[go: up one dir, main page]

WO2004111071A1 - 5'-aminocarbonylphosphonates d4t utilises comme inhibiteurs de la reproduction du virus de l'immunodeficience humaine - Google Patents

5'-aminocarbonylphosphonates d4t utilises comme inhibiteurs de la reproduction du virus de l'immunodeficience humaine Download PDF

Info

Publication number
WO2004111071A1
WO2004111071A1 PCT/RU2003/000513 RU0300513W WO2004111071A1 WO 2004111071 A1 WO2004111071 A1 WO 2004111071A1 RU 0300513 W RU0300513 W RU 0300513W WO 2004111071 A1 WO2004111071 A1 WO 2004111071A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hiv
compound
cells
compounds
inhibitors
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2003/000513
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andrei Georgievich Pokrovsky
Tatyana Rudolfovna Pronyaeva
Nina Vladimirovna Fedyuk
Marina Konstantinovna Kukhanova
Elena Anatolevna Shirokova
Maksim Vladimirovich Yasko
Anastasia Lvovna Khandazhinskaya
Dmitry Vasilevich Yanvarev
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor'
Institut Molekulyarnoy Biologii Im Vaengelgardta Ran
Original Assignee
Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor'
Institut Molekulyarnoy Biologii Im Vaengelgardta Ran
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor', Institut Molekulyarnoy Biologii Im Vaengelgardta Ran filed Critical Gosudarstvenny Nauchny Tsentr Virusologii I Biotekhnologii 'vektor'
Publication of WO2004111071A1 publication Critical patent/WO2004111071A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • the invention relates to the field of molecular biology, 5 virology and medicine, namely to the use of new derivatives of nucleosides, namely d4T amides to suppress the reproduction of the human immunodeficiency virus.
  • the new compounds are highly effective inhibitors of the reproduction of the human immunodeficiency virus type 1 in the culture of vivo transfused lymphocytes MT-4, and also protect cells from the cytopathogenic effect of the virus.
  • nucleosides 15 nucleosides, protease inhibitors and the so-called non-nucleoside inhibitors.
  • nucleoside derivatives the most known and used are Z'-azido-3'-deoxythymidine (AZT), 2'3'-dideoxyxycytidine, 2'3'-dideoxyxyinosine, 2'3'-dideoxyxy-2'3'-didehydrothymidine and 2 ' 3'-dideoxy-3'-thiotimidine [1-2].
  • the closest analogue of the claimed compound is a compound belonging to the group of nucleoside inhibitors of 2'3'-dideoxy-2'3'-didehydrothymidine (d4T) [2]. With moderate toxicity for uninfected transplanted cells of the MT-4 lymphoid line, this compound has high anti-HIV activity.
  • the technical result of the invention is the creation of new highly effective anti-HIV modified nucleoside derivatives that are able to penetrate into cells that are resistant to dephosphorylation enzymes and have selective activity in inhibiting DNA synthesis catalyzed by HIV reverse transcriptase.
  • the specified technical result is achieved by the fact that according to the invention, new compounds of 5'aminocarbonylphosphonates - derivatives of 2'3'-dideoxy-2'3'-didehydrothymidine (d4T prototype, [2]) of the general formula:
  • R Alkul which are low toxic inhibitors of human immunodeficiency virus.
  • 2'3'-didehydrothymidine (d4T prototype, [2]) with moderate toxicity for uninfected transplanted cells of the MT-4 lymphoid line has high anti-HIV activity, which made it possible to conduct directed synthesis of new effective derivatives on its basis.
  • FIG. Figure 1 shows dose-dependent curves for calculating the quantitative characteristics of the inhibition of HIV-1 by the studied compounds (using compound 3 b as an example) while being introduced with the virus. Similar plots were obtained for compounds 3a; 3 sec
  • FIG. Figure 2 shows dose-dependent curves for calculating the quantitative characteristics of the inhibition of HIV-1 by the studied compounds (for example, compound 3 b) when introduced after adsorption of the virus. Similar plots were obtained for compounds 3a; 3 sec
  • Target 5'aminocarbonylphosphonates were prepared according to the following scheme:
  • the starting compound was 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-dehydro-thymidine-5'-ethoxycarbonylphosphonate (1) (or the corresponding 5'-methoxycarbonylphosphonate) synthesized previously.
  • Amination of ethoxycarbonylphosphonate (1) with appropriate amines leads to amidophosphonates (2) that are alkylated with alcohols in the presence of triisopropylsulfonyl chloride (TPSCl) or under the Mitsunobu reaction conditions.
