or inhibited in the present invention is any SR protein, that is, X16 / SRp20, SF2 / ASF / SRp30a, SC35 / PR264 / SRp30b, SRp30c, 9G8, HRS / SRp40, SRp46, SRp55 , SRp75, and force including p54
  • the SR protein means SF2 / ASF / SRp30a, SC35 / PR264 / SRp30b, SRp30c, HRS / SRp40, SRp46, and SRp75, and particularly preferably SRp40 and SRp75.
  • the SR protein means SF2 / ASF / SRp30a, SC35 / PR264 / SRp30b, SRp30c, HRS / SRp40, SRp46, or SRp75.
  • the gene sequence encoding X16 / SRp20 is, for example, Accession number L10838.
  • NP_003008 indicated in AAA36648 (Zahler, A. et al., 1992, SR proteins: a conserved family of pre-mRNA splicing factors, Genes Dev. 6: 837-847).
  • the gene sequence encoding SF2 / ASF / SRp30a is shown, for example, in Accession number NM.006924, 91-834.
  • the amino acid sequence of SF2 / ASF / SRp30a is shown in Accession number NP_008855, Q07955 (Ge, H. et al., Cell 66, 373-382 (1991)).
  • the gene sequence encoding SC35 / PR264 / SRp30b is shown in Accession number M90104, 156-818, for example.
  • the amino acid sequence of SC35 / PR264 / SRp30b is shown in Accession number AAA60306, Q01130 (Fu, X.D. and Maniatis, T. Science 256, 535-538 (1992)).
  • the gene sequence encoding SRp30c is, for example,
  • SRp30c is shown in Accession number AAA93069, Q13242, NP_003760. (Screaton, GR et al "EMBO J. 14, 4336-4349 (1995)).
  • the gene sequence encoding 9G8 is shown in, for example, Accession number NM_006276, 54-464.
  • the amino acid sequence is shown in Accession number NP_006267, Q16629 and the like (Lejeune, F. et al., J. Biol. Chem. 276, 7850-7858 (2001); Popielarz, M. et al., J. Biol. Chem. 270, 17830-17835 (1995); Cavaloc, Y. et al., EMBO J. 13, 2639-2649 (1994))
  • the gene sequence encoding HRS / SRp40 is, for example, Accession number.
  • AF020307 (join (2406-2531, 2864-2925, 3049-3147, 3433-3503, 4740-4812, 5269-5382, 5472-5492)), the amino acid sequence is shown in Accession number AAC39543, Q13243, etc. Du, K. and Taub, R "Gene 204 (1-2), 243-249 (1997); Screaton, GR et al” EMBO J. 14, 4336-4349 (1995)).
  • the gene sequence encoding SRp46 is shown in Accession number AF031166, 1-816, for example.
  • the amino acid sequence of SRp46 is shown in Accession number AAK54351 and the like (Soret, J. et al., Mol. Cell. Biol.
  • the gene sequence encoding SRp55 is shown in Accession number U30883 at 106-1137, for example.
  • the amino acid sequence of SRp55 is shown in Accession number AAA93073, Q13247 and the like (Screaton, GR et al "EMBO J. 14, 4336-4349 (1995); Zahler, AM et al., Genes Dev. 6, 837 -847 (1992); Barnard, DC and Patton J.G., Mol. Cell. Biol. 20, 3049-3057 (2000))
  • the gene sequence encoding SRp75 is, for example, 98-1579, Accession number BC002781, NM_005626
  • SRp75 The amino acid sequence of SRp75 is shown in Accession number AAH02781, NP-005617, Q08170 and the like (Zahler, A.M. et al., Mol. Cell. Biol. 13, 4023-4028 (1993)).
  • the gene sequence encoding p54 is shown, for example, in Accession number M74002 at 84-1535.
  • the amino acid sequence of p54 is shown in Accession number AAA35554, Q05519 and the like (Chaudhary, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8189-8193 (1991)).
  • the antiviral agent of the present invention is particularly suitable for inhibiting the growth of HIV, but is not limited to human immunodeficiency virus (HIV), but also severe acute respiratory syndrome (SARS) belonging to RNA type virus, poliovirus, human rhinovirus Virus, adult T cell leukemia virus (HTLV_I), type A, type C, D It has the same effect for viruses other than hepatitis B virus such as hepatitis B or E, vaccinia virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, human coronavirus, Ebola hemorrhagic fever virus, influenza virus, and Sindbis virus. .
  • the Drosophila oral virus includes SARS coronavirus (also referred to as SARS-associated coronavirus or SARS virus).
  • SR protein has also been reported as a host defense mechanism during infection with DNA-type viruses such as simple herpes virus and human adenovirus.
  • DNA-type viruses such as simple herpes virus and human adenovirus.
  • particularly suitable target viruses include retroviridae viruses.
  • Togaviridae including alphaviruses; Herpesviridae viruses (Herpesviridae; including cytomegaloinoles); and Coronawinores; innores (Coronaviridae; including coronaviruses).
  • the present invention includes (1) an antiviral agent by reducing or inhibiting the activity of an SR protein, more specifically, (i) an antiviral agent by promoting dephosphorylation of an SR protein, and ii) Antiviral agents that inhibit proteins that phosphorylate SR proteins are included.
  • the present invention provides (2) an antiviral agent by inhibiting the expression of SR protein, and (3) an antiviral agent by activating a protein having a function opposite to that of SR protein. Is included.
  • the present invention relates to an anti-viral agent containing a compound that inhibits the activity and / or expression of SRPK.
  • SRPK SRPK1 and / or SRPK2
  • SRPK2 SRPK1 and / or SRPK2
  • the present invention also includes (1) a method for inhibiting virus production by reducing or inhibiting the activity of SR protein, and more specifically, (i) a method for promoting virus dephosphorylation of SR protein. And (ii) a method of inhibiting virus production by inhibiting a protein that phosphorylates the SR protein.
  • the present invention relates to a method for inhibiting virus production, which comprises the step of inhibiting the activity and / or expression of SRPK.
  • the present invention includes (2) a method for inhibiting virus production by inhibiting the expression of SR protein, and (3) a method for activating a protein having a function opposite to that of SR protein.
  • a method for inhibiting production of Norres is included.
  • the present invention also includes the following inventions.
  • [Ml] A method for suppressing virus growth, comprising the step of reducing the activity or expression level of an SR protein.
  • [M2] The method of [M1], wherein the SR protein is SF2 / ASF / SRp30a, SC35 / PR264 / SRp30b, SRp30c, HRS / SRp40, SRp46, or SRp75.
  • [M3] The method according to [M1] or [M2], which is a step of suppressing the phosphorylation of the SR protein or promoting the dephosphorylation of the SR protein by reducing the activity or expression level of the SR protein.
  • [M4] The method according to [M3], which is a step of increasing protein phosphatase 2A (Protein Phophatase 2A) activity by inhibiting the phosphorylation of SR protein or promoting dephosphorylation.
  • protein phosphatase 2A Protein Phophatase 2A
  • M5 one or more selected from the group consisting of the HIV tat gene, the adenovirus E4-ORF4 gene, and the vaccinia virus VH1 gene, which increase the activity of protein phosphatase 2A (Protein Phophatase 2A).
  • [M6] The method of [M3], wherein the step of inhibiting the phosphorylation or promoting the dephosphorylation of the SR protein is a step of inhibiting the expression or activity of SRPK.
  • R 1 , R 2 , Q and W are as described in the above [16] in the present specification.
  • R 1 force hydrogen atom, a C alkyl group which may have a substituent, or a halogen atom
  • [M14] The method of [M8], selected from the group consisting of Compound Nos. 340, 348, 613, 616, 618, 622, and 624 described in the present specification.
  • [M16] The method according to [M1] or [M2], which is a step of administering a substance having an activity reverse to that of the SR protein, which reduces the activity or expression level of the SR protein.
  • [M17] The method according to [M16], which is an hnRNP A1 expression vector having an activity opposite to that of the SR protein.
  • [M18] virus (1) Human immunodeficiency virus (HIV), severe acute respiratory syndrome (SARS), poliovirus, human rhinovirus, adult T-cell leukemia virus (HTLV_I), type A, type C, type D Or any RNA-type virus of hepatitis E virus, vaccinia virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, human coronavirus, Ebola virus, influenza virus, or Sindbis virus, or (2) simple herpes virus Human hepatitis B virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, herpes virus, human herpes virus, smallpox virus, poliovirus virus, or human papillomavirus, including human adenovirus.
  • HCV Human immunodeficiency virus
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • poliovirus human rhinovirus
  • HTLV_I adult T-cell leukemia virus
  • type A type C
  • type D Or any RNA-type virus of hepatitis E virus, vaccinia virus,
  • [M19] A method for inhibiting SRPK, comprising a step of administering the aniline derivative according to [M8], a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • [M26] The ability of the aniline derivative described in [M8] to be selected from the group consisting of the compound numbers 340, 348, 613, 616, 618, 622, and 624 described in the present specification, or a pharmaceutical thereof.
  • the present invention relates to the use of a compound that reduces the expression and / or activity of an SR protein for inhibiting the growth of a virus, and the production of an antiviral agent (a reagent and / or a medicament for suppressing the growth of a virus). Regarding use. Specifically, the present invention also relates to the following inventions.
  • [U2] The use according to [U1], wherein the SR protein is SF2 / ASF / SRp30a, SC35 / PR264 / SRp30b, SRp30c, HRS / SRp40, SRp46, or SRp75.
  • [U3] The use of [U1] or [U2], which is a compound that suppresses the phosphorylation of SR protein or promotes dephosphorylation, which is a compound capable of reducing the activity or expression level of SR protein.
  • [U4] The use according to [U3], which is a compound capable of suppressing the phosphorylation of SR protein or promoting dephosphorylation, which is a compound which increases the activity of protein phosphatase 2A (Protein Phophatase 2A).
  • a compound that increases the activity of protein phosphatase 2A is selected from the group consisting of HIV tat gene, adenovirus E4-ORF4 gene, and vaccinia virus VH1 gene Use according to [U4], which is a vector for expressing the above genes.
  • [117] The use of [U6], wherein 51 ⁇ 3 ⁇ 4 is 51 ⁇ 11 or 31 ⁇ 3 ⁇ 42.
  • [U8] The ability of the compound to inhibit the expression or activity of SRPK.
  • R 1 , R 2 , Q and W are as described in the above [16] in the present specification.
  • R 1 is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted C alkyl group, or a halogen atom.
  • R 3 is a C aryl group which may have a substituent
  • R 5 and R 6 are as defined above, or the use according to any one of [U8] to [U12].
  • [U16] The use of [U1] or [U2], which is a substance having an activity reverse to that of SR protein, which is a compound capable of reducing the activity or expression level of SR protein.
  • viruses include (1) human immunodeficiency virus (HIV), severe acute respiratory syndrome (SARS), poliovirus, human rhinovirus, adult T-cell leukemia virus (HTLV_I), type A, type C, and type D Or any RNA-type virus of hepatitis E virus, vaccinia virus, Japanese encephalitis virus, dengue virus, human coronavirus, Ebola virus, influenza virus, or Sindbis virus, or (2) simple herpes virus , Including human adenovirus, hepatitis B virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, herpes virus, human herpes virus, smallpox virus, poliovirus, or human papilloma virus.
  • HCV human immunodeficiency virus
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • poliovirus human rhinovirus
  • HTLV_I adult T-cell leukemia virus
  • type A type C
  • type D or any RNA-type virus of hepatitis E virus, vaccinia virus, Japanese
  • R 1 is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted C alkyl group, or a halo.
  • the R 3 has a substituent, may have a substituent, a C aryl group, or has a substituent.
  • R 5 and R 6 are as defined above, according to any one of [U19] to [U24].
  • [U26] The ability of the aniline derivative described in [U8] to be selected from the group consisting of the compound numbers 340, 348, 613, 616, 618, 622, and 624 described in the present specification, or a pharmaceutical thereof.
  • the invention of the present application includes (1) a method for treating or preventing a viral disease by reducing or inhibiting the activity of SR protein, and more specifically, (i) a method for treating a disease of Vinoles by dephosphorylating the SR protein. Or (ii) a method for treating a viral disease by inhibiting a protein that phosphorylates the SR protein.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing a viral disease comprising a step of inhibiting the activity and / or expression of SRPK. Inhibition of SRPK inhibits the phosphorylation of SR proteins, and suppresses virus growth by reducing SR protein levels.
  • the invention of the present application further includes (2) a method for treating or preventing a viral disease by inhibiting the expression of SR protein, and (3) a virus by activating a protein having a function opposite to that of SR protein. Disease treatment or prevention methods are included.
  • the present invention further includes a method for screening an antiviral agent and the use of an SRPK enzyme inhibitor.
  • the present invention includes (1) a method of screening an SRPK inhibitor using an SR protein or an RS or a peptide that is continuous twice or more as an SR substrate.
  • the invention of the present application further includes (1) an SRPK enzyme inhibitor containing SRPIN-hota analog as an active ingredient, (2) a virus growth inhibitor containing SRPIN-hota analog as an active ingredient, And (3) an antiviral therapeutic comprising SRPIN-1 or an analog thereof as an active ingredient Is included.
  • Antiviral agents that reduce or inhibit the activity of SR proteins
  • polypeptides encoded by the HIV tat gene eg, Accession number AAK08486), or a polypeptide encoded by adenovirus E4-ORF4 (eg, Accession number AAB37507), or a polypeptide encoded by Vexin virus VH1 (eg, Accession number AAV38329).
  • an expression vector for gene therapy carrying the HIV tat gene, the adenovirus E4-ORF4 gene, or the vaccinia virus VH1 gene is included.
  • the CDS of Accession number AF324493 (5830-6044 plus 8369-8411)
  • the E4-ORF4 is the CDS of Accession number S82508 (1634-1993)
  • the vaccinia virus VH1 is the CDS of Accession number BT019522. 1-555).
  • SRPK is the only enzyme capable of performing a specific phosphorylation that contributes to stabilization of the SR protein. Therefore, in order to prevent the stabilization due to the phosphorylation of the SR protein, the enzyme that phosphorylates the target SR protein includes, among others, SRPK among the phosphorylases of the SR protein, and SRPKl ( Nature (1994) Vol. 369, pp. 678-682) and SRPK2 (Biochem. Biophys. Res.Commun. (1998) Vol. 242: pp.
  • the nucleotide sequence of the SRPK1 gene is Accession number NM-003137 124-2088, U09564 109-2073, AJ318054 10-2487, NM016795 43-1986, etc., and the amino acid sequence is NP_003128, AAA20530, CAC39299, CAA11833, NP_058075 etc. Can be referred to.
  • nucleotide sequence of the SRPK2 gene 188-2245 of Accession number U88666, 208-2253 of NM_009274, etc.
  • amino acid sequence, AAC05299, NP_033300, etc. can be referred (Nikolakaki, E. et al, J. Biol. Chem. 276, 40175-40182 (2001); Papoutsopoulou, S., et al "Nucleic Acids Res. 27, 2972-2980 (1999); Wang, HY et al, Genomics 57, 310-315 (1999); GuiJ.F. et al "Nature 369, 678-682 (1994); Wang, HYet al., J.
  • SRPK1 includes those described as SRPKla.
  • Examples of the substance having a function of inhibiting a phosphorylating enzyme (SRPK) used in the method of the present invention include compounds represented by the following general formula (including SRPIN-1 and its analogs), and pharmaceutically acceptable salts thereof. Acceptable salts and hydrates can be used.
  • R 1 is a hydrogen atom, an optionally substituted C alkyl group
  • alkoxy group a group having a substituent, a C alkoxy group, a group having a substituent, a C
  • R 2 is a hydrogen atom, a C alkyl group which may have a substituent, or a
  • R 3 is an optionally substituted C alkyl group, an optionally substituted C
  • R 4 represents a hydrogen atom or a halogen atom
  • Q is one C (0) _, one C (S)-, -SO-, one C (S) NHC ( ⁇ ) _, one C (0) NHC (0) _, or-
  • W is a hydrogen atom, a substituent having a substituent, a C alkyl group, a substituent having a substituent,
  • R 5 and R 6 are the same or different from each other, and each independently represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted C alkyl group, a substituted or unsubstituted nitrogen-containing group.
  • a condensed aromatic heterocyclic ring, an acyl group, or an acylamino group or
  • R 5 and R 6 may form a heterocyclic ring which may have a substituent together with an adjacent nitrogen atom, and the heterocyclic ring may have a substituent. It may be a good fused aromatic complex;
  • R 5 and R 6 may be a cycloalkylideneamino group which may have a substituent, a substituted or unsubstituted cycloalkylideneamino group, or an aromatic ring-fused cycloalkylidene group. ,. ).
  • the SRPIN-I of the present invention can be obtained from Maybridge (Trevillett, Tintagel, Cornwall PL34 OHW, England) and Ambinter (46 quai Louis Bleriot, Pans, F-75016 France). Can be chemically synthesized.
  • RNAi against SRPK1 gene and SRPK2 gene In order to reduce the expression of SRPK1-encoding gene and SRPK2-encoding gene in cells, siRNA, monorefurino Oligos or miRNAs can be used.
  • a siRNA can be designed using a known method.
  • the siRNA can be designed by the following method.
  • (i-2-1) The target sequence of the siRNA should not be near the 5'-side or 3'-side UTR (untranslated region) start codon and should be at least 50 bases downstream from the start codon, In the ORF, 19 to 21 bases starting from AA or starting from NA (19 bases are most common), with a CG content of around 50%, and as little as possible 5 'or 3' bias and repeated sequences An array can be used.
  • the siRNA can be prepared by adding dTdT or UU2 base overhang when starting from AA, or dTdN, dTdT or UU when the target sequence starts from NA.
  • the selected sequence is subjected to similarity to other RNA sequences using a BLAST search or the like. Check.
  • the present invention also includes an embodiment using an siRNA expression vector prepared so that the designed siRNA is expressed in cells.
  • the morpholino oligo is a compound in which a plurality of morpholino subunits having a base are linked in a chain, and is composed of a morpholin ring and a non-ionic phospholin diamidate.
  • Morpholino antisense oligos can be suitably used for suppressing the expression of target genes because of their high affinity for mRNA, which has high intracellular stability (Summerton JE., Ann NY Acad Sci 2003; 1002 : 189). Methods for designing effective morpholino oligos are already known (Summerton, 1989, In: Discoveries in Antisense Nucleic Acids; Ed .: C. Brakel; Pub .: The Portfolio Publishing Co., Woodlands, Texas; pages 71 -80; Summerton & Weller, 1997, Antisense Nuc. Acid Drug Dev. 7, 187; and the Gene Tools website). Morpholino oligos are available from Gene Tools (Gene Tools, LLC, Philomath, OR).
  • the antiviral agent by inhibiting the expression of the gene encoding the SR protein includes, for example, siRNA, morpholino oligo, or miRNA.
  • the method (i) can be used.
  • the function opposite to that of the SR protein refers to a function of promoting selection of a 3 ′ splice site distal to an intron, for example, in splicing. That is, the activity of the SR protein can be canceled using a splicing regulator opposite to the SR protein that promotes selection of the 3 'splice site proximal to the intron.
  • proteins having functions opposite to those of SR proteins include heteronuclear proteins such as hnRNP Al, A2, and B1.
  • hnRNPs ribonucleoproteins
  • the preferred ability is to include hnRNP A1. More preferably, an antiviral agent in which a gene encoding hnRNP A1 is loaded on an expression vector for gene therapy is used.
  • the gene sequences encoding hnRNP A1 are shown in, for example, Accession numbers NM_002136 at 105-1064 and NM_031157 at 105-1220.
  • the amino acid sequence of hnRNP A1 is Accession number NP_002127,
  • hnRNP A2 / B1 The gene sequence encoding hnRNP A2 / B1 is shown in, for example, Accession number NM.002137 170-1192 and NM_031243 170-1228.
  • the amino acid sequence of hnRNP A2 / B1 is shown in Accession number NP_002128, NP_112533, etc. (Kozu, T., et al., Genomics 25, 365-371 (1995); Biamonti, G. et al., Nucleic Acids Res.
  • the method for screening an antiviral agent of the present invention is, for example, a method comprising selecting a SRPK inhibitor comprising a step of causing a test compound to act on SRPK and a step of assaying the ability of SRPK to phosphorylate the SR protein. is there.
  • Compounds that decrease the ability are useful as antiviral agents.
  • the present invention includes anti-virus which includes screening various compounds targeting SRPK1 or SRPK2 with an SR protein or a peptide of RS or SR or a peptide having two or more consecutive SRs as an SRPK substrate. Agent screening methods are also included.
  • SRPK inhibitor a compound that effectively inhibits the SR protein phosphorylation activity of SRPK can be selected.
  • the screening of the present invention includes the following steps.
  • an SR protein As the substrate, an SR protein, a partial polypeptide thereof containing an RS domain as described above, or a polypeptide in which RS or SR is repeated twice or more continuously can be used (see Examples).
  • the SRPK may be wild-type SRPK1 or SRPK2, or a fusion protein to which a tag peptide has been added or other modified proteins as long as phosphorylation activity is maintained.
  • SRPK or the like having a mutation is also referred to as SRPK as long as the phosphorylation activity on the SR protein is maintained.
  • SRPK1 refers to (a) a protein containing the amino acid sequence described in Accession number NP_003128, AAA20530, CAC39299, CAA11833, or NP_058075; (b) 80% or more, preferably Is a protein having an amino acid sequence having an identity of 85%, more preferably 90%, and even more preferably 95% or more, which has phosphorylation activity. (C) Accession number 124-2088 of NM_003137, U09564 of
  • a protein having a phosphorylation activity which is a protein encoded by a nucleic acid that hybridizes under a stringent condition with a complementary strand of a nucleic acid containing 109-2073, 10-2487 of AJ318054, or 43-1986 of NMJ316795, and included.
  • SRPK2 is defined as (a) a protein containing the amino acid sequence of Accession number AAC05299 or NP_033300, (b) 80% or more, preferably 85%, more preferably 90%, more preferably 90% of the amino acid sequence.
  • a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity and having a phosphorylation activity includes part or all of 188-2245 of Accession number U88666 or 208-2253 of NM_009274
  • proteins encoded by nucleic acids that hybridize under stringent conditions with the complementary strands of the nucleic acids and that have phosphorylation activity.
  • a part means, for example, continuous 20 bases or more, preferably 25 bases or more, more preferably 30 bases or more, 40 bases or more, 45 bases or more, and 50 bases or more.
  • Amino acid sequence identity can be determined, for example, using the BLASTP program (Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). For example, all NCBI (National Center for Biothchnology Information) BLAST to Uefu of 1 to Shea and ⁇ this your Rere Fei filter one, including ow complexity is in the OFF, a search is performed using the default parameters (Altschul, SF et al (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, TL et al. (1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, SF et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.
  • the gap is treated in the same manner as the mismatch, and the identity value for the entire amino acid sequence of the wild-type protein indicated by the above Accession number (for example, the full length of SEQ ID NO: 2 or 4) is calculated.
  • the identity value may be calculated by ignoring gaps outside the amino acid sequence of the wild-type protein in the alignment.
  • a probe is prepared from either a nucleic acid containing a coding sequence of a wild-type protein (for example, SEQ ID NO: 1 or 3) or a nucleic acid to be hybridized, and the probe is prepared using the other nucleic acid.
  • Stringent hybridization conditions include, for example, 5 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC contains 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 7% (W / V) SDS, 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 5x Denhardt's solution (lx Denhardt's solution Contains 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% bovine serum albumin, and 0.2% ficoll) at 48 ° C, preferably 50 ° C, more preferably 52 ° C.
  • the condition is that washing is performed in O.lxSSC for 2 hours while shaking.
  • the phosphorylation activity of SRPK can be detected, for example, by reacting SRPK with a substrate using labeled ATP and quantifying the labeled substrate. Specifically, the method described in Example 4B may be followed.
  • the obtained compound may be further subjected to the following steps to detect an antiviral effect, and to further select a compound exhibiting a remarkable antiviral effect.
  • Viral growth or viral gene expression can be measured by detecting viral protein production in cells into which the viral genome has been introduced, as exemplified in the Examples.
  • the present invention also relates to an SRPK inhibitor and an antiviral agent comprising the compound selected by the above-mentioned screening method of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of a compound obtained by the above-described screening method of the present invention for the production of an SRPK inhibitor and / or an antiviral agent, and for the use for SRPK inhibition and / or antiviral treatment.
  • the present invention also includes the use of the above antiviral agent as a virus growth inhibitor or an antiviral therapeutic.
  • the above antiviral agent when SRPIN-1 is used as an antiviral agent, well-known pharmaceutical auxiliaries can be added in addition to SRPIN-1, such as AZT and protease. Inhibitors can be added.
  • the virus growth inhibitor or antiviral therapeutic of the present invention has, for example,
  • It can be administered intermittently or continuously, orally, transdermally, submucosally, subcutaneously, intramuscularly, intravascularly, intracerebrally, or intraperitoneally, to be anywhere between lOnM-lmM.
  • the SRPIN-1 analog compound of the present invention is described in more detail below.
  • the present invention relates to a compound having the following structure and use thereof.
  • the compound according to the present invention is an aniline derivative represented by the following general formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof.
  • R 1 is a hydrogen atom, an optionally substituted C alkyl group
  • Loxy group, having a substituent may be, c alkoxy group, having a substituent, may be,
  • R 2 has a hydrogen atom, a substituent, a substituent, a C alkyl group, or a substituent
  • R 3 is an optionally substituted C alkyl group, an optionally substituted C
  • R 4 represents a hydrogen atom or a halogen atom
  • Q is _C ( ⁇ ), -C (S), -SO, -C (S) NHC (O), _C ( ⁇ ) NHC (O), Or one C (O) NHC (S) —
  • W represents a hydrogen atom, a substituent having a substituent, a C alkyl group, a substituent having a substituent,
  • R 5 and R 6 are the same or different from each other, and each independently represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted C alkyl group, a substituted or unsubstituted nitrogen-containing group.
  • R 5 and R 6 together with a nitrogen atom which is in contact with P form a heterocyclic ring which may have a substituent.
  • the heterocyclic ring which may be substituted may be a condensed aromatic compound ring which may have a substituent;
  • R 5 and R 6 may be a cycloalkylideneamino group which may have a substituent, a substituted or unsubstituted cycloalkylideneamino group, or an aromatic ring-fused cycloalkylidene group. ,. ).
  • preferable compounds are, for example, the following compounds.
  • R 1 is a hydrogen atom, a C alkyl group which may have a substituent, or a halogen atom
  • a compound that is an atom is an atom.
  • R 1 is a hydrogen atom, a C alkyl group, a halogenated C alkyl group or a halogen atom;
  • a compound that is an atom is an atom.
  • R 1 is a hydrogen atom, a methyl group, a trifluoromethyl group, a chlorine atom or a fluorine atom.
  • the R 3 force S a C aryl group which may have a substituent, or a substituent.
  • a compound which is a 5- to 10-membered nitrogen-containing heteroaryl ring is a 5- to 10-membered nitrogen-containing heteroaryl ring.
  • a compound which is a phenyl group; or a pyridinole group is a compound which is a phenyl group; or a pyridinole group.
  • 1 3 is phenyl group, a tolyl group, Metokishifuweniru group or Nitorofue alkenyl group or compound is a pyridyl group,.
  • W is a hydrogen atom, a halogen atom, or the following general formula (II)
  • R 5 and R 6 are the same or different from each other, and may have a substituent.
  • 1-6 represents a alkyl group
  • R 5 and R 6 may form a heterocyclic group which may have a substituent together with an adjacent nitrogen atom, and the heterocyclic group may have a substituent. It may be a condensed aromatic heterocyclic group. ).
  • the W contains one nitrogen atom which may have a C alkyl group as a substituent
  • a nitrogen atom containing a 4- to 8-membered heterocyclic group or a phenyl group condensed with an oxygen atom A compound that is a 4- to 8-membered heterocyclic group containing an elemental atom.
  • W contains one nitrogen atom which may have a C alkyl group as a substituent
  • a compound that is a 4- to 8-membered heterocyclic group is a 4- to 8-membered heterocyclic group.
  • the above-mentioned W is a piperidinyl group or a pyridinyl group optionally having a C alkyl group as a substituent.
  • W is a hydrogen atom, a halogen atom, a getylamino group, a pyrrolidinyl group, a piperidinyl group, a 2_methylpiperidinyl group, a perhydroazepine group, an indolinyl group, an isoindolinyl group, or 1,2,3,
  • the compound may be a 4-tetrahydroquinolyl group.
  • R 1 in the order of (1) one (4), (4) is more preferable.
  • R 2 (7) is more preferable in the order of (5)-(7).
  • R 3 (8) - in the order of (13), (13) is more favorable preferable.
  • Q (16) is more preferable in the order of (15) and (16).
  • W (20) is more preferable in the order of (17)-(20). (21) is also preferred.
  • the present invention relates to any of the compounds exemplified above, and among these exemplified compounds, preferably, the exemplified compound numbers 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 608, 613, 615, 616, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, more preferably 340, 341, 342, 343, 345, 347, 348, 608, 613, 615 , 616, 618, 619, 620, 622, 623, 624, 625, 626, more preferably Compound No. 340, 348, 613, 616, 618, 622, 624, etc., and more preferably ⁇ , ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ , 340, ⁇ ⁇ ⁇ Can be
  • the present invention also relates to any compound exemplified above.
  • the present invention relates to the exemplified compound Nos. 341, 342, 346, 347, 348, 349, 612, 613, 614, 616, 617, 618, 619, 620.
  • Room temperature means a temperature of about 20-30 ° C.
  • compound la is reacted with compound 2a to obtain compound 3a.
  • the nitrobenzene derivative la as a raw material is obtained from a commercially available product or an appropriate functional group.
  • Hal is a halogen atom serving as a leaving group.
  • Compound 2a is a reagent containing -NR 5 R 6 to be introduced, and X is a hydrogen atom or the like. It is preferable to use 1 to 2 equivalents of the compound 2a.
  • the reaction can be performed in a solvent in the presence of a base.
  • bases examples include triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, and 4- (dimethyl
  • (amino) pyridine can be used.
  • the base is preferably used in an amount of 115 equivalents.
  • excess as base X-NR 6 (1 to 5 equivalents) can be used instead.
  • solvent examples include dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N-methylolepyrrolidone, dioxane, tetrahydrofuran, toluene and the like.
  • the reaction can be carried out at a temperature of 0 ° C. to 150 ° C., preferably at room temperature.
  • the nitro group of compound 3a is reduced to an amino group to obtain compound 4a.
  • the reduction can be carried out by contacting concentrated hydrochloric acid or the like in a solvent in the presence of tin chloride or the like.
  • a general reduction reaction such as catalytic hydrogenation can be used.
  • reaction solvent methanol, ethanol, N, N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, 1,4-dioxane, water, or a mixed solvent thereof can be used. .
  • reaction can be carried out at a reaction temperature of 0 ° C to 100 ° C.
  • compounds 3a and 4a are commercially available, and in such a case, commercially available products may be used.
  • W in the general formula (I) is hydrogen or halogen
  • commercially available products are often available.
  • compound numbers 608, 612, 623-626 and the like in the present specification correspond to this.
  • compound 4a is reacted with compound 5a to obtain compound 6a.
  • L is a halogen atom or the like.
