WO2004101787A1

WO2004101787A1 - ハンチンチン遺伝子の発現抑制

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Publication number: WO2004101787A1
Application number: PCT/JP2004/006360
Authority: WO
Inventors: Ichiro Kanazawa; Wanzhao Liu; Yu-Lai Wang; Keiji Wada; Jun Goto; Miho Murata
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-05-14
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2005-11-14
Also published as: US7589189B2; JPWO2004101787A1; CA2526893A1; AU2004239114B2; JP4179562B2; AU2004239114A1; US20080015158A1; CA2526893C

Abstract

　二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いたハンチンチン遺伝子の発現抑制方法、及び、該ハンチンチン遺伝子の発現抑制に用いるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤、ハンチントン病予防及び／又は治療薬を提供するものである。ハンチントン病のＨＤ遺伝子のＣＡＧリピートの上流近傍領域にあるｍＲＮＡの特異配列を標的として、該配列に相同なｄｓＲＮＡを用いて、ハンチンチン遺伝子の発現抑制を行う。本発明においては、ＣＡＧリピートの上流近傍領域のＲＮＡ特異配列に相同なｄｓＲＮＡとして、ｂｐが約２１～２３のように短いｓｉＲＮＡ（短二重鎖ＲＮＡ）を特に効果的に用いることができる。本発明のｄｓＲＮＡは、ハンチンチン遺伝子の発現抑制剤として、或いはハンチントン病の予防及び／又は治療薬として、哺乳動物の生体或いは生体細胞に、投与或いは導入して、ハンチントン病の予防及び／又は治療を行うことができる。

Description

明細書ハンチンチン遺伝子の発現抑制技術分野

本発明は、 RNA i (RNA inter f erence： R N A干渉）法を利用するものであって、ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチン mRN Aの標的となる特定配列に相同なセンス鎖 RN Aとァンチセンス鎖 R N Aからなる二重鎖 R N A ( s i R N A ： small interfering RNA) 、該二重鎖 R N Aからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含有するハンチントン病の予防及び Z又は治療薬等に関する。背景技術

ハンチントン病（HD) は、運動障害、認識喪失及び精神医学症状発現を特徴とする進行性の神経変性障害である U.Med. 315, 1267-1276, 1986) 。この病気は、普通、年齢 3 0〜 5 0歳の中年で発症するが、ある場合には非常に早期に、又は前記年齢よりも遅い時期に発症する場合もある。病徴は進行性であり、殆んどの場合は、運動障害の続発性の合併症の結果として発症の 1 0〜 2 0年後に死を招来する。ハンチントン病個体の脳の死後調査により、線条体に影響するニューロンの選択的喪失が判明している。ハンチントン病の原因遺伝子であるハンチンチン遺伝子は、ヒトでは染色体 4の短腕における末端の細胞遺伝子学的サブバンド内にある loci D 4 S 1 2 6及び D 4 S 9 8に挟まれた 2. 2 Mb 領域にマッピングされている（Neuron 3， 183-190, 1989、 J. Hum. Genet. 49, 7-16, 1991、 Am. J. Hum. Genet. 51, 357-362, 1992) 。ハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子転写の第 1ェクソンにおいて C AGリピ一トが伸長し、ポリグルタミン（poly Q) トラクトに翻訳され、その結果脳線条体神経細胞が進行的に喪失することに因る遺伝性の神経変性疾患である（Annu. Rev. Med. 47, 201-209, 1996) 。すなわち、ハンチントン病は、ハンチンチン遺伝子の第 1ェクソン部位上の非定常的な C AGリピ一トの伸長によって引き起こされ、選択的脳線条体神経の死（loss) に至る。ハンチンチン遺伝子は、ハンチンチンという分子量 34 8 k D aの細胞質タンパク質をコードし、中枢神経系（CN S ) 及び非中枢神経系（non-CN S) 組織の両方において広く発現している。ハンチンチンタンパク質において、 HD遺伝子の C AG 3連配列（ CAG triplets) はポリグルタミン（poly Q) に翻訳される。一般的に、正常及びミュータント（変異）ハンチンチンアレル中に、それぞれ 6〜 3 7、 3 5〜； L 8 0の C A Gリピートが含まれる。

昨今、ハンチントン病に対する処置方法として、ハンチンチン遺伝子を処置したり、ハンチンチン遺伝子をターゲッティングにした方法、或いは、ハンチンチン遺伝子の発現するハンチンチンタンパク質に拮抗する物質を用いた方法等が開示されている。例えば、特開平 7 - 6 7 6 6 1号公報には、患者の細胞に正常なハンチンチンタンパク質を発現する D N Aを導入して、ミュータントハンチンチン遺伝子を正常な遺伝子で置換する方法や、患者の細胞にハンチントン病のハンチンチン遺伝子のアンチセンス RN Aを転写 ·発現可能な配列をコードする遺伝子を導入する方法、或いはハンチントン病のハンチンチンタンパク質にアン夕ゴ二ストを投与する方法等の処置方法が開示されている。また、特表 2 0 0 3 - 5 0 3 0 0 8号公報には、ハンチントン病のような常染色体優性疾患に対する処置方法として、ハンチントン病の RN Aを標的とした対立遺伝子特異的ターゲッティングによる処置方法が開示されている。しかし、これらの処置方法は、遺伝子導入の複雑さや安定性の問題、或いは得られる処置効果の面から、必ずしも期待通りのものとはなっていない。