  • TPSCl triisopropylsulfonyl chloride
  • Triphenylphosphine (130 mg, 0.5 mmol) and ethanol (100 ⁇ l) were added to a solution of compound 1 (120 mg, 0.5 mmol) in DMF (2 ml), the solution was cooled to 4 ° C and a solution of diethyl azodicarboxylate (0.5) was added to it. mmol, 77 ⁇ l) in THF (1 ml). The reaction mixture was kept at room temperature for 5 h, evaporated, the residue was chromatographed on a silica gel column (2.5 x 30 cm), eluting with a methanol gradient in chloroform (0-> 10%). 45 mg (60%) of compound Za were obtained.
  • Example 2. 2 ', 3'-Dideoxy-2', 3'-dihydro-thymidine-5 '- (N-methylaminocarbonyl) phosphonate (compound 2b) (R' Me).
  • a study of the inhibition of HIV reproduction includes the cultivation of primary infected lymphoid cells of the MT-4 line in the presence of the test compounds, final concentrations which in the culture medium are 0.0001-100 ⁇ g / ml, during one passage - for 4 days.
  • the cytotoxicity of the drug is assessed by adding dilutions in serum-free RPMI-1640 medium to the MT-4 cell suspension, placed in the wells of a 96-night plate (Cell-Cult, Epglapd), to final concentrations of 0.001-100 ⁇ g / ml (three wells each) per dose), followed by cultivation at 37 ° C for 4 days [7].
  • the inoculum concentration is 0.5 x 10 b cell particles per milliliter. Cells are used as control without the addition of a drug, instead of which the same amount of serum-free medium is added.
  • a study of the antiviral activity of compounds against HIV-1 is carried out on the transplantable line of sensitive cells MT-4.
  • the supernatant of infected cells stored in liquid nitrogen is used, the multiplicity of infection is 0.2-0.5 infectious units per cell.
  • a suspension of MT-4 cells with a concentration of 2, OxIO 6 cell particles per milliliter and a viability of at least 90% is placed in the wells of a 96-night plate ("Orpge") immediately after application of the virus-containing material and the test compounds diluted in RPMI-medium are immediately added 1640 serum-free, to a final concentration of 0.0001-100 ⁇ g / ml (three wells per dose).
  • the controls are HIV-1 infected MT-4 cells without drug addition (instead of the drug, the same amount of RPMI-1640 medium without additives is added) and uninfected cells.
  • the plate is incubated for one hour at 37 ° C to adsorb the virus, then the cells are diluted to a seed concentration (0.5 x 10 6 per milliliter) with RPMI-1640 culture medium supplemented with 10% fetal KPC serum pre-inactivated by heating at 56 ° C for 30 minutes, ZOOmg / ml b-glutamine and 100 ⁇ g / ml gentamicin. Then the tablet is placed in a thermostat at 37 0 C in an atmosphere of 5% CO 2 . On the 4th day of cultivation, the concentration and viability of the cells are calculated by the formazan method.
  • graphs of the dependence of the growth of cell viability relative to control under the influence of increasing doses of drugs are constructed determine the ability of drugs to protect infected cells from the cytopathogenic effect of the virus.
  • Evaluation of the anti-HIV activity of the compounds is carried out using a quantitative determination of the virus-specific protein p24 by direct enzyme immunoassay, as described in [8], and dose-dependent curves are constructed (Fig. 1.2), which are used to calculate the concentrations that inhibit growth by 50 and 90% viral antigen (ID 50 and ID 90 ).
  • the therapeutic index, or selectivity index (IS) is considered as the ratio of the 50% toxic concentration of the compound to its 50% effective dose (the results are presented in the table).
  • the therapeutic indices of the studied compounds are comparable to IS d4T with simultaneous administration of the drug and the virus and are 2-5 times higher than IS d4T under post-adsorption conditions. This suggests the promise of new d4T derivatives for further research with the goal of creating dosage forms for the treatment of HIV / AIDS.
  • Table 1 The therapeutic indices of the studied compounds (IS) are comparable to IS d4T with simultaneous administration of the drug and the virus and are 2-5 times higher than IS d4T under post-adsorption conditions. This suggests the promise of new d4T derivatives for further research with the goal of creating dosage forms for the treatment of HIV / AIDS. Table 1.