  • the reaction can be carried out in a solvent in the presence of a base, optionally adding a catalyst. In this case, it is preferable to use 13 equivalents of the compound 5a.
  • reaction solvent dichloromethane, chlorophonolem, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran, toluene, pyridine, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone and the like can be used.
  • Bases include triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, 4- (dimethyl
  • (amino) pyridine can be used.
  • Examples of the catalyst include 4- (dimethylamino) pyridine.
  • the reaction can be performed at a reaction temperature of 0 ° C to 100 ° C.
  • the reaction can be carried out by reacting acyl isothiocyanate in a solvent in the presence of a base.
  • acyl isothiocyanate a commercially available product or a product appropriately prepared in a reaction solution from acylsilodilide and a thiocynate can be used as it is. It is preferable to use 115 to 5 equivalents of the acyl isothiocyanate.
  • thiocyanate potassium thiocyanate, sodium thiocyanate, ammonium thiocyanate and the like can be used, and it is preferable to use 115 equivalents.
  • solvent for example, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether, 1,4-dioxane and the like can be used.
  • the base for example, triethylamine, diisopropylamine, pyridine, 4- (dimethylamino) pyridine and the like can be used. It is preferable to use 115 equivalents of the base.
  • the reaction can be carried out at a reaction temperature of 0 ° C to 150 ° C.
  • the amide group of the compound 6a is alkylated (R 2 converted) to obtain a compound 7a.
  • the reaction can be performed using an alkylating reagent (R 2 _X) in a solvent in the presence of a base.
  • X is a halogen atom or a sulfonic acid ester serving as a leaving group. It is preferable to use one to five equivalents of the alkylating reagent (R 2 _X).
  • the solvent examples include N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, tetrahydrofuran, ethylene glycol dimethyl ether, 1,4-dioxane, acetonitrile, ether and the like.
  • sodium hydride, potassium hydride, lithium hydride, butyllithium, methyllithium, phenyllithium, lithium diisopropylamide and the like can be used. It is preferable to use 115 equivalents of the base.
  • the reaction can be carried out at a reaction temperature of 0 ° C to 150 ° C.
  • the reaction is performed using a thiocarbonylation reagent in a solvent.
  • thiocarbonylation reagent for example, Lawesson's reagent (
  • 2,4-bis (4-methoxyphenyl) -l, 3,2,4-dithiadiphosphetane 2,4-disulfide, pentasulfide (tetraphosphorus desulfide, P S) and the like can be used.
  • the thiocarbonylation reagent is 1
  • solvent examples include toluene, benzene, benzene, xylene, N, N-dimethylolephonoremamide, N-methylpyrrolidone, ethylene glycol dimethyl ether, 1,4-dioxane, tetrahydrofuran and the like.
  • the reaction can be carried out at a reaction temperature of 0 ° C to 200 ° C.
  • the raw material compounds' various reagents form salts, hydrates or solvates. All of them vary depending on the starting materials, the solvent used, and the like, and are not particularly limited as long as the reaction is not inhibited.
  • the solvent used also differs depending on the starting materials, reagents and the like, and it is needless to say that the solvent is not particularly limited as long as it does not hinder the reaction and dissolves the starting material to some extent.
  • the compound (I) according to the present invention is obtained as a free form, it is necessary to convert the compound (I) into a salt or a hydrate thereof which may be formed by a conventional method. S can.
  • the compound (I) according to the present invention When the compound (I) according to the present invention is obtained as a salt of the compound (I) or a hydrate of the compound (I), it can be converted to the free form of the compound (I) according to a conventional method. .
  • various isomers for example, geometric isomers, optical isomers based on asymmetric carbon, rotational isomers, stereoisomers, tautomers, etc.
  • SRPIN-1 analogs can be used to inhibit the activity of SRPK. That is, the phosphorylation activity of SRPK1 and / or SRPK2 can be inhibited by administering the SRPIN-1 analog described in the present specification.
  • the present invention relates to the use of SRPIN-1 analogs in inhibiting SRPK activity.
  • the present invention also relates to SRPK inhibitors comprising SRPIN-1 analogs. Further, the present invention relates to the production of an SRPK inhibitor,
  • the present invention relates to a method for inhibiting SRPK activity, comprising a step of contacting an SRPIN-1 analog with SRPK.
  • contacting with SRPK may mean administering an SRPIN-1 analog to a cell, tissue, and / or individual expressing SRPK in vivo or in vitro.
  • the SRPIN-1 analog can be used to suppress the growth of virus. That is, by administering the SRPIN-1 analog described herein, the virus growth is suppressed through inhibiting the phosphorylation activity of SRPK1 and / or SRPK2.
  • the present invention relates to the use of SRPIN-1 analogs in inhibiting viral growth.
  • the present invention also relates to antiviral agents containing SRPIN-1 analogs.
  • the invention also relates to the use of an SRPIN-1 analog in the manufacture of an antiviral agent.
  • the present invention relates to a method for suppressing virus growth, which comprises a step of bringing an SRPIN-1 analog into contact with SRPK.
  • contacting with SRPK may refer to administering an SRPIN-1 analog to cells, tissues, and / or individuals expressing SRPK in vivo or in vitro.
  • the present invention also relates to a package containing the above SRPIN-1 analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, wherein the compound exhibits RPK inhibitory activity and / or antiviral activity.
  • Power Provide a package as described in the package or the contents of the package.
  • the package means a package containing the SRPIN-1 analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate thereof, and the package includes the SRPIN-1 analog or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a container for containing these hydrates and may further include a bag or an outer box for accommodating the container. Good.
  • the present invention also relates to a package containing a compound that reduces the activity or the expression level of an SR protein, wherein the compound has an antiviral activity, if the package or the contents of the package contain the compound.
  • the present invention provides a package, wherein the compound is a compound having an activity of inhibiting the expression and / or activity of SRPK.
  • the compound of the present invention can be made into a composition together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a well-known formulation technique may be applied to obtain a pharmaceutical composition.
  • an antiviral agent that is, a prophylactic or therapeutic agent for a viral disease
  • its administration form includes, for example, tablets, capsules and the like. , Granules, powders, pills, troches, syrups, etc., or injections, aerosols, suppositories, patches, cataplasms, lotions, liniments, ointments, eye drops, etc. Parenteral administration.
  • These preparations are manufactured by a known method using additives such as excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents, diluents and the like.
  • excipients include starch such as starch, potato starch, and corn starch, lactose, crystalline cellulose, calcium hydrogen phosphate, and the like.
  • Examples of the coating agent include ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, shellac, talc, carnauba wax, paraffin and the like.
  • binder examples include polybierpyrrolidone, macrogol, and compounds similar to the above-mentioned excipients.
  • disintegrant examples include the same compounds as the above-mentioned excipients and chemically modified starch and cellulose such as croscarmellose sodium, sodium carboxymethyl starch, and crosslinked polybulpyrrolidone. .
  • Examples of the stabilizer include paraoxybenzoic acid esters such as methyl paraben and propyl paraben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; and phenols such as phenol and tarezol. Anols; thimerosal; dehydroacetic acid; and sorbic acid.
  • flavoring agent examples include, for example, commonly used sweeteners, sour agents, flavors and the like.
  • a solvent for producing a liquid preparation ethanol, phenol, cresol, purified water, distilled water, and the like can be used.
  • surfactant or emulsifier examples include polysorbate 80, polyoxinole stearate 40, lauromacrogol, and the like.
  • the amount of the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof varies depending on symptoms, age, administration method, and the like.
  • the lower limit is (0.01) mg (preferably (0.1) mg) and the upper limit is (2000) mg (preferably ( It is desirable to administer 500) mg, more preferably (100) mg) once or in several divided doses according to the symptoms.
  • the upper limit is (2000) mg (preferably ( It is desirable to administer 500) mg, more preferably (100) mg) once or in several divided doses according to the symptoms.
  • intravenous administration (0.001) mg (preferably (0.01) mg) as a lower limit and (500) mg (preferably (50) mg) as an upper limit per day for adults It is desirable to administer once or several times depending on the symptoms.
  • Tetramethylsilane ((CH) Si) is expressed as a relative value as an internal standard (0 ppm), and
  • Reference Example 1-1B 1- [2-nitro-41- (trifluoromethyl) phenyl] piperidine ( ⁇ _ [2_mtro_4_ rifluoromethyl) phenyl] pipendine) (6.13 g, 22.4 mmol) of cyclolomethane ( Concentrated hydrochloric acid (12.2 mL, 146 mmol) and anhydrous tin dichloride (12.7 g, 67.2 mmol) were added to the solution at 0 ° C. in order to a solution of dichloromethane (10 mL) at 0 ° C., and the mixture was stirred for 7 hours. Water was added to this and the mixture was extracted with ethyl acetate (x3).
  • ⁇ _fluoro_2_nitro_4_ (trifluoromethvl) benzene 211 mg, 1.01 mmol, N, N_
  • dimethylformamide ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (DMF)
  • dimethylamine 230 ⁇ L, 2.22 mmol, commercial product
  • N_ [2-Dethylamino-5- (trifluoromethyl) pheninole] isonicotinamide N- [2-diethylamino-5- (trifluoromethyl) phenyl] isonicotinamide (GIF-0347) (51.0 mg, 34.1%) was obtained as a colorless solid.
  • isonicotinamide (SRPIN-1, GIF-0340) (121 mg, 0.496 mmol) in N, N-dimethylformamide ( ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (DMF)) (0.5 mL) was added to sodium hydride (60% w / (w oil mixture) (200 mg, 0.500 mmol) was added at 0 ° C and the mixture was stirred for 1 hour. To this was added a solution of methyl iodide in ⁇ , ⁇ -dimethylformamide ( ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (DMF)) (0.8 ⁇ , 0.62 mL, 0.496 mmol) at 0 ° C., and the mixture was further stirred for 3 hours. .
  • N-Methyl-N_ [2_ (l-piperidinyl) _5_ (trifluoromethyl) phenyl] isonicotinate (N-methytri N- [2- (1-piridinyl) -5- (trifluoromethyl) phenyl] isonicotinamide) (GIF-0614) (65.9 mg, 51.5%) was obtained as a colorless solid.
  • N- [5-methyl-2- (l-piperidinyl) phenyl] isonicotinamide) (GIF-0342) (69.5 mg, 28.8%) was obtained as a colorless solid.
  • 1,4-Difluoro-2-nitrobenzene (l, 4-difluoro-2-nitrobenzene) (225 mg, 1.41 mmol, commercial product)
  • N, N-dimethylformamide ( ⁇ , ⁇ -dimethylformamide (DMF)) (0.5 (mL) solution, piperidine (320 ⁇ 1, 3.23 mmol, commercial product) was added at room temperature, and the mixture was stirred for 2 hours. After addition of water, the mixture was extracted with ethyl acetate (x3). The obtained organic layer was washed with saturated saline, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • N 1.5 / 1) and purified by N_ [5_fluoro_2_ (1-piperidinyl) phenyl] isonicotinamide (N— [5-fluoro-2- (1- piperidinyl) phenyl] isonicotinamide) (GIF— 0348) (257 mg, 67.6%) as a colorless solid.
  • dichloromethane (5 mL) in a solution of isonicotinoyl chloride hydrochloride (390 mg, 2.19 mmol, commercial product) and triethylamine (449 ⁇ L, 3.24 mmol) at 0 ° C. Added sequentially. The mixture was returned to room temperature and stirred for 0.5 hours. Water was added thereto, and the mixture was extracted with dichloromethane (x3). The obtained organic layer was washed with saturated saline, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure.
  • a chromosome aberration screening test for SRPIN-1 was performed using mammalian cells. Induced clastogenicity using Chinese's hamster CHL cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) The mutagenicity of SRPIN-1 was searched using as an index. The test was performed using the metabolic activation method with a short treatment (treatment time: 6 hours, recovery time: 18 hours) (+ S9 mix), and the continuous treatment without metabolic activation system (24-hour treatment) ). CHL cells were prepared by adding 5% CO2 in MEM R liquid medium (GIBCO BRL) supplemented with 10% fetal calf serum (ICN Flow).
  • the composition of the S9 mix used in the assay was 4 x mol HEPES buffer ( ⁇ 7.4), 5 ⁇ mol MgCl, 33 ⁇ mol KCL 5 ⁇ mol G6P, 4 ⁇ mol NADP and 0.3 mL S9 fraction in 1 mL.
  • CHL cells (approximately 4 x 10 3 cells / mL) were cultured in 5 mL of a culture medium in a 60 mm dish for 3 days, and then 1.33 mL of the Petri dish was extracted, and the S9 mix was added to 0.83 Immediately, 0.5 mL of each test solution (final concentration: 5, 1.58, 0.5 mg / mL; dissolved in a 0.5% aqueous solution of sodium carboxymethylcellulose (CMC-Na)) was added. After culturing for 6 hours, the cells were washed with PBS, replaced with 5 mL of a new culture solution, and further cultured for 18 hours.
  • CMC-Na sodium carboxymethylcellulose
  • Structural abnormalities are classified into chromatid breaks (ctb), chromatid exchanges (cte), chromosome breaks (csb), chromosome exchanges (cse), and others (5 or more abnormalities, fragmentation, fineness, etc.)
  • the number of occurrences was recorded for each type of abnormality. Cells having at least one of these abnormalities were regarded as abnormal cells. The appearance rate of abnormal cells was judged as negative, less than 5% to less than 10% as false positive, and more than 10% as positive.
  • the test substance was determined to be a substance that induces chromosomal abnormalities when the frequency of occurrence of chromosomal abnormal cells was 10% or more in the test substance treated group.
  • the frequency of abnormal chromosomal cells in the positive control group was 26 (52.0%) in the DMN 500 zg / mL treatment group, and 24 (48.0%) in the MMC 0.5 xg / mL treatment group. Since no was observed, it was concluded that the study was properly performed.
  • abnormal chromosomal cells in the SRPIN-1 treatment group showed negative chromosomal structural abnormalities and an increase in numerically abnormal cells in both the short-term treatment method and the continuous treatment method under any of the treatment conditions. there were. Based on the above results, it was considered that the compound had no clastogenicity in cultured mammalian cells under the test conditions.
  • SRPIN-1 A single oral dose toxicity study of SRPIN-1 in rats was performed.
  • Slc SD rats (5 weeks old, Japan SLC) received 125, 250, 500, 1000, and 2000 mg / kg of SRPIN- 1 was orally administered to 2 males and 2 females per group (dose volume: 10 mL / kg). Animals were fasted from the evening before dosing until approximately 4 hours after dosing. As a result of observation for 2 days after administration, no death was observed in either sex, and no change was observed in the general condition.
  • SRPIN-1 2000 mg / kg was orally administered to each of 5 male and 5 female Slc: SD rats (5 weeks old) in the same manner as above, and observed for 14 days after administration, and the type, degree, The time of onset, recovery, and death were recorded. As a result, neither males nor females died, and no abnormalities were observed in the general condition.
  • Flp_In-293 cells (R750-07: purchased from Invitrogen) derived from human fetal kidney were transfected with 3 micrograms of the HIVpNL4_3 genome (Adachi, A. et al, 1986, J. Virol. 59: 284-289).
  • This protein sample was used for Western analysis.
  • the samples were separated by SDS-PAGE using a Laemini buffer at 40 mA for 45 minutes under a gradient gradient of 4-20%.
  • the molecular weight was measured using a broad range prestained marker (02525-35; Nacalai) as a marker.
  • semi-dry blotting was performed on a PROTRAN nitrocellulose membrane (BA85; purchased from Schleicher & Schuell Bioscience) using a TransBlot SD cell (170-3940; purchased from Bio-rad) at 160 mA for 60 min.
  • the membrane was washed by shaking with TBS for 5 minutes, followed by blocking for 1 hour at room temperature using BlockingOne (03953_95; purchased from Nacalai). The membrane is washed again with TBS, and mouse monoclonal 104 antibody that recognizes the phosphorylated SR protein diluted with TBS
  • BDTransduction mouse monoclonal anti-SF2 antibody (AK103: provided by Dr. Adrian Krainer; Hanamura, A. et al., 1998, RNA 4: 430-444; Kojima, T. et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 32247-56) at 4 ° C overnight.
  • AK103 provided by Dr. Adrian Krainer; Hanamura, A. et al., 1998, RNA 4: 430-444; Kojima, T. et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 32247-56

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Abstract

　本願発明は、（１）ＳＲ蛋白質の活性を低減又は阻害することによる抗ウイルス剤、より具体的には、（i）ＳＲ蛋白質の脱リン酸化を促進させることによる抗ウイルス剤、及び（ii）ＳＲ蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害することによる抗ウイルス剤、更に（２）ＳＲ蛋白質の発現を阻害することによる抗ウイルス剤、並びに、（３）ＳＲ蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによる抗ウイルス剤を提供する。また本発明は、ＳＲ蛋白質をリン酸化させるＳＲＰＫを阻害する化合物を提供する。これらの化合物は、ＳＲ蛋白質の活性を阻害し抗ウイルス作用を示す。本発明は、ＳＡＲＳをはじめ、種々の新規なウイルスの出現に伴い、新規なウイルスにも対応できる、適用性が広く、しかも、持続性の高い抗ウイルス剤を提供する。

Description

明 細 書
SR蛋白質のリン酸化制御方法、および、 SR蛋白質の活性制御剤を有効 成分とする抗ウィルス剤
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子発現過程におけるスプライシング反応に関与している SR蛋白質 のリン酸化制御に関する。さらにウィルス等の感染による慢性および急性疾患の治療 及び予防に有用な SR蛋白質の活性制御、発現制御および安定化制御方法並びに SR蛋白質の活性制御剤を有効成分とする抗ウィルス剤に関する。さらに本発明は、 SR蛋白質の活性制御および抗ウィルス療法に有用な化合物およびそれらの利用に 関する。
背景技術
[0002] これまでウィルスの複製を阻害すると報告されている数多くの抗ウィルス剤は、ウイ ルスプロテアーゼゃウィルスの持つ逆転写酵素などを標的としたものであった。
[0003] 例えば、 HIVウィルスについて言えば、 HIVのゲノムの特性をターゲットにする手法 が用いられている。 HIVは、逆転写酵素により HIVの RNAゲノムが DNA (プロウィル ス）に変換されて宿主染色体に組み込まれ、次に、プロウィルス DNAから宿主細胞 の転写、翻訳機構によりウィルスのタンパク質が生産され、これらのタンパク質は大き なポリプロテイン前駆体として転写され、プロテアーゼにより蛋白分解されてはじめて 、ウィルスが再構成され、成熟する。そこで HIVの阻害剤については、このような HIV の成熟過程のそれぞれをターゲットに、 (1)レトロウイルス特有の逆転写酵素をター ゲットとする AZT等 (非特許文献 1)、（2)プロテアーゼを阻害するプロテアーゼ阻害 剤 (非特許文献 2)が研究開発されてきた。
[0004] しかしながら、いずれも種々のウィルスの増殖過程を特異的に攻撃する個別的に対 応の抗ウィルス剤であった。
[0005] 非特許文献 1： Proc Natl Acad Sci USA Vol.86, No.21, pp.8333- 7
非特許文献 2 :Antimicrob Agents Chemother. 1995 Jul;39(7):1559_64
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0006] ウィルス特に RN Aウィルスは、突然変異速度が速いため、これまで開発されたウイ ノレスプロテアーゼゃウィルスの持つ逆転写酵素などを標的とした抗ウィルス剤は、有 効性が失われることも早ぐ更なる、効果的な抗ウィルス剤の開発が望まれてきた。