一方、近年、ある種の生物（線虫： Caenorhabditis elegans) では、二重鎖 RNAによって遺伝子の発現を特異的に阻害できることが見い出された（Nature 391, 806-811, 1998、 WO 9 9 / 3 2 6 1 9) 。この現象は、ある遺伝子と相同な、センス RNAとアンチセンス RNAからなる二重鎖 RNA (double-strand RNA： d s RNA) が、その遺伝子の転写産物（mRNA) の相同部分を破壊するという現象で、 RNA i ( RNA interference) と呼ばれている。この現象は、その後、種々の動物 (Cell 95, 1017-1026, 1998、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14687-14692, 1998、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5049-5054, 1999 ) や、植物（Proc. Natl. Acad. Sci, USA 95， 13959-13964, 1998) を含む下等な真核細胞において見い出されている。

RNA iは、発見された当初、哺乳動物細胞においては、約 3 0 b p 以上の d s RNAを細胞内へ導入すると、細胞が本来持っている免疫機能によりアポト一シスを起こし、細胞が死んでしまうため、哺乳動物細胞での利用は困難と思われていた。しかし、 2 0 0 0年にマウス初期胚や哺乳動物培養細胞でも、 RN A iが起こりうることが示され、 RNA iの誘導機構そのものは、哺乳動物細胞にも存在することが明らかになつてきた（FEBS Lett 479, 79-82, 2000、 WO 0 1 / 3 6 6 4 6 ) 。

このような RNA iの機能を利用して、哺乳動物において、ある特定の遺伝子又は遺伝子群の発現を阻害することができれば有益であることは明らかである。多くの疾病（癌、内分泌疾患、免疫疾患など）は、哺乳動物の中で、ある特定の遺伝子又は遺伝子群が異常発現することによつて起こるので、遺伝子又は遺伝子群の阻害は、これらの症状を治療するために使用することができる。また、変異型タンパク質の発現に起因して疾病が発症することもあり、このような場合には、変異した対立遺伝子の発現を抑えることで、疾病の治療が可能となる。更に、このような遺伝子特異的な阻害は、例えば、 H I Vなどのレトロウイルス（レトロウィルス中のウィルス遺伝子は、それらの宿主のゲノム中に組み込まれて、発現される）によって引き起こされるウィルス疾患を治療するためにも使用し得る。

RN A iの機能を引き起こす d s RN Aは、当初、約 3 0 b p以上の d s RNAの細胞内への導入が必要と考えられていたが、最近、更に短い（ 2 1〜 2 3 b p)の d s RNA (短二重鎖 RNA： s i RNA： small interfering RNA) が、哺乳動物細胞系でも細胞毒性を示さずに R N A i を誘導できることが明らかになった（Nature 411， 494-498, 2001) 。 s i RNAは、体細胞の全ての発生段階において遺伝子の発現を抑制する強力な手段として認識されており、進行性の遺伝病等において、発病する前に、病気の原因となる遺伝子の発現を抑制する方法として期待し得る。しかし、今までこのような d s RNAによる遺伝子特異的な遺伝子発現の抑制方法をハンチントン病（HD) の遺伝病に効果的に適用した報告はなされていない。

本発明の課題は、ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチン mRNAの標的となる特定配列に相同なセンス鎖 R N Aとアンチセンス鎖 RNAからなる二重鎖 RNA ( s i RNA) 、該二重鎖 RN Aからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤、該発現抑制剤を有効成分として含有するハンチン卜ン病の予防及び Z又は治療藥等提供することにある。

ハンチントン病は、 HD遺伝子転写の第 1ェクソンにおいて C AGリピートが伸長し、ポリグルタミン（poly Q) トラクトに翻訳され、その結果脳線条体神経細胞が進行的に喪失することに因る遺伝性の神経変性疾患である。本発明者らは、 C A Gリピートの上流のハンチンチン mR NAを調べたところ、 s i RN Aの有効な標的である独特な配列を有する 2つの部位を見い出した。そこで、この配列に相同な d s RNA配列として： a) 5，非翻訳領域を標的とした s i RNA_ 5，UTR、及び、, b) C AGリピートの上流近傍領域を標的とした s i RNA— HDェクソン 1、更に、 c) 現在知られている通常のハンチンチン遺伝子とミュ一夕ントハンチンチン遺伝子との唯一の相違点は C AGリピートの長さであることから、 C A Gリピートを直接標的にする s i RNA- C AG の 3種類の s i RNAを作製し、該 s i R N Aの影響について培養組織モデルや、ハンチントン病モデルマウスを用いることにより解析したところ、 s i RN A— HDェクソン 1が極めて効果的にハンチンチン遺伝子の発現を抑制し、ハンチントン病の発症を抑制することを見い出し、本発明を完成するに至った。発明の開示

