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WO2005047454A1 - アミノ酸培地を含有するプレート及びアミノ酸培地を含有するプレートを用いたスクリーニング方法 - Google Patents

アミノ酸培地を含有するプレート及びアミノ酸培地を含有するプレートを用いたスクリーニング方法 Download PDF

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WO2005047454A1
WO2005047454A1 PCT/JP2004/017211 JP2004017211W WO2005047454A1 WO 2005047454 A1 WO2005047454 A1 WO 2005047454A1 JP 2004017211 W JP2004017211 W JP 2004017211W WO 2005047454 A1 WO2005047454 A1 WO 2005047454A1
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WO
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amino acids
amino acid
medium containing
plate
amino
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2004/017211
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kenji Takehana
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
Priority to JP2005515503A priority Critical patent/JP4770463B2/ja
Publication of WO2005047454A1 publication Critical patent/WO2005047454A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C12Q1/08—Quantitative determination using multifield media

Definitions

  • the present invention relates to a plate for screening the physiological activity and / or pharmacological activity of an amino acid, and a method for screening the physiological activity and / or the pharmacological activity of an amino acid using the plate.
  • Amino acids have long been known for their living bodies to have only a nutritional effect as a substrate for the synthesis of metabolites such as protein synthesis and biogenic amines.In recent years, however, some amino acids have been identified as nutrient sources. In addition to its action, it has been found to have certain biological or pharmacological effects. For example, glutamate and glycine each induce excitatory or inhibitory stimuli in nerve cells and other cells through specific receptors (eg, Nature Reviews Neuroscience, 3; 748-755 (2002), TiPS , 23; 519-527 (2002)).
  • leucine and other branched-chain amino acids activate mTOR, which plays a central role in the signal for promoting translation initiation in protein synthesis (JBC, 273; 14484-14494 (1998)). Furthermore, it has been reported that isoleucine is known to induce antimicrobial peptides and activate innate immunity (PNAS, 97; 12723-12728 (2000)).
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a plate for screening the physiological or pharmacological activity of an amino acid or a group of amino acids, and to efficiently utilize the plate to efficiently regulate the physiological or pharmacological activity of an amino acid or a group of amino acids. It is an object of the present invention to provide a method for screening.
  • the present inventors have found that the use of a plate is effective for efficiently screening the physiological activity and pharmacological action of up to 20 amino acids, and furthermore, intensive research on the structure of the plate As a result, the present invention has been achieved. That is, the present invention is as follows.
  • Amino acid groups include branched-chain amino acids, aromatic amino acids, acidic amino acids, basic amino acids, essential amino acids, non-essential amino acids, S-containing amino acids, and side-chain amides of acidic amino acids (NH2-AA)
  • Medium containing only one amino acid group contains branched-chain amino acids, aromatic amino acids, acidic amino acids, basic amino acids, essential amino acids, non-essential amino acids, sulfur-containing amino acids, and acid-amino acid side chain amides
  • a medium containing amino acids excluding only one amino acid group from all types of amino acids contains branched-chain amino acids, aromatic amino acids, acidic amino acids, basic amino acids, essential amino acids, non-essential amino acids, and sulfur-containing amino acids.
  • (11) A method for screening a physiological activity and a Z or pharmacological activity of an amino acid or a group of amino acids using the plate according to any one of (1) to (10).
  • the physiological activity and / or pharmacological activity of the amino acid or amino acid group is screened using the plate according to any one of (1) to (10), and the obtained data is analyzed to determine the physiological activity. And Z or a method for specifying an amino acid or amino acid group involved in pharmacological activity.
  • the plate of the present invention it is possible to screen the physiological activity or pharmacological action of the amino acid or amino acid group very efficiently.
  • search for specific amino acid or amino acid groups related to various physiological functions by using various biological tissues, cells, or body fluids as specimens, and use of tissues or body fluids of patients suffering from specific diseases
  • the search for a specific amino acid or amino acid group associated with the disease can be performed by using a natural or synthetic physiologically active substance.
  • a search for a specific amino acid having an action such as increasing or decreasing its main effect or increasing or decreasing a side effect can be performed at a glance with a maximum of 20 kinds of amino acids, so that screening can be performed extremely efficiently.
  • FIG. 1 shows the arrangement of the medium in the plate of Example 1.
  • FIG. 2-1 shows the measurement results of mTOR activation in hepatocellular carcinoma H4IIE cells using the plate of Example 1 (2A to 11 and 111 to 11H).
  • FIG. 2-2 shows the results of measuring mTOR activation in hepatocellular carcinoma H4IIE cells using the plate of Example 1 (2B to 11C).
  • FIG. 2-3 shows the measurement results of mTOR activation in hepatocellular carcinoma ⁇ 4 ⁇ cells using the plate of Example 1 (2D to 1E).
  • FIG. 2-4 shows the measurement results of mTOR activation in hepatocellular carcinoma ⁇ 4 ⁇ cells using the plate of Example 1 (2F to 11G). Detailed description of the invention
  • the medium containing amino acids used in the plate of the present invention is referred to as “amino acid medium”.
  • the plate in the present invention refers to a set of containers in which two or more types of culture media can be arranged, and may have any form as long as two or more types of culture media can be arranged therein, for example, a tube-shaped or dish-shaped accommodation.
  • a multi-well plate in which a plurality of storage units are arranged on one plate is preferable.
  • a 6-well plate, a 12-well plate manufactured by Coing Coaster (USA) is preferred.
  • L-plates 24 ⁇ -L plates, 48 ⁇ -L plates, and 96-L plates are particularly preferred. From the viewpoint that various types of culture media can be arranged, a 96-well plate or a plate having a greater number of wells is more preferable.
  • the medium is water, pH-adjusting components, nutrients, and supports that are used to grow, grow, survive, or maintain living cells, tissues, organs, homogenates of cells or tissues, etc. in glass or plastic vessels. And the like, for example, a natural medium composed of mammalian cells, tissue homogenate, fetal serum, or a synthetic medium, or a pH buffer.
  • the type of medium may be any of solid, semi-solid, and liquid.
  • the medium may be obtained by adding water, or may be a lyophilized medium. In the case of lyophilized medium, As a medium reconstituting agent to be reconstituted, sterile water, a buffer such as lOmM HEPES, a baking soda solution, or the like may be used as a kit. Appropriate ones can be used depending on the type of sample and the purpose of screening.
  • a synthetic medium such as a DMEM medium (Invitrogen Corp. (USA), catalog number # 3160000) is preferred because it is advantageous and simple for preparing an amino acid medium of various formulations.
  • Various media can be prepared by appropriately preparing the components of the medium.
  • a medium containing only non-amino acid compositions such as sugars, minerals, and vitamins in the medium is called a zero medium, and a medium containing all amino acids is called a full medium.
  • a non-amino acid medium refers to a medium that does not contain any amino acids.
  • the medium containing all amino acids refers to a medium containing all 20 amino acids in the above medium.
  • the medium containing only one kind of amino acid refers to a medium containing only one kind of amino acid among the twenty kinds of amino acids in the above-mentioned medium.
  • a medium containing only one amino acid group refers to a medium containing only one amino acid group out of the twenty amino acids in the above medium.
  • a medium containing only one amino acid from all amino acids is defined as a medium containing the remaining 19 amino acids excluding only one of the 20 amino acids in the above-described medium. Refers to the medium.
  • a medium containing amino acids excluding only one amino acid group from all amino acids refers to a medium containing the remaining amino acids excluding one amino acid group among the 20 amino acids in the above medium.