[0007] 特に、最近、 SARSをはじめ、種々の新規なウィルスの出現に伴レ、、新規なウィル スにも対応できる、適用性が広ぐしかも、持続性の高い抗ウィルス剤の開発を課題と する。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、従来から、遺伝子発現系に関与する SRタンパク質のリン酸化に関 する研究を行ってきた。特に SRタンパク質をリン酸化する酵素である、 SRPK2 ( Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 357-364)、線虫の SRPK相同分子である SPK1 (Mech. Dev.. 99， 51-64)、 hPRP4 (J. Biol. Chem. 277, 44220-44228)、および SRタンパク質リン酸化酵素 Clk4の制御因子 CLASP (J. Biol. Chem. 276,
32247-32256)は本発明者が世界で初めてクローニングしたものである。
[0009] SR蛋白質は、 Serineと Arginineに富む RNA結合蛋白質で、通常 1ないし 2ケ所の RNA認識モチーフ (RNA_recognition motifs; RRM)と RSの連続配列に富む
RS(Arginine/Serine-rich)ドメインを共通に持ち、真核生物における RNAプロセッシン グ、特に、 pre-mRNAのスプライシングに重要な役割を果たしている。
[0010] 哺乳類の SR蛋白ファミリ一として、 X16/SRp20, SF2/ASF/SRp30a,
SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, 9G8, HRS/SRp40, SRp46, SRp55, SRp75, p54の 10 種類の RNA結合蛋白が報告されている。 SRタンパク質の多くが細胞内でリン酸化を 受けていることが示されており、特に SRタンパク質のひとつである SF2/ASFは、ぺプ チドマッピングによる解析から、 RSドメイン内の複数の部位でリン酸化されている (J. Cell. Biol.(1991) 115: 587-596)ことが確認されている。また SF2/ASFの UlsnRNPへ の選択的結合能は、リン酸化によって高まる（Genes & Dev. (1997) 11 : 334-344)こと が知られている。 RSドメインのリン酸化と脱リン酸化力 スプライソゾームの形成と組み 換えに必要で、これを阻害すると、 mRNAのプロセシングに異常を来す。上述したよう に、 RSドメインは RNA結合蛋白のみならず、核内で機能すると目される様々な機能蛋 白に見い出され、それらは SR関連蛋白ファミリー (SR-related protein family)と名付け られている（Biochem. Cell Biol. (1999) 77: 277-291)。
[0011] 本発明者らは、ウィルスに感染した細胞中の SRファミリータンパク質のリン酸化状 態を研究中に偶然にも、ウィルス感染した細胞中では SRタンパク質のリン酸化が抑 えられ、ュビキチン'プロテアソーム経路を介して分解されることを発見した。逆に、 SRp40又は SRp75などの SRタンパク質、又は SRタンパク質リン酸化酵素の SRPK1又 は SRPK2を強制的に発現させたところ、 SRタンパク質が安定化されウィルス産生が 増加するという現象を見出した。このことは、 SRタンパク質がウィルス複製に重要な 役割を担っており、 SRタンパク質の脱リン酸化は、生体内のウィルス侵入に対する防 御システムであることを示してレ、る。
[0012] SR蛋白は UlsnRNPや U2AFと結合しスプライソゾームの形成に必要だ力 その蛋白 間相互作用に RSドメインが大きな役割を果たしていると考えられている。また、 SR蛋 白（はスプライス部位の選択に影響を与え、イントロンに近位の 3'スプライス部位の選 択を促進するのに対し、逆に hnRNP Al、 A2、 B1などの heteronuclear
ribonucleoproteins (hnRNPs)は遠位の 3'スプライス部位の選択を促す。従って細胞 内の SR蛋白と hnRNP蛋白の量比によって、スプライス部位が決められている可能性 力 sある。
[0013] そこで、本発明者らは、ウィルスの複製に重要な役割を果たしていることが分かった SRタンパク質を対象とした抗ウィルス剤を開発し、提供したものである。
[0014] 具体的には、まず、 SR蛋白質のリン酸化酵素を阻害することによる SR蛋白質の阻 害を試みた。
これまで SRPKの活性を阻害する低分子量ィ匕合物は知られていなかったところ、 SRPKを標的とした低分子量化合物のスクリーニングを行い、結果として下記の式で 表される SRPIN- 1 (SR protein phosphorylation inhibitor 1) (ィ匕合物番号 340とも表す） カ^ン酸化酵素 SRPKの阻害活性を有することを見出した。
Figure imgf000006_0001
(IV)
[0016] そこで、 SRPIN-1を用いて SRPKの酵素活性を阻害することで、 SR蛋白質のリン酸化 を阻害し、結果として HIVのウィルス複製を阻害できると推測した。 MT-4細胞と HIVゥ ィルスを用いた感染実験において、 SRPIN-1の濃度を変えてウィルス複製を抑制でき るか検討したところ、 SRPIN-1は顕著に HIVウィルスの複製を抑制することを見出した
[0017] さらに本発明者らは、複数の SRPIN-1類縁体を合成し、その効果を調べたところ、 SRPIN-1と同様に SRPK阻害活性および抗ウィルス作用を示すことが示された。従つ て、 SRPIN-1およびそれらの類縁体は SRPK阻害剤として有用であり、さらに抗ウィル ス剤として用いることができる。
[0018] すなわち本発明は、 SR蛋白質の活性を制御する SR活性制御剤を有効成分として 含有する抗ウィルス剤、抗ウィルス剤のスクリーニング方法、および SRPKを阻害する 活性を有する化合物、およびその利用などに関し、より具体的には請求項の各項に 記載の発明に関する。すなわち本発明は、
〔1〕 SR蛋白質の活性を制御する SR活性制御剤を有効成分として含有する抗ウィル ス剤、
〔2〕SR蛋白質が、 SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c， HRS/SRp40, SRp46,又は SRp75のいずれかである、前記〔1〕に記載の抗ウィルス剤、
〔3〕 SR活性制御剤が SR蛋白質の脱リン酸化を促進する物質又は組成物である、前 記〔1〕又は〔2〕に記載の抗ウィルス剤、
〔4〕フォスファターゼ 2A (Phosphatase 2A)を活性化する活性化剤である、前記〔3〕に 記載の抗ウィルス剤、 〔5〕 HIVの tat遺伝子又はアデノウイルスの E4-ORF4遺伝子又はワクシニアウィルスの VH1遺伝子を載せた遺伝子治療用の発現ベクターである、前記〔4〕に記載の抗ウイ ルス剤、
〔6〕 SR活性制御剤が SRPKを阻害する物質である、前記〔1〕又は〔2〕に記載の抗ゥ ィルス剤、
〔7〕31¾¾が31«¾：1または31¾¾2でぁる、前記〔6〕に記載の抗ウィルス剤、
〔8〕 SR活性制御剤が SRPK遺伝子の発現阻害剤である、前記〔1〕又は〔2〕に記載 の抗ウィルス剤、
〔9〕 SRPK遺伝子の発現阻害剤が、 SRPKに対する miRNA又は siRNA又はモルフォ リノオリゴ、あるいは該 miRNAまたは siRMAの発現ベクターである、前記〔8〕に記載の 抗ウィルス剤、
〔10〕 SR活性制御剤が SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質である、前記〔1〕 又は〔2〕に記載の抗ウィルス剤、
〔11〕SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質力 ¾nRNPAl発現ベクターである、前 記〔10〕に記載の抗ウィルス剤、
〔12〕ウィルスが、 （1)ヒト免疫不全ウィルス (HIV)、重症急性呼吸器症候群（SARS)、 ポリオウイルス、ヒトライノウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス（HTLV_I)、 A型、 C型 、 D型又は E型肝炎ウィルス、ワクシニアウィルス、 日本脳炎ウィルス、デング熱ウィル ス、ヒトコロナウィルス、エボラ出血熱ウィルス、インフルエンザウイルス、若しくはシン ドビスウィルスのいずれかの RNA型ウィルス、又は（2)単純へルぺスウィルス、ヒトァ デノウィルスを含め、 B型肝炎ウイノレス、サイトメガロウィルス、 EBウィルス、ヘルぺスゥ イノレス、ヒトヘルぺスウィルス、天然痘ウィルス、ポリオ一マウィルス、若しくはヒトパピ ローマウィルスのいずれかの DNA型ウィルスである、前記〔1〕一〔11〕のいずれかに 記載の抗ウィルス剤、
〔13〕試験化合物を SRPKに作用させる工程、及び SRPKの SR蛋白質をリン酸化す る能力を検定する工程、および該能力を阻害する化合物を選抜することを含む、抗ゥ ィルス剤のスクリーニング方法、
〔14〕 SRタンパク質又は Arg- Ser (RS)若しくは Ser-Arg (SR)の 2回以上連続するぺプ チドを SRPKの基質として SR蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程を含む、前記 〔13〕に記載のスクリーニング方法、
〔15〕前記〔13〕又は〔14〕の方法により得られた化合物を製剤化する工程を含む、抗 ウィルス剤の製造方法、
〔16〕下記一般式 (I)
Figure imgf000008_0001
(式中、 R1は、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有して
1-6
いてもよい C アルケニル基、置換基を有していてもよい C アルキニル基、置換基
2-6 2-6
を有していてもよい C ァリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、アジド基、ヒド
6-10
ロキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルコキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、
1-6 c アルキルチオ基、置換基を有していてもよい C アルキルスルホニル基、カルボキ
1-6 1-6
シノレ基、ホルミル基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルコキシカルボニル基、ァシル
1-6
基、ァシルアミノ基、またはスルファモイル基を示し；
R2は、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、または置換基を有し
1-6
てレ、てもよレヽァリール基を示し；
R3は、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有していてもよい C ァ
1-6 2-6 ルケニル基、置換基を有していてもよい C ァリール基、置換基を有していてもよい
6-10
含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
R4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
Qは、一C (〇）一、 -C (S)―、 -SO―、 -C (S) NHC (O)―、一C (〇） NHC (O)―、ま
2
たは一 C (O) NHC (S)—を示し；
Wは、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、置換基を有してレ、て
1-6
もよレ、 C ァリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよい C ァ ルコキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルキルチオ基、置換基を有してレヽても
1-6
よい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般 式 (II)
Figure imgf000009_0001
(II)
(式中、 R5および R6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していても ょレ、C アルキル基、置換基を有してレ、てもよレ、含窒素複素環、置換基を有してレ、て
1-6
もよい縮合芳香族複素環、ァシル基、もしくはァシルアミノ基を示し;または、 前記 R5および R6は、 P 接する窒素原子と一緒になつて、置換基を有していてもよい 複素環を形成していてもよぐ該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複 素環であってもよく；
前記 R5および R6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンァミノ基または置 換基を有していてもよい芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよい、）で表さ れるァ二リン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、 〔17〕前記 が、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、またはハロゲ
1-6
ン原子である、前記〔16〕に記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩 、またはこれらの水和物、
〔18〕前記 R2が、水素原子または C アルキル基である、前記〔16〕または〔17〕に記
1-6
載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、 〔19〕前記 が、置換基を有していてもよい C ァリール基、または置換基を有して
6-10
いてもよい 5— 10員含窒素へテロアリール基である、前記〔16〕一〔18〕のいずれかに 記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、 〔20〕前記 R4が、水素原子である、前記〔16〕一〔19〕のいずれかに記載のァニリン誘 導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物、
〔21〕前記 Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式 (II) (π)
(式中、 R5および R6は、互いに同一又は異なって、置換基を有していてもよい C ァ
1-6 ルキル基を示し；または、
前記 R5および R6は、 P 接する窒素原子と一緒になつて、置換基を有していてもよい ヘテロ環式基を形成していてもよぐ該ヘテロ環式基は、置換基を有していてもょレ、 縮合芳香族へテロ環式基であってもよい、）で表される、前記〔16〕一〔20〕のいずれ かに記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和 物、
〔22〕前記〔16〕一〔21〕のいずれかに記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許 容される塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、 SRPK阻害剤、 〔23〕前記〔16〕一〔21〕のいずれかに記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許 容される塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、抗ウィルス剤、に関 する。なお同一の請求項を引用する請求項に記載の発明の 1つまたは複数の組み 合わせからなる発明は、それらの請求項に記載の発現に既に意図されている。
以下に、本明細書において記載する用語、記号等の意義を説明し、本発明を詳細 に説明する。
本明細書における「C アルキル基」とは、炭素数 1一 6個の脂肪族炭化水素から
1-6
任意の水素原子を 1個除いて誘導される一価の基である、炭素数 1一 6個の直鎖状 または分枝鎖状のアルキル基を意味し、具体的には例えば、メチル基、ェチル基、 1 —プロピル基、 2_プロピル基、 2—メチルー 1_プロピル基、 2—メチルー 2_プロピノレ基、 1 ブチル基、 2 ブチル基、 1 ペンチル基、 2 ペンチル基、 3 ペンチル基、 2—メチ ノレ _1_ブチル基、 3—メチノレ _1_ブチル基、 2—メチノレ _2_ブチル基、 3_メチル _2_ ブチル基、 2, 2_ジメチルー 1_プロピル基、 1_へキシル基、 2_へキシル基、 3—へキ シノレ基、 2—メチノレ _1_ペンチル基、 3—メチノレ _1_ペンチル基、 4—メチノレ _1_ペンチ ノレ基、 2—メチノレ _2_ペンチル基、 3—メチノレ _2_ペンチル基、 4—メチノレ _2_ペンチ ノレ基、 2—メチノレ _3_ペンチル基、 3—メチノレ _3_ペンチル基、 2， 3—ジメチル _1—ブ チノレ基、 3， 3_ジメチルー 1_ブチル基、 2， 2_ジメチルー 1_ブチル基、 2—ェチルー 1_ ブチル基、 3， 3_ジメチルー 2_ブチル基、 2， 3_ジメチルー 2_ブチル基等があげられ る。
[0020] 本明細書における「C アルケニル基」とは、炭素数 2— 6個の直鎖状または分枝
2-6
鎖状のアルケニル基を意味し、具体的には例えば、ビエル基、ァリル基、 1一プロぺニ ル基、 2_プロぺニル基、 1—ブテュル基、 2—ブテュル基、 3—ブテュル基、ペンテュル 基、へキセニル基等があげられる。
[0021] 本明細書における「C アルキニル基」とは、炭素数 2 6個の直鎖状または分枝
2-6
鎖状のアルキニル基を意味し、具体的には例えば、ェチュル基、 1一プロピニル基、 2 —プロピニル基、ブチュル基、ペンチニル基、へキシュル基等があげられる。
[0022] 本明細書における「C アルコキシ基」とは前記定義の「C アルキル基」が結合し
1-6 1-6
たォキシ基であることを意味し、具体的には例えば、メトキシ基、エトキシ基、 1一プロ ピルォキシ基、 2_プロピルォキシ基、 2—メチルー 1_プロピルォキシ基、 2—メチルー 2 —プロピルォキシ基、 1_ブチルォキシ基、 2_ブチルォキシ基、 1_ペンチルォキシ基 2—ペンチルォキシ基、 3—ペンチルォキシ基、 2—メチルー 1一ブチルォキシ基、 3—メ チルー 1一ブチルォキシ基、 2—メチルー 2—ブチルォキシ基、 3—メチルー 2—ブチルォキ シ基、 2, 2—ジメチノレー 1一プロピルォキシ基、 1 キシルォキシ基、 2 キシルォキ シ基、 3 キシルォキシ基、 2—メチルー 1一ペンチルォキシ基、 3—メチルー 1一ペンチ ルォキシ基、 4ーメチノレー 1一ペンチルォキシ基、 2—メチノレー 2—ペンチルォキシ基、 3— メチノレー 2_ペンチルォキシ基、 4ーメチノレー 2_ペンチルォキシ基、 2—メチルー 3_ペン チルォキシ基、 3—メチルー 3—ペンチルォキシ基、 2, 3—ジメチルー 1一ブチルォキシ 基、 3, 3—ジメチノレー 1一ブチルォキシ基、 2, 2—ジメチルー 1一ブチルォキシ基、 2 チルー 1一ブチルォキシ基、 3, 3—ジメチルー 2—ブチルォキシ基、 2, 3—ジメチルー 2— ブチルォキシ基等があげられる。
[0023] 本明細書における「C アルキルチオ基」とは前記定義の「C アルキル基」が結
1-6 1-6
合したチォ基であることを意味し、具体的には例えば、メチルチオ基、ェチルチオ基 1_プロピルチオ基、 2_プロピルチオ基、プチルチオ基、ペンチルチオ基等があげ られる。
[0024] 本明細書における「C アルコキシカルボニル基」とは前記定義の「C アルコキシ
1-6 1-6 基」が結合したカルボニル基であることを意味し、具体的には例えば、メトキシカルボ ニル基、エトキシカルボニル基、 1一プロピルォキシカルボニル基、 2—プロピルォキシ カルボニル基等があげられる。
[0025] 本明細書における「C アルキルスルホニル基」とは前記定義の「C アルキル基」
1-6 1-6
が結合したスルホニル基であることを意味し、具体的には例えば、メチルスルホニル 基、ェチルスルホニル基、 1_プロピルスルホニル基、 2_プロピルスルホ二ル基等力 S あげられる。
[0026] 本明細書における「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはョ ゥ素原子を意味する。
[0027] 本明細書中における「C ァリール基」とは、炭素数 6 10の芳香族性の炭化水
6-10
素環式基をいい、具体的には例えば、フエ二ル基、 1一ナフチル基、 2_ナフチル基な どが挙げられる。
[0028] 本明細書中における「複素環」とは、環を構成する原子中に 1一 2個のへテロ原子 を含有し、環中に二重結合を含んでいてもよぐ非芳香族性の環または芳香族性の 環を意味する。
[0029] 本明細書中における「含窒素複素環」とは、環を構成する原子中に 1一 2個の窒素 原子を含有し、環中に二重結合を含んでいてもよぐ非芳香族性の環または芳香族 十生の環を意味する。
[0030] 本明細書における「ヘテロ原子」とは、硫黄原子、酸素原子または窒素原子を意味 する。
[0031] 本明細書における「5— 10員含窒素へテロアリール環」とは、環を構成する原子の 数力 ¾ないし 10であり、環を構成する原子中に少なくとも 1個の窒素原子を含み、さら に 1または複数個の窒素原子以外のへテロ原子を含有してもよい、芳香族性の環を 意味する。
[0032] 具体的には例えば、ピリジン環、ピロール環、ォキサゾール環、イソォキサゾール環 、チアゾール環、イソチアゾール環、インドール環、イソインドール環、イミダゾール環 、トリァゾール環、ピラゾール環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、キノリン環、 イソキノリン環、ベンズイミダゾール環などがあげられる。
[0033] 当該「5— 10員へテロァリール環」において好ましくは、ピリジン環、ピロール環、イミ ダゾール環をあげることができ、より好ましくはピリジン環をあげることができる。
[0034] 本明細書における「5— 10員含窒素へテロアリール基」とは、前記「5— 10員へテロ ァリール環」から任意の位置の水素原子を 1または 2個除いて誘導される一価または 二価の基を意味する。具体的には、ピリジル基、ピロリル基、ォキサゾリル基、イソォ キサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、イミダ ゾリル基、トリァゾリル基、ピラゾリル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジュル基 、キノリル基、イソキノリル基、ベンズイミダゾリル基が挙げられる。
[0035] 本明細書における「4一 8員へテロ環」とは、
1.環を構成する原子の数力 ないし 8であり、
2.環を構成する原子中に 1一 2個のへテロ原子を含有し、
3.環中に二重結合を 1一 2個含んでいてもよぐ
4.環中にカルボ二ル基を 1一 3個含んでレ、てもよレ、、
5.単環式である非芳香族性の環を意味する。
4一 8員へテロ環としては、ヘテロ原子として窒素原子を含有する 4一 8員含窒素へ テロ環が好ましい。
[0036] 4一 8員へテロ環として具体的には例えば、ァゼチジン環、ピロリジン環、ピぺリジン 環、ァゼパン環、ァゾカン環、テトラヒドロピラン環、モルホリン環、チオモルホリン環、 ピぺラジン環、チアゾリジン環、ジォキサン環、イミダゾリン環、チアゾリン環などが挙 げられる。当該「4一 8員へテロ環」において好ましくは、ピロリジン環、ピぺリジン環、 モノレホリン環、ピぺラジン環が挙げられる。
[0037] 本明細書における「4一 8員へテロ環式基」とは、前記「4一 8員へテロ環」から任意 の位置の水素原子を 1または 2個除いて誘導される一価または二価の基を意味する 。 4一 8員へテロ環式基としては、具体的には例えば、ァゼチジュル基、ピロリジニル 基、ピペリジニル基、ァゼパニル基、ァゾカニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリ ニル基、チオモルホリニル基、ピペラジニル基、チアゾリジニル基、ジォキサニル基、 イミダゾリル基、チアゾリル基などが挙げられる。
[0038] 本明細書における「縮合芳香族複素環」とは、その複素環部がベンゼン環などの芳 香族環とオルソ縮合している環状構造を意味し、複素環部は上記定義の複素環であ る。
[0039] 本明細書における「縮合芳香族へテロ環式基」とは、そのへテロ環式部がベンゼン 環などの芳香族環とオルソ縮合してレ、る環状構造を意味し、ヘテロ環式部は上記定 義のヘテロ環式基である。
たとえば、インドリニル基、イソインドリニル基、 1 , 2, 3， 4_テトラヒドロキノリンなどが 挙げられる。
[0040] 本明細書における「ハロゲン化 C アルキル基」とは前記定義「C アルキル基」中
1-6 1-6
の任意の少なくとも 1つの水素原子を、前記定義「ハロゲン原子」で置換した基を意 味する。たとえば、トリフルォロメチル基、ジフルォロメチル基、モノフルォロメチル基 などが挙げられる。
[0041] 本明細書における「置換基を有していてもよい」とは、置換可能な部位に、任意に 組み合わせて 1または複数個の置換基を有してもよいことを意味する。当該置換基と は具体的には例えば、以下の置換基 A群から選ばれる基をあげることができる。
[置換基 A群]
ハロゲン原子、水酸基、メルカプト基、ニトロ基、シァノ基、ホルミル基、カルボキシ ル基、トリフルォロメチル基、トリフルォロメトキシ基、アミノ基、ォキソ基、イミノ基、 C
1-6 アルキル基、 C アルコキシ基
1-6
[0042] 本明細書における「塩」とは、本発明に係る化合物と塩を形成し、かつ薬理学的に 許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基 塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。
[0043] 無機酸塩の好ましレ、例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、 リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸 塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クェン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安 息香酸塩、メタンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩などがあげられる。
[0044] 無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金 属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、ァ ンモニゥム塩などがあげられ、有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジェチルァ ミン塩、ジエタノールアミン塩、メグノレミン塩、 N, N，—ジベンジルエチレンジァミン塩 などがあげられる。
[0045] 酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩な どが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン 塩、オノレニチン塩などがあげられる。
[0046] また、本発明の化合物は、大気中に放置しておくことにより、水分を吸収し、吸着水 が付いたり、水和物となったりする場合があり、そのような水和物も本発明に包含され る。
さらに、本発明の化合物は、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があ るが、そのような塩も本発明に包含される。
[0047] また本発明において「遺伝子」とは、転写単位をセンスまたはアンチセンスにコード する DNAまたは RNAを言う。転写単位とは、一続きに転写される配列を言う。ある蛋 白質をコードする核酸 (DNAまたは RNA)は、本発明においてその蛋白質の遺伝子と も言う。
[0048] また、本明細書において、「または」という用語は非排他的に用いられる。例えば「A 、 B、または C」は、 A、 B、または Cのいずれかの要素を少なくとも含むことを意味して レ、るに過ぎず、 A、 B、および Cの 2つ以上または 3つ全てを含むもの、およびそれ以外 の要素を含むものも含まれる。
[0049] また本明細書において表 1から表 3に示した化合物は、化合物番号で表わす場合 もある。これらの化合物は、化合物番号を引用して「GIF -」として表記されることもある
発明の効果
[0050] 本発明により、 SRPIN-1 (SR protein phosphorylation inhibitor 1)およびその類縁体 カ^ン酸化酵素 SRPKの阻害活性を有することが明らかにされた。 SR蛋白質は SRPK によるリン酸化によって細胞中で安定に存在している力 SRPIN-1またはその類縁体 等によって SRPKの酵素活性を阻害すると、 SR蛋白質のリン酸化が阻害され、ュビキ チン ·プロテアソーム経路を介して分解されることを見出した。そこで SRPIN-1および その類縁体を添加して SRPKの阻害を試みたところ、 HIV感染実験ではこれらの化合 物にウィルス複製を抑制する抗ウィルス作用を有することを見出した。 [0051] 更に、本発明は、 SR蛋白質の活性を制御することにより、同一のメカニズムで、広 範囲なウィルスに対して有効な抗ウィルス剤を提供するという効果を奏するものであ る。
図面の簡単な説明
[0052] [図 1A]「HIV感染細胞における SR蛋白質のリン酸化」 pNL4_3ゲノムを遺伝子導 入した Flp-In_293細胞中のリン酸化 SR蛋白質を、抗リン酸化 SR蛋白質マウスモノク ロナール抗体（Mabl04)、抗 SC35マウス抗体、及び抗 SF2マウス抗体を用いたゥェ スタン解析より調べた。
[図 1B]「SR蛋白質の分解」 Flp-In-293細胞に、 HAタグを融合した SRp75， SRp55, SRp40遺伝子のプラスミド遺伝子導入し、 MG132(474790; CALBIOCHEMより購入)を 終濃度 (10 / M)でカ卩えた。細胞を溶解して熱変性を行レ、、蛋白質サンプノレとし
SDS-PAGEを行レ、、ゥサギ抗 HA抗体を一次抗体、ロバ抗ゥサギ IgG抗体を二次抗体 としてウェスタン解析した。
[図 2A]「SRPK2安定的発現細胞における SR蛋白質のリン酸化」 Flp-In-293細胞に マウス SRPK2遺伝子を導入した SRPK2安定的発現細胞（SRPK2-2)及び親株
Flp-In293 (mock)の 2つの細胞に pNL4-3を遺伝子導入して、 4日後に HIV感染にお ける内在性 SR蛋白質の動態を図 1Aと同様にウェスタン解析により調べた。
[図 2B]「SRPK2安定的発現細胞における SR蛋白質の存在」 図 2Aと同じ mockと SRPK2-2細胞に、 HIVpNL4_3ゲノムと、 HAタグを融合した SRp75， SRp55, SRp40遺伝 子のプラスミドを遺伝子導入し、 36時間後にサンプノレを回収して、ウェスタン解析を 行った。
[図 2C]「HIVの産生量を測定」 上記図 2Aの場合の培養上清を回収して HIVの産生 量を測定した。
[図 3A]「in vivoでの HIVの産生に寄与する SR蛋白質の検討」 Mock、 SC35、 SF2、 SRp40、 SRp55、 SRp75発現プラスミドを各々 Flp_In293細胞に遺伝子導入し、 36時間 後に培養上清を回収し、ノレミパルス ELISAシステムを用いて HIVp24の量を測定した。
[図 3B]「hnRNPAlを用いた、 in vivoにおける HIV産生への効果の検討」 一定量 (500ng)の SRp40、 SRp75発現プラスミドに加えて、 hnRNPAl発現プラスミドの量を段階 的に増やして Flp-In293細胞へ遺伝子導入を行った。 36時間後に培養上清を回収し 、ノレミパルス ELISAシステムを用いて HIVp24の量を測定した。
[図 4A]「細胞内 SR蛋白質のリン酸化を阻害するための、 SRPKの阻害剤の探索」 SRPIN-l(SRPk Inhibitor- 1)の構造式
[図 4B]「SRPIN-1を用いた SRPK1のリン酸化活性の阻害の検討」 SF2の RSドメインに 相当する RSペプチドを、 10mM Tris-HCl(pH 7.5)で10¾/011になるょぅに溶解した。
SRPK1蛋白質を 用いて、反応バッファー（250 MgCl、 0.25mM ATP、 1 mCi
[ r32P] ATP, SRPIN-1終濃度 0.1、 0.3、 1.0、 3.0、 10.0 z M)中で 30。Cの湯浴で 10分 間インキュベートし、反応液を P81フォスフォセルロースメンブレン（P81; Whatman)に 滴下し、 5。/0リン酸溶液で洗浄した。洗浄後、 P81メンブレンの32 Pについての放射活 性を液体シンチレーシヨンカウンターによって測定した。
[図 4C]「SRPIN-1を用いた in vivoにおける SR蛋白質のリン酸化阻害と、それに伴う SR 蛋白質分解の誘導の検討」 Flp-In293細胞に HA-SRp75プラスミドを遺伝子導入し て、 36時間後に MG132(終濃度 10 μ M)、 SRPIN_1(10、 20、 50 μ Μ)をそれぞれ添加し て 15時間インキュベートした。その後、細胞を溶解して、 SDS-PAGEして、抗 ΗΑ抗体 を用いたウェスタン解析を行った。また蛋白質量のコントロールとして抗 ァクチン抗 体を用いてウェスタン解析を行った。
[図 4D]「SRPIN_1の添加による、 HIV感染の阻害の検討」 MT-4細胞に、 293T細胞で 調製した HIVビリオンを添加すると同時に、 SRPIN-1 (終濃度 0.5、 10、 20 μ Μ)を添カロ した。 2時間 37°C5% COの培養条件下でインキュベートした後、細胞を遠心して培養 液に交換後、 48時間後に培養上清を回収してルミパルス ELISAシステムによって HIVp24の量を測定した。
[図 5A]「SRPIN-1およびその類縁体による SRPK阻害活性の検討」 SRPIN-1 (化合物 番号 340)およびその類縁体（化合物番号 341 349、 608— 626)の SRPK1および SRPK2のリン酸化活性に対する阻害効果を定量した。
[図 5B]「SRPIN-1およびその類縁体による HIV複製の抑制効果」 HIV複製に対する SRPIN-1およびその類縁体の抑制効果を、 MT-4細胞でアツセィした結果を示す。
[図 5C]「SRPIN-1およびその類縁体による HIV複製の抑制効果」 Jurkat細胞を用い て、図 5Bと同様に HIV複製に対する SRPIN-1およびその類縁体の抑制効果を測定し た結果を示す。
[図 6A]「シンドビスウィルスに対する SRPIN-1の抗ウィルス作用」 シンドビスウィルス を感染させた細胞の位相差顕微鏡像を示した。 SRPIN-1非投与の細胞では、シンド ビスウィルスの増殖による細胞傷害が顕著に認められたが、 SRPIN-1の投与により細 胞傷害は劇的に抑制された。
[図 6B]「シンドビスウィルスに対する SRPIN-1の抗ウィルス作用」 シンドビスウィルス を感染させた細胞のプラークアツセィの結果を示した。 5 μ M以上の SRPIN-1はシンド ビスウィルスの増殖を有意かつ濃度依存的に抑制した。
[図 7]「サイトメガロウィルスに対する SRPIN-1およびその類縁体の抗ウィルス作用」 サイトメガロウィルスを感染させた細胞の位相差顕微鏡像を示した。対照群の細胞（ 図中の 1および 2)はサイトメガロウィルス感染に特有の形態変化と細胞死が高率に観 察されたのに対し、 SRPIN-1またはその類縁体（化合物番号 349)を添加 (20 /i l)した 細胞 (図中の 3および 5)においては、サイトメガロウィルス感染による異常な形態変化 や細胞死は抑制された。
[図 8]「SARSウィルスに対する SRPIN-1およびその類縁体の抗ウィルス作用」 SARSゥ ィルスを感染させた細胞のプラークアツセィの結果を示した。 SARSウィルスの感染に より細胞死したプラーク数をカウントし、 SRPIN-1およびその類縁体の抗ウィルス作用 を検討した（プラークアツセィ）。その結果、図 8Aに示したように、 40 μ Μの SRPIN-1 およびその類縁化合物 (ィ匕合物番号 349)は SARSウィルスの増殖を有意に抑制した。 また図 8Bに示したように、 SRPIN-1は 1 μ Μから 40 μ Μの濃度範囲において濃度依存 的に SARSウィルスの増殖を抑制することが判明した。
発明を実施するための最良の形態
[0053] 本願発明者等は、 SR蛋白質をリン酸化する SRPK酵素を阻害することにより、 HIV の複製を阻害することができることから、この現象を広く応用することにより、広範なゥ ィルスに対して、抗ウィルス剤を提供できるかを検討した。
[0054] I. SR蛋白質 活性の低減:分解と安定化
(1)本願発明者等は、細胞の HIVウィルスによる感染と SR蛋白質のリン酸化状態及 び SR蛋白質の細胞での存在の有無の関係について調べた。具体的には、 NL4-3タ イブの HIVウィルスを 293細胞に感染させた後、 SR蛋白質に対する抗体及びリン酸 ィ匕された SR蛋白質に対する抗体によって、細胞中のリン酸化された蛋白質と細胞中 での SR蛋白質（全量）を調べた。
[0055] また、 SR蛋白質をリン酸化する SRPKを強制的に発現させた細胞への HIVウィル スによる感染と同細胞内の SR蛋白質のリン酸化状態及び SR蛋白質の細胞での存 在の有無の関係についても調べた。具体的には、上記と同様に、 NL4-3タイプの HIV ウィルスを SRPK— 2を強制的に発現させた 293細胞に感染させた後、 SR蛋白質に 対する抗体及びリン酸化された SR蛋白質に対する抗体によって、同細胞中のリン酸 化された蛋白質と細胞中での SR蛋白質 (全量)を調べた。
[0056] 上記の結果から、 SR蛋白質はリン酸化されることで細胞中で安定化する力 S、逆に、 SR蛋白質を脱リン酸化させることにより、 SR蛋白質を分解させることができることが分 かった。
[0057] さらに、検証のため、本願発明者等は、 SR— HA融合蛋白質を 293細胞内に発現 させ、ュビキチン'プロテアソーム阻害剤である MG132の添加の有無により、抗 HA— 抗体に反応する融合 SR— HAのシグナル強度を測定したところ、 MG132により、蛋 白質分解が抑制されていることが見られたので、 SR蛋白質は、ュビキチン'プロテア ソーム経路を介して分解されることがわかった。
[0058] すなわちウィルス感染に応答して、宿主は防御機構として SR蛋白質の分解を行うと 推測された。しかし SR蛋白質のリン酸化酵素を強制発現した状態では、 SR蛋白質は リン酸化されることで分解されずに安定化され、防御機構を破綻してウィルス産生の 昂進に寄与することを見出した。
[0059] つまり、 SR蛋白質は、脱リン酸化されることで、ュビキチン'プロテアソーム経由で 分解されてしまうことが分かった。 SR蛋白質は、遺伝子転写に必須であるから、 SR 蛋白質を脱リン酸化することにより、ウィルスの増殖阻害ができることが分かった。
[0060] (2) 次に、 SR蛋白質のリン酸化酵素の阻害を検討した。 SR蛋白質のリン酸化を担 うリン酸化酵素としては SRPKl/2、 Clk/Sty family kinase, PRP4、 DNA topoisomerase Iなどが候補と考えられているが、スプライシングにおける各々の機能差については 不明な点が多い。そこで、本願発明者等は、 SRPKを阻害することによる、ウィルス感 染細胞からのウィルス産生状態を、 SRPK阻害剤である SRPIN-1を用いて調べた。
[0061] すると、 SRPIN-1による SRPKの阻害力 積極的な SR蛋白質の分解を引き起こすこと を見出した。
[0062] (3) 更に、また HIVの感染と同時に、スプライシングを促進する SR蛋白質と、 in vitro では拮抗して働くことが知られている hnRNPAlを細胞に強制発現させたところ、 SRp40と SRp75は HIV産生を更に昂進させ、 hnRNPAlの量依存的に HIV産生を抑制 することを初めて in vivoで見出した。
[0063] 以上のように、 SR蛋白質の脱リン酸化は、生体 (人体）のウィルスに対する防御反 応であり、既に、アデノウイルス及びワクシニアウィルスについては、動物細胞に感染 後、当該動物細胞内での SR蛋白質が脱リン酸化されることは確かめられており（ Nature Vol.393，pp. l85- 187, EMBO R印 Vol.3,pp.1088-1093)、上記のように脱リン 酸化されると、 SR蛋白質は速やかに分解され、ウィルスの遺伝子の発現に利用でき なくなり、結局これらのウィルスも、増殖できないものと考えられる。
[0064] 本発明者らは、 HIVとは異なるウィルスであるシンドビスウィルス、サイトメガロウィル ス、および SARSコロナウィルスにおいても、 SRPK阻害剤による SR蛋白質の活性抑制 力 HIVと同様にウィルス増殖を抑制することを確認した。従って、 SR蛋白質の活性 を制御することによる抗ウィルス作用は、広範なウィルスに対して有効であるといえる
[0065] Π.本願発明には、 SR蛋白質の活性を制御することによる、抗ウィルス剤、ウィルス産 生阻害方法、及びウィルス病治療方法が包含される。本願発明には、 SR蛋白質活 性制御剤を有効成分として含む抗ウィルス剤が包含される。ここで、 SR蛋白質の活 性の制御には、発現制御および安定化制御も含まれる。例えば、 SR蛋白質の転写ま たは翻訳を抑制したり、あるいは SR蛋白質をコードする mRNAの安定性または SR蛋白 質の安定性を低下させることにより、 SR蛋白質の活性を低下させることができる。好ま しくは、本発明における SR蛋白質の活性の制御においては、 SR蛋白質の活性または 発現量を直接または間接に低下させる SR蛋白質の活性抑制剤が用いられる。 SR蛋 白質の活性または発現量を低下させるためには、 SR蛋白質を直接標的とする以外に 、例えば SRPKによる SR蛋白質のリン酸化を抑制および/または脱リン酸化を促進する ことも好ましい。例えばプロテインフォスファターゼ 2A (フォスファターゼ 2Aとも記す）を 活性化することにより、 SR蛋白質の脱リン酸化が促進される。従って、プロテインフォ スファターゼ 2Aの発現および/または活性を上昇させる化合物を用いてウィルスの増 殖を抑制することができる。また、 SRPKの発現および/または活性を阻害することによ り、 SR蛋白質のリン酸化を阻害することができる。従って SRPKの阻害剤は、本発明に おける好適な抗ウィルス剤となる。