すなわち本発明は、（ 1 ) ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチン mR N Aの標的となる特定配列に相同なセンス鎖 RNAとアンチセンス鎖 RNAからなることを特徴とする二重鎖 RN Aや、（ 2 ) ハンチンチン mRNAの標的となる特定配列が、配列表の配列番号 1に示される塩基配列に由来する RNAからなる（ 1 ) 記載の二重鎖 RN Aや、（ 3 )ハンチンチン mRNAの標的となる特定配列が、 1 9〜 24 b pの塩基配列である（ 1 ) 又は（ 2 ) 記載の二重鎖 RN A や、（ 4 )配列表の配列番号 1に示される塩基配列に由来する RN Aが、ハンチンチン遺伝子のェクソン 1の C AGリピートの上流近傍の領域に由来する RN Aである（ 1 )〜（ 3) のいずれか記載の二重鎖 RN Aや、 ( 5 ) ハンチンチン遺伝子のェクソン 1の CAGリピートの上流近傍の領域に由来する RNAが、配列表の配列番号 3に示される塩基配列及び配列表の配列番号 4に示される塩基配列からなる（ 1 ) 〜（4) のいずれか記載の二重鎖 RNAや、（ 6) 配列表の配列番号 3に示される塩基配列において、 1又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列と該塩基配列に相補的な塩基配列からなる（ 1 ) 記載の二重鎖 RNA や、（ 7) 合成により製造されたセンス鎖 RN Aとアンチセンス鎖 RN Aから形成された（ 1 )〜（ 6 )のいずれか記載の二重鎖 RN Aや、（ 8 ) 遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖 RN Aとアンチセンス鎖 RNAから形成された（ 1 ) 〜（ 6 ) のいずれか記載の二重鎖 RNAや、（ 9) 遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖 RN Aとアンチセンス鎖 RN Aが、それら RN Aをそれぞれ転写することができる DN Aを組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入し、生成された RN Aを取得することによって形成されたものである（ 8 ) 記載の二重鎖 RN Aに関する。

また本発明は、（ 1 0 ) 上記（ 1 ) 〜（ 9) のいずれか記載の二重鎖 RN Aからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤や、（ 1 1 ) 上記（ 1 ) 〜（ 9 ) のいずれか記載の二重鎖 RN Aを、 H I V— 1由来の protein transduction domainである T A T配列に付加した融合物からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤や、（ 1 2) 上記（ 1 ) 〜（ 9) のいずれか記載の二重鎖 R Ν Αと、正電荷リポソーム /脂質との複合体からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤や、（ 1 3) 上記（ 1 ) 〜（6 ) のいずれか記載の二重鎖 Aを転写することができる D N Aを組み込んだ発現べクタ一からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤に関する。

更に本発明は、（ 1 4) 上記（ 1 0) 〜（ 1 3) のいずれか記載の発現抑制剤を哺乳動物の生体或いは生体細胞に導入する哺乳動物の生体或いは生体細胞におけるハンチンチン遺伝子の発現を抑制する方法や、

( 1 5) 上記（ 1 0) 〜（ 1 3 ) のいずれか記載の発現抑制剤を有効成分として含有するハンチントン病の予防及び/又は治療薬や、（ 1 6 ) さらに薬学的に許容される担体を含む（ 1 5) 記載のハンチントン病の予防及びノ又は治療薬や、（ 1 7) 上記（ 1 5 ) 又は（ 1 6) 記載の八ンチントン病の予防及び Z又は治療薬を、哺乳動物の生体或いは生体細胞に導入するハンチントン病の発症の予防及び/又は治療方法に関する, 図面の簡単な説明

第 1図、本発明の実施例における、 s i RN A s及び標的部位の配列を示す写真である。

第 2図は、本発明の実施例における、 s i R N Aの標的部位と pdlEGFP N1 の発現コンストラクトを示す写真である。なお、 aは、 s i RNAを用いた標的部位（黒い矢印）を、 bは、 pdlEGFP N1 プラスミドを、 cは、さまざまな数の C AGリピート（poly Q) を含む H Dェクソン 1を挿入した pdlEGFP N1の発現コンストラクトを示す写真である。

第 3図は、本発明の実施例における、 s i RN A— HDェクソン 1をコトランスフエクトした CO S— 7細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。

第 4図は、本発明の実施例における、 s i RNA— 5 'UTRをコトランスフェクトした CO S— 7細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。

第 5図は、本発明の実施例における、 s i RNA— CAGをコトランスフヱクトした CO S— 7細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。

第 6図は、本発明の実施例における、 s i RNA— CAGをコトランスフヱクトした CO S— 7細胞の蛍光顕微鏡による観察を示す写真である。なお、 aは、未処理のコントロール（4つの独立した実験）を E G F P光の平均値で標準化することにより、 s i R N Aの効果及び s i R N Aの効果が標的位置と細胞種により異なることを示した図を、 bは、親ベクター（HDェクソン 1なし）をそれぞれ 3種の s i RNAとコトランスフエクトした結果を、 cは、未処理のコントロールに対する、 H D、 β—了クチン、 GAP DHの m'RN Α量の相対的平均を示す写真である。

第 7図は、本発明の実施例における、 s i RNA— HDェクソン治療群の R 6 2マウスが 1 4週齢の時点で体重の減少が有意に抑えられたことを示す写真である。 s i RN A— HDェクソン治療群と未治療群を比較すると、野生型タイプ（WT ；黒バー）に比べて、未治療群（ダレ —バー）の体重が顕著に減少していることに対し、治療群（赤バー）の方はわずかしか減少が見られない。

第 8図は、本発明の実施例における、 s i RN A— HDェクソン治療群の R 6 / 2マウスにおける生存期間が有意に伸びていたことを示す写真である。

第 9図は、本発明の実施例における、 s i RN A— HDェクソン治療群の R 6 / 2マウスに脳内注入 48時間後線条体におけるミュータントハンチンチン mR N Aの発現量が抑制されたことを示す定量 R T— P C Rの結果の写真である。縦軸がミュータントハンチンチンの mRNAレベルの相対値を示し、グレーのバーが ]3—ァクチンを内部標準とし、赤のバーが GAP DHを内部標準とした値を示す。