  • amino acids are glycine (hereinafter, referred to as “Gly”; the same applies hereinafter), alanine (Ala), serine (Ser), threonine (Thr), and cysteine (Cys) constituting proteins.
  • Gly glycine
  • Al alanine
  • Ser serine
  • Thr threonine
  • Cys cysteine
  • Methionine (Met) gnoretamic acid (G1u), aspartic acid (Asp), glutamine (Gin), asparagine (Asn), palin (Va1), leucine (Leu), isoleucine (I 1 e), fenirarayun (Phe), tyrosine (Tyr), tryptophan (Trp), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), proline (Pro
  • the amino acid may be any of D-form, L-form and DL-form, but L-form is preferred.
  • the “all kinds of amino acids” to be arranged on the plate are preferably 20 kinds of ⁇ -amino acids among the above amino acids, but may contain other amino acids as necessary.
  • the amino acid group means a group containing two or more amino acids having a common property, and the group can be formed by an arbitrary combination according to the purpose.
  • branched-chain amino acids [BCAA] Va 1, L eu, I 1 e
  • aromatic amino acids [AAA] Ty r, Ph e s Tr p
  • acidic amino acids [aAA] As, G 1 u
  • Basic amino acid [bAA] A rg, Lys, His :
  • essential amino acid [e AA] Ile, Leu, Lys, Met, PheThr, Tr, Va1, His
  • Non-essential amino acids [ne AA] Gly, Ala, Ser, Cys, Gln, Asn, Glu, Asp, Tyr, Arg, Pro
  • sulfur-containing amino acids [S—AA ] Cys, Met
  • amino acids containing side-chain amides of acidic amino acids [NH2-AA] Asn, Gin.
  • one kind of amino acid or one kind of amino acid group may be substituted with N-alkylamino acid, N-acylamino acid, Z-amino acid or C-terminal amide amino acid which is a structural derivative of the corresponding amino acid, respectively.
  • the amino acid concentration in the medium is arbitrary, and may be set to a concentration required for the screening system. For example, the same concentration of amino acid added to DMEM The concentration may be set. In the case of a medium containing only one kind of amino acid, it is preferable to set the concentration to be higher in order to enhance the discrimination of the reaction result. For example, it is preferable to set the concentration to about 4 to 10 times the concentration set in the DMEM medium, and more preferable to set the two concentrations within the concentration range of about 4 to 10 times. Good to do.
  • the arrangement of the amino acid medium on the plate may be such that at least two of the above-mentioned mediums containing amino acids are placed in separate wells, and one of them is used as a control and a medium containing no amino acids or containing all amino acids. It is preferable to use a culture medium in which
  • all of the media exemplified above are placed on one plate.
  • a plate on which all the media are placed it is possible to search the reactivity of 20 individual amino acids or amino acid groups to a sample at once.
  • a plate with all configurations as the first step, and as the second and third steps a medium or a full medium in which the concentration of amino acids and / or amino acids that show some reactivity with the sample is further changed.
  • a plate on which a medium from which the amino acid and amino acid group or amino acid group has been removed is used, a narrow search can be performed.
  • amino acid medium When the amino acid medium is liquid or semi-solid (paste), it can be solidified by freeze-drying or the like.
  • Samples that can be screened by the plate of the present invention may be any of various biological tissues and body fluids, and physiologically active substances obtained naturally or synthetically.
  • organ tissues, cells, cell extracts, blood, and urine are used.
  • the search for specific amino acids related to various physiological functions can be performed by using the tissues and body fluids of patients suffering from the specific disease.
  • cords and, moreover, using natural or synthetic bioactive substances it is possible to extremely efficiently search for specific amino acids related to metabolism, increase / decrease of main effects, increase / decrease of side effects, etc. of the bioactive substances. it can.
  • mTOR target using their respective media constituted by a plate It can be examined by measuring the degree of phosphorylation of p70 S6 kinase, one of them.
  • the pharmacological action of amino acids in all biological activity measurements that can be basically performed using cultured cells can be examined in detail.
  • All biological activities that can be performed using cultured cells include cell proliferation, cell damage, cell death, and cytokines *
  • an appropriately prepared solution or suspension containing a desired specimen is poured onto an amino acid medium arranged on the plate of the present invention, and cultured in a usual manner. Then, the obtained culture is subjected to ELISA, RIA, Western blotting, immunoprecipitation, color reaction, component analysis, or a Vitro test using biological tissue, depending on the type of sample and screening purpose. Screening is performed by a Vivo test using experimental animals, etc., to search for the association between the sample and a specific amino acid or amino acid group.
  • the composition other than amino acids is based on the DMEM medium (Invitrogen, Cat. # 3160), and various amino acids are arranged on a 96-well plate as shown in Fig. 1. did.
  • the concentrations of various amino acids contained in the prepared plate were measured by a bioanalytical method using an amino acid analyzer (Hitachi L8800), and the results are shown in Table 1.
  • Table 1-1 Measured values 2A 3A 4A 5 ⁇ 6 ⁇ 7A 8A 9 ⁇ 10A 11A Component name Full Full ABCAA ⁇ AaAA AbAA ⁇ aneAA AsAA ⁇ 2 ⁇
  • a full medium containing all amino acids is contained in wells 2A and 3B of a 96-well multiwell plate, and branched amino acids [BCAA] and aromatics are contained in 4A to 11A, respectively.
  • the medium from which the amide-containing amino acid [NH2-AA] had been removed was added to 2B to 11C from the Full medium, Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Glu, Asp, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Pro, and 2D-: LIE, Gly, A la, Ser, Thr, Cys, Met, Gln, Asn, Glu, Asp, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Tr
  • H4IIE were cultured in 10% FBS, 100U / ml penicillin ⁇ 100 / g / ml 37 ° C in DMEM medium containing streptomycin, 5 C0 2 incubator, before the day of evaluation sample plate, without serum After replacing the medium, the cells were cultured for 10 minutes. Next S PBS (-) at twice washed, after incubation is replaced with an amino acid-free DMEM medium (Zero medium) for 2 hours 37 ° C, 5% C0 2 , each of the medium plate of Example 1 After the replacement, the mixture was further kept at 37 ° C for 30 minutes.
  • Anti S6 kinase antibody (Chemicon) is coating buffer (0. 1M NaHC0 3 ( pH9 6).) was diluted to lg / ml at, 50; ul / well in ELISA plate (96 well, COSTAR) in dispensed And allowed to stand at 104 ° C. The next day, after washing once with TBS-T (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20), wash the blocking buffer (5% ski ⁇ ilk / TBS) 100; / 1. Then, the mixture was allowed to stand for 0.5 to 1 hour.
  • TBS-T 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20
  • a cell lysate 401 was added, and a phosphorylated S6 kinase antibody diluent (final concentration 1: 300 dilution) 201 was further added, and the mixture was allowed to stand for 2 hours.
  • a phosphorylated S6 kinase antibody diluent (final concentration 1: 300 dilution) 201 was further added, and the mixture was allowed to stand for 2 hours.
  • 501 ng of 200 ng / ml Eu-labelled anti-mouse IgG2a antibody was added and left to stand for 1 hour.
  • 100 ⁇ l of Enhancement solution was added, and time-resolved fluorescence of Eu was measured with ARV0.
  • the plate of the present invention By using the plate of the present invention, it has become possible to perform, at once, extremely efficiently screening which has been performed while replacing the amino acid medium for each amino acid. Therefore, the present invention is extremely useful in that screening for the physiological activity and pharmacological activity of amino acids or amino acid groups has been dramatically reduced in labor.