[0066] [制御対象 SR蛋白質]
なお、本願発明で活性を低減又は阻害させるべき SR蛋白質は、任意の SR蛋白質 、すなわち、 X16/SRp20, SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, 9G8， HRS/SRp40, SRp46, SRp55, SRp75,及び p54が含まれる力 好適には、
SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46,及び SRp75，であり、特に好適には、 SRp40及び SRp75である。以下で SR蛋白質というと きは、 SF2/ASF/SRp30a， SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40, SRp46,又は SRp75を意味する。
[0067] X16/SRp20をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number L10838の
1-492に示されている。また X16/SRp20のアミノ酸配列は、 Accession number
NP_003008、 AAA36648に示されている（Zahler, A. et al., 1992, SR proteins: a conserved family of pre-mRNA splicing factors, Genes Dev. 6:837-847)。
SF2/ASF/SRp30aをコードする遺伝子配列は、例えば Accession number NM.006924 の 91-834に示されている。また SF2/ASF/SRp30aのアミノ酸配列は、 Accession number NP_008855、 Q07955に示されている（Ge， H. et al.， Cell 66, 373-382 (1991) )。 SC35/PR264/SRp30bをコードする遺伝子配列は、例えば Accession number M90104の 156-818に示されている。また SC35/PR264/SRp30bのアミノ酸配列は、 Accession number AAA60306、 Q01130に示されている（Fu， X.D. and Maniatis, T. Science 256, 535-538 (1992))。 SRp30cをコードする遺伝子配列は、例えば
Accession number U30825の 53- 715、 NM_003769の 147-809に示されている。また SRp30cのアミノ酸配列は、 Accession number AAA93069、 Q13242、 NP_003760に示 されている（Screaton, G. R. et al" EMBO J. 14, 4336-4349 (1995))。 9G8をコードす る遺伝子配列は、例えば Accession number NM_006276の 54-464に示されている。ま た 9G8のアミノ酸配列は、 Accession number NP_006267、 Q16629等に示されている（ Lejeune, F. et al., J. Biol. Chem. 276, 7850-7858 (2001); Popielarz, M. et al., J. Biol. Chem. 270, 17830-17835 (1995); Cavaloc, Y. et al., EMBO J. 13， 2639—2649 (1994))。 HRS/SRp40をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number
AF020307 (join(2406-2531, 2864-2925, 3049-3147, 3433-3503, 4740-4812, 5269-5382, 5472-5492))、アミノ酸配列は、 Accession number AAC39543、 Q13243 等に示されている（Du， K. and Taub, R" Gene 204 (1-2), 243-249 (1997); Screaton, G.R. et al" EMBO J. 14， 4336-4349 (1995))。 SRp46をコードする遺伝子配列は、例 えば Accession number AF031166の 1- 816に示されている。また SRp46のアミノ酸配 列は、 Accession number AAK54351等に示されている（Soret, J. et al., Mol. Cell. Biol. 18, 4924-4934 (1998))。 SRp55をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number U30883の 106-1137に示されている。また SRp55のアミノ酸配列は、 Accession number AAA93073, Q13247等に示されている（Screaton, G.R. et al" EMBO J. 14, 4336-4349 (1995); Zahler,A.M. et al., Genes Dev. 6, 837-847 (1992); Barnard, D.C. and PattonJ.G., Mol. Cell. Biol. 20, 3049-3057 (2000))。 SRp75をコードする遺 伝子配列は、例えば Accession number BC002781の 98-1579、 NM_005626の
98-1579に示されている。また SRp75のアミノ酸配列は、 Accession number AAH02781 、 NP— 005617、 Q08170等に示されている（Zahler, A.M. et al., Mol. Cell. Biol. 13, 4023-4028 (1993))。 p54をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number M74002の 84-1535に示されている。また p54のアミノ酸配列は、 Accession number AAA35554, Q05519等に示されている（Chaudhary，N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 8189-8193 (1991))。
[対象ウィルス]
本発明の抗ウィルス剤は、特に HIVの増殖阻害に好適であるが、ヒト免疫不全ウイ ノレス（HIV)に限らず、 RNA型ウィルスに属する重症急性呼吸器症候群（SARS)、ポリ ォウィルス、ヒトライノウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス（HTLV_I)、 A型、 C型、 D 型又は E型等の B型以外の肝炎ウィルス、ワクシニアウィルス、 日本脳炎ウィルス、デ ング熱ウィルス、ヒトコロナウィルス、エボラ出血熱ウィルス、インフルエンザウイルス、 シンドビスウィルスを含めたウィルスについても、同様の効果を有する。なお、ヒトコ口 ナウィルスには、 SARSコロナウィルス（SARS- associated coronavirusまたは SARSウイ ノレスとも言う）が含まれる。
[0069] また DNA型ウィルスである単純へルぺスウィルス、ヒトアデノウイルスについても感 染にともなう宿主の防御機構として SR蛋白質の脱リン酸化が報告されていることから、 SRPIN-1の効果は単純へルぺスウィルス、ヒトアデノウイルスを含め、 B型肝炎ウィル ス、サイトメガロウイノレス、 EBウイノレス、へノレぺスゥイノレス、ヒトへノレぺスゥイノレス、天然 痘ウィルス、ポリオ一マウィルス、ヒトパピローマウィルスについても、同様の抗ウィル ス活性を有する。
[0070] 本発明において、特に好適な標的となるウィルスとしては、レトロウイルス科ウィルス
(Retroviridae；レンチウィルス属ウィルスを含む）、トガウィルス科ウィルス（
Togaviridae；アルファウィルス属ウィルスを含む）、ヘルぺスウィルス科ウィルス（ Herpesviridae；サイトメガロウイノレスを含む）、コロナウイノレス科ゥイノレス（Coronaviridae ；コロナウィルス属ウィルスを含む）が挙げられる。
[0071] [抗ウィルス剤]
本願発明には、（1) SR蛋白質の活性を低減又は阻害することによる抗ウィルス剤、 より具体的には、（i) SR蛋白質の脱リン酸化を促進させることによる抗ウィルス剤、及 び (ii) SR蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害することによる抗ウィルス剤が包含さ れる。
[0072] 更に、本願発明には、 （2) SR蛋白質の発現を阻害することによる抗ウィルス剤、並 びに、（3) SR蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによる抗ウィルス剤が 包含される。
[0073] 特に本発明は、 SRPKの活性および/または発現を阻害する化合物を含む抗ウイノレ ス剤に関する。 SRPKを活性および/または発現を阻害することにより、 SR蛋白質の安 定化に貢献するリン酸化を抑制し、結果として SR蛋白質の分解を促進して SR蛋白質 の活性を低下させる。従って、 SRPK (SRPK1および/または SRPK2)は、本発明におい て特に好適な阻害の標的である。
[0074] [ウィルス産生阻害方法]
また、本願発明には、 （1) SR蛋白質の活性を低減又は阻害することによるウィルス の産生阻害方法、より具体的には、 （i) SR蛋白質の脱リン酸化を促進させることによ るウィルスの産生阻害方法、及び (ii) SR蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害するこ とによるウィルスの産生阻害方法が包含される。特に本発明は、 SRPKの活性および/ または発現を阻害する工程を含むウィルスの産生阻害方法に関する。 SRPKを阻害 することにより、 SR蛋白質のリン酸化が阻害され、 SR蛋白質レベルが低下し SR蛋白質 の活性は低下する。
[0075] 更に、本願発明には、 （2) SR蛋白質の発現を阻害することによるウィルスの産生阻 害方法、並びに、（3) SR蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによるウイ ノレスの産生阻害方法が包含される。
[0076] すなわち本発明は、以下の発明も包含する。
[Ml] SR蛋白質の活性または発現量を低下させる工程を含む、ウィルス増殖を抑制 する方法。
〔M2〕SR蛋白質力 SF2/ASF/SRp30a、 SC35/PR264/SRp30b、 SRp30c、 HRS/SRp40 、 SRp46、または SRp75である、〔M1〕に記載の方法。
〔M3〕 SR蛋白質の活性または発現量の低下させる工程力 SR蛋白質のリン酸化を抑 制または脱リン酸化を促進する工程である、〔M1〕または〔M2〕に記載の方法。
[M4] SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する工程力 プロテインフ ォスファターゼ 2A (Protein Phophatase 2A)の活性を上昇させる工程である、〔M3〕に 記載の方法。
〔M5〕プロテインフォスファターゼ 2A (Protein Phophatase 2A)の活性を上昇させるェ 程力 HIVの tat遺伝子、アデノウイルスの E4-ORF4遺伝子、およびワクシニアウィル スの VH1遺伝子からなる群より選択される 1つ以上の遺伝子を発現するベクターを導 入する工程である〔M4〕に記載の方法。
〔M6〕SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する工程が、 SRPKの発現 または活性を阻害する工程である、 [M3]に記載の方法。 ^7 1¾¾が31¾¾1または31¾¾2でぁる、〔M6〕に記載の方法。
〔M8〕 SRPKの発現または活性を阻害する工程力 下記一般式で表されるァニリン誘 導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を投与する工程であ る、〔M6〕または〔M7〕に記載の方法。
Figure imgf000025_0001
(I)
上記式中、 R1, R2、
Figure imgf000025_0002
Q、および Wは、本明細書上記〔16〕の通りである。
〔M9〕前記 R1力 水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、またはハロゲ
1-6
ン原子である、〔M8〕に記載の方法。
[M10]前記 R2力 水素原子または C アルキル基である、 [M8]または〔M9〕に記載の
1-6
方法。
〔1^11〕前記1^が、置換基を有していてもよい C ァリール基、または置換基を有して
6-10
いてもよい 5— 10員含窒素へテロアリール基である、〔M8〕から〔M10〕のいずれかに 記載の方法。
〔M12〕前記 R4が、水素原子である、〔M8〕から〔M11〕のいずれかに記載の方法。 〔M13〕前記 Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式 (II)
Figure imgf000025_0003
(式中、 R5および R6は、上記の通り）で表される、〔M8〕から〔M12〕のいずれかに記載 の方法。
[M14] [M8]に記載のァニリン誘導体力 本明細書に記載の化合物番号 340、 348、 613、 616、 618、 622、 624力らなる群より選択される、〔M8〕に記載の方法。
〔M15〕SRPKの発現または活性を阻害する工程力 SRPKに対する miRNA、 siRNA、モ ノレフォリノオリゴ、または該 miRNAまたは siRMAの発現ベクターを導入する工程である 、 [M6]に記載の方法。
[M16] SR蛋白質の活性または発現量を低下させる工程力 SR蛋白質と逆の活性を 有する物質を投与する工程である、 〔M1〕または〔M2〕に記載の方法。
〔M17〕SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質力 hnRNP A1発現ベクターである、 [M16]に記載の方法。
[M18]ウィルスが、 （1)ヒト免疫不全ウィルス (HIV)、重症急性呼吸器症候群（SARS) 、ポリオウイルス、ヒトライノウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス（HTLV_I)、 A型、 C 型、 D型又は E型肝炎ウィルス、ワクシニアウィルス、 日本脳炎ウィルス、デング熱ウイ ルス、ヒトコロナウィルス、エボラ出血熱ウィルス、インフルエンザウイルス、若しくはシ ンドビスウィルスのいずれかの RNA型ウィルス、又は（2)単純へルぺスウィルス、ヒト アデノウイルスを含め、 B型肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス、 EBゥイノレス、ヘルぺス ウィルス、ヒトヘルぺスウィルス、天然痘ウィルス、ポリオ一マウィルス、若しくはヒトパ ピローマウィルスのいずれかの DNA型ウィルスである、 〔M1〕から〔M17〕のいずれか に記載の方法。
[M19]〔M8〕に記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれ らの水和物を投与する工程を含む、 SRPKを阻害する方法。
〔1^20〕31¾¾が31¾¾1または31¾¾2でぁる、〔M19〕に記載の方法。
〔M21〕前記 R1力 水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、またはハロ
1-6
ゲン原子である、〔M19〕または〔M20〕に記載の方法。
〔M22〕前記 R2が、水素原子または C アルキル基である、〔M19〕から〔M21〕のいずれ
1-6
かに記載の方法。
[M23]前記 R3力 置換基を有してレ、てもよレ、C ァリール基、または置換基を有して
6-10
いてもよい 5 10員含窒素へテロアリール基である、〔M19〕から〔M22〕のいずれかに 記載の方法。
〔M24〕前記 R4が、水素原子である、〔M19〕から〔M23〕のいずれかに記載の方法。 〔M25〕前記 Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式 (II) R5 R6
(II)
(式中、 R5および R6は、上記の通り）で表される、〔M19〕から〔M24〕のいずれかに記載 の方法。
[M26]〔M8〕に記載のァニリン誘導体力 本明細書に記載の化合物番号 340、 348、 613、 616、 618、 622、 624力らなる群より選択されるィ匕合物、もしくはその医薬上 許容される塩、またはこれらの水和物である、 [M19]に記載の方法。
さらに本発明は、 SR蛋白質の発現および/または活性を低下させる化合物の、ウイ ノレス増殖の阻害のための使用、および抗ウィルス剤（ウィルス増殖を抑制するための 試薬および/または医薬）の製造における使用にも関する。具体的には本発明は、以 下の発明にも関する。
[Ul] SR蛋白質の活性または発現量を低下させる化合物の、ウィルス増殖を抑制す るための使用、または抗ウィルス剤の製造における使用。
〔U2〕SR蛋白質が、 SF2/ASF/SRp30a、 SC35/PR264/SRp30b、 SRp30c、 HRS/SRp40、 SRp46、または SRp75である、〔U1〕に記載の使用。
〔U3〕 SR蛋白質の活性または発現量の低下させる化合物力 SR蛋白質のリン酸化を 抑制または脱リン酸化を促進する化合物である、〔U1〕または〔U2〕に記載の使用。 〔U4〕 SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する化合物力 プロテイン フォスファターゼ 2A (Protein Phophatase 2A)の活性を上昇させる化合物である、 〔U3 〕に記載の使用。
〔U5〕プロテインフォスファターゼ 2A (Protein Phophatase 2A)の活性を上昇させる化 合物が、 HIVの tat遺伝子、アデノウイルスの E4-ORF4遺伝子、およびワクシニアウイ ノレスの VH1遺伝子からなる群より選択される 1つ以上の遺伝子を発現するベクターで ある、 [U4]に記載の使用。
[U6] SR蛋白質のリン酸化を抑制または脱リン酸化を促進する化合物が、 SRPKの発 現または活性を阻害する化合物である、〔U3〕に記載の使用。
〔117〕51^¾が51^1 1または31^¾2でぁる、〔U6〕に記載の使用。 〔U8〕 SRPKの発現または活性を阻害する化合物力 下記一般式で表されるァニリン 誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物である、 [U6]に記 載の使用。
Figure imgf000028_0001
(I)
上記式中、 R1, R2、
Figure imgf000028_0002
Q、および Wは、本明細書上記〔16〕の通りである。
[U9]前記 R1が、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、またはハロゲ
1-6
ン原子である、〔U8〕に記載の使用。
[U10]前記 R2が、水素原子または C アルキル基である、〔U8〕または〔U9〕に記載の
1-6
使用。
〔U11〕前記 R3が、置換基を有していてもよい C ァリール基、または置換基を有して
6-10
いてもよい 5— 10員含窒素へテロアリール基である、〔U8〕から〔U10〕のいずれかに 記載の使用。
〔U12〕前記 R4力 水素原子である、〔U8〕から〔U11〕のいずれかに記載の使用。 〔U13〕前記 Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式 (II)
Figure imgf000028_0003
(式中、 R5および R6は、上記の通り）で表される、〔U8〕から〔U12〕のいずれかに記載の 使用。
[U14] [U8]に記載のァニリン誘導体力 本明細書に記載の化合物番号 340、 348、 613、 616、 618、 622、 624力らなる群より選択される、〔U8〕に記載の使用。
〔U15〕SRPKの発現または活性を阻害する化合物力 SRPKに対する miRNA、 siRNA、 モノレフォリノオリゴ、または該 miRNAまたは siRMAの発現ベクターである、〔U6〕に記載 の使用。
〔U16〕SR蛋白質の活性または発現量を低下させる化合物力 SR蛋白質と逆の活性 を有する物質である、〔U1〕または〔U2〕に記載の使用。
〔U17〕 SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質が、 hnRNP A1発現ベクターである、 [U16]に記載の使用。
〔U18〕ウィルスが、 （1)ヒト免疫不全ウィルス (HIV)、重症急性呼吸器症候群（SARS) 、ポリオウイルス、ヒトライノウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス（HTLV_I)、 A型、 C 型、 D型又は E型肝炎ウィルス、ワクシニアウィルス、 日本脳炎ウィルス、デング熱ウイ ルス、ヒトコロナウィルス、エボラ出血熱ウィルス、インフルエンザウイルス、若しくはシ ンドビスウィルスのいずれかの RNA型ウィルス、又は（2)単純へルぺスウィルス、ヒト アデノウイルスを含め、 B型肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス、 EBゥイノレス、ヘルぺス ウィルス、ヒトヘルぺスウィルス、天然痘ウィルス、ポリオ一マウィルス、若しくはヒトパ ピローマウィルスのレ、ずれかの DNA型ウィルスである、 〔U1〕一 [U17]のレ、ずれかに 記載の使用。
[U19]〔U8〕に記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれ らの水和物の、 SRPKを阻害するための使用、または SRPK阻害剤の製造における使 用。
〔1；20〕31¾¾が31¾¾1または31¾¾2でぁる、〔U19〕に記載の使用。
[U21]前記 R1が、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、またはハロ
1-6
ゲン原子である、〔U19〕または〔U20〕に記載の使用。
〔U22〕前記 R2が、水素原子または C アルキル基である、〔U19〕から〔U21〕のいずれ
1-6
かに記載の使用。
[U23]前記 R3が、置換基を有してレ、てもよレ、C ァリール基、または置換基を有して
6-10
いてもょレ、 5 10員含窒素へテロアリール基である、〔U19〕から〔U22〕のいずれかに 記載の使用。
〔U24〕前記 R4力 水素原子である、〔U19〕から〔U23〕のいずれかに記載の使用。 〔U25〕前記 Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式 (II) R5 R6
(II)
(式中、 R5および R6は、上記の通り）で表される、〔U19〕から〔U24〕のいずれかに記載 の使用。
[U26]〔U8〕に記載のァニリン誘導体力 本明細書に記載の化合物番号 340、 348、 613、 616、 618、 622、 624力らなる群より選択されるィ匕合物、もしくはその医薬上 許容される塩、またはこれらの水和物である、 [U19]に記載の方法。
[0078] [治療方法]
本願発明には、（1) SR蛋白質の活性を低減又は阻害することによるウィルス病の 治療又は予防方法、より具体的には、 （i) SR蛋白質を脱リン酸化させることによるウイ ノレス病の治療又は予防方法、及び (ii) SR蛋白質をリン酸化させる蛋白質を阻害する ことによるウィルス病の治療方法が包含される。特に本発明は、 SRPKの活性および/ または発現を阻害する工程を含むウィルス病の治療又は予防方法に関する。 SRPK を阻害することにより、 SR蛋白質のリン酸化が阻害され、 SR蛋白質レベルが低下する ことによりウィルス増殖が抑制される。
更に、本願発明には、 （2) SR蛋白質の発現を阻害することによるウィルス病治療又 は予防方法、並びに、（3) SR蛋白質と逆の機能をする蛋白質を活性化することによ るウィルス病治療又は予防方法が包含される。
[0079] III.更に本願発明には、抗ウィルス剤のスクリーニング方法、並びに SRPK酵素阻害 剤の利用が含まれる。
[0080] [抗ウィルス剤のスクリーニング方法]
更に本願発明には、 (1) SRタンパク質若しくは RS又は SRの 2回以上連続するぺプ チドを SRPKの基質として SRPK阻害剤をスクリーングする方法が包含される。
[0081] [SRPK酵素阻害剤及びその利用]
更に、本願発明には、 （l) SRPIN-ほたはその類縁体を有効成分として含む SRPK 酵素阻害剤、（2) SRPIN-ほたはその類縁体を有効成分として含むウィルス増殖阻 害剤、及び（3) SRPIN-1またはその類縁体を有効成分として含む抗ウィルス治療薬 が包含される。
[0082] IV.本願発明の具体的開示
(1) SR蛋白質の活性を低減又は阻害する抗ウィルス剤
(i)SR蛋白質を脱リン酸化させることによる抗ウィルス剤
SR蛋白質を脱リン酸化させることによる抗ウィルス剤としては、 Phosphatase 2A ( Mumby, M.C. and Walter, G. (1993) Physiol. Rev. 73, 673-680; Lechward, K.， Awotunde, O. S., Swiatek, W. and Muszynska, G. (2001) Acta Biochim. Pol. 48, 921-933;し ohen, P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Annu. Rev. Biochem. 58， 453-508; Janssens, V. and Goris, J. (2001) Biochem. J. 353， 417-39)を活性化する活性化剤が含まれ、具体的には、 HIVの tat遺伝子がコー ドするポリペプチド（例えば、 Accession number AAK08486)、又はアデノウイルスの E4-ORF4がコードするポリペプチド（例えば、 Accession number AAB37507)、又はヮ クシニアウィルスの VH1がコードするポリペプチド（例えば、 Accession number AAV38329)が含まれる。さらに、 HIVの tat遺伝子又アデノウイルスの E4-ORF4遺伝 子又はワクシニアウィルスの VH1遺伝子を載せた遺伝子治療用の発現ベクターが 含まれる。 tat遺伝子としては、 Accession number AF324493の CDS (5830-6044プラ ス 8369-8411)、 E4-ORF4としては、 Accession number S82508の CDS (1634-1993)、 ワクシニアウィルス VH1としては、 Accession number BT019522の CDS (1-555)が例示 できる。
[0083] (ii)SR蛋白質のリン酸化酵素阻害剤
(ii一 1) SR蛋白質をリン酸化する酵素としては、既に種々のリン酸化酵素が知られて いる力 これらの酵素は、 RSドメインのリン酸化部位が異なると考えられており、これ ら RSリン酸化酵素のうち、 SR蛋白質の安定化に寄与する特定のリン酸化を行いうる 酵素としては、 SRPKのみであることを本発明者らは発見した。そこで、 SR蛋白質の リン酸化による安定化を防ぐために、標的とする SR蛋白質をリン酸化する酵素として は、 SR蛋白質のリン酸化酵素の内、特に、 SRPKがあげられ、 SRPKとしては、 SRP Kl (Nature(1994) Vol.369, pp.678-682)及び SRPK2(Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) Vol.242:pp.357-364; Wang, H.Y. et al., J. Cell. Biol. 1998, 140:737-750)の両者を挙げることができる。 SRPK1遺伝子の塩基配列は、 Accession number NM— 003137の 124-2088、 U09564の 109-2073、 AJ318054の 10-2487、 NM016795の 43-1986等を、アミノ酸配列は NP_003128、 AAA20530, CAC39299、 CAA11833, NP_058075等を参照することができる。また SRPK2遺伝子の塩基配列は 、 Accession number U88666の 188-2245、 NM_009274の 208- 2253等を、アミノ酸配列 は AAC05299、 NP_033300等を参照することができる（Nikolakaki,E. et al , J. Biol. Chem. 276, 40175-40182 (2001); Papoutsopoulou,S., et al" Nucleic Acids Res. 27, 2972-2980 (1999); Wang,H.Y. et al, Genomics 57， 310-315 (1999); GuiJ.F. et al" Nature 369, 678-682 (1994); Wang,H.Y.et al., J. Cell Biol. 140, 737-750 (1998); Papoutsopoulou,S. et al., Nucleic Acids Res. 27, 2972-2980 (1999); Kuroyanagi,N. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 242, 357—364 (1998); Bedford,M.T. et al., EMBO J. 16， 2376-2383 (1997))。 SRPK1には、 SRPKlaと表記されるものも含む。 本願発明の方法で用いるリン酸化酵素（SRPK)を阻害する機能を有する物質とし ては、次の一般式で示される化合物（SRPIN - 1及びその類縁体を含む）、およびそ れらの医薬上許容される塩および水和物を用いることができる。
Figure imgf000032_0001
(式中、 R1は、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有して
1-6
いてもよい C アルケニル基、置換基を有していてもよい C アルキニル基、置換基を
2-6 2-6
有していてもよい C ァリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、アジド基、ヒドロ
6-10
キシ基、置換基を有してレ、てもよレ、C アルコキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、C
1-6 1-6 アルキルチオ基、置換基を有していてもよい C アルキルスルホニル基、カルボキシ
1-6
ル基、ホルミル基、置換基を有していてもよい C アルコキシカルボニル基、ァシル基
1-6
、ァシルアミノ基、またはスルファモイル基を示し； R2は、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、または置換基を有して
1-6
レ、てもよレ、ァリール基を示し；
R3は、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有していてもよい C ァ
1-6 2-6 ルケニル基、置換基を有していてもよい c ァリール基、置換基を有していてもよい
6-10
含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
R4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
Qは、一 C(0)_、一 C(S)―、 -SO―、一 C(S)NHC(〇)_、一 C(0)NHC(0)_、または—
2
C(〇)NHC(S)_を示し；
Wは、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、置換基を有してレ、ても
1-6
よい C ァリーノレ基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよい C アル
6-10 1-6 コキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキルチオ基、置換基を有してレ、てもよレヽ
1-6
含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般式 (I I)
I
入
R5 R6
(II)
(式中、 R5および R6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していても ょレ、C アルキル基、置換基を有してレ、てもよレ、含窒素複素環、置換基を有してレ、て
1-6
もよい縮合芳香族複素環、ァシル基、もしくはァシルアミノ基を示し;または、
前記 R5および R6は、隣接する窒素原子と一緒になつて、置換基を有していてもよい 複素環を形成していてもよぐ該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複 素環であってもよく；
前記 R5および R6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンァミノ基または置 換基を有してレ、てもよレ、芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよレ、。 )。
上記化合物の一例としては、以下の化合物が例示できる。
Figure imgf000034_0001
(III)
[0086] Xとしては、 F Cl Br I又は Atを挙げることができる c
具体的には、下記の SRPIN-lを挙げることができる。
Figure imgf000034_0002
(IV)
[0088] 本発明の SRPIN-lは、 Maybridge社（Trevillett, Tintagel, Cornwall PL34 OHW, England)および Ambinter社 (46 quai Louis Bleriot, Pans, F— 75016 Franceノょり入手 できるが、概略次のように化学合成することができる。
Figure imgf000034_0003
SRPIN--
[0090] (ii一 2) SRPK1遺伝子及び SRPK2遺伝子に対する RNAiを利用する抗ウィルス剤 細胞内での SRPK1をコードする遺伝子及び SRPK2をコードする遺伝子の発現を 低下させるために、 siRNA、モノレフオリノオリゴ、又は miRNAを用いることができる。
[0091] siRNAの設計には、周知の方法を用いることができる力 例えば、次のような方法 で設計することができる。 [0092] (i卜 2-1) siRNAのターゲット配列としては、 5'側や 3'側の UTR (非翻訳領域）ゃスタ 一トコドン付近を避け、スタートコドンより 50塩基以上下流であって、 ORF中で、 AAか ら始まる又は NAから始まる 19一 21塩基（19塩基が最も一般的）で CG含量が 50%前 後で、可能な限り 5'や 3'への偏りや繰り返し配列が少ない配列を用いることができる。
[0093] siRNAは、 AAから始まる場合は、 dTdTまたは UU2塩基のオーバーハング、 NAか ら始まるターゲット配列の場合には dTdN、 dTdT、または UUをつけて調製することが できる。
[0094] なお、 目的とするターゲット配列以外と交差反応を起こし、 目的以外のタンパク質の 発現に影響を及ぼすことを防ぐため、選び出した配列は BLASTサーチ等を用いて他 の RNA配列との類似性を確認する。
[0095] なお設計された siRNAを細胞内で発現するように調製した、 siRNA発現ベクターを 用いる態様も本発明に含まれる。
[0096] モルフォリノオリゴとは、塩基を有するモルフォリノサブユニットが鎖状に複数つなが つた化合物であり、モルフオリン環および非イオン性ホスフォロージアミデート
(phosphorodiamidate)のサブユニット間結合構造を含む（US Patents 5, 142,047, 5, 185,444)。細胞内の安定性が高ぐ mRNAに対して高い親和性を有することから、 モルフォリノアンチセンスオリゴは標的遺伝子の発現抑制のために好適に使用できる (Summerton JE.， Ann NY Acad Sci 2003; 1002: 189)。効果的なモルフォリノオリゴの 設計方法は既に知られている（Summerton, 1989， In: Discoveries in Antisense Nucleic Acids; Ed. : C. Brakel; Pub. : The Portfolio Publishing Co., Woodlands, Texas; pages 71-80; Summerton & Weller, 1997, Antisense Nuc. Acid Drug Dev. 7， 187;および Gene Tools社のウェブサイトを参照）。モルフォリノオリゴは、 Gene Tools 社（Gene Tools, LLC, Philomath, OR)において入手することができる。
[0097] (2) SR蛋白質をコードする遺伝子の発現を阻害することによる抗ウィルス剤には、例 えば、 siRNA、モルフォリノオリゴ、又は miRNAが包含される。
(2-1) siRNA,
siRNAの設計には、上記（i卜 2)の方法を用いることができる。
[0098] (3) SR蛋白質と逆の機能をする蛋白質又は該蛋白質を活性化することによる抗ウイ ルス剤
(3-1) SR蛋白質と逆の機能とは、例えばスプライシングにおいて、イントロンに遠位 の 3'スプライス部位の選択を促進する機能を言う。すなわち、イントロンに近位の 3'ス プライス部位の選択を促進する SR蛋白質とは逆のスプライシング調節因子を用いて、 SR蛋白質の活性をキャンセルすることができる。具体的には、 SR蛋白質と逆の機能 をする蛋白質としては、 hnRNP Al、 A2、及び B1などの heteronuclear
ribonucleoproteins (hnRNPs)を挙げることができる力 好適には、 hnRNP A1を挙げる こと力 Sできる。更に好適には、 hnRNP A1をコードする遺伝子を遺伝子治療用発現べ クタ一に載せた抗ウィルス剤が挙げられる。 hnRNP A1をコードする遺伝子配列は、 例えば Accession number NM_002136の 105-1064、 NM_031157の 105-1220に示さ れている。また hnRNP A1のアミノ酸配列は、 Accession number NP_002127、
NP_112420等に示されている（Expert- Bezan, Sureau,A. et al.， J. Biol. Chem. 279, 38249-38259 (2004); Zahler,A.M. et al., J. Biol. Chem. 279， 10077-10084 (2004); Marchand,V. et al., J. Mol. Biol. 323， 629-652 (2002); Buvoli,M. et al" EMBO J. 9， 1229-1235 (1990); Biamonti'G. et al., J. Mol. Biol. 207, 491-503 (1989);
Buvoli,M. et al., Nucleic Acids Res. 16， 3751—3770 (1988); Michael,W.M. et al., Cell 83, 415-422 (1995))。 hnRNP A2/B1をコードする遺伝子配列は、例えば Accession number NM.002137の 170- 1192、 NM_031243の 170-1228に示されている 。また hnRNP A2/B1のアミノ酸配列は、 Accession number NP_002128、 NP_112533等 に示されている（Kozu,T.， et al., Genomics 25, 365-371 (1995); Biamonti,G. et al., Nucleic Acids Res. 22, 1996-2002 (1994); Burd'C.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 9788-9792 (1989); Kumar,A. et al., J. Biol. Chem. 261, 11266-11273 (1986))
(4) SRPKを阻害する物質をスクリーニングすることによる抗ウィルス剤のスクリーニン グ方法。
本発明の抗ウィルス剤のスクリーニング方法は、例えば、試験化合物を SRPKに作 用させる工程、及び SRPKの SR蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程を含む SRPK阻害剤を選抜することを含む方法である。該能力を低下させる化合物（SRPK阻 害剤）は、抗ウィルス剤として有用である。特に本願発明には、 SRPK1若しくは SRP K2をターゲットとする種々の化合物を、 SRタンパク質若しくは RS又は SRの 2回以上 連続するペプチドを SRPKの基質として SRPK阻害剤をスクリーングすることを含む抗ゥ ィルス剤のスクリーング方法も包含する。 Arg-Ser (RS)若しくは Ser-Arg (SR)の 2回以 上連続するペプチドを SRPKの基質として利用し、この基質をリン酸化する能力を低 下させる化合物（SRPK阻害剤）を選抜することで、効率的に SRPKの SR蛋白質リン酸 化活性を阻害する化合物を選択することができる。
より具体的には、本発明のスクリーニングは以下の工程を含む。
(a)被験化合物の存在下で、 SRPKとその基質を接触させる工程、
(b)該基質のリン酸化を検出する工程、
(c)被験化合物の非存在下または低用量の存在下に比べ、該リン酸化を低下させる 化合物を選択する工程。
基質としては、上記のように SR蛋白質、 RSドメインを含むその部分ポリペプチド、あ るいは RSまたは SRが 2回以上連続して繰り返したポリペプチドを用いることができる（ 実施例参照）。 SRPKとしては、野生型 SRPK1または SRPK2、あるいはリン酸化活性を 維持する限り、タグペプチドが付加された融合蛋白質やその他の改変蛋白質であつ てもよレ、。本発明においては、 SR蛋白質に対するリン酸化活性を維持する限り、変異 を有する SRPKなども SRPKと呼ぶ。
