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WO2005045006A1 - ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法 - Google Patents

ジペプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジペプチドの製造法 Download PDF

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WO2005045006A1
WO2005045006A1 PCT/JP2004/016710 JP2004016710W WO2005045006A1 WO 2005045006 A1 WO2005045006 A1 WO 2005045006A1 JP 2004016710 W JP2004016710 W JP 2004016710W WO 2005045006 A1 WO2005045006 A1 WO 2005045006A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
dna
microorganism
protein
dipeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2004/016710
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shin-Ichi Hashimoto
Kazuhiko Tabata
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Priority to KR1020067009536A priority patent/KR101250187B1/ko
Priority to CA2544207A priority patent/CA2544207C/en
Priority to CN2004800339547A priority patent/CN1882683B/zh
Publication of WO2005045006A1 publication Critical patent/WO2005045006A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism producing a peptide and a method for producing the peptide using the microorganism.
  • the present invention relates to a microorganism producing a peptide and a method for producing the peptide using the microorganism.
  • Dipeptides are important compounds for foods, pharmaceuticals, cosmetics, etc.
  • an extraction method from a natural product As a method for producing a dipeptide, an extraction method from a natural product, a chemical synthesis method, and an enzymatic method are known.
  • the types of dipeptides that can be produced are limited, and the content of the target dipeptide in natural products is low, resulting in poor productivity.
  • the synthesis of peptides by chemical synthesis protection and deprotection of functional groups are required, and racemates are also synthesized.Thus, chemical synthesis is economical and efficient. Absent.
  • the chemical synthesis method is not preferable in terms of environmental hygiene since a large amount of an organic solvent or the like is used.
  • thermostable aminosyl-t-RNA synthetase has a problem that it is difficult to inhibit the expression of the enzyme and the reaction of forming by-products.
  • the method using NRPS, D-Ala-D-Ala ligase and basilicin synthase does not have the above-mentioned problems, and can produce a peptide having a specific sequence.
  • it is not an efficient method because it requires an energy source such as ATP.
  • Escherichia coli has three systems that incorporate dipeptides [Chem. Biol., 5, 489-504 (1998), Microbiol., 145, 2891-2901 (1999) 3.
  • Genomic DNA information also confirms that microorganisms belonging to the genera Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, and Saccharomyces have three or more peptide incorporation systems.
  • the present invention relates to the following (1) to (21).
  • peptide uptake protein The activity of one or more peptides and a protein having one or more peptides uptake activity (hereinafter, also referred to as peptide uptake protein) is reduced or lost, and the peptide has the ability to produce peptides Microorganisms.
  • Peptidase has 80% or more homology with a protein having the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4, or with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 4
  • microorganism according to any one of (1) to (4), wherein the microorganism capable of producing a dipeptide is a microorganism capable of producing a protein described in any of the following [1] to [4]: At least one microorganism.
  • a protein comprising an amino acid sequence having at least 65% homology with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 19 to 25 and 68, and having a peptide synthesizing activity.
  • microorganism having the ability to produce dipetide is described in the above (6).
  • microorganism a microorganism belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Corynepacterium, or Saccharomyces.
  • microorganism capable of producing a dipeptide is a microorganism capable of producing a dipeptide from an L-amino acid ester and L-amino acid.
  • microorganism (10) The microorganism according to the above (9), wherein the microorganism capable of producing a peptide from an L-amino acid ester and an L-amino acid is a microorganism that produces proliminopeptidase.
  • the microorganism capable of producing a peptide from an L-amino acid ester and an L-amino acid is a microorganism that produces proliminopeptidase.
  • a microorganism capable of producing a dipeptide from an L-amino acid ester and an L-amino acid is a microorganism having a recombinant DNA in which DNA encoding a protein having proline iminopeptidase activity is linked to vector DNA.
  • microorganism according to any one of the above (9) to (11), wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Corynebacterium or Saccharomyces.
  • microorganism capable of producing a dipeptide is a microorganism capable of producing a dipeptide from L-amino acid amide and L-amino acid.
  • microorganism capable of producing a dipeptide from L-amino acid amide and L-amino acid is a microorganism that produces a protein having L-amino acid amide hydrolase activity.
  • a microorganism capable of producing a dipeptide from L-amino acid amide and L-amino acid is a recombinant DNA in which DNA encoding a protein having L-amino acid amide hydrolase activity and vector DNA are linked.
  • microorganism according to any one of the above (13) to (15), wherein the microorganism is a microorganism belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Corynepacterium, or Saccharomyces. .
  • a culture of a microorganism of any one of (1) to (8) or a processed product of the culture is used as an enzyme source, and the enzyme source and one or more amino acids are present in an aqueous medium;
  • a method for producing a dipeptide wherein the peptide is produced and accumulated in the icy medium, and the peptide is collected from the medium.
  • R 1 and R 2 represent the same or different amino acids.
  • a culture of the microorganism according to any one of the above (13) to (16) or a processed product of the culture is used as an enzyme source, and the enzyme source, L-amino acid amide and L-amino acid are contained in an aqueous medium.
  • a process for producing and accumulating diztide in the aqueous medium, and collecting the diptide from the medium is used as an enzyme source, and the enzyme source, L-amino acid amide and L-amino acid.
  • the processed product of the culture is a concentrated product of the culture, a dried product of the culture, cells obtained by centrifuging the culture, a dried product of the cells, a lyophilized product of the cells, Surfactant of the cells, ultrasonic treatment of the cells, mechanical grinding of the cells, solvent treatment of the cells, enzyme treatment of the cells, or the cells
  • the microorganism of the present invention has an ability to reduce or lose the activity of one or more peptides and a protein having one or more peptides uptake activities (hereinafter abbreviated as peptide uptake protein), and to produce a peptide. Or a microorganism in which the activity of three or more kinds of peptides is reduced or lost, and which has the ability to produce peptides.
  • the microorganism includes a gene encoding a peptidase (hereinafter abbreviated as a peptidase gene) and a gene encoding a peptide-incorporating protein (hereinafter referred to as a peptide) present on the genomic DNA of the microorganism.
  • a gene encoding a peptidase hereinafter abbreviated as a peptidase gene
  • a gene encoding a peptide-incorporating protein hereinafter referred to as a peptide
  • the fact that the activity of peptidase is likely to decrease means that the peptidase-degrading activity is lower than that of peptidase having no base deletion, substitution or addition as described above.
  • the peptide degrading activity of microorganisms is determined by coexisting a peptide serving as a substrate with microbial cells in an aqueous medium, performing a peptide degradation reaction, and measuring the amount of remaining peptide by a known method, for example, HPLC. Can be measured by quantification using the analytical method
  • More specific peptideases include, for example, PepA having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, PepB having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and PepB having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which are present in Escherichia coli.
  • PepD having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • PepN having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • GenBank AAC75946 PepQ (GenBank AAC76850), PepE '(GenBank AAC76991), PepT (GenBank AAC74211), Dcp (GenBank, AAC74611), and IadA (GenBank AAC77284), such as Bacillus' S. s' YjbG (GenBank Z991 10), YkvY (GenBank Z99111), YqjE (GenBank Z99116), YwaD (GenBank Z99123), etc.
  • BAB99013, BAB99598 And BAB99819 (both of which are registered numbers of Japan DNA Data Bank), such as proteins having the amino acid sequence represented by Saccharomyces cerevisiae, 0CT1 (GenBank NC_001143), SPC2 (GenBank NC_003 143), SPY2 rSaccharomyces genome database '(htt: // www. eastgenome. org /) accession no. L0Q02875] and YIM1 (GenBank NCJ01145), etc., and as dipeptidase, it is represented by arrangement numbers 1-4.
  • PepA, PepB, PepD and PepN having an amino acid sequence
  • PepQ, PepE and IadA can be mentioned.
  • BLAST A program called BLASTN or BLASTX has been developed [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)].
  • BLASTN A program called BLASTN or BLASTX
  • BLAST and Gapped BLAST programs use the default parameters of each program. Specific methods of these analysis methods are known (http: @ www.ncbi.nlm.nih.gov.).
  • decreased activity of a peptide-incorporating protein means that the peptide-incorporating activity is lower than that of a peptide-incorporating protein encoded by DNA having no base deletion, substitution or insertion as described above.
  • the peptide uptake activity of a microorganism is determined by coexisting the peptide serving as a substrate and the microbial cells in an aqueous medium, performing the peptide uptake reaction, and then knowing the amount of the peptide remaining in the aqueous medium. It can be measured by quantification by the method described above, for example, an analytical method using HPLC or the like.
  • the above-mentioned peptide uptake protein is a protein encoded by a gene that forms an operon on chromosomal DNA, and forms a complex on the cell membrane to express a dipeptide uptake activity, and as a single protein.
  • Any protein involved in the peptide uptake of microorganisms such as a protein having a peptide uptake activity, may be any protein, preferably a protein having a high peptide uptake activity.
  • More specific peptide uptake proteins include, for example, DppA having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and Escherichia coli having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • DppC having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7
  • DppD having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8
  • DppF ⁇
  • OppA having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • OppB GenBank AAC76568)
  • OppC GeneBank AAC76567
  • OppD GenBank AAC76566
  • OppF GeneBank AAC76565
  • YddO GenBank AAG74556
  • YddP GenBank AAC74557
  • YddQ GenBank AAC74558
  • SapC GenBank AAC74374
  • SapD GenBank AAC74373
  • SapF GenBank AAC
  • DppA (GenBank CAA40002), DppB (Ge nBank CAA40003), DppC (GenBank CAA40004), DppD (GenBank CAA40005), DppE (GenBank. GenBank CAA39791), AppA (GenBank CAA62358), AppB (GenBank CAA62359 '), AppC (GenBank CAA62360), AppD (GenBank CAA62356), AppF (GenBank CAA62357), YclF (GenBank CAB12175) and YkfD (GenBank CAB13157) BAB990'48, BAB99383, BAB99384, BAB99385, BAB99713.
  • OPTl GenBank NPJ12323
  • 0PT2 GenBank NP—015520
  • PTR2 GenBank CAA 82172
  • DppA, DppB, DppC, DppD, Dpp F having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOS: 5 to 9 and 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more of any amino acid sequence thereof Proteins having homology to the above can also be cited as peptide uptake proteins having high peptide uptake activity.
  • Amino acid sequence homology can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • microorganisms As a microorganism in which the activity of three or more peptidases is reduced or lost, the activity of any three or more peptidases is reduced or lost as long as the microorganism can grow normally.
  • Microorganisms can be mentioned, and preferably microorganisms in which the activity of 3 to 9 types, more preferably 3 to 6 types, and still more preferably 3 or 4 types of peptidases are reduced or lost. I can give it.
  • the peptidase include the peptidases and dipeptidases present in Escherichia coli, Bacillus subtilis, corynebacterium, Rimum gulmicum and Saccharomyces cerepiche described above. In addition, it is composed of an amino acid sequence having homology of 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more with any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4, and has a peptidase activity. Proteins can also be mentioned as proteins having dipeptide degrading activity.
  • Amino acid sequence homology can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • the microorganism having the ability to produce a dipeptide is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability to produce a dipeptide.For example, it has the ability to synthesize a dipeptide by condensing and linking one or more amino acids.
  • Microorganisms that produce proteins those that produce proteins that have the activity of synthesizing dipeptides from L-amino acid esters and L-amino acids, and that that produce proteins that have the activity of synthesizing dipeptides from L-amino acid amides and L-amino acids Microorganisms that can be used.
  • Microorganisms that produce proteins having the activity of synthesizing peptides by condensing and linking one or more amino acids include the group consisting of NRPS, D-Ala-D-Ala ligase, and basilicin synthase. Microorganisms that produce more selected proteins can be mentioned.
  • Microorganisms that produce NRPS include prokaryotes such as Bacillus, eukaryotes such as Penicillium, microorganisms that produce BacA, BacB and BacC (GenBank AF007865), TycA, TycB and TycC. (GenBank AF004835) -producing microorganism, PbAB (GenBank M57425) -producing microorganism, and BacA ⁇ BacB, BacC, TycA, TycB, TycCs, the amino acid sequence of any protein selected from PcbAB and 80% or more, preferably May include microorganisms having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more, and producing a protein having NRPS activity.
  • Microorganisms that produce D-Ala-D-Ala ligase include prokaryotic microorganisms that form peptide glycans, microorganisms that produce DdlA (GenBank accession no.ref. 67), and DdlB (GenBank accession no.AE000118). microorganisms, which produce DdlC (GenBank accession no. D88 151 ), and DdlA, in any of the amino acid sequence selected from the DdlB s DDLC, 1 or more amino acids are deleted, substituted or Tsukeka ⁇ the amino acid sequence And a microorganism that produces a protein having D-Ala-D-Al ligase activity.
  • Amino acid sequence homology can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • Microorganisms that produce bacillusin synthase include microorganisms belonging to the genus Bacillus, preferably Bacillus subtilis, Bacillus' Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, and Bacillus coagulans.
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Bacillus' Bacillus amyloliquefaciens Bacillus coagulans
  • Bacillus coagulans and Bacillus coagulans.
  • ⁇ Riquetinov Olmys Bacillus licheniformis, Bacillus' mega Terium (Bacillus megaterium), Bacillus pumilus (Bacillus pumilus), and the following ⁇ [1:]-[4],
  • microorganism that produces a protein selected from the group consisting of:
  • microorganisms that produce a protein having the activity of synthesizing a peptide from L-amino acid ester and L-amino acid include microorganisms that produce proline iminobeptidase, and specifically include Bacillus and Corynebacterium. Examples include microorganisms belonging to the genus Bacteria or Pseudomonas. Specifically, Bacillus 'Sachiris ATCC6633, Bacillus': Guylans EK01 [J.
  • microorganisms that produce proline iminopeptidase include proteins selected from the following [1] to [3],
  • a protein comprising an amino acid sequence having at least 80% homology with the amino acid sequence of any one of the above-mentioned [1], and having a proline iminopeptidase activity;
  • Microorganisms that produce proteins having the activity of synthesizing dipeptides from L-amino acid amides and L-amino acids include microorganisms that produce L-amino acid amide hydrolase.
  • microorganisms producing L-amino acid amide high 'proteins having a hydrolase activity include the proteins described in [1] or [2] below.
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having a dipeptide synthesizing activity can be obtained from Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ( (Hereinafter abbreviated to "Molecular”. Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biotechnology, John Wileyk Sons (1987-1997) (hereinafter "Current Protocols” in "Molecular” Biology Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34> 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431. Acad. Sci.
  • a protein having proline iminopeptidase activity and L-amino acid amide It can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding any one of the proteins having a drolase activity.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, it is a number that can be deleted, substituted or added by a well-known method such as the above-described site-directed mutagenesis, and is one to several tens. , Preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5. '
  • Protein having L-amino acid amide hydrolase activity 4 016710 One or more amino acids deleted, substituted or added in any of the amino acid sequences of white matter means that one or more amino acids have been deleted, substituted or added at any position in the same sequence. Is also good. .
  • amino acids to be substituted or added may be natural or unnatural.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-arginine, L-glucamine, L-gnoretamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-isocyanate, L-lysine , L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tributophane, L-tyrosine,: L-parin, L-cysteine, etc. Examples of amino acids that can be substituted with each other are shown below. Amino acids contained in the same group are mutually interchangeable.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, palin, norparin, alanine ⁇ 2-aminobutanoic acid, methionine, 0-methylserine, t-butylglycine, t-butylylalanine, cyclohexylalanine
  • Group B Aspartic acid, glumic acid, 'isosvalagic acid, isoglucamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosperic acid
  • Group D lysine, arginine, ordinine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid
  • Group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • the position at which one or more amino acids are deleted, substituted or added is not particularly limited as long as the protein having the amino acid sequence into which the mutation has been introduced has a peptide synthesis activity.
  • amino acid sequences represented by Nos. 19 to 25 and 68 are compared, amino acid residues that are not conserved in one or more amino acid sequences in the amino acid sequence can be mentioned.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amic acids are deleted, substituted or added, and a protein having a dipeptide synthesizing activity includes SEQ ID NO: 19
  • the homology is usually 65% or less.
  • a protein having homology an amino acid sequence of proline iminopeptidase or an amino acid of L-amino amide hydrolase Proteins having a homology of at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% with any amino acid sequence of the sequence can be mentioned.
  • the homology between the amino acid sequence and the base sequence can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 is a region conserved among proteins having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 19 to 25, and also has Ala-Ala ligase activity of various microorganisms. Region corresponding to the consensus sequence of a protein having
  • Microorganisms that produce proteins having peptide-synthesizing activity are also microorganisms that produce peptides.
  • Amino acid sequence homology can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • DNA encoding a protein having an activity of synthesizing a peptide by condensing and linking one or more amino acids, and a protein having an activity of synthesizing a dipeptide from an L-amino acid ester and an L-amino acid may be used.
  • Microorganisms that have recombinant DNA obtained by linking DNA and DNA that encode DNA or a protein that has the activity of synthesizing a dipeptide from L-amino acid amide and L-amino acid are also invented. Ming is a microorganism.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Corynebacterium or the genus Saccharomyces.
  • DNA encoding a protein having the activity of synthesizing a peptide by condensing and linking one or more amino acids includes NRPS, D-Ala-D-Ala ligase or bacillin synthase. Can be given.
  • Examples of the DNA encoding NRPS include a DNA encoding a protein selected from the group consisting of BacA, BacB, BacC, TycA, TycB, TycC and PcbAB.
  • DNA encoding D-Ala-D-Ala ligase examples include DNA encoding a protein selected from the group consisting of DdlA, DdlB and DdlC.
  • Examples of the DNA encoding the basilicin synthase include DNAs encoding the proteins described in the following [1] to [4];
  • DNA encoding a protein having a nucleotide sequence having 80% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 34 and having a peptide synthesizing activity. . ' DNAs encoding a protein having the activity of synthesizing a peptide from an L-amino acid ester and an L-amino acid include DNAs encoding the proteins described in the following [1] to [: 3]:
  • DNA encoding a protein having an activity of synthesizing a peptide from an L-amino acid amide and an L-amino acid a DNA encoding a protein according to the following [1] or [2],
  • [2] a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence of L-amino acid amide hydrolase described in WO03 / 010187, and having an L-amino acid amide hydrolase activity;
  • the DNA capable of hybridizing under the above-mentioned stringent conditions is defined as the colony-hybridization method, plaque-hybridization method using part or all of any of the above-mentioned DNA as a probe.
  • This refers to DNA obtained by using the shion method or the Southern plate hybridization method.
  • the method is to use a filter in which DNA derived from colonies or plaques is immobilized. After performing hybridization at 65 ° C.
  • the composition of a 1x concentration of SSC solution can be identified by washing the filter at 65 ° C under the conditions of 150 ° C, consisting of sodium chloride and sodium citrate. To give Kill. 'Hybridization is molecular. Second edition, current' protocols 'in' molecular 'biology, DNA Cloning 1: Core' Techniques, A Practical Approach, Second Edit ion, Oxford University ( 1995)) and the like. Specific examples of the hybridizable DNA include those described above such as BLAST and FASTA. When calculated using a program and based on the above parameters, at least 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology to any one of the above DNA base sequences. Can be given. .
  • a DNA that hybridizes with the above-described DNA under stringent conditions is a DNA that encodes a protein having a peptide synthesizing activity
  • a recombinant DNA expressing the DNA is prepared, and the recombinant DNA is prepared.
  • Nucleotide sequence homology can be determined using a program such as BLAST or FASTA described above.
  • the microorganism of the present invention includes: 1) a microorganism in which the function of one or more peptidases and one or more proteins having peptide uptake activity is reduced or lost, or the function of three or more peptidases is reduced or reduced.
  • a method for imparting dipeptide-producing ability to a lost microorganism or 2) a microorganism having the ability to produce a dipeptide, a) one or more peptidase and one or more peptide-incorporating proteins, or b) It can be obtained by any method of reducing or losing the function of three or more peptide enzymes.
  • microorganism in which the activity of peptidase or peptide-incorporating protein has been reduced or lost, as long as the microorganism can be obtained. It can be obtained by introducing a deletion, substitution or addition of a base into a peptidase gene or a peptide uptake protein gene of chromosomal DNA of a microorganism.
  • Examples of a method for introducing a base deletion, substitution, or addition of a base into the chromosomal DNA gene of a microorganism include a method utilizing homologous recombination.
  • a mutant gene into which a base deletion, substitution or addition has been introduced can be used to transform a mutant gene having a drug resistance gene which cannot replicate autonomously in a host cell into which a base deletion or the like is to be introduced.
  • a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with a plasmid DNA can be used.
  • a transformant having the plasmid for homologous recombination integrated on the chromosomal DNA by homologous recombination is selected using drug resistance as an index. .
  • the transformant After culturing the obtained transformant for several hours to one day in a medium not containing the drug, the transformant is applied to the drug-containing agar medium and the drug-free agar medium, and does not grow on the previous medium. By selecting a strain that can grow on the medium, a strain in which the second homologous recombination has occurred on chromosomal DNA can be obtained.
  • Microorganisms capable of introducing a base deletion, substitution or addition into a target gene on chromosomal DNA by the above method include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Corynebacterium or Saccharomyces. Can be given.
  • a method of incorporating linear DNA containing a gene into which a base deletion, substitution or addition is to be introduced into a cell and causing homologous recombination between the chromosomal DNA and the introduced linear DNA is.
  • This method can be applied to any microorganisms that efficiently take up linear DNA, and preferred microorganisms are microorganisms belonging to the genus Escherichia or Bacillus, more preferably Escherichia coli, and Preferable examples include E. coli expressing a group of recombinant proteins derived from phage (Red recombination system).
  • Escherichia coli expressing the ARed recombination system we have the plasmid DNA pKD46 [available from Escherichia coli Escherichia coli Stock Center (Yale University, USA)], which is a plasmid DNA containing the Red recombination gene. Escherichia-coli JM101 strain and the like.
  • DNA located at both ends of the above-described linear DNA and located outside both ends of the region to be substituted or deleted on the chromosome DNA or DNA having homology with the DNA is a linear DNA.
  • the DNA is arranged in the same direction as the direction on the chromosomal DNA, and its length is preferably about 1 to 100 bp, more preferably about 20 to 50 bp, and still more preferably about 30 to 4 Obp.
  • the nucleotide sequence recognized by yeast-derived Flp recombinase is not particularly limited as long as the protein recognizes and catalyzes homologous recombination, but is preferably a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39. And DNA having a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted or added in the DNA, and having a base sequence that recognizes yeast-derived Flp recombinase and catalyzes homologous recombination. be able to.
  • the DNA having homology is DNA having such an identity that the above linear DNA has homologous recombination in a target region on chromosomal DNA, and specific homology is as follows. % Or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and even more preferably 100% homology.
  • the linear DNA fragment can be prepared by PCR.
  • the target linear DNA can be obtained by treatment with a restriction enzyme.
  • 'Methods for introducing a base deletion, substitution or addition into the chromosomal DNA of a microorganism include the following methods 1-4.
  • Method 1 Transformant in which the linear DNA of (a) or (d) above was introduced into a host microorganism, and the linear DNA was inserted into the chromosomal DNA by homologous recombination based on drug resistance. How to choose. _ ⁇
  • [2;] has homology to DNA located outside the both ends of the target region of substitution or deletion on chromosomal DNA: synthesizes DNA linked to DNA in the same direction on chromosome DNA And introducing the transformant obtained in the above [1],
  • the transformant that has been subjected to the operation of [2] above is cultured under conditions in which a gene that can be used for negative selection is expressed, and a strain that can grow in the culture is identified as a drug-resistant gene and a negative selection.
  • a method in which a gene that can be used for the above is selected as a strain that has been deleted from the chromosomal DNA.
  • any method for introducing DNA into the microorganism can be used, for example, a method using calcium ions (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69. 2110 (1972)], protoblast method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 63-248394), electrolysis method [Nucleic Acids Res ,, 16, 6127 (1988)] and the like. 'be able to.
  • Chromosomal DNA of a microorganism belonging to the genus A primer DN that can be designed based on the Southern hybridization method for the A library or the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOS: 26 to 32, 64 and 6'5. And PCR using A as the type III chromosome DNA of a microorganism belonging to the genus Bacillus [PCR Protocols, Academic Press (1990)].
  • nucleotide sequence of the DNA encoding the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 19 to 25, 33 and 68 with respect to various gene sequence databases is 65% or more, preferably 80% or more, More preferably, a sequence having a homology of 90% or more, more preferably 95% or more is searched, and based on the base sequence obtained by the search, a chromosomal DNA, cDNA library, etc. of an organism having the base sequence is obtained. Can also obtain DNA encoding a protein having the activity of synthesizing a dipeptide by the method described above. ⁇
  • the obtained DNA is used as it is or after being cut with an appropriate restriction enzyme or the like, assembled into a vector by a conventional method to obtain a recombinant DNA, and the recombinant DNA is introduced into Escherichia coli.