  • This application is based on a patent application No. 2003-38464 filed on Nov. 133, 2003, the contents of which are incorporated herein by reference.

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Abstract

本発明は、アミノ酸の生理活性及び／又は薬理活性を効率的にスクリーニングするための物及びスクリーニング方法を提供する。具体的には、収容部に、アミノ酸を全く含有しない培地、全種類のアミノ酸を含有する培地、１種類のアミノ酸のみを含有する培地、１種類のアミノ酸グループのみを含有する培地、全種類のアミノ酸から１種類のアミノ酸のみを除外したアミノ酸を含有する培地、全種類のアミノ酸から１種類のアミノ酸グループのみを除外したアミノ酸を含有する培地、のいずれか２つ以上の培地を配置したことを特徴とするアミノ酸の生理活性及び／又は薬理活性のスクリーニング用のプレート、及び該プレートを用いるアミノ酸又はアミノ酸グループの生理活性及び／又は薬理活性のスクリーニング方法に関する。

Description

明 細 書
アミノ酸培地を含有するプレート及ぴ
アミノ酸培地を含有するプレートを用いたスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 アミノ酸の生理活性及び/又は薬理活性をスクリーニングするため のプレート、 及び該プレートを用いるアミノ酸の生理活性及ぴノ又は薬理活性の スクリーニング法に関する。 背景技術
アミノ酸は、 永く、 生体にとっては蛋白質合成や生体アミンをはじめとする代 謝物合成の基質としての栄養効果のみが知られてきたが、 近年、 ある種のアミノ 酸の中には栄養源としての作用以外に、 ある種の生理活性ないし薬理学的効果を 有することが見出された。 例えば、 グルタミン酸とグリシンはそれぞれ特異的な 受容体を介して神経細胞やその他の細胞に興奮性あるいは抑制性の刺激を誘導す る （例えば、 Nature Reviews Neuroscience, 3 ; 748-755 (2002)、 TiPS, 23； 519-527 (2002) ) 。 また、 ロイシンをはじめとする分岐鎖アミノ酸は蛋白質合成 における翻訳開始促進シグナルにおいて中心を担う mTORの活性化をする （JBC, 273 ; 14484-14494 (1998) ) 。 さらにイソロイシンは抗菌ペプチドを誘導し自然 免疫を活性化することが知られるなどの報告がなされている （PNAS， 97； 12723- 12728 (2000) ) 。
したがって、 各種のアミノ酸について、 生理機能との関連、 新たな生理活性や 特定疾患の病理との関連、 あるいは、 種々の生理活性物質との相互作用などを解 明することは、 ただ単に、 アミノ酸の生理機能を明らかにするに止まらず、 特定 疾患の病理解明や診断、 あるいは、 新たな医薬品の開発や治療方法の開発につな がり得る点で極めて重要である。 しかし、 アミノ酸の潜在的な生理活性の分析'試験は、 通常の細胞培養用培地 に栄養素として含まれるアミノ酸濃度を変更させた特殊な培地を必要とするため 、 従来から、 それぞれのアミノ酸について個別に行わなければならず、 例えば、 ある種の生理活性と特定アミノ酸との関連を検討するには、 蛋白質を構成するァ ミノ酸の場合、 全種類のアミノ酸にっき 2 0回の実験を重ねなければならないな ど、 時間的、 労力的に多大な負担を伴うのが実情であった。 したがって、 ァミノ 酸の生理活性などを効率的に検索する方法が求められている。 発明の開示
本発明が解決しょうとする課題は、 アミノ酸又はアミノ酸グループの生理活性 や薬理活性をスクリーニングするためのプレートの提供、 及び該プレートの利用 によりァミノ酸又はァミノ酸グループの生理活性や薬理活性を効率的にスクリー ニングする方法を提供することにある。
本発明者は、 最大 2 0種類というアミノ酸について、 その生理活性や薬理作用 を効率的にスクリーニングするためには、 プレートの利用が有効であることを見 出し、 さらに、 該プレートの構成につき鋭意研究の結果、 本発明に至った。 すなわち、 本発明は以下のとおりのものである。
( 1 ) プレートの収容部に、 アミノ酸を全く含有しない培地、 全種類のアミノ酸 を含有する培地、 1種類のアミノ酸のみを含有する培地、 1種類のアミノ酸ダル ープのみを含有する培地、 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸のみを除外し たアミノ酸を含有する培地、 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸グループの みを除外したアミノ酸を含有する培地、 のいずれか 2つ以上の培地を配置したこ とを特徴とするプレート。
( 2 ) 培地の 1つがアミノ酸を全く含有しない培地であることを特徴とする （1 ) に記載のプレート。
( 3 ) 培地の 1つが全アミノ酸を含有する培地であることを特徴とする （1 ) に 記載のプレート。 (4) アミノ酸を全く含有しない培地、 全種類のアミノ酸を含有する培地、 1種 類のアミノ酸のみを含有する培地、 1種類のァミノ酸グループのみを含有する培 地、 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸のみを除外したアミノ酸を含有する 培地、 全アミノ酸から 1種類のアミノ酸グループを除外したアミノ酸のみを含有 する培地、 の全てを配置したことを特徴とする （1) に記載のプレート。
(5) 1種類のアミノ酸のみを含有する培地が、 全種類のアミノ酸について存在 することを特徴とする （1) 〜 （4) のいずれか 1に記載のプレート。
(6) 1種類のアミノ酸のみを含有する培地が、 アミノ酸濃度の異なる 2つの培 地として存在することを特徴とする （1) 〜 （5) のいずれか 1に記載のプレー ト。
(7) 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸を除外したアミノ酸を含有する培 地が、 全種類のアミノ酸について存在することを特徴とする （1) 〜 （6) のい ずれか 1に記載のプレート。
(8) アミノ酸グループが、 分岐鎖アミノ酸、 芳香族アミノ酸、 酸性アミノ酸、 塩基性アミノ酸、 必須アミノ酸、 非必須アミノ酸、 S含有アミノ酸、 酸性アミノ 酸の側鎖アミ ド体 （NH2- AA) の各グループから選ばれることを特徴とする (1) 〜 （7) のいずれか 1に記載のプレート。
(9) 1種類のアミノ酸グループのみを含有する培地が、 分岐鎖アミノ酸、 芳香 族アミノ酸、 酸性アミノ酸、 塩基性アミノ酸、 必須アミノ酸、 非必須アミノ酸、 硫黄含有ァミノ酸、 酸性ァミノ酸の側鎖ァミド含有ァミノ酸の全種類のァミノ酸 グループについて存在することを特徴とする （1) 〜 （8) のいずれか 1に記载 のプレ—ト。
(10) 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸グループのみを除外したァミノ 酸を含有する培地が、 分岐鎖アミノ酸、 芳香族アミノ酸、 酸性アミノ酸、 塩基性 アミノ酸、 必須アミノ酸、 非必須アミノ酸、 硫黄含有アミノ酸、 酸性アミノ酸の 側鎖ァミド含有ァミノ酸の全種類のァミノ酸グループについて存在することを特 徴とする （1) 〜 （9) のいずれか 1に記載のプレート。 (1 1) (1) 〜 （10) のいずれか 1に記載のプレートを用いて、 アミノ酸又 はアミノ酸グループの生理活性及ぴ Z又は薬理活性をスクリーニングする方法。
(12) (1) 〜 （10) のいずれか 1に記載のプレートを用いてアミノ酸又は アミノ酸グループの生理活性及び/又は薬理活性をスクリ一ユングし、 得られた データを解析して、 生理活性及ぴ Z又は薬理活性に関与するアミノ酸又はアミノ 酸グループを特定する方法。
(13) (1) 〜 （10) のいずれか 1に記載のプレートの 1ないし複数種を組 み合わせたキット。