より具体的には、本発明において SRPK1とは、 （a) Accession number NP_003128、 AAA20530, CAC39299、 CAA11833、または NP_058075に記載のアミノ酸配列を含 む蛋白質、（b)該アミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 85%、さらに好ましくは 90%、より好 ましくは 95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であってリン酸化活性 を有する蛋白質、（c) Accession number NM_003137の 124-2088、 U09564の
109-2073、 AJ318054の 10-2487、または NMJ316795の 43-1986の一部または全部を 含む核酸の相補鎖とストリンジヱントな条件でハイブリダィズする核酸がコードする蛋 白質であってリン酸化活性を有する蛋白質が含まれる。また本発明において SRPK2 とは、（a) Accession number AAC05299または NP_033300に記載のアミノ酸配列を含 む蛋白質、（b)該アミノ酸配列と 80%以上、好ましくは 85%、さらに好ましくは 90%、より好 ましくは 95%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質であってリン酸化活性 を有する蛋白質、 (c) Accession number U88666の 188-2245、または NM_009274の 208-2253の一部または全部を含む核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリ ダイズする核酸がコードする蛋白質であってリン酸化活性を有する蛋白質が含まれる 。ここで一部とは、例えば連続する 20塩基以上、好ましくは 25塩基以上、より好ましく は 30塩基以上、 40塩基以上、 45塩基以上、 50塩基以上を言う。
アミノ酸配列の同一性は、例えば BLASTPプログラム（Altschul, S. F. et al.， 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)を用いて決定することができる。例えば NCBI (National Center for Biothchnology Information)の BLASTのゥエフへ1 ~シ ίこおレヽ飞し ow complexityを含むフィルタ一は全て OFFにして、デフォルトのパラメータを用いて検索 を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141 ; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656)。パラメ ータの設定は、例えば open gapのコストは 11、 extend gapのコストは 1、 wordsizeは 2、 Dropoff (X) for blast extensions m bitsは/、 X dropoff value for gapped alignment (in bits)は 15、 final X dropoff value for gapped alignment (in bits)は 25にする。スコゾのた めのマトリックスとして BLOSUM62を用いる。例えば 2つの配列の比較を行う blast2 sequencesプログラム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)に より、 2配列のァライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップ はミスマッチと同様に扱い、上記の Accession numberで示した野生型蛋白質のァミノ 酸配列全体 (例えば配列番号: 2または 4の全長）に対する同一性の値を計算する。ァ ライメントにおける野生型蛋白質のアミノ酸配列の外側のギャップは無視して同一性 の値を計算すればよい。また、ハイブリダィゼーシヨンにおいては、野生型蛋白質の コード配列（例えば配列番号： 1または 3)を含む核酸、またはハイブリダィズの対象と する核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダィズする かを検出することにより同定することができる。ストリンジヱントなハイブリダィゼーショ ンの条件は、例えば 5xSSC (1 X SSCは 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む )、 7%(W/V) SDS、 10 μ g/ml変性サケ精子 DNA、 5xデンハルト液（lxデンハルト溶液 は 0.2%ポリビニールピロリドン、 0.2%牛血清アルブミン、および 0.2%フイコールを含む） を含む溶液中、 48°C、好ましくは 50°C、より好ましくは 52°Cでハイブリダィゼーシヨンを 行レ、、その後ハイブリダィゼーシヨンと同じ温度、より好ましくは 60°C、さらにこの好ま しくは 65°C、最も好ましくは 68°Cで 2xSSC中、好ましくは lxSSC中、より好ましくは 0.5xSSC中、より好ましくは O. lxSSC中で、振蘯しながら 2時間洗浄する条件である。
[0102] SRPKのリン酸化活性は、例えば標識した ATPを用いて SRPKと基質との反応を行い 、標識された基質を定量することにより検出することが可能である。具体的には、実施 例 4Bに記載の方法に従えばよい。
[0103] 得られた化合物は、さらに以下の工程により抗ウィルス作用を検出し、顕著な抗ウイ ノレス作用を示すものをさらに選別してもよレ、。
(d)選択された被験化合物の存在下で、ウィルス増殖またはウィルス遺伝子の発現 を検出する工程、
(e)該化合物の非存在下または低用量の存在下に比べ、該ウィルス増殖またはウイ ノレス遺伝子の発現を低下させる化合物を選択する工程。
ウィルス増殖またはウィルス遺伝子の発現は、実施例に例示したように、ウィルスゲ ノムを導入した細胞におけるウィルス蛋白質の産生を検出することなどにより測定す ること力 Sできる。
[0104] また本発明は、本発明の上記スクリーニング方法により選択された化合物を含む SRPK阻害剤および抗ウィルス剤に関する。また本発明は、本発明の上記スクリー二 ング方法により得られた化合物の、 SRPK阻害剤および/または抗ウィルス剤の製造 のための使用、ならびに SRPK阻害および/または抗ウィルス処置のための使用に関 する。例えば、 CAS Registry Nos. 218156-96-8、 674360-18-0、 494830-83-0、 672919-05-0、 54231-51-5、 10338-55-3、 1692-79-1、 1496-40-81、 496012-09-0、 445406-05-3、 445412-62-4、および 388071-30-5からなる群より選択される化合物 は、 SRPK阻害剤および Zまたは抗ウィルス剤として有用である。
[0105] 更に、本願発明には、上記抗ウィルス剤をウィルス増殖阻害剤又は抗ウィルス治療 薬として用いることも包含される。例えば、抗ウィルス剤として SRPIN-1を用いる場合、 SRPIN-1以外に周知の製薬助剤を添カ卩することができ、例えば、 AZTやプロテアーゼ 阻害剤を添加することができる。
[0106] 本発明のウィルス増殖阻害剤又は抗ウィルス治療薬は、例えば、体内濃度が
lOOnM-lmMの間にいずれかになるように、間歇的若しくは持続的に、経口、経皮、 粘膜下、皮下、筋肉内、血管内、脳内、又は腹腔内に投与することができる。
[0107] 本発明の SRPIN-1類縁体化合物について、以下にさらに詳細に記載する。本発明 は、以下の構造を有する化合物およびその利用に関する。
[0108] 本発明に係る化合物は、下記一般式 (I)で表されるァニリン誘導体、もしくはその医 薬上許容される塩、またはこれらの水和物である。
Figure imgf000040_0001
(I)
(式中、 R1は、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有して
1-6
いてもよい C アルケニル基、置換基を有していてもよい C アルキニル基、置換基
2-6 2-6
を有していてもよい C ァリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、アジド基、ヒド
6-10
ロキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルコキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、
1-6 c アルキルチオ基、置換基を有していてもよい C アルキルスルホニル基、カルボキ
1-6 1-6
シノレ基、ホルミル基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルコキシカルボニル基、ァシル
1-6
基、ァシルァミノ基、またはスルファモイル基を示し；
R2は、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、または置換基を有し
1-6
てレ、てもよレヽァリール基を示し；
R3は、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有していてもよい C ァ
1-6 2-6 ルケニル基、置換基を有していてもよい C ァリール基、置換基を有していてもよい
6-10
含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
R4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
Qは、 _C (〇）一、 -C (S)一、 -SO一、 -C (S) NHC (O)一、 _C (〇） NHC (O)一、ま たは一 C (O) NHC (S)—を示し；
Wは、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、置換基を有してレ、て
1-6
もよレ、 C ァリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよい C ァ
6-10 1-6 ルコキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルキルチオ基、置換基を有してレ、ても
1-6
よい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般 式 (II)
(II)
(式中、 R5および R6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していても ょレ、C アルキル基、置換基を有してレ、てもよレ、含窒素複素環、置換基を有してレ、て
1-6
もよい縮合芳香族複素環、ァシル基、もしくはァシルアミノ基を示し;または、 前記 R5および R6は、 P 接する窒素原子と一緒になつて、置換基を有していてもよい 複素環を形成していてもよぐ該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複 素環であってもよく；
前記 R5および R6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンァミノ基または置 換基を有してレ、てもよレ、芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよレ、。 )。
[0109] このような一般式 (I)で表される化合物のうち、好ましいィ匕合物としては、たとえば、 下記の化合物が挙げられる。
[0110] (1)前記 R1が、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、またはハロゲ
1-6
ン原子である化合物。
(2)前記 R1が、水素原子、 C アルキル基、ハロゲン化 C アルキル基またはハロゲ
1-6 1-6
ン原子である化合物。
(3)前記 R1が、水素原子、メチル基、トリフルォロメチル基、塩素原子またはフッ素原 子である化合物。
(4)前記 R1が、水素原子またはトリフルォロメチル基である化合物。
[0111] (5)前記 R2力 S、水素原子または C アルキル基である化合物。
1-6
(6)前記 R2が、水素原子またはメチル基である化合物。 (7)前記 R2が、水素原子である化合物。
[0112] (8)前記 R3力 S、置換基を有していてもよい C ァリール基、または置換基を有してい
6-10
てもよレ、 5— 10員含窒素へテロアリール環である化合物。
(9)前記 R3力 フヱニル基； C アルキル基、 C アルコキシ基またはニトロ基を置換
1-6 1-6
基に有する C ァリール基；または 5— 10員含窒素へテロアリール基である化合物。
6-10
(10)前記 R3力 フヱニル基； C アルキル基、 C アルコキシ基、またはニトロ基を置
1-6 1-6
換基に有してレ、るフエニル基；またはピリジノレ基である化合物。
(11)前記1 3が、フエニル基、トリル基、メトキシフヱニル基、またはニトロフエ二ル基、 またはピリジル基である化合物。
(12)前記 R3が、トリル基またはピリジノレ基である化合物。
(13)前記 R3が、 4_ピリジル基である化合物。
[0113] (14)前記 R4が、水素原子である化合物。
[0114] (15)前記 Q力 -C (〇）_または- C (0) NHC (S) _である化合物。ここで、 C (〇）と は、炭素原子に酸素原子が二重結合で結合していることを意味し、 c (s)とは炭素原 子に硫黄原子が二重結合で結合していることを意味する。
(16)前記 Qが、 -C (〇)一である化合物。
[0115] (17)前記 Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式 (II)
I
R5 R6
(II)
(式中、 R5および R6は、互いに同一又は異なって、置換基を有していてもよい C ァ
1-6 ルキル基を示し；または、
前記 R5および R6は、隣接する窒素原子と一緒になつて、置換基を有していてもよい ヘテロ環式基を形成していてもよぐ該ヘテロ環式基は、置換基を有していてもよい 縮合芳香族へテロ環式基であってもよレ、。 )で表される化合物。
[0116] (18)前記 Wが、 C アルキル基を置換基に有していてもよい 1の窒素原子を含有す
1-6
る 4一 8員へテロ環式基、 C アルキル基を置換基に有していてもよい 1の窒素原子
1-6
および 1の酸素原子を含有する 4一 8員へテロ環式基、フヱニル基が縮合した 1の窒 素原子を含有する 4一 8員へテロ環式基である化合物。
(19)前記 Wが、 C アルキル基を置換基に有していてもよい 1の窒素原子を含有す
1-6
る 4一 8員へテロ環式基である化合物。
(20)前記 Wが、 C アルキル基を置換基に有していてもよいピペリジニル基またはパ
1-6
ーヒドロアゼピン基である化合物。
(21)前記 Wは、水素原子、ハロゲン原子、ジェチルァミノ基、ピロリジニル基、ピペリ ジニル基、 2_メチルピペリジニル基、パーヒドロアゼピン基、インドリニル基、イソイン ドリニル基、または 1,2,3,4-テトラヒドロキノリル基である化合物であってもよい。
[0117] このうち、 R1に関しては、 (1)一（4)の順で、 (4)がより好ましい。 R2に関しては、 (5) 一（7)の順で、（7)がより好ましい。 R3に関しては、（8)—（13)の順で、 （13)がより好 ましい。 Qに関しては、（15) （16)の順で、（16)がより好ましい。 Wに関しては、 (1 7)—（20)の順で、（20)がより好ましい。また（21)も好ましい。
[0118] 前記一般式 (I)で表される化合物について、 （1)一（4)、（5)—（7)、（8)—（13)、 ( 14)、（15)—（16)、 (17)—（21)からなる群から、それぞれの置換基における好まし い態様を選択し、それらを任意に組み合わせた化合物はより好ましい。
[0119] 以下、一般式 (I)で表される具体的な化合物について、下記に挙げることができる 力 本発明は、以下に列挙された化合物に限定されるものではない。
[0120] [表 1]
Figure imgf000044_0001
[0121] [表 2]
Figure imgf000045_0001
[0122] [表 3]
Figure imgf000046_0001
本発明は、上記に例示した任意の化合物に関するが、これらの例示化合物のうち、 好ましくは、上記例示化合物番号 340、 341、 342、 343、 344、 345、 346、 347、 348、 608 、 613、 615、 616、 618、 619、 620、 621、 622、 623、 624、 625、 626の化合物が挙げられ 、より好ましくは、 340、 341、 342、 343、 345、 347、 348、 608、 613、 615、 616、 618、 619 、 620、 622、 623、 624、 625、 626の化合物が挙げられ、さらに好ましくは、上記例示化 合物番号 340、 348、 613、 616、 618、 622、 624のィ匕合物力 S挙げられ、さらに好ま しくは、 ί列示ィ匕合物番号 340、 348、 613、 618、 624力 S挙げられる。
[0124] また本発明は、上記に例示した任意の化合物にも関する。特に本発明は、記例示 化合物番号 341、 342、 346、 347、 348、 349、 612、 613、 614、 616、 617、 618、 619、 620
、 621、 622、および 624からなる群より選択される新規化合物にも関する。
[0125] これらの化合物（ァニリン誘導体）、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれら の水和物は、 SRPK阻害剤として有効である。
[0126] また、これらの化合物（ァニリン誘導体）、もしくはその医薬上許容される塩、または これらの水和物は、抗ウィルス剤として有用である。
[0127] 本発明に係る前記式 (I)で表される化合物の代表的な製造方法について以下に記 す。
以下、
Figure imgf000047_0001
R2、 R3、 R4、 R5、 R6、 Q、 Wは前記定義と同意義である。室温とは、 20 30°C程度の温度を意味する。
[0128] 製造方法 A
Figure imgf000047_0002
[0129] 工程 1
化合物 laと化合物 2aとを反応させ、化合物 3aを得る工程である。原料のニトロベン ゼン誘導体 laは、市販品または適宜官能基を誘導して入手する。 Halは、脱離基と なるハロゲン原子である。化合物 2aは導入する- NR5R6を含む試薬であり、 Xは水素 原子などである。化合物 2aは、 1一 2当量用いることが好ましい。反応は、溶媒中、塩 基の存在下で行うことができる。
[0130] 塩基としては、トリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、ピリジン、 4—(ジメチル ァミノ）ピリジン等を用いることができる。塩基は 1一 5当量用いることが好ましい。また 、塩基として過剰量（1から 5当量）の X-NR 6を代わりに用いることができる。
溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド、 N, N-ジメチルホルムアミド、 N—メチ ノレピロリドン、ジォキサン、テトラヒドロフラン、トルエン等をあげることができる。
反応温度は、 0°Cから 150°Cで反応を行うことができる力 好ましくは室温で行うこと ができる。
[0131] 工程 2
化合物 3aのニトロ基をァミノ基に還元し、化合物 4aを得る工程である。 還元方法としては、溶媒中、塩化スズ等の存在下、濃塩酸等を接触させて行うこと ができる。その他、接触水素化などの一般的な還元反応も利用可能である。
[0132] 反応溶媒としてはメタノール、エタノール、 N, N—ジメチルホルムアミド、テトラヒドロ フラン、 1， 2—ジメトキシェタン、 1， 4-ジォキサン、水、またはこれらの混合溶媒を用 レ、ることができる。
還元剤となる塩化スズ等は質量比で 1一 20当量の量を用いることが好ましい。反応 温度は 0°Cから 100°Cで反応を行うことができる。
[0133] なお化合物 3aおよび 4aは市販品を入手できる場合もあり、その場合は市販品を用 いればよい。特に一般式 (I)の Wが水素またはハロゲンの場合は、多くの場合、巿販 品を入手可能である。例えば、本明細書の化合物番号 608、 612、 623— 626などがこ れに該当する。
[0134] 工程 3a
化合物 4aと化合物 5aを反応させ、化合物 6aを得る工程である。 Lはハロゲン原子 などである。
反応は、溶媒中、塩基の存在下、必要に応じ触媒を添加して行うことができる。この 場合、化合物 5aを 1一 3当量用いることが好ましい。
[0135] 反応溶媒は、ジクロロメタン、クロロホノレム、 1 , 4_ジォキサン、テトラヒドロフラン、ト ルェン、ピリジン、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N—メチルピロリドンなどを用いること ができる。
塩基としては、トリェチルァミン、ジイソプロピルェチルァミン、ピリジン、 4—(ジメチル ァミノ）ピリジン等を用いることができる。
その他、 Lが水酸基である場合に縮合剤を用いる一般的なアミド結合形成反応など や、 Lとしてスクシンイミジノレ基やイミダゾィル基などの脱離基である場合の一般的な アミド結合形成反応も利用可能である。
触媒としては、 4- (ジメチルァミノ）ピリジンなどが挙げられる。
反応温度は 0°Cから 100°Cで反応を行うことができる。
[0136] 工程 3b
化合物 4aと化合物 5bとを反応させ、化合物 6bを得る工程である。
反応は、溶媒中、塩基の存在下でァシルイソチオシアナートを作用させて行うことが できる。ァシルイソチオシアナートは、市販品、または適宜ァシルノヽライドとチオシァ ン酸塩とから反応溶液中で調製したものをそのまま用いることができる。ァシルイソチ オシアナートは、 1一 5当量用いることが好ましい。チォシアン酸塩としては、チオシァ ン酸カリウム、チォシアン酸ナトリウム、チォシアン酸アンモニゥム等を用いることがで き、 1一 5当量用いることが好ましい。
溶媒としては、例えばァセトニトリル、 N, N-ジメチルホルムアミド、 N-メチルピロリド ン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールジメチルエーテル、 1, 4一ジォキサン等をあ げること力 Sできる。
塩基としては、例えばトリェチルァミン、ジイソプロピルァミン、ピリジン、 4 - (ジメチル ァミノ）ピリジン等を用いることができる。塩基は、 1一 5当量用いることが好ましい。 反応温度は、 0°Cから 150°Cで反応を行うことができる。
[0137] 工程 4a
化合物 6aのアミド基部分をアルキル化 (R2化）し、化合物 7aを得る工程である。 反応は、溶媒中、塩基の存在下でアルキル化試薬 (R2_X)を用いて行うことができ る。 Xは、脱離基となるハロゲン原子またはスルホン酸エステルである。アルキル化試 薬 (R2_X)は、 1一 5当量用いることが好ましい。
溶媒としては、例えば N， N—ジメチルホルムアミド、 N—メチルピロリドン、テトラヒドロ フラン、エチレングリコールジメチルエーテル、 1 , 4一ジォキサン、ァセトニトリル、エー テル等をあげることができる。 塩基としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、水素化リチウム、ブチルリチウム、 メチルリチウム、フエ二ルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド等を用いることができる 。塩基は、 1一 5当量用いることが好ましい。
反応温度は、 0°Cから 150°Cで反応を行うことができる。
[0138] 工程 4b
化合物 6aのアミド結合のカルボニル基をチォカルボニル基へと変換し、化合物 7b を得る工程である。
反応は、溶媒中、チォカルボニル化試薬を用いて行う。
チォカルボニル化試薬としては、例えば Lawesson's試薬（
2,4-bis(4-methoxyphenyl)-l,3,2,4-dithiadiphosphetane 2, 4 - disulfide)、五硫ィ匕二リン (十硫化四リン、 P S )等を用いることができる。チォカルボニル化試薬は、 1
4 10 一 5当量 用いることが好ましい。
溶媒としては、例えばトルエン、ベンゼン、クロ口ベンゼン、キシレン、 N, N—ジメチ ノレホノレムアミド、 N—メチルピロリドン、エチレングリコールジメチルエーテル、 1 , 4ージ ォキサン、テトラヒドロフラン等をあげることができる。
反応温度は、 0°Cから 200°Cで反応を行うことができる。
[0139] 以上が本発明にかかる化合物（I)の製造方法の代表例であるが、本発明化合物の 製造における原料化合物'各種試薬は、塩や水和物あるいは溶媒和物を形成してい てもよく、いずれも出発原料、使用する溶媒等により異なり、また反応を阻害しない限 りにおいて特に限定されない。用いる溶媒についても、出発原料、試薬等により異な り、また反応を阻害せず出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定されな レ、ことは言うまでもない。本発明に係る化合物（I)がフリー体として得られる場合、前 記の化合物（I)が形成していてもよい塩またはそれらの水和物の状態に常法に従つ て変換すること力 Sできる。
[0140] 本発明に係る化合物（I)が化合物（I)の塩または化合物（I)の水和物として得られる 場合、前記の化合物（I)のフリー体に常法に従って変換することができる。
[0141] また、本発明に係る化合物（I)について得られる種々の異性体 (例えば幾何異性体 、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体、等）は、 通常の分離手段、例えば再結晶、ジァステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロ マトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマト グラフィー、等）を用いることにより精製し、単離すること力 Sできる。
[0142] 本発明において、 SRPIN-1類縁体は、 SRPKの活性を阻害するために用いることが できる。すなわち、本明細書に記載の SRPIN-1類縁体を投与することにより、 SRPK1 および/または SRPK2のリン酸化活性を阻害することができる。本発明は、 SRPK活性 の阻害における、 SRPIN-1類縁体の使用に関する。また本発明は、 SRPIN-1類縁体 を含む SRPK阻害剤に関する。また本発明は、 SRPK阻害剤の製造における、
SRPIN-1類縁体の使用に関する。さらに本発明は、 SRPIN-1類縁体を SRPKに接触さ せる工程を含む、 SRPK活性を阻害する方法に関する。ここで SRPKに接触させるとは 、 SRPKを発現する細胞、組織、および/または個体にインビボまたはインビトロで SRPIN-1類縁体を投与することであってもよい。
[0143] また本発明において、 SRPIN-1類縁体は、ウィルスの増殖を抑制するために用いる こと力 Sできる。すなわち、本明細書に記載の SRPIN-1類縁体を投与することにより、 SRPK1および/または SRPK2のリン酸化活性を阻害することを通して、ウィルス増殖が 抑制される。本発明は、ウィルス増殖の抑制における、 SRPIN-1類縁体の使用に関 する。また本発明は、 SRPIN-1類縁体を含む抗ウィルス剤に関する。また本発明は、 抗ウィルス剤の製造における、 SRPIN-1類縁体の使用に関する。さらに本発明は、 SRPIN-1類縁体を SRPKに接触させる工程を含む、ウィルス増殖を抑制する方法に関 する。ここで SRPKに接触させるとは、 SRPKを発現する細胞、組織、および/または個 体にインビボまたはインビトロで SRPIN-1類縁体を投与することであってもよい。
[0144] また本発明は、上記 SRPIN-1類縁体もしくはその医薬上許容される塩、またはこれ らの水和物を含むパッケージであって、該化合物力 RPK阻害活性および/または抗 ウィルス作用を有すること力 該パッケージまたは該パッケージの内容物中に記載さ れている、パッケージを提供する。ここでパッケージとは、該 SRPIN-1類縁体もしくは その医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を含む包装物のことであり、該 SRPIN-1類縁体もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物を入れるた めの容器を含んでいてよぐさらに該容器を収納するバッグまたは外箱等を含んでも よい。
[0145] また本発明は、 SR蛋白質の活性または発現量を低下させる化合物を含むパッケ一 ジであって、該化合物が抗ウィルス作用を有することが、該パッケージまたは該パッ ケージの内容物中に記載されている、パッケージを提供する。特に本発明は、該化 合物が SRPKの発現および/または活性を阻害する活性を有する化合物であるパッケ ージを提供する。
[0146] 本発明の化合物は、薬学的に許容される担体と共に組成物とすることができる。例 えば、周知の製剤技術を適用して、医薬組成物としてよい。本発明の医薬組成物を 、 SRPK阻害剤、または抗ウィルス剤（すなわち、ウィルス疾患の予防剤または治療 剤）、あるいはその他の医薬として使用する場合、その投与形態としては、例えば錠 剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤もしくはシロップ剤等による経口投 与、又は注射剤、エアゾール剤、座剤、貼布剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤 、軟膏剤、若しくは点眼剤等による非経口投与を挙げることができる。これらの製剤は 、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を 用いて周知の方法で製造される。
[0147] 例えば、賦形剤としては、デンプン、ノくレイショデンプン、トウモロコシデンプン等の デンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
[0148] コーティング剤としては、例えば、ェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース 、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナゥバロウ、パラフィン等 を挙げることができる。
[0149] 結合剤としては、例えばポリビエルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様 の化合物を挙げることができる。
[0150] 崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウ ム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビュルピロリドンのような化学修飾さ れたデンプン ·セルロース類を挙げることができる。
[0151] 安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラォキシ安息 香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フヱニルエチルアルコール のようなアルコール類；塩化ベンザルコニゥム；フエノール、タレゾールのようなフエェ ノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。
[0152] 矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げるこ とができる。
また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フエノール、クロ口クレゾ一 ノレ、精製水、蒸留水等を使用することができる。
[0153] 界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート 80、ステアリン酸ポリオキ シノレ 40、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
[0154] 本発明の医薬組成物を、 SRPK阻害剤または抗ウィルス剤として使用する場合、本 発明の化合物又はその薬理上許容される塩の使用量は症状、年齢、投与方法等に より異なる。例えば経口投与の場合、患者（温血動物、特に人間）に対して 1日あたり 、下限として（0. 01) mg (好ましくは（0.1) mg)、上限として、 (2000) mg (好ましくは (500) mg、より好ましくは（100) mg)を 1回又は数回に分けて、症状に応じて投与す ることが望ましい。静脈内投与の場合には、成人に対して 1日当たり、下限として（0. 001) mg (好ましくは（0. 01) mg)、上限として、 (500) mg (好ましくは（50) mg)を 1 回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
実施例
[0155] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであ つて、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用さ れた文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
[0156] 下記で、カラムクロマトグラフィーはシリカゲル（MERCK 9385-5B, 70-230 mesh)を 用いて行った。薄層クロマトグラフィー（TLC)は、あらかじめシリカゲルが塗布された ガラスプレート（MERCK 5715， silica gel 60 F )を用いて行った。融点は、ャナコ社
254
製微量融点測定装置 YANACO MP-500Dを用いて測定した。 NMRスペクトルは 日本電子 (JE〇L)社製 JNM AL-400核磁気共鳴装置を用いて測定した。 NMRスぺク トル測定用溶媒には、 CDC1または CD OD (ISOTEC社製）を使用した。化学シフトは
3 3
テトラメチルシラン ((CH ) Si)を内部標準 (0 ppm)として相対的な値として表し、結合
3 4
定数 CJ)は Hzで示した。略号 s、 d、 t、 m、および brはそれぞれ単重線、二重線、三重 線、四重線、多重線、およびブロードピークを表す。 [参考例 1] SRPIN-1の合成
SRPIN-Kcode name GIF-0340)の代表的な合成法は以下の通りである。
Figure imgf000054_0001
SRPIN-1 (GIF-0340)
[0158] [参考例 1一 1A]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
上- fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene ) (427 mg, 2.04 mmol、商用口「口)の N，N-ジメチルフオルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (1 mL)溶液に順次、 ピぺリジン（piperidine) (220 /i L, 2.22 mnol)及び N，N_ジイソプロピルェチルアミン（ Ν,Ν-diisopropylethylamine ) (220 β \, 2.40 mmol)が室温で添加された。混合物は、 1時間撹拌された。 これに、水が添加され、混合物はエーテル (x3)で抽出された。 抽出された有機層は、ブラインで洗浄、 Na SO上で乾燥、フィルターにかけ、減圧
2 4
下で濃縮された。
[0159] 残查は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（40 g, hexane/ethyl acetate = 10/1)で 精製され、 1_[2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル）フヱニル]ピぺリジン（
l-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]pipendine) (5D1 mg, 2.04 mmol, quantjをォレ ンジ色の固体として得た。
[0160] TLC及び1 H NMR (CDC1 , 400 MHz)の結果は次の通りである。： TLC R 0.47
3 f
(hexane/acetone = 16/1); 'Η NMR (CDCl , 400 MHz) δ 1.61-1.68 (m, 2H, CH )，
3 2
1.72 (tt, 4H, J = 5.3, 5.3 Hz, 2CH )， 3.13 (t, 4H, J = 5.3 Hz, 2CH ), 7.13 (d, 1H， J
2 2
= 8.8 Hz, aromatic) 7.61 (dd, 1H， J = 2.0, 8.8 Hz, aromatic), 8.03 (d， 1H, J = 2.0 Hz, aromatic).
[0161] [参考例 1一 2A]
参考例 1_1Aで得られた 1_[2—二トロー 4一（トリフルォロメチル）フエニル]ピぺリジン (l-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]piperidine ) (559 mg, 2.03 mmol)の methanol (10 mL)溶液に順次、濃塩酸（2.00 mL, 24.0 mmol)および無水二塩化スズ（2.50 g， 13.1 mmol)が 0°Cで添加された。混合物は、室温に戻され、 17. 5時間撹拌された。 これに重炭酸ナトリウムの飽和水溶液が添加された。混合物は酢酸ェチル (x3)で抽 出された。得られた有機層はブラインで洗浄され Na SO上で乾燥され、 濾過され、
2 4
減圧濃縮された。 残查はシリカゲルカラムクロマトグラフィー (50 g, hexane/ethyl acetate = 14/1)で精製され、 2— (1—ピペリジニル ) _5— (トリフルォロメチル）ァニリン (2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (448 mg, 1.83 mmol, 90.4%)を淡黄色 の固体として得た。
[0162] TLCおよび 'Η NMR (CDCl， 400 MHz)の結果は次の通りである。 TLC R
3 f
0.30(hexane/acetone = 18/1); 'Η NMR (CDCl， 400 MHz) δ 1.59-1.60 (m, 2H, CH
3
), 1.71 (tt， 4H, J = 5.4, 5.4 Hz, 2CH ), 2.85 (brs, 4H, 2CH )， 4.09 (brs, 2H, NH )，
2 2 2 2
6.92 (d, 1H， J = 1.9 Hz, aromatic), 6.97 (dd, 1H， J = 1.9, 8.4 Hz, aromatic), 7.01 (d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic).
[0163] [参考例 1 3A]
参考例 1_2Aで得られた 2_ (1—ピペリジニル ) _5—（トリフルォロメチル）ァニリン（ 2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (173 mg, 0.708 mmol)のジクロロメタン ( dichloromethane) (5 mU溶液に順次、イソニコチン酸クロリド塩酸塩 (isonicotinoyl chloride hydrochloride) (151 mg, 0.850 mmol,商用品)，トリェチルアミン (triet hylamine ) (450 μ L, 3.23 mmol),及び触媒量の 4 （ジメチルァミノ）ピリジン（ 4-(dimethylamino)pyridine )が 0°Cで添加された。混合物は室温に戻され、 19時間 半撹拌された。これに水が添加され、混合物は、酢酸ェチル (x3)で抽出された。得ら れた有機層は重炭酸ナトリウム飽和水溶液で洗浄され、 Na SO上で乾燥され、濾過
2 4
され、そして減圧濃縮された。残查はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（10 g, hexane/ethyl acetate = 1.5/1)および再結晶（へキサン）にて精製され、 N- [2_ (l—ピ ペリジニル) _5_ (トリフルォロメチル）フエニル]イソニコチン酸アミド（
N-[2-(l-pipendmyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isomcotinamide) (SRPIN— 1、 code name GIF- 0340) (83.8 mg, 0.240 mmol, 33.9%)を無色の固体として得た。
[0164] 融点、 TLC及び NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。 融点 96- 98 °C ; TLC R 0.40 (hexane/ethyl acetate = 1/1); H NMR (CDC1， 400 f 3
MHz) δ 1.67-1.68 (m， 2H, CH )， 1.78 (tt, 4H, J = 5.5, 5.5 Hz, 2CH ), 2.88 (t, 4H,
2 2
J = 5.5 Hz, 2CH )， 7.29 (d, 1H, J = 8.2 Hz, aromatic), 7.40 (dd， 1H, J = 1.8, 8.2
2
Hz, aromatic), 7.76 (dd， 2H, J = 2.0, 4.4 Hz, aromatic), 8.86 (dd, 2H, J = 2.0, 4.4 Hz, aromatic), 8.87 (d， 1H, J = 1.8 Hz, aromatic), 9.53 (s, 1H， NH).