  • % inhibition (Px-Po) / (P-Po) * 100, where Px is the concentration of p24 protein on the 4th day of cultivation in the presence of the drug, Po is the concentration of p24 after 1 hour incubation of HIV-1 with cells without drug addition (“O” point), P - p24 concentration on day 4 of cultivation of HIV-1 in cells without drug addition (virus control).
  • the therapeutic index, or selectivity index (IS), 5 is defined as the ratio of the concentration of the drug, toxic to 50% of the cells (CD 5 o), to the concentration, 50% inhibiting the growth of viral antigen (ID 5 o) '.
  • inventive compounds have pronounced inhibitory activity against the human immunodeficiency virus and may be potential candidates for the preparation of antiviral agents used in medicine and the pharmaceutical industry.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

5'-Aминoкapбoнилфocфoнaτы d4T - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека
Изобретение относится к области молекулярной биологии, 5 вирусологии и медицины, а именно к применению новых производных нуклеозидов, а именно амидов d4T для подавления репродукции вируса иммунодефицита человека.
Новые соединения являются высокоэффективными ингибиторами репродукции вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре ιо перевиваемых лимфоцитов MT-4, а так же обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса.
В настоящее время известен целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении ВИЧ, в том числе и используемых в медицинской практике. К ним относятся производные
15 нуклеозидов, ингибиторы протеаз и так называемые ненуклеозидные ингибиторы. Среди нуклеозидных производных наиболее известны и используются З'-азидо-З'-дезокситимидин (AZT), 2'3'-дидeзoкcицитидин, 2'3'-дидeзoкcиинoзин, 2'3'-дидeзoкcи-2'3'-дидeгидpoтимидин и 2'3'- дидезокси-З'-тиотимидин [1-2].
20 Наиболее близким аналогом заявляемого соединения (прототипом) является соединение, относящееся к группе нуклеозидных ингибиторов 2'3'-дидeзoкcи-2'3'-дидeгидpoтимидин (d4T) [2]. При умеренной токсичности для неинфицированных перевиваемых клеток лимфоидной линии MT-4 это соединение обладает высокой анти-ВИЧ активностью.
25 Механизм действия указанных соединений-аналогов состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилированию и специфично блокируют синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ.
Однако, к сожалению, по сравнению с природными нуклеозидами, зо процесс фосфорилирования модифицированных нуклеозидов клеточными ферментами значительно менее эффективен и протекает медленно, что дает время проникшему в клетки вирусу интегрироваться в геном в форме провирусной ДНК. Кроме того, высокая изменчивость ВИЧ приводит к быстрому возникновению резистентных штаммов вируса [3,4], и, следовательно, к необходимости смены препарата на основе выше приведенных соединений-аналогов, в том числе и на основе соединения- прототипа. К тому же, в условиях длительного применения, используемые препараты оказывают выраженное токсическое действие на организм.
Техническим результатом изобретения чявляется создание новых высокоэффективных в отношении ВИЧ модифицированных нуклеозидных производных, способных проникать внутрь клетки, устойчивых к действию ферментов дефосфорилирования и обладающих избирательной активностью в подавлении синтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ. Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению, заявляются новые соединения 5'aминoкapбoнилфocфoнaты - производные 2'3'-дидeзoкcи-2'3'-дидeгидpoтимидинa (d4T- прототип, [2] ) общей формулы:
Figure imgf000004_0001
где: R'= H, аlkуl, аrуl; R"= H, аlkуl, аrуl; R1, R"= сусliс аlkуl
R = аlkуl которые являются низкотоксичными ингибиторами вируса иммунодефицита человека.
Относящийся к группе нуклеозидных ингибиторов 2'3'-дидeзoкcи-
2'3'-дидeгидpoтимидин (d4T- прототип, [2] ) при умеренной токсичности для неинфицированных перевиваемых клеток лимфоидной линии MT-4 обладает высокой анти-ВИЧ активностью, что позволило провести на его основе направленный синтез новых эффективных производных.
На фиг. 1 приведены дозозависимые кривые для расчета количественных характеристик ингибирования BИЧ-1 исследуемыми соединениями (на примере соединения 3 Ъ) при одновременном внесении с вирусом. Аналогичные графики получены и для соединений 3 а; 3 с.
На фиг. 2 приведены дозозависимые кривые для расчета количественных характеристик ингибирования BИЧ-1 исследуемыми соединениями (на примере соединения 3 b) при внесении после адсорбции вируса. Аналогичные графики получены и для соединений 3 а; 3 с.