(14) (1) 〜 （10) のいずれか 1に記載のプレートの 1ないし複数種と、 培地溶解用の滅菌水、 緩衝液、 又は重曹水を組み合わせたキット。
本発明のプレートを用いれば、 アミノ酸又はァミノ酸グループの生理活性ある いは薬理作用を極めて効率的にスクリ一二ングすることができる。
すなわち、 検体として、 生体各種組織や細胞あるいは体液などを用いることに よってさまざまな生理機能と関連する特定ァミノ酸又はアミノ酸グループの検索 を、 また、 特定疾患に罹患した患者の組織や体液を用いることによって、 該疾患 と関連する特定アミノ酸又はアミノ酸グループの検索を、 天然あるいは合成の生 理活性物質あるレ、は薬理活性物質を用いることによって、 該生理活性あるいは薬 理活性物質の代謝 ·吸収と関連し、 その主作用を増減させあるいは副作用を増減 させるなどの作用を有する特定アミノ酸の検索などを、 最大 20種類のアミノ酸 にっき一挙に実施することできるため、 極めて効率的にスクリーニングすること ができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1のプレートにおける培地の配置を示す。
図 2— 1は、 実施例 1のプレートを用いた肝細胞癌 H4IIE細胞における mTOR 活性化の測定結果を示す （2A〜1 1 及ぴ111〜1 1H) 。 図 2— 2は、 実施例 1のプレートを用いた肝細胞癌 H4IIE細胞における mTOR 活性化の測定結果を示す （2 B〜1 1 C) 。
図 2— 3は、 実施例 1のプレートを用いた肝細胞癌 Η4ΠΕ細胞における mTOR 活性化の測定結果を示す （2 D〜1 I E) 。
図 2— 4は、 実施例 1のプレートを用いた肝細胞癌 Η4ΠΕ細胞における mTOR 活性化の測定結果を示す （2 F〜1 1 G) 。 発明の詳細な説明
(プレート）
本発明のプレートで用いるアミノ酸含有の培地を 「アミノ酸培地」 という。 本発明におけるプレートとは、 2種類以上の培地が配置できる容器のセットを いい、 2種類以上の培地が配置できるものであればどのような形態でもよく、 例 えば、 チューブ状又は皿状の収容部を有する独立型の容器のセット、 あるいはこ れらの形状の収容部を一体に連設したプレート等が挙げられる。 その中でも、 複 数の収容部を 1枚のプレート上に配置した形状のマルチウエルプレートが好まし く、 例えば、 コ一二ング .コースター社 （米国） 製の、 6ゥエルプレート、 1 2 ゥエルプレート、 2 4ゥエルプレート、 4 8ゥエルプレート、 9 6ゥエルプレー トなどがとくに好ましい。 多種類の培地が配置できるという点から、 9 6ゥエル プレート若しくはそれ以上のゥエル数を有するプレートがより好ましい。
(培地）
培地とは、 生物の細胞、 組織、 器官、 細胞や組織のホモジネートなどをガラス 器やプラスチック器内で増殖、 発育、 生存、 又は維持させるために与える水、 p H調整成分、 栄養成分、 支持体などをいい、 例えば、 哺乳動物の細胞、 組織のホ モジネート、 ゥシ胎仔血清などによって構成される天然培地、 又は合成培地、 あ るいは p H緩衝液などが挙げられる。 また、 培地のタイプとしては、 固形、 半固 形、 液体のいずれでもよく、 水分を添加することにより目的の培地が得られるも のでもよく、 凍結乾燥された培地でもよい。 凍結乾燥された培地の場合、 それを 再構成する培地溶解剤として、 滅菌水、 lOmM HEPESなどの緩衝液、 重曹溶液な どをキットとしてもよい。 検体の種類、 スクリーニングの目的によって適宜のも のを用いることができる。
そのなかでも、 例えば、 DMEM培地（インビトロジェン社 （米国） 、 カタ口 グ番号 # 3 1 6 0 0 )などの合成培地が、 各種配合のァミノ酸培地の調製に有利 で簡便であるため好ましく、 該培地の構成成分を適宜に調製して、 種々の培地を 調製することができる。 該培地における糖、 ミネラル、 ビタミンなどの非ァミノ 酸組成のみからなるものをゼロ（Zero)培地といい、 これに、 全アミノ酸を加えた ものをフル (Full)培地という。 ゼロ培地とフル培地に、 各種のアミノ酸あるいは アミノ酸グループを添カ卩あるいは除去することによって、 各ゥエルに配置する培 地を調製する。
非アミノ酸培地とは、 アミノ酸を全く含有していない培地をいう。
全アミノ酸を含有する培地とは、 上記培地において、 2 0種類のアミノ酸全て を含有している培地をいう。
1種類のアミノ酸のみを含有する培地とは、 上記培地において、 2 0種類のァ ミノ酸のうち 1種類のアミノ酸のみを含有している培地をいう。
1種類のアミノ酸グループのみを含有する培地とは、 上記培地において、 2 0 種類のアミノ酸のうち、 1種類のアミノ酸グループのみを含有している培地をい
5 o
全アミノ酸から 1種類のアミノ酸のみを除外したアミノ酸を含有する培地とは 、 上記培地において、 2 0種類のアミノ酸のうち、 1種類のアミノ酸のみを除外 した残り 1 9種類のアミノ酸を含有している培地をいう。
全アミノ酸から 1種類のアミノ酸グループのみを除外したアミノ酸を含有する 培地とは、 上記培地において、 2 0種類のアミノ酸のうち、 1種類のアミノ酸グ ループを除外した残りのアミノ酸を含有している培地をいう。
(アミノ酸） 本発明において、 アミノ酸とは、 蛋白質を構成する、 グリシン （ 「G l y」 と いう。 以下、 同様） 、 ァラニン （A l a) 、 セリン （S e r) 、 スレオニン （T h r) 、 システィン （Cy s) 、 メチォニン （Me t) 、 グノレタミン酸 (G 1 u ) 、 ァスパラギン酸 （As p) 、 グルタミン （G i n) 、 ァスパラギン （As n ) 、 パリン （V a 1 ) 、 ロイシン （Le u) 、 イソロイシン （I 1 e) 、 フエ二 ルァラユン （Ph e) 、 チロシン （Ty r) 、 トリプトファン （T r p) 、 リジ ン （Ly s) 、 アルギニン （Ar g) 、 ヒスチジン （H i s ) 、 プロリン （ P r o) の 20種類の a—アミノ酸のほか、 その他分子中にアミノ基とカルボキシル 基を有する化合物、 アミノ酸誘導体、 生体内アミノ酸代謝物などをいう。 ァミノ 酸は、 D体、 L体、 DL体のいずれでもよいが、 L体が好ましい。 プレートに配 置する 「全種類のアミノ酸」 とは、 上記アミノ酸のうち 20種類の α—アミノ酸 であることが好ましいが、 必要に応じてそれ以外のァミノ酸を含有してもよい。 アミノ酸グループとは、 共通の性質を有する 2種類以上のアミノ酸を含むダル ープを意味し、 目的に応じて任意の組み合わせによるグループを構成することが 可能である。 例えば、 分岐鎖アミノ酸 [BCAA] (Va 1、 L e u、 I 1 e) 、 芳香族アミノ酸 [AAA] (Ty r, Ph es Tr p) 、 酸性アミノ酸 [aAA] ( As , G 1 u) 、 塩基性アミノ酸 [bAA] (A r g、 L y s、 H i s：) 、 必須 アミノ酸 [e AA] (I l e、 L e u, Ly s、 Me t、 P h e Th r、 Tr 、 Va 1、 H i s) 、 非必須アミノ酸 [n e AA] (G l y、 A l a、 S e r、 C y s、 G l n、 As n、 G l u、 As p、 Ty r、 Ar g、 P r o) 、 硫黄含有 アミノ酸 [S— AA] (Cy s、 Me t) 、 酸性アミノ酸の側鎖アミド含有アミノ 酸 [NH2- AA] (As n、 G i n) などのグループ分けが挙げられる。
また、 1種類ァミノ酸または 1種類のァミノ酸グループをそれぞれ対応するァ ミノ酸の構造誘導体である N -アルキルァミノ酸、 N -ァシルァミノ酸、 Z -ァミノ 酸または C末アミドアミノ酸に置換してもよい。
培地中のアミノ酸濃度は、 任意であり、 スクリーニング系で必要とされる濃度 を設定すればよい。 例えば、 DMEMに添カ卩されているアミノ酸濃度と同程度の 濃度を設定してもよく、 1種類のアミノ酸のみを含有する培地の場合は、 反応結 果の識別性を高めるために、 濃度を高めに設定することが好ましい。 例えば、 D MEM培地で設定されている濃度の 4倍から 1 0倍程度の濃度を設定するのが好 ましく、 より好ましくは、 4倍から 1 0倍程度の濃度範囲で 2つの濃度を設定す るのがよい。