[0165] [参考例 1-lB]
1_クロ口一 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
1- chloro— 2— nitro— 4— (trifluoromethyl)benzene) (5.00 g, 22.4 mmol、商用口 )の N,N_ ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (7 mL)溶液に、ピぺリジン（ piperidine) (5.50 mL, 55.5 mmol、商用品）を 0 °Cにて加え、混合物を 40分間撹拌し た。これに水をカ卩えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した (x3)。得られた有機層 を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮 した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200 g,へキサン/酢酸ェチル =8/ 1)にて精製し、 1_[2_ニトロ一 4一（トリフルォロメチル)フエニル]ピぺリジン（ 丄— [2— mtro— 4— rifluoromethyl)phenyl]pipendine) (6.13 g， quant.) オレンン色の固 体として得た。
[0166] [参考例 1-2B]
参考例 1—1Bで得られた 1_[2—二トロー 4一（トリフルォロメチル）フエニル]ピぺリジン (丄 _[2_mtro_4_ rifluoromethyl)phenyl]pipendine) (6.13 g， 22.4 mmol)のシクロロメタ ン（dichloromethane) (10 mL)溶液に、濃塩酸（12.2 mL, 146 mmol)および無水二塩 化スズ（12.7 g， 67.2 mmol)を 0 °Cにて順次カ卩え、混合物を 7時間撹拌した。これに水 を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗 浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー（200 g，へキサン Z酢酸ェチル = 15Zl)にて精製し、 2 _ (1—ピペリジニル) _5_ (トリフルォロメチル）ァニリン（
2- (l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (4.55 g, 83.0%)を淡黄色の固体として得 た。
[0167] [参考例 1-3B] 参考例 1_2Bで得られた 2_ (1—ピペリジニル ) _5—（トリフルォロメチル）ァニリン（ 2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (4.45 g, 18.2 mmol)のジクロロメタン ( dichloromethane) (10 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩 (isonicotinoyl chloride hydrochloride) (6.48 g， 36.4 mmol,商用品）、およびトリェチルアミン（ triethylamine) (5.57 mL, 54.6 mmol)、を 0 °Cにて順次加え、混合物を 0.5時間撹拌し た。これに水を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和 食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。 残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（200 g，へキサン Z酢酸ェチル = 1/1)お よび再結晶（へキサン）にて精製し、 N_[2_ (l—ピペリジニル ) _5_ (トリフルォロメチ ノレ）フエニル]イソニコチン酸アミド（N-[2_(l-piperidinyl)_5_(trifluoromethyl)phenyl] isonicotinamide) (SRPIN-1, GIF-0340) (5.49 g， 86.3%)を無色の固体として得た。
[参考例 2] code name GIF-0613の合成
Figure imgf000057_0001
[参考例 2 - 1]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
l-fluoro-2-nitro-4-(,trifluoromethyl)benzene) (211 mg， 1.00 mmol、商用品リの N，N_ ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (0.5 mL)溶液に、（S) - 2-メチ ルピペリジン（(S)- 2- methylpiperidine) (270 μ L, 2.24 mmol,商用品）を室温にてカロ え、混合物を 2時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出し た (x3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥 し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g，へキ サン/酢酸ェチル = 12/1)にて精製し、（S) -l-[2—二トロー 4一（トリフルォロメチル） フエニル] _2—メチルビペリジン（(S)-l-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]
-2-methylpiperidine) (286 mg， 99.2%)をオレンジ色の油状物質として得た。 TLC R 0.44 (へキサン/酢酸ェチル = 16/1)。
[0169] [参考例 2— 2]
[参考例 2_1]で得られた（S) -1_[2—二トロー 4一（トリフルォロメチル）フエニル]一 2 —メチノレピペリンン ((S)— 1— [2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-2-methylpiperidine) ( 275 mg, 0.953 mmol)のメタノール（5 mL)溶液に、濃塩酸（1.00 mL, 12.0 mmol)およ び無水二塩化スズ (903 mg, 4.76 mmol) を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻 し、 17時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸ェ チル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム を用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一（50 g,へキサン/酢酸ェチル = 12Zl)にて精製し、（S) - 2_ (2_メチル _1—ピぺ リジニル) _5_ (トリフルォロメチル）ァニリン（
(S)-2-(2-methyl-l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (233 mg, 94.6%)を無色の 油状物質として得た。
TLC R 0.38 (へキサン/酢酸ェチル = 16/1)。
f
[0170] [参考例 2— 3]
[参考例 2-2]で得られた（S) -2- (2—メチルー 1-ピベリジニル)一 5—（トリフルォロメ チノレ）ァニリン（(S)— 2— (2— methy卜 1— piperidinyl)— 5— (trifluoromethyl)aniline) (223 mg, 0.863 mmol)のジクロロメタン（dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリ 卜 i¾酸 J¾ Usonicotmoyl chloride hydrochloride) (466 mg, 2.61 mmo丄、 f¾用品)、およ びトリエチルァミン（triethylamine) (600 β 1, 4.30 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混 合物を室温に戻し、 19時間半撹拌した。これに水をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3) で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾 燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（25 g， へキサン/酢酸ェチル = 1·5Ζ1)にて精製し、（S) _N— [2_ (2_メチル_1_ピぺリジ ニル) _5_ (トリフルォロメチル）フエニル]イソニコチン酸アミド（
(S)-N-[2-(2-methyl-l-pipendmyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide) ( GIF-0613) (293 mg, 93.4%)を無色の油状物質として得た。
[0171] TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。 TLC R 0.40 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; H NMR (CDC1 ， 400 MHz) δ 0.84 f 3
(d, 3H, J = 6.4 Hz, CH )， 1.39-1.69 (m, 3H， CH ， CH), 1.82-1.86 (m， 1H, CH)，
3 2
1.92-1.95 (m, 2H, CH ), 2.65-2.72 (m, 1H, CH), 2.89-2.92 (m, 1H， CH),
2
2.98-3.02 (m， 1H, CH), 7.35 (d， 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 7.40 (dd， 1H, J = 2.2, 8.4 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 2H， J = 1.8, 4.4 Hz, aromatic), 8.86 (dd， 2H , J = 1.8 4.4 Hz, aromatic), 8.93 (d, 1H ， J = 1.8 Hz, aromatic), 10.1 (s， 1H, NH)。
[参考例 3] code name GIF-0617の合成
Figure imgf000059_0001
GIF-0617
[参考例 3 - 1 ]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
l-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene) ( 1.02 g， 4.89 mmol、商用品）の N，N_ ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (4 mL)溶液に、ピロリジン（ pyrrolidine) (983 μ L, 12.0 mmol、商用品）を 0 °Cにて加えた。混合物を室温に戻し 、 4.5時間撹拌した。これに水をカ卩えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した (x3)。 得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を 行レ、、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g,へキサン Z酢 酸ェチル = 5/ 1 )にて精製し、 1 - [ 2_二トロ _4_ (トリフルォロメチル)フエニル]ピロリ ジン（1-[2- nitro- 4- (trifluoromethyl)phenyl]pyrrolidine) ( 1.26 g， 99.3%)をオレンジ色 の固体として得た。
TLC R 0.45 (へキサン/酢酸ェチル = 5/1)。
f
[参考例 3— 2]
参考例 3_1で得られた 1- [2—二トロー 4一（トリフルォロメチル）フエニル]ピロリジン（ l-[2-nitro-4-(tnfluoromethyl)phenyl]pyrrolidme; (60り mg, 2.33 mmol)のメタノ1 ~~ノレ ( 4 mL)溶液に、濃塩酸（1.36 mし， 16.3 mmol)および無水二塩化スズ（1.55 g, 8.16 mmol) を 0 °Cにて順次加え、混合物を 4時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウ ム水溶液を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食 塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残 查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g，へキサン Z酢酸ェチル = 15/1)にて 精製し、 1— [2—ァミノ— 4— (トリフルォロメチル)フエニル]ピロリジン（
l-[2-amino-4-(tnfluoromethyl)phenyl]pyrrolidine) (550 mg, quant.ノを赤澄色の油状 物質として得た。
TLC R 0.63 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1)。
f
[0174] [参考例 3— 3]
参考例 3— 2で得られた 1— [2—ァミノ—4_ (トリフルォロメチル）フエニル]ピロリジン（ l-[2-amino-4-(tnfluoromethyl)phenyl]pyrrolidine) (516 mg, 2.24 mmol)のングロロメ タン（dichloromethane) (10 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride) (705 mg, 3.96 mmol、商用品）、およびトリェチルアミン（ triethylamine) (823 μ L, 5.94 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 5 時間撹拌した。これに水をカ卩え、混合物をジクロロメタン (x3)で抽出した。得られた 有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減 圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（25 g,へキサン/酢酸ェチル = 1/2)にて精製し、 N_[2_ (l_ピロリジニル) _5_ (トリフルォロメチル）フエニル]ィ ソニコチン酸ァ;^ (N-[2-(l-pyrrohdinyl)-5- nfluoromethyl)phenyl]isonicotinamide) (GIF-0617) (734 mg, 97.8%)を無色の固体として得た。
[0175] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 134-135。C ; TLC R 0.29 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 2.01 (tt， 4H, J = 3.2 Hz, 6.4 Hz, 2CH ), 3.15 (t， 4H, J = 6.4 Hz, 2CH
2 2
)， 7.19 (d， 1H, J = 8.5 Hz, aromatic), 7.38 (dd， 1H, J = 2.2, 8.5 Hz, aromatic), 7.71 (dd， 2H, J = 1.6， 4.4 Hz, aromatic), 8.53 (d, 1H， J = 2.2, Hz, aromatic), 8.79 (s, 1H， NH), 8.83 (dd, 2H, J = 1.6, 4.4 Hz, aromatic)。
[0176] [参考例 4] code name GIF- 0618の合成
Figure imgf000061_0001
GIF-0618
[参考例 4_:L ]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
丄 _fluoro_2_nitro_4_(trifluoromethyl)benzeneノ (506 mg， 2.42 mmol、商用品ノの N，N_ ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (2 mL)溶液に、へキサヒドロ- 1H—ァゼピン（hexahydro-lH-azepine) (682 /i L, 6.05 mmol,商用品）を 0 °Cにてカロ えた。混合物を室温に戻し、 1時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸 ェチルで抽出した (x3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウ ムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトダラ フィー（20 g，へキサン Z酢酸ェチル = 7/1)にて精製し、へキサヒドロ- 1_[2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル）フエ二ル]— 1H—ァゼピン（
hexahydro-l-[2-mtro-4-(1trifluoromethyl)phenyl]-lH-azepme) (680 mg, 97.5%) ォ レンジ色の固体として得た。
[0177] TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
TLC R 0.49 (へキサン/酢酸ェチル = 5/1) ; NMR (CDC1， 400 MHz) δ
f 3
1.57-1.63 (m， 4H, 2CH ), 1.79-1.83 (m， 4H, 2CH ), 3.31 (t， 4H, J = 5.5 Hz, 2CH )，
2 2 2
7.11 (d, 1H， J = 9.1 Hz, aromatic) 7.53 (dd, 1H， J = 2.0, 9.1 Hz, aromatic), 7.99 (d， 1H, J = 2.0 Hz, aromatic)0
[0178] [参考例 4一 2]
参考例 4_1で得られたへキサヒドロ- 1_[2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル）フエニル ]— 1H—ァ ピン (hexahydro_l_[2— nitro— 4— (trifluoromethyl)phenyl]— 1H— azepine) ( 675 mg, 2.34 mmol)のメタノール（5 mL)溶液に、濃塩酸（1.27 mL, 15.2 mmol)およ び無水二塩化スズ（1.43 g， 7.54 mmol) を 0 °Cにて順次加え、混合物を 2時間撹拌し た。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出 した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、 濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g，へキサ ン/酢酸ェチル =20/1)にて精製し、 1_[2—ァミノ _4_ (トリフルォロメチル）フエ二 ノレ]—へキサヒドロ— 1H—ァゼピン（1-[2— amino— 4— (trifluoromethyl)phenyl]
-hexahydro_lH-az印 ine) (522 mg, 86.3%)を無色の固体として得た。
[0179] TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
TLC R 0.81 (へキサン/酢酸ェチル = 3/1) ; NMR (CDC1， 400 MHz) δ
f 3
1.70-1.84 (m， 8H, 4CH ), 3.04 (t， 4H, J = 5.4, Hz, 2CH )， 4.10 (brs, 2H， NH )，
2 2 2
6.92 (d, 1H， J = 1.2 Hz, aromatic), 6.94 (dd, 1H， J = 1.2, 7.9 Hz, aromatic), 7.05 (d， 1H, J = 7.9 Hz, aromatic)0
[0180] [参考例 4一 3]
参考例 4— 2で得られた 1— [2—ァミノ—4_ (トリフルォロメチル）フエ二ル]—へキサヒド 口— 1H—ァゼピン (l_[2_amino— 4— (trifluoromethyl)phenyl]— hexahydro— 1H— azepine) ( 512 mg, 1.98 mmol)のジクロロメタン（dichloromethane) (6 mL)溶液に、イソニコチン 酸クロリド塩酸塩 (isonicotinoyl chloride hydrochloride) (704 mg, 3.95 mmol、商用品 )、およびトリェチルァミン (triethylamine) (823 μ L, 5.94 mmol)を 0 °Cにて順次加え 、混合物を 1.5時間撹拌した。これに水をカ卩え、混合物をジクロロメタン (x3)で抽出し た。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾 過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g，へキサン /酢酸ェチル = 2/1)にて精製し、 ^ -[2- (1-へキサヒドロ-111-ァゼピニル) -5- ( トリフルォロメチル）フエニル]イソニコチン酸アミド（
N-[2-( 1 -hexahydro- lH-azepmyi)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isomcotinamide) ι, GIF-0618) (697 mg, 97.0%)を無色の固体として得た。
[0181] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 138-139。C ; TLC R 0.40 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.79 (br, 8H， 4CH )， 3.06-3.10 (m, 4H, 2CH )， 7.31 (d， 1H, J = 8.2
2 2
Hz, aromatic), 7.37 (dd, 1H, J = 1.6, 8.2 Hz, aromatic), 7.76 (dd, 2H, J = 2.0, 6.0 Hz, aromatic), 8.85 (m, 3H, aromatic), 9.66 (s, 1H， NH)。 [0182] [参考例 5] code name GIF-0346の合成
Figure imgf000063_0001
[0183] [参考例 5— 1]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
l-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene) (209 mg， 1.00 mmol、商用品)の N，N— ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (0.5 mL)溶液に、モルホリン（ morpholine) (190 μ L, 2.17 mmol、商用品）を室温ににて加え、混合物を 3時間撹拌 した。これに水をカ卩えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した（x3)。得られた有機 層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃 縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 3 /1)にて精製し、 4_[2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル）フヱニル]モルホリン（ 4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine) (270 mg, 97·7ο/ο)をオレンジ色の油 状物質として得た。
TLC R 0.27 (へキサン/酢酸ェチル = 3/1)。
f
[0184] [参考例 5— 2]
参考例 5—1で得られた 4_[2_ニトロ一 4_ (トリフルォロメチル）フエニル]モルホリン（ 4-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine) (263 mg, 0.952 mmol)のメタノ1 ~ノレ (5 mL)溶液に、濃塩酸（1.00 mし， 12.0 mmol)および無水二塩化スズ（905 mg, 4.77 mmol) を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 20時間撹拌した。これに飽和 炭酸水素ナトリウム水溶液をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた 有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減 圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 2/1)にて精製し、 4— [2—ァミノ— 4一（トリフルォロメチル）フエニル]モルホリン（ 4-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]morpholine) (214 mg, 91.2%)を無色の固体と して得た。
TLC R 0.31 (へキサン/酢酸ェチル = 3/1)。
[0185] [参考例 5— 3]
参考例 5—2で得られた 4_[2—ァミノ— 4_ (トリフルォロメチル）フエニル]モルホリン（ 4-[2-amino-4-(tnfluoromethyl)phenyl]morpholine) (19ο mg, 0.796 mmol)のンクロ口 メタン（dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride) (320 mg, 1.80 mmol,商用品）、およびトリェチルアミン（ triethylamine) (480 μ L, 3.44 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 60時間撹拌した。これに水をカ卩え、混合物をジクロロメタン (x3)で抽出した。得られ た有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、 減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g,へキサン/酢酸ェチ ノレ = 2/1)にて精製し、 N_[2_ (4—モルホリンィル） _5_ (トリフルォロメチル）フエ二 ノレ]イソニコチン酸アミド (N— [2— (4— mo卬 holinyl)— 5-(trifluoromethyl)phenyl] isonicotinamide) (GIF-0346) (65.1 mg, 23.2%)を無色の固体として得た。
[0186] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 172-173 °C ; TLC R 0.23 (へキサン/酢酸ェチル = 1/3) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 2.96 (t, 4H, J = 4.4 Hz, 2CH ), 3.92 (t, 4H, J = 4.4 Hz, 2CH )， 7.34
2 2
(d, 1H, J = 8.4 Hz, aromatic), 7.44 (dd， 1H, J = 1.6, 8.4 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 1H J = 1.6， 4.4 Hz, aromatic), 8.87-8.88 (m, 3H， aromatic) 9.48 (s, 1H， NH)。
[0187] [参考例 6] code name GIF-0347の合成
Figure imgf000064_0001
[0188] [参考例 6— 1]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
丄 _fluoro_2_nitro_4_(trifluoromethvl)benzeneノ (211 mg, 1.01 mmol、商用品ノの N，N_ ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (0.5 mL)溶液に、ジェチルァ ミン（diethylamine) (230 μ L, 2.22 mmol、商用品）を室温にて加え、混合物を 3時間 撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した（x3)。得られた 有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減 圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 8/1)にて精製し、 1—ジェチルァミノ- 2—ニトロ— 4— (トリフルォロメチル）ベンゼン（ l-diethylamino-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene) (258 mg, 98.3%)をオレンジ色の 油状物質として得た。
TLC R 0.37 (へキサン/酢酸ェチル /エーテル = 16/1/1)。
f
[0189] [参考例 6— 2]
参考例 6—1で得られた 1—ジェチルァミノ- 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル）ベンゼ y ( 1 -diethylammo-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene) (251 mg, 0.9ο ί mmol)のメタ ノール（5 mL)溶液に、濃塩酸（1.00 mL, 12.0 mmol)および無水二塩化スズ（908 mg, 4.78 mmol) を 0 °Cにて順次カ卩えた。混合物を室温に戻し、 22時間撹拌した。これに 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得ら れた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行 レ、、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸 ェチル = 20/1— 10/1)にて精製し、 2-ァミノ- 1-ジェチルァミノ- 4- (トリフルォロメ チノレ)ヘンゼン (2-amino-l-dietnyiamino-4-(tnfluoromethyl)benzene) (144 mg, 64.7%)を無色の油状物質として得た。
TLC R 0.22 (へキサン/酢酸ェチル = 30/1)。
[0190] [参考例 6— 3]
参考例 6— 2で得られた 2—ァミノ— 1—ジェチルァミノ- 4_ (トリフルォロメチル）ベンゼ ン (2-ammo-l-diethylammo-4-(trifluoromethyl)benzeneノ (103 mg, 0.443 mmol)のン クロロメタン（dichloromethane) (3 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（ isonicotinoyl chloride hydrochloride) (88.2 mg, 0.495 mmol、商用品八お びトリエ チルァミン（triethylamine) (140 μ L, 1.00 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室 温に戻し、 1.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン (x3)で抽出し た。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾 過を行い、減圧濃縮した。
Figure imgf000066_0001
g，へキサン
/酢酸ェチル = 2/1)にて精製し、 N_[2—ジェチルアミノー 5—（トリフルォロメチル）フ ェニノレ]イソニコチン酸アミド（N-[2— diethylamino— 5— (trifluoromethyl)phenyl] isonicotinamide) (GIF-0347) (51.0 mg， 34.1%)を無色の固体として得た。
[0191] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 78-80。C ; TLC R 0.31 (へキサン/酢酸ェチル = 1 1) ; NMR (CDC1
f 3， 400
MHz) δ 1.01 (t, 6H， J = 7.1 Hz, 2CH ), 3.04 (q, 4H, J = 7.1 Hz, 2CH ), 7.33 (d,
3 2
1H， J = 8.2 Hz, aromatic), 7.41 (dd, 1H， J = 1.8, 8.2 Hz, aromatic), 7.73 (dd， 2H, J = 1.8, 4.4 Hz, aromatic), 8.60 (d， 1H , J = 2.6 Hz, aromatic), 8.85 (dd, 2H，J = 1.8, 4.4 Hz, aromatic), 8.91 (d, 1H， J = 1.8 Hz, aromatic) 9.90 (s， 1H, NH)。
[0192] [参考例 7] code name GIF-0343の合成
Figure imgf000066_0002
参考例 1—2で得られた 2_ ( 1—ピペリジニル ) _5_ (トリフルォロメチル）ァニリン（ 2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (152 mg, 0.622 mmol)のジクロロメタン ( dichloromethane) (5 mL)溶液に、ニコチン酸クロリド塩酸塩（nicotinoyl chloride hydrochloride) (122 mg, 0.685 mmol,商用品）、およびトリェチルァミン（triethylamine ) (250 β L, 1.79 mmol)、を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 16.5時間撹 拌した。これに水をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を 飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮し た。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（15 g,へキサン/酢酸ェチル = 1.5/1 一 1/1)にて精製し、 N_[2_ ( l—ピペリジニル ) _5_ (トリフルォロメチル）フエニル]二 コチン酸ア ド (N_[2_(l_piperidinyl)_5_(trifluoromethyl)phenyl]mcotmamide) ( GIF-0343) (98.4 mg, 45.3%)を無色の固体として得た。 [0193] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 145-146 °C ; TLC R 0.40 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.62-1.69 (m, 2H， CH )， 1.79 (tt, 4H, J = 5.8， 5.8 Hz, 2CH ), 2.88 (t
2 2
4H, J = 5.8 Hz, 2CH ), 7.29 (d, 1H， J = 8.4 Hz, aromatic), 7.39 (dd, 1H， J = 2.0,
2
8.4 Hz, aromatic), 7.51 (dd, 1H， J = 4.8, 8.0 Hz, aromatic), 8.30 (ddd, 1H, J = 1.6, 2.4, 8.0 Hz, aromatic), 8.82 (dd, 1H, J = 1.6, 4.8 Hz, aromatic), 8.87 (d, 1H， J = 2.0 Hz, aromatic), 9.16 (d, 1H， J = 2.4 Hz, aromatic), 9.53 (s， 1H, NH)。
[0194] [参考例 8] code name GIF- 0344の合成
Figure imgf000067_0001
参考例 1-2で得られた 2- ( l-ピベリジニル)一 5—（トリフルォロメチル）ァニリン（ 2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (102 mg, 0.417 mmol)のジクロロメタン ( dichloromethane) (3 mL)溶液に、塩ィ匕べンゾィノレ (benzoyl chloride) (50.0 μ L, 0.430 mmol、商用品）、およびトリェチルァミン（triethylamine) ( 170 μ L, 1.21mmol)、 を 0 °Cにて順次カ卩えた。混合物を室温に戻し、 18時間撹拌した。これに水をカ卩え、混 合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水 硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラム クロマトグラフィー（20 g，へキサン/酢酸ェチル = 10/1)にて精製し、 N-[2- ( l-ピ ペリジニル) _5_ (トリフルォロメチル)フエニル]安息香酸アミド（
N-[2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]benzamide) (GIF-0344) (126 mg, 86.7%)を無色の固体として得た。
融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 128-129。C、 TLC R 0.46 (へキサン/酢酸ェチル =4 1) ; NMR (CDC1 , f 3
400 MHz) δ 1.62-1.70 (m, 2H, CH )， 1.78 (tt, 4H, J = 5.2, 5.2 Hz, 2CH ), 2.88 (t,
2 2
4H, J = 5.2 Hz, 2CH ), 7.26 (d, 1H， J = 8.6 Hz, aromatic), 7.35 (d, 1H， J = 0.8, 8.6 Hz, aromatic), 7.52-7.61 (m, 1H， aromatic), 8.10 (m, 2H, aromatic), 7.94 (m, 2H aromatic), 8.91 (d, 1H , J = 0.8 Hz, aromatic), 9.44 (s, 1H， NH)。
[参考例 9] code name GIF-0345
Figure imgf000068_0001
参考例 1-2で得られた 2- (l-ピベリジニル)一 5—（トリフルォロメチル）ァニリン（ 2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (51.2 mg, 0.209 mmol)のジクロロメタン ( dichloromethane) (2 mL)溶液に、塩ィ匕 4_二卜口ベンゾィル (4_nitrobe画 yl chloride) (64.2 mg, 0.345 mmol,商用品）、およびトリェチルァミン（triethylamine) (120 μ L, 0.859 mmol)、を 0 °Cにて順次カ卩えた。混合物を室温に戻し、 60時間撹拌した。これ に水を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水 で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查を シリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g,へキサン/酢酸ェチル =8/1— 6/1)にて 精製し、 N— [2— (1—ピベリジニル)—5— (トリフルォロメチル）フヱニル] -4-ニトロ安息 杳酸ァ ド (N— [2-(l_piperidinyl)— 5— (trifluoromethyl)phenyl]— 4— nitrobenzamiae) ι, GIF-0345) (46.3 mg, 56.3%)を黄色の固体として得た。
[0197] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 125-136 °C ; TLC R 0.33 (へキサン/酢酸ェチル =4/1) ; NMR (CDC1，
f 3
400 MHz) δ 1.62-1.70 (m, 2H， CH )， 1.77 (tt, 4H, J = 5.0， 5.0 Hz, 2CH ), 2.88 (t,
2 2
4H, J = 5.0 Hz, 2CH ), 7.30 (d, 1H， J = 8.0 Hz, aromatic), 7.40 (dd, 1H， J = 1.6,
2
8.2 Hz, aromatic), 8.10 (dd, 2H, J = 1.8， 6.8 Hz, aromatic), 8.41 (d, 2H , J = 1.8, 6.8 Hz, aromatic), 8.86 (d, 1H， J = 2.0 Hz, aromatic), 9.54 (s, 1H, NH)。
[0198] [参考例 10] code name GIF-0615の合成
Figure imgf000069_0001
参考例 1-2で得られた 2- ( l-ピベリジニル)一 5—（トリフルォロメチル）ァニリン（ 2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (147 mg, 0.602 mmol)のジクロロメタン ( dichloromethane) (4 mL)溶液に、塩ィ匕 4—メトキシベンゾィノレ (4— methoxybenzoyl chloride) (250 mg, 1.47 mmol,商用品）、およびトリェチルァミン（triethylamine) (254 β L, 1.83 mmol)、を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 17時間撹拌した。こ れに水をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩 水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查 をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g，へキサン Z酢酸ェチル = 5/1)にて精製 し、 N_ [2_ ( l—ピペリジニル）_5_ (トリフルォロメチル）フエ二ル] - 4 -メトキシ安息香 酸ノ ト (N— [2-(l-pipenmnyl)— 5— (tnfluoromethyl)phenyl]— 4— methoxybenzamideノ ( GIF-0615) (240 mg, quant. )を無色の固体として得た。
[0199] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 111-114 °C ; TLC R 0.33 (へキサン/酢酸ェチル = 4/1) ; NMR (CDC1，