第 1 0図は、本発明の実施例における、 s i RNA— HDェクソン治療群の R 6 / 2マウスにおいて線条体の神経細胞核内封入体の出現頻度が顕著に減少したことを示す写真である。 A— Fは、抗ハンチンチン抗体、 G—Hは抗ュビキチン抗体で染まったことを示している。発明を実施するための最良の形態

本発明の二重鎖 RNAとしては、ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチン mRN Aの標的となる特定配列に相同なセンス鎖 RNAとアンチセンス鎖 RNAからなるものであれば特に制限されるものではなく、上記ハンチンチン遺伝子の由来としては特に限定されないがヒト由来のハンチンチン遺伝子が好ましい。かかるハンチンチン遺伝子としては、配列表の配列番号 1に示される塩基配列からなるハンチンチン遺伝子の第 1ェクソン C B Iァクセッション番号 L 1 2 3 9 2及び NM— 0 0 2 1 1 1の：！〜 5 84番目；配列表の配列番号 1、その遺伝子の対応するアミノ酸配列については、配列番号 2に示される）（Cell 72, 6, .971-983, 1993) を例示することができる。上記ハンチンチン mRN Aの標的となる特定配列とは、ハンチンチン mRN Aの特定の領域の部分配列、好ましくは 1 9〜 24 b p、より好ましくは 2 1〜 2 3 b p、特に好ましくは 2 1 b pの塩基長の部分配列をいい、かかるハンチンチン mRN Aの標的配列としては、ハンチンチン遺伝子のェクソン 1の C A Gリピ一トの上流近傍の領域に由来する R N A、特に、配列表の配列番号 1に示される塩基配列の 343〜 3 6 3 番目の塩基配列に由来する R N Aを好適に例示することができる。

また、ハンチンチン mRNAの標的となる特定配列に相同なセンス鎖 RNAとは、上記配列番号 1に示される塩基配列の 3 43〜 3 6 3番目の塩基配列などに由来する RN Aをいい、ハンチンチン mRNAの標的となる特定配列に相同なアンチセンス鎖 RNAとは、上記センス鎖 R N Aと相補的な RNAをいい、具体的には、センス鎖 RNAとしては、 G C CUUC GAGUC C CUCAAGUC C (配列番号 3 ) を、アンチセンス鎖 RNAとしては、 UC C GGAAGCUCAGGGAGUUC A (配列番号 4) を好適に例示することができる。また、センス鎖 RN Aとして GAUGGAC GGC C GCUCAGGUUU (配列番号 5 ) を、アンチセンス鎖 RNAとして UUCUAC CUGC C GGC GAG UC CA (配列番号 6) を挙げることもできる。

本発明の二重鎖 RN Aは、通常これらセンス鎖 RN Aとアンチセンス鎖 RNA同士が結合した s i RNAとして構築されるが、便宜上、センス鎖 RN A配列において、 1又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された変異センス鎖 RN A配列と該変異センス鎖 RN A配列に相補的な変異アンチセンス鎖 RN A配列との s i RNAとして構築した二重鎖 RN Aも本発明の範囲に含まれる。上記「 1又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列」とは、例えば 1〜 5個、好ましくは 1〜 3個、より好ましくは 1〜2個、さらに好ましくは 1個の任意の数の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列を意味する。

本発明の二重鎖 RNA (d s RNA) を作製するには、合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二重鎖 RN Aを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖 D N Aやアンチセンス鎖 D N Aを組み込んだ発現べクタ一を構築し、該ベクタ一を宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖 RN Aやアンチセンス鎖 RN Aをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、ハンチンチン遺伝子の特定配列のセンス鎖 DNA—リンカ一—アンチセンス鎖 DNAを用いて、ヘアピン構造を形成する R N Aを発現させることにより、所望の二重鎖 RN Aを作製することもできる。

本発明のハンチンチン遺伝子の発現抑制剤としては、上記本発明の二

0 重鎖 R N A ( d s R N A ) 、該二重鎖 R N Aを H I V - 1由来の protein transduction domainである T A T配列に付加した融合物、該二重鎖 R N Aと正電荷リボソーム Z脂質との複合体、又は該二重鎖 R N Aを転写することができる D N Aを組み込んだ発現ベクターを挙げることができる。上記発現ベクターとしては、レンチウィルスベクター、ヘルぺスゥィルス ( H S V ) ベクター、アデノウイルスベクター、ヒト免疫不全ゥィルス（H I V ) ベクター等のウィルスベクターや、動物細胞発現用プラスミドを挙げることができる。

本発明のハンチントン病の予防及びノ又は治療薬としては、上記本発明のハンチンチン遺伝子の発現抑制剤を有効成分として含有するものであれば特に制限されないが、この分野で通常用いられる薬学的に許容される担体、例えば結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、 p H緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分とともに用いることができる。該薬学的に許容される担体とともに用いる薬学的組成物は、その投与形態、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）投与、或いは非経口投与（注射剤等）等に合わせて、薬学の分野ではそれ自体周知の製剤形態で製剤化することができる。