  • a plasmid DNA is extracted from the transformant obtained by the above method, and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, a dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, U, 5463 (1977)] or 373 ⁇ DNA sequencer is used.
  • Bases such as (Pakkin 'Elma') By performing analysis using a sequence analyzer, the base sequence of the! NA can be determined. .
  • the obtained DNA has a partial length as a result of the nucleotide sequence determination, obtain the full-length DNA by the Southern hybridization method for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe. can do.
  • the objective DNA can be prepared by chemical synthesis using a Perceptive's Biosystems 8905 type DNA synthesizer or the like; .
  • Examples of the DA obtained as described above include, for example, DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 26 to 32, 64, and 65.
  • Examples of the vector incorporating the DNA include pBscript II KS (+) (Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp S (+) PT7Blue (manufactured by Novagen), pCR II (manufactured by Invitrogen), pCR-TRAP (manufactured by Jinhan Yuichi) and the like.
  • Escherichia coli examples include, for example, Escherichia coli XIA-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli K1 KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli M. Escherichia 'Kori JM109, Escherichia' Kori HB101, Escherichia 'Kori No.
  • Any method for introducing the recombinant DNA can be used as long as it is a method for introducing the DNA into the host cell described above.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • the elect-port method ("Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)").
  • microorganism having A examples include Escherichia coli 'Thigh 522 / pPE43, which is a microorganism having a recombinant DNA containing DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 19 described below. (b) Production of a protein having a peptide synthesis activity
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding a protein having a dipeptide synthesizing activity is prepared, if necessary. Further, by substituting the nucleotide sequence of the portion encoding the protein so that the nucleotide sequence becomes an optimal codon for expression in the host, the production rate of the protein can be improved.
  • a recombinant DNA is prepared by inserting the PNA fragment downstream of an appropriate expression vector promoter.
  • a transformant producing a protein having a peptide synthesizing activity By introducing the recombinant DNA into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing a protein having a peptide synthesizing activity can be obtained.
  • a host cell any microorganisms such as bacteria and yeast that can express the gene of interest can be used.
  • the expression vector contains a promoter V at a position capable of autonomously replicating in the above-mentioned host cells, or capable of integrating into a chromosome, and transcribing DNA encoding a protein having dipeptide synthesis activity. Are used.
  • a recombinant DNA having a DNA encoding a protein having a peptide synthesizing activity is capable of autonomous replication in a prokaryote and also has a promoter. It is preferably a recombinant DNA comprising a ribosome binding sequence, a DNA encoding a protein having a dipeptide synthesis activity, and a transcription termination sequence. A gene that controls the promoter every night may be included.
  • pBTrp2 As expression vectors, pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (both manufactured by Boehringer Mannheim), pHelixl (manufactured by Roche Diagnostics), K233-2 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), PSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (
  • Any promoter may be used as long as it functions in a host cell such as Escherichia coli.
  • tr promoter evening one P ⁇
  • lac promoter Isseki one p lac
  • P R promoter Isseki one one such P SE promoter Isseki, the Eshierihia 'coli Ya phage, etc.
  • P ⁇ lac promoter Isseki one
  • P R promoter Isseki one
  • P SE promoter Isseki the Eshierihia 'coli Ya phage, etc.
  • From Promo Yuichi SP01 Promo Yoichi, SP02 Promo — Yuichi, penP Promo Yoichi, etc.
  • artificially designed and modified promoters such as Promoter, tac promoter, lacT7 Promoter, let ' ⁇ promoter in which two P trps are connected in series can also be used.
  • Promoters include xylA promoter for expression in Bacillus bacteria [Appl. Microbiol. Biotechnol., 594-599 (1991)] and P54 for expression in Corynebacterium bacteria. -6 Zuromo Ichiichi [Appl. Microbiol. Biotechnol,, 53,
  • a transcription termination sequence is not always necessary, but the transcription termination sequence should be located immediately below the structural gene. Is preferred.
  • Prokaryotes to be used as host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus, or Corynebacterium, such as Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, and Escherichia coli DH5.
  • any method can be used as long as the DNA is introduced into the host cell described above.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 69> 2110 (1972) ']
  • protoplast method JP-A-63-248394
  • electrification method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], and the like.
  • YEpl3 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • pHS19, pHS15 and the like can be used as expression vectors.
  • Any promoter may be used as long as it functions in a strain belonging to the genus Lomyces.
  • PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter One one for ADH Promo, one for gal 1 Promo, one for gal 10 Promo, one for Human Shock Polypeptide Promo, one for MF «1 Promo, one for CUP One Promo for one night I can give you one.
  • any method for introducing the recombinant DNA any method can be used as long as it introduces DNA into yeast ⁇ , for example, electroporation [Methods Enzyraol., 194, 182 (1990)], targetoplasm Natl. Acad. Sci., USA, 81, 889 (1984)], lithium acetate method [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] and the like.
  • the function of a microorganism capable of producing a dipeptide is as follows: a) one or more peptidases and one or more peptide uptake proteins; or b) three or more peptidases. How to lower or lose
  • a microorganism having an ability to produce a dipeptide By performing the method (ii) of the above (1) using an arbitrary microorganism as a host cell, a microorganism having an ability to produce a dipeptide can be produced.
  • one or more peptide Microorganisms with reduced or lost function of the enzyme and one or more peptide-incorporating proteins or three or more peptides, and having the ability to produce peptides By performing the method (ii) of the above (1) using an arbitrary microorganism as a host cell, a microorganism having an ability to produce a dipeptide can be produced.
  • a microorganism having an ability to produce a peptide as an intrinsic property can produce the microorganism of the present invention by performing the method (1) (i) on the microorganism.
  • microorganisms examples include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Bacillus, Corynepacterium or —Saccharomyces, and more preferably, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium 'Guryu micum and Sao Karomyces' Celebiche and others.
  • one or more amino acids used for the substrate preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably one or more amino acids used for the substrate, preferably
  • L-amino acids include L-alanine (L-Ala), L-glutamine (L-Gln), L-glutamic acid (L-Glu), L-valine (L-Val), L-leucine (L -Leu), L-isoleucine (L-Ile), L-proline (L- Pro), L-phenylalanine (L-Phe), L-tryptophan (L-Trp), L-thionine
  • L-Met L-serine (L-Ser), L-threonine (L-Thr), L-cystine (L-Cys).
  • L-asparagine L-Asn
  • L-tyrosine L-Tyr
  • L-lysine L-Lys
  • L-arginine L-Arg
  • L-histidine L-His
  • L-aspartic acid L-Asp
  • L-hydroxyaminobutyric acid L- ⁇ - ⁇
  • L-azaserine (L-Azaserine) L-theanine (L-theanine), L-4-hydroxyproline (L-4-HYP), L-3-hydroxyproline (L-3-HYP)
  • L-ornithine L-Orn
  • L-citrulline L-Cit
  • L-6-diazo-5-oxonorleucine L-6-diazo-5-oxo-norieucine
  • More preferred amino acids used in the production method (i) are L-Ala, Gly, L-Met, L-Ser, L-Thr, and L-Ala , L-Gln, L-Glu ⁇ Gly, L-Vals L-Leu, L-Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met ⁇ L-Ser ⁇ L-Thr ⁇ L-Cys, L-Asn ⁇ L-Tyr ⁇ L-Lys ⁇ L-Arg ⁇ L-His ⁇ L-Asp ⁇ L-H-AB,-Ala, L-Azaserih e, L-theanines L-4-HYP, L-3 -HYP, L-Orn-L-Cit and L-6-diazo-5-oxo-norieucine, one combination of amino acids, L-Gln and L-Phe, and L-H-P Combination of AB and L-Gln, L-Arg or L-H
  • the amino acid used as a substrate is added to the aqueous medium for the first time or during the reaction so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L.
  • the dipeptide produced by the production method of the above (i) includes the following formula (I)
  • R 1 -R 2 (e) (Wherein, R 1 and R 2 represent the same or different amino acids).
  • R 1 and R 2 are the same as each other.
  • R 1 Is L-Ala, Gly, L-Met, 'L- Ser, L-Thr or /?-Ala
  • R 2 is L-Gln, L-Glu ⁇ Gly ⁇ L-Val, L-Leu, L -Ile, L-Pro, L-Phe, L-Trp, L-Met, L-Ser s L-Thr s L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys s L-Arg, L-His , L-Asp s L- a -AB , -?
  • L- Azaserine ⁇ L-theanine ⁇ L-4- HYP ⁇ L-3-HYP L-Orn or dipeptide can be mentioned a L-6- diaz ⁇ -5- oxo-norleucine, and still more preferably, when R 1 is L-Ala, R 2 is L- Gln, Gly ⁇ L- VaU L-Leu, L-Ile, L-Phe, L-Trp, L-ffet ⁇ L-Ser, L-Thr ⁇ L-Cys, L-Asn, L-Tyr, L-Lys, L-Arg, L-His s L- ⁇ - ⁇ , L-Azaserine or L-theanine dipeptide, R 1 is Gly, R 2 is L-Gln, Gly, L-Trp, L-Met, L -Ser, L-Thr, L- Cys , L-Tyr, L-Lys, L-Arg or L- Fei - If
  • a compound capable of producing ATP by metabolizing the microorganism of the present invention for example, a sugar such as glucose, ethanol, Alcohols such as toluene, organic acids such as acetic acid, and the like can be added in an aqueous medium.
  • the L-amino acid ester and L-amino acid used for the substrate include L-amino acid ester and L-amino acid that can be used by the microorganism of the present invention to produce a dipeptide. If any, any!
  • the J -amino acid ester and the L-amino acid may be used in any combination.
  • the L-amino acid ester is an L-alanine ester, a glycine ester, an L-valine ester, or an L- ⁇ r soleucine Esters, L-methionine ester, L-phenylalanine ester, L-serine ester, L-threonine ester, L-glutamine ester, L-tyrosine ester, L-arginine ester, L-aspartate monoester, L L-Spargicic acid-/?-Ester, L-leucine ester, L-asparagine: t-ster, L-lysine ester, L-aspartic acid mono-,?
  • L-Dimethyl ester and L-luminamine-ester L-amino acid ester selected from the group consisting of L-amino acids, L-Gln, L-Asn, Gly, L-Ala, L-Leu, L-Met, L-Pro, L-Ph e, L-Trp, L-Se r, L-Thr ⁇ L-Tyr ⁇ L-Lys, L-Arg, L-His and L-Glu it can.
  • the L-amino acid ester and the L-amino acid used as the substrate are initially or in the middle of the reaction in an aqueous medium so as to have a concentration of 0.1 to 500 g / L, preferably 0.2 to 200 g / L. Add the sauce.
  • the L-amino acid amide and the L-amino acid used for the substrate include an L-amino acid amide and an L-amino acid that can be used by the microorganism of the present invention to produce a dipeptide.
  • an amino acid any L-amino acid amide and L-amino acid may be used in any combination.
  • the L-amino acid amide is selected from the group consisting of L-alaninamide, glycine amide and L-aspartic acid amide.
  • L-amino acid amide selected, where L-amino acid is L-Gln, L-Asn, Gly, L-Ala ⁇ L-Val L-Leu, L-lie ⁇ L-Met, L-Pro, L- ' L-amino acids selected from the group consisting of Phe, L-Trp, L-Ser, L-Thr, L-Tyr L-Lys, L-Arg, L-His and L-Glu can be mentioned.
  • a surfactant or an organic solvent may be added to the aqueous medium.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene octadecylamine (eg, Nimin S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium, promidealkyldimethyl, benzylammonium.
  • Cationic surfactants such as chloride (eg, Cation F2-40E, manufactured by NOF Corporation), anionic surfactants such as lauroyl sarcosine, alkyl dimethylamine (eg, tertiary amine FB, NOF Corporation) Any of tertiary amines, such as tertiary amines, may be used as long as they promote the production of dipeptides, and one or more of them may be used in combination. Surfactants are usually used at a concentration of between 0.1 and 50 g. Examples of the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, azetone, ethyl acetate, and the like.
  • Examples of the processed product of the culture include a concentrate of the culture, a dried product of the culture, cells obtained by centrifuging the culture, a dried product of the cells, a lyophilized product of the cells, and a lyophilized product of the cells.
  • the processed product of the culture of the present invention may be a processed product obtained by subjecting the above cells to a surfactant treatment, ultrasonic treatment, mechanical attrition treatment, solvent treatment, enzymatic treatment, or the like, to insolubles, etc.
  • the crude protein extract obtained by removing the above is also included.
  • the amount of the enzyme source varies depending on the specific activity of the enzyme source and the like. Add 5 to 1000 mg, preferably 10 to 400 mg per mg of ter or L-amino acid amide.
  • the peptides generated and accumulated in the aqueous medium are collected by the usual method using activated carbon or ion-exchange resin, or by extraction with organic solvents, crystallization, thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography, etc. be able to.
  • production methods (ii) and (iii) can be performed according to the description in TO 03/010189 or WO 03/010187.
  • EXPERIMENTAL EXAMPLE 1 Construction of a Bacillus subtilis-derived l gene expression plasmid.
  • a Bacillus subtilis Mfijfi gene fragment was obtained as follows.
  • Primer A is a nucleotide sequence containing a region in which the initiation codon (atg) of the l gene has been replaced with an I 'recognition sequence (cc ⁇ Sg).
  • Primer B is a nucleotide sequence containing a region in which the stop codon of I_ has been replaced with an IHI recognition sequence (gg tcc).
  • Bacillus subtilis chromosome PCR was performed using DNA as type III, and primers A and B as a set of primers. PCR was performed using a reaction containing 0.1 zg of chromosomal DNA, 0.5 mol / L of each primer, 2.5 units of DNA polymerase, 4 L of X10 buffer for Pfu DNA polymerase, and 200 mol / L of each dNTP. A 40 L solution was prepared, and the process was repeated 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 3 minutes.
  • the 180 volume of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and about 1.
  • the amplified DNA is digested with restriction enzymes l and SHI, DNA fragments are separated by agarose gel electrophoresis, and the GeneClean II kit (B
  • the 1.4 kb DNA fragment and 3.4 kb DNA fragment containing the l gene obtained above were ligated by reacting at 16 ° C for 16 hours using a ligation kit (Takara Shuzo).
  • Escherichia coli 522 strain manufactured by Stratagene was transformed by a method using force ion (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)).
  • the transformant was spread on an LB agar medium containing 50 zg / inL of ampicillin, and then cultured overnight at 30 ° C. ,
  • a plasmid was extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with a known method to obtain pQE60ywfE, an expression vector for the 'C-terminal His-tagged l-gene.
  • the structure of the vector was confirmed by restriction enzyme digestion '(FIG. 1).
  • the Escherichia coli '522 / pQE60ywfE strain carrying pQE60ywfE was inoculated into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 zg / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C for 17 hours. After contacting the culture with a 250 ml triangular flask containing 50 ml of LB medium containing 50 / g / ml ampicillin and culturing at 30 ° C for 3 hours, the final concentration is 1 tmol / L.
  • IPTG isopropyl 1 /?-1 D-thiogalactopyranoside
  • reaction product was analyzed in the same manner as in (i) above, and 5.2 g / L of glycyl-L-phenylalanine (Gly-L-Phe) or 1. lg / L was added to the reaction mixture. It was confirmed that glycyl_L_methionine (Gly-L-Met) was produced and accumulated.
  • the reaction was performed at 7 ° C for 16 hours. After the completion of the reaction, the reaction product was analyzed by HPLC, and it was confirmed that the dipeptide shown in Table 1 had been produced.
  • the cells were inoculated and cultivated at 30 ° C for 1B.
  • the chromosomal DNA of the microorganism was isolated and purified by a method using a saturated phenol described in Current “Protocols in” Molecular Biology.
  • primers C, D and I DNAs having the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 37 and 38 (hereinafter, primers C, D and I, respectively) were obtained. Synthesized.
  • Primer C is the sequence of the region including the upstream of the start codon of the chromosome DNA gene of Bacillus' subtilis 168 strain.
  • Primer-D is a sequence that is complementary to a sequence that includes downstream from the stop codon of the ywfE gene.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA as type I and the above primers C and B as the set.
  • PCR 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 ⁇ mol / L of each primer, 2.5 units of Bin DNA polymerase, / L of Pfu DNA polymerase x 10 buffer, 200 / mol / L
  • a reaction solution (40 ⁇ L) containing each dNTP was prepared, and the process was repeated 30 times at 94 ° C. for 1 minute, at 55 ° C. for 2 minutes, and at 72 ° C. for 3 minutes 30 times.
  • reaction solution 180 g was subjected to agarose gel electrophoresis, and after confirming that a fragment of about 1.4 kb corresponding to the ywfE gene fragment had been amplified, an equivalent amount of TE-saturated phenol / The black-mouthed form solution was added and mixed.
  • the upper layer obtained by centrifuging the solution was mixed with 2 volumes of cold ethanol and allowed to stand at -80 ° C for 30 minutes.
  • the DNA precipitate obtained by centrifuging the solution was dissolved in 20 / L of TE.
  • the Escherichia coli 522 strain was transformed using the reaction solution by a method using calcium ions, applied to an LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin, and cultured at 30 ° C. overnight.
  • Plasmids were extracted from the thus grown colonies of the transformant in accordance with a known method, and their structures were analyzed using restriction enzymes, whereby pYWFEl (a plasmid containing a gene corresponding to the l gene) was obtained.
  • a gene corresponding to the l gene derived from Bacillus pumilus NRRL B-12025 (DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64) was obtained as follows.
  • the chromosome DNA of the NRRL B-1225 strain prepared as described above was transformed into type III, and a PCR was carried out using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 66 and 67 as a primer set.
  • PCR 0.1 / g chromosomal DNA, 0.5 zmol / L of each primer, 2.5 units of Z-taq polymerase (Yukara Bio Inc.), 5 zL of Z-taq polymerase x10 buffer
  • Z-taq polymerase Yukara Bio Inc.
  • 5 zL of Z-taq polymerase x10 buffer Prepare 50 zL of a reaction solution containing 200 Zfflol / L of each dNTP (Yukara Bio Inc.), and repeat the process at 98 ° C for 5 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 1 minute 30 times. Went by
  • the 0.8 kb fragment derived from the chromosomal DNA of each strain obtained above and pGEM T-easy (manufactured by Promega) were ligated by performing a reaction at 16 ° C. for 16 minutes using a Leigeshort kit.
  • the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 / g / ml ampicillin, and cultured at 30 ° C overnight. .
  • Plasmids were extracted from the transformant obtained above and the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment of about 0.8 kb was determined. As a result, nucleotide numbers 358 to 11 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64 were determined. A nucleotide sequence consisting of No. 60 was confirmed.
  • the chromosomal DNA of the NRRL B-12025 strain is completely digested with IHI, ECORK Hindi II Kpn Pstl, Sacl, Sall and il, respectively, and the DNA is cut by agarose gel electrophoresis. After the pieces were separated, they were transferred to a nylon membrane plus charge (manufactured by Roche's Diagnostics) according to a conventional method.
  • PCR consisted of 10 ng of purified DNA, 0.5 zmol / L of each primer, 2.5 units of pyrobest polymerase (Yukara Bio Inc.), 5 ⁇ L of X10 buffer for pyrobest polymerase (Yukara Bio Inc.) Prepare a 50 / L reaction mixture containing 200 mol / L of each dNTP, and repeat the process 30 times at 98 ° C for 5 seconds, at 55 ° C for 30 seconds, and at 72 ° C for 3 minutes 30 seconds 30 times This was done by:
  • the DNA fragment obtained above and a Zero Blunt PCR Cloning Kit (manufactured by Invitrogen) were ligated using a Reigesion kit. After transforming the Escherichia coli 522 strain using the reaction solution by a method using calcium ions, apply it to an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml ambicilin, and culture at 30 ° C overnight. did.
  • Plasmids were extracted from colonies of the grown transformants in accordance with a known method, and their structures were analyzed using restriction enzymes, whereby plasmid pYWFElO containing the gene corresponding to the gene (derived from NRRL B-1225 strain, It was confirmed that DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 64) was obtained.
  • the base sequence of each gene corresponding to the L gene contained in pYWFEl to pYWFE10 obtained above was determined using a base sequence analyzer 373 ⁇ ⁇ DNA sequencer.
  • amino acid sequence of the protein encoded by the genes contained in pYWFEl, pYWFE6 and pYWFE7 was identical to the amino acid sequence of the protein encoded by the i_ gene, except that pYWFE2, pYWFE3, pYWFE4, pYWFE5 s pYWFE8,
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the genes contained in pYWFE9 and pYWFElO was different from the amino acid sequence of the protein encoded by the L gene. .
  • amino acid sequence of the protein encoded by the gene corresponding to the i gene contained in WFE7 is represented by SEQ ID NOS: 20 to 25, 68 and 19, and the nucleotide sequence of the gene is represented by SEQ ID NOs: 27 to 32, 6 5 and 2 6 show it respectively.
  • PCR was performed using 0.1 ⁇ g of chromosomal DNA, 0.5 zmo 1 / L of each primer, 2.5 units of Efi DNA polymerase, £ in DNA polymerase—X10 buffer for enzyme, 200 mol / A reaction solution (40 zL) containing L of each dNTP was prepared, and the process was repeated 30 times at 94 ° C for 1 minute, at 55 ° C for 2 minutes, and at 72 ° C for 3 minutes 30 times.
  • PCR was carried out under the same conditions as above using DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 69 or 70 as a primer set. went. 1/10 volume of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and after confirming that a DNA fragment of about 1.4 kb corresponding to the fragment had been amplified, TE-saturated phenol of the same volume as the remaining reaction solution was used. / Formula solution was added and mixed. The mixture was centrifuged to obtain an upper layer, to which two volumes of cold ethanol was added, mixed, and left at -80 ° C for 30 minutes. The DNA precipitate obtained by centrifuging the solution was dissolved in 20 ⁇ L of TE.
  • a 1.4 kb DNA fragment and a 3.4 kb DNA fragment containing the gene corresponding to the l gene of Bacillus subtilis 168 obtained above were reacted at 16 ° C for 16 hours using a ligation kit. Connected.
  • the reaction solution was used to transform 522 strains of Escherichia coli by the method using calcium ion, and then spread on an LB agar medium containing 50 zg / ml ampicillin, followed by culturing at 30 ° C.
  • Plasmids were extracted from colonies of the grown transformants in accordance with a known method, and their structures were analyzed using restriction enzymes, whereby pQE60ywfEl (a C-terminal His addition-type gene expression vector) was obtained.
  • Escherichia obtained above Inoculate the coli NM522 / pQE60 wfEl ⁇ 5222 / pQE60ywfE10 strain into a large test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 zg / ml of ampicillin at 28 ° C. Culture was performed for 17 hours. The culture was diluted with 50 ml of L containing 50 g / ml of ampicillin. Inoculate a 250 ml Erlenmeyer flask containing medium B, incubate at 30 ° C for 3 hours, add IPTG to a final concentration of 1 ol / L, and further incubate at 30 ° C for 4 hours did. The His-tagged recombinant enzyme was purified from the wet cells obtained by centrifuging the culture solution using HisTrap according to the manufacturer's instructions.
  • DNAs having the sequences of SEQ ID NOs: 60 to 63 (hereinafter referred to as Primer E, Primer F, Primer G, Primer H) was synthesized.
  • the sequence of SEQ ID NO: 60 is obtained by adding a sequence containing a l-recognition sequence to the 5 'region of the region containing the Shine-Dalgarno sequence, which is the liposomal binding sequence of ywfE of the plasmid pQE60ywfE.
  • the sequence of SEQ ID NO: 61 is a sequence complementary to the sequence containing the stop codon of ywfE, with the sequence containing the ⁇ recognition sequence added to 5 ′.
  • the sequence of SEQ ID NO: 62 is obtained by adding a sequence containing a recognition sequence to the 5 'of the sequence of the trp promoter region of the expression vector pTrS30 containing the trp promoter.
  • the sequence of SEQ ID NO: 63 is a sequence complementary to the sequence of the promoter region of the expression vector of pTrS30, including the promoter vector, to which a sequence containing the l-recognition sequence is added.
  • Plasmid pQE60ywfE was used as a primer. Primers E and F described above were used to amplify the fragment, and primers G and B were used to amplify the fragment in the promoter region. PCR was performed using IH as a primer set. PCR was performed using 10 ⁇ of pQE60ywfE, 0.5 mol / l of each primer, 2.5 units of £ in DNA polymerase, 4 ⁇ 1 £ DNA; X10 buffer for polymerase, 00 / mol / l to prepare a reaction solution 40 ⁇ 1 including dNTPs, 1 minute at 94 ° C, 2 minutes at 55 ° C, was performed by Succoth repeated 30 times 3 min step at 72 P C.