f 3
400 MHz) δ 1.64-1.68 (m, 2H， CH )， 1.78 (tt, 4H, J = 5.4, 5.4 Hz, 2CH ),
2 2
1.60-1.70 (m, 2H, CH ), 2.39-2.41 (m, 2H, CH ), 2.87 (t, 4H, J = 5.4 Hz, 2CH )，
2 2 2
3.89 (s, 3H, CH )， 7.03 (dd， 2H, J = 2.0, 7.0 Hz, aromatic), 7.23 (d, 1H， J = 8.0 Hz,
3
aromatic), 7.32 (dd， 1H, J = 1.6, 8.0 Hz, aromatic), 7.91 (dd, 2H， J = 2.0， 7.0 Hz, aromatic), 8.88 (d, 1H， J = 1.6 Hz, aromatic), 9.34 (s, 1H， NH)。
[0200] [参考例 1 1 ] code name GIF-0622の合成
Figure imgf000069_0002
参考例 1-2で得られた 2- (l-ピベリジニル)一 5—（トリフルォロメチル）ァニリン（ 2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (149 mg, 0.610 mmol)のジクロロメタン ( dichloromethane) (5 mL)溶液に、 p—トノレエンスノレホン酸クロリド (p—toluenesulfonyl chloride) (233 g， 1.22 mmol,商用品）、およびトリェチルァミン（triethylamine) (254 β L, 1.83 mmol)、を室温にて順次加え、混合物を 60時間撹拌した。これに水を加え 、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、 無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲル力 ラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 10/1)にて精製し、 N-[2- (l —ピベリジニル） _5_ (トリフルォロメチル）フヱニル] _p -トルエンスルホン酸アミド（ N-[2-(l-pipendmyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]-p-toluenesulronamide; (uIF-0622J (243 mg, quant)を無色の固体として得た。
[0201] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 117-134 °C ; TLC R 0.49 (へキサン/酢酸ェチル = 5/1) ; NMR (CDC1，
f 3
400 MHz) δ 1.55-1.60 (m, 2H， CH )， 1.66 (tt, 4H, J = 5.2， 5.2 Hz, 2CH ), 2.36 (s,
2 2
3H， CH ), 2.51 (t, 4H, J = 5.2 Hz, 2CH )， 7.11 (d, 1H, J = 8.0 Hz, aromatic),
3 2
7.22-7.28 (m, 3H, aromatic), 7.71 (dd, 2H， J = 1.8, 8.6 Hz, aromatic), 7.85 (d, 1H， J = 2.0 Hz, aromatic), 7.94 (s, 1H, NH)。
[0202] [参考例 12] code name GIF-0624の合成
Figure imgf000070_0001
チォシアン酸カリウム（potassium thiocyanate,商用品）（119 mg, 1.22 mmol)および ニコチン酸クロリド塩酸塩 (nicotinoyl chloride hydrochloride) (352 mg, 1.97 mmol、商 用品）のァセトニトリノレ（15 mL)溶液を 70 °Cにて 40分間撹拌した。混合物を室温に戻 したのち、これに参考例 1-2で得られた 2_ (1—ピペリジニル ) _5—（トリフルォロメチル )ァ二リン（2— (1— piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)aniline) (244 mg, 1.00 mmol)のァセト 二トリル（5 mL)溶液およびトリェチルァミン（triethylamine) (278 μ ΐ, 2.00 mmol)を順 次加え、混合物を 50 °Cにて 1時間撹拌した。これに水を加え、混合物をジクロロメタン (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用 レ、て乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ 25 g,へキサン/酢酸ェチル = 4Zl lZl)にて精製し、 1-ニコチノィル -3- [2_ (1 —ピペリジル） _5_ (トリフルォロメチル）フエニル]チォゥレア（
l-nicotmoyl-3-[2-(l-piperidmyl)-o-(trifluoromethyl)phenyl]tniourea) ( Ir-0624) ( 383 mg, 93.7%)を淡黄色の固体として得た
[0203] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CD OD， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 142-144。C ; TLC R 0.26 (へキサン/酢酸ェチル = l/l)； NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.58-1.67 (m, 2H, CH )， 1.75-1.85 (m, 4H, 2CH )， 2.89-2.95 (m, 4H,
2 2
2CH )， 7.33-7.40 (m, IH, aromatic), 7.44-7.48 (m, 1H， aromatic), 7.60—7.65 (m,
2
1H， aromatic), 8.76-8.78 (m, 1H， aromatic), 9.05 (s, 0.6H, aromatic), 9.09-9.14 (m, 1H， aromatic), 8.37—8.39 (m, IH, aromatic), 8.49 (s, 0.4H, aromaticん
[0204] [参考例 13] code name GIF-0614の合成
Figure imgf000071_0001
参考例 1一 3で得られた N— [2—（1ーピペリジニル ) _5—(トリフルォロメチル）フエニル ]イソニコチン酸アミド（N_[2-(l-piperidinyl)_5_(trifluoromethyl)phenyl]
isonicotinamide) (SRPIN-1, GIF- 0340) (121 mg, 0.496 mmol)の N，N—ジメチルホル ムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (0.5 mL)溶液に、水素化ナトリウム（60% w/w油混合物） (200 mg, 0.500 mmol)を 0 °Cにて加え、混合物を 1時間撹拌した。こ れにヨウ化メチルの Ν,Ν -ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF))溶液（ 0.8 Μ, 0.62 mL, 0.496 mmol)を 0 °Cにてカロえ、混合物をさらに 3時間撹拌した。これ に水を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水 で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查を
Figure imgf000072_0001
g,へキサン/酢酸ェチル = 1/1)にて精製し
、 N—メチル -N_[2_ (l—ピペリジニル）_5_ (トリフルォロメチル）フエニル]イソニコチ ン酸ァ ト (N— methy卜 N-[2— (1— piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide ) (GIF-0614) (65.9 mg, 51.5%)を無色の固体として得た。
[0205] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 119-121。C ; TLC R 0.36 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.50-1.60 (m, 2H, CH )， 1.60—1.70 (m, 2H, CH )， 1.60—1.70 (m, 2H,
2 2
CH ), 2.39-2.41 (m, 2H, CH )， 2.80-2.82 (m, 2H, CH )， 3.20 (s, 3H， CH )， 6.86 (d，
2 2 2 3
1H， J = 8.3 Hz, aromatic), 7.15 (d, 2H, J = 4.4 Hz, aromatic), 7.41 (d, 2H, J = 8.3 Hz, aromatic), 7.48 (s, 1H， aromatic), 8.44 (d, 2H， J = 4.4 Hz, aromatic)。
[0206] [参考例 14] code name GIF-0616の合成
Figure imgf000072_0002
参考例 1—3で得られた N_[2_ (l—ピペリジニル ) _5_ (トリフルォロメチル）フエニル ]イソニコチン酸アミド（N_[2-(l-piperidinyl)_5_(trifluoromethyl)phenyl]
isonicotinamide) (SRPIN-1, GIF- 0340) (528 mg, 1.51 mmol)のトルエン（2.5 mL)溶 液に、 Lawesson' s試薬（328 mg, 0.811 mmol,商用品）を加え、混合物を 100。。にて 12時間還流撹拌した。室温に戻した後、これに 2M水酸化ナトリウム水溶液を加えて 溶液をアルカリ性にし、さらに混合物を 12M水酸化ナトリウム水溶液 (x3)で逆抽出し た。得られた水層に 2M塩酸を加えて溶液を酸性としたのち混合物をエーテル (x3) で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾 燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g， へキサン/酢酸ェチル = 1/1)にて精製し、 N-[2- (l-ピペリジニル ) -5- (トリフル ォロメチル）フエニル]イソニコチン酸チオアミド（ N-[2-(l-piperidinyl)-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinthioamide) (GIF—0616) ( 186 mg， 33.7%)を無色の固体として得た。
[0207] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 108-109。C ; TLC R 0.27 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.61-1.62 (m, 2H, CH )， 1.68 (tt， 4H, J = 5.0, 5.0 Hz, 2CH ), 2.87 (t
2 2
4H, J = 5.0 Hz, 2CH ), 7.32 (d, 1H， J = 7.8 Hz, aromatic), 7.51 (dd, 1H， J = 1.6
2
Hz, aromatic), 7.71 (dd, 2H, J = 1.6, 6.4 Hz, aromatic), 8.76 (dd, 2H , J = 1.6, 6.4 Hz, aromatic), 9.58 (d， 1H , J = 1.6 Hz, aromatic), 10.5 (s, 1H， NH)。
[0208] [参考例 15] code name GIF-0341の合成
Figure imgf000073_0001
[0209] [参考例 15— 1]
1、 4—ジクロ口一 2_ニトロベンゼン（1,4- dichloro-2-nitrobenzene) (390 mg, 2.03 mmol、商用品）の N，N_ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (1 mL) 溶液に、ピぺリジン（piperidine) (660 μ L, 6.66 mmol、商用品）を室温にて加え、混 合物を 18.5時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した（ x3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、 濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g，へキサ ン/酢酸ェチル = 10/1)にて精製し、 1- (4-クロ口- 2-ニトロフエニル）ピぺリジン（ l-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine) (471 mg, 96.4%)をオレンジ色の油状物質とし て得た。
TLC R 0.18 (へキサンのみ)。
[0210] [参考例 15— 2]
参考例 15—1で得られた 1— (4—クロ口- 2—ニトロフエニル）ピぺリジン（
l-(4-chloro-2-nitrophenyl)piperidine) (471 mg, 1.95 mmol)のメグノ1 ~ノレ (10 mL) '溶 液に、濃塩酸（2.00 mL, 24.0 mmol)および無水二塩化スズ（1.84 g， 9.70 mmol) を 0 °Cにて順次カ卩えた。混合物を室温に戻し、 16時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナ トリウム水溶液をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽 和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した 。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g,へキサン/酢酸ェチル =9/1)に て精製し、 5_クロ口 _2_ (1—ピベリジニル）ァニリン（5-chloro-2-(l-piperidinyl)aniline ) (388 mg, 94.3%)を無色の油状物質として得た。
TLC R 0.26 (へキサン/酢酸ェチル = 18/1)。
f
[0211] [参考例 15— 3]
参考例 15— 2で得られた 5—クロ口— 2— (1—ピペリジニル）ァニリン（
5-chloro-2-(l-piperidinyl)aniline) (378 mg, 1.79 mmol)のジクロロメタン (
dichloromethane) (10 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride) (350 mg, 1.96 mmol、商用品）、トリェチルアミン（
triethylamine) (740 μ L, 5.30 mmol)、および触媒量の 4一（ジメチルァミノ）ピリジン（ 4-(dimethylamino)pyridine)を室温にて順次加え、混合物を 19時間撹拌した。これに 水をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で 洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィー（200 g，へキサン/酢酸ェチル = 1/1)にて精製し、 N — [5—クロ口一 2— (1—ピペリジニノレ）フエニル]イソニコチン酸アミド（
N-[5-chloro-2-(l-piperidinyl)phenyl]isomcotinamide) (GIF—0341) (180 mg, 31.8%) を無色の固体として得た。
[0212] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 141-143。C ; TLC R 0.32 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.61-1.62 (m, 2H, CH )， 1.76 (tt， 4H, J = 5.0, 5.0 Hz, 2CH ), 2.82 (t,
2 2
4H, J = 5.0 Hz, 2CH ), 7.09 (dd, 1H， J =2.6, 8.8 Hz, aromatic), 7.14 (d， 1H, J =
2
8.8 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 2H， J = 1.6, 4.4 Hz, aromatic), 8.60 (d， 1H , J = 2.6 Hz, aromatic), 8.85 (dd, 2H , J = 1.6， 4.4 Hz, aromatic), 9.66 (s, 1H， NH)。
[0213] [参考例 16] code name GIF-0342の合成
Figure imgf000075_0001
[0214] [参考例 16-1 ]
4-クロ口- 3—ニトロトルエン（4-chloro-3-nitrotoluene) (358 mg, 2.08 mmol、商用品 )の ^ージメチルホルムアミド（N，N-dimethylformamide (DMF)) ( 1 mL)溶液に、ピぺ リジン（piperidine) (660 μ L, 6.66 mmol、商用品）を室温にて加えたのち、混合物を 100 °Cにて 17時間撹拌した。室温に戻したのちに、これに水を加え、混合物を酢酸 ェチルで抽出した (x3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウ ムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトダラ フィー（50 g，へキサン Z酢酸ェチル = 50/ 1 )にて精製し、 1_ (4—メチル -2—ニトロフ ェニノレ）ピぺリジン（1— (4— methyト 2-nitrophenyl)piperidine) (212 mg, 46.2%)を無色の 油状物質として得た。
TLC R 0.54 (へキサン/酢酸ェチル = 10/ 1)。
f
[0215] [参考例 16— 2]
参考例 16-1で得られた 1- (4一メチル -2-ニトロフエニル）ピぺリジン（ l-(4-methyl-2-nitrophenyl)piperidine) (212 mg, 0.880 mmol)のメタノーノレ (5 mL)溶 液に、濃塩酸（0.70 mL, 8.4 mmol)および無水二塩化スズ（834 mg, 4.39 mmol) を 0 °Cにて順次カ卩えた。混合物を室温に戻し、 16時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナ トリウム水溶液をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽 和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した 。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 12/ 1 )に て精製し、 5—メチルー 2— ( 1—ピペリジニル）ァニリン（
5-methyl-2-(l-piperidinyl)aniline) ( 164 mg, 95.0%)を淡黄色の油状物質として得た。 TLC R 0.36 (へキサン/酢酸ェチル = 10/ 1)
[0216] [参考例 16— 3] 参考例 16—2で得られた 5—メチルー 2_ (1—ピペリジニル）ァニリン（
5-methyl-2-(l-piperidinyl)aniline) (155 mg， 0.815 mmol)のジクロロメタン (
dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩 (isonicotinoyl chloride hydrochloride) (172 mg, 0.966 mmol,商用品）、トリエチノレアミン（
triethylamine) (340 μ L, 2.44 mmol)、および触媒量の 4—(ジメチルァミノ）ピリ
4-(dimethylamino)pyridine)を室温にて順次加え、混合物を 19時間撹拌した。これに 水をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で 洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィー（10 g，へキサン Z酢酸ェチル = lZl)にて精製し、 N _[5_メチル_2_ (1_ピぺリジニル）フエニル]イソニコチン酸アミド（
N-[5-methyl-2-(l-piperidinyl)phenyl]isonicotinamide) (GIF—0342) (69.5 mg, 28.8%) を無色の固体として得た。
[0217] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 142-144 °C ; TLC R 0.35 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.62-1.70 (m, 2H， CH )， 1.75 (tt, 4H, J = 4.9, 4.9 Hz, 2CH ), 2.37 (s,
2 2
3H， CH ), 2.82 (t, 4H, J = 4.9 Hz, 2CH )， 6.94 (dd， 1H, J = 1.6, 8.1 Hz, aromatic),
3 2
7.12 (d, 1H， J = 8.1 Hz, aromatic), 7.76 (dd, 2H， J = 1.3, 4.5 Hz, aromatic), 8.38 (d, 1H, J = 1.6 Hz, aromatic), 8.84 (dd, 2H , J = 1.3， 4.5 Hz, aromatic), 9.75 (s, 1H， NH)。
[0218] [参考例 17] code name GIF-0348の合成
Figure imgf000076_0001
GIF-0348
[0219] [参考例 17— 1]
1、 4—ジフルオロー 2_ニトロベンゼン（l，4-difluoro-2-nitrobenzene) (225 mg, 1.41 mmol、商用品）の N，N—ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (0.5 mL)溶液に、ピぺリジン（piperidine) (320 β 1, 3.23 mmol,商用品）を室温にて加え、 混合物を 2時間撹拌した。これに水を加えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した（ x3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、 濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g，へキサ ン/酢酸ェチル = 12Zl)にて精製し、 1_ (4—フルォ口- 2_ニトロフヱニル）ピベリジ ン（l-(4-fluoro- 2- nitrophenyl)piperidine) (298 mg, 94.2%)をオレンジ色の油状物質と して得た。
TLC R 0.46 (へキサン/酢酸ェチル = 12/1)。
f
[0220] [参考例 17— 2]
参考例 17—1で得られた 1_ (4—フルォロ- 2_ニトロフエニル）ピぺリジン（ l-(4-fluoro-2-nitrophenyl)piperidine) (289 mg, 1.28 mmol)のメタノーノレ (5 mL)溶液 に、濃塩酸（1.20 mL, 14.4 mmol)および無水二塩化スズ（1.22 g， 6.43 mmol) を 0。C にて順次カ卩えた。混合物を室温に戻し、 21時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食 塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残 查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（25 g，へキサン/酢酸ェチル = 12/1)にて 精製し、 5_フルォ口— 2_ (1—ピペリジニル）ァニリン（5-fluoro-2-(l-piperidinyl)aniline ) (250 mg, quant.)を無色の油状物質として得た。
TLC R 0.34 (へキサン/酢酸ェチル = 16/1)
[0221] [参考例 17— 3]
参考例 17—2で得られた 5_フルォ口— 2_ ( 1—ピペリジニル）ァニリン（
5-fluoro-2-(l-piperidinyl)aniline) (248 mg, 1.27 mmol)のジクロロメタン (
dichloromethane) (10 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride) (454 mg, 2.55 mmol,商用品）、およびトリエチノレアミン（ triethylamine) (385 μ L, 3.83 mmol)、を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し 、 17時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られ た有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、 減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（15 g,へキサン/酢酸ェチ ル = 1.5/1)にて精製し、 N_[5_フルォロ _2_ (1—ピペリジニル）フエニル]イソニコ チン酸アミド（N— [5— fluoro— 2— (1— piperidinyl)phenyl]isonicotinamide) (GIF— 0348) (257 mg， 67.6%)を無色の固体として得た。
[0222] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 115-116。C ; TLC R 0.40 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1， f 3
400 MHz) δ 1.62-1.69 (m, 2H, CH )， 1.76 (bs， 4H, 2CH ), 2.82 (bs, 4H, 2CH )，
2 2 2
6.81 (ddd, 1H， J = 2.8, 8.8， 10.8 Hz, aromatic), 7.18 (dd, 1H， J = 5.6, 8.8 Hz, aromatic), 7.75 (dd, 2H, J = 2.0, 4.4 Hz, aromatic), 8.34 (dd, 1H , J = 2.8, 10.8 Hz, aromatic), 9.16 (dd, 2H , J = 2.0， 4.4 Hz, aromatic), 9.83 (s, 1H， NH)。
[0223] [参考例 18] code name GIF-0349の合成
Figure imgf000078_0001
[0224] [参考例 18— 1]
2 -フノレオ口 -1—二卜口ベンゼン (2 - fluoro - 2 - nitrobenzene) (219 mg, 1.55 mmol、商 用品）の Ν,Ν—ジメチルホルムアミド（N，N- dimethylformamide (DMF)) (0.5 mL)溶液に 、ピぺリジン（piperidine) (338 μ L, 3.41 mmol、商用品）を室温にて加え、混合物を 2 時間撹拌した。これに水をカ卩え、混合物を酢酸ェチルで抽出した (x3)。得られた有 機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧 濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 20/1)にて精製し、 1_ (2_ニトロフヱニル）ピぺリジン（1-(2- nitrophenyl)piperidine) ( 315 mg, 98.8%)を無色の油状物質として得た。
TLC R 0.53 (へキサン/酢酸ェチル = 16/1)。
f
[0225] [参考例 18— 2]
参考例 18—1で得られた 1_ (2_ニトロフエニル）ピぺリジン（
l-(2-nitrophenyl)piperidine) (315 mg, 1.52 mmol)のメタノーノレ (10 mL)溶液に、濃塩 酸（1.50 mし, 18.0 mmol)および無水二塩化スズ（1.45 g， 7.64 mmol) を 0 °Cにて順 次加えた。混合物を室温に戻し、 17時間撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水 溶液を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水 で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查を シリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 15/1)にて精製 し、 2_ (1—ピペリジニル）ァニリン（2- (1- piperidinyl)aniline) (238 mg, 88.8%)を淡黄色 の油状物質として得た。
TLC R 0.19 (へキサン/酢酸ェチル = 18/1)
f
[0226] [参考例 18— 3]
参考例 18—2で得られた 2_ (1—ピベリジニル）ァニリン（2-(l-piperidinyl)aniline) ( 203 mg, 1.15 mmol)のジクロロメタン（dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソニコチン 酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride) (616 mg, 3.46 mmol,商用品 )、およびトリェチルァミン（triethylamine) (800 μ L, 5.73 mmol)を 0 °Cにて順次加え た。混合物を室温に戻し、 2時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸ェチル (X 3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用い て乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチル = 1/1)にて精製し、 N_[2_ ( l—ピペリジニル）フエニル]ィ ソニコチン酸アミド（N- [2- (1- piperidinyl)phenyl]isonicotinamide) (GIF- 0349) (259 mg, 80.0%)を無色の固体として得た。
[0227] 融点、 TLCおよび1 H NMR (CDC1， 400 MHz)の結果は次の通りである。
3
融点 111-113 °C ; TLC R 0.35 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1) ; NMR (CDC1，
f 3
400 MHz) δ 1.62-1.67 (m, 2H, CH )， 1.76 (tt, 4H, J = 4.8, 4.8 Hz, 2CH ), 2.85 (t,
2 2
4H, J = 4.8 Hz, 2CH ), 7.13 (td， 1H, J = 1.6, 7.8 Hz, aromatic), 7.21 (td, 1H， J
2
= 1.6, 7.8 Hz, aromatic), 7.24 (dd， 1H, J = 1.6, 7.8 Hz, aromatic), 7.77 (dd, 2H, J = 1.9, 4.4 Hz, aromatic), 8.53 (dd, 1H , J = 1.6， 7.8 Hz, aromatic), 8.84 (dd, 2H , J = 1.9, 4.4 Hz, aromatic), 9.71 (s, 1H， NH)。
[0228] [参考例 19] code name GIF-0619の合成
Figure imgf000080_0001
[0229] [参考例 19一 1]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
l-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene) (498 mg， 2.38 mmol、商用品)の N，N— ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (2 mL)溶液に、インドリン（ indoline) (402 /i L, 3.59 mmol、商用品）および N，N_ジイソプロピルェチルアミン（ Ν,Ν-diisopropylethylamine) (619 /i L, 3.59 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混合物を 室温に戻し、 1時間撹拌したのち、さらに 70 °Cに加熱し、 5.5時間撹拌した。混合物を 室温に戻し、これに水をカ卩えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した（x3)。得られ た有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、 減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g,へキサン/酢酸ェチ ル = 20/1)にて精製し、 1_[2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル)フエニル]インドリン（ l-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline) (730 mg， 99.4%)を濃赤色の油状物質 として得た。
TLC R 0.48 (へキサン/酢酸ェチル = 6/1)。
f
[0230] [参考例 19一 2]
参考例 19—1で得られた 1_ [ 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル）フエニル]インドリン（ l-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline) 30 mg， 2.37 mmol)のメタノーノレ mL)溶液に、濃塩酸（1.28 mL, 15.4 mmol)および無水二塩化スズ（1.57 g， 8.30 mmol) を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 8時間撹拌した。これに飽和炭 酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有 機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧 濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g,へキサン/酢酸ェチル = 10/1)にて精製し、 1— [2—ァミノ- 4- (トリフルォロメチル）フエニル]インドリン（ l-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]indoline) (619 mg， 93.9%)を赤橙色の油状物 質として得た。
TLC R 0.27 (へキサン/酢酸ェチル = 6/1)。
[0231] [参考例 19一 3]
参考例 19— 2で得られた 1— [2—ァミノ—4_ (トリフルォロメチル）フエニル]インドリン（ l-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]in oline) (518 mg, 1.86 mmol)のシクロロメタン (dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride) (669 mg, 3.76 mmol,商用品）、およびトリェチルアミン（ triethylamine) (773 μ L, 5.58 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 2.5時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得られた 有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減 圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（50 g,へキサン/酢酸ェチル = 1/1)にて精製し、 N-[2- (l インドリニル) 5 （トリフルォロメチル）フエニル]イソ ニコテン酸アミド (N-[2-(l_indolinyl)-5— (trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide) ( GIF-0619) (643 mg, 90.1%)を無色の固体として得た。
TLC R 0.32 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1)。
[0232] [参考例 20] code name GIF-0620の合成
Figure imgf000081_0001
[参考例 20 - 1]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
l-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene) (508 mg, 2.43 mmol,商用品）の N，N— ジメチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (2 mL)溶液に、イソインドリン（ isoindoline) (679 μ L, 5.98 mmol,商用品）を 0 °Cにて加えた。混合物を室温に戻し 、 2時間撹拌した。これに水をカ卩えたのち、混合物を酢酸ェチルで抽出した (x3)。得 られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行 レ、、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g,へキサン/酢酸 ェチル = 15/1)にて精製し、 2_[2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチル）フエニル]イソィ ントリン (2_[2- nitro- 4- (trifluoromethyl)phenyl]isoindoline) (749 mg, quant.)を _gt|色の 固体として得た。
TLC R 0.42 (へキサン/酢酸ェチル = 10/1)。
[0234] [参考例 20— 2]
参考例 20— 1で得られた 2— [2—ニトロ— 4—(トリフルォロメチル）フエニル]イソインド リン (2_[2-nitro-4- rifluoromethyl)phenyl]isoindoline) (641 mg, 2.08 mmol)のメタノ 一ノレ（7 mL)溶液に、濃塩酸（1.13 mL， 13.5 mmol)および無水二塩化スズ（1.38 g, 7.28 mmol) を 0 °Cにて順次カ卩えた。混合物を室温に戻し、 8.5時間撹拌した。これに 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得ら れた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行 レ、、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（30 g,へキサン/酢酸 ェチル = 15/1)にて精製し、 2- [ 2_アミノー 4_ (トリフルォロメチル）フエニル]イソィ ンドリン（2-[2-amino-4-(trifluoromethyl)phenyl]isoindoline) (225 mg, 38.9%)を赤橙 色の油状物質として得た。
TLC R 0.38 (へキサン/酢酸ェチル = 10/1)。
[0235] [参考例 20— 3]
参考例 20-2で得られた 2-[2-ァミノ- 4一（トリフルォロメチル）フエニル]イソインドリ ン (2_[2_amino_4_(tnfluoromethyl)phenyl]isomdolineノ (193 mg, 0.694 mmol)のシクロ ロメタン（dichloromethane) (6 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（ isonicotinoyl chloride hydrochloride) (250 mg, 1.40 mmol、商用 f口)、およびトリェチ ルァミン（triethylamine) (287 μ L, 2.07 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温 に戻し、 3時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出した。得 られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行 レ、、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（5 g,へキサン Z酢酸ェ チル = 1/1)にて精製し、 N_[2— (2_イソインドリニル)— 5—(トリフルォロメチル）フエ 二ノレ]イソニコチン酸アミド（N- [2— (2— isoindolinyl)- 5- (trifluoromethyl)phenyl] isonicotinamide) (GIF-0620) (266 mg， quant.)を無色の固体として得た。
TLC R 0.31 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1)。
[参考例 21] code name GIF-0621の合成
Figure imgf000083_0001
[0237] [参考例 21-1]
1_フルオロー 2_ニトロ _4_ (トリフルォロメチノレ）ベンゼン（
l-fluoro-2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzene) (506 g， 2.42 mmol、商用品)の N，N—ジ メチルホルムアミド（Ν,Ν-dimethylformamide (DMF)) (4 mL)溶液に、 1、 2、 3、 4—テト ラヒドロイソキノリン（1，2，3,4- tetrahydroisoquinoline) (909 μ L, 7.26 mmol、商用品）を 0 °Cにてカ卩えた。混合物を室温に戻し、 3.5時間撹拌した。これに水を加えたのち、混 合物を酢酸ェチルで抽出した (x3)。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水 硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラム クロマトグラフィー（30 g，へキサン Z酢酸ェチル = 10Zl)にて精製し、 1、 2、 3、 4- テトラヒドロ— 2— [2—ニトロ— 4— (トリフルォロメチル）フエニル]イソキノリン（ l,2,j,4-tetrahydro-2-[2-nitro-4-(tnfluoromethyl)phenyl]isoquinoime) (779 mg, 99.9%)をオレンジ色の固体として得た。