Схема получения заявляемых целевых
5'aминoкapбoнилфocфoнaтoв
Целевые 5'aминoкapбoнилфocфoнaты получали по следующей схеме:
Figure imgf000005_0001
1 Z = Me5 Et
O-, _ Тhу
Figure imgf000005_0002
Исходным соединением послужил 2',3'-дидeзoкcи-2',3'- дидeгидpoтимидин-5'-этoкcикapбoнилфocфoнaт (1) (или соответствующий 5'-мeтoкcикapбoнилфocфoнaт), синтезированный ранее. Аминирование этоксикарбонилфосфоната (1) соответствующими аминами приводит к амидофосфонатам (2), которые алкилируют спиртами в присутствии триизопропилсульфонилхлорида (TPSCl) или в условиях реакции Мицунобу.
Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.
Пример 1.
2',3'-Дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин -5'- аминокарбонилфосфонат (соединение 2а) (R'=H).
2',3'-Дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин-5'-этoкcикapбoнилфocфoнaт (73 мг, 0,2 ммоль) (или -5'-мeтoкcикaρбoнилфocфoнaт, 70 мг, 0.2 ммоль) растворили в 25% водном растворе аммиака (3 мл), полученный раствор перемешивали 2 часа при комнатной температуре, а затем сконцентрировали в вакууме. Остаток растворили в воде и хроматографировали на DЕАЕ-Тоуореаrl, элюировали линейным градиентом NH4HCO3 (0-0.2 M), целевой продукт элюировали 0.12 M NH4HCO3. Получили 62 мг (94%) соединения (1). УФ УФ (MeOH, λмaкc): 266 нм. 1H ЯMP (D2O, δ, м.д.): 7.51 (IH, с, H6), 6.87 (Ш, м, Hl1), 6.41 (IH, м, H21), 5.90 (IH, м, НЗ'), 5.03 (IH, м, H4'), 4.09 (2H, м, H5'), 1.81 (ЗН, с, CH3). 31P ЯМР (D2O, δ, м.д.): -1.62 с. 2',3'-Дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин-5'-
(этил)(aминoкapбoнил)фocфoнaт (соединение За) (R=Et, R'=H).
Метод А. Соединение (2а) (70 мг, 0.21 ммоль) растворили в пиридине (2 мл) и раствор сконцентрировали в вакууме. Эту процедуру повторили три раза, а затем остаток растворили в пиридине (3 мл) и добавили EtOH (0.5 мл) и TPSCl (90 мг, 0.3 ммоль). Реакционную массу перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Растворитель удалили в вакууме. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем (2 х 25 см), элюируя системой хлороформ-метанол 96:4. Получили 54 мг (72%) соединения За. УФ (MeOH, λмaкc): 266 нм. 1H ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 7.35 (IH5 с, H6), 6.96 (IH, м, Hl1), 6.37 (IH5 м, H2'), 5.94 (IH, м, НЗ1), 5.02 (IH, м, H4!), 4.37 (2H5 м, H5!), 4.19 (2H, м, CH2CH3), 1.88 (ЗН, с, CH3), 1.35 (ЗН, м, CH2CHs)- 31P ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 0.15 с, -0.12 с. Метод Б. К раствору соединения 1 (120 мг, 0.5 ммоль) в ДМФА (2 мл) прибавили трифенилфосфин (130 мг, 0.5 ммоль) и этанол (100 мкл), раствор охладили до 40C и прибавили к нему раствор диэтилазодикарбоксилата (0.5 ммоль, 77 мкл) в ТГФ (1 мл). Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре 5 ч, упаривали, остаток хроматографировали на колонке с силикагелем (2.5 х 30 см), элюируя градиентом метанола в хлороформе (0->10%). Получили 45 мг (60%) соединения За. Пример 2. 2',3'-Дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин-5'-(N- мeтилaминoкapбoнил)фocфoнaт (соединение 2b) (R'=Me).
Соединение 2b синтезировали из соединения 1 по методу, описанному для аминокарбонилфосфоната 2а кипячением в водном растворе метиламина. Выход соединения 2b составил 92%. УФ (MeOH): λмaкc 267 нм. 1H ЯМР (D2O, δ, м.д.): 7.43 (IH, с, H6), 6.85 (IH, м, Hl1), 6.35 (IH, м, H2f), 5.86 (IH, м, НЗ1), 4.97 (IH, м, H4'), 4.03 (2H5 м, H5'), 2.61 (ЗН, с, CH3NH), 1.76 (3H5 с, CH3). 31P ЯМР (D2O5 δ, м.д.): -1.53 с.