  • E. coli strain 522 was transformed according to a method using calcium ions, and the transformant was applied to an LB agar medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and then overnight at 30 ° C. Cultured.
  • Plasmids were extracted from the grown transformants according to a known method from D. knee to obtain PPE56, an expression vector containing the L gene, at the downstream of the promoter. The structure of the vector was confirmed by restriction enzyme digestion (FIG. 2). Brief Description of Drawings
  • a strain lacking a specific gene on Escherichia coli chromosome DNA was prepared according to a method using a homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2 000)]. did.
  • Plasmids pKD46, pKD3 and pCP20 described below were obtained from a strain of Escherichia coli harboring the plasmid from Escherichia coli 'E. coli genus oxenichii' (Yale University, USA) and obtained from the Escherichia coli. Was used.
  • ⁇ 1 ⁇ is 1013 ⁇ 4 plasmid DNA, 0.5 / mol 8 of each primer, 2.5 units of Ein DNA polymerase (Stratagene), 4 l of DNA polymerase.
  • X 10 buffer Solution manufactured by Stratagene
  • E. coli JM101 strain was transformed with ⁇ ⁇ 6, spread on LB agar medium containing 100 mg of ampicillin, and cultured at 30 ° C. for selection.
  • ⁇ ' E. coli JM101 strain was transformed with ⁇ ⁇ 6, spread on LB agar medium containing 100 mg of ampicillin, and cultured at 30 ° C. for selection.
  • the ARed recombinase gene is inserted into plasmid pKD46, and its expression is designed to be induced by L-arabinose. Therefore, when E. coli grown in the presence of L-arabinose is transformed with linear DNA, The same recombination occurs.
  • PKD46 has a temperature-sensitive origin of replication, plasmids can be easily eliminated by growing it at 42 ° C.
  • the selected chloramphenicol-resistant strain was inoculated on an LB agar medium containing 25 mg of chloramphenicol, and cultured at 42 ° C for 14 hours, followed by single colony separation. Each obtained colony was replicated on an LB agar medium containing 25 mg of chloramphenicol and on an LB agar medium containing lOOmg / 1 ⁇ > picillin, cultured at 37 ° C, and resistant to chloramphenicol and ampicillin sensitive.
  • PKD46 shed strain was obtained by selecting Koguchi 21 showing the following.
  • Plasmid PCP20 contains a yeast-derived Flp recombinase gene, which is designed to be induced at 42 ° C.
  • both ends of the chloramphenicol resistance gene of the DNA fragment containing the £ ⁇ gene, the pe gene, the pepB gene, the pepA gene, and the chloramphenicol resistance gene for deletion of the d-operin are nucleotide sequences recognized by Flp recombinase.
  • the resistance gene can be easily eliminated by homologous recombination catalyzed by Flp recombinase.
  • Chromosome DNA was prepared from each of the strains selected above in accordance with a conventional method (Bioengineering Experiments, edited by the Society of Biotechnology, pages 97-98, Baifukan, 1992).
  • SEQ ID NO: designed based on the internal nucleotide sequence of the E ⁇ L gene, which is the target gene for deletion.DNA with the nucleotide sequences represented by 50 and 51 was used as a primer set, and the chromosomal DNA was converted to type III. Went PC R '.
  • PCR was performed using 0.1 / g chromosomal DNA, 0.5 mol / l of each primer, 2.5 units of £ i DNA polymerase, 4 zl of DNA polymerase x10 buffer, '200 zmoi / Using a 40 zl reaction solution containing 1 l of each deoxyNTP, a process consisting of 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes was repeated 30 times.
  • a strain in which the amplified DNA fragment was not detected in the above PCR was designated as a gene-deficient 1 ⁇ 4 strain, and was named Escherichia coli 'JPD1 strain.
  • the Escherichia coli E. coli JPD1 strain obtained in the above (2) was transformed with pKD46, applied to an LB agar medium containing 100 mg / 1 ampicillin, and cultured at 30 ° C. for selection.
  • a chloramphenicol resistance gene-deficient gene fragment for gene deletion was introduced into the obtained transformant (Escherichia coli KPD JPDl / pKD46) by the electric pulse method, and the DNA fragment was added to the chromosomal DNA of Escherichia coli KPD1 / pKD46.
  • a transformant in which a DNA fragment containing a chloramphenicol resistance gene for gene deletion was integrated by homologous recombination was obtained.
  • a strain lacking the chloramphenicol resistance gene was obtained from the chromosomal DNA by performing the same operation as in (2) above, and the strain was named Escherichia coli EPDN2 and feo
  • the pepN gene, the pepA gene, the epB gene, or the strain deficient in the ⁇ -open mouth can be obtained by using each of the genes prepared in (1) above or the DNA fragment containing the chloramphenicol-resistant gene for the open-mouth deficient gene in the above (2) ).
  • the fact that each of the gene-deficient strains was obtained by the above-mentioned method means that each DNA-deficient strain was located inside of each of the defective genes.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 52 to 59 designed and synthesized based on the nucleotide sequence was used as a primer set. It was confirmed by the same PCR as in (2) above.
  • DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 52 and 53 is used for confirming the deletion of the Et gene
  • DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 54 and 55 is used for confirming the deletion of the n Jt gene
  • the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 56 and 57 is a primer set for confirming the deletion of the pepB gene
  • the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 58 and 59 is a primer set for confirming the deletion of the d22_open. is there.
  • the dp operatin-deficient strain obtained by the above method was used for the Escherichia coli JDPP1 strain, the ⁇ eN gene-deficient strain was used for the Escherichia coli JPNI strain, and the e Jl gene-deficient strain was used for the Escherichia coli JPA1 strain, £ ⁇ _gene
  • the defective strain was named Escherichia 'coli JPB7 strain.
  • the triple gene-deficient strain lacking the pepD gene and the MPi gene was identified as Escherichia coli JPDNB43 strain
  • the triple gene-deficient strain lacking the pepD gene, ⁇ gene and the dpp operator was identified as Escherichia coli JPNDDP36 strain, uepA gene, pepD Escherichia coli deficient in the gene, the epN gene and the d-operin deficient strain, and Escherichia coli in the Escherichia coli deficient strain deficient in the JPNDAP5 strain, the epB gene, the £ epD gene, the uepN gene, and the dpp operant.
  • ⁇ Coli 'JPNDBP7 strain Table 2 shows the names of the defective genes in each gene-deficient strain. Table 2
  • Example 2 Productivity of L-alanyl-L-glutamine (hereinafter referred to as AlaGln) and L-alanyl-L-alanine (hereinafter referred to as AlaAla) using an Escherichia coli strain in which peptidase and peptide incorporation activities have been lost Evaluation of '
  • Example 1 The operon-deficient strains encoding various peptidase genes and dipeptide uptake proteins obtained in Example 1 were transformed using the plasmid pPE56 constructed in Experimental Example 8, to obtain transformants showing ampicillin resistance.
  • the resulting transformant was inoculated into a test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 zg / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C for 17 hours.
  • the culture solution was added to an 8 ml production medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin (dipotassium hydrogen phosphate 16 g / l, potassium dihydrogen phosphate 14 g / l, ammonium sulfate 5 g / L, citric acid (anhydrous) lg / l, Casamino acid (manufactured by Difco) 0.5 g / UL-Proig / L-Ala 2.5 g / K L-Gln 2.5 g 8, glucose lOg / K vitamin 10 mg / L, magnesium sulfate 'heptahydrate 25 mg / l, iron sulfate heptahydrate 50mg octa, pH adjusted to 7.2 using l
  • Magnesium sulfate7-hydrate, iron sulfate '7 The hydrate was separately added after steaming) and inoculated in a test tube at 1% and cultured at 30 ° C for 24 hours. The culture solution was centrifuged to obtain a culture supernatant.
  • the C product in the culture supernatant was derivatized by the F-mocation method and then analyzed by the HPLC method.
  • the HPLC method For analysis by the HP LC method, use 0DS-HG5 (manufactured by Nomura Chemical Co., Ltd.) for the separation column, and use solution A as the eluent (adjusted to ⁇ 4.8 with acetic acid 6 ml, 20% (v / v) acetonitrile, and triethylamine).
  • Table 3 shows that two or less peptidase genes were deficient ⁇ [In organisms and microorganisms deficient in only one peptide uptake protein gene, the production and accumulation of dipeptides were low, but one or more Microorganisms deficient in one or more of the peptide uptake protein genes, or those in which three or more of the peptide uptake genes have been lost, have significantly increased production and accumulation of peptides. I knew I was doing it.
  • Example 3 Evaluation of productivity of L-alanyl-L-parin (hereinafter referred to as AlaVal) using an Escherichia coli strain in which the activity of peptide-uptake and peptide-incorporating proteins has been lost.
  • operon-deficient Escherichia coli strains encoding various beptidase genes and peptide uptake proteins were transformed using PPE56.
  • the resulting transformant was inoculated into a test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C. for 17 hours.
  • the culture solution was mixed with 8 ml of a production medium (100 g / ml of ampicillin, 16 g of dipotassium hydrogen phosphate, 14 g / l of potassium dihydrogen phosphate, 5 g of ammonium sulfate, 5 g / ls of citric acid (anhydrous) lg) / l, casamino acid (manufactured by Difco) 0.5 g / l, L-Pro lg / L-Ala 2.5 g / U L-Val 2.5 g / K Darcos 10 g / l, vitamin 10 mg / K magnesium sulfate 7 Hydrate 25mg, iron sulfate 'heptahydrate 50 rag / KlOmol 8 sodium hydroxide solution adjusted to pH 7.2.Dalcos, Bismin B ls magnesium sulphate ⁇ heptahydrate ⁇ iron sulphate ⁇ 1% was inoculated into a test tube
  • JPNDBP7 pepB, pepD, pepN, dpp operon 0.20 From Table 4, it can be seen that microorganisms deficient in two or less peptidase genes and microorganisms deficient in only one peptide uptake protein gene do not produce peptides, but three or more peptidase genes. It was found that microorganisms deficient in the gene, or microorganisms deficient in one or more of the peptidase genes and one of the peptide uptake protein genes, produced peptides.
  • GlyGln glycyl-L-glutamine
  • operon-deficient strains encoding various beptidase genes and a protein incorporating a peptide were transformed using PPE56.
  • the obtained transformant was inoculated into a test tube containing 8 ml of LB medium containing 50 zg / ml of ampicillin, and cultured at 28 ° C for 17 hours.
  • the culture solution was added to 8 ml of a production medium containing 16 mg / ml of ampicillin (16 ⁇ 1, dipotassium hydrogen phosphate, 14 g of potassium dihydrogen phosphate, 5 g / L of ammonium sulfate ', 5 g / L of citric acid (water free).
  • a production medium containing 16 mg / ml of ampicillin (16 ⁇ 1, dipotassium hydrogen phosphate, 14 g of potassium dihydrogen phosphate, 5 g / L of ammonium sulfate ', 5 g / L of citric acid (water free).
  • L-Gin is sterilized by filtration of 10-fold concentrated solution by filtration, and glucose and vitamin B 1 % magnesium sulfate heptahydrate and iron sulfate 'heptahydrate were separately added after steaming) and inoculated at 1% into a test tube, and cultured at 30 ° C for 24 hours. The culture was centrifuged to obtain a culture supernatant.
  • the present invention it is possible to provide a microorganism producing a peptide and a method for producing the peptide using the microorganism.
  • SEQ ID NO: 35 Description of artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 4 1 Description of artificial sequence Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 4 2 Description of artificial sequence Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 49 Description of artificial sequence, synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 50 Description of artificial sequence Synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 5 Description of one artificial sequence; synthetic DNA
  • SEQ ID NO: 54 Description of artificial sequence; synthetic DNA SEQ ID NO: 55--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 56--Description of artificial sequence Synthetic SEQ ID NO: 57--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 58--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 59 --Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 60---Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 61--Description of artificial sequence Synthetic SEQ ID No. 62--Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 63--Artificial Description of sequence Synthetic DNA SEQ ID No. 6 6--Description of artificial sequence Synthetic DNA 'SEQ ID No.

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Abstract

本発明によれば、１種以上のペプチダーゼおよび１種以上のペプチド取り込み活性を有する蛋白質の活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物、３種以上のペプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジペプチドを生産する能力を有する微生物、および該微生物を用いたジペプチドの製造法が提供される。

Description

明 細 書
ジぺプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジぺプチドの製造法 技術分野
本発明は、ジぺプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジぺプチドの製造 法に関する。
背景技術
ジペプチドは、 食品、 医薬品、 化粧品等として重要な化合物である。
ジペプチドの製造法としては、天然物からの抽出法、化学合成法、酵素法が知られ ている。天然物からの抽出法は、生産できるジペプチドの種類が限られている上、天 然物中に含まれる目的のジぺプチドの含量が低く生産性が悪い。化学合成法によるジ ぺプチドの合成では、官能基の保護 ·脱保護などの操作が必要であり、 またラセミ体 も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。 また、 学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。
酵素法によるジぺ^ ^チドの合成に関しては、 タンパク質分解酵素 （プロテア一ゼ） の逆反応を利用した方法 [J. Biol. Chem., 119, 707-720 (1937)]、 iffif熱性ァミノ ァシル t- RNA合成酵素を利用する方法（特開昭 58-146539号公報、 特開昭 58-209991 号公報、 特閧昭 58-209992号公報、 特開昭 59-106298号公報）、 非リボゾームべプチ ドシンセ夕ーゼ （以下、 NRPS と称す） を利用する方法 [Chem. Biol., 7, 373-384 (2000)、 FEBS Lett.', 98> 42-45 (2001)、 米国特許第 5795738号、 米国特許第 5652 116号] 、 D-Ala-D-Alaリガーゼを利用する方法 [Biochemistry, 35, 10464-10471 (1996 )]、 バシリシン合成酵素を利用する方法 [J. Ind. Microbiol., , 201-208 (1987)、 Enzyme . Microbial. Techno! . , 29, 400-406 (2001)]、 L-アミノ酸アミド ハイドロラ一ゼまたはプロリシィミノべプチダーゼを利用する方法（国際公開第 WOO 3/010307号パンフレット） が知られている。
しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官 能基の保護 ·^保護が必要であり、ぺプチド形成反応の効率化およびぺプチド分解反 応の阻止が困難といつた問題点がある。耐熱性ァミノァシル t-RNA合成酵素を利用す る方法には、 酵素の発現、 副生物の生成反応の阻止が困難という問題点がある。 一方、 NRPS、 D-Ala-D-Alaリガーゼおよびバシリシン合成酵素を利用する方法は、 上記したような問題点はなく、特定の配列のジぺプチドを製造することができる方法 であるが、 ATPなどのエネルギー供給源を必要とする反応であるため、 効率的な方法 ではない。
L-アミノ酸アミドハイドロラ一ゼまたはプロリンィミノべプチダ一ゼを利用する 方法では、該酵素を生産する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、該 微生物菌体の処理物を用いてジぺプチドを製造することができる旨記載されている が、 該製造法によるジペプチドの生産量は十分なものではない。
生細胞は、不要になつた蛋白質を構成ァミノ酸にまで分解し、生じたアミノ酸を必 要な蛋白質の合成に用いる代謝を営んでいる。該機能は細胞の生存、増殖に必須であ るため、生物には多種のプロテァ一ゼゃぺプチダ一ゼが存在することが知られている。 例えば、 ェシエリヒア'コリ (Escherichia coli) には少なくとも 7種のジぺプチ ダーゼが存在する他、他のプロテァ—ゼゃぺプチダーゼによっても分解されるジぺプ チドがあることが知られている [FEMS Microbial . Rev. , 63> 265-276 (1989)]。 k た、 コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム（Corrnebacterium glutamicum)、 ノ、'チノレス · サチリス（Bacillus subtilis )、 サヅカロマイセス ·セレビシェ（Saccharomyces ser )の染色体 D N A上 (こはぺプチダーゼ遺伝子と同定されている遺伝子が、それ それ 25以上、 14以上、 20以上存在している。
しかしながら、ジペプチドを生産する微生物に、ぺプチダ一ゼの欠損を導入するこ とによりジぺプチドの生産量が上昇することについては知られていない。
また、生細胞には複数のぺプチド取込みシステムが備わっていることが知られてい る。 .
例えばェシエリヒア'コリにはジぺプチドを取り込む 3つのシステムがあることが 報告されている [Chem. Biol . , 5 , 489-504 (1998 )、 Microbiol . , 145 , 2891-2901 (1999)3。ゲノム D N A情報^らも、 ェシエリヒア属、 バチルス属、 コリネバクテリ ゥム属およびサッカロマイセス属に属する微生物にはいずれも 3種類あるいはそれ 以上のペプチド取込みシステムが存在することが確認されている。
しかしなが _ら、細胞内で合成されたジぺプチ'ドが細胞外に排出されるか否かは知ら れておらず、ましてジぺプチドを生産する微生物に、ぺプチドの取込みに関与する蛋 白質の欠損を導入することにより、ジぺプチドの生産量が上昇することは知られてい ない。
発明の開示 本発明の目的は、ジぺプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジぺプチド 製造法を提供することにある。 '
本発明は、 以下の （1) 〜 （21) に関する。
( 1 ) 1種以上のぺプチダ一ゼおよび 1種以上のぺプチド取り込み活性を有する 蛋白質（以下、 ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失し、 かつジ ぺプチドを生産する能力を有する微生物。
( 2 ) 3種以上のぺプチダーゼの活性が低下または喪失し、 かつジぺプチドを生 産する能力を有する微生物。
( 3 ) ぺプチダ一ゼが、配列番号 1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列を有 する蛋白質、または配列番号 1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80 %以上 の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつべプチダ一ゼ活性を有する蛋白質である 上記 （1) または （2) の微生物。
(4) ペプチド取込み蛋白質が、配列番号 5〜 9のいずれかで表されるアミノ酸 配列を有する蛋白質、または配列番号 5-9のいずれかで表されるアミノ酸配列と 8 0%以上の相同性を有し、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である上記（ 1) または （3) の微生物。
(5) 'ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 以下の [1]〜 [4]のい ずれかに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物である上記（1)〜（4)のい ずれか 1つの微生物。
[1]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋 白質
[2].配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、 S換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジぺプ チドの合成活性を有する蛋白質
[3]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65 %以 上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、かつジぺプチドの合成活性を有する蛋白 質 .
[ 4 ]配列番号 33で表されるァ'ミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸 配列を有し、 かつジぺプチドの合成活性を有する蛋,白質 (6) .ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 以下の [1]〜 [4]のい ずれかに記載の DN Aを有する微生物である上記（1)〜（4)のいずれか 1つの微 生物。
[1]上記 （5) の [1] [4]のいずれかに記載の蛋白質をコードする DNA [2]配列番号 26-32 64および 65のいずれかで表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 26〜32、 64および 65のいずれかで表される塩基配列を有する DN Aとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、かつジぺプチド合成活性を 有する蛋白質をコードする DNA -
[4]配列番号 34で表される塩基配列と 80 %以上の相同性を有する塩基配列を有 し、 かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする DNA
(7) ジペケチドを生産する能力を有する微生物が、 上記（6)の. [1：！〜 のいずれかに記載の DN Aとべクタ一 DN Aが連結した組換え体 DN Aを有する微 生物である上記 （1) 〜 （6) のいずれか 1つの微生物。
(8) 微生物が、 ェシエリヒア属、 バチルス属、 コリネパクテリゥム属またはサ ヅカロマイセス属に属する微生^である上記（ 1 )〜（ 7 )のいずれか 1つの微生物。
(9) ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 L一アミノ酸エステルと L — ミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1つの微生物。
(10) L—アミノ酸エステルと L—アミノ酸からジぺプチドを生成する能力を 有する微生物が、 プロリ イミノぺプチダ一ゼを生産する微生物である上記（9)の 微生物。 |
(11) L—アミノ酸エステルと L—アミノ酸からジペプチドを生成する能力を 有する微生物が、プロリンィミノべプチダーゼ活性を有する蛋白質を.コードする DN Aとべクタ一 DNAが連結した組換え体 DNAを有する微生物である上記（9)また は （ 10 ) の微生物。 ' ，
(12) 微生物が、 ェシエリヒア属、 バチルス属、 コリネバクテリゥム属または サヅカロマイセス属に属する微生物である上記（9)〜（11)のいずれか 1つの微 生物。 (13) ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 L—アミノ酸アミドと L 一アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1つの微生物。
(14) L一アミノ酸アミドと L一アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有 する微生物が、 L一アミノ酸アミドハイドロラ一ゼ活性を有する蛋白質を生産する微 生物である上記 （ 13) の微生物。
(15) L—アミノ酸アミドと L一アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有 する微生物が、 L一アミノ酸アミドハイドロラ一ゼ活性を有する蛋白質をコードする DNAとべクタ一 DNAが連結した組換え体 DNAを有する微生物である上記 （1
3 ) の微生物。 '
(16) 微生物が、 ェシエリヒア属、 バチルス属、 コリネパクテリゥム属または サヅカロマイセス属に属する微生物である上記（ 13)〜（ 15)のいずれか 1つの 微生物。 .
(17) 上記（1) ~ (8)のいずれか 1つの微生物の培養物または該培養物の 処理物を酵素源に用い、 該酵素源、 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、 該氷性媒体中にジぺプチドを生成、蓄積させ、該媒体から.該ジぺプチドを採取するジ ペプチドの製造法。
(18) ジペプチドが下式 （I) ,
R1 - R2 (I)
(式中、 R1および R2は同一または異なってアミノ酸を表す） で表されるジぺプチ ドである上記 （17)の製造法。
(19) 上記（ 9 ) ~ ( 12 )のいずれか 1つの微生物の培養物または該培養物 の処理物を酵素源に用い、該酵素源、. L一アミノ酸エステルおよび L一アミノ酸を水 性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該 ジぺプチドを採取するジぺプチドの製造法。
(20) 上記（ 13 )〜 （ 16 )のいずれか 1つの微生物の培養物または該培養 物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、 L—アミノ酸アミドおよび L—アミノ酸を水 性媒体中に存在せしめ、該水性 体中にジぺズチドを生成、蓄積させ、該媒体から該 ジぺプチドを採取するジぺプチドの製造法。 ( 2 1 ) 培養物の処理物が、 培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、 培養物を遠心分 離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処 理物、 該菌体の超音波処理物、 該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体の溶媒処理物、 該 菌体の酵素処理物、 または該菌体の固定化物であることを特徴とする上記（1 7 ) ~
( 2 0 ) のいずれか 1つの製造法。
以下に本発明を詳細に説明する。
1 . 本発明の微生物
本発明の微生物は、 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のぺプチド取り込み活 性を有する蛋白質 (以下、ペプチド取込み蛋白質と略す)の活性が低下または喪失し、 かつジぺプチドを生産する能力を有する微生物、または 3種以上のぺプチダ一ゼの活 性が低下または喪失し、 かつジぺプチドを生産する.能力を有する微生物である。
1種以上のベプチダーゼおよび 1種以上のぺプチド取込み蛋白質の活性が低下ま たは喪失している微生物としては、該微生物が正常に生育できる限りにおいて、'任意 の 1種以上のぺプチダーゼおよび任意の 1.種以上のぺプチド取込み蛋白質の活性が 低下または喪失している微生物をあげることができ、 好ましくは 1種以上 9種以下、 より好ましくは 1種以上 Ί種以下、さらに好ましくは 1種以上 4種以下のぺプチダ一 ゼの活性が低下または喪失しており、かつ好ましくは 1種以上 5種以下、 より好まし くは 1種以上 3種以下、さらに好ましくは 1種以上 2種以下、特に好ましくは 1種の ぺプチド取込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができ る。 ' .