また、本発明のハンチンチン遺伝子の発現抑制方法や、本発明のハンチントン病の予防及び Z又は治療方法としては、上記本発明の発現抑制剤やハンチントン病の予防及び/又は治療薬を、哺乳動物の生体、組織又は細胞に導入する方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、二重鎖 R N Aのそれぞれの R N Aを転写する遺伝子、ヘアピン状の二重鎖 R N Aを転写する遺伝子を哺乳動物の生体或いは生体細胞に導入するには、それ自体公知の遺伝子導入方法によって行うことができる。例えば、以下の導入方法を挙げることができる。（ 1 ) 脳内注入法：胎児期や新生児期に二重鎖 R N A、 s i R N Aを組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウィルスベクターやプラスミド、 TAT— s i RNA、正電荷リボソーム Z脂質一 s i RN A複合体を直接に脳内注入する。成熟期に脳室内に投与する。（ 2 ) 四肢や尻尾の静脈よりパルス注射法：短時間内に相当量の二重鎖 R N A、 s i RN Aを組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウィルスベクターやプラスミド、正電荷リボソーム Z脂質一 s i RN A複合体を注入する。（ 3)腹腔内投与法： s i RNAを組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウィルスベクター、 TAT— s i RNAを注入する。（4) 鼻粘膜点滴導入法：二重鎖 RNA、 s i RNA を組み込んだ生体内で合成できる既に公知のウィルスベクター、 T AT 一 s i RNAを鼻粘膜から吸収させる。

(実施例）

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

実施例 1

[材料及び方法]

( s i RNA sの作製）アンチセンス鎖 RN Aとしては、 UC C GGA AGCUCAGGGAGUUCA (配列番号 4)

ハンチンチン遺伝子のェクソン 1領域（N CB I ァクセッション番号： L 1 2 3 9 2及び NM— 0 0 2 1 1 1の 1〜 5 84番目；配列番号 1 ) を基にして、 3種類の RNA sを設計した（図 1 ) 。 2 1ヌクレオチドからなる 3種類の RN A s、すなわち（ 1 ) s i RNA— HDェクソン 1 センス鎖：配列番号 1の 34 3〜 3 6 3番目； GC CUUC G AGUC C CUCAAGUC C (配列番号 3 ) 、アンチセンス鎖：配列番号 1の 3 4 1〜 3 6 1番目に相補的； UC C GGAAGCUCAGG GAGUUCA (配列番号 4) 、 ( 2) s i RNA- 5 'UTR センス鎖：配列番号 1の 1 9 0〜 2 1 0番目； GAUGGAC GGC C GCU

2 C AGGUUU (配列番号 5) 、アンチセンス鎖：配列番号 1の 1 8 8 〜 2 0 8番目に相補的； UUCUAC CUGC C GGC GAGUC CA (配列番号 6) 、（ 3 ) s i RN A- C AG センス鎖：配列番号 1の 3 6 7〜 3 8 7番目； GCAGCAG CAGCAGCAGCAGCA ( 配列番号 7) 、アンチセンス鎖：配列番号 1の 4 0 9〜 4 2 9番目に相補的； GU C GU C GU C GU C GU C GU C GU C (配列番号 8 ) 、すべて図 1参照）を化学的に合成し、 HP L C精製を行った（Xeragon, USA) 。二重鎖 s i RN A sは、ァニ一リングパッファー（ 1 0 0 mM酢酸カリウム、 2 mM酢酸マグネシウム、 3 0mMHE P E S、 0. I N 水酸化カリウムで pH 7. 4に調整、 4°Cで保存）中で、 2 0mMのセンス鎖及びアンチセンス鎖 RN Aをァニールさせた。反応混合物を 9 5 °C 5分で反応させた後、 1. 5時間かけて 3 7 °Cまで徐々に冷却し、 6〜 2 0時間室温下においた。ァニール後の s i RNA sは、使用時まで、一 2 0 °C若しくは一 8 0 °Cで保存した。

(プラスミドの構築）

5 'UTR ェクソン 1及び HD ェクソン 1の 2種類の発現べクタ一を構築した。 2つのタイプのコンストラクトは、 5 'UTRを含むもの、又は含まないもの、そして、両タイプとも通常（ 34の CAGリピートを含む）又は変異（ 3 5以上の C AGリピートを含む） HD遺伝子を用いて作製した。コンストラクトは、ヒト HD 5 'UTR断片及びェクソン 1の完全長 pdlEGFP- Nl (de-stabled EGFP, Clontech) E GF Pを持つインフレームと融合させた（図 2参照）。

(細胞系及び培地）

C 0 S— 7細胞（African green monkey fibroblasts：アフリカミドリザル繊維芽細胞）、 SH— s y 5 y細胞（human neurob 1 as t oma：ヒト神経芽細胞腫）、及び Neuro- 2A細胞（mouse neur ob 1 as t oma：マウスヒト神経芽細胞腫）のそれぞれ異なる起源を持つ 3種の細胞系を用いた。 C 0 S— 7細胞は、 Minimum Essen t ial Medium-Alpha Medium (Gibco BRL ) 、 S H— s y 5 y細胞及び Neuro-2A細胞は、 DMEM (Dulbecco' s Modified Eagle's Medium) 培地（Gibco BRL) 中でそれぞれ培養した。なお、培地中には、 1 0 %熱非動化ゥシ胎児血清、 l O UZmLぺニシリン（明治製菓社製）、及び 5 0 /2 g/mLストレプトマイシン（明治製菓社製）をそれぞれ含む。

(卜ランスフエクシヨン）

トランスフエクシヨン 24時間前に播種した培養細胞を、抗生物質を含まない 1 0 % F B S含有培地中で増殖させた。 2種類のトランスフエクシヨン試薬を用いることにより、構造プラスミド及び s i RNA sの細胞への導入を行った。

a. Ef fectene (Qiagen, Germany) ：細胞培養及びトランスフエクション実験には、 9 6穴プレートを用いた。製造者の取扱説明書にしたがつて、約 40〜 6 0 %コンフルェントの細胞を、トランスフエクシヨン前に 24時間前培養した。 0. 5 Lの Ef fectene試薬を各穴に添加し、 2 4時間後に結果を解析した。

b . Lipofectaraine 2000 (Invitrogen, USA) ：製造者の取扱説明書にしたがって、約 8 0 %コンフルェントの細胞を、トランスフエクシヨン前に 24時間の前培養を行った。 0. 3 Lの Lipofectamine 2000試薬を各穴に添加した。

なお、 a、 bいずれの試薬を用いた実験においても、 24〜4 8時間後に発現レベルを解析した。

c . ヒト内因性 HD遺伝子発現の抑制に対する s i RNA sの影響を調ベるために、 Lipofectamine 2000試薬を用いて、 s i RNA sをSH— s y 5 y細胞に導入した。トランスフエクション後 4 8時間後に細胞を回収し、全 RNAを Trizol (Invitrogen, USA) を用いて抽出した。

( s i RNA効果の定量的評価）

トランスフエクシヨン後 24時間及び 4 8時間後に培養プレートを蛍光顕微鏡で観察した。 s i RN Aの効果を定量的に評価するために、 Wallac 1420 ARVO sx (ParkinElmer, USA) 又は FluoreScan 11を用いて、 G F P蛍光を測定した（励起： 48 5 nm、発光： 5 3 8 nm) 。

(mR N Aレベルの定量）

トランスジエニック HDェクソン 1— E GF PmRN Aの定量的解析は、 Light Cycler (Roche, USA) を用いたリアルタイム RT— P C Rにより行った。 S H_ s y 5 y細胞の内因性 HD発現における s i RNA— HDェクソン 1の効果を Light Cycler (Roche, USA) を用いた定量的 R T 一 P CRにより測定した。コントロールとして、各サンプルごとの GA P DH及び /3—ァクチンの発現レベルを定量した。

(哺乳類モデル動物）

ハンチントン病モデルマウス ( 系統名：

B6CBA-Tg(HDexonl)62oGpb/J 一般名： R 6 / 2、購入元： The Jackson Laboratory, USA) を用いた。このマウスはハンチンチン遺伝子の一部ひ \ンチンチンプロモーター及び 1 1 4個の CAGリピ一ト領域を含むェクソン 1 ) 約 l k bの長さのヒト遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの F 1のメスの卵巣を移植した hemizygote である。生後約 9 週から 1 1週の間に発症し、臨床症状としては体重の減少、振戦、不安定歩行及び痙攣様発作などが示され、生後 1 5週までに全例が死亡する。神経病理学的な所見としてほとんどすべての神経細胞の核内に抗ハンチンチン抗体及び抗ュビキチン抗体に染まる核内封入体が検出できる。 (生体内投与方法）

生後 2 曰のマウスの脳内に 5 0 a 1 のハミルトンのシリンジで s i R N A— H Dェクソンとリボフェク夕ミン（ Lipofectamine2000, Invitrogene, USA) とのコンプレクスの量（約 2 0 0 n g s i RNA— HDェクソン含有）を注入した。針の注入位置はプレダマより後方へは l mm、右方へは l mmであり、注入の深さは 2 mmである。

(生体内での s i RN A効果の定量的評価）

mRNAレベルの定量：脳内投与後ミユータントハンチンチンの mRN Aの定量的解析は、 ABI 7700 sequence detector system (ABI,USA)を用いたリアルタイム R T— P C Rにより行った。プライマー配列： 5 ' 一 C GC C GC CTC CT CAGCTTC C T— 3，（フォワード；配列番号 9) ; 5'— GC GGTGGTGG C GG C GGC GGCT - 3' (リバース；配列番号 1 0)。内部標準として GAP DHと）3—ァクチンを使用した。

病理組織学的定量解析：室温で P B Sによる 5分間前灌流してから、 4 % パラホルムアルデヒド（P FA) で灌流固定した後、速やかに抜脳し、手早く同一固定液にて 4°Cで一晩後固定した。その後、脳組織をパラフインで包埋し、 4 mmの厚さの切片を作成した。 AB C法（Vectorstain Elite ABC kit .Vector Labs, Burlinggame, USA)にて免疫染色した。ゥサギ抗ュビキチンポロクロ一ナル抗体（1:100; Dako, CA, USA)とマウス抗ハンチンチンモノクローナル抗体（mEM48, 1:500; Chemicon, Temecula, USA)を用いた。 DAB発色した後、へマトキシリンにて後染色し、脱水、透明、封入後光顕で観察し写真を撮った。

個体レベルでの定量解析：

体重変化：生後 4週齢から体重を週ごとに測定した。

尾吊り下げ試験：生後 4週齢から 1 4週齢の間、「発症」という判定するまでに週ごとにマウスの尻尾を掴んで吊り下げて後肢が腹側に抱き込む姿勢をとるまでの時間を計った。判定標準として 1 5秒以内に出てきたら発症という判定を下す。

生存期間：個別飼育にて病死までの寿命（日数）を記録した。

[結果]

(インビトロデ一夕）

COS— 7培養細胞を用いて、合成 s i RNAの抑制効果を、発現コンストラクトと共にコトランスフエクトすることにより解析した。その結果、本発明者の s i RNAは、 s i RN Aによって効果が異なるものの、外因性 HD遺伝子ェクソン 1の発現を抑制したことを示した（図 3 〜 5、参考写真 1〜 3参照）。調べた 3種の s i RNAのうち、 s i R N A— HDェクソン 1は非常に高い効果を示し、培地中の s i RNAの終濃度が 40 nMのときに、標的である導入遺伝子の発現を 8 0 %以上抑制した。これに対して、他の 2種の s i RNA ( s i RNA— 5 'UT R、 s i RNA— CAG) は中程度から弱い効果しか示さなかった（図 6 a、 G F P光による測定により判断）。さらに、本発明者は、 2種の s i RN Aによる抑制効果は遺伝子特異的であるが、 s i RNA— CA Gは、 HD遺伝子ェクソン 1がないベクタ一の発現を抑制する非特異的な抑制効果があることが観察された（図 6 b) 。予想通り、 s i RNA は、定量的 R T _ P C Rにより推測された標的であるトラスフエクト遺伝子の mRN A分解を誘導した。

ハンチントン病（HD) は選択的な神経細胞死によつて引き起こされるものであり、神経細胞内の HDの発現を抑制することが最も重要である。神経細胞は RNA i に対し最も抵抗力があるとみなされてきたが（ Gene 263, 103-112, 2001) 、神経細胞内でうまく機能していることが実証された（PNAS 99, 18， 11926-11929, 2002) 。本発明者による、 s i RNAと発現コンストラクトを、 S H— s y 5 y (ヒト神経芽細胞腫）培養細胞内にコトランスフエクトした実験によれば、 s i RN A-HD

7 ェクソン 1が C O S— 7細胞培養と比較して効果は少ないものの、他の 2種の s i RN Aは低程度の効果しかないか、もしくは効果がなかった (図 6 a) 。

上記の結果により、 s i RNA— HDェクソン 1が、ハンチントン病 (HD)の発現を最も抑制することが明らかになつたので、本発明者は、 S H- s y 5 y細胞における内因性 HDの発現に対する影響を調べた。 HD mRN Aの定量的測定により、 s i R N A— H Dェクソン 1を使用してから 4 8時間後には、内因性 HD遺伝子の発現が 6 0 %以上阻害されることが示された。ところが、 G AP DHと j3—ァクチン両方の mR N Aレベルはどちらも明らかに変化しなかったので、 s i RNA— HD ェクソン 1が HD遺伝子を特異的に抑制することが証明された（図 6 c )< (インビポデータ）

個体レベルでの効果は発症する証拠とする尾吊り下げ試験では s i R NA— HDェクソン治療群は有意に遅れることがわかった。また、 5週齢以後、未治療群 R 6 / 2マウスにおける持続的な体重の減少と比べ s i RNA— HDェクソン治療群 R 6 / 2マウスにおいては有意に改善された（図 7 )。また、 s i RN A— HDェクソン治療群と未治療群における累積生存率曲線の比較（Kaplan-Meter 法）から、未治療群（黒線）と比べ治療群（赤線）の生存期間も有意に延長された（図 8)。

この臨床効果とともに、脳内では注入後 4 8時間で線条体のミュー夕ントのハンチンチンの mRN A発現量が 6 0パ一セント減少した（図 9 ), 病理学的に抗ュビキチン抗体と抗ハンチンチン抗体を用いた免疫染色の結果、 s i RNA— HDェクソン治療群では線条体におけるュビキチンとハンチンチン陽性の核内凝集体の出現頻度が両方とも顕著に減少していた（図 1 0 )。第 1 0図には、 1 0週齢の R 6 / 2 トランスジエニックマゥスの線条体におけるハンチンチン及びュビキチン陽性の核内封入体

8 の免疫染色像が示されている。 A— Fはハンチンチン、 G— Hはュビキチンの染色性を示す。ハンチンチンの場合、全く検出されない野生型マウス（A, D) と比べ R 6/ 2マウス（B， E, C， F) では、はっきりとした核内強陽性の所見が見られる。一方、 s i RNA— HDェクソン治療群のマウス（C， F) では、対照となる未治療群（B， E) と比ベ、核内封入体の数が顕著に減少している。同様に s i RNA— HDェクソン治療群のマウスのュビキチン核内封入体の数も減っている（Gは未治療群； Hは s i RNA— HDェクソン治療群）。

上記のように、ただ一回注入だけで生体内でハンチンチン遺伝子の転写レベルが抑制され、 R 6 Z 2マウスにおいて新しい核内凝集体の形成が減少しており、結果としてこのマウスの寿命が延びた。

[考察]

理想的なアプローチとしては、毒性が現れる前に、（ 3 5以上の〇八 Gリピートを持つ）変異対立遺伝子の発現を抑えることである。しかし、 s i R N Aとそれぞれ異なる CAGリピートの長さ（ 1 4〜 1 4 9) を含むコンストラクトとの組合わせたところ、抑制効果が C AGリピ一トの長さとは無関係であることが明らかになつた。