2',3'-Дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин-5'-(этил)(N- мeтилaминoкapбoнил)фocфoнaт (соединение Зb) (R'=Me, R=Et). Соединение Зb синтезировали аналогично аминокарбонилфосфонату За с выходом 48% по методу А и 80% по методу В. УФ (MeOH): λмaкc 267 нм. 1H ЯМР (CDCl3, δ, м.д.): 8.92 (IH, с, NH), 7.39 (IH, с, NH), 7.34 и 7.32 (IH, 2с, H6), 7.00 (IH, м, Hl1), 6.28 (IH, м, H2'), 5.88 (IH5 м, HЗ'), 4.98 (IH, м, H4'), 4.40 (2H, м, H51), 4.19 (2H, м, CH2CH3), 2.87 и 2.86 (ЗН, 2с, CH4NH),
5 1.93 (ЗН, с, CH3), 1.34 (ЗН, м, CH2CH3). 31P ЯМР (CD3CN, δ, м.д.): -0.27 с, - 0.76 с.
Пример 3.
2',3'-Дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин-5'-(N- фeнилэтилaминoкapбoнил)фocфoнaт (соединение 2с) (R'=PhCH2CH2~). ю Соединение 2с синтезировали из соединения 1 по методу, описанному для аминокарбонилфосфоната 2а перемешиванием в фенилэтиламине. Выход соединения 2с составил 94%. УФ (MeOH): λмaкc 267 нм. 1R ЯМР (D2O, δ, м.д.): 7.43 (IH, с, H6), 7.45-7.17 (5H, м, Ph), 6.89 (IH, м, Hl1), 6.25 (IH, м, H2!), 5.86 (IH, м, НЗ'), 4.95 (IH, м, H41), 4.10 (2H,
15 м, H5'), 3.60 (2H, M5-CH2NH), 2.61 (2H, с, CH2Ph), 1.86 (ЗН, с, CH3). 31P ЯMP (D2O, δ, м.д.): -1.47 c.
2',3'-Дидeзoкcи-2',3'-дидeгидpoтимидин-5f-(этил)(N- фeнилэтшiaминoкapбoнил)фocфoнaт (соединение Зс) (R'= PhCH2CH2-, R=Et). Соединение Зс синтезировали аналогично
20 аминокарбонилфосфоната За с выходом 51% по методу А и 72% по методу В. УФ (MeOH): λмaкc 267 нм. 1H ЯМР (CDCl3, δ, м.д.): 9.17 (IH, с, NH), 7.45 (IH, с, NH), 7.33 и 7.31 (IH, 2с, H6), 7.45-7.17 (5H, м, Ph)5 6.99 (IH, уш. с, Hl1), 6.27 и 6.17 (IH, 2м, H2'), 5.84 (IH, м, НЗ'), 4.91 (IH, м, H4?), 4.29 (2H, м, H5'), 4.09 (2H5 м, CH2CH3), 3.62 (2H, M5-CH2NH), 2.85
25 (2H, с, CH2Ph), 1.91 (ЗН, 2с, CH3), 1.29 (ЗН, м, CH2CH3). 31P ЯМР (CDCl3, δ, м.д.): -0.14 с, -0.75 с.
Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии MT-4 в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,0001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.
Об ингибировании репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток судят по снижению накопления вирусспецифического белка p24 (по данным иммуноферментного анализа), а так же по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования [5-6] при окрашивании 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diρhenyltetrazolium brотidе (MTT). Пример 4.
Оценка ЦИТОТОКСИЧНОСТИ соединений.
Цитотоксичность препарата оценивают путем добавления его разведений в бессывороточной среде RPMI- 1640 к клеточной суспензии MT-4, помещенной в лунки 96-лyнoчнoгo планшета ("Сеl-Сult", Епglапd), до конечных концентраций 0,001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу) с последующим культивированием при 370C в течение 4 суток [7]. Посевная концентрация составляет 0,5x10б клеточных частиц в миллилитре. Контролем служат клетки без добавления препарата, вместо которого вносят такое же количество бессывороточной среды. Жизнеспособность клеток подсчитывают на 4 сутки культивирования, пользуясь формазановым методом (прижизненным окрашиванием клеток 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diρhenyltetrazolium brотidе (MTT). ТОКСИЧНОСТЬ различных доз препарата определяют по жизнеспособности клеток относительно контроля (Фиг.l, 2), по полученным результатам строят дозозависимую кривую и определяют концентрацию, на 50% снижающую жизнеспособность клеток (CD5o)- Следует отметить, что исследуемые соединения не оказывают токсического действия на клетки MT-4 в эффективных концентрациях: 50% токсичные дозы на 5-6 порядков превышают эффективные в отношении BИЧ-1 дозы (таблица 1). Пример 5.