(アミノ酸培地の配置）
プレートにおけるアミノ酸培地の配置は、 前記したアミノ酸を含む培地の少な くとも 2つを別々のゥエルに配置すればよく、 そのうち 1種類をコントロールと して、 アミノ酸を全く含有しない培地又は全アミノ酸を含有する培地とするのが 好ましい。
より好ましくは、 先に例示した培地の全てを 1枚のプレートに配置する。 全ての培地を配置したプレートを用いることによって、 2 0種類の個別アミノ 酸、 あるいはアミノ酸グループの、 検体に対する反応性を一挙に検索することが できる。
あるいは、 第 1段階として全配置のプレートを用い、 第 2、 第 3段階として、 検体に対して何らかの反応性のみられたアミノ酸及ぴ 又はアミノ酸グループに つき、 さらに濃度変化を付した培地、 フル培地から当該アミノ酸及びノ又はアミ ノ酸グループを抜いた培地などを配置したプレートを用いることによって、 絞り 検索を行うことができる。
アミノ酸培地が液状あるいは半固形状 （ペースト状） である場合には、 凍結乾 燥などによって固形化することができる。
(検体 ' スクリーニング系）
本発明のプレートによって、 スクリーニングできる検体としては、 各種生体組 織や体液、 天然あるいは合成によって得られる生理活性物質などいずれでもよく 、 例えば、 臓器組織、 細胞、 細胞抽出物、 血液、 尿を使用することによりさまざ まな生理機能と関連する特定アミノ酸の検索を、 また、 特定疾患に罹患した患者 の組織や体液を用いることにより、 該特定疾患の病理に係わる特定アミノ酸の検 索を、 さらには、 天然又は合成による生理活性物質を用いることにより、 該生理 活性物質の代謝、 主作用の増減、 副作用の増減などに係わる特定アミノ酸の検索 などを、 極めて効率的に行うことができる。
すなわち、 例えばラット肝細胞癌株 Η4ΠΕ細胞を用いて栄養飢餓時からの m TOR信号伝達の活性化に対する各種アミノ酸の効果を検討するために、 プレート によって構成されるそれぞれの培地を用いて mTORの標的のひとつである p70 S6 キナーゼのリン酸化程度を測定することによって調べることができる。 また、 基 本的に培養細胞を用いて行うことができる全ての生物活性の測定におけるァミノ 酸の薬理作用を詳細に調べることができる。 培養細胞を用いて行うことができる 全ての生物活性とは、 細胞増殖、 細胞障害、 細胞死、 サイトカイン *ケミカルメ ディエーター ·酵素 ·接着因子などの物質生産能や分泌能、 細胞運動能、 細胞接 着性、 生理活性物質の膜透過性などの生物反応を含む。
(スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、 本発明のプレートに配置したアミノ酸培地上 に、 適宜に調製した所望の検体を含む溶液あるいは懸濁液を注加し、 通常の方法 で培養する。 ついで、 得られた培養物を、 検体の種類やスクリーニング目的に応 じて、 E L I S A法、 R I A法、 ウェスタンプロッテング法、 免疫沈降法、 呈色 反応、 成分分析、 あるいは生体組織を用いる Vitro試験や実験動物を用いた Vivo試験などによってスクリーニングにかけ、 検体と特定アミノ酸又はアミノ 酸グループとの関連を検索する。
得られたデータの解析によって、 特定の生理活性や薬理活性に関与するァミノ 酸又はアミノ酸グループを検出することが可能である。 すなわち、 全種類のアミ ノ酸を含む培地において発揮される生物活性を 1 0 0 %とした時の、 各プレート を構成する培地についての各々の活性を比較検討することにより、 ある種のァミ ノ酸又はァミノ酸グループが特定の生理活性を発揮することが明らかとなる。 (キット） 本発明のアミノ酸培地を配置したプレートは、 各ゥエルにアミノ酸培地を配置 した後、 シールして製品とする。
プレートに配置したアミノ酸培地の種類、 数などに応じて多種類のプレートが 調製可能であり、 これらを適宜に組み合わせ、 また、 固体培地の場合にはその溶 解用の滅菌水、 緩衝液、 又は重曹水と組み合わせ、 さらに、 予備的な 1〜2 0種 のアミノ酸などと任意に組み合わせてキットとすることができる。 実施例
以下に、 .本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらの例 によって何ら限定されるものではない。
実施例 1
(プレートの作成）
プレートを構成する培地は、 アミノ酸以外の組成は DMEM培地 （インビトロ ジェン社、 カタログ番号 # 3 1 6 0 0 ) を基準として、 各種のアミノ酸は、 図 1 に示すように 9 6穴プレート上に配置した。 作製したプレートに含まれる各種の アミノ酸濃度を、 アミノ酸分析装置 （日立 L8800型） を用いて生体分析法により 測定し、 その結果を、 表 1に示した。
表 1— 1 実測値 2A 3A 4A 5Α 6Α 7A 8A 9Α 10A 11A 成 分 名 Full Full ABCAA ΔΑΑΑ AaAA AbAA ΔβΑΑ aneAA AsAA ΔΝΗ2ΑΑ
1 Gly Glycine 38 38 39 40 41 41 39 ― 38 41
2 Ala Alanine 45 45 45 48 49 49 47 一 46 48
3 Ser Serine 54 54 54 57 59 59 57 一 55 58
4 Thr Threonine 119 119 119 125 130 128 - 121 120 128
5 Cys Cystine 55 55 56 58 59 60 60 - - 58 β Met Methionine 38 38 39 39 41 42 - 38 - 40
7 Gin Glutamine 565 565 546 581 594 596 558 一 567 一
8 Asn Asparasine 65 65 68 69 82 74 73 一 71 -
9 Glu Glutamic acid 74 74 77 80 - 82 79 - 77 79
10 Asp Aspartic acia 66 66 66 68 - 71 67 ― 66 69
11 Val Valine 117 117 - 124 128 一 119 119 126
12 Leu Leucine 131 131 一 139 144 143 - 134 133 141
13 lie isoleucine 133 133 - 141 1 5 287 - 135 135 142
14 Phe Phenylalanine 84 84 8β - 92 92 一 86 86 90
15 Tyr Tyrosine 123 123 126 一 135 135 129 一 126 132
16 Trp Tryptophan 18 18 18 - 21 18 一 14 19 21
17 Lys Lysine 144 144 1 7 153 158 一 一 147 148 156
18 Ant Ατχιηιπβ SO 90 91 95 99 - 93 - 92 97
19 His Histidine 38 38 37 39 40 - - 37 38 40
20 Pro Proine 58 58 60 61 64 67 63 - 70 64 合 計 2053 2053 1675 1915 2083 2072 1265 8321 2006 1531
表 1一 2 実測値 2B 3B 4Β 5B 6B 7B 8B 9B 10B 11 Β 成 分 名 △ Gly ΔΑΙβ △ Ser △ Thr △ Gys A Met △ Gin AAsn △ Glu △ Asp
1 Gly Glycine 一 32 32 33 33 33 33 32 33 34
2 Ala Alanine 42 - 38 39 39 39 39 38 39 41
3 Ser Serine 49 46 一 47 47 47 46 45 46 49
4 Thr Threonine 108 102 101 一 104 104 102 100 101 107
5 Cys Cystine 50 47 47 48 - 49 48 47 48 50