本研究により、 s i RNAの一つが、ハンチントン病（HD) の発現の特異的抑制を効率的に仲介することが明らかになった。 RN A iは成熟したマウスにおいても機能することが示されたので（Nature 418, 38-39, 2002) 、 H D発現の効率的な抑制は、様々の種類の細胞及びモデル動物の生体内における内因性ハンチンチンを抑制した後、未だ解明されていないハンチンチンの機能を研究するのに有用である。 s i RNA 技術を治療法として利用することは HD患者の治療の戦略となりうる (Mol. Med. Today 3, 175-183, 1997) 。特定の範囲での H D発現の抑制により、疾病の進行を停止させることができる。なぜなら、ハンチン

9 チンの機能は、 HD患者において発現した遺伝子産物の量に対して敏感に（もしくは、検出限界以下）現れるようには見えないからである（Cell 101, 57-66, 2000) 。産業上の利用可能性

本発明においては、ハンチンチン遺伝子発現を特異的かつ効率的に抑制する二重鎖 RN A (d s RNA) の作製に成功した。本発明の d s R N Aは、ゲノム中での配列の希少性の検索及びハンチンチン遺伝子産物の予測二次構造の検討結果から d s RNA配列を決定し、作製したものである。本発明の d s RN Aは、： N A干渉により遺伝子発現を抑制するが、その効果が特異的かつ効率的であり、ハンチンチン遺伝子発現を特異的かつ効率的に抑制する。特に、本発明で構築された短二重鎖 RN A ( s i RNA) は顕著な抑制効果を奏し、ハンチントン病の遺伝子治療実現化のための薬剤としての期待が大きい。

ハンチントン病は進行性で有用な治療法が確立されていない遺伝性疾患である故に、疾患原因である変異遺伝子を特異的かつ効率的に発現抑制すれば有用な治療法となると期待されている。本発明の二重鎖 RN A (d s RNA) による RNA i (RNA干渉）の応用は上記目的を達成するに有望な手段であり、ハンチントン病治療法の開発における本発明の寄与は大きい。

また、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳失調症、球脊髄性筋 ― 萎縮症や Machado-Joseph病などはハンチントン病と共通の発症機序を持つトリプレットリピート病である。従って、本発明によるハンチントン病の治療方法の確立は、これらの共通点を持つ疾患の克服の可能性を広げるものである。

Claims

請求の範囲

1. ハンチンチン遺伝子の発現を抑制することができる、ハンチンチン mRN Aの標的となる特定配列に相同なセンス鎖 RN Aとアンチセンス鎖 RNAからなることを特徴とする二重鎖 RNA。

2. ハンチンチン mRN Aの標的となる特定配列が、配列表の配列番号 1に示される塩基配列に由来する RN Aであることを特徴とする請求項 1記載の二重鎖 RN A。

3. ハンチンチン mRN Aの標的となる特定配列が、 1 9〜 2 4 b pの塩基配列であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の二重鎖 RN A。

4. 配列表の配列番号 1に示される塩基配列に由来する RNAが、ハンチンチン遺伝子のェクソン 1の C A Gリピートの上流近傍の領域に由来する RN Aであることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の二重鎖 R N A。

5. ハンチンチン遺伝子のェクソン 1の C A Gリピートの上流近傍の領域に由来する RN Aが、配列表の配列番号 3に示される塩基配列及び配列表の配列番号 4に示される塩基配列からなることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の二重鎖 RN A。

6. 配列表の配列番号 3に示される塩基配列において、 1又は数個の塩基が欠失、置換或いは付加された塩基配列と該塩基配列に相補的な塩基配列からなることを特徴とする請求項 1記載の二重鎖 RN A。

7. 合成により製造されたセンス鎖 RN Aとアンチセンス鎖 RN Aから形成されたことを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか記載の二重鎖 RN A。

8. 遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖 RNAとアンチセンス鎖 RN Aから形成されたことを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか記載の二重鎖 R N A。

9 . 遺伝子組換え方法を用いることにより製造されたセンス鎖 R N Aとアンチセンス鎖 R N Aが、それら R N Aをそれぞれ転写することができる D N Aを組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入し、生成された R N Aを取得することによって形成されたものであることを特徴とする請求項 8記載の二重鎖 R N A。

1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか記載の二重鎖 R N Aからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。

1 1 . 請求項 1〜 9のいずれか記載の二重鎖 R N Aを、 ^1 1 ー 1由来の protein transduction domainである T A T配列に付加した融合物からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。

1 2 . 請求項 1〜 9のいずれか記載の二重鎖 R N Αと、正電荷リポソ一ム /脂質との複合体からなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。

1 3 . 請求項 1〜 6のいずれか記載の二重鎖 R N Aを転写することができる D N Aを組み込んだ発現ベクターからなるハンチンチン遺伝子の発現抑制剤。

1 4 . 請求項 1 0〜1 3のいずれか記載の発現抑制剤を哺乳動物の生体或いは生体細胞に導入することを特徴とする哺乳動物の生体或いは生体細胞におけるハンチンチン遺伝子の発現を抑制する方法。

1 5 . 請求項 1 0〜1 3のいずれか記載の発現抑制剤を有効成分として含有するハンチントン病の予防及び/又は治療薬。

1 6 . さらに薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする請求項 1 5記載のハンチントン病の予防及び Z又は治療藥。

1 7 . 請求項 1 5又は 1 6記載のハンチントン病の予防及びノ又は治療薬を、哺乳動物の生体或いは生体細胞に導入することを特徴とするハンチントン病の発症の予防及び又は治療方法。