TLC R 0.54 (へキサン/酢酸ェチル = 10/1)。
f
[0238] [参考例 21— 2]
参考例 21—1で得られた 1、 2、 3、 4—テトラヒドロ— 2_[2_ニトロ _4_ (トリフルォロメ チル）フエニル]イソキノリン（
丄， 2，3,4_tetranydro_2_[2_nitro_4_ ;riiluoromethyl)phenyl]isoquinoline) (658 mg, 2.04 mmol)のメタノール（8 mL)溶液に、濃塩酸（1.11 mL, 13.3 mmol)および無水二 塩化スズ（1.35 g， 7.12 mmol) を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 18時間 撹拌した。これに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、混合物を酢酸ェチル (x3) で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾 燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。
Figure imgf000084_0001
g， へキサン/酢酸ェチル = 20/1)にて精製し、 2_[2_アミノー 4一（トリフルォロメチル） フエ二ル]— 1、 2、 3、 4—テトラヒドロイソキノリン（2_[2— amino-4-(trifluoromethyl)phenyl ]-l,2,3,4-tetrahydroisoquinoline) (426 mg, 71.4%)を赤橙色の油状物質として得た。
TLC R 0.36 (へキサン/酢酸ェチル = 10/1)。
f
[0239] [参考例 21—3]
参考例 21— 2で得られた 2— [2—ァミノ—4_ (トリフルォロメチル）フエ二ル]— 1、 2、 3、 4—テトラヒドロイソキノリン（2-[2— amino— 4— (trifluoromethyl)phenyl]
-1,2, 3 ,4-tetrahydroisoquinoline) (315 mg, 1.08 mmol)のジクロロメタン (
dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸塩（isonicotinoyl chloride hydrochloride) (390 mg, 2.19 mmol、商用品）、およびトリェチルアミン（ triethylamine) (449 μ L, 3.24 mmol)を 0 °Cにて順次加えた。混合物を室温に戻し、 0.5時間撹拌した。これに水をカ卩え、混合物をジクロロメタン (x3)で抽出した。得られ た有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過を行い、 減圧濃縮した。残查をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（20 g,へキサン/酢酸ェチ ノレ = 2/1)にて精製し、 N-[2— (1、 2、 3、 4—テトラヒドロイソキノリン一 2-ィル)一5— (ト リフルォロメチル）フエニル]イソニコチン酸アミド（
N_[2_(l，2，3,4_tetrahydroisoqumolin_2_yl)_5_(trifluoromethyl)phenyl]isomcotmamid e) (GIF-0621) (418 mg, 97.6%)を無色の固体として得た。
TLC R 0.52 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1)。
[0240] [参考例 22] code name GIF-0608の合成
Figure imgf000084_0002
[0241] 3—（トリフルォロメチル）ァニリン（3-(trifluoromethvl)aniline、商用品）（208 mg, 1.29 mmol)のジクロロメタン（dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソニコチン酸クロリド塩酸 塩 Usomcotinoyl chloride hydrochloride) (670 mg, 3.76 mmol、商用口「口)、およびトリエ チルァミン（triethylamine) (864 β 1, 6.20 mmol)、を 0 °Cにて順次加えた。混合物を 室温に戻し、 23時間撹拌した。これに水をカ卩え、混合物を酢酸ェチル (x3)で抽出し た。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾 過を行い、減圧濃縮した。残查を再結晶（酢酸ェチル）にて精製し、 N— [2_ (3_ (トリ フルォロメチノレ）フエ二ノレ）イソニコチン酸アミド（N— [3-(trifluoromethyl)phenyl] isonicotinamide) (GIF-0608) (166 mg, 48.3%)を無色の固体として得た。
TLC R 0.26 (へキサン/酢酸ェチル = 1/2)。
f
[参考例 23] code name GIF-0612の合成
Figure imgf000085_0001
[0243] 2_ブロモ _5_ (トリフルォロメチノレ）ァニリン（2-bromo-5-(trifluoromethyl)aniline、商 用品）（480 mg, 2.00 mmol)のジクロロメタン（dichloromethane) (5 mL)溶液に、イソ二 コチン酸クロリド塩酸塩 (isonicotinoyl chloride hydrochloride) (427 mg, 2.39 mmol, 商用品）、およびトリェチルァミン (triethylamine) (410 μ L, 2.94 mmol)、を 0。。にて 順次加えた。混合物を室温に戻し、 24時間撹拌した。これに水を加え、混合物を酢 酸ェチル (x3)で抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリ ゥムを用いて乾燥し、濾過を行い、減圧濃縮した。残查を再結晶（酢酸ェチル）にて 精製し、 N— [2— (2—ブロモ—5— (トリフルォロメチル）フエニル)イソニコチン酸アミド（ N-[2-bromo-5-(trifluoromethyl)phenyl]isonicotinamide) (GIF-0612) (308 mg, 44.8% )を無色の固体として得た。
TLC R 0.46 (へキサン/酢酸ェチル = 1/1)。
f
[0244] [参考例 24] SRPIN-1の毒性試験
哺乳動物細胞を用いて、 SRPIN-1の染色体異常スクリーニング試験を行った。チヤ ィニーズ'ハムスター CHL細胞（大日本製薬株式会社)を用い、染色体異常誘発性 を指標として SRPIN-1の変異原性を検索した。試験は、短時間処理 (処理時間： 6時 間、回復時間： 18時間）の代謝活性化法による場合 (+S9 mix)、及び代謝活性化系 非存在下での連続処理法 (24時間処理）について検討した。 CHL細胞は、 10%牛胎 仔血清（ICN Flow)を 10%添加した MEMアール液体培地（GIBCO BRL)中、 5% CO
2
、 37。Cの条件下で培養した。 Sprague- Dawley系ラット（雄、 日本チヤ一ルスリバ一、 7 週齢）に phenobarbitalを 1日 1回の割合で 4日間連続腹腔内投与し（1回目 30mg/kg、 2 一 4回目 60mg/kg)、さらに投与 3日目に 5， 6-benzoflavone 80mg/kgを腹腔内投与し た肝臓から調製した S9 fraction (オリエンタル酵母工業； A.T. Natarajan et al.，
Mutation Res., 37， pp 83-90 (1976))を、代謝活性化法によるアツセィのために用い た。アツセィに用いる S9 mixの組成は、 1 mL中に 4 x mol HEPES buffer (ρΗ 7.4)、 5 μ mol MgCl、 33 μ mol KCL 5 μ mol G6P、 4 μ mol NADP及び 0.3 mL S9 fractionとした
[0245] 短時間処理法では、 CHL細胞（約 4 X 103 cells/mL)を 5mLの培養液で 60mmシヤー レで 3日間培養後、シャーレ力ら培養液 1.33 mLを抜き取り、 S9 mixを 0.83 mL加え、 直ちに各用量の被験液 0.5 mL (最終濃度 5、 1.58、 0.5 mg/mL ; 0.5%カルボキシメチ ルセルロースナトリウム（CMC-Na)水溶液に溶解）を加えた。 6時間培養した後、 PBS で洗浄し新しい培養液 5 mLと交換して、さらに 18時間培養した。別に陰性対照として 0.5%CMC_Na水溶液（0.5 mL)、陽性対照には dimethylnitrosamine (DMN ;最終濃度 500 μ g/mL)を用いて、同様に操作した。連続処理法では、 CHL細胞（約 4 X 103 cells/mL)を含む培養液 5 mLを 60 mmシャーレで 3日間培養後、培養液 0.5 mLを抜き 取り、各用量の被験液 0.5 mL (最終濃度 5、 1.58、 0.5 mg/mL)を加え、そのまま 24時 間（約 1.5細胞周期）培養した。別に陰性対照として 0.5%CMC_Na水溶液（0.5 mL)、 陽性対照には mitomycin C (MMC ;最終濃度 0.05 μ g/mL)を用いて、同様に操作し た。
[0246] 培養終了 2時間前に 10 μ g/mLの colcemid 0.1 mLをカロえ、 0.25% trypsin溶液で処理 して細胞を回収し、 0.075 M塩化カリウム溶液で低張処理後、 methanol :酢酸（3 : 1)混 合液にて固定し、乾燥後、 Giemsa染色を施した。各用量あたり 50個の良く拡がった分 裂中期像を観察し、染色体の構造異常と数的異常の種類及び出現数を計測した。 構造異常は染色分体切断 (ctb)、染色分体交換 (cte)、染色体切断 (csb)、染色体交 換 (cse)、その他 (5個以上の異常、断片化、細粉化など）に分類し、異常の種類別に 出現数を記録した。また、これらの異常を 1個でも有する細胞を異常細胞とした。異常 細胞の出現率力 未満を陰性、 5%以上 10%未満を疑陽性、 10%以上を陽性と判 定した。被験物質処理群で染色体異常細胞出現頻度が 10%以上の出現頻度となつ た場合に、被験物質は染色体異常を誘発する物質であると判定した。陽性対照群に おける染色体構造異常細胞の出現頻度は、 DMN 500 z g/mL処理群で 26個（52.0%) 、 MMC 0.5 x g/mL処理群で 24個（48.0%)であり、陰性対照では異常は認められなか つたことから、本試験は適切に実施されたと判断された。
[0247] 試験の結果、 SRPIN-1の処理群における染色体構造異常細胞は、短時間処理法、 連続処理法ともに、いずれの処理条件においても染色体構造異常及び数的異常細 胞の増加は陰性であった。以上の結果、本試験条件下において、当該化合物はほ 乳類培養細胞に対し染色体異常誘発性を有さないと考えられた。
[0248] [参考例 25] SRPIN-1のインビボ投与
SRPIN- 1のラットにおける単回経口投与毒性試験を行つた。馴化期間中の体重増 加が順調で一般状態にも異常を認めなレ、 Slc:SDラット（5週齢、 日本エスエルシー）に 、 125、 250、 500、 1000、 2000 mg/kgの SRPIN-1を、 1群あたり雌雄各 2匹に経口投与 した（投与容量 10 mL/kg)。動物は投与前日の夕方より投与後約 4時間まで絶食さ せた。投与後 2日間観察した結果、雌雄共に死亡の発現はみられず一般状態にも変 ィ匕は認められなかった。次に SRPIN-1 2000 mg/kgを、上記と同様に Slc:SDラット（5週 齢)雌雄各 5匹に経口投与し、投与後 14日間にわたって観察し、肉眼による毒性徴候 の種類、程度、発現時期、回復時期及び死亡時期を記録した。その結果、雌雄共に 死亡は認められず、一般状態にも異常は認められなかった。
[0249] [実施例 1A] HIV感染細胞における SR蛋白質のリン酸化
ヒト胎児腎臓由来の Flp_In-293細胞（R750-07: Invitrogenより購入）に、 HIVpNL4_3 ゲノム（Adachi, A. et al , 1986, J. Virol. 59:284-289)の 3マイクログラムを、遺伝子導 入試薬 Genejuice (70967-4; Novagenより購入） 9マイクロリットルを用いて遺伝子導入 を行った。 4日後、細胞に SDS- PAGEサンプルバッファーを 1ミリリットルカ卩えて溶解さ せ、 95°Cで 3分熱変性させた後に、すみやかに氷上において、蛋白質サンプノレとした
[0250] この蛋白質サンプルをウェスタン解析に用いた。サンプルは 4-20%のグラジェントゲ ノレによって、 40mA, 45分の条件で Laeminiのバッファーを用いた SDS-PAGEにより分 離した。マーカーとしてブロードレンジプレスティンドマーカー（02525-35;ナカライ） を用いて分子量を検量した。続レ、て PROTRANニトロセルロースメンブレン（BA85; Schleicher&Schuell Bioscienceより購入）に TransBlot SDセル (170-3940; Bio- radより 購入)を用いて 160mA， 60minの条件でセミドライブロッテイングした。ブロッテイング終 了後、メンブレンは TBSで 5分間振盪洗浄し、続けて BlockingOne(03953_95;ナカライ より購入)を用いてブロッキングを 1時間、室温で行った。メンブレンを再度 TBSで洗浄 し、 TBSで希釈したリン酸化 SR蛋白質を認識するマウスモノクローナル 104抗体
(Mabl04; ATCCよりハイプリドーマを購入)、マウス抗 SC35抗体（S4045;
BDTransductionより購入）、マウスモノクローナル抗 SF2抗体（AK103: Dr.Adrian Krainer氏より供与； Hanamura, A. et al., 1998， RNA 4:430-444; Kojima, T. et al.， 2001， J. Biol. Chem. 276:32247-56)と 4°C、 over nightでインキュベートした。
[0251] メンブレンを TBSで室温 10分振盪洗浄し、これを 3回行った。その後、二次抗体とし て HRP標識されたヒッジ抗マウス IgG抗体（NA9310;アマシャムより購入）を TBSで希 釈し、メンブレンと室温で 1時間インキュベートした。メンブレンを TBSで室温 10分振 盪洗浄し、これを 3回行った。その後、 ECL Detection Reagents (RPN2105;アマシャ ムより購入）を用いた化学発光法により、 LAS1000CCDカメラ（LAS1000;富士フィルム )で取り込みを行った。結果を図 1Aに示す。
[0252] その結果、 HIVpNL4-3の感染にともなって Mabl04抗体、 SC35抗体、 SF2抗体を用 いたウェスタン解析のシグナルは認められなくなり、 SR蛋白質が脱リン酸化されてい るだけでなぐ SC35や SF2という内在性の SR蛋白質が分解されていることが明らかと なった。
[0253] [実施例 IB] SR蛋白質の分解
ヒト胎児腎臓由来の Flp_In-293細胞に、 HAタグを融合した SRp75, SRp55, SRp40遺 伝子のプラスミド（HA-SRp75， HA-SRp55, HA-SRp40; Dr. Woan-Yuh TARNより供 与） 1マイクログラムを Genejuiceを用いて遺伝子導入し、 36時間後に、ュビキチンプロ テアソーム阻害剤である MG132(474790; CALBIOCHEMより購入)を終濃度 (10 μ Μ) で加えた。さらに 10時間後に、 SDS-PAGEサンプルバッファーで細胞を溶解して熱変 性を行レ、、蛋白質サンプルとした。これを同様に SDS-PAGEを行レ、、ゥサギ抗 ΗΑ抗 体（H1803;サンタクルーズより購入）を一次抗体、ロバ抗ゥサギ IgG抗体（ΝΑ9340;ァ マシャムより購入）を二次抗体としてウェスタン解析した。結果を図 1Bに示す。
[0254] その結果、 MG132を添加した細胞では、コントロールに比べて、強いシグナルが得 られたことから、 MG132によって SR75, SR55, SR40の蛋白質分解が阻害される結果を 得た。また、この他の SR蛋白質についても同様のことが解っている（data not shown) こと力ら、 SR蛋白質は MG132によるュビキチンプロテアソームを介して蛋白質分解さ れていることが明らかとなった。
[0255] [実施例 2A] SRPK2安定的発現細胞における SR蛋白質のリン酸化
Flp-In-293細胞を用いて、マウス SRPK2遺伝子を Flp-In部位に 1コピー導入した SRPK2安定的発現細胞を複数株樹立した。解析では親株 Flp-In293を mockとして、 複数株樹立した SRPK2安定的発現細胞のうち SRPK2-2を実験に用いた。この 2つの 細胞に PNL4-3を遺伝子導入して、 4日後に HIV感染における内在性 SR蛋白質の動 態をウェスタン解析により調べた。
[0256] 図 1Aと同様にウェスタン解析を行ったところ、 SRPK2-2細胞に HIVpNL4_3ゲノムを 遺伝子導入した場合に、 Mabl04抗体で SRp35、 SRp40、 SRp55、 SRp75の位置にシグ ナルが認められることから、 Mabl04で認識される SRドメインはリン酸化状態にあること が明らかとなった。
[0257] さらに、 SC35抗体、 SF2抗体を用いたウェスタン解析によると HIVpNL4_3ゲノムを遺 伝子導入した SRPK2-2細胞では SC35、 SF2のシグナルが認められた。図 2Aに示す。 これらの結果、通常 HIV感染に伴って SR蛋白質は分解される力 SRPK2安定的発 現細胞では SR蛋白質のリン酸化状態が維持され、結果として SR蛋白質が安定化され る。このことは、 SRPK2安定的発現細胞では、 SR蛋白質がリン酸化状態にあり、ュビ キチンプロテアソームを介した蛋白質の分解が起きなレ、と考えられる。
[0258] [実施例 2B] SRPK2安定的発現細胞における SR蛋白質の存在 親株 Flp-In293 (mock)と SRPK2遺伝子を Flp-In部位に 1コピー導入した SRPK2安定 的発現 Flp-In-293細胞（SRPK2-2細胞）に、 HIVpNL4_3ゲノムを 1マイクログラムと、 HAタグを融合した SRp75, SRp55,及び SRp40遺伝子のプラスミド（HA_SRp75，
HA-SRp55, HA-SRp40; Dr. Woan-Yuh TARNより供与） 1マイクログラムを Genejuice により遺伝子導入し、 36時間後にサンプノレを回収して、ウェスタン解析を行った。結 果を図 2Bに示す。その結果、 HIV感染に伴って Flp_In293細胞では SC35,SF2だけで なぐ SRp75、 SRp55、 SRp40についても、抗 HA抗体によるシグナルが無くなるカゝ、また は弱くなつていた。また SRPK2-2細胞では、同様にシグナルはコントロールに比べて 弱くなつている力 SC35，SF2と同様に SRp75、 SRp55、 SRp40のシグナルが見られる。
[0259] これらの結果は、 HIV感染に伴って SR蛋白質の分解が促進される力 SRPK2-2細 胞では SR蛋白質をリン酸化するので、 SR蛋白質が安定化されてレ、ることを意味して いる。
[0260] [実施例 2C] HIVの産生量を測定
実施例 2A (図 2A)の実験の際に培養上清を回収して HIVの産生量を測定した。遺 伝子導入後の培養上清を回収し、培養上清に含まれる HIV外膜蛋白質である p24の 量を、ルミパルス ELISAシステム（富士レビォ）によって測定した。結果を図 2Cに示す
[0261] その結果、 mockの培養上清に比べて SRPK2-2細胞では 2.3倍量の HIVが産生され ている結果を得た。
[0262] 以上のことから、 HIV感染に応答して SR蛋白質が脱リン酸化されるが、 SR蛋白質を 恒常的にリン酸化状態にした場合には、感染に応答した SR蛋白質の制御機構が働 かないので、結果として HIV産生を昂進させることが明らかとなった。
[0263] このことは、 HIV感染に応答した SR蛋白質の脱リン酸化は、宿主の防御機構として 機能してレ、ることを示唆してレ、る。
[0264] [実施例 3A] in vivoでの HIVの産生に寄与する SR蛋白質の検討
HIVは、その遺伝子発現過程において宿主の因子を用いて転写、プロセシング、翻 訳を行っている。特に、 HIVの Tat、 Revは分断されたェクソンを持ち、その遺伝子発 現には mRNAのスプライシング反応が必須であると想定されている。 [0265] 実施例 1 2 (図 1 2)で示した様に、 HIV感染に伴って宿主の防御機構が作動し、 SR蛋白質は分解されることを示した力 in vivoでの HIVのスプライシング反応や、そ れに寄与する SR蛋白質については不明である。実際、 SR蛋白質は細胞内に複数種 類が存在してレ、るので、これらの SR蛋白質を発現するプラスミド（0.5 μ g)を
HIVpNL4-3ゲノム（1.0 z g)とともに遺伝子導入して、その効果を検討した。結果を図 3Aに示す。
[0266] Mock, SC35、 SF2、 SRp40、 SRp55、 SRp75発現プラスミドを各々 Flp_In293細胞に遺 伝子導入し、 36時間後に培養上清を回収し、ノレミパルス ELISAシステムを用いて HIVp24の量を測定した。
[0267] その結果、 mockに比べて SRp40、 SRp75では HIVp24量は増加していることから、 SRp40、 SRp75に HIV産生を昂進する効果を認めた。
[0268] [実施例 3B]hnRNPAlを用いた、 in vivoにおける HIV産生への効果の検討
図 3Bに示したように、 HIVpNL4-3ゲノム（0.5 x g)と共に、一定量 (500ng)の SRp40、 SRp75発現プラスミドに加えて、 hnRNPAl発現プラスミドの量を段階的に増やして Flp-In293細胞へ遺伝子導入を行った。 36時間後に培養上清を回収し、ルミパルス ELISAシステムを用いて HIVp24の量を測定した。
[0269] その結果、 hnRNPAlの量に依存して、ルミパルス ELISAシステムにより測定した HIVp24量が減少する結果を得た。すなわち SRp40と SRp75に対して競合的に hnRNPAlが働レ、て、 HIV産生を抑制してレ、る。
[0270] このことは、細胞内で HIVの遺伝子発現に、スプライシング反応を介して発現制御し ていることが示唆された。実際、細胞内には SRp40や SRp75と hnRNPAlが共存してい るので、 HIV感染にともなう細胞内 SR蛋白質の分解は、細胞内における hnRNPAlを 優位にして、 HIVの遺伝子発現を抑制することで防御機構として成立していると考え られる。
[0271] [実施例 4A] 細胞内 SR蛋白質のリン酸化を阻害するための、 SRPKの阻害剤の探 索
リン酸化酵素が共通に持つ ATP結合部位を標的として、競合的に結合する阻害剤 を探索した。スクリーニングの結果ヒットした化合物は、分子量 349.35の Maybridge社 力 既に販売されている化合物の一つであった（CAS Registry No. 218156-96-8)。 し力 ながら、リン酸化酵素の阻害に関しては、これまでレ、かなる発表もなされていな レヽ。我々はこれを SRPIN-l(SRPk Inhibitor-1)と名づけた。
[0272] [実施例 4B] SRPIN-1を用いた SRPK1のリン酸化活性の阻害の検討
SF2の RSドメインに相当する RSペプチド（
NH2-RSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSY-OH) (配列番号： 5)を合成した。これを 10mM Tris-HCl(pH 7.5)で lmg/mlになるように溶解した。大腸菌で発現精製した組 み換え SRPK1蛋白質を l z g用いて、反応バッファー（250 MgCl、 0.25mM ATP、
2
1 mCi [ γ _32Ρ] ATP、 SRPIN-1終濃度 0.1、 0.3、 1.0、 3.0、 10.0 μ M)中で 30°Cの湯浴 で 10分間インキュベートした。このリン酸化酵素の活性測定における SRPK1と RSぺプ チドの量、および反応時間の条件は、予め反応の直線性を検討し、直線性が成立す る条件を選んでいる。
[0273] SRPK1と RSペプチドの反応を 10分行った後、反応液を P81フォスフォセルロースメン ブレン（P81; Whatman)に滴下し、 5%リン酸溶液で洗浄した。洗浄後、 P81メンブレン の32 Pについての放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターによって測定した。結果 を図 4Bに示す。
[0274] その結果、 SRPIN-1の SRPK1に対する IC50は約 400nMである結果を得た。また同様 の手法 (こよって検討した CLK1、 CLK2, CLK3, CLK4, SRPK2, PRP4、 PKA、 PKC【こ ついては、終濃度 10 /i Mでも阻害効果を見出せなかったことから、 SRPIN-1は SRPK1 の特異的酵素阻害剤と言える。
[0275] [実施例 4C] SRPIN-1を用いた ^^^0にぉける3尺蛋白質のリン酸化阻害と、それに 伴う SR蛋白質分解の誘導の検討
Flp-In293細胞に HA-SRp75プラスミド（1.0 g)を遺伝子導入して、 36時間後に MG132(終濃度 10 μ M)、 SRPIN-1(10、 20、 50 μ Μ)をそれぞれ添加して 15時間インキ ュペートした。その後、 SDS— PAGEサンプルバッファーで細胞を溶解して、蛋白質サ ンプノレとした。このサンプルを、 SDS-PAGEして、抗 HA抗体を用いたウェスタン解析 を行った。また蛋白質量のコントロールとして抗 j3ァクチン抗体を用いてウェスタン解 析を行った。結果を図 4Cに示す。 [0276] その結果、 SRPIN-1の濃度依存的に HA抗体のシグナルが弱くなる結果を得た。こ のことは、 SRPIN-1依存的に内在性の SRPK1活性が阻害されたことで、結果として SRp75蛋白質が分解されたことを示している。
[0277] このことは、 SRPIN-1による SRPK1の阻害は、 in vivoにおいて SR蛋白質のリン酸化を 阻害することが可能であり、その結果として SR蛋白質は不安定化して蛋白質分解が 促進されることを意味してレ、る。
[0278] [実施例 4D] SRPIN-1の添カ卩による、 HIV感染の阻害の検討
MT-4細胞に、 293T細胞で調製した HIVビリオンを添加して、感染実験を行った。ま ずウィルス調製液を MT-4細胞に加えると同時に、 SRPIN_1 (終濃度 0.5、 10、 20 μ Μ) を添加する。 2時間 37°C5% COの培養条件下でインキュベートした後、細胞を遠心し て新しい培養液に交換した。その後、 48時間後に培養上清を回収してルミパルス ELISAシステムによって HIVp24の量を測定した。結果を図 4Dに示す。
[0279] その結果、ルミパルス ELISAシステムによって測定した HIVp24の量は、 SRPIN-1の 濃度に依存して減少する結果を得た。このことは、 SRPIN-1が HIV産生を濃度依存的 に阻害できることを意味している。
[0280] [実施例 5] SRPIN- 1類縁体を用いた SRPK1/2のリン酸化活性の阻害
実施例 4Bと同様に、 SRPIN-1類縁体を用いた SRPK1および SRPK2のリン酸化活性 の阻害活性を確認した。大腸菌で発現精製した組み換え SRPK1蛋白質および
SRPK2蛋白質 を用いて、反応バッファー（400 /i M HEPES ( H 7.5)、 100 μ M MgCl、 200 μ M ATPヽ 1 mCi [ γ -32 P] ATPヽ RSペプチド（配列番号： 5) 1 mg/ml、
SRPIN- 1類縁体各 10 /i M (DMSO中)）中で 30°Cの湯浴で 20分間インキュベートした
[0281] SRPK1または SRPK2と RSペプチドの反応を 20分行った後、反応液を P81フォスフォ セルロースメンブレン（P81 ; Whatman)に滴下し、 5 %リン酸溶液で洗浄（10分を 3回） した。洗浄後、 P81メンブレンの32 Pについての放射活性を液体シンチレーシヨンカウン ターによって測定した。その結果、図 5Aに示したように、各 SRPIN- 1類縁体は SRPK1 および/または SRPK2に対するリン酸化活性阻害効果を示した。特に、化合物番号 340 (SRPIN- 1) 348、 612、 613、 615、 618、 619、 621、 624、 625では、 SRPK1または SRPK2に強い阻害効果が認められた。
[0282] 次に、各 SRPIN-1類縁体の HIV複製に対する抑制効果を確認した。 MT_4細胞
(JCRB No. JCRB0135)に、 293T細胞で調製した HIVビリオンを添加して、感染実験を 行った。まずウィルス調製液を MT-4細胞に加えると同時に、 SRPIN- 1類縁体（終濃 度 5、 10、 20 μ Μ)を添加した。 2時間 37°C、 5% COの培養条件下でインキュベートし た後、細胞を遠心して新しい培養液に交換した。 48時間後に培養上清を回収してル ミパルス ELISAシステムによって HIVp24の量を測定した。その結果、図 5Bに示した各 SRPIN- 1類縁体は HIV複製を阻害する活性を有していた。特に化合物番号 340、 341 、 342、 343、 345、 347、 348、 608、 613、 615、 616、 618、 619、 620、 622、 623、 624、 625 、 626では、 HIV増殖に対する強い抑制効果が認められた。また、図 5Cに示したよう に、他の細胞 (Jurkat)を用いた実験でも同様に HIV増殖を抑制する効果が確認され た。
[0283] [実施例 6] シンドビスウィルスに対する増殖抑制効果
Vero細胞（JCRB0111 )にシンドビスウィルス（4.7xl07 PFU/ml)を 5 microL加え、 24 時間培養した培養上清をストックウィルスとして調製した。これを BHK21 C 13細胞 (JCRB9020)に、 102から 107 PFUとなるように希釈して添加すると同時に、 SRPIN_1 ( 終濃度 5、 10、 20、または 40 μ Μ)を添加した。室温で 1時間感染させた後、 1 %メチ ルセルロース（SIGMA M0512-100G)を含む培地を加え、 48時間、 37°C、 5% COの 培養条件下で静かに培養し、位相差顕微鏡下で細胞形態を観察するとともに、シン ドビスウィルス感染により細胞死したプラーク数をカウントし (プラークアツセィ）、
PFU/mlを計算した。
[0284] 図 6Aに、ウィルス感染の 20時間後の細胞の位相差顕微鏡像を示した。 SRPIN- 1非 投与細胞（図中の "+SIN、対照 Ίでは、シンドビスウィルスの増殖による細胞傷害が 顕著に認められたが、 SRPIN-1 (40 μ Μ)の投与により細胞傷害は劇的に抑制される ことが分かる（図中の "+SIN、 40 μ Μ (#340)")。プラークアツセィの結果でも、 5 μ Μ以 上の SRPIN-1はシンドビスウィルスの増殖を有意かつ濃度依存的に抑制することが判 明した（図 6Β)。
[0285] [実施例 7] サイトメガロウィルスに対する増殖抑制効果 HFL1細胞（IFO50074)に、サイトメガロウィルス（lxlO4 PFU/ml)を添加すると同時 に、 SRPIN-1またはその類縁体（ィ匕合物番号 340および 349 ;終濃度 20または 40 )を添加した。その結果、感染 7日後に、位相差顕微鏡下でサイトメガロウィルスの感 染した HFL1細胞を観察したところ、図 7に示すように、 SRPIN- 1を添カ卩しな力、つた対 照群の HFL1細胞（図中の 1および 2)はサイトメガロウィルス感染に特有の形態変化 と細胞死が高率に観察されたのに対し、 SRPIN-1 (20 μ Μ)を添加した HFL1細胞（図 中の 3)においては、サイトメガロウィルスを感染させたにも関わらず、異常な形態変 化や細胞死は認められなかった。高濃度（40 μ Μ)の SRPIN-1を添加した HFL1細胞 においては一部の当該化合物が惹起したと思われる細胞の形態変化を認めた。また SRPIN-1類縁化合物（化合物番号 349) 20 μ Μあるいは 40 μ Μを HFL1細胞に添加す ることによつても、サイトメガロウィルスの感染による異常な形態変化や細胞死は抑制 された（図中の 5および 6)。この結果、本試験条件下において、 SRPIN-1とその類縁 化合物はサイトメガロウィルスの感染による細胞の形態変化や細胞死を抑制できるこ とが確認された。
[0286] [実施例 8] SARSウィルスに対する増殖抑制効果
Vero細胞 (JCRB0111)に、 SARSウィルス（FFM-l) (Yamamoto, N. et. al., Biochem Biophys Res Commun. 318， 719-725 (2004》を感染させ、同時に SRPIN-1またはそ の類縁体（終濃度 5、 10、 20、 40 / M)を添加した。室温で 2時間感染させた後、 1%メ チルセルロース（SIGMA M0512-100G)を含む D-MEMを加え、 48時間、 37°C、 5% COの培養条件下で培養した。その結果、 SARSウィルス感染により細胞死したプラー ク数をカウントし (プラークアツセィ）、 PFU/mlを計算した。その結果、図 8Aに示したよ うに、 40 μ Μの SRPIN-1およびその類縁化合物（化合物番号 349)は SARSウィルスの 増殖を有意に抑制した。ただし、その効果は SRPIN-1の方が、類縁化合物（化合物 番号 349)と比べて、ウィルス増殖抑制効果がより顕著であった。また図 8Bに示したよ うに、 SRPIN- 1は 1 μ Μ力 40 μ Μの濃度範囲において濃度依存的に SARSウィルスの 増殖を抑制することが判明した。
産業上の利用可能性
[0287] 本発明により、 SRPIN- 1 (SR protein phosphorylation inhibitor 1)およびその類縁体 力 Sリン酸化酵素 SRPKの阻害活性を有することが明らかにされた。 SR蛋白質は SRPK によるリン酸化によって細胞中で安定に存在している力 これらの SRPK阻害剤によつ て SRPKの酵素活性を阻害すると、 SR蛋白質のリン酸化が阻害され、ュビキチン'プロ テアソーム経路を介して分解されることを見出した。そこで SRPK阻害剤を添加して SRPKの阻害を試みたところ、 HIV感染実験では SRPK阻害剤にウィルス複製を抑制 する抗ウィルス作用を有することを見出した。
更に、本発明は、 SR蛋白質の活性を制御することにより、同一のメカニズムで、広 範囲なウィルスに対して有効な抗ウィルス剤を提供するという効果を奏するものであ る。

Claims

請求の範囲
[I] SR蛋白質の活性を制御する SR活性制御剤を有効成分として含有する抗ウィルス 剤。
[2] SR蛋白質が、 SF2/ASF/SRp30a, SC35/PR264/SRp30b, SRp30c, HRS/SRp40,
SRp46,又は SRp75のレ、ずれかである請求項 1記載の抗ウィルス剤。
[3] SR活性制御剤が SR蛋白質の脱リン酸化を促進する物質又は組成物である請求 項 1又は 2項記載の抗ウィルス剤。
[4] フォスファターゼ 2A (Phosphatase 2A)を活性化する活性化剤である請求項 3項記 載の抗ウィルス剤。
[5] HIVの tat遺伝子又はアデノウイルスの E4-ORF4遺伝子又はワクシニアウィルスの V
HI遺伝子を載せた遺伝子治療用の発現ベクターである請求項 4記載の抗ウィルス 剤。
[6] SR活性制御剤が SRPKを阻害する物質である請求項 1又は 2記載の抗ウィルス剤
[7] SRPKが SRPK1または SRPK2である請求項 6記載の抗ウィルス剤。
[8] SR活性制御剤が SRPK遺伝子の発現阻害剤である請求項 1又は 2記載の抗ウイ ルス剤。
[9] SRPK遺伝子の発現阻害斉 ljが、 SRPKに対する miRNA又は siRNA又はモルフオリ ノオリゴ、あるいは該 miRNAまたは siRMAの発現ベクターである請求項 8記載の抗ウイ ルス剤。
[10] SR活性制御剤が SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質である請求項 1又は 2 記載の抗ウィルス剤。
[II] SR蛋白質の活性と逆の活性を有する物質力 ¾nRNPAl発現ベクターである請求項
10記載の抗ウィルス剤。
[12] ウィルスが、 （1)ヒト免疫不全ウィルス (HIV)、重症急性呼吸器症候群（SARS)、ポリ ォウィルス、ヒトライノウィルス、成人 T細胞白血病ウィルス（HTLV_I)、 A型、 C型、 D 型又は E型肝炎ウィルス、ワクシニアウィルス、 日本脳炎ウィルス、デング熱ウィルス、 ヒトコロナウィルス、エボラ出血熱ウィルス、インフルエンザウイルス、若しくはシンドビ スウィルスのいずれかの RNA型ウィルス、又は（2)単純へルぺスウィルス、ヒトアデノ ウィルスを含め、 B型肝炎ウイノレス、サイトメガロウィルス、 EBウィルス、ヘルぺスウィル ス、ヒトヘルぺスウィルス、天然痘ウィルス、ポリオ一マウィルス、若しくはヒトパピロー マウィルスのいずれかの DNA型ウィルスである、請求項 1一 11いずれか 1項記載の 抗ウィルス剤。
[13] 試験化合物を SRPKに作用させる工程、及び SRPKの SR蛋白質をリン酸化する能 力を検定する工程、および該能力を阻害する化合物を選抜することを含む、抗ウィル ス剤のスクリーニング方法。
[14] SRタンパク質又は Arg-Ser(RS)若しくは Ser-Arg (SR)の 2回以上連続するペプチド を SRPKの基質として SR蛋白質をリン酸化する能力を検定する工程を含む、請求項 1
3のスクリーニング方法。
[15] 請求項 13又は請求項 14の方法により得られた化合物を製剤化する工程を含む、 抗ウィルス剤の製造方法。
[16] 下記一般式 (I)
Figure imgf000098_0001
(式中、 R1は、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有して
1-6
いてもよい C アルケニル基、置換基を有していてもよい C アルキニル基、置換基
2-6 2-6
を有していてもよい C ァリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、シァノ基、アジド基、ヒド
6-10
ロキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルコキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、
1-6 c アルキルチオ基、置換基を有していてもよい C アルキルスルホニル基、カルボキ
1-6 1-6
シル基、ホルミノレ基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルコキシカルボニル基、ァシル
1-6
基、ァシルアミノ基、またはスルファモイル基を示し；
R2は、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、または置換基を有し てレ、てもよレヽァリール基を示し；
R3は、置換基を有していてもよい C アルキル基、置換基を有していてもよい C ァ
1-6 2-6 ルケニル基、置換基を有していてもよい c ァリール基、置換基を有していてもよい
6-10
含窒素複素環、または置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環を示し；
R4は、水素原子又はハロゲン原子を示し；
Qは、一C (〇）一、 -C (S)―、 -SO―、 -C (S) NHC (O)―、一C (〇） NHC (O)―、ま
2
たは一 C (O) NHC (S)—を示し；
Wは、水素原子、置換基を有してレ、てもよレ、C アルキル基、置換基を有してレ、て
1-6
もよレ、 C ァリール基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよい C ァ
6-10 1-6 ルコキシ基、置換基を有してレ、てもよレ、c アルキルチオ基、置換基を有してレ、ても
1-6
よい含窒素複素環、置換基を有していてもよい縮合芳香族複素環、または下記一般 式 (II)
I
N
\ ハ
R5 R6
(II)
(式中、 R5および R6は、互いに同一又は異なって、水素原子、置換基を有していても ょレ、C アルキル基、置換基を有してレ、てもよレ、含窒素複素環、置換基を有してレ、て
1-6
もよい縮合芳香族複素環、ァシル基、もしくはァシルアミノ基を示し;または、 前記 R5および R6は、隣接する窒素原子と一緒になつて、置換基を有していてもよい 複素環を形成していてもよぐ該複素環は、置換基を有していてもよい縮合芳香族複 素環であってもよく；
前記 R5および R6は、置換基を有していてもよいシクロアルキリデンァミノ基または置 換基を有していてもよい芳香族環縮合シクロアルキリデン基であってもよい。）で表さ れるァ二リン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
[17] 前記 R1が、水素原子、置換基を有していてもよい C アルキル基、またはハロゲン
1-6
原子である、請求項 16に記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、 またはこれらの水和物。
[18] 前記 R2が、水素原子または C アルキル基である、請求項 16または 17に記載のァ 二リン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
[19] 前記 R3力 S、置換基を有していてもよい C ァリール基、または置換基を有していて
6-10
もよレ、 5— 10員含窒素へテロアリール基である、請求項 16— 18のいずれかに記載 のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
[20] 前記 R4が、水素原子である、請求項 16 19のいずれかに記載のァニリン誘導体、 もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
[21] 前記 Wが、水素原子、ハロゲン原子、または下記一般式 (II)
I
N
R5 R6
(II)
(式中、 R5および R6は、互いに同一又は異なって、置換基を有していてもよい C ァ
1-6 ルキル基を示し；または、
前記 R5および R6は、 P 接する窒素原子と一緒になつて、置換基を有していてもよい ヘテロ環式基を形成していてもよぐ該ヘテロ環式基は、置換基を有していてもょレ、 縮合芳香族へテロ環式基であってもよい。）で表される、請求項 16— 20のいずれか に記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容される塩、またはこれらの水和物。
[22] 請求項 16— 21のいずれかに記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容され る塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、 SRPK阻害剤。
[23] 請求項 16— 21のいずれかに記載のァニリン誘導体、もしくはその医薬上許容され る塩、またはこれらの水和物を有効成分として含有する、抗ウィルス剤。
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