該微生物としては、 より具体的には、該微生物のゲノム D N A上に存在するぺプチ ダーゼをコードする遺伝子（以下、ぺプチダーゼ遺伝子と略す）およびペプチド取込 み蛋白質をコードする遺伝子（以下、 ペプチド取込み蛋白質遺伝子）のうち、 1種以 上のぺプチダ一ゼ遺伝子の塩基配列および.1種以上のペプチド取込み蛋白質遺伝子 の塩基配列において、該塩基配列の全部または一部が欠失しているため、 または該塩 基配列中に塩基の置換または付加があるために該ぺプチダーゼおよび該ぺプチド取 込み蛋白質の活性が低下または喪失している微生物をあげることができる。
ぺプチダ一ゼの活性が低下しそいるとは、上記した塩基の欠失、置換または付加が ないぺプチダーゼに比べ、 ぺプチド分解活性が低くなつていることを意味する。- 微生物のぺプチド分解活性は、基質となるぺプチドと微生物菌体とを水性媒体中に 共存せしめ、 ペプチド分解反応を行った後、 残存しているペプチド量を公知の方法、 例えば H P L Cなどを用いた分析法によって定量することにより測定することがで さる
上記ぺプチダ一ゼとしては、ぺプチド分解活性を有する蛋白質であればいずれでも よく、好ましくはジペプチド分解活性が高い蛋白質、 より好ましくはジぺプチダ一ゼ をあげることができる。
より具体的なぺプチダ一ゼとしては、例えばェシエリヒア'コリに存在する、配列 番号 1で表されるアミノ酸配列を有する PepA、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列 を有する PepB、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列を有する PepD、 配列番号 4で表 されるアミノ酸配列を有する PepN、 PepP [GenBank accession no . (以下、 GenBank と略す） AAC75946]、 PepQ (GenBank AAC76850)、 PepE ' (GenBank AAC76991)、 Pe pT (GenBank AAC74211)、 Dcp (GenBank, AAC74611)および IadA (GenBank AAC77284) など、 バチルス 'サチリスに存在する AmpS (GenBank AF012285)、 PepT (GenBank X 99339)、 YbaC (GenBank Z99104)、 YcdD (GenBank Z99105) s ' YjbG (GenBank Z991 10)、 YkvY (GenBank Z99111)、 YqjE (GenBank Z99116)、 YwaD (GenBank Z99123) など、 コリネバクテリウム ·グル夕ミカムに存在する BAB97732、 BAB97858、 BAB9808 0、 BAB98880、 BAB98892, BAB99013、 BAB99598および BAB99819 (いずれも日本 D N A デ一夕バンクの登録番号）で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質など、サッカロマ イセス -セレピシェに存在する 0CT1 (GenBank NC_001143)、 SPC2 (GenBank NC_003 143)、 SPY2 rSaccharomyces genome database ' (htt ： //www. eastgenome . org/ ) ac cession no . L0Q02875]および YIM1 (GenBank NCJ01145)などをあげることができ、 ジぺプチダ一ゼとしては、 配^番号 1〜4で表されるアミノ酸配列を有する PepA、 P epB、 PepDおよび PepN、 並びに PepQ、 PepE、 IadAをあげることができる。 また、 配 列番号 1〜 4のいずれかのアミノ酸配列と 8 0 %以上、好ましくほ 9 0 %以上、 より 好ましくは 9 _5 %以上の相同性を有し、かつべプチダーゼ活性を有する蛋白質もジぺ プチド分角军活性が高い蛋白質としてあげることができる。
- アミノ酸配列や塩基配列の相崗性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム B
LAST[Pro . Natl . Acad. Sci . USA, 90 , 5873 (1993 ) ] FASTA[Methods Enzymol . , 1
83 , 63 (1990 ) ]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol . Biol . , 215 , 40 3(1990 )]。 BLASTに基づいて BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、 パラメ —夕一は例えば Score = 100、 wordlength=12とする。 また、 B,LASTに基づいて BLAS TXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 パラメ一夕一は例えば score = 50、 w ordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各プロ グラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知 である (http：〃 www.ncbi .nlm. nih. gov. ) 。
また、ペプチド取込み蛋白質の活性が低下しているとは、上記した塩基の欠損、置 換または揷入がない D N Aにコードされるぺプチド取込み蛋白質に比べ、ぺプチド取 り込み活性が低くなつていることを意味する。
微生物のぺプチド取り込み活性は、基質となるぺプチドと微生物菌体とを水性媒体 中に共存せしめ、ぺプチド取り込 反応を行った後、水性媒体中に残存しているぺプ チド量を公知の方法、例えば H P L Cなどを用いた分析法によって定量することによ り測定することができる。
上記ペプチド取り込み蛋白質としては、染色体 D N A上でオペロンを形成する遺伝 子にコードされている蛋白質であり、細胞膜上で複合体を形成してジペプチド取り込 み活性を発現する蛋白質、および単独の蛋白質としてべプチド取り込み活性を有する 蛋白質など、微生物のペプチド取り込みに関与.している蛋白質であればいずれでもよ く、 好ましくはペプチド取り込み活性が高い蛋白質をあげることができる。
より具体的なぺプチド取り込み蛋白質としては、例えばェシエリヒア ·コリに存在 する配列番号 5で表されるァミノ酸配列を有する DppA、 配列番号 6で表されるァミ ノ酸配列を有す.る DppB、 配列番号 7で表されるァミノ酸配列を有する DppC、 配列番 号 8で表されるァミノ酸配列を有する DppD、 配列番号 9で表されるァミノ酸配列を 有する DppFヽ OppA (GenBank AAC76569)、 OppB (GenBank AAC76568)、 OppC (GenBa nk AAC76567)、 OppD (GenBank AAC76566)、 OppF (GenBank AAC76565)、 YddO (Ge nBank AAG74556)、 YddP (GenBank AAC74557) \ YddQ (GenBank AAC74558)、 YddR
(GenBank AAC74559)、 YddS (GenBank AAC74560)、 YbiK (GenBank AAC73915)、 M ppA (GenBank AAC74411)、 SapA' (GenBank AAC74376)、 SapB (GenBank AAC74375)、
SapC (GenBank AAC74374)、 SapD (GenBank AAC74373)、 および SapF (GenBank AAC
74372) など、 バチルス 'サチリスに存在する DppA (GenBank CAA40002)、 DppB (Ge nBank CAA40003)、 DppC (GenBank CAA40004)、 DppD (GenBank CAA40005)、 DppE (GenBank . CAA40006)、 OppA (GenBank CAA39787)、 OppB (GenBank CAA39788)、 0 ppC (GenBank CAA39789)、 OppD (GenBank CAA39790)、 OppF (GenBank CAA39791)、 AppA (GenBank CAA62358)、 AppB (GenBank CAA62359')、 AppC (GenBank CAA62360)、 AppD (GenBank CAA62356)、 AppF (GenBank CAA62357)、 YclF (GenBank CAB12175) および YkfD (GenBank CAB13157) など、 コリネバクテリゥム ·グルタミカムに存在 する BAB990'48、 BAB99383、 BAB99384 BAB99385, BAB99713. BAB99714、 BAB99715, B AB99830、 BAB9983U BAB99832 (いずれも日本 D N Aデ一夕バンクの登録番号） で表 されるァミノ酸配列を有する蛋白質など、サヅカロマイセス 'セレピシェに存在する OPTl (GenBank NPJ12323)、 0PT2 (GenBank NP— 015520) および PTR2 (GenBank CAA 82172) などをあげることができ、 また、 ペプチド取り込み活性が高い蛋白質として は、 配列番号 5〜 9で表されるアミノ酸配列を有する DppA、 DppB、 DppC、 DppD、 Dpp Fおよびそれらいずれかのアミノ酸配列と 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、 より 好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する蛋白質もぺプチド取り込み活性が高いぺプ チド取り込み蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記した BLASTまたは FASTA等のプログ ムを用いて決 定することができる。
3種以上のぺプチダーゼの活性が 下または喪失している微生物としては、該微生 物が正常に生育できる限りにおいて、任意の 3種以上のぺプチダーゼの活性が低下ま たは喪失している微生物をあげることができ、好ましくは 3種以上 9種以下、 より好 ましくは 3種以上 6種以下、さらに好ましくは 3種または 4種のぺプチダーゼの活性 が低下または喪失している微生物をあげることができる。
具体的なぺプチダ一ゼとしては、 上記したェシエリヒア 'コリ、 バチルス 'サチリ ス、 コリネバクテ,リゥム ·グル夕ミカムおよびサヅカロマイセス ·セレピシェに存在 するぺプチダーゼおよびジぺプチダーゼをあげることができる。また、配列番号 1〜 4のいずれかのアミノ酸配列と 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、 より好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、かつべプチダーゼ活性を有する 蛋白質もジペプチド分解活性が い蛋白質としてあげることができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定す ることができる。 ジペプチドを生産する能力を有する微生物としては、ジペプチドを生産する能力を 有する微生物であれば特に限定されず、例えば、 1種以上のアミノ酸を縮合、連結す ることによりジペプチドを合成する ¾性を有する蛋白質を生産する微生物、 L一アミ ノ酸エステルと L一アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質を生産 する微生物、 L—アミノ酸アミドと L一アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有 する蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
1種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジぺプチドを合成する活性を有す る蛋白質を生産する微生物としては、 NRPS、 D-Ala-D-Alaリガ一ゼ、 バシリシン合成 酵素からなる群より選ばれる蛋白質を生産する微生物をあげることができる。
NRPSを生産する微生物としては、 バチルス属をはじめとする原核生物、 ぺニシリ ゥム属をはじめとする真核生物、 BacA、 BacBおよび BacC (GenBank AF007865) を生 産する微生物、 TycA、 TycBおよび TycC (GenBank AF004835) を生産する微生物、 P bAB (GenBank M57425) を生産する微生物、 および BacAヽ BacB、 BacC、 TycA、 TycB, TycCs PcbABから選ばれるいずれかの蛋白質のアミノ酸配列と 8 0 %以上、 好ましく は 9 0 %以上、 より好ましくは 9 5 %以上の相同性 ¾有し、 かつ NRPSの活性を有す る蛋白質を生産する微生物などをあげることができる。
D-Ala-D- Alaリガーゼを生産する微生物としては、ぺプチドグリカンを形成する原 核微生物、 DdlA (GenBank accession no . 顧 67) を生産する微生物、 DdlB(GenBan k accession no . AE000118 ) を生産する微生物、 DdlC (GenBank accession no . D88 151) を生産する微生物、 および DdlA、 DdlBs DdlCから選ばれるいずれかのアミノ酸 配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付カ卩したァミノ酸配列からなり、 かつ D-Ala- D-Al リガーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物などをあげること ができる。
アミノ酸配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定す ることができる。
バシリシン合成酵素を生産する微生物としでは、バチルス属に属する微生物、好ま しくはバチルス ·サチリス (Bacillus subti lis) 、 バチルス 'アミ口リケファシェ ンス (Bacillus amyloliquefaciens) 、 ノ チノレス -コグランス (Bacillus coagulan s) 、 バチルス · リケチノフオルミス (Bacil lus licheniformis 、 バチルス 'メガ テリゥム (Bacillus megaterium) 、 バチルス 'プミルス (Bacillus pumilus) 、 よび以下 © [1：] 〜 [4]、
[1]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋 白質、
[2] 配列番号 19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジぺプ チドの合成活性を有する蛋白質、
[3]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65 %以 上の相同性を有するアミノ酸配歹！]からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白 質、 または
[ 4 ]配列番号 33で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列を有し、 かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
から選ばれる蛋白質を生産する微生物をあげることができる。
L—アミノ酸エステルと Lーァミノ酸からジぺプチドを合成する活性を有する蛋 白質を生産する微生物としては、プロリンィミノべプチダーゼを生産する微生物をあ げることができ、具体的にはバチルス属、コリネバクテリゥム属またはシユードモナ ス属に属する微生物などをあげることができる。 具体的には、 バチルス 'サチリス ATCC6633、 バチルス 'コ： ギュランス EK01[J. BacterioL. , 174, 7919(1992)]、 コ リネパクテリゥム ·グルタミカム ATCC13286、 シュ一ドモナス ·プチダ AJ-2402 (F ERM BP-8101) シュ一ドモナズ ·プチダ ATCC12633、 シユードモナス ·プチダ AJ20 48 (FERM BP-8123) (以上、 W003/010307に記載の微生物） などをあげることがで きる。 また、 アースロバク夕一 'ニコチアナ [FEMS Microbiol. Lett., 78, 191(199 9)]、 ェヅシエリヒア 'コリ （特開平 2— 113887) 、 フラボパクテリゥム■メ 二コンゴセプチティカム [Arch. Biochem. Biophys. , 336> 35(1996) ]、ハフニァ 'ァ ルべィ [J. Bioc em., 119, 468(1996)], ラクトバチルス 'デブルキ一 [Microbiolog y, 140, 527(U94):kバチルス 'コアギュランス [J. BacterioL, 174, 7919(1994)], ァエロモナス ·ソブリア [J. Biochem.， 116, 818(1994)] 、 キサントモナス ·キヤ ンぺストリス （特開平 9一 12 i 860) 、 ナイセリア 'ゴノレーヤー [Mol . Micro biol., 9, 1203(1993)]、 プロピオニバクテリゥム 'フリュデンリチ一 [Appl . Envir on. Microbiol. , 64> 4736(1998)]、 セラチア 'マルエッセンス [J. Biochem. ,122, 601 (1997)〗、 jリネバクテリゥム 'バリアビリス [J. Appl. Microbiol., 90> 449(2 001)]、 サ一モプラズマ■ァシドフィラム [FEBS Lett.， 398. 101(1096)]、 シユード モナス 'アルギノ一サ [Nature,.1 , 959(2000)]などもプロリンィミノべプチダ一ゼ を生産する微生物としてあげることができる。
さらに、 プロリンイミノぺプチダ一ゼを生産する微生物としては、 以下の [1]〜 [3] から選ばれる蛋白質、
[1] W003/010307、 FEMS Microbiol. Lett., 78, 191 (1999)、 特開平 2— 1138 87、 Arch. Biochem. Biophys., 塁， 35 (1996 )、 J. Biochem., 119, 468(1996)、 M icrobiology, 140, 527(1994)、 J. Bacteriol. , 174, 7919(1994), J. Biochem, , 1 16, 818(1994),特開平 9一 121860、 Mol . Microbiol., 9, -1203(1993)、 Appl .
Environ. Microbiol., 64> 4736(1998)、 J.' Biochem., 122, 601(1997)、 FEBS Let t.， 398. 101 (1996) Nature,- 406, 959(2000)のいずれかに記載のプロリンイミノ プチダーゼ、
[ 2 ]上記 [ 1 ]のいずれかのプロリンィミノぺプチダ一ゼのアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換または^加したア ノ酸配列からなり、かつプロリ ンィミノべプチダ一ゼ活性を有する蛋白質、
[3]上記 [1]のいずれかのプロリンイミノぺプチダ一ゼのアミノ酸配列と 80% 以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノぺプチダ一ゼ活性 を有する蛋白質、
を生産する能力を有する微生物をあげることができる。
L—アミノ酸アミ ドと L一アミノ酸からジぺプチドを合成する活性を有する蛋白 質を生産する微 物としては、 L一アミノ酸アミ ドハイ ドロラ一ゼを生産する微生物 をあげることができ、具体的にはバチルス属、コリネパクテリゥム属、ェルビ二ァ属、 ロドコヅカス属、 クリセォバクテリウム属、 ミクロコヅカス属、 シユードモナス属、 クリプトコヅカス属、 トリコスポロン属、 ロドスポリジゥム属、 スポロボロマイセス 属、 トレメラ属、 トルラスボラ属、 ステリグマ小マイセス属、 またはロドトルラ属に 属する微生物、好ましくはバチルス属、 コリネバクテリゥム属またはシュ一ドモナス 属に属する微生物、より好ましくはバチルス 'メガテリゥム AJ3284(FERM BP-8090), コリネパクテリゥム 'グルタミカム ATCC13286、 ミクロコヅカス 'ルテウス ATCC934 1、 シュ"ドモナス 'サヅカロフイラ. ATCC15946 (以上、 WO03/010187に記載の微生 物） などをあげることができる。
また、 L—アミノ酸アミドハイ 'ドロラ一ゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物と しては、 以下の [1] または [2] 記載の蛋白質、 '
[1] WO03/010187記載の L一アミノ酸アミドハイドロラ一ゼのアミノ酸配列におい て、 1個以上のアミノ酸が欠失、 置換または付加したアミノ酸配列からなり、 かつ L 一アミノ酸アミドハイド口ラ一ゼ活性を有する蛋白質 ·
[2] WO03/010187記載の L—アミノ酸アミドハイドロラ一ゼのアミノ酸配列と 8 0%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ L—アミノ酸アミドハイドロ ラ一ゼ活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物、
をあげることができる。.
上記において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列か έ なり、 ジペプチド合成活性を有する蛋白質は、 Molecular Cloning, A Laboratory M anual , Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、 モ レキユラ一.クロ一ニング第 2版と略す） 、 Current Protocols in Molecular Biol ogy, John Wiley k Sons (1987-1997) (以下、 カレント ·プロトコ一ルズ'イン 'モ. レキユラ一'バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 P roc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34> 315 (1985)、 Nucleic Ac ids Research, 13, 4431 (1985)、 Pro Natl . Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等 に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 19〜25および 68で表 されるアミノ酸配列からなる蛋白質、プロリンィミノぺプチダ一ゼ活性を有する蛋白 質および L—アミノ酸アミドハイドロラ一ゼ活性を有する蛋白質のいずれかの蛋白 質をコードする DN Aに部位特異的変異を導入することにより、取得することができ る。
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異 的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個か ら数十個、好ましくは 1〜20個、 より好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1 〜5個である。 '
配列番号 19〜25および 68で表されるアミノ酸配列、プロリンイミノぺプチダ
—ゼ活性を有する蛋白質および L—アミノ酸アミドハイドロラ一ゼ活性を有する蛋 4 016710 白質のアミノ酸配列のいずれかにおいて 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたとは、 同一配列中の任意の位置において、 1または複数のアミノ酸の欠失、 置換 または付加があってもよい。 .
欠失、置換または付-加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天 然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、 L—アラニン、 L一ァスパ ラギン、 Lーァスパラギン酸、 L—アルギニン、 L一グル夕ミン、 Lーグノレタミン酸、 グリシン、 L—ヒスチジン、 L一イソロイシン、 L一口イシン、 L一リジン、 L—メ チォニン、 L一フエ二ルァラニン、 L—プロリン、 Lーセリン、 L—スレオニン、 L —トリブトファン、 Lーチロシン、 ： L—パリン、 L一システィンなどがあばられる。 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互 に詈換可能である。
. A群：ロイシン、 イソロイシン、 ノルロイシン、 パリン、 ノルパリン、 ァラニン ^ 2-アミノブタン酸、 メチォニン、. 0-メチルセリン、 t-ブチルグリシン、 t-プチルァ ラニン、 シクロへキシルァラニン
B群：ァスパラギン酸、 グル夕ミン酸、'ィソァスバラギン酸、 ィソグル夕ミン酸、 2-アミノアジピン酸、 2-アミノスペリン酸
C群：ァスパラギン、 グルタミン
D群： リジ 、 アルギニン、 オル二チン、 2, 4-ジアミノブタン酸、 2, 3-ジアミノブ ロピオン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、 スレオニン、 ホモセリン
G群：フエ二ルァラニン、 チロシン
また、上記した 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加が導入される位置は、該 変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛋白質がジぺプチド合成活性を有する限り、 特に限定されず、例えば配列番号 1 9〜2 5および 6 8で表されるアミノ酸配列を比 較したとき、該アミノ酸配列中の 1つ以上のァ'ミノ酸配列において保存されていない アミノ酸残基をあげることができる。
. また、上記した 1以上のァミン酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列から なる蛋白質であり、かつジペプチド合成活性を有する蛋白質としては、配列番号 1 9
〜2 5および 6 8のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が、通常は 6 5 %以 上、好ましくは 8 0 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、特に好ましくは 9 5 %の相 同性を有する蛋白質、プロリンィミノぺプチダ一ゼのアミノ酸配列または L—ァミノ 酸アミドハイドロラ一ゼのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列との相同性が、通 常は 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、 より好ましくは 9 5 %以上の相同性を有す る蛋白質をあげることができる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、上記した BLASTまたは FASTA等のプログラム を用いて決定することができる。
配列番号 3 3で表されるアミノ酸配列は、配列番号 1 9〜2 5で表されるアミノ酸 配列を有する蛋白質の間で保存されている領域であり、 かつ各種微生物の Ala-Ala リガ一ゼ活性を有する蛋白質のコンセンサス配列に対応する領域である。
配列番号 3 3で表されるァミノ酸配列と 8 0 %以上、好ましぐは 9 0 %以上、 より 好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつ、:） ぺプチド合成活性を有する蛋白質を生産する微生物もまたジぺプチドを生産する微 生物である。
配列番号 3 3で表されるァミノ酸配列と 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、 より 好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質が、ジぺプチド 合成活性を有する蛋白質であるためには、該蛋白質のアミノ酸配列と配列番号 1 9〜 2 5で表されるいずれかのアミノ酸配列との相同性が、少なくとも 8 0 %以上、通常 は 9 0 %以上、 特に 9 5 %以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定す ることができる。
また、 1種以よのアミノ酸を縮合、連結することによりジぺプチドを合成する活性 を有する蛋白質をコードする D N A、 L一アミノ酸エステルと L—アミノ酸からジぺ プチドを合成する活性を有する蛋白質をコードする D NA、または L一アミノ酸アミ ドと L—アミノ酸からジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードする D N Aとべクタ一: D N Aを連結して得られる組換え体 D N Aを有する微生物もまた本発 明の微生物であ ¾。
該微生物としては、ェシエリ 11ァ属、バチルス属、 コリネパクテリゥム属またはサ ヅカロマイセス属に属する微生物をあげることができる。 1種以上のアミノ酸を縮合、連結することによりジぺプチドを合成する活性を有す る蛋白質をコードする DNAとしては、 NRPS、 D- Ala-D-Alaリガ一ゼまたはバシリシ ン合成酵素をコードする DN Aなどをあげることができる。
NRPSをコードする DNAとしては BacA、 BacB、 BacC、 TycA、 TycB、 TycCおよび P cbABからなる群より選ばれる蛋白質をコードする DNAをあげることができる。
D-Ala-D- Alaリガ一ゼをコードする D NAとしては DdlA、 DdlBおよび DdlCからな る群より選ばれる蛋白質をコードする DNAをあげるこどができる。
バシリシン合成酵素をコードする DNAとしては、 以下の [1]〜 [4]記載の蛋 白質をコードする DNA、
[1]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋 白質、
[2]配列番号 19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジぺプチ ドの合成活性を有する蛋白質、
[3]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65 %以 上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジぺプチドの合成活性を有する蛋白 質、
[ 4 ]配列番号 33で表されるァミノ酸配列と 80 %以上の相同性を有するァミノ酸 配列を有し、 かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
および、 以下の [5：]〜 [7] 記載の DNA、
[5]配列番号 26〜32、 64および 65のいずれかで表される塩基配列を有する DNA、
[6]配列番号 26~32、 64および 65のいずれかで表される塩基配列を有する D N Aとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつジぺプチド合成活性を 有する蛋白質をコードする DNA、
[7]配列番号 34で表される塩基配列と 80 %以上の相同性を有する塩基配列を有 する DN Aであり、 かつジぺプチド合成活性を有する蛋白質をコードする DNA、 をあげることができる。 ' L一アミノ酸エステルと L一ァミノ酸からジぺプチドを合成する活性を有する'蛋 白質をコードする DN Aとしては、 以下の [1]〜 [： 3]記載の蛋白質をコードする DNA、
[1] W003/010307、 FEMS Microbiol. Lett., 78/ 191 (1999),特開平 2—1138 87、 Arch. Biochem. Biophys., 336, 35(1996)、 J. Biochem., 119, 468(1996 )、 Microbiology, 140> 527(1994)、 J. Bacteriol. , 174, 7919(1994)、 J, Biochem. , 116, 818(1994)、 特開平 9 _ 121860s Mol. Microbiol., 9, 1203(1993) App 1. Environ. Microbiol., 6 > 4736(1998), J. Biochem., 122, 601(1997)、 FEBS L ett., 398> 101 (1996)、 Nature, 406> 959(2000)のいずれかに記載のプロリンイミノ ぺプチダ一ゼヽ
[ 2 ]上記 [ 1 ]のいずれかのプロリンィミノぺプチタ'、ーゼのアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつプロリ ンィミノべプチダ一ゼ活性を有する蛋白質、
[3]上記 [1]のいずれかのプロリンイミノぺプチダーゼのアミノ酸配列と 80% 以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつブロリンィミノぺプチダーゼ活性 を有する蛋白質、
および以下の [4] または [5]記載の DNA、
[4] W003/010307. FEMS Microbiol. Lett., 78, 191 (1999)、特閧平 2 _ 1138 87、 Arch. Biochem. Biophys., 336> 35(1996)、 J. Biochem. , 119, 468(1996)、 M icrobiology, 140* 527(1994)、 J. Bacteriol. , 174, 7919(1994)ヽ J. Biochem. , 1 16, 818(1994)、特開平 9— 121860、 Mol. Microbiol., 9, 1203(1993)、 Ap l.