Изучение влияния исследуемых соединений на репродукцию BИЧ-1 в культуре клеток MT-4.
Исследование противовирусной активности соединений в отношении BИЧ-1 проводят на перевиваемой линии чувствительных клеток MT-4. Для заражения используют супернатант инфицированных клеток, хранящийся в жидком азоте, множественность заражения составляет 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. Суспензию клеток MT-4 с концентрацией 2,OxIO6 клеточных частиц в миллилитре и жизнеспособностью не менее 90% помещают в лунки 96-лyнoчнoгo планшета ("Оrапgе") непосредственно после внесения вируссодержащего материала и сразу же добавляют исследуемые соединения, разведенные в среде RPMI- 1640 без сыворотки, до конечных концентраций 0,0001-100 мкг/мл (по три лунки на каждую дозу). Контролями служат инфицированные BИЧ-1 клетки MT-4 без добавления препарата (вместо препарата вносят такое же количество среды RPMI- 1640 без добавок) и неинфицированные клетки.
Планшет инкубируют в течение часа при 370C для адсорбции вируса, затем клетки разводят до посевной концентрации (0,5x106 в миллилитре) питательной средой RPMI- 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки KPC, предварительно инактивированной прогреванием при 560C в течение 30 минут, ЗООмг/мл Ь -глютамина и 100 мкг/мл гентамицина. Затем планшет помещают в термостат на 370C в атмосфере 5% CO2. На 4 сутки культивирования подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток формазановым методом. По полученным данным строят графики зависимости прироста жизнеспособности клеток относительно контроля под действием возрастающих доз препаратов, т.е. определяют способность препаратов защищать инфицированные клетки от цитопатогенного действия вируса. Оценку анти-ВИЧ активности соединений проводят с использованием количественного определения вирусспецифического белка p24 методом прямого иммуноферментного анализа, как описано в [8], и строят дозозависимые кривые (Фиг. 1,2), по которым рассчитывают концентрации, на 50 и 90% подавляющие прирост вирусного антигена (ID50 и ID90). Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-нoй токсической концентрации соединения к его 50%-нoй эффективной дозе (результаты представлены в таблице). На основании этих количественных показателей ингибирования можно судить об эффективности противовирусного действия соединений, заключающейся в высокой степени подавления репликации BИЧ-1 в культуре клеток MT-4, сравнимой с эффективностью d4T при одновременном внесении препарата и вируса и в 2 - 5 раз превышающей ее при проведении исследования в постадсорбционных условиях. Из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях (50%-е токсические дозы на 5-6 порядков превышают 50%-е ингибирующие дозы), помимо способности защищать клетки от гибели в результате цитопатогенного действия вируса (>50% в дозах 0,1 — 0,5 мкг/мл), в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1 типа в культуре клеток MT-4. Терапевтические индексы исследуемых соединений (IS) сравнимы с IS d4T при одновременном внесении препарата и вируса и в 2-5 раз превышают IS d4T в постадсорбционных условиях. Это говорит о перспективности новых производных d4T для дальнейших исследований с целью создания на их основе лекарственных форм для лечения ВИЧ/СПИД. Таблица 1.
Противовирусная активность аминокарбонилфосфонатов d4T против BИЧ-1 ГKB-4046:
.
Figure imgf000012_0001
* Относительную степень защиты инфицированных клеток от гибели различными дозами препарата рассчитывают по формуле:
Защита (%) = (X-V)/(K-V)* 100, где X - % жизнеспособности инфицированных клеток в присутствии препарата на 4 сутки культивирования, К - % жизнеспособности в контроле клеток, V - % жизнеспособности инфицированных клеток в контроле вируса (без добавления препарата).
Относительную степень ингибирования репродукции вирусного белка считают по формуле:
%ингибиp.= (Px-Po)/(P-Po)* 100, где Px - концентрация белка p24 на 4 сутки культивирования в присутствии препарата, Po - концентрация p24 после 1 часа инкубирования BИЧ-1 с клетками без добавления препарата ("O"тoчкa), P - концентрация p24 на 4 сутки культивирования BИЧ-1 в клетках без добавления препарата (контроль вируса).