6 Met Methionine 34 32 32 33 33 - 32 32 32 34
7 Gin Glutamine 494 466 467 469 477 480 一 483 493 514
8 Asn Asparagine 64 60 59 60 60 62 66 一 66 62
9 Glu Glutamic Acid 69 65 65 66 66 66 62 64 - 68
10 Asp Aspartic Acid 60 55 55 56 57 57 56 55 56 -
11 Val Valine 106 100 100 102 02 103 100 98 100 106
12 Leu Leucine 119 112 111 113 114 117 111 110 112 118
13 He Isoleucine 120 113 112 115 115 115 113 112 113 119
14 Phe Phenylalanine 77 71 72 74 74 75 75 72 73 76
15 Tyr 1 yrosino 112 106 106 08 109 110 108 105 106 112
16 Trp Tryptophan 15 14 15 17 17 16 17 15 1β 18
17 Lys Lysine 131 124 123 126 126 127 125 123 125 131
18 Arg Arginine 81 77 76 78 79 79 77 76 77 82
19 His Histidine 34 33 32 33 35 34 33 34 33 35
20 Pro Proline 57 57 52 54 52 53 52 51 53 55 合 計 1822 1713 1696 1671 1739 1768 1298 1691 1723 1810
表 1—3 実測値 2C 3C 4C 5G 6C 7C 8C 9C 10C 11 C 成 分 名 厶 Val ALeu 厶 lie 厶 Phe 厶 Tyr 厶 Trp 厶 Lys 厶 His 厶 Pro
1 Giy Glycine 32 30 31 31 31 31 31 31 31 32
2 Ala Alanine 38 35 37 36 37 36 37 37 37 37
3 Ser Serine 45 42 44 44 44 44 44 44 44 45
4 Thr Threonine 99 93 97 95 96 95 96 97 97 98
5 Cys Cystine 48 44 46 46 46 46 46 46 49 46
6 Met Methionine 32 30 31 31 31 30 31 31 31 31
7 Gin Glutamine 472 439 463 455 462 458 467 463 458 465
8 Asn Asparagine 58 55 57 57 57 57 56 57 57 58
9 Glu Glutamic acid 63 59 62 62 61 62 63 62 62 64
10 Asp Aspartic acid 54 50 53 53 52 52 53 53 53 54
1 1 Val Valine - 91 95 94 95 94 95 95 95 97
12 Leu Leucine 109 - 106 105 106 105 107 107 106 108
13 lie Isoleucine 111 102 - 106 108 107 108 108 108 109
14 Phe Phenylalanine 71 ββ 69 - 69 68 72 69 69 70
15 Tyr Tyrosine 105 98 103 101 一 102 103 103 103 104
16 Trp Tryptophan 16 17 15 15 14 一 16 15 17 16
17 Lys Lysine 122 113 1 19 117 118 117 - 1 18 119 122
1 B Arg Arginine 75 71 73 73 73 73 73 - 74 75
19 His Histidine 32 30 33 31 32 32 32 31 - 32
20 Pro Proina 55 48 53 49 51 50 50 55 54 - 合 計 1636 1513 1588 1599 1582 1657 1582 1621 1662 1664
表 1—4
実測値 2D 3D 4D 5D 6D 7D 8D 9D 10D 11D 成 分 名 4XGIy 4XAIa 4XSer 4XThr 4XCys 4X et 4XGIn 4XAsn 4XGIu 4XAsp
1 Gly Glycine 130 一 ― 一 - 一 ― 一 一 一
2 Ala Alanine 一 147 - - 一 一 一 一 - -
3 Ser Serine 一 - 173 - - - 一 - 一 ―
4 Thr Threonine 一 ― - 378 ― ― 一 一 一 -
5 Cys Cystine ― 一 ― 一 192 - 一 ― ― -
6 Met Methionine 一 一 一 - 一 120 一 - 一 ―
7 Gin Qlutamine - - - - ― - 2163 - ― 一
8 Asn Asparagine - 一 - ― - 一 - 238 ― 一
9 Giu Glutamic Acid 一 一 一 一 - - 一 一 222 一
10 Asp Aspartic Acid ― ― ― ― ― 一 - - ― 223
11 Val Valine - - ― ― - 一 ― 一 ― 一
12 Leu Leucine - 一 一 一 - 一 一 一 一 -
13 lie Isoleucine 一 一 一 一 一 - - 一 - -
14 Phe Phenylalanine 一 - ― - - 一 一 ― ― 一
15 Tyr Tyrosine - ― 一 一 ― - 一 - ―
16 Trp Tryptophan - - - - 一 一 一 一 - -
17 Lys Lysine 一 一 一 - ― 一 一 - ― -
18 Arg Arginine - - - ― ― 一 一 - - ―
19 His Histidine - - - - 一 一 一 - 一 一
20 Pro Proline 一 - - 一 一 一 - - ― -
130 147 173 378 192 120 2163 23 & 222 223
表 1—5
実測値 2E 3E 4E 5E 6E 7E 8E 9E 10E 11E 成 分 名 4XVal 4XLeu 4Xile 4XPhe 4XTyr 4ΧΤπ 4XLys 4XArg 4XHis 4XPro
1 Gly Glycine 一 一 一 - 一 一 - - -
2 Ala Alanine - - ― - - ― - 一 一 ―
3 Ser Serine 一 - ― - 一 一 - - 一
4 Thr Threonine - 一 一 - 一 ― ― - - 一
5 Cys Cystine 一 一 ― - 一 - ― 一 - -
6 Met Methionine - - - 一 - 一 - 一 一
7 Gin Glutamine - ― - 一 - - - - - 一
8 Asn Asparagine - ― - 一 一 一 - - - 一
9 GIu Glutamic acid 一 一 一 一 - - ― - - 一
10 Asp Aspartic acid - 一 - 一 一 一 一 ― - 一
11 Val Valine 383 一 一 - 一 一 - 一 一 -
12 Leu Leucine - 414 - 一 一 - 一 一 - ―
13 lie Iso!eucine 一 一 413 ― 一 - - 一 一 一
H Phe Phenylalanine - 一 - 269 - 一 ― - 一 ―
15 Tyr Tyrosine ― ― - 一 403 - - - 一 一
16 Τ Tryptophan 一 一 - ― ― 59 ― - - -
17 Lys Lysine - 一 - 一 ― 一 436 - ― ―
18 Ai¾ Arginine 一 一 - 一 一 - - 283 一 -
19 His Histidine 一 一 - - ― 一 一 ― 121 一
20 Pro Proine 一 一 ― ― 一 一 一 - - 209 合 計 383 414 413 269 403 59 436 283 121 209
表 1—6 実測値 2F 3F 4F 5F 6F 7F 8F 9F 10F 1 1 F 成 分 名 10XGIy 10XA!a lOXSer 10XThr tOXCys lOXMet !OXGIn tOXAsn lOXGIu 10XAsp
1 G!y Glycine 322 - 一 - - - 一 ― - 一
2 Ala Alanine - 358 一 ― - 一 一 ― ― -
3 Ssr Serine 一 - 427 - ― ― 一 - ― 一
4 Thr Threonine 一 ― - 948 - 一 - - ― -
5 Cys Cystine 一 一 ― - 259 - - - 一 ―
6 Met Methionine - ― 一 ― - 275 一 - ― -
7 Gin Glutamine 一 - 一 - 一 一 4892 - - ―
8 Asn Asparagine - 一 - 一 - - 一 585 - 一
9 Glu Glutamic Acid ― - 一 一 - - - - 575 -
10 Asp Aspartic Acid 一 一 一 - - 一 ― ― 一 548
1 1 Val Valine - - - 一 - 一 - ― 一 -
12 Leu Leucine 一 ― 一 - 一 ― ― - ― 一
13 lie Isoteucine - 一 一 一 - - - - 一 一
14 Phe Phenylalanine 一 - 一 - - 一 一 ― 一
15 Tyr Tyrosine 一 ― 一 - - 一 - 一 一 ―
16 Trp Tryptophan ― ― ― 一 一 - ― - ― 一
1 7 Lys Lysine ― 一 一 一 - 一 - ― -
18 Are Arginine - ― - - - 一 一 ― ― -
19 His Histidine - 一 - 一 - 一 - ― - 一
20 Pro Proline 一 一 - 一 - - 一 一 一 一
322 358 427 948 259 275 4892 585 575 548
表 1 —Ί
実測値 2G 3G 4G 5Q 6G 7G 8G 9G 10G 11 G 成 分 名 10XVal lOXLeu 10XUe 10XPhe lOXTyr lOXTrp 10XLys lOXArg 10XHis 10XPro
1 Qly Glycine - 一 ― - - 一 - 一 - ―
2 Ala Alanine - - ― ― ― - - - 一 一
3 Ser Serine - 一 一 - - ― 一 - - 一
4 Thr Threonine - - - - - - - 一 一 ―
5 Cys Cystine - 一 - ― - ― - - - -
6 Met Methionine - - - ― - - - 一 ―
7 G!n Giutamine ― 一 - - ― - - - 一 -
8 Asn Asparagine - - 一 - - - - 一 - 一
9 Gtu Glutamic acid 一 ― - ― - - ― - 一 -
10 Asp Aspartic acid 一 一 一 - - - - ― - -
11 Val Valine 961 ― 一 - ― 一 一 - ― ―
12 Leu Leucine 一 1038 ― - ― - 一 - -
13 lie Isoleucine 一 ― 1036 一 一 - - - 一
14 Phe」 Phenylalanine ― 一 一 671 - 一 - - 一 -
15 Tyr Tyrosine 一 一 - - 818 - - 一 一 -
16 Trp Tryptophan - - 一 一 - 146 - - - -
17 Lys Lysine - 一 一 一 ― - 1149 一 - -
18 Arg Arginine 一 一 一 - 一 - ― 704 一 ―
19 His Histidine 一 - - 一 - - ― ― 306 -
20 Pro Proine 一 一 - 一 - -. ― 一 - 481 合 計 961 1038 1036 671 818 146 1149 704 306 481
表 1— 8
実測値 2H 3H 4H 5H 6H 7Η 8H 9H 10H 11H 成 分 名 BCAA AAA aAA bAA βΑΑ neAA sAA NH2AA Zero
1 Gly Glycine - 一 - ― 一 30 一 - ― -
2 Ala Alanine 一 - - 一 一 36 一 - -
3 Ser Serine - ― - - - 44 一 一 - -
4 Thr Threonine - 一 一 - 98 一 一 - 一 -
5 Cys Cystine - - ― 一 ― 47 45 - - 一
6 Met Methionine ― - 一 一 32 - 31 一 一 一
7 Gin G!u amine ― ― ― - - 452 ― 458 - -
8 Asn Asparagine - 一 ― 一 ― 54 - 60 ― 一
9 Glu Glutamic Acid ― 一 60 ― ― 60 ― - - 一
10 Asp Aspartic Acid - ― 53 - ― 52 一 - - ―
11 Val Valine 103 一 一 一 97 一 一 一 一 -
12 Leu Leucine 118 一 - 一 109 一 一 - - 一
13 lie Isoleucine 117 - 一 ― 109 ― - 一 ― ―
Figure imgf000019_0001
14 Phe Phenylalanine ― 69 ― ― 70 ― 一 一 一 一
15 Tyr Tyrosine 一 104 一 - ― 103 一 - 一 ―
16 Trp Tryptophan - 17 - 一 15 ― - 一 一 一
17 Lys Lysine 一 一 ― 120 120 - - 一 一 一
一 一 ― ― 00
18 Arg Arginine 75 一 73 一 一 一
19 His Histidine ― - - 31 32 一 一 - - -
20 Pro Proline 一 - - - 一 54 - 一 - - 合 計 338 191 113 226 682 1005 77 519 0 0
図 1において、 96穴マルチウエルプレートのゥエル 2 A及ぴ 3 Bに全ァミノ 酸を含有する Full培地を、 4 A〜 11 Aに Full培地からそれぞれ、 分岐鎖アミ ノ酸 [BCAA]、 芳香族アミノ酸 [AAA]、 酸性アミノ酸 [aAA]、 塩基性アミ ノ酸 [bAA]、 必須アミノ酸 [eAA]、 非必須アミノ酸 [n e AA]、 硫黄含有ァ ミノ酸 [S— AA]、 酸性アミノ酸の側鎖アミド含有アミノ酸 [NH2- AA]を抜 いた培地を、 2B〜1 1 Cに、 Full培地からそれぞれ、 G l y、 Al a、 S e r、 Th r、 Cy s、 Me t、 G l n、 As n、 G l u、 As p、 Va l、 L e u、 I l e、 Ph e、 Ty r、 Tr p、 Ly s、 Ar g、 H i s、 P r oを抜い た培地を、 2D〜： L I Eに、 G l y、 A l a、 S e r、 Th r、 Cy s、 Me t 、 G l n、 As n、 G l u、 As p、 Va l、 L e u、 I l e、 Ph e、 T y r 、 Tr p、 Ly s、 Ar g、 H i s、 P r oの各ァミノ酸のみを Full培地の 4 倍量含む培地を、 2F〜1 1Gに、 上記と同じ各アミノ酸のみを Full培地の 1 0倍量含む培地を、 2H〜9Hに、 それぞれ、 BCAA、 AAA、 a AA、 b A A、 eAA、 n eAA、 S— AA、 NH 2 -A Aのみを含む培地を、 10H〜1 1 Hに Zero培地を配置する。
実施例 2
(プレートを用いた肝細胞癌 Η4ΠΕ細胞における mTOR活性化の測定）
H4IIEは 10%FBS、 100U/ml penicillin^ 100/ g/ml streptomycinを含む DMEM 培地にて 37°C、 5 C02 incubatorで培養し、 プレートのサンプルで評価を行う前 日に、 血清を含まない培地に置換後一晚培養した。 翌 S PBS (-)にて 2回洗浄後 、 アミノ酸不含 DMEM培地 （Zero培地） に置換して 2時間 37°C、 5%C02 にて保温 後、 実施例 1のプレートのそれぞれの培地に置換した後、 37°Cにて 30分間さら に保温した。 その後、 PBS (-)にて 2回洗浄し、 氷上にて lysis buffer (50mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1% Triton X - 100, 120mM NaCl, 20mM NaF, 2mM Na3V04, 20mM β -glycerophosphate, 0.5mM DTT, protease inhibitor cocktail (Roche Biochemicals) ) 100 1を添加し、 5分間室温で振動させて細胞を溶解させた後 、 さらに氷上にて 15 - 30分静置した。 2500rpmにて 10分遠心した上清を細胞溶 解液として、 S6キナーゼのリン酸化を ELISA法にて測定した。 抗 S6キナーゼ 抗体 （ケミコン社） は coating buffer (0. 1M NaHC03 (pH9. 6) ) にて l g/mlに 希釈し、 50 ;u l/wellで ELISA plate (96穴、 COSTAR) に分注し、 一晚 4°Cにて静 置させた。 翌日 TBS - T (20mM Tris-HCl (pH7. 6) , 150mM NaCl, 0. 1% Tween - 20) にて 1回洗浄した後、 blocking buffer (5% ski丽 ilk/TBS) 100;/ 1を添カ卩し、 0. 5-1時間静置させた。 TBS- Tにて 1回洗浄した後、 細胞溶解液 40 1を添加し 、 さらにリン酸化 S6 kinase抗体希釈液 （終濃度 1 : 300希釈） を 20 1添加し、 2時間静置させた。 TBS- Tにて 3回洗浄した後、 200ng/ml Eu- labelled抗マウス IgG2a抗体を 50 1添カ卩し、 1時間静置させた。 TBS- Tにて 5回洗浄した後、 Enhancement solution を 100 μ 1加えて ARV0にて Euの時間分解蛍光を測定した 。 全種類のアミノ酸を含む培地を用いたときの S6キナーゼのリン酸化程度を 1 0 0としたときの、 プレートの各々の活性をプロットし、 図 2に示した。 この結 果は既に報告のある米澤らの結果 （FEBS Letters, 447； 303-306 (1999) ) とほ ぼ同様の傾向を示した。 すなわち、 肝細胞癌においては、 Leuを代表とする分岐 鎖ァミノ酸や Metが mTORの活性化に重要な役割を果たし、 このことから肝機能 を維持または向上させるための用途として有用である可能性を示している。 さら に、 肝細胞以外の種々の細胞において、 こうした細胞活性の指標を測定すること により特定のアミノ酸の医薬品や健康食品などへの有用な新規用途を見出すこと ができると考えられ、 このことからプレートの有用性は明白である。 産業上の利用可能性
本発明のプレートを用いることによって、 従来、 アミノ酸ごとに、 逐一アミノ 酸培地を取り替えながら実施していたスクリーニングを、 一挙に極めて効率的に 実施することが可能となった。 したがって、 本発明は、 アミノ酸又はアミノ酸グ ル プの生理活性や薬理活性のスクリーニングを画期的に省力化させた点で、 極 めて有用である。 本出願は、 2003年 11月 133に 3本で出願された特願 2003-384 64を基礎としており、 その内容は本明細書中に援用される。

Claims

請求の範囲
1 . プレートの各収容部に、 アミノ酸を全く含有しない培地、 全種類のァミノ 酸を含有する培地、 1種類のアミノ酸のみを含有する培地、 1種類のアミノ酸グ ループのみを含有する培地、 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸のみを除外 したアミノ酸を含有する培地、 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸グループ のみを除外したアミノ酸を含有する培地、 のいずれか 2つ以上の培地を配置した ことを特徴とするプレート。
2 . 培地の 1つがァミノ酸を全く含有しない培地であることを特徴とする請求 項 1に記載のプレート。
3 . 培地の 1つが全ァミノ酸を含有する培地であることを特徴とする請求項 1 に記載のプレート。
4 . アミノ酸を全く含有しない培地、 全種類のアミノ酸を含有する培地、 1種 類のァミノ酸のみを含有する培地、 1種類のァミノ酸グループのみを含有する培 地、 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸のみを除外したアミノ酸を含有する 培地、 全アミノ酸から 1種類のアミノ酸グループを除外したアミノ酸のみを含有 する培地、 の全てを配置したことを特徴とする請求項 1に記載のプレート。
5 . 1種類のアミノ酸のみを含有する培地が、 全種類のアミノ酸について存在 することを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のプレート。
6 . 1種類のアミノ酸のみを含有する培地が、 アミノ酸濃度の異なる 2つの培 地として存在することを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のプレー
7 . 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸を除外したアミノ酸を含有する培 地が、 全種類のァミノ酸について存在することを特徴とする請求項 1〜 6のいず れか 1項に記載のプレート。
8 . ァミノ酸グループが、 分岐鎖ァミノ酸、 芳香族ァミノ酸、 酸性ァミノ酸、 塩基性アミノ酸、 必須アミノ酸、 非必須アミノ酸、 S含有アミノ酸、 酸性アミノ 酸の側鎖アミド含有アミノ酸の各グループから選ばれることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載のプレート。
9 . 1種類のァミノ酸グループのみを含有する培地が、 分岐鎖ァミノ酸、 芳香 族アミノ酸、 酸性アミノ酸、 塩基性アミノ酸、 必須アミノ酸、 非必須アミノ酸、 S含有アミノ酸、 酸性アミノ酸の側鎖アミド含有アミノ酸の全種類のアミノ酸グ ループについて存在することを特徴とする請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の プレート。
1 0 . 全種類のアミノ酸から 1種類のアミノ酸グループのみを除外したァミノ 酸を含有する培地が、 分岐鎖アミノ酸、 芳香族アミノ酸、 酸性アミノ酸、 塩基性 アミノ酸、 必須アミノ酸、 非必須アミノ酸、 S含有アミノ酸、 酸性アミノ酸の側 鎖ァミド含有ァミノ酸の舍種類のアミノ酸グループについて存在することを特徴 とする請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載のプレート。
1 1 . 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載のプレートを用いて、 アミノ酸又 はアミノ酸グループの生理活性及ぴ Z又は薬理活性をスクリーニングする方法。
1 2 . 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載のプレートを用いてアミノ酸又は アミノ酸グループの生理活性及ぴノ又は薬理活性をスクリーニングし、 得られた データを解析して、 生理活性及び Z又は薬理活性に関与するアミノ酸又はアミノ 酸グループを特定する方法。
1 3 . 請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載のプレートの 1ないし複数種を組 み合わせたキット。
1 4 . 請求項 1〜1 0のいずれか 1項に記載のプレートの 1ないし複数種と、 培地溶解用の滅菌水、 緩衝液、 又は重曹水を組み合わせたキット。
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