Environ. Microbiol., 64> 4736(1998)、 J. Biochem., 122, 601(1997)、 FEBS Let t.， 398> 101(1996), Nature," 406> 959(2000)のいずれかに記載の塩基配列を有する プロリンィミノべプチダ一ゼをコードする DNA、
[5]上記 [4]のいずれかのプロリンイミノぺプチダ一ゼをコードする DNAとス トリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、'かつプロリンイミノぺプチダ一ゼ活性 を有する蛋白質をコードする DNA、
をあげることができる。 L一アミノ酸アミドと L—アミノ酸からジぺプチドを合成する活性を有する蛋白 質をコードする DNAとして 、 以下の [1]または [2]記載の蛋白質をコードす る DNA、
[1] WO03/010187記載の L—アミノ酸アミドハイドロラ一ゼのアミノ酸配列におい て、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、 かつ L 一アミノ酸アミドハイドロラ一ゼ活性を有する蛋白質、
[2] WO03/010187記載の L—アミノ酸アミドハイドロラ一ゼのアミノ酸配列と 8 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、かつ L—アミノ酸アミドハイド口 ラ一ゼ活性を有する蛋白質、
および以下の [3] または [4]記載の DNA、
[3] WO03/010187記載の塩基配列を有する L—アミノ酸アミドハイドロラーゼをコ —ドする DNA、 '
[ 4 ] WO03/010187記載の塩基配列からなる L—アミノ酸アミドハィド口ラーゼをコ
—ドする D N Aとストリンジェ,ントな条件下でハイプリダイズし、かつ L一アミノ酸 アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA、
をあげることができる。
上記のス,トリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な D N Aとは、上記のいず れかの DNAの一部、 または全部をプローブとして、 コロニ一'ハイプリダイゼーシ ヨン法、プラーク 'ハイプリダイゼ一シヨン法あるいはサザンプロヅトハイプリダイ ゼ一シヨン法等を用いることにより得られる DNAを意味し、具体的には、コロニー あるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィル夕一を用いて、 0. 7〜1. 0m ol 、 好ましくは 0. 9mol/lの塩化ナトリウム存在下、 65°Cでハイブリダィゼ一 シヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度、 好ましくは 0. 1倍濃度の SSC溶液（1倍 濃度の S S C溶液の組成は、 150醒 ol八の塩化ナトリゥム、 および 15腿 01八の クェン酸ナトリウムよりなる）を用い、 65 °C条件下でフィルターを洗浄することに より同定でき D N Aをあげることができる。'ハイプリダイゼ一ションは、モレキュ ラ— .クロ一ニング第 2版、 カレント 'プロトコ一ルズ 'イン 'モレキュラー 'バイ ォロジ一、 DNA Cloning 1: Core' Techniques, A Practical Approach, Second Edit ion, Oxford University (1995 )等に記載されている方法に準じて行うことができる。 ハイブリダイズ可能な D N Aとして具体的には、上記した BLASTおよび FASTA等のプ ログラムを用いて、上記パラメ一タ に基づいて計算したときに、上記したいずれか の D NAの塩基配列と少なくとも 8 0 %以上、好ましくは 9 0 %以上、 より好ましく は 9 5 %以上の相同性を有する D NAをあげることができる。 .
上記した D N Aとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする D N Aが、ジぺ プチドの合成活性を有する蛋白質をコードする D N Aであることは、該 D N Aを発現 する組換え D N Aを作製し、該組換え D N Aを宿主細胞に導入して得られる微生物を 酵素源に用い、 1 )該酵素源および 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該 水性媒体中'にジぺプチドが生成、 蓄積するか否かを H P L C等により分析する方法、
2 )該酵素源、 L—ァミノ酸エステルおよび L—ァミノ轔を水性媒体中に存在せしめ、 該水性媒体中にジぺプチドが生成、蓄積するか否かを H P L C等により分析する方法、
3 )該酵素源、 L—アミノ酸アミドおよび L一アミゾ酸を水性媒体中に存在せしめ、該 水性媒体中にジぺプチドが生成、 蓄積するか否かを H P L C等により分析する方 、 によって確認することができる。
塩基配列の相同性は、上記した BLASTまたは FASTA等のプログラムを用いて決定す ることができる。
2 . 本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、 1 ) 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のぺプチド取り込 み活性を有する蛋白質の機能が低下または喪失した微生物、または 3種以上のぺプチ ダーゼの機能が低下または喪失した微生物に、ジペプチド生産能を付与する方法、 ま たは 2 )ジペプチドを生産する能力を有する微生物の、 a ) 1種以上のぺプチダ一ゼ および 1種以上のペプチド取り込み蛋白質、 または b ) 3種以上のぺプチダ一ゼ、 の 機能を低下または喪失させる方法のいずれの方法によっても取得することができる。 ( 1 ) 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のぺプチド取り込み蛋白質の機能が低 下または喪失した微生物、または 3種以上のぺプチダーゼの機能が低下または喪失し た微生物に、 ジペプチド生産能を付与する方法
( i )ぺプチダーゼ、ぺプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物の 製造
ぺプチダ一ゼ、ペプチド取り込み蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、該 微生物を取得できる方法であれば、その取得方法に制限はないが、例えば以下に示す 微生物の染色体 D N Aのぺプチダーゼ遺伝子やべプチド取り込み蛋白質遺伝子に塩 基の欠失、 置換または付加を導入する方法により取得することができる。
微生物の染色体 D N Aの遺伝子に塩基の欠失、置換または付カ卩を導入する方法とし ては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用 した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の 欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するブラ スミド D N Aと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげる ことができる。
該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に'導入した後、薬剤耐性を指標に して相同組換えによって染色体 D NA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた 形質転換株を選択する。 得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜 1 日間培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、前 の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択することで、染色体 D NA上に おいて 2回目の相同組換えが生じた株を取得することができる。染色体 D N A上の欠 失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体 D N A上 の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することがでぎ o
上記方法により、染色体 D NA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導 入することができる微生物としては、ェシ リヒア属、バチルス属、 コリネバクテリ ゥム属、 またはサッカロマイセス属に属する微生物をあげることができる。
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換または付加を導入する相同組換え を利用した方法としては、 直鎖 D N Aを用いた方法をあげることができる。
具体的には、塩基の欠失、 '置換または付加を導入したい遺伝子を含有する直鎖 D N Aを細胞内に取り込ませ、染色体 D N Aと導入した直鎖 D N Aとの間で相同組換えを 起こさせる方法である。 本方法は、 直鎖 D NAを効率よく取り込む微生物であれば、 いずれの微生 )にも適用でき、好ましい微生物としてはェシエリヒア属またはバチル ス属に属する微生物、 より好ましくはェシエリヒア'コリ、 さら (こ好ましくはえファ —ジ由来の組換えタンパク質群（R e d組換え系） を発現しているシエリヒア'コリ をあげることができる。 ARe d組換え系を発現しているェシエリヒア'コリとしては、 / R e d組換え系 遺伝子を有するプラスミド DNAである pKD46 [ェシエリヒア 'コリ ジエネティヅ ク ストック センター（米国エール大学） より入手可能] を保有するェシエリヒア - コリ JM101株等をあげることができる。
相同組換えに用いられる DNAとしては、
(a)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体 DN A上の領域の両外側 に存在する D N Aまたは該 D N Aと相同性を有する D N Aを、薬剤耐性遺伝子の両端 に有する直鎖 DNA、 ,
(b)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体 DN A上の領域の両外側 に存在する DN Aまたは該 DN Aと相同性を有する DN Aを直接連結した直鎖 DN
( c)塩基の欠失、置換または付カ卩の導入対象である染色体 DNA上の領域の両外 111 に存在する DNAまたは該 DNAと相同性を有する DNAを、薬剤耐:性遺伝子および ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子の両端に有する直鎖 D N A、
(d)上記（a)の直鎖 DNAにおいて、 薬剤耐性遺伝子と染色体 DN A上の領域の 両外側に存在する D N Aまたは該 D N Aと相同性を有する D N Aの間に、さらに酵母 由来の Flp recombinase [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , , 5875 (1985)]が認識 する塩基配列を有する DNA、
をあげることができる。
薬剤耐性遺伝子としては、宿主微生物が感受性を示す薬剤に対し、薬剤耐性を付与 する薬剤耐性遺伝子であれば、いずれの薬剤耐性遺伝子も使用することができる。宿 主微生物にェシヱリヒア ·コリを用いた場合は、 薬剤劣性遺伝子としては、 例えば、 カナマイシン耐性遺伝子、ク 0ラムフエニコ一ル耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺 伝子、スぺクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子およびアンピシ リン耐性遺伝子等をあげることができる。
ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子とは、宿主微生物で該遺伝子 を発現させたとき、一定培養条件下においては、該微生物に致死的である遺伝子のこ とをいい、 該遺伝子としては例えば、 バチルス属に属する微生物由来の^ L遺伝子 [Appl. Environ. Microbiol., 59, 1361-1366 (1993) ]、 およびェシエリヒア属に 属する微生物由来の I L遺伝子 [Genomics, 72, 99-104(2001 )]等をあげることが できる。 ·
上記の直鎖 DN Aの両末端に存在する、染色体 DN A上の置換または欠失の導入対 象となる領域の両端の外側に位置する D N Aまたは該 D N Aと相同性を有する D N Aは、直鎖 DNAにおいて、染色体 DNA上の方向と同じ方向に配置され、 その長さ は 1 Obp〜l 00 bp程度が好ましく、 20bp〜50 b p程度がより好ましく、 30〜4 Ob p程度がさらに好ましい。
酵母由来の Flp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組 換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが 好ましくは配列番号 39で 表される塩基配列を有する DN A、および該 D N Aにおいて 1個〜数個の塩基が欠失、 置換または付加された塩基配列を有し、 かつ酵母由来の Flp recombinaseが認識し、 相同組換えを触媒する塩基配列を有する DNAをあげることができる。
相同性を有する DNAとは、上記直鎖 DNAが、染色体 DNA上の目的とする領域 において、相同組換えが起こる程度の同一性を有する DNAのことであり、具体的な 相同性としては、 80%以上、 好ましくは 90%以上、 より好ましくは 95%以上、 さらに好ましくは 100 %の相同性を有する D N Aをあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、上記した BLASTや FASTA等のプログラムを用いて決定す ることができる。
上記直鎖 DNA断片は、 PCRにより作製することができる。また上記直鎖 DNA を含む DN Aをプラスミド上にて構築した後、制限酵素処理にて目的の直鎖 DN Aを 得ることもできる。 ' 微生物の染色体 DN Aに塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、以 下の方法 1〜4があげられる。
方法 1：上記（a) または（d)の直鎖 DNAを宿主微生物に導入し、 薬剤耐性を指 標に該直鎖 DN Aが染色体 DN A上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選 択する方法。 _ ·
方法 2：上記方法 1により取得された形質転換株に、塩基の欠失、置換または付加の 導入対象である染色体 D N A上め領域の両外側に存在する D N Aまたは該 D N Aと 相同性を有する DN Aを直接連結した DN Aを導入し、該方法により染色体 DN A上 に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物め染色体 D N A上の領域を置 換または欠失させる方法。 . 方法 3 ：
[1]上記（c)の直鎖 DN Aを宿主微生物に導入し、 薬剤耐性を指標に該直鎖 DN Aが染色体 DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[ 2；]染色体 D N A上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置する D N Aと 相同性を有する: DN Aを、染色体 DN A上における方向と同一の方向で連結した DN Aを合成し、 上記 [ 1 ] で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下におい て、上記 [ 2 ]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、 薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色 体 DNA上から削除された株として選択する方法。
方法 4：
[1]上記（d)の直鎖. DNAを宿主微生物に導入し、 薬剤耐性を指標に該直鎖 DN Aが染色体 D N A上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記 [1]で得られた形質転換株に Flp recombinase遺伝子発現プラスミドを 導入し、該遺伝子を発現させた後、 上記 [1]で用いた薬剤に感受性である株を取得 する方法。
上記方法で用いられる、直鎖 DN Aを宿主微生物に導入する方法としては、該微生 物へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウム イオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 69. 2110 (1972)]、 プロトプ ラスト法（特開昭 63-248394)、 エレクトロボレ一シヨン法 [Nucleic Acids Res,, 16, 6127 (1988)]等をあげる'ことができる。
方法 2または方法 3 [2]で用いられる DN Aにおいて、該 DN Aの中央部付近に、 染色体 DN A上に挿入したい任意の遺伝子を組み込こんだ DN Aを用いることによ り、薬剤耐性 伝子等を削除するのと同時に、任意の遺伝子を染色体 DN A上に挿入 することができる。
.上記方法 2〜 4では、最終的に得られる形質転換株の染色体 D N A上には薬剤耐性 遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子 を残さない方法である め、該方法を用いることにより、同一の薬剤耐性遺伝子およ びネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、 方法 2、 方法 3 [1：！ 〜 [3]、 および方法 4 [1] [2]の操作を繰り返すことにより、 容易に染 色体 DN A上の位置の異なる 2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微 生物を製造することができる。 ·
(ii) ジペプチドを生産する能力を付与する方法
上記（i)で用いた微生物に、ジペプチドを生産する能力を付与する方法としては、 例えば以下の方法をあげることができる。
(a) ジペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードする； DNAの調製 上記したジぺプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードする DNAは、該 DN Aの塩基配列情報を利用し、 以下に記載する方法により取得,することができる。 例えば、バシリシン合成酵素をコードする DNAを取得する方法としては、配列番 号 26-32, 64および 65のいずれかで表される塩基配列に基づき設計するこ^: ができるプローブを用いた、バチルス属に属する微生物の染色体 DN Aライブラリ一 に対するサザンハイブリダィゼーシヨン法、または配列番号 26~32、 64および 6 '5のいずれかで表される塩基配列に基づき設計することができるプライマ一 DN Aを用いた、 バチルス属に属する微生物の染色体 DN Aを錶型とした PC R[PCR Pr otocols, Academic Press (1990)]等をあげることができる。
また、各種の遺伝子配列デ一夕ベースに対して配列番号 19〜25、 33および 6 8のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードする DNAの塩基配列と 65 %以上、 好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の 相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配 列を有する生物の染色体 D N A、 c D N Aライブラリ一等から上記した方法によりジ ペプチドを合成する活性を有する蛋白質をコードする DN Aを取得することもでき る ο
取得した D N Aをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりべ クタ一に組み み、組換え体 DN Aを取得し、'該組換え体 DN Aをェシエリヒア -コ リに導入して得られる形質転換体からブラズミド DNAを抽出して、通常用いられる 塩基配列解析方法、 例えばジデォキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, U, 5463 (1977)]あるいは 373Α· DNAシークェンサ一 （パ一キン 'エルマ一社製）等の塩基 配列分析装置を用いて分析することにより、該!） N Aの塩基配列を決定することがで きる。 . .
塩基配列を決定した結果、取得された DN Aが部分長であった場合は、該部分長 D N Aをプ p ブに用いた、染色体 D N Aライブラリ一に対するサザンハイプリダイゼ ーシヨン法により、 全長 DNAを取得することができる。
更に、決定された DN Aの塩基配列に基づいて、パ一セプティブ'バ オシステム ズ社製 8905型 D N A合成装置等を用いて化学合成することにより目的とする; D N A を調製することもできる。 .
上記のようにして取得される D Aとして、例えば、配列番号 26〜32、 64お. よび 65で表される塩基配列を有する DNAをあげることができる。
該 DNAを組み込むベクタ一としては、 pB escript II KS (+) (ストラタジーン社 製）、 pDIRECT[Nucleic Acids Res. , 18, 6069 (1990)]、 pCR-Script Amp S (+) トラ夕ジーン社製）、 pT7Blue (ノバジェン社製）、 pCR II (インビトロジヱン社製） および pCR-TRAP (ジ一ンハン夕一社製） などをあげることができる。
ェシェリヒア 'コリとしては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ XIA-Blue、 ェシェリ ヒア 'コリ XL2- Blue、 ェシェリヒア 'コリ DH1、 ェシェリヒア .コリ MC1000、 ェシ エリヒア 'コリ KY3276、 ェシエリヒア 'コリ W1485、 ェシエリヒア .コリ JM101、 ェシエリヒア 'コリ JM109、 ェシエリヒア 'コリ HB101、 ェシエリヒア 'コリ No.4 9、 ェシエリヒア 'コリ W3110、 ェシエリヒア 'コリ NY49、 ェシエリヒア:'コリ MP 347、 ェシエリヒア -コリ 腿 522、 ェシエリヒア 'コリ ME8415等をあげることがで ぎる。
組換え体 DN Aの導入方法として 、上記宿主細胞へ DN Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、'例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、 プロトプラスト法 （特開昭 63-248394)、 ェ レクト口ポレ^ "シヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることが できる。
上記方法によって得られるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする DN
Aを保有する微生物としては、後述する配列番号 19で表される配列を有する DN A を含有する組換え体 DNAを保有する微生物であるェシェリヒア 'コリ 腿 522/pPE4 3をあげることができる。 (b) ジぺプチド合成活性を有する蛋白質の生産
ジペプチド合成活性を有する蛋白質は、 モレキュラー 'クロ一ニング第 2版、 カレ ント ·プロトコ一ルズ 'イン'モレキュラー'バイオロジ一等に記載された方法等を 用い、例えば以下の方法により、上記（a)の方法により取得した DNAを宿主細胞 中で発現させて、 生産することができる。
上記（a)の方法により取得した DNAをもとにして、必要に応じて、ジペプチド合 成活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さの DN A断片を調製する。 また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるよ うに、 塩基を置換することにより、 該蛋白質の生産率を向上させることができる。 該 PN A断片を適当な発現べクタ一のプロモーターの下流に揷入することにより、 組換え体 DN Aを作製する。
該組換え体 DNAを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することにより ジぺプチド合成活性を有する蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。 宿主細胞としては、細菌および酵母等、 目的とする遺伝子を発現できる微生物であ ればいずれも用いることができる。
発現べクタ一としては、上記宿主細胞において自立複製可能な V、しは染色体中への 組込が可能で、ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする DN Aを転写できる 位置にプロモー夕一を含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、ジぺプチド合成活性を有する蛋 白質をコードする DN Aを有する組換え体 DN Aほ、原核生物中で自立複製可能であ ると同時に、 プロモ一夕一、 リボソーム結合配列、 ジペプチド合成活性を有する蛋白 質をコ一ドする D N A、転写終結配列より構成された組換え体 D N Aであることが好 ましい。 プロモ一夕一を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現べクタ一としては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイ ム社製）、 pHelixl (ロシュ ·ダイァグノステイクス社製）、 K 233-2 (アマシャム · フアルマシア'バイオテク社製）、 PSE280 (ィ'ンビトロジェン社製）、 pGEMEX- 1 (プ
、 口'メガ社製）、 QE-8 (キアゲン社製）、 pET-3 (ノバジェン社製） pKYPIO (特開昭
5.8-110600) , pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl[Agric. Biol.
Chem., 53, 277 (1989)]、pGELl[Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 8 > 4306 (1985)]、
, Bluescriptll SK (十)、 pBluescript II KS (-) (ストラタジーン社製） 、 TrS30 [ェ シエリヒア'コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、 pTrS32 [ェシエリヒア ' コリ JM109/pTrS32(FERM BP- 5408)より調製]、 pPAC31 (W098/12343) pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、 pSTV28(宝酒造社製)、 pUC118 (宝酒造社製)、 pPAl (特開昭 63- 2 33798) 等を例示することができる。 ·
プロモ一夕一としては、ェシエリヒア ·コリ等の宿主細胞中で機能するものであれ ばいかなるものでもよい。例えば、 tr プロモー夕一（P^)、 lacプロモ一夕一 (p lac) ヽ 1 プロモ一夕一、 PRプロモ一夕一、 PSEプロモ一夕一等の、 ェシエリヒア ' コリゃファージ等に由来するプロモー夕一、 SP01プロモ一夕一、 SP02プロモ —夕一、 p enPプロモ一夕一等をあげることができる。また Ptrpを 2つ直列させた プロモー夕一、 tacプロモーター、 lacT7プロモ一夕一、 let 'Γプロモーターのよう に人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
プロモ一夕一としては、 バチルス属細菌中で発現させるための xylAプロモー夕上 [Appl. Microbiol. Biotechnol . , ， 594-599 (1991 )]やコリネバクテリウム属細 菌中で発現させるための P54-6ズロモ一夕一 [Appl. Microbiol. Biotechnol, , 53,
674-679 (2000)] なども用いることができる。 -. '
リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ （Shine-Dalgarao)配列と開始コド シとの間を適'当な距離 （例えば 6〜18核酸） に調節したプラスミドを用いることが 好ましい。
ジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする DNAを発現べクタ一に結合さ せた組換え体 DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝 子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体 D N Aとしては、例えば後述する PPE43をあげることができる。 宿主細胞として用いる原核生物としては、 ェシエリヒア属、バチルス属、 またはコ リネパクテリゥム属などに属する微生物、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ XL1-Blue、 ェシエリヒア 'コリ XL2- Blue、 ェシエリヒア ·コリ DH1、 ェシエリヒア 'コリ DH5 、 ェシエリヒア 'コリ MC1000、 ェシエリヒア 'コリ KY3276、 ェシエリヒア 'コリ
W1485s ェシエリヒア 'コリ JM101、 ェシェリヒア 'コリ JM109、 ェシエリヒア ·コ リ HB101、 ェシエリヒア 'コリ No.49、 ェシエリヒア 'コリ W3110、 ェシエリヒア ' コリ NY49、 ェシエリヒア 'コリ MP347 、 ェシエリヒア 'コリ 丽 522、 バチルス ·サ チリス ATCC33712、 バチルス■メガテリゥム (Bacillus megaterium) 、 バチルス · エスピー (Bacillus sp.) FERM BP-6030、 バチルス 'アミロリケファシエンス cillus amyloliauefaciens)、 バチルス .コアギュランス (Bacillus coagulans)、 バチルス · リケニフォルミス (Bacillus licheniformis)ヽ'バチルス ·プミルス （旦 acillus pumilus)、 コリネバクテリゥム ·グル夕ミカム ATCC13032、 コリネバクテ リウム .グルタミカム ATCC14297等をあげることができる。
組換え体 DN Aの導入方法としては、上記宿主細胞へ DN Aを導 λする方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69> 2110 (1972)']、 プロトプラスト法 （特開昭 63-248394)、 ェ レクトロボレ一シヨン法 [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988 )]等をあげることが できる。
サヅカロマイセス属に属する菌株を宿主細胞として用いる'場合には、発現べクタ一 として、 例えば、 YEpl3 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)ヽ YCp50 (ATCC37419) pHS19、 pHS15等を用いることができる。
プロモー夕一としては、サヅ力.ロマイセス属に属する菌株中で機能するものであれ ばいずれのものを用いてもよく、 例えば、 PH05プロ乇一夕一、 PGKプロモ一夕一、 G APプロモータ一、 ADHプロモ一夕一、 gal 1プロモー夕一、 gal 10プロモ一夕一、 ヒ —トショックポリペプチドプロモー夕一、 MF«1 プロモ一夕一、 CUP 1プロモ一夕一 等のプロモ一夕一をあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属等に属する菌株をあげることができ、具体 的には、 サヅカロマイセス 'セレピシェ等をあげることができる。
組換え体 DN Aの導入方法としては、酵母に DN Aを導入する方法であればいずれ も用いること^でき、例えば、エレクトロポレーシヨン法 [Methods Enzyraol . , 194, 182 (1990)]、 スフエロプラズト法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 889 (198 4)]、 酢酸リチウム法 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)]等をあげることができる。 (2)ジペプチドを生産する能力を有する微生物の、 a) 1個以上のぺプチダ一ゼお よび 1個以上のペプチド取り込み系蛋白質、 ま'たは b) 3個以上のぺプチダーゼ、 の 機能を低下または喪失させる方法
任意の微生物を宿主細胞に用いて、 上記（1)の （ii)の方法を実施することによ り、 ジペプチドを生産する能力を有する微生物を製造することができるので、該微生 物を用いて、 上記 （1) の （i) の方法を実施することにより、 1個以上のぺプチダ ーゼと 1個以上のぺプチド取り込み系蛋白質、または 3個以上のぺプチダ一ゼの機能 が低下または喪失した微生物であり、かつジぺプチドを生産する能力を有する微生物 を製造することができる。
また、本来の性質としてジぺプチドを生産する能力を有する微生物は、該微生物に 対し、 上記 （1 ) の （i) の方法を実施することにより、 本発明の微生物を製造する ことができる。
上記微生物としては、 ェシエリヒア属、バチルス属、 コリネパクテリゥム属または —サッカロマイセス属に属する微生物などをあげることができ、より好ましくはェシェ リヒア ·コリ、 バチルス ·サチリス、 コリネバクテリウム 'グル夕ミカムおよびサヅ カロマイセス 'セレビシェなどをあげることができる。
3 . 本発明のジペプチドの製造法
本発明の製造法としては、'
(i) 本発明の微生物の培養物または培養物の処理物を酵素源に用い、 該酵素源、 お よび 1種以上のァミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、 該媒体中にジぺプチドを生成、 蓄積させ、 該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法、
. (ii) 本発明の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、 該酵素源、 Lーァミノ酸エステルおよび L—ァミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中 にジぺプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺプチドを採取するジぺプチドの製 造法、 および
(iii)本発明の微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、 L—アミノ酸アミドおよび L—ァミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に ジぺプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺプチドを採取するジぺプチドの製造 法、 '
などをあげることができる。 .