Терапевтический индекс, или индекс селективности (IS), 5 определяют как отношение концентрации препарата, токсичной для 50% клеток (CD5o), к концентрации, на 50% подавляющей прирост вирусного антигена (ID5o)'.
IS = CD50 /ID50
Промышленная применимость ю Заявляемые соединения обладают выраженной ингибирующей активностью в отношении вируса иммунодефицита человека и могут являться потенциальными кандидатами для получения противовирусных средств, используемых в медицине и фармацевтической промышленности.
15
Источники научно-технической и патентной информации:
1. Vеаl GJ., Аgrаwаl S., Вуm R.А. Sупеrgistiс iпhibitiоп оf HIV-I bу an antisense оligопuсlеоtidе апd пuсlеоsidе апаlоg rеvеrsе trапsсriрtаsе mhibitоrs. Апtivirаl Rеsеаrсh 1998, 38, 63-73.
20 2. Саrdопа V.M., Ауi A.I., Аubеrtiп A.M., Guеdj R. Sупthеsis апd апti-ШV асtivitу оf sоmе поvеl аrуlрhоsрhаtе апd Н-рhоsрhопаtе dеrivаtivеs оf 3'-azido-2l,3'-dideoxythymidiпe апd 2'53'-didehydro-
2',3'-dideoxythymidiпe. y4иftvгrα/iгβ$i 1999, 42(3), 189-196.
3. Sсhiпаzi R.F., Llоуd R.M., Rатапаthап CS. апd Тауlоr E. W. 5 Апtivirаl Drug Rеsistапсе Мutаtiоп iп Нumап Immшюdеfiсiепсу
Viшs Тtуре 1 Rеvеrsе Trапsсriрtаsе Оссur iп Sресiflс RNA Stгасturаl Rеgiопs. АпtiтiсrоЫаl Аgепts апd Сhетоthеrару 199 '4, 38(2), 268-274. 4. Аvrаmis V.I., Кwоск R., Sоlоrzапо М.М. and Gomperts E. Еvidепsе оf In Vitrо Dеvеlорmепt оf Dгаg Rеsistапsе tо Аzidоthуmidiпе in T- Lуmрhосуtiс Lеuкеmiа CeIl Liпеs (Jurкаt E6-1/AZT-100) and in Реdiаtriс Раtiепts with HIV-I Iпfесtiоп. Jоиrпаl оf Асqиirеd Iттипе Dеfιсiепсу Sупdrотеs 1993, 6, 1287-1296.
5. Sviпаrсhuк F.P., Копеvеtz D.A., Рliаsuпоvа O.A., Роkrоvskу A.G., Vlаsоv V. V. Iпhibitiоп оf HIV рrоlifеrаtiоп iп MT-4 сеlls bу апtisепsе оligопuсlеоtidе сопjugаtеd tо liрорhiliс grоuрs. Вiосhiтiе 1993, 75, 49-54. 6. Роkrоvskii A.G., Рliаsшiоvа O.A., Вliпоv V.M., Vlаsоv V.V.,
Sviпаrсhuk F.P., Аbrаmоvа T.V., Gоrп V.V. and Копеvеtz D.А. Iпhibitiоп оf Нumап Immuпоdеfϊсiепсу Viшs bу Sense and Апtisепsе Оligоdеохупuсlеоtidеs. Моlесиlаr Вiоlоgу 1993, 27(5), Nl, 641-644. 7. Патент РФ 2144956, МПК. С 12 N 7/04, опубл. 27.01.2000 г.
8. Иммуноферментный анализ // под ред. T-T. Нго, Г. Ленхоффа. - M: Мир. - 1988.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ '-Aминoкapбoнилфocфoнaты d4T5 имеющие общую формулу
Figure imgf000015_0001
где: R'= H, аlkуl, аrуl; R"= H, аlkуl, аrуl; R', R"= сусliс аlkуl
R = аlkуl
ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека.