上記 （i) の製造法において、 基質に用いられる 1種以上のアミノ酸、 好ましくは
1種または 2 のアミノ酸としては、 アミノ酸、好ましくは L一アミノ酸、 グリシン
(Gly)および^ーァラニン （ ?Ala)からなる群より選ばれるアミノ酸であれば、 い ずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。 L—アミノ酸としては、例え ば L-ァラニン (L-Ala) 、 L -グルタミン (L-Gln) 、 L -グルタミン酸 (L-Glu) 、 L -バ リン （L-Val) 、 L-ロイシン （L-Leu) 、 L-イソロイシン （L-Ile) 、 L-プロリン （L- Pro) 、 L-フヱニルァラニン （L- Phe) 、 L-トリプトファン （L-Trp) 、 L- チォニン
(L-Met) 、 L-セリン （L-Ser) 、 L-スレオニン （L- Thr) 、 L-システィン （L- Cys). 、 L-ァスパラギン （L-Asn) 、 L-チロシン （L- Tyr) 、 L-リジン （L-Lys) 、 L-アルギニ ン （L-Arg) 、 L-ヒスチジン （L-His) 、 L-ァスパラギン酸（L-Asp) 、 L-ひ-アミノ酪 酸 （L-α-ΑΒ) 、 L-ァザセリン （L- Azaserine) 、 L-テアニン （L-theanine) 、 L-4- ヒドロキシプロリン （L-4-HYP) 、 L-3-ヒドロキシプロリン （L- 3-HYP) 、 L-オルニチ ン （L- Orn) 、 L-シトルリン （L-Cit) および L- 6-ジァゾ -5-ォキソノルロイシン （L- 6-diazo- 5- oxo-norieucine) などをあげることができる。
上記 (i)の製造法に用いられる、 より好ましいアミノ酸としては、 L-Ala、 Gly、 L -Met、 L- Ser、 L-Thrおよび/? -Alaから選ばれる 1種のアミノ酸と L-Ala、 L-Gln、 L- Gluヽ Gly、 L-Vals L-Leu、 L-Ile、 L- Pro、 L-Phe、 L-Trp、 L- Metヽ L-Serヽ L-Thrヽ L- Cys、 L - Asnヽ L - Tyrヽ L-Lysヽ L - Argヽ L - Hisヽ L - Aspヽ L-ひ - AB 、 - Ala、 L-Azaserih e、 L-theanines L-4-HYP、 L - 3-HYP、 L-Ornヽ L-Citおよび L-6-diazo-5-oxo-norieuc ineから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 L-Glnと L - Pheの組み合わせ、 およ び L-ひ- ABと L-Gln、 L-Argまたは L-ひ- ABの組み合わせ、 さらに好ましくは L-Ala と L- Alaヽ L-Gln、 Glyヽ L-VaK L- Leuヽ L-Ile、 L-Pheヽ L-Trpヽ L-Met、 L-Serヽ L- Thr、 L-CyS L - Asn、 L - Tyr、 L- Lysヽ L - Argヽ L - Hisヽ L- α-ΑΒ 、 L-Azaserines L - Citおよ び L-theanineから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 Glyと L- Gln、 Gly、 L-Ph e、 L-Trps L- Met、 L-Ser, L-Thr、 L-Cys、 L- Tyr、 L- Lys、 L-Argヽ L-ひ- ABおよび L - Citから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 L-Metと L-Phe、 L- Met、 L- Ser、 L-T to、 L-Cyss L-Tyrs L-Lysおよび L-Hisから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 L-Serと L- Gln、 L-Phe、 L- Ser、 L-Thr, L-Tyr、 L- Hisおよび L-ひ- ABから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、' L- Thrと L-Gln、 L-Phe、 L-Leus L- Thrおよび L-ひ - A Bから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、 L-Glnと L-Pheの組み合わせ、 ?-Ala と L- Phe、 L-Mets L-Hisおよび L- Citから選ばれる 1種のアミノ酸の組み合わせ、お よび L- - ABと L-Gln、 L- Argまたは L- - ABの組み合わせをあげることができる。 上記 (i)の製造法において、基質として用いるアミノ酸ば、 0.1〜500g/L、 好まし くは 0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。 . 上記 （i) の製造法で製造されるジペプチドとしては、 下式 （I )
R 1 - R 2 (ェ） (式中、 R1および R2は、 同一または異なってアミノ酸を表す） で表されるジぺプ チドをあげることができ、 好ましくは、 上記式 （I) において R1および R2が同時' にまたは異なって、 L-Ala、 L- Gln、 L - Glu、 Gly、 'L- Val、 L-Leu、 L- Ile、 L- Pro、 L-P he、 L-Trp, L-KQ L- Ser、 L - Thrヽ L - Cys、 L- Asn、 .L-Tyrヽ L-Lyss L-Argヽ L - His、 L - Asp、 L- - AB、 ?-Ala、 L - Azaserine、 L-theanineヽ L-4- HYPヽ L-3-HYPヽ L-Oraおよ び L-6-diazo- 5- oxo-norleucineから選ばれるアミノ酸であるジぺプチドをあげるこ とができ、 より好ましくは R1が L- Ala、 Gly、 L-Met、' L- Ser、 L-Thrまたは/? -Alaの 場合は、 R2が L-Gln、 L - Gluヽ Glyヽ L- Val、 L-Leu, L-Ile、 L-Pro、 L-Phe、 L-Trp, L - Met、 L-Sers L-Thrs L - Cys、 L - Asn、 L-Tyr、 L-Lyss L- Arg、 L - His、 L-Asps L- a -A B、 ?- Ala、 L- Azaserineヽ L-theanineヽ L-4- HYPヽ L-3-HYPヽ L-Ornまたは L-6- diaz ρ-5-oxo-norleucineであるジペプチドをあげることができ、 さらに好ましくは、 R1 が L-Alaの場合は、 R2は L- Gln、 Glyヽ L-VaU L - Leu、 L-Ile、 L-Phe、 L-Trp、 L-ffe tヽ L-Ser、 L-Thrヽ L-Cys、 L - Asn、 L-Tyr、 L - Lys、 L-Arg, L-Hiss L-α-ΑΒ 、 L-Azas erineまたは L-theanineであるジぺプチド、 R 1が Glyの場合は、 R2は L-Gln、 Gly、 L-Trp, L- Met、 L-Ser、 L-Thr, L- Cys、 L-Tyr、 L-Lys、 L-Argまたは L-ひ- ABである ジペプチド、 R 1が L-Metの場合は、 R^¾L-Phe、 L- Met、 L- Cys、 L-Tyr、 L- Lysま たは L- Hisであるジペプチド、 R1が L- Serの場合は、 R2は L-Gln、 Gly, L- Phe、 L -Met, L-Ser、 L-Thrヽ L - Tyr、 L-Hisまたは L-ひ- ABであるジペプチド、 R1が L- Thr の場合は、 R2は L-Gln、 L-Gly、 L-Phe, L-Met, L-Ser、 L-Thrまたは L-α-ΑΒであ るジぺプチド、 R 1が L- Ginの場合は、 R 2は L-Pheまたは L-ひ- ABであるジぺプチ ド、 R1が L- Pileの場合は、 R2は L- Ginであるジペプチド、 R 1が L-Trpの場合は、 R 2は Glyであるジペプチド、 R1が L-Cysの場合は、 R2は L-Ala、 L-Gln、 Gly、 ま たは L-Metであるジペプチド、 R1が L- Lysの場合は、 R2は L-Ala、 Glyまたは L - M etであるジペプチド、 R1が L- Argの場合は、 R2は L -ひ- ABであるジペプチド、 R1 が L-Hisである場合は、 R2は L-Metであるジペプチド、 および R 1が L-ひ- ABの場 合は、 R2は L-Ala、 L-Gln, Gly、 L-Ser, L-Thr, L-Argまたは L- ABであるジぺ プチドをあげることができる。
. また上記製造法においては、 必要に応じて、 AT Pの供給源として、 本発明の微生 物が代謝して ATPを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、ェタノ一 ルのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中 加えることがで きる。
上記（ii)の製造法において、 基質に用いられる L—アミノ酸エステルおよび L一 アミノ酸としては、本発明の微生物が基質に用いてジペプチドを生成することができ る L—アミノ酸エステルおよび L—アミノ酸であれば、いずれの！ J—アミノ酸エステ ルと, L—ァミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよく、好ましくは L一アミノ酸ェ ステルが、 Lーァラニンエステル、 グリシンエステル、 L一バリンエステル、 L一^ r ソロイシンエステル、 L一メチォニンエステル、 L—フエ二ルァラニンエステル、 L ーセリンエステル、 L—スレオニンエステル、 L一グルタミンエステル、 L—チロシ ンエステル、 L—アルギニンエステル、 L—ァスパラギン酸一ひ一エステル、 Lーァ スパラギシ酸—/?—エステル、 L—ロイシンエステル、 Lーァスパラギン: tステル、 L—リジンエステル、 L—ァスパラギン酸一ひ， ?—ジメチルエステルおよび L一 ル夕ミン—ァ—エステルからなる群より選ばれる L一アミノ酸エステルであり、 L— アミノ酸が L-Gln、 L-Asn, Gly、 L-Ala, L- Leu、 L-Met、 L-Pro、 L-Phe、 L- Trp、 L-Se r、 L-Thrヽ L-Tyrヽ L-Lys、 L - Arg、 L- Hisおよび L- Gluからなる群ょり選ばれる ー ,アミノ酸をあげ.ることができる。
上記（ii)の製造法において、 基質として用いる L—アミノ酸エステルおよび L— アミノ酸は、 0.1〜500g/L、 好ましくは 0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中 に初発または反応途中に添カ卩する。
上記 (iii) の製造法において、 基質に用いられる L一アミノ酸アミ ドおよび L一 アミノ酸としては、本発明の微生物が基質に用いてジペプチドを生成することができ る L—アミノ酸アミ ドおよび L一アミノ酸であれば、いずれの L—アミノ酸アミ ドと L一アミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよく、好ましくは L一アミノ酸アミ ド が、 Lーァラニンアミド、 グリシンアミ ドおよび Lーァスパラギン酸アミ ドからなる 群より選ばれる L—アミノ酸アミ ドであり、 L—アミノ酸が L-Gln、 L-Asn、 Gly、 L- Alaヽ L-Val L-Leu、 L- lieヽ L- Met、 L- Pro、 L-'Phe、 L- Trp、 L-Ser, L-Thr、 L-Tyr L - Lys、 L-Arg、 L-Hisおよび L- Gluからなる群より選ばれる L一アミノ酸をあげるこ とができる。 ' 上記 （iii) の製造法において、 基質として用いる L—アミノ酸アミドおよび L一 アミノ酸は、 0.1〜500g/L、 好ましくは 0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中 に初発または反応途中に添加する。 . ，
本発明の製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しな い限り、 いかなる成分、 組成の水性媒体であってもよく、 例えば、 水、 りん酸塩、 炭 酸塩、.酢酸塩、 ほう酸塩、 クェン酸塩、 トリスなどの緩衝液などをあげることができ る。 また、 メタノール、 エタノールなどのアルコール類、 酢酸ェチルなどのエステル 類、 アセトンなどのケ十ン類、 ァセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。 ジペプチドの生成反応は水性媒体中.、 pH5〜ll、 好ましくは pH6〜10、 20〜60°C；、 好ましくは 25〜45°Cの条件で 2〜150時間、 好ましくは 6〜120時間行う。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。 界面活性剤としては、 ポリオキシエチレン'ォク夕デシルァミン（例えばナイミ ン S-215、 日本油脂社製） などの非イオン界面活性剤、 セチルトリメチルアンモニゥ ム 'プロマイドゃアルキルジメチル 'ベンジルアンモニゥムクロライド （例えばカチ オン F2-40E、 日本油脂社製） などのカチオン系界面活性剤、 ラウロイル ·ザルコシ ネ一トなどのァニオン系界面活性剤、 アルキルジメチルァミン （例えば三級アミン F B、 日本油脂社製） などの三級アミン類など、 ジペプチドの生成を促進するものであ ればいずれでもよく、 1種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤 は、 通常' 0. l〜50 g八の濃度で用いられる。 有機溶剤としては、 キシレン、 トルェ ン、 脂肪族アルコール、 ァゼトン、 酢酸ェチルなどがあげられ、 通常 0.1〜50 ml/1 め濃度で用いられる。
培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離し て得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、 該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の 酵素処理物、およぴ該菌体の固定化物などをあげることができる。 また、本発明の培 養物の処理物 は、 上記菌体を界面活性剤処理、超音波処理、機械的摩砕処理、 溶媒■ 処理または酵素処理等して得られる処理物から、不溶物等を除いて得られる蛋白質の 粗抽出物も含まれる。 '
培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該 酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質であるアミノ酸、 L—アミノ酸エス テルまたは L一アミノ酸アミド lmgあたり 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添加す る。
水性媒体中に生成、蓄積したジぺプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを 用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、 高速液体ク口マトグラフィ一等により行うことができる。
その他、 上記（ii)および（iii)の製造法は、 TO 03/010189または WO 03/010187の 記載に準じて行うことができる。
以下に、 本発明の実験例を示す。
実験例 1 バチルス 'サチリス由来の l遺伝子発現プラスミドの造成 .
バチルス ·サチリスの Mfijfi伝子断片を以下のようにして取得した。
パ一セプティブ 'バイオシステムズ社製 8905型 DN A合成機を用いて、 配列番号 35および配列番号, 36で表される塩基配列を有する DNA (以下、それそれプラ マ一 A、 プライマ一 Bと呼ぶ） を合成した。 プライマ一 Aは、 l遺伝子の閧始コ 'ドン （atg)を I'認識配列（cc^Sg)に置換した領域を含む塩基配列である。.ブラ イマ一 Bは、 I_の終止コドンを I HI認識配列 （gg tcc) に置換した領域を含む 塩基配列である。
バチルス ·サチリスの染色体: D N Aを錡型とし、上記プライマ一 Aおよびプライマ —Bをプライマ一セットとして用いた P CRを行った。 PCRは、 0.1 zgの染色体 DNA、 0.5 mol/Lの各プライマ一、 2.5 unitsの DNAポリメラ一ゼ、 4 Lの Pfu DNAポリメラ一ゼ用 X 10緩衝液、 200 mol/Lの各 dNTPを含む反応液 40 Lを調 製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すことによ り行った。
該反応液の 1八 0量をァガ口一スゲル電気泳動し、 l遺伝子断片に相当する約 1.
4kbの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノ一ル / クロ口ホルム溶液を添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に 2倍 容量の泠エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離し DNAの沈殿を得た。 該 DNAの沈殿を 20 zLの TEに溶解した。
.該溶解液 を用い、増幅した DNAを制限酵素 lおよび S HIで切断し、ァ ガロ一スゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、ジーンクリーン IIキット （B
10101社製） により、 l遺伝子を含む 1.4kbの DNA断片を回収した。 C末端 Hisタグ付加型組換え体発現べクタ一 PQE60 (キアゲン社製） 0.2 z を制限 酵素 lおよび で切断後、 ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離 し、 上記と同様の方法により 3.4kbの DNA断片を回収した。
上記で得られた l遺伝子を含む 1.4kbの D N A断片と 3.4kbの D N A断片をラ ィゲ一シヨンキット （宝酒造社製） を用いて、 16°Cで 16時間反応させ連結した。 該連結反応液を用いてェシヱリヒア 'コリ 丽 522株 （ストラタジーン社製） を力 ルシゥムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 69, 2110 (1972)〕に よって形質転換し、該形質転換体を 50 zg/inLのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗 布後、 30°Cで一晩培養した。 . ,
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 ' C末 Hisタグ付加型 l遺伝子発現ベクターである pQE60ywfEを得た。 該ベクター の構造を制限酵素消化により確認した' （図 1) 。
実験例 2 l遺伝子産物の取得
pQE60ywfE を保有するェシエリヒア'コリ 丽 522/pQE60ywfE株を 50 zg/mlのアン ピシリンを含む 8mlの L B培地の入った太型試験管に接種し 28°Cで 17時間培養した。 該培養液を 50 /g/mlのアンピシリンを含む 50mlの L B培地の入った 250ml容三角フ ラスコに接瘇し 30°Cで 3時間培養した後、 終濃度が 1腿 ol/Lになるようにィソプロ ピル一/?一 D—チォガラクトピラノシド (IPTG)を添加し、 さらに 30°Cで 4時間培養 'した。 該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。 該湿菌体から、 HisTrap (Hisタグ 付加タンパク精製キット、 Amersham Pharmasia Biotech社製) を用いて、 説明書に 従い Hisタグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例 3 His夕グ付加組換え型酵素を用いたジぺプチドの生産 （ 1 )
( i) 実験例 2で取得した精製した Hisタグ付加組換え型酵素 0.04mg、 100腿 ol/L の Tris-HCl(pH8.0)、 60腿 ol/Lの塩化マグネシウム、 60mmol/Lの ATP、 30mmol/Lの L -AlaN 30腿 ol/Lの L-Glnからなる 0.1mlの反応液を調製し、 37°Cで 16時間反応を行 つた。 '
反応終了後、 反応生成物をジニトロフヱノ一ル化法で誘導体化した後に HPLC法に より分析した。 HPLC法による分析は、 分離カラムに関東化学社製の Lichrosorb-RP - 18カラムを用い、溶離液として 1%(ν/ν)リン酸、 25%(v/v)ァセトニトリルを用 い、 0.7m l /分の流動速度で行った。 反応液中に 3.7g/Lの L-Ala—L- Ginと 0.3g/L の L-ァラニルー L-ァラニン （L-Ala— L-Ala) が生成蓄積していることを確認した。 (il)酵素を 0.01mg、 L-Glnの代わりに L-Phe、 L-Met、 L - Leuまたは L-Valを含有す る以外は、 上記（i)の反応液の組成と同じ反応液を調製し、 上記（i) の反応条件で 反応させた。
反応終了後、 上記（i )と同様の方法により反応生成物を分析し、 反応液中にそれそ れ、 7.0g/Lの L—ァラニルー L—フエ二ルァラニン （L-Ala— L-Phe) のみ、 7.0g/L の L—ァラニル— L—メチォニン（L- Al a-L-Met)および 0.03g/Lの L-Ala— L- Al a、 5.0g/Lの Lーァラニル— L一口イシン （L-Ala_L-Leu) および 0.2g/Lの L-Ala— L - Ala、 または 1.6g/Lの L—ァラニルー L _パリン （L-Ala— L- Val,) および 0.3g/Lの L-Ala— L-Alaが生成蓄積していることを確認した。
(iii)酵素を 0.01mg、 L-Alaの代わりに Gly、 L- Ginの代わりに L-Pheまたは を含有する以外は、上記（i )の反応液の組成と同じ反応液を調製し、上記（i )の反応条 件で反応させた。
反応終了後、 上記 (i )と同様の方法により反応生成物を分析し、 反応液中にそれそ れ 5.2g/Lのグリシル— L—フェニルァラニン（Gly— L- Phe)または 1. lg/Lのグリシ ル _ L _メチォニン （Gly—L-Met) が生成蓄積していることを確認した。
上記反応液組成から ATPを除くとジぺプチドは全く生成されなかった。
以上の結果から、 E遺伝子産物は、 ATP存在下において、 L-Alaと IHUn、 L-Ph e、 L-Met L- Leuまたは L-Valとから、 L- Ala— L-Glnおよび L-Ala— L-Ala、 L-Ala— L-Phe、 L-Ala— L-Metおよび L-Ala— L-Ala、 L-Ala— L-Leuおよび L- Ala— L- Ala、 ま たは L-Ala-L-Valおよび L-Ala— L- Alaを生成する活性、 Glyと L-Pheまたは L-Met とから Gly— L- Pheまたは Gly— L-Metを生成する活性を有することが明らかになった。 実験例 4 Hisタグ付加組換え型酵素を用いたジペプチドの生産 （2 )
実験例 2で得られた精製した Hisタグ付加組換え型酵素 0.04mg、 100腿 ol/Lの Tri ' s-HCl (pH8.0 )、 60腿 ol/Lの塩化マグネシウム、' 60腿 ol/Lの ATPからなる 0.1mlの反 応液を調製し、表 1の第 1行目と最左列のァミノ酸の組み合わせからなる各種 L—ァ ミノ酸、 Glyまたは/?- Alaをそれそれ 30醒 ol/Lずつになるように反応液に添カ卩し、 3
7°Cで 16時間反応を行つた。 反応終了後、 反応生成物を HPLC分析したところ、 第 1 表に示すジペプチドが生成していることが確認された。
Figure imgf000038_0001
 1表一 2
Figure imgf000039_0001
第 1表一 3
Figure imgf000040_0001
第 1表の第 1行目と最左列に記載の 2種類（もしくは 1種類)の L—アミノ酸、 Gly または/? -Alaを基質として反応した場合に生成したジペプチドを枠内に記載した。 〇は配歹 }Jは未確定だがジぺプチドが生成したこと、 Xはジぺプチドの生成が確認され なかったこと-、 および空欄は未実施を示す。 '
実験例 5 His夕グ付加組換え型酵素発現株を用いたジぺプチドの生産
• 実験例 1で得られたェシエリヒア 'コリ 丽 522/pQE60ywfE株を 50〃g/mlのアンピ シリンを含む 8ml.の L B培地の入った太型試験管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。 該培養液を 50〃g/mlのアンビシリンを含む 50mlの L B培地の入つた 250ml容三角フ ラスコに接種し 30°Cで 3時間培養した後、終濃度が lmmol/Lになるように IPTGを添 加し、 さらに 30°Cで 4時間培養した。 該培養液を遠心分離し湿菌体を取得した。
200g/Lの湿菌体、 50g/Lのグルコース、 5g/Lのフィチン酸 （33%の濃水酸化ナト リウム溶液を用いて中性になるよう希釈） 、 15g/Lのリン酸二水素カリウム、 5g/L の硫酸マグネシウム ' 7水和物、 / Lのナイミーン S- 215、 10ml/Lのキシレン、 200 腿 ol/Lの L-Ala、 200腿 οΙ/L·の L-Glnからなる 20mlの反応液 (ρΉ7.2) を 50ml容量 のビ一力一に入れ、 32°C；、 900rpmの条件下で 2時間反応を行った。 反応中は 2mol/L の水酸化カリウムを用いて反応液の pHを' 7 . 2に保った。 '
反応生成物を実験例 3記載の方法と同様の方法で分析したところ、 25mg/Lの L-A1 a— L- Ginの蓄積が確認された'。 + '
実験例 6 バチルス属に属する各種微生物からの ywfE遺伝子に相当する遺伝子の夕 ローニングとその解析
配列番号 2 6で表される塩基配列に基づき、 バチルス 'サチリス ATCC15245、 ATG C6633、 I皿 213、 匪107ヽ I皿 214、 ATCC9466、 I厘 033、 ATCC21555 バチルス ·ァ ミロリケファシエンス IFO3022、 およびバチルス ·プミルス NRRL B-12025に存在 する l遺伝子に相当する遺伝子を以下のようにして取得した。
まず、 バチルス ·サチルス ATCC15245, ATCC6633、 IAM1213, 1皿107ヽ 1舰214、 A TCC9466, IAM1033N ATCC21555、 バチルス 'アミノリケファシエンス IFO3022、 およ びバチルス ·プミルス NRRL B-12025をそれそれ LB培地に植菌し 30°Cで一 B免静置培 養した。培養後、 カレント 'プロトコールズ ·ィン 'モレキュラー ·バイオロジーに 記載の飽和フエノ一ルを用いる方法により、該微生物の染色体 D N Aをそれぞれ単離 精製した。
パ一セプティプ ·バイオシステムズ社製 8905型 DNA合成機を用いて、 配列番号 3 7および 3 8で表される塩基配列を有する D N A (以下、 それぞれプライマ一 C、 プ ライマ一 Dと I ぶ） を合成した。 プライマ一 Cは、 バチルス 'サチリス 168株の染 色体 D N Aの 遺伝子の開始コドンより上流を含む領域の配列である。 プライマ 一 Dは、 ywfE遺伝子の終止コドンより下流を含む配列と相補的な配列である。
バチルス ·サチルス ATCC15245, ATCC6633、 I皿 213、 1皿107ヽ 1厘214、 ATCC94
66、 IAM1033、 ATCC21555、 またはバチルス 'アミノリケファシエンス IFO3022の染 色体 D N Aを錶型とし、上記ブライマ一 Cおよびブラィマー Dをブラィマ一セヅトと して用いて P CRを行った。 P CRは、 0.1〃gの染色体 DNA、 0.5〃mol/Lの各プ ライマ一、 2.5 unitsの Bin DNAポリメラ一ゼ、 /Lの Pfu DNAポリメラーゼ用 x 1 0緩衝液、 200 /mol/Lの各 dNTPを含む反応液 40〃'Lを調製し、 94°Cで 1分間、 55°C で 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
該反応液の 1八 0量をァガロースゲル電気泳動し、 ywfE遺伝子断片に相当する約 1. 4kbの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フエノ一ル / クロ口ホルム溶液を添カ卩し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、 2倍 容量の冷エタノールを加えて混合し、 -80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離し て得られた DNAの沈殿を 20 /Lの TEに溶解した。
上記で得られた各菌株染色体 D N A由来の Ί .4kb断片と pCR-blunt (インビトロジ ェン社製）を、 ライゲ一シヨンキットを用いて、 16°Cで 16時間反応を行い連結した1; 該反応液を用いてェシエリヒア 'コリ 丽 522株をカルシウムイオンを用いる方法 によって形質転換した後、 50 g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培 ¾feに塗布して、 30°Cで一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従つてプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてそれそれの構造を解析することにより、 l遺伝子に相当する遺 伝子を含むプラスミドである pYWFEl (ATCC15245株由来、配列番号 65で表される塩 基配列を有する DNA)、 pYWFE2 (ATCC6633株由来、 配列番号 27で表される塩基 配列を有する DNA)、 pYWFE3 (IAM1213株由来、 配列番号 28で表される塩基配列 を有する DNA)、 pYWFE4 (IAM1107株由来、 配列番号 29で表される塩基配列を有 する DNA)、 PYWFE5 (IAM1214株由来、 配列番号 30で表される塩基配列を有する DNA)、 pYWFE6 (ATCC9466 ¾由来、 配列番号 26で表される塩基配列を有する D NA)、pYWFE7(IAM1033株由来、配列番号 65で表される塩基配列を有する D NA'；)、 PYWFE8 (ATCC21555株由来、 配列番号 31で表される塩基配列を有する D NA)、 pY WFE9 (IFO3022株由来、 配列番号 32で表される塩基配列を有する D ΝΑ) が取得さ れていることを確認した。
.一方、バチルス ·プミルス NRRL B-12025由来の l遺伝子に相当する遺伝子（配 列番号 64で表される塩基配列を有する DNA) は以下のように取得した。 上記で調製した NRRL B- 12025株の染色体 DN Aを錡型にし、 配列番号 66および 67で表される塩基配列からなる DNAをプライマ一セヅトとして用いて、: P CRを 行った。 PCRは、 0.1 /gの染色体 DNA、 0.5 zmol/Lの各プライマ一、 2.5 unit sの Z-taqポリメラ一ゼ （夕カラバイオ社製） 、 5 zLの Z- taq ポリメラ一ゼ用 x 10 緩衝液 （夕カラバイオ社製） 、 200 Zfflol/L の各 dNTPを含む反応液 50 zLを調製し、 98°Cで 5秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間の工程を 30回繰り返すことにより行つ た
該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 約 0.8kbの断片が増幅している ことを確認後、残りの反^液と等量の TE飽和フエノ一ル /ク口口ホルム溶液を添カロ'し、 混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷ェ夕ノ一ルを加え て混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られた DNAの沈殿を 20 zLの TEに溶解した。 '
上記で得られた各菌株染色体 DNA由来の 0.8kb断片と pGEM T-easy (プロメガ社 製）を、 ライゲ一シヨンキヅトを用いて、 16°Cで 16哼間反応を行い連結した。
該反応液を用いてェシエリヒア'コリ DH5 株を'カルシウムイオンを用いる方法に よって形質転換した後、 50 /g/mlのアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°C で一晩培養した。
上記で得られた形質転換体からプラスミドを抽出して、約 0 · 8kbの挿入 D N A断片 の塩基配列を決定したところ、配列番号 64で表される塩基配列中の塩基番号 3 5 8 〜1 1 6 0番からなる塩基配列が確認された。
次に該プラスミドを で切断した後、ァガロースゲル電気泳動により DNA断 片を分離した。 該 DNA断片をジーンクリーン IIキットを用いて精製した。 約 0.5 〃gの該精製 DNA断片を、 DI—G-ハイプライム DNAラベリング &デテクシヨン ス夕 —夕ーキット I (ロシュ.ダイァグノステイクス社製）を用いて、 DIGラベル化した。 DIGラベル化は、 該キヅト添付の説明書に従って行った。
上記で得られた DIGラペル化 DN Aを用いて'、 NRRL B-12025株の染色体 D N Aの サザン解析を行った。
NRRL B - 12025株の染色体 DNAを I HI、 ECORK Hindi I I Kpn Pstl、 Sacl、 S allおよび ilを用いてそれぞれ完全消化し、 ァガロース電気泳動により DNA断 片を分離した後、常法に従いナイロンメンプレンプラスチャージ（ロシュ 'ダイァグ ノステイクス社製） に転移させた。
UVを照射することにより、 該ナイロン膜に D N A断片を固定した後、 上記プロ一 ブ D N Aおよび該ナイ口ン膜を用いてサザンハイプリダイゼ一ションを行った。 ハイブリダィゼ一シヨンは、該プローブ D N Aと該ナイロン膜を 65°Cで 16時間接 触させ、 その後該ナイロン膜を、 0.1 %SDSおよび 2 XSSCからなる溶液を用い、 室温 で 5分間、 2回洗浄し、 さらに 0.1%SDSおよび 0.5 XSSCからなる溶液を用い、 .65°C で 15分間、 2回洗浄すること,で行い、 その他の操作、 条件およびハイプリダイズし た D N Aの検出は、 上記した DIG-ハイプライム DNAラベリング &デテクシヨン ス 夕一夕ーキヅト Iに添付されている説明書に準じて行った。
その結果、 Hindi IIおよび Iの完全消化断片の 3. 5kbp付近に発色が見られた。 次に、 NRRL B-12025株の染色体 D NAを Si dinおよび lを用いてそれそれ 全消化し、ァガロースゲル電気泳動により D NA断片を分離した。それそれの制限酵 素消化 D NAから 3-4kbpの断片をジーンクリーン IIキヅトを用いて精製し、ライゲ —シヨンキットを用いて自己環化させた。 '
上記で決定した 0.8kbの D N A断片の塩基配列に基づき、配列番号 7 1および 7 2 で表される塩基配列を設計、合成し、上記で取得した環ィ匕 D NAを錶型として P C R を行った。 P C Rは、 10ngの璟化 D NA、 0.5 zmol/Lの各プライマ一、 2.5 units の pyrobestポリメラ一ゼ （夕カラバイオ社製） 、 5〃Lの pyrobestポリメラ一ゼ用 X 10緩衝液（夕カラバイオ社製）、 200〃mol/Lの各 dNTPを含む反応液 50 /Lを調製 し、 98°Cで 5秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 3分 30秒間の工程を 30回繰り返すこと により行った。
該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 約 3.0kbの断片が増幅している ことを確認後、残りの反応液と等量の TE飽和フヱノール /ク口口ホルム溶液を添加し、 混合した。該混合液を遠心分離して得られた上層に、 2倍容量の冷エタノールを加え て混合し、 -80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られた D NAの沈殿を 20 Lの TEに溶解した。
.上記で得られた D N A断片と Zero Blunt PCR Cloning Kit (インビトロジェン社 製） とをライゲ一シヨンキットを用いて連結した。 該反応液を用いてェシエリヒア 'コリ丽 522株をカルシウムイオンを用いる方法に よつて形質転換した後、 50〃g/mlのアンビシリンを含む LB寒天培地に塗布して、 30°C で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてその構造を解析することにより、 遺伝子に相当する遺伝子を 含むプラスミドである pYWFElO (NRRL B- 12025株由来、配列番号 6 4で表される塩基 配列を有する D N A) が得られていることを確認した。
上記で得られた pYWFEl〜pYWFE10に含まれる L遺伝子に相当する各遺伝子の塩 基配列を塩基配列分析装置 373Α · D N Aシークェンサ一を用いて決定した。
pYWFEl, pYWFE6および pYWFE7に含まれる遺伝子にコ一ドされる蛋白質のアミノ酸 配列は、 i_遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸配列と同一であつたが、 pYWFE 2、 pYWFE3、 pYWFE4、 pYWFE5s pYWFE8、 pYWFE9および pYWFElOに含まれる遺伝子に 3 —ドされる蛋白質のアミノ酸配列は、 L遺伝子にコードされる蛋白質のアミノ酸 配列と異なっていた。 .
PYWPE2, pYWFE3, pYWFE4 pYWFE5、 pYWFE8、 pYWFE'9、 pYWFElOおよび pYWFElと pY
WFE7に含まれる i遺伝子に相当する遺伝子にコ—ドされる蛋白質のアミノ酸配列 を配列番号 2 0〜 2 5、 6 8および 1 9に、該遺伝子の塩基配列を配列番号 2 7〜 3 2、 6 5および 2 6にそれそれ示した。
実験例 7 C末端 Hisタグ付加型組換え型ジペプチド合成酵素の精製
バチルス ·サチルス ATCC15245 ATCC6633、 1晨213ヽ IAM1107、 1颜214、 ATCC94 66、 IAM1033、 ATCC21555 またはバチルス ·アミノリケファシエンス IFO3022の染 色体 D N Aを錶型とし、実験例 1記載のブラィマ一 Aおよぴプライマ一 Bをプライマ —セットとして用いて P C R 行った。 P C Rは、 0 . 1〃gの染色体 D N A、 0 . 5 zmo 1/Lの各プライマー、 2. 5 unitsの Efi DNAポリメラ一ゼ、 の £in DNAポリメラ —ゼ用 X 10緩衝液、 200 mol/Lの各 dNTPを含む反応液 40 zLを調製し、 94°Cで 1 分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
バチルス ·プミルス NRRL B-12025の染色体 D N Aを錶型とした場合は.、 配列番号 6 9および 7 0で表される塩基配列を有する D N Aをプライマ一セヅトとして用い、 上記と同様の条件で P C Rを行った。 該反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 断片に相当する約 1.4kbの D N A断片がそれそれ増幅していることを確認後、 残りの反応液と等量の TE飽和フ エノ一ル /クロ口ホルム溶液を添カ卩し、 混合した。 該混合液を遠心分離して得られた 上層に、 2倍容量の冷ェ夕ノ一ルを加えて混合し、 -80°Cに 30分間放置した。該溶液 を遠心分離して得られた DNAの沈殿を 20〃Lの TEに溶解した。
該溶解液のそれそれ' を用い、 増幅した DNAを制限酵素 lおよび 2 HI で切断し、ァガロースゲル電気泳動により DNA断片を分離した後、ジーンクリーン. IIキットを用いて、 l遺伝子に相当する遺伝子を含む 1.4kbの DNA断片を回収 した。
次に C末端 Hisタグ付加型組換え体発現べクタ一 PQE60 を制限酵素 Iお よび脑 ιΗΙで切断後、ァガ口一スゲル電気泳動により DNA断片を分離し、上記と同 様の方法により 3.4kbの DNA断片を回収した。
上記で得られたバチルス ·サチルス 168株の l遺伝子に相当する遺伝子を含む 1.4kbの DNA断片、 および 3.4kbの D N A断片をライゲ一シヨンキヅトを用いて、 16°Cで 16時間反応を行いそれそれ連結した。該反応液を用いて大腸菌匪 522株を力 ルシゥムイオンを用いる方法により形質転換した後、 50 zg/mlのアンピシリンを含 む LB寒天培地に塗布して、 30°Cでー晚培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 制限酵素を用いてそれらの構造を解析することにより、 C末 His夕グ付加型遺伝キ発 現べクタ一である pQE60ywfEl (ATCC15245由来の遺伝子を含有するべクタ一） 、 pQE 60ywfE2 (ATCC6633由来の遺伝子を含有するべクタ一) 、 QE60ywfE3 (IAM1213,由来 の遺伝子を含有するべクタ一）、 pQE60ywfE4 (IAM1107由来の遺伝子を含有するべク 夕一）、 QE60ywfE5 (IAM1214'由来の遺伝子を含有するべクタ一)、 pQE60ywfE6 (AT GC9466由来の遺伝子を含有するべクタ一）、 pQE6'0ywfE7 (IAM1033由来の遺伝子を含 有するベクター）、 pQE60ywfE8 (ATCC21555由来の遺伝子を含有するべクタ一）、 pQ E60ywfE9 (IFO302 由来の遺伝子を含有するべクタ一）、 および pQE60ywfE10 (NRRL B-12025由来の遺伝子を含有するべクタ一） が取得されていることを確認した。
•上記で得られたェシェリヒア：コリ NM522/pQE60 wfEl〜匪 522/pQE60ywfE10株を、 それそれ 50 zg/mlのアンピシリンを含む 8mlの L B培地の入った太型試験管に接種 し、 28°Cで 17時間培養した。 該培養液を 50 g/mlのアンピシリンを含む 50mlの L B培地の入った 250ml容の三角フラスコに接種し 30°Cで 3時間培養した後、 終濃度 が 1腿 ol/Lになるように IPTGを添カ卩し、 さらに 30°Cで 4時間培養した。該培養液を 遠心分離して得られた湿菌体から、 HisTrapをその使用説明書に従って用いて、 His タグ付加組換え型酵素を精製した。
実験例 8 精製酵素を用いたジペプチドの生産
実験例 7で得られた組換え型酵素 04mg、 100匪 ol/Lの Tris- HCl (pH8 . 0 )、 60腿 ol /Lの塩化マグネシウム、 60mmol/Lの ATP、 30mi?iol/Iiの L- Alaおよび 30讓 ol/Lの L-G Inからなる 0 . 1mlの反応液を調製し、 37°Cで 16時間反応を行った。
反応終了後、実験例 3記載の方法により反応液を分析した結果、それそれ、 3 . 0〜3 . 5g/Lの L-Ala-L-Glnおよび 0 . 25〜0. 3g/Lの L-Ala-L-Alaが生成蓄積していること が確認された。
また、上記反応液組成から 'ATPを除くと L- Ala-L-Glnおよび L-Ala-L-Alaは全く^ 成されなかった。
以上の結果から、 実験例 7で得られた遺伝子の産物は、 いずれも ATP存在下で L-A laと L-Glnとから L-Ala-L-Glnおよび L-Ala-L-Ala 'を生成する活性を有することが 明らかになった。
実験例 9 l遺伝子の発現を強化した大腸菌の造成
パ一セプティブ ·バイオシステムズ社製 8905型 D N A合成機を用いて、 配列番号 6 0〜6 3に記載の配列をそれぞれ有する D N A (以下、 それそれプライマ一 E、 プ ライマ一 F、 プライマ一 G、 プライマー H ) を合成した。配列番号 6 0の配列は、 プ ラスミド pQE60ywfEの ywf Eのリポソ一ム結合配列であるシャインーダルガノ配列を 含む領域について 5 'に l認識配列を含む配列を付加したものである。配列番号 6 1,の配列は、 ywfEの終止コドンを含む配列と相補的な配列の 5 'に Ι ΗΙ認識配列を 含む配列を付加したものである。 また配列番号 6 2の配列は、 trpプロモー夕一を含 む発現ベクター pTrS30の trpプロモーター領域の配列について 5 'に 認識配列 を含む配列を付加したものである。配列番号 6 3の配列は、 プロモー夕一を含む 発現べクタ一 pTrS30の プロモー夕—領域の配列と相補的な配列の 5 'に l認識 配列を含む配列を付加したもの'である。
プラスミド pQE60ywfEを鎳 とし、 断片の増幅には上記のプライマ一 Eおよ びプライマ一 Fを、 プロモーター領域の断片の増幅にはプライマ— Gおよびブラ イマ一 Hをそれそれプライマ一セットとして用いた P C Rを行った。 P C Rは、 10η の pQE60ywfE、 0.5〃mol/lの各プライア一、 2.5 unitsの £in DNAポリメラ一ゼ、 4〃1の £ DNA.ポリメラ一ゼ用 X 10緩衝液、 00 /mol/lの各 dNTPを含む 40〃 1の 反応液を調製し、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72PCで 3分間の工程を 30回繰り返 すことにより行った。
該反応液の 1八 0量をァガロースゲル電気泳動し、 プライマー Eおよびプライマー Fを用いた P C Rでは ywfE遺伝子断片に相当する約 1 · 4kb、 プライマー Gおよびプ ライマ一 Hを用いた反応では プロモ—夕一領域の断片に相当する約ひ.3kbの断片 がそれそれ増幅していることを確認後、 残りの反応液と等量の TE飽和フエノ一ル / クロ口ホルム溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離後、得られた上層に 2倍容 量の冷エタノールを加えて混合し、 - 80°Cに 30分間放置した。該溶液を遠心分離して 得られた D NAを 20 /1の TEに溶解した。
上記で得られたそれそれの D Ν Α溶液 5 1を用い、 プライマ一 Εおよびプライマ ― Fで増幅した ί) N Aを制限酵素 lおよび iHIで、 またプライマー Gおよびプ ライマ一 Hで増幅した D N Aを制限酵素. EcoRIおよび馳1で切断し、 ァガ口一スゲ ル電気泳動により MA断片を分離した後、 ジーンクリーン IIキットにより、 それそ れ l遺伝子を含む 1.4kbおよび プロモー夕一領域を含む 0.3kbの DNA断片を 回収した。 ,
0.2 zgの _プロモー夕一を含む発現べクタ一 pTrS30を制限酵素 および^ HHIで切断後、 ァガロースゲル電気泳動により D NA断片を分離し、 同様に 4.5kb © D NA断片を回収した。
上記で得られた U1伝子を含む 1.4kb断片、 プロモー夕一領域を含む 0.3k b断片および 4.5kbの断片をライゲ一シヨンキヅトを用いて、 16°Cで 16時間、 連結 "汉 Jit、を丁った。
該反応液を用いて大腸菌丽 522株をカルシウムイオンを用いる方法に従つて形質 転換し、該形箄転換体をアンピシリン 50〃g/mlを含む LB寒天培地に塗布後、 30°Cで 一晩培養した。
.生育してきた形質転換体のコ Dニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、 プロモー夕一下流に L遺伝子を含む発現べクタ一である PPE56を得た。 該ぺ クタ一の構造を制限酵素消化により確認した （図 2 ) 。 図面の簡単な説明
第 1図は、 Hisタグ付加型 y f t伝子発現ベクターである pQE60ywfEの構築過程 を示す図である。
第 2図は、 zif 遺伝子発現強化型べクタ一である PPE56の構築過程を示す図であ る。
各図中の符号の意味は以下のとおりである。
PT5； T5プロモーター '
Ptrp; トリプトファンプロモーター
以下に本発明の実施例を示すが、下記実施例は本発明の範囲を制限するものではな い。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 epD遺伝子、 uepN遺伝子、' pepB遺伝子、 epA遺伝子および dppオペロ 欠損株の作製 '
ェシエリヒア.コリ染色体 D N A上の特定遺伝子が欠損した菌株は、ラムダファ一 ジの相同組換え系を利用した方法 [Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 97, 6641-6645 (2 000) ] に従って作製した。
以下に記載のプラスミド pKD46、 pKD3および pCP20は、 ェシエリヒア 'コリ ジェ ネティヅク ス小ヅク セン夕一（米国エール大学）から該プラスミドを保持するェシ エリヒア ·コリ株を入手し、 該大腸菌から抽出したものを用いた。
( 1 ) 遺伝子欠損用 D N A断片のクローニング ' ェシエリヒア'コリ K12株の染色体 D NA上に存在する配列番号 1 0で表される塩 基配列を有する 遺伝子、配列番号 1 1で表される塩基配列を有する pepN遺伝子、 配列番号 1 2で表される塩基 列を有する 遺伝子、 配列番号 1 3で表される塩 基配列を有する 遺伝子および配列番号 1 4で表される塩基配列を有する dppA 遺伝子、 配列番号 1 5で表される塩基配列を有する 遺伝子、 配列番号 1 6で表 される塩基配^を有する dppC遺伝子、配列番号 1 7で表される塩基配列を有する 遺伝子および配列番号 1 8で表される塩基配列を有する M t伝子を欠損させる とを目的に 、'一セプティブ 'バイオシステムズ社製 8905型 D N A合成機を用い、 ェシエリヒア'コリ K12株の染色体 D N A上における各々の欠損標的遺伝子の上流お よび下流に位置する 36bpからなる塩基配列と相同な塩基配列、 および配列番号 3 9 で表される酵母由来 Flp recombinaseが認識する塩基配列を有する D N Aを合成し た。 ただし、 dppA遺伝子、 dppB遺伝子、 dppC遺伝子、. ^El遺伝子および 遺伝 子は、オペロンを形成しているので、該ォペロンの上流および下流に位置する塩基配 列と相同な塩基配列を有する D NAを合成した。 ·
すなわち、 遺伝子欠損用 D NA断片増幅用プライマーセットとして配列番号 4 0および 4 1、 遺伝子欠損用 D NA断片増幅用プライマ一セットとして酉己列 番号 4 2および 4 3、 遺伝子^損用 D N A断片増幅用プライマ一セヅトとして 配列番号 4 4および 4 5、 遺伝子欠損用 D NA断片増幅用プライマ一セットと して配列番号 4 6および 4 7、 オペロン欠損用 D N Α断片増幅用プライマ一セヅ トとして配列番号 4 8および 4 9で表される塩基配列からなる D NAをそれそれ合 成した。
次に、上記合成 D N Aをプライマ一セヅトとして用い、 PKD3D NAを銪型として C Rを行った。 ？〇1^は101¾のプラスミ ド D NA、 0.5 /mol八の各プライマ一、 2. 5units の Ein DNAポリメラ一ゼ (ストラ夕ジーン社製)、 4 lの DNAポリメラ一. ゼ用 X 1 0緩衝液（ストラタジーン社製)、 200 /mol/l の各 deoxyNTP (dATP dGTP、 dCTPおよび TTP) を含む 40 1の反応液を用い、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°C で 3分間の工程を 30回繰り返すことにより行った。
そ lそれの反応液の 1/10量をァガロースゲル電気泳動し、 目的の断片が増幅して いること.を確認後、 残りの反応液と等量の T E ClOmmol/1 Tris- HCl (pH8.0)、 1腿 ol /1 EDTA〕飽和フエノール/クロ口ホルム （lvol八 vol) を添加し、 混合した。
該混合液を遠心分離後、 得られた上層に 2倍容量の冷エタノ一ルを加えて混合し、 -80°Cで 30分間放置した。該溶液を遠心分離し、 epD遺伝子、 epN遺伝子、 pepB遺 伝子、 n _遺伝子およぴ dTOォペロン欠損用クロラムフエニコ一ル耐性遺伝子含有 D N A断片を取得した。
( 2 ) 2 ϋ伝子欠損ェシヱリヒア 'コリ JM101の作製
大腸菌 JM101株を ρΚΜ6で形質転換し、 lOOmg八のアンピシリンを含む LB寒天培 地に塗布し、 30°Cで培養することで選択した。 · '
, プラスミド pKD46上には ARed recombinase遺伝子が挿入されており、 またその発 現は L-ァラビノースにより誘導されるよう設計されている。 よって、 L-ァラビノー ス存在下で生育させた大腸菌を、直鎖状 D N Aを用いて形質転換すると、高頻度で相 同組換えが起こる。また PKD46は温度感受性の複製起点を有するために、 42°Cで生育 させることにより、 プラスミドを容易 脱落させることができる。
10腿 ol の L-ァラビノースと 50 zg/mlのアンピシリンを添加して培養して得られ た大腸菌 JM101/pKD46に、 電気パルス法により上記で取得した 遺伝子欠損用ク 口ラムフェニコ一ル耐性遺伝子含有 D N A断片を導入し、大腸菌 JM101の染色体 D N A上に 遺伝子欠損用クロラムフエ二 'コール耐性遺伝子含有 D N A断片が相同組 換えにより組込まれた形質転換株を 25mg八のクロラムフヱ二コールを含む LB寒天培 地 （バクトトリプトン 10g/l、 バクトイ一ストエキストラクト 5g八、 塩化ナトリウ ム 5g八、 寒天 15g八） に塗布し、 30°Cで培養することで選択した。
選択したクロラムフエニコ一ル耐性株を、 25mg のクロラムフエニコ一ルを含む L B寒天培地に植菌し、 42°Cで 14時間培養した後、 単コロニー分離した。 得られた各 コロニーを 25mg八のクロラムフヱニコ一ルを含む LB寒天培地、及び lOOmg/1のァ > ピシリンを含む LB寒天培地にレプリカし、 37°Cで培養し、 クロラムフエニコ一ル耐 性かつアンピシリン感受性を示すコ口二一を選択することにより、 pKD46脱落株を取 得した。
次に上記 得られた PKD46脱落株を pCP20を用いて形質転換し、 lOOmg/1のアンピ シリンを含む！; B寒天培地上で選択する.'ことにより、 pCP20を保持する PKD46脱落株 'を取得した。
プラスミド PCP20には酵母由来 Flp recombinase遺伝子が揷入されており、該遺伝 子の発現は 42°Cで誘導されるよう設計されている。
また、上記で作製した £ ^遺伝子、 pe 遺伝子、 pepB遺伝子、 pepA遺伝子及び d オペ口ン欠損用クロラムフヱニコ一ル耐性遺伝子含有 D N A断片の、 クロラムフ ェニコール耐性遺伝子の両端こは Flp recombinaseが認識する塩基配列が存在する ため、 Flp recombinaseが触媒する相同組換えにより容易に該耐性遺伝子を脱落させ ることができる。 ' さらに、 PCP20は温度感受性の複製起点を有しているため、 pCP20保持株を 42°Cで 生育させることにより、 Flp recombinaseの発現と pCP20の脱落を同時に誘導するこ とができる。 '
上記で取得した PCP20保有 pKD46脱落株を薬剤無添加の LB寒天培地に植菌し、 42°C で 14時間培養した後、 単コ r二一分離した。 得られた各コロニーを薬剤無添加 LB 寒天培地、 25mg/lのクロラムフヱニコールを含む LB寒天培地および 100mg/lのアン ピシリンを含む LB寒天培地にレプリカして、 30°Cで培養し、 クロラムフエニコ一ル 感受性かつアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体 D N Aを常法 (生物工学実験書、 日本生物 工学会編 97〜98ページ、 培風館、 1992年）に従って調製した。 欠損の標的遺伝子で ある E^L遺伝子の内部塩基配列に基づいて設計した配列番号.5 0および 5 1で表さ れる塩基配列を有する D N Aをプライマ一セヅトとして用い、染色体 D N Aを錶型に した P C R'を行った。 P C Rは、 0.1 /gの染色体 D NA、 0.5〃mol/lの各プライマ ―、 2. 5units の £i DNAポリメラ一ゼ、 4 z lの DNAポリメラ一ゼ用 x 1 0緩衝 液、' 200 zmoi/l の各 deoxyNTPを含む 40 z lの反応液を用い、 94°Cで 1分間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間からなる工程を 30回繰り返すことにより行った。
上記 P C Rにおいて、 増幅 D N A断片が検出されなかった株を 遺伝子欠損 ¼ とし、 ェシエリヒア 'コリ JPD1株と名づけた。
( 3 )ェシエリヒア'コリ JM101の染色体 D Ν Α上の 遺伝子および epN遺伝子 が欠損した株の作製
上記 （2 ) で得られたェシエリヒア 'コリ JPD1株を pKD46で形質転換し、 lOOmg/ 1のアンピシリンを含む LB寒天培地に塗布し、 30°Cで培養することにより選択した。 得られた形質転換株 （ェシエリヒア 'コリ JPDl/pKD46) に、 電気パルス法により 遺伝子欠損用クロラムフエニコール耐性遺伝子含有 D N A断片を導入し、 ェシェ リヒア 'コリ JPDl,/pKD46の染色体 D N A上に m 遺伝子欠損用クロラムフエニコ一 ル耐性遺伝子含有 D N A断片が相同組換えにより組込まれた形質転換株を取得した。 次に、 上記（2 ) と同様の操作を行うことにより、 染色体 D NA上からクロラムフ ェニコール耐性遺伝子が欠落した株を取得し、該株をェシエリヒア'コリ JPDN2と名 づけ feo
( 4 ) ェシエリヒア ·コリ JM101の染色体 D N A上の epN遺伝子、 pepA遺伝子、 2L遺伝子また.は dppオペ口ンが欠損した株、 および多重遺伝子欠損株の作製
pepN遺伝子、 pepA遺伝子、 epB遺伝子または. ^オペ口ンの欠損株は、上記（ 1 ) で作製した各遺伝子またはオペ'口ン欠損用クロラムフヱニコ一ル耐性遺伝子含有 D NA断片を用い、 上記 （2 ) と同様の方法により作製した。 上記方法により各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、各々の欠損遺伝子の内部. 塩基配列に基づき設計、合成した配列番号 52〜59で表される塩基配列を有する D NAをプライマーセットとして用い、 上記（2) と同様の PCRにより確認した。 こ こで、 配列番号 52および 53で表される塩基配列から る DNAは E t伝子欠 損確認用、 配列番号 54および 55で表される塩基配列からなる DNAは n Jt伝 子欠損確認用、 配列番号 56および 57で表される塩基配列からなる D N Aは pepB 遺伝子欠損確認用、配列番号 58および 59で表される塩基配列からなる DNAは d 22_オペ口ン欠損確認用プライマ一セットである。
上記方法で取得された dp オペ口ン欠損株をェシエリヒア 'コリ JDPP1株、 ^e N 遺伝子欠損株をェシエリヒア'コリ JPNI株、 e Jl伝子欠損株をェシエリヒア ·コ リ JPA1株、 £^_遺伝子欠損株をェシェリヒア 'コリ JPB7株と名付けた。
また、 上記（3) の方法に準じて、 epD遺伝子、 epN遺伝子、 pepA遺伝子、 pe B 遺伝子および^ Ε£オペロンからなる群より選ばれる 2以上の遺伝子またはオペロン の多重欠損株を作製した。多重欠損株が取得できたことの確認は、 上記（2) と同様 の P CRにより確認した。 前記方法で取得された^ L遺伝子および オペロンが 欠損した二重遺伝子欠損株をェシエリヒア 'コリ JPDP49株、 pepB遺伝？、 pepD遺伝 子および MPi遺伝子が欠損した三重遺伝子欠損株をェシエリヒア 'コリ JPDNB43株、 pepD遺伝子、 ΘΡΝ遺伝子および dppオペ口ンが欠損した三重遺伝子欠損株をェシェ リヒア .コリ JPNDDP36株、 uepA遺伝子、 pepD遺伝子、 epN遺伝子および d卯オペ 口ンが欠損した四重遺伝子欠損株をェシエリヒア 'コリ JPNDAP5株、 epB遺伝子、 £ epD遺伝子、 uepN遺伝子および dppオペ口ンが欠損した四重遺伝子欠損株をェシエリ ヒア ·コリ' JPNDBP7株と名づけた。第 2表は、各遺伝子欠損株における欠損遺伝子名 を示す。 第 2表
Figure imgf000054_0001
実施例 2 ぺプチダーゼおよびべプチド取り込み活性が喪失した大腸菌株を用いた L—ァラニル— L—グルタミン （以下、 AlaGlnと称す）及び Lーァラニル— Lーァ ラニン （以下、 AlaAlaと称す） の生産性の評価 '
実施例 1で得られた各種ぺプチダーゼ遺伝子およびジペプチド取り込み蛋白質を コードするオペロンの欠損株を、実験例 8で造成したプラスミド pPE56を用いて形質 転換し、 アンピシリン耐性を示す形質転換株を取得した。
• 得られた形質転換株を 50 zg/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った試験 管に接種し、 28°Cで 17時間培養した。 該培養液を 100〃g/mlのアンピシリンを含む 8 mlの生産培地 （リン酸水素二カリウム 16g/l、 リン酸二水素カリウム 14g/l、 硫酸アンモニゥム 5g/L、 クェン酸（無水） lg/ l、 カザミノ酸（Difco社製） 0. 5g/U L - Pro ig/ L-Ala 2.5g/K L-Gln 2. 5g八、 グルコース lOg/K ビタミン 10mg/L, 硫酸マグネシウム ' 7水和物 25mg/l、 硫酸鉄 7水和物 50mg八、 lOmol /1の水酸化ナトリゥム溶液を用いて PH7.2に調整。 L- Ginは 10倍濃縮液をフィル夕 一ろ過滅菌後、 ダルコ ス、 ビタミン 、硫酸マグネシウム · 7水和物、 硫酸鉄' 7 水和物は別個に蒸煮後添加） を試験管に 1%接種し、 30°Cで 24 時間培養した。該培 養液を遠心分離し培養上清を取得した。
培養上清中 C 生産物を F- moc化法で誘導体化した後に HPLC法により分析した。 HP LC法による分析は、 分離カラムに 0DS-HG5 (野村化学社製） を用い、 溶離液として A液（酢酸 6ml 、 20%(v/v)ァセトニトリル、 トリェチルァミンにて ρΗ4· 8に調 整）および Β液（酢酸 6ml/l、 70%(ν/ν)ァセトニトリル、 トリェチルァミンにて ΡΗ4.8調整） を用い、 0〜5分までは 液：：6液=8 : 2、 5〜20'分までは、 20分目で A 液： B液 =1： 1になるようにリニア一グラジェントをかける条件で分析を行った。 分析結果を第 3表に示す。
^ 3
Figure imgf000055_0001
第 3表から、 2種以下のぺプチダーゼ遺伝子が欠損した ^[生物、 1種のペプチド取 り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物では、ジぺプチドの生成、蓄積量は低いが、 1種以上のぺプチダ一ゼ遺伝子および 1種のぺプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損 した微生物、 または 3種以上のぺプチダ一ゼ遺伝子が^損した微生物では、ジぺプチ ドの生成、 蓄積量が大幅に増加していることがわかった。 実施例 3 ぺプチダ一ゼおよぴぺプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株 を用いた L—ァラニル— L—パリン （以下、 AlaValと称す） .の生産性の評価
実施例 2と同様に、各種べプチダーゼ遺伝子およびぺプチド取り込み蛋白質をコ一 ドするオペロンの欠損大腸菌株を、 PPE56を用いて形質転換した。得られた形質転換 株を 50〃g/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った試験管に接種し、 28°C で 17時間培養した。該培養液を 100 ig/mlのアンピシリンを含む 8mlの生産培地（リ ン酸水素二カリウム 16g八、 リン酸二水素カリウム 14g/l、 硫酸アンモ tゥム 5 g/ls クェン酸 （無水） lg/l、 カザミノ酸 （Difco社製） 0.5g/l、 L-Pro lg/ L-Ala 2.5g/U L-Val 2.5g/K ダルコ一ス 10g/l、 ビタミン 10mg/K 硫酸マ グネシゥム · 7水和物 25mg 、 硫酸鉄' 7水和物 50rag/K lOmol八の水酸化ナト リゥム溶液で PH7.2に調整。ダルコ一ス、ビ夕ミン Bls硫酸マグネシウム · 7水和物、 硫酸鉄 · 7水和物は別個に蒸煮後に添加） が入った試験管に 1 %接種し、 30°Cで 2 時間培養した。 該培養液を遠心分離し培養上清を取得し fe。
培養上清中の生成物を、実施例.2記載の方法により分析した。結果を第 4表に示す。
第 4表 , 菌株名 欠損遺伝子 AlaVal (g/1)
JM101 なし， 0 '
JDPP1 ' dppオペ口ン o -
JPN1 pepN 0
JPA1 pep A . 0
JPB7 pepB ' ' 0 '
JPD1 pepD · 0
JPDN2 . pepD, pepN 0
JPNDB43 pepB, pepD, pepN 0.04
JPDP49 pepD, .dp オペ口ン 0.11
JPNDDP36 pepD, pepN, dppオペロン 0.22
JPNDBP7 pepB, pepD, pepN, dppオペロン 0.20 第 4表から、 2種以下のぺ チダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および 1種のぺプ チド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物はジぺプチドを生産しないが、 3種 以上のぺプチダ一ゼ遺伝子が欠損した微生物、または 1種以上のぺプチダーゼ遺伝子 および 1種のぺプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損した微生物は、ジぺプチドを生産 することがわかった。
実施例 4 ぺプチダーゼおよびべプチド取り込み蛋白質の活性が喪失した大腸菌株 を用いたグリシルー L—グルタミン （以下、 GlyGlnと称す) の生産性の評価
実施例 2と同様に各種べプチダーゼ遺伝子およびべプチド取り込み蛋白質をコ一 ドするオペロンの欠損株を、 PPE56を用いて形質転換した。 得られた形質転換株を、 50 zg/mlのアンピシリンを含む 8mlの LB培地の入った試験管に接種し、 28°Cで 17 時間培養した。
該培養液を 100〃g/mlのアンピシリンを含む 8mlの生産培地（リン酸水素二カリ ム 16^1、 リン酸二水素カリウム 14g八、硫酸アンモニゥム' 5g/L、 クェン酸（無 水） lg/ l、 カザミノ酸 （ディ.フコ社製） 0.5g/l、 L-Pro lg/l、 Gly 2.5g/ L- Gln 2.5g/U グルコース . 10^1、 ビタミン 10mg/L, 硫酸マグネシウム · 7水和 物 25mg八、 硫酸鉄 7水和物 50mg八、 lOraol八の水酸化ナトリウム溶液を用いて p H7.2に調整。 L- Ginは 10倍濃縮液をフィルターろ過滅菌後、 グルコース、 ビタミン B1 硫酸マグネシウム · 7水和物、 硫酸鉄' 7水和物は別個に蒸煮後添加） が入った 試験管に 1 %接種し、 30°Cで 24 時間培養した。該培養液を遠心分離し培養上清を取 得した。
培養上清中の生成物を、 実施例 2記載の方法より分析した。 結果を第 5表に示す。
第 5表 '
菌株名 ' 欠損遺 ί云子 GlyGln (g/1)
JM101 なし 0
JDPP1 dp オペ口ン 0
JPDN2 pepD, pepN ' 0
JPNDB43 pepB, pepD, pepN 0.01
JPNDDP36 pepD, pepN, dppオペロン 0.02
JPNDBP7 pepB, pepD, pepN, dppオペロン 0.03 . 第 5表から、 2種以下のぺプチダーゼ遺伝子が欠損した微生物、および 1種のぺプ チド取り込み蛋白質遺伝子のみが欠損した微生物は、ジぺプチドを生産しなかったが、 3種以上のぺプチダ一ゼ遺伝子が欠損した微生物、および 2種以上のぺプチダーゼ遺 伝子および 1種のぺプチド取り込み蛋白質遺伝子が欠損のした微生物は、ジぺプチド を生産することがわかった。
産業上の利用可能性
本発明により、ジぺプチドを生産する微生物および該微生物を用いたジぺプチドの 製造法を提供することができる。
「酉己列表フリ一テキスト」
配列 号 3 5一人工配列の説明 ；合成 DNA
配列番号 3 6一人工配列の説明 '合成 DNA
配列番号 3 7一人工配列の説明 '合成 DNA
配列番号 3 8一人工配列の説明 '合成 DNA
配列番号 3 9一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 0一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 1一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 2 —人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 3一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 4一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 5一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 6一人工配列の説明 合成
配列番号 4 7一人工配列の説昉 .合成
配列番号 4 8一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 4 9一人工配列の説明 ,合成 DNA
配列番号 5 0一人工配列の説明 合成 DNA
配列番号 5 1一人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 5 2一人工配列の説明：合成
配列番号 5 3 —人工配列の説明；合成 DNA
配列番号 5 4一人工配列の説明；合成 DNA 配列番号 55- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 5 6- -人工配列の説明 合成 配列番号 5 7- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 5 8- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 5 9- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 6 0 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 6 1- -人工配列の説明 合成 配列番号 6 2- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 6 3- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 6 6 - -人工配列の説明 合成 DNA' 配列番号 6 7- -人： ϋ配列の説明 合成 DNA 配列番号 6 9- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 7 0- -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 7 1 - -人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 7 2 - -人工配列の説明 合成 DNA

Claims

請求の範囲
1. 1種以上のぺプチダーゼおよび 1種以上のぺプチ 'ド取り込み活性を有する蛋白 質（以下、 ペプチド取込み蛋白質ともいう）の活性が低下または喪失し、 かつジぺプ チドを生産する能力を有する微生物。
2. 3種以上のぺプチダーゼの活性が低下または喪失し、かつジぺプチドを生産す る能力を有する微生物。
3. ぺプチダーゼが、配列番号 1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する 蛋白質、または配列番号 1〜4のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80 %以上の相 同性を有するアミノ酸配列を有し、かつべプチダ一ゼ活性を有する蛋白質である請求 項 1または 2記載の微生物。
4. ぺプチド取込み蛋白質が、配列番号 5〜 9のいずれかで表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質、または配列番号 5〜 9のいずれかで表されるアミノ酸配列と 80¾ 以上の相同性を有し、かつペプチド取り込み活性を有する蛋白質である請求項 1また は 3記載の微生物。 .
5. ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 以下の [1]〜 [4]のいずれ かに記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物である請求項 1〜4のいずれか 1 項に記載の微生物。
[1]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋 白質
[2]配列番号 19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列において、 1個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつジぺプ チドの合成活性を有する蛋白質
[3]配列番号19〜25および 68のいずれかで表されるアミノ酸配列と 65 %以 上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつジペプチドの合成活性を有する蛋白 質 ·
[4]配列番 "f 33で表されるアミノ酸配列と' 80%以上の相同性を有するアミノ酸 配列を有し、 かつジペプチドの合成活性を有する蛋白質
6. ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 以下の [1]〜 [4]のいずれか に記載の DN Aを有する微生物である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の微生物。
[1]請求項 5の [1]〜 [4]のいずれかに記載の蛋白質をコードする DN A [2]配列番号 26〜32、 64および 65のいずれかで表される塩基配列を有する DNA
[3]配列番号 26〜32、 64および 65のいずれかで表される塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつジぺプチド合成活性を 有する蛋白質をコードする DNA
[4]配列番号 34で表される塩基配列と 80%以上の相同性を有する塩基配列を有 し、 かつジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードする DNA
7. ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 請求項 6の [1]〜 [4]のい ずれかに記載の DN Aとべク夕丄 DN Aが連結した組換え体 DN Aを有する微生物 である請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の微生物。
8. 微生物が、 ェシエリヒア属、 バチルス属、 コリネバクテリゥム属またはサヅカ ロマイセス属に属する微生物である請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の微生物。
9. ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 L—アミノ酸エステルと Lーァ ミノ酸からジぺプチドを生成する能力を有する微生物である請求項 1〜 4のいずれ か 1項に記載の微生物。
10. L—アミノ酸エステルと L—アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有す る微生物が、プロリンィミノぺプチダ一ゼを生産する微生物である請求項 9記載の微 生物。
11. L—'アミノ酸エステルと L—アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有す る微生物が、プロリンィミノべプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNAと ベクタ一 DN Aが連結した組換え体 DN Aを有する微生物である請求項 9または 1
0記載の微生物。
12. 微生物が、 ェシエリ tァ属、 バチルス属、 コリネバクテリゥム属またはサヅ カロマイセス属に属する微生物である請求項 9〜 11のいずれか 1項に記載の微生 物。
13. ジペプチドを生産する能力を有する微生物が、 L—アミノ酸アミドと Lーァ ミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する微生物である請求,項 1〜4のいずれ か 1項に記載の微生物。 '
1 4 . L—アミノ酸アミドと L一アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する 微生物が、 L—アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質を生産する微生物 である請求項 1 3記載の微生物。
1 5 . L—アミノ酸アミドと L一アミノ酸からジペプチドを生成する能力を有する 微生物が、 L一アミノ酸アミドハイドロラーゼ活性を有する蛋白質をコードする D N Aとぺク夕一: D NAが連結した組換え体 D NAを有する微生物である請求項 1 3記 載の微生物。
1 6 . 微生物が、 ェシエリヒア属、 バチルス属、 コリネバクテリゥム属またはサヅ カロマイ^ス属に属する微生物である請求項 1 3〜1 5のいずれか 1項に記載の微 生物。 '
1 7 . 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載め微生物の培養物または該培養物の処理 物を酵素源に用い、該酵素源、 1種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該 性媒体中にジぺプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺプチドを採取するジぺプ チドの製造法。
1 8 . ジペプチドが式 （I ).
R 1 - R 2 ( I )
(式中、 R 1および R 2は同一または異なってアミノ酸を表す） で表されるジぺプチ ドである請求項 1 7記載の製造法。
1 9 . 請求項 9〜1 2のいずれか 1項に記載の微生物の培養物または該培養物の処 理物を酵素源に用い、該酵素源、 L一アミノ酸エステルおよび L—アミノ酸を水性媒 体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺ プチドを採取するジぺプチドの製造法。
2 0 . 請求項 1 3〜1 6の ずれか 1項に記載の微生物の培養物または該培養物の 処理物を酵素源に用い、該酵素源、 L _アミノ酸アミドおよび L一アミノ酸を水性媒 体中に存在せしめ、該水性媒体中にジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジぺ プチドを採取： るジぺプチドの製造法。 '
2 1 . 培養物の処理物が、 培養物の濃縮物、 培養物の乾燥物、 培養物を遠心分離し て得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物
、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、 該菌体の溶媒処理物、該菌体 の酵素処理物、または該菌体の固定化物であることを特徴とする請求項 1 7〜2 0の いずれか 1項に記載の製造法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005218369A (ja) * 2004-02-05 2005-08-18 Ajinomoto Co Inc 変異型微生物およびこれを用いたペプチドの製造方法
JP2007202559A (ja) * 2006-02-02 2007-08-16 Consortium Elektrochem Ind Gmbh 組み換えタンパク質の製造のための微生物菌株
WO2008126783A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-23 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. ジペプチドの製造法
JP2020022433A (ja) * 2018-08-01 2020-02-13 東海物産株式会社 イミダゾールジペプチドの製造方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1627884B9 (en) * 2004-06-25 2010-10-20 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing dipeptides
EP1616963B1 (en) * 2004-06-25 2009-11-18 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Process for producing dipeptides or dipeptide derivatives
US20080213827A1 (en) * 2004-06-25 2008-09-04 Hashimoto Shin-Ichi Process For Producing Dipeptides or Dipeptide Derivatives
EP2575499A2 (en) 2010-05-31 2013-04-10 Vib Vzw The use of transporters to modulate flavor production by yeast
KR101495597B1 (ko) * 2013-10-16 2015-02-26 한국식품연구원 젓갈 유래 바실러스속 미생물 및 이를 이용하여 s-아데노실-l-메티오닌을 대량 생산하는 방법
CN105510497A (zh) * 2015-11-30 2016-04-20 精晶药业股份有限公司 L-丙氨酰-l-丙氨酸的定量检测方法
CN115667517A (zh) * 2020-06-25 2023-01-31 协和发酵生化株式会社 二肽的制造方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4667024A (en) * 1983-07-13 1987-05-19 Smithkline Beckman Corporation Process for the preparation of purified vancomycin class antibiotics
US4675285A (en) * 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
EP0700431A1 (en) * 1993-05-18 1996-03-13 Quest International B.V. Proline iminopeptidase, process for its preparation and its use in the flavouring of food compositions
US5319098A (en) * 1993-05-18 1994-06-07 Celgene Corporation Process for the stereoselective preparation of L-alanyl-L-proline
CN1160465C (zh) * 1995-12-15 2004-08-04 诺沃奇梅兹有限公司 其中areA、pepC和/或pepE基因已被灭活的真菌
GB9828711D0 (en) * 1998-12-24 1999-02-17 Genencor Int Production of proteins in gram-positive microorganisms
CA2365594A1 (en) * 1999-03-29 2000-10-05 Holland Sweetener Company V.O.F. Microbiological production method for .alpha.-l-aspartyl-l-phenylalanine
US6435586B2 (en) * 2000-04-17 2002-08-20 Bestop, Inc. Storage systems for pickup trucks and other vehicles
CN101982546A (zh) * 2001-07-26 2011-03-02 味之素株式会社 二肽的制备方法
CA2511553C (en) * 2002-12-26 2013-07-30 Shin-Ichi Hashimoto Process for producing dipeptides

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAGTING A. ET AL.: "The di- and tripeptide transport protein of Lactococcus lactis. A new type of bacterial peptide transporter", J. BIOL. CHEM., vol. 269, no. 15, 1994, pages 11391 - 11399, XP002983605 *
VERKAMP E. ET AL.: "The periplasmic dipeptide permease system transports 5-aminolevulinic acid in Escherichia coli.", J. BACTERIOL, vol. 175, no. 5, 1993, pages 1452 - 1456, XP002983606 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005218369A (ja) * 2004-02-05 2005-08-18 Ajinomoto Co Inc 変異型微生物およびこれを用いたペプチドの製造方法
JP2007202559A (ja) * 2006-02-02 2007-08-16 Consortium Elektrochem Ind Gmbh 組み換えタンパク質の製造のための微生物菌株
US7749756B2 (en) 2006-02-02 2010-07-06 Wacker Chemie Ag Microorganism strain for producing recombinant proteins
WO2008126783A1 (ja) 2007-04-06 2008-10-23 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. ジペプチドの製造法
US8673590B2 (en) 2007-04-06 2014-03-18 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for producing dipeptide
JP2020022433A (ja) * 2018-08-01 2020-02-13 東海物産株式会社 イミダゾールジペプチドの製造方法

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