PCT/RU2003/000513 2003-06-16 2003-11-21 5'-aminocarbonylphosphonates d4t utilises comme inhibiteurs de la reproduction du virus de l'immunodeficience humaine Ceased WO2004111071A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2003118102/04A RU2247124C1 (ru) 2003-06-16 2003-06-16 5`-аминокарбонилфосфонаты d4т - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека
RU2003118102 2003-06-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004111071A1 true WO2004111071A1 (fr) 2004-12-23

Family

ID=33550550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2003/000513 Ceased WO2004111071A1 (fr) 2003-06-16 2003-11-21 5'-aminocarbonylphosphonates d4t utilises comme inhibiteurs de la reproduction du virus de l'immunodeficience humaine

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2247124C1 (ru)
WO (1) WO2004111071A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0306597A2 (en) * 1985-03-16 1989-03-15 The Wellcome Foundation Limited Antiviral nucleosides
RU2130942C1 (ru) * 1997-07-11 1999-05-27 "С энд Ти Сайенс энд Текнолоджи Инк" Способ получения 3'-азидо-2', 3'-дидезокситимидина
RU2188203C2 (ru) * 2000-10-05 2002-08-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидин-5'[(этоксикарбонил)(этил)фосфонат]- ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0306597A2 (en) * 1985-03-16 1989-03-15 The Wellcome Foundation Limited Antiviral nucleosides
RU2130942C1 (ru) * 1997-07-11 1999-05-27 "С энд Ти Сайенс энд Текнолоджи Инк" Способ получения 3'-азидо-2', 3'-дидезокситимидина
RU2188203C2 (ru) * 2000-10-05 2002-08-27 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидин-5'[(этоксикарбонил)(этил)фосфонат]- ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека

Also Published As

Publication number Publication date
RU2247124C1 (ru) 2005-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baba et al. Potent and selective inhibition of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by 5-ethyl-6-phenylthiouracil derivatives through their interaction with the HIV-1 reverse transcriptase.
CA1336820C (en) Fluorinated nucleosides and process for treating retrovirus infections therewith
Tanaka et al. Synthesis and anti-HIV activity of 2-, 3-, and 4-substituted analogs of 1-[(2-hydroxyethoxy) methyl]-6-(phenylthio) thymine (HEPT)
Storer et al. The synthesis and antiviral activity of 4-fluoro-1-β-D-ribofuranosyl-1H-pyrazole-3-carboxamide
WO2003062256A1 (en) 2'-beta-modified-6-substituted adenosine analogs and their use as antiviral agents
EP0322384A1 (en) Nucleosides for use in therapy
WO1990008550A1 (en) Antivirals and methods for increasing the antiviral activity of azt
WO1996033171A1 (en) 1h-pyrrol-1-yl and 1h-indol-1-yl aryl sulphones, processes for their preparation and use for the therapy of hiv-1 infections
Busso et al. Nucleotide dimers suppress HIV expression in vitro
McGuigan et al. Kinase bypass: a new strategy for anti-HIV drug design
RU2188203C2 (ru) 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидин-5'[(этоксикарбонил)(этил)фосфонат]- ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека
Yang et al. Highly selective action of triphosphate metabolite of 4′-ethynyl D4T: a novel anti-HIV compound against HIV-1 RT
AU609099B2 (en) Methods of treating acquired immune deficiency syndrome (AIDS) caused by human immunodeficiency virus (HIV)
Song et al. Synthesis and biological properties of amino acid amide ligand-based pyridinioalkanoyl thioesters as anti-HIV agents
WO2004111071A1 (fr) 5'-aminocarbonylphosphonates d4t utilises comme inhibiteurs de la reproduction du virus de l'immunodeficience humaine
RU2187509C1 (ru) Производные 5'-h-фосфоната 3'-азидо-3'-дезокситимидина и фармацевтические композиции на их основе
McGuigan et al. Phosphate derivatives of AZT display enhanced selectivity of action against HIV1 by comparison to the parent nucleoside
Parkhurst et al. Growth inhibition of cells in culture and of vaccinia virus infected HeLa cells by derivatives of trifluorothymidine
RU2243972C1 (ru) Фосфорамидаты нуклеозидных аналогов - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека
Czernecki et al. Synthesis and anti-HIV-1 activity of base modified analogues of 3′-azido-2′, 3′-dideoxythymidine (AZT)
Singh et al. Synthesis, structure–activity relationship and antiviral activity of 3′-N, N-dimethylamino-2′, 3′-dideoxythymidine and its prodrugs
RU2373218C2 (ru) 5'-фосфорсодержащие производные 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина новые противовирусные агенты
Thillier et al. Solid-phase synthesis of 5′-triphosphate 2′-5′-oligoadenylates analogs with 3′-O-biolabile groups and their evaluation as RNase L activators and antiviral drugs
Van Aerschot et al. 2′-Azido-2′, 3′-dideoxythymidine: Synthesis and crystal structure of a 2′-substituted dideoxynucleoside
Martin et al. Synthesis, Anti-Hiv Activity, and Biological Properties of 2′, 3′-Didehydro-2′, 3′-Dideoxythwidine (d4T)

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA IN JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP