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WO2004029089A2 - Nouvelle cible de l’ angiogenese et utilisations - Google Patents

Nouvelle cible de l’ angiogenese et utilisations Download PDF

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Publication number
WO2004029089A2
WO2004029089A2 PCT/FR2003/002810 FR0302810W WO2004029089A2 WO 2004029089 A2 WO2004029089 A2 WO 2004029089A2 FR 0302810 W FR0302810 W FR 0302810W WO 2004029089 A2 WO2004029089 A2 WO 2004029089A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ehta
protein
inhibitor
gene
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2003/002810
Other languages
English (en)
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WO2004029089A3 (fr
Inventor
Fabien Schweighoffer
Silvère Petit
Emmanuel Valentin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ExonHit Therapeutics SA
Original Assignee
ExonHit Therapeutics SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ExonHit Therapeutics SA filed Critical ExonHit Therapeutics SA
Priority to AU2003299096A priority Critical patent/AU2003299096A1/en
Publication of WO2004029089A2 publication Critical patent/WO2004029089A2/fr
Publication of WO2004029089A3 publication Critical patent/WO2004029089A3/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present application relates to the field of biology and health. It relates more particularly to the identification and functional characterization of a new protein involved in the mechanisms of vascular permeability, cell adhesion and angiogenesis, as well as the use of this protein as a therapeutic, diagnostic or screening target. It also relates to tools which can be used for the implementation of therapeutic, diagnostic or screening methods, such as in particular probes, antibodies, vectors, recombinant cells, etc.
  • the invention is particularly useful for the preparation of pharmaceutical compounds in the field of cancers, angiogenesis, inflammatory diseases or tissue damage.
  • Cell adhesion is a particularly important complex process to maintain tissue integrity and compartmentalization within the body.
  • the adhesion of one cell type to another within a given tissue results in the formation of intercellular junctions, known as tight junctions, adherent junctions, gap junctions and desmosomes.
  • the formation of these junctions ensures cohesion of the epithelia and endothelia and is responsible for the existence of impermeable barriers which prevent the free diffusion of cells and other biological substances from one tissue compartment to another.
  • a compound found in the blood must first cross the barrier formed by the endothelial cells making up the blood vessel. This barrier makes it difficult to target drugs to a given tissue.
  • Endothelial cells make blood capillaries very impermeable to drugs and the blood-brain barrier particularly complicates the delivery of molecules to the central nervous system.
  • many solid tumors develop internal barriers that limit the delivery of anti-tumor compounds or antibodies to targeted cells.
  • a modification of the intercellular connections also occurs during angiogenesis, and many pathologies have been described as having a component or a stage linked to the phenomenon of angiogenesis. Mention may be made, among others, of numerous cancers, retinopathies linked to diabetes, atherosclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, as well as pathologies linked to delayed scarring.
  • the present invention now describes the identification of a new protein involved in the phenomena of angiogenesis, cell adhesion and response to hypoxia.
  • An original approach has made it possible to identify a cDNA corresponding to a new protein which has structural and functional homology with the claudin family.
  • This new protein provides new bases for therapeutic and diagnostic approaches to pathologies associated with angiogenesis phenomena and, more generally, with proliferative processes.
  • RNA extracted from HMEC-1 cells (“Human dermal Microvascular Endothelial Cell ”) in culture, exposed or not to hypoxia (by treatment with desferoxiamine (DFO) for 16 hours).
  • This analysis was carried out by qualitative differential screening according to the DATAS technique described in patent No. WO99 / 46403.
  • This analysis made it possible for the applicant to construct a directory of splicing alterations in HMEC-1 cells exposed to hypoxia.
  • This repertoire which contains more than 1100 distinct sequences, involves key players in the phenomenon of response to hypoxia such as glycolysis enzymes (phosphofructokinase, pyruvate kinase or lactate dehydrogenase) or the glucose transporter GLUT-1.
  • RNAs coding for proteins involved in the stress response and in particular ORP150, which is directly involved in the response to hypoxic stress and in the stabilization of the NEGF factor, are also part of this repertoire, underlining the implication. of this response in response to hypoxia.
  • application WO02 / 070539 describes nearly a thousand different gene sequences, but without any functional characterization.
  • Application WO01 / 29221 also mentions several hundred gene sequences, without however providing any functional characterization.
  • the only sequence showing a region of homology with the protein of the invention is sequence No. 378 of this application, for which no expression was detected in any tissue (Table 9 of application WO01 / 29221).
  • Applications WO02 / 144499 and WO02 / 098898 describe the sequences of FLJ or claudin proteins, but without significant structural relationship with the protein according to the present invention. Under these conditions, no biological function and no application Industrial specific have so far been attributed to this putative sequence, and the very existence of the protein in biological samples has not been documented in the prior art.
  • the present application describes for the first time the identification of mRNA and of a protein having a sequence corresponding to FLJ20898, under pathophysiological conditions.
  • This protein was designated EHTA, because of its Expression after Treatment in Hypoxia ("Expressed upon Hypoxia Treatment”).
  • EHTA Expression after Treatment in Hypoxia
  • the present application demonstrates that this sequence is expressed and has important biological properties in the regulation of cell adhesion and paracellular permeability.
  • the present application thus provides a new functionally characterized protein and exposes, for the first time, its specific industrial applications.
  • EHTA amino acid sequence of this new protein
  • SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence of this new protein, designated EHTA, is shown below (SEQ ID NO: 2).
  • the coding sequence is represented in the sequence SEQ ID NO: 1.
  • EHTA protein (SEQ ID NO: 2)
  • a bioinformatics analysis carried out using tools known to those skilled in the art did not reveal any significant homology between the EHTA protein of the invention and other known proteins. However, it made it possible to highlight a weak homology between the EHTA protein and certain domains of proteins of the claudin family.
  • a second bioinformatics analysis, carried out using the Pfam server, made it possible to hypothesize that the EHTA protein was part of the claudin family. These proteins are involved in the formation of a tight junction.
  • the software used compares the protein sequence to be studied with a consensus sequence representative of a given protein domain. This consensus sequence is generated from an alignment of a large number of protein sequences of the domain considered.
  • a cDNA corresponding to the open reading phase of the EHTA protein was isolated by RT-PCR.
  • the sequence of the amplified fragment is provided in the sequence SEQ ID NO: 1.
  • This sequence was then cloned in phase with the sequence of the EGFP protein, and transfection and fluorescence imaging experiments made it possible to establish that the EHTA protein was addressed to the plasma membrane of the transfected cells.
  • Several stable clones of MDCK cells transfected with the EHTA-EGFP fusion protein were then isolated. The results obtained show that the fluorescence signal due to the expression of the fusion protein is highly concentrated at the junction between several cells ( Figure 2).
  • An MDCK clone stably transfected with the EHTA-EGFP fusion protein was then used in a test for measuring the paracellular permeability.
  • a monolayer of the cells studied is formed in order to separate two compartments of culture medium.
  • One of these compartments contains a fluorescent tracer, dextran coupled to FITC ("Fluorescein IsoThioCyanate").
  • FITC Fluorescein IsoThioCyanate
  • the present application therefore relates to the use of this protein as a target for the development of new molecules or of diagnostic methods. It also relates to EHTA protein regulatory compounds and their therapeutic use. It also relates to methods and compositions for screening for active compounds. It is particularly suitable for the diagnosis, monitoring or treatment of cancers.
  • a first subject of the invention relates to an EHTA protein in isolated or purified form, as well as variants and fragments thereof.
  • Another subject of the invention relates to a composition comprising an EHTA protein in isolated or purified form, or variants or elements thereof.
  • Another subject of the invention relates to a vector comprising a nucleic acid encoding the EHTA protein, as well as any recombinant cell expressing an EHTA protein.
  • a recombinant cell typically comprises a vector as defined above or a nucleic acid encoding an EHTA protein, and expresses an EHTA protein.
  • Another object of the invention lies in the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancers, in particular for inhibiting the formation of metastases in patients suffering from cancers.
  • Another subject of the invention lies in the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to inhibit angiogenesis, to regulate vascular or para-cellular permeability or to preserve or restore the tissue integrity.
  • Another subject of the invention relates to an antagonist or inhibitor compound of the EHTA protein, in particular an antibody, an antisense, a cytotoxic ligand.
  • the invention also relates to a method for detecting a pathology or a predisposition to a pathology in a subject, or for monitoring the evolution or the stage of advancement of a pathology, comprising determining the presence, the quantity (relative or absolute) or the distribution, in a sample of said subject, of the EHTA protein, of its expression, of altered forms thereof or of the corresponding gene or messenger RNA.
  • It also relates to methods of selection, screening, characterization, optimization or production of active compounds, comprising a step of determining the capacity of a test compound to interact with the protein or the EHTA gene, to modulate its expression or to modulate its activity.
  • the term EHTA protein designates any polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 2, a variant of the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof.
  • the term “variant” designates in particular all the natural variants of the sequence SEQ ID NO: 2, resulting for example from polymorphism (s), splicing (s), mutations (s), etc. Such natural variants can therefore comprise one or more mutations or substitutions, a deletion of one or more residues, etc. with respect to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the term variant also designates the EHTA polypeptides originating from another species, for example from rodents, bovines, etc.
  • the term EHTA protein designates a polypeptide of human origin.
  • variant also includes any synthetic variant of an EHTA protein, and in particular any polypeptide comprising one or more mutations, deletions, substitutions and / or additions of one or more amino acids with respect to the sequence SEQ ID NO 2.
  • polypeptides recognized by a polyclonal antibody produced from the EHTA protein of sequence SEQ ID NO 2.
  • Preferred variants advantageously comprise at least 75% identity with the primary sequence SEQ ID NO: 2, preferably at least 80%, more preferably at least 85%. Even more preferably, the preferred variants have at least 90% identity with the primary sequence SEQ ID NO: 2, preferably at least 95%, 96%, 97% or 98%.
  • the degree of identity can be determined by different methods and by means of software known to those skilled in the art, such as for example according to the CLUSTAL method.
  • Particular variants have a mutation or a substitution affecting 5 amino acids at most of the sequence SEQ ID NO 2.
  • the variants according to the invention are polypeptides retaining at least one immunological, biological or pharmacological property of the EHTA protein of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the biological properties are in particular the modulation of cell adhesion, para-cellular permeability or the contraction of inter-cellular junctions.
  • the immunological properties are for example the capacity to produce antibodies recognizing the protein of SEQ ID NO: 2.
  • the term EHTA protein also includes polypeptides comprising fragments of the sequence SEQ ID NO: 2 or a variant thereof. They are more particularly the polypeptides comprising a part of the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the fragment polypeptides of the invention preferably contain less than 200 amino acids, more preferably less than 180 amino acids, even more preferably less than 150 amino acids, for example less than 120 amino acids. They advantageously comprise at least 5 consecutive residues of the sequence of the EHTA protein.
  • the fragment polypeptides contain at least one region or a functional domain of the EHTA protein of sequence SEQ ID NO: 2, such as for example a membrane addressing domain, a transmembrane domain, a site for binding to the type domain. PDZ, an epitope, a secondary structure (loop, sheet, etc.), a consensus site, etc.
  • Preferred polypeptides of the invention comprise less than 200 amino acids of the sequence SEQ ID NO 2, more preferably less than 150, even more preferably less than 100, and contain at least residues 14-31, 101-123, 139- 162, 169-190, 210-212, 214-221 or 217-226 of the sequence SEQ ID NO 2.
  • polypeptides of the invention comprise less than 200 amino acids of the sequence SEQ ID NO 2 and comprise at least one specific antigenic domain of the sequence SEQ ID NO 2.
  • Another particular polypeptide is characterized in that it comprises a fragment of the sequence SEQ ID NO: 2 and in that it comprises at least one immunogenic domain of human EHTA protein.
  • the present application indeed proposes the production of EHTA fragment polypeptides preferably comprising an immunogenic portion of EHTA, which can be used for the production of antibodies, assay tests, etc.
  • These polypeptides can be developed using algorithms to assess the hydrophilicity or antigenicity of a polypeptide.
  • the term "fragment” or "portion” immunogen designates any portion of the polypeptide comprising an epitope, preferably a T or B epitope.
  • Such a fragment therefore advantageously comprises at least 7 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 2, more preferably at least 10 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 2, even more preferably at least 15 consecutive amino acids of the sequence SEQ ID NO: 2.
  • polypeptides capable of antagonizing the activity of EHTA are polypeptides capable of antagonizing the activity of EHTA. Such fragments can be used to inhibit the action of EHTA.
  • the EHTA polypeptides or proteins of the invention may include heterologous residues added to the indicated amino acid sequence.
  • an object of the invention resides in a polypeptide comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 2, or of a variant thereof, and a heterologous part.
  • the heterologous part can correspond to amino acids, lipids, sugars, etc. It can also be a chemical, an enzymatic, a radioactive group, etc.
  • the heterologous part may in particular constitute a marker, a targeting agent, a stabilizing agent, an agent improving immunogenicity or facilitating production, a protective agent, an agent facilitating penetration of the polypeptide into cells, a toxin, or compound. active, antibody, etc.
  • the EHTA proteins of the invention can be in soluble, purified or complexed form with a carrier molecule such as KLH or serum albumin, or any other inert molecule (for example synthetic), such as a bead for example.
  • polypeptides according to the invention are preferably devoid of contamination by proteins naturally present in their natural environment.
  • the polypeptides are coupled to a carrier molecule in particular for the manufacture of antibodies.
  • the coupling can be carried out according to conventional techniques.
  • the polypeptides can also be conjugated or fused to any other polypeptide or peptide molecule such as for example a peptide, polypeptide or a biologically active protein.
  • the EHTA proteins of the invention can be manufactured by any technique known per se to those skilled in the art, in particular by any chemical, biological, genetic, enzymatic technique, etc., alone or in combination (s).
  • Preferred methods include expression, in an appropriate cellular host, of a corresponding nucleic acid or artificial synthesis according to conventional techniques such as solid phase synthesis.
  • the EHTA proteins according to the invention can be used in selection or screening tests, in assay methods, to regulate the activity of EHTA in vitro or in vivo, for the production of drugs or vaccines, for the targeting of molecules, for the production of anti-EHTA antibodies, in particular therapeutic antibodies, etc.
  • EHTA gene means any nucleic acid encoding an EHTA protein as defined above. It can be DNA or RNA, of natural or synthetic origin. It can in particular be genomic, complementary, chimeric, artificial DNA, mRNA, etc.
  • the EHTA gene can be in single-stranded or double-stranded form. It can be obtained by any technique known to those skilled in the art from the sequence SEQ ID NO: 1 and the information contained in this application.
  • a particular EHTA gene comprises all or part of the sequence SEQ ID NO: 1 or of a complementary sequence, or of a different sequence due to the degeneration of the genetic code, or of a sequence hybridizing with these in high stringency conditions and encoding an EHTA protein.
  • the EHTA gene of the invention can be incorporated into a cloning or expression vector, into the genome of a cell, etc.
  • vectors which can be used to clone an EHTA gene of the invention are in particular plasmids, cosmids, episomes, artificial chromosomes, viruses, phages, etc. Mention may be made of various commercial plasmids such as pUC, pcDNA, pBR, etc.
  • viral vectors mention may be made of retroviruses, adenoviruses, AAVs, herpesviruses, etc. Such vectors constitute particular objects of the invention.
  • the gene or vector can be introduced into a host cell to produce an EHTA protein.
  • usable cells are in particular mammalian, yeast, plant, insect or bacteria cells. Mention may be made of primary cells or established lines of mammalian cells. Examples of mammalian cells include hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells or cell lines such as MDCK, HepG2, CHO, Vero, 293, etc.
  • mammalian cells include hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells or cell lines such as MDCK, HepG2, CHO, Vero, 293, etc.
  • bacteria or yeast cells mention may in particular be made of E. Coli, Saccharomyces and Kluyveromyces, for example. Such recombinant cells constitute particular objects of the invention.
  • a particular object of the invention relates to a nucleic probe characterized in that it allows the detection of an EHTA gene or of a corresponding RNA, typically by selective hybridization from a sample.
  • the probe comprises the sequence of an EHTA gene as defined above or a part of it.
  • a probe of the invention typically comprises from 10 to 1000 nucleotides, preferably from 20 to 800, more preferably from 50 to 600, and is generally single-stranded.
  • a particular example of a probe is represented by an oligonucleotide specific and complementary to a region of at least one EHTA gene or the corresponding RNA. The oligonucleotide is typically single-stranded, and generally has 10 to 100 bases.
  • nucleic acid probe of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 1 or the coding part thereof.
  • the nucleic acid probes according to the invention can be labeled, for example by means of radioactive, enzymatic, fluorescent, luminescent markers, etc.
  • the probes can be in free form or immobilized on a support (column, ball, slide, membrane, etc.).
  • a particular object of the invention relates to a product comprising at least one nucleic acid comprising all or a specific part of the sequence SEQ ID NO: 1, immobilized on a support.
  • the support can be solid, flat or not, regular or not, such as for example nylon, glass, plastic, metal, fiber, ceramic, silica, polymer, etc., or any other compatible material.
  • the nucleic acid is preferably immobilized at one end, under conditions leaving the molecule accessible for a hybridization reaction. Techniques for immobilizing materials (such as nucleic acids, polypeptides, antibodies, etc.) on supports have been described in the literature, and in particular in applications or patents no. EP619,321, WO91 / 08307, US4,925,785 and GB2,197,720.
  • a primer according to the invention is advantageously composed of 3 to 50 bases, preferably from 5 to 40 and even more preferably from 6 to 35 bases. It is typically single-stranded.
  • a particular primer is complementary to at least one region of the EHTA gene or of the corresponding RNA.
  • a preferred embodiment resides in a primer consisting of a single-stranded nucleic acid comprising from 6 to 50 nucleotides complementary to at least part of the sequence SEQ ID NO: 1 or to its complementary strand.
  • the invention also relates to a pair of primers comprising a sense sequence and a reverse sequence, characterized in that the primers of said pair hybridize with a region of an EHTA gene and allow the amplification of at least one portion. of it.
  • the primers can be complementary to part of the coding region of the EHTA gene, or to regulatory regions (promoter, terminator, etc.).
  • inhibitory nucleic acid any nucleic acid capable of inhibiting the transcription of the EHTA gene or the translation of the corresponding messenger.
  • the inhibitory nucleic acid may comprise all or part of the sequence of the EHTA gene, of a fragment thereof, of the messenger of EHTA, or of a sequence complementary to these.
  • the inhibitor can in particular comprise a region complementary to a part of the sequence SEQ ID NO: 1 and inhibit (or reduce) its translation into protein.
  • the inhibitor is preferably complementary to at least one portion of the coding region of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the complementarity of the nucleic acid is preferably perfect, even if certain mismatches can be tolerated.
  • the inhibitor can be DNA or RNA, and it can be an antisense, a ribozyme (WO 99/32618), an AR (WO01 / 29058; WO01 / 75164), etc., or a vector encoding them. It can be single-stranded or double-stranded. Its length can vary between a few bases and several hundred bases, for example up to the full length of the sequence SEQ ID NO: 1 or of the mRNA of EHTA. It can also be an RNA coded by an antisense gene. As it is an antisense or interfering oligonucleotide, it typically comprises less than 100 bases, for example of the order of 10 to 50 bases.
  • This oligonucleotide can be modified to improve its stability, its resistance to nucleases, its cell penetration, etc.
  • inhibitory nucleic acids represent particular objects of the invention, as well as pharmaceutical compositions comprising them, in association with any pharmaceutically acceptable vehicle or excipient.
  • Another subject of the invention relates to any antibody specific for an EHTA protein or polypeptide, that is to say capable of binding, preferably selectively, to such a polypeptide or protein.
  • the antibody can be polyclonal or monoclonal. It can also be fragments and derivatives of antibodies having substantially the same antigenic specificity, in particular antibody fragments (eg, Fab, Fab'2, CDRs), humanized, polyfunctional, single-stranded antibodies ( ScFv), etc.
  • Antibodies can be produced using conventional methods, including immunizing a non-human animal with an EHTA protein or a fragment thereof having an epitope, and recovering its serum (polyclonal) or spleen cells (so as to produce hybridomas by fusion with appropriate cell lines).
  • the antigen is combined with an adjuvant (eg, Freund's adjuvant) and administered to an animal, for example by subcutaneous injection. Repeated injections can be given. Blood samples are collected and immunoglobulin or serum are separated.
  • an adjuvant eg, Freund's adjuvant
  • monoclonal antibodies Conventional methods of producing monoclonal antibodies include immunizing a non-human animal with an antigen, followed by the recovery of spleen cells which are then fused with immortalized cells, such as myeloma cells.
  • the resulting hybridomas produce monoclonal antibodies and can be selected by limiting dilutions so as to isolate the individual clones.
  • the Fab or F (ab ') 2 fragments can be produced by digestion using a protease according to conventional techniques.
  • the invention also relates to a method for producing antibodies, comprising injecting an EHTA protein as defined above (or an immunogenic fragment thereof) into a non-human animal and recovering the antibodies or antibody producing cells.
  • the preferred antibodies are antibodies specific for the EHTA protein, that is to say having a higher affinity for the EHTA protein than for other antigens, even if a non-specific or less affine bond cannot be excluded.
  • the invention also relates to hybridomas producing the monoclonal antibodies described above and their use for producing said antibodies.
  • the antibodies of the invention can be coupled to heterologous fragments such as toxins, markers, drugs or any other therapeutic agent, covalently or not, either directly or through coupling agents.
  • the markers can be chosen from radio-markers, enzymes, fluorescent agents, magnetic particles, etc.
  • the toxins can be chosen from diphtheria, botulinum toxin, ricin, etc.
  • the antibodies of the invention can also be immobilized on a support, such as a ball, column, gel, chip, etc.
  • a particular object of the invention relates to a product comprising at least one antibody specific for an EHTA protein immobilized on a support.
  • the support can be solid, flat or not, regular or not, such as for example nylon, glass, plastic, metal, fiber, ceramic, silica, polymer, etc., or any other compatible material.
  • the antibody is preferably immobilized by one end, under conditions leaving the molecule accessible for an immunological reaction.
  • the present application describes new methods for detecting a pathology or a predisposition to a pathology in a subject, or for monitoring the evolution or the stage of advancement of a pathology, comprising determining the presence, the quantity (relative or absolute) or the distribution, in a sample of said subject, of the EHTA protein, of its expression, of altered forms thereof or of the corresponding gene or messenger RNA.
  • the determination can be carried out by various techniques, such as sequencing, hybridization and / or selective amplification.
  • Methods that can be used to determine the presence of proteins (or protein domains) are based, for example, on immunoenzymatic reactions, such as ELISA, RIA, ELA, etc.
  • Techniques that can be used to determine the presence or expression of genes or RNA are, for example, PCR, RT-PCR, ligation chain reaction (LCR), the technique of PCE or TMA (“Transcriptional Mediated Amplification”) ), gel migration, electrophoresis, in particular DGGE (“denaturing gel gradient electrophoresis”), etc.
  • the latter preferably uses a primer or a pair of primers as defined above.
  • a particular object of the invention relates to the use of nucleic acids complementary and specific to the EHTA gene for the detection of cancers, the characterization of cancers or for monitoring the progression of cancers, in particular the formation of metastases.
  • This detection can be carried out using DNA chips or by carrying out a PCR using biopsy or biological fluids such as blood (notably serum), urine, seminal fluid, etc.
  • the invention also resides in the development and use of immunoassays containing one or more antibodies as described above or fragments thereof. These tests make it possible to detect and / or measure the presence and / or the amount of EHTA protein in a biological sample, this amount being correlated with a pathological process.
  • a particular method comprises bringing a sample from a subject into contact with a nucleic probe as defined above, and demonstrating hybridization.
  • Another particular method comprises bringing a sample from a subject into contact with a primer or a pair of primers as defined above, and demonstrating an amplification product.
  • Another particular method comprises bringing a sample from a subject into contact with an antibody as defined above, and demonstrating an antigen-antibody complex.
  • the EHTA protein is involved in the mechanisms of cell adhesion, para-cellular permeability, interaction between cells and angiogenesis.
  • the overexpression of this protein induces a loosening of the intercellular bonds and is observed in pathological tissues, in particular cancerous tissues.
  • the detection or determination of this protein (or of altered forms) in a sample of a subject therefore constitutes an indicator of the presence of such pathological events and of the severity of these pathologies.
  • kits which can be used for implementing a method as defined above comprising i. a pair of primers or a probe or an antibody as defined above, and ii. the reagents necessary for amplification or for a hybridization or immunological reaction.
  • the EHTA protein according to the invention represents a particularly advantageous therapeutic target for the treatment of cancers, angiogenesis, tissue diseases or for the regulation of cell adhesion or para-cellular permeability.
  • the invention therefore allows the development of methods of selection, screening, characterization, optimization or production of active compounds, based on a determination of the ability of test compounds to interact with EHTA, to modulate its expression or to modulate its activity.
  • a particular object of the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising bringing into contact in vitro or ex vivo a test compound with an EHTA protein as defined above, and the selection or identification of the compounds binding to said protein.
  • the EHTA protein (or any fragment thereof) can be used in soluble form or immobilized on a support (column, bead, plate, etc.).
  • the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising contacting in vitro or ex vivo a test compound with a cell expressing an EHTA protein as defined above, and the selection or identification of compounds modulating the expression or the activity of said protein.
  • the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising contacting in vitro or ex vivo a test compound with an EHTA gene or a corresponding RNA, and the selection or identification of compounds which bind to said gene or RNA. In this process, it is possible to use portions of the gene or RNA.
  • the invention resides in a method of selection, identification, characterization, optimization or production of active compounds, comprising contacting in vitro or ex vivo a test compound with a nucleic acid comprising the sequence of the promoter of the EHTA gene, and the selection or identification of compounds which bind to said promoter.
  • a genetic construction is used comprising a reporter gene placed under the control of the promoter, and the effect of the compound is determined by measuring the expression of the reporter gene (or of variation in the level of expression, by relative to a control situation).
  • the binding to the EHTA protein, to the gene or to the corresponding RNA can be measured by various techniques, such as the displacement of a labeled ligand, migration on gel, electrophoresis, etc.
  • the modulation of expression can be determined by assaying the RNAs or proteins, or by means of a reporter system.
  • the cells used can be any compatible cell, in particular eukaryotic or prokaryotic cells.
  • These cells can be mammalian cells, bacteria, yeast, plant, insect cells, etc. They can be primary cultures or established lines. Examples of mammalian cells include hepatocytes, fibroblasts, endothelial cells or cell lines such as MDCK, HepG2, CHO, Vero, 293, etc. Among the bacteria or yeast cells, mention may in particular be made of E. Coli, Saccharomyces and Kluyveromyces, for example.
  • the selection process can be carried out in any suitable support, such as for example a plate, a tube, a flange, etc., typically in a multi-container support, such as multi-well plates.
  • the method can be implemented to select or identify an activator or an inhibitor of the expression or activity of the EHTA protein.
  • EHTA inhibitors are selected.
  • a particular object of the invention relates to methods of selection, identification, or characterization of anti-cancer compounds, comprising bringing one or more test compounds into contact with an EHTA protein, a gene EHTA or a cell expressing an EHTA protein, and the selection of compounds inhibiting the expression or activity of EHTA or binding thereto.
  • the present application describes the identification of a new protein involved in the production of inter-cellular junctions.
  • This protein when overexpressed, induces loosening of inter-cellular junctions, and can therefore regulate para-cellular permeability.
  • this protein is overexpressed in tumor cells, which confirms its role in the relaxation of the epithelium and its involvement in the formation of metastases.
  • This protein therefore represents a particularly interesting target for therapeutic interventions aimed at regulating cell adhesion or permeability, in particular in pathologies linked to angiogenesis, epithelial permeability or to uncontrolled or pathological cell proliferation.
  • a particularly beneficial therapeutic application lies in the treatment of pathologies linked to uncontrolled or pathological cell proliferation, in particular cancers.
  • a particular object of the invention therefore lies in the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended for the treatment of cancers.
  • Another object of the invention lies in the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to inhibit the formation of metastases in patients suffering from cancers.
  • angiogenesis is not only essential for the growth of a tumor but is also involved in the progression from the benign stage to the stage of invasive cancer, and in the progression of dormant metastases to metastatic lesions.
  • the possibility of negatively regulating angiogenesis and strengthening cell adhesion makes it possible to reduce the metastatic progression of cancers.
  • the invention can be used in particular for inhibiting the growth of blood vessels in tumors or in the vicinity of tumors.
  • the invention can be used for the treatment of various types of cancer, in particular solid tumors, such as for example breast, lung, prostate, colon, uterus, head and neck, brain (eg, glioblastoma), skin, liver, bladder, etc. It is particularly suitable for the treatment of prostate, breast and colon cancer.
  • solid tumors such as for example breast, lung, prostate, colon, uterus, head and neck, brain (eg, glioblastoma), skin, liver, bladder, etc. It is particularly suitable for the treatment of prostate, breast and colon cancer.
  • Another subject of the invention relates to the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to inhibit angiogenesis.
  • Angiogenesis the development of new blood vessels from preexisting vascularity, takes place mainly during embryonic development. This process is also highly regulated in the adult stage during the healing, ovulation and menstruation processes. Many pathologies have been described as having a component or a stage linked to the phenomenon of angiogenesis. Mention may be made, among others, of numerous cancers, retinopathies linked to diabetes, atherosclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, as well as pathologies linked to delayed scarring. The invention therefore makes it possible to control the appearance, progression or development of these pathologies in patients.
  • a particular object of the invention therefore lies in the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended for the treatment of retinopathies linked to diabetes, atherosclerosis, osteoarthritis, polyarthritis rheumatoid, psoriasis, as well as pathologies linked to delayed healing.
  • Another object of the invention lies in the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to promote wound healing.
  • Another subject of the invention relates to the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to regulate cell adhesion.
  • the regulation of cell adhesion is important in organ or tissue transplants and in the control of tissue pathologies and the loss of organ function, in particular linked to tissue ischemia, edemas, etc.
  • Another subject of the invention relates to the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to regulate vascular or para-cellular permeability.
  • Another subject of the invention relates to the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to preserve or restore tissue integrity.
  • Another subject of the invention relates to the use of an inhibitor of the EHTA protein for the preparation of a medicament intended to reduce inflammation.
  • Angiogenesis and inflammation are two closely related processes and many inflammatory pathologies have an angiogenic component. A control of angiogenesis can therefore result in a benefit in certain inflammatory pathologies.
  • Another subject of the invention relates to methods of treating the pathologies mentioned above, comprising the administration to a patient of an effective amount of an inhibitor of the EHTA protein.
  • treatment designates preventive, curative, palliative treatment, as well as the management of patients (reduction of suffering, improvement of lifespan, slowing down the progression of the disease ), etc.
  • the treatment can also be carried out in combination with other agents or treatments (chemotherapy, radiotherapy, gene therapy, etc.).
  • the treatments and medicaments of the invention are very particularly intended for humans.
  • a particular object of the invention lies in the combined use of an inhibitor of the EHTA protein and of a chemotherapy or radiotherapy agent, for the treatment of cancer, in particular for inhibiting the formation of metastases, very particularly in patients with prostate, colon or breast cancer.
  • the chemotherapy agent can be chosen from all known anti-tumor compounds and treatment, including in particular cytokines, interferons, tumor suppressor genes or proteins and chemical agents such as: methotrexate, vinblastine, adriamycin, cyclophosphamide, Cis-platinum , etc.
  • the term “inhibitor” of the EHTA protein designates any compound, treatment or composition capable of inhibiting the expression of the EHTA protein or its activity. It may especially be a compound, treatment or composition inhibiting the transcription of the gene, the maturation of the RNAs, the translation of the mRNA, the post-fraductional modification of the protein, its translocation to the membrane, etc. It can also be a compound, treatment or composition inhibiting the activity of the EHTA protein, for example by inhibiting its interaction with other cellular constituents, in particular with other constituents of tight junctions.
  • the inhibitor is preferably selective, that is to say without direct and specific effect on other proteins or genes.
  • inhibitor includes any reduction in the expression or activity of the EHTA protein, even if it is not total.
  • inhibitors are preferred which are capable of reducing in vitro by at least 20% the expression or activity of the EHTA protein, more preferably by at least 30%.
  • particularly preferred inhibitors are selective inhibitors, that is to say which act mainly on the EHTA protein and, to a lesser extent or essentially indirectly, on other targets or mechanisms. Selectivity can be determined by testing the effect of inhibitors on other cellular proteins, especially on other proteins involved in the formation of tight junctions.
  • the compound is an inhibitory nucleic acid (e.g., antisense, ribozyme, RNAi, etc.) capable of inhibiting the transcription of the EHTA gene or the translation of the corresponding messenger. It is very particularly an antisense oligonucleotide or an RNAi, or a gene encoding these.
  • inhibitory nucleic acid e.g., antisense, ribozyme, RNAi, etc.
  • the compound is a peptide comprising a region of the EHTA protein and capable of antagonizing its activity.
  • the peptide advantageously comprises at least 5 consecutive residues of the EHTA protein, more generally between 10 and 100.
  • the peptide typically comprises the PDZ domain binding site of the EHTA protein, located at residues 217 to 226.
  • the inhibitor is an antibody specific for the EHTA protein, or a fragment or derivative of such an antibody, as defined above.
  • Such antibodies, fragments and derivatives constitute particular subjects of the present application.
  • the antibody can also be coupled to a heterologous fragment, such as a toxin, a drug or any other therapeutic agent, covalently or not, either directly or through coupling agents.
  • the inhibitor compound is a cytotoxic ligand specific for EHTA.
  • cytotoxic ligands are particularly suitable for the treatment of cancers.
  • Specific cytotoxic ligands are typically molecules comprising a region conferring cytotoxicity and a region conferring specificity towards EHTA.
  • the region conferring cytotoxicity may be any molecule toxic to a cell, either by itself, or conditionally or indirectly (i.e. by making the cell sensitive to a chemical agent or to the patient's immune system, for example).
  • the region conferring specificity with respect to EHTA is typically an antibody or antibody fragment as defined above. he may however also be specific ligands for EHTA, in particular part of a receptor or cellular partner of EHTA.
  • the inhibitor compound is a chemical compound, of natural or synthetic origin, in particular an organic or inorganic molecule, of vegetable, bacterial, viral, animal, eukaryotic, synthetic or semi-synthetic origin, capable of modulate the expression or activity of the EHTA protein.
  • an inhibitor is preferably obtained or derived from a selection method as defined above.
  • the inhibitor can be used at different doses and according to different protocols. In addition, it can be used alone or, preferably, combined with other active agents. Administration can be carried out by any method known to a person skilled in the art, preferably by injection, typically by intraperitoneal, intra-tumotal, infra-dermal, infra-cerebral, infra-venous, intra-arterial or intra route. -muscular.
  • the doses administered can be adjusted by those skilled in the art. Typically, from 0.01 mg to 100 mg / kg approximately are injected, for inhibiting compounds of a chemical nature. For nucleic compounds, the doses can vary for example between 0.01 mg and 100 mg per dose.
  • the doses can vary for example between 0.01 mg and 100 mg per dose. It is understood that repeated injections can be carried out, possibly in combination with other active agents or any pharmaceutically acceptable vehicle (eg, buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.).
  • active agents e.g, buffers, saline, isotonic solutions, in the presence of stabilizing agents, etc.
  • the invention can be used in mammals, in particular in humans.
  • the results presented in this application illustrate the involvement of the protein EHTA in the mechanisms of para-cellular permeability and its deregulation in pathological tissues, and demonstrate the interest of therapeutic approaches based on the regulation of this protein.
  • the entire molecular biology part (cloning, plasmid constructs, transfection, establishment of stable clones, immunofluorescence, etc.) was carried out using conventional protocols known to those skilled in the art.
  • the paracellular permeability measurement test was carried out as follows. At D0, approximately 10 5 MDCK cells transfected stably were seeded at confluence in Becton Dickinson Transwell 8 ⁇ m semi-permeable inserts defining a basal part and an apical part (Boyden chamber). On D + 5, dextran-FITC 3 kDa was deposited at a concentration of 0.5 mg / ml in the apical part. A sample is taken from the basal part over time and the fluorescence intensity is measured with a fluorimeter. The different kinetics were plotted and a coefficient of permeability was calculated. The different results are supported by the ANONA and Wilcoxon 5% statistical tests.
  • the protein and nucleic acid sequences are provided in the annexed sequence list.
  • Figure 1 Northern blot analysis of the tissue distribution of the messenger RNA of the EHTA protein. This messenger is mainly expressed in the lung, kidney and heart.
  • FIG. 2 Analysis by fluorescence microscopy of the cellular localization of the EHTA protein.
  • the open EHTA reading phase was cloned in phase with the EGFP protein.
  • HMEC-1 cells were transfected with this plasmid construct and stable clones were selected. This image shows a concentration of the fluorescent signal at the junction between several cells, this type of image is also observed after stable transfection with other members of the claudin family.
  • Figure 3 Left part: analysis by fluorescence microscopy of the cellular localization of the EHTA protein.
  • the open EHTA reading phase was cloned in phase with the EGFP protein.
  • MDCK cells were transfected with this plasmid construct and stable clones were selected. This image shows a concentration of the fluorescent signal at the junction between several cells, this type of image is also observed after stable transfection with claudin 1 (right part of the figure).
  • Figure 4 Measurement of the passage of a FITC-labeled dextran molecule through a monolayer of MDCK cells transfected stably either with the EHTA protein fused with EGFP (EHTA-EGFP), or with EGFP alone (EGFP) ). A higher permeability is observed for the clone transfected with the EHTA-EGFP fusion protein. A coefficient of permeability was calculated by normalizing the results by the area occupied by the monolayer of cells (right part of the figure).
  • FIG. 5 Analysis of the expression of EHTA messenger RNA by real-time quantitative PCR (QPCR).
  • Biopsies of the tumor part (tumor) on the one hand and of peritumoral tissue (normal) on the other hand were isolated in the same patient suffering from prostate cancer.
  • the RNAs extracted from these biopsies were retrotranscribed and used in QPCR experiments.
  • the results were normalized by the expression of beta-tubulin. A 3.5, 8.2 and 1.9 times stronger expression is observed in the tumor part compared to the normal part in patients A, B and C, respectively.

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Abstract

La présente demande concerne le domaine de la biologie et de la santé. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle protéine impliquée dans les mécanismes de perméabilité vasculaire, d'adhésion cellulaire et d'angiogénèse, ainsi que l'utilisation de cette protéine comme cible thérapeutique, diagnostique ou de criblage, Elle porte également sur des outils utilisables pour la mise en oeuvre de méthodes thérapeutiques, diagnostiques ou de criblage, comme notamment des sondes, anticorps, vecteurs, cellules recombinantes, etc. L'invention est particulièrement utile pour la préparation de composés pharmaceutiques dans le domaine des cancers, de l'angiogenèse, des maladies inflammatoires ou des altérations tissulaires.

Description

NOUVELLE CIBLE DE L'ANGIOGENESE ET UTILISATIONS
La présente demande concerne le domaine de la biologie et de la santé. Elle concerne plus particulièrement l'identification et la caractérisation fonctionnelle d'une nouvelle protéine impliquée dans les mécanismes de perméabilité vasculaire, d'adhésion cellulaire et d'angiogénèse, ainsi que l'utilisation de cette protéine comme cible thérapeutique, diagnostique ou de criblage. Elle porte également sur des outils utilisables pour la mise en œuvre de méthodes thérapeutiques, diagnostiques ou de criblage, comme notamment des sondes, anticorps, vecteurs, cellules recombinantes, etc. L'invention est particulièrement utile pour la préparation de composés pharmaceutiques dans le domaine des cancers, de Pangiogenèse, des maladies inflammatoires ou des altérations tissulaires.
L'adhésion cellulaire est un processus complexe particulièrement important pour maintenir l'intégrité tissulaire et la compartimentalisation au sein de l'organisme. L'adhésion d'un type cellulaire à un autre au sein d'un tissu donné entraîne la formation de jonctions intercellulaires, connues sous le nom de jonction serrées (« tight junctions »), jonctions adhérentes, jonctions gap et desmosomes. La formation de ces jonctions assure la cohésion des épithéliums et des endothéliums et est responsable de l'existence de barrières imperméables qui empêchent la libre diffusion de cellules et d'autres substances biologiques d'un compartiment tissulaire vers un autre. Par exemple, un composé présent dans le sang doit tout d'abord traverser la barrière constituée par les cellules endothéliales composant le vaisseau sanguin. Cette barrière rend difficile le ciblage de médicaments vers un tissu donné. Les cellules endothéliales rendent les capillaires sanguins très imperméables aux médicaments et la barrière hémato- encéphalique complique particulièrement l'administration de molécules au système nerveux central. De plus, de nombreuses tumeurs solides développent des barrières internes qui limitent la délivrance de composés anti-tumoraux ou d'anticorps aux cellules ciblées.
De nombreuses pathologies présentent des anomalies de l'adhésion cellulaire. L'adhésion cellulaire est également impliquée dans les phénomènes de rejets de greffes, et il est aussi bien établi que l'ischémie tissulaire perturbe le transport normal d'eau et de solutés à travers la microvasculature, et que ceci résulte en différentes formes d'oedèmes tissulaires. Dans ces circonstances, la perte soudaine de la fonction de barrière de l'endothélium constitue une cause majeure de pathologie tissulaire et de perte de la fonction d'un organe donné.
Lors de pathologies à composantes prolifératives, les cellules qui se multiplient voient également une réorganisation de leurs jonctions entre elles. Ainsi, au cours du développement de vascularites et lors de la néovascularisation tumorale, une prolifération des cellules endothéliales s'accompagne d'un relâchement de l'endothélium vasculaire. Ce relâchement est lié à une modification de la nature des interactions entre cellules endothéliales. De façon analogue, lors de la prolifération tumorale, les cellules épithéliales transformées ne constituent plus d'épithéliums réguliers mais ne sont plus affectées par le phénomène d'inhibition de contact. Les cellules tumorales capables de former des métastases peuvent se détacher de leurs voisines et donc relâcher leurs interactions avec celles-ci.
Une modification des liaisons intercellulaires survient également lors de l'angiogénèse, et de nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'angiogenèse. On peut citer entre autres de très nombreux cancers, les rétinopathies liées au diabète, l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée.
La présente invention décrit à présent l'identification d'une nouvelle protéine impliquée dans les phénomènes d'angiogenèse, d'adhésion cellulaire et de réponse à l'hypoxie. Une approche originale a permis d'identifier un ADNc correspondant à une nouvelle protéine qui présente une homologie de structure et fonctionnelle avec la famille des claudins. Cette nouvelle protéine fournit de nouvelles bases pour des approches thérapeutiques et diagnostiques des pathologies associées aux phénomènes d'angiogenèse et, plus généralement, à des processus prolifératifs.
Plus particulièrement, une analyse qualitative différentielle a été effectuée à partir d'ARN extraits de cellules HMEC-1 («Human dermal Microvascular Endothelial Cell ») en culture, exposées ou non à Phypoxie (par traitement avec la desferoxiamine (DFO) pendant 16 heures). Cette analyse a été effectuée par criblage différentiel qualitatif selon la technique DATAS décrite dans le brevet n° WO99/46403. Cette analyse a permis la construction, par le demandeur, d'un répertoire des altérations d'épissage dans les cellules HMEC-1 exposées à l'hypoxie. Ce répertoire qui contient plus de 1100 séquences distinctes, implique des acteurs clefs du phénomène de réponse à l'hypoxie tels que les enzymes de la glycolyse (phosphofructokinase, pyruvate kinase ou lactate deshydrogénase) ou le transporteur de glucose GLUT-1. Des séquences dérivées d'ARNs codant pour des protéines impliquées dans la réponse au stress, et notamment ORP150, qui est directement impliqué dans la réponse au stress hypoxique et dans la stabilisation du facteur NEGF, font également partie de ce répertoire, soulignant l'implication de cette réponse dans la réponse à l'hypoxie.
La réalisation de DATAS sur des ARΝ de cellules HMEC-1 traitées ou non par le DFO a permis d'isoler un fragment d'ADΝc dérivé de l'ARΝm d'un gène hypothétique. Ce gène, répertorié dans GenBank sous la référence ΝM 024600, est purement hypothétique. Ainsi, aucune démonstration de l'expression physiologique de cette séquence n'a été rapportée antérieurement. De même, la séquence putative codée (numéro FLJ20898) a été déduite de la séquence de l'ADNc, mais une telle protéine n'a jamais été identifiée dans des échantillons biologiques, ni isolée ou caractérisée. A cet égard, la demande WO02/24888 présente des centaines de séquences de gènes surexprimées dans certains tissus pathologiques, mais ne permet nullement de caractériser la fonction de ces séquences dans les pathologies concernées. De même, la demande WO02/070539 décrit près de mille séquences de gènes différentes, mais sans aucune caractérisation fonctionnelle. La demande WO01/29221 mentionne également plusieurs centaines de séquences de gènes, sans toutefois fournir la moindre caractérisation fonctionnelle. A cet égard, la seule séquence présentant une région d'homologie avec la protéine de l'invention est la séquence n° 378 de cette demande, pour laquelle aucune expression n'a été détectée dans aucun tissu (tableau 9 de la demande WO01/29221). Les demandes WO02/144499 et WO02/098898 décrivent les séquences de protéines FLJ ou claudins, mais sans relation structurale significative avec la protéine selon la présente invention. Dans ces conditions, aucune fonction biologique et aucune application industrielle spécifique n'ont été jusqu'à présent attribuées à cette séquence putative, et l'existence même de la protéine dans des échantillons biologique n'a pas été documentée dans l'art antérieur.
La présente demande décrit pour la première fois l'identification d' ARNm et de la d'une protéine ayant une séquence correspondant à FLJ20898, dans des conditions physio- pathologiques. Cette protéine a été désignée EHTA, en raison de son Expression après Traitement en Hypoxie (« Expressed upon Hypoxia Treatment »). La présente demande démontre que cette séquence est exprimée et possède des propriétés biologiques importantes dans la régulation de l'adhésion cellulaire et de la perméabilité para- cellulaires. La présente demande fournit ainsi une nouvelle protéine caractérisée fonctionnellement et expose, pour la première fois, ses applications industrielles spécifiques.
La séquence en acides aminés de cette nouvelle protéine, désignée EHTA, est représentée ci-après (SEQ ID NO :2). La séquence codante est représentée dans la séquence SEQ ID NO :1.
Protéine EHTA (SEQ ID NO :2)
M VQRLVAAAVLVALVSLILNNVAAFTSNWVCQTLEDGRRRSVGLWRSCWLVDRT RGGPSPGARAGQVDAHDCEALGWGSEAAGFQESRGTVKLQFDMMRACNLVATAAL TAGQLTFLLGLVGLPLLSPDAPCWEEAMAAAFQLASFVLVIGLVTFYRIGPYTNL S SCYLNIGACLLATLAAAMLI NILHKREDCMAPRVIVISRSLTARFRRGLDND YVESPC
Une analyse bio-informatique réalisée à l'aide d'outils connus de l'homme de l'art n'a pas révélé d'homologie significative entre la protéine EHTA de l'invention et d'autres protéines connues. Elle a toutefois permis de mettre en évidence une faible homologie entre la protéine EHTA et certains domaines des protéines de la famille des claudins. Une seconde analyse bio-informatique, réalisée grâce au serveur Pfam, a permis d'émettre l'hypothèse selon laquelle la protéine EHTA faisait partie de la famille des claudins. Ces protéines sont impliquées dans la formation de jonction intercellulaire de type serrée (« tight junction »). Le logiciel utilisé compare la séquence proteique à étudier avec une séquence consensus représentative d'un domaine proteique donné. Cette séquence consensus est générée à partir d'un alignement d'un grand nombre de séquences protéiques du domaine considéré.
L'analyse de séquences a permis de mettre en évidence la présence d'un site de liaison au domaine de type PDZ, très conservé dans les claudins, ainsi qu'une topologie identique à celle des claudins. Ces particularités structurales ont renforcé l'hypothèse selon laquelle cette nouvelle protéine était un nouveau membre de la famille des claudins, même s'il n'existe pas d'homologie importante dans la structure primaire de ces différentes protéines.
La distribution tissulaire de ce nouveau gène a ensuite été analysée par la technique du Northern blot, et a permis de mettre en évidence une expression marquée dans le cœur, les poumons et le rein (Figure 1). Ce profil d'expression est celui qui est classiquement observé pour des gènes fortement exprimés dans l'endothélium.
Par ailleurs, en utilisant les techniques des puces à ADN et de la PCR quantitative en temps réel, une forte sur-expression de l'ARNm de la protéine EHTA a été mise en évidence dans différentes lignées cellulaires exposées à un traitement hypoxique, confirmant l'implication de cette protéine dans la perméabilité vasculaire.
Afin de poursuivre l'analyse biologique fonctionnelle, un ADNc correspondant à la phase ouverte de lecture de la protéine EHTA a été isolé par RT-PCR. La séquence du fragment amplifié est fournie dans la séquence SEQ ID NO :1. Cette séquence a ensuite été clonée en phase avec la séquence de la protéine EGFP, et des expériences de transfection puis d'imagerie en fluorescence ont permis d'établir que la protéine EHTA était adressée à la membrane plasmique des cellules transfectées. Plusieurs clones stables de cellules MDCK transfectées avec la protéine de fusion EHTA-EGFP ont ensuite été isolés. Les résultats obtenus montrent que le signal de fluorescence dû à l'expression de la protéine de fusion est fortement concentré à la jonction entre plusieurs cellules (Figure 2). Ceci constitue une forte indication que la protéine EHTA est bien un membre de la famille des claudins. En effet, le type d'image obtenu dans cette expérience est très similaire à celui observé avec d'autres claudins (Claudin-1, Claudin-2 et Claudin-4) (Figure 3).
Un clone MDCK transfecté de manière stable avec la protéine de fusion EHTA-EGFP a ensuite été utilisé dans un test de mesure de la perméabilité paracellulaire. Dans ce type de test, une monocouche des cellules étudiées est constituée afin de séparer deux compartiments de milieu de culture. L'un de ces compartiments contient un traceur fluorescent, du dextran couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate »). Une mesure du passage de ce traceur d'un compartiment à l'autre permet de mesurer la perméabilité de la monocouche cellulaire et donc des jonctions entre les cellules qui la constituent.
Les résultats obtenus montrent que le coefficient de perméabilité mesuré à partir du clone protéine de fusion EHTA-EGFP est trois fois plus élevé que celui mesuré avec un clone transfecté avec la protéine EGFP seulement (Figure 4). Ce résultat indique que la sur-expression de la protéine EHTA induit un relâchement des liaisons entre cellules, ce qui est compatible avec une interférence de la protéine EHTA avec les « tight junctions » entre cellules.
Un tel relâchement des liaisons intercellulaires survient entre les cellules endothéliales lors de la formation des vaisseaux sanguins et entre les cellules épithéliales lors de la prolifération tumorale. L'expression de l'ARNm de EHTA a donc été étudiée dans des échantillons de tumeurs. Des expériences de QPCR ont permis de mettre en évidence, de manière inattendue, une sur-expression de l'ARNm codant pour EHTA dans des échantillons de tumeurs de la prostate par rapport au tissu sain (Figure 5). Cette surexpression souligne une fois encore la corrélation entre la présence de la protéine EHTA et l'intégrité tissulaire, l'adhésion cellulaire et l'angiogénèse. Ceci est également conforté par les conditions d'hypoxie dans lesquelles la protéine EHTA a été mise en évidence, l'hypoxie étant caractérisée notamment par une augmentation significative de la perméabilité vasculaire in vivo.
Ces résultats démontrent donc l'identification et l'isolement d'une nouvelle protéine 1) exprimée dans l'endothélium, 2) sur-exprimée en conditions hypoxiques in vitro (cellules en culture) et in vivo (cancer de la prostate) et 3) dont l'expression augmente la perméabilité vasculaire dans un modèle de mesure de flux paracellulaire. Cette protéine constitue donc une nouvelle cible particulièrement attrayante pour la mise au point de procédés de diagnostics et/ou thérapeutiques utiles dans les domaines du cancer, des pathologies à composantes angiogéniques ou impliquant une perturbation de l'intégrité ou de l'adhésion tissulaire.
La présente demande concerne donc l'utilisation de cette protéine comme cible pour le développement de nouvelles molécules ou de méthodes de diagnostic. Elle concerne également des composés régulateurs de la protéine EHTA et leur utilisation thérapeutique. Elle concerne également des méthodes et compositions pour le criblage de composés actifs. Elle est particulièrement adaptée au diagnostic, suivi ou traitement de cancers.
Un premier objet de l'invention concerne une protéine EHTA sous forme isolée ou purifiée, ainsi que des variants et fragments de celle-ci.
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant une protéine EHTA sous forme isolée ou purifiée, ou des variants ou f agments de celle-ci.
Un autre objet de l'invention concerne un vecteur comprenant un acide nucléique codant la protéine EHTA, ainsi que toute cellule recombinante exprimant une protéine EHTA. Une telle cellule recombinante comprend typiquement un vecteur tel que défini ci-avant ou un acide nucléique codant une protéine EHTA, et exprime une protéine EHTA. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers, notamment pour inhiber la formation de métastases chez les patients atteints de cancers.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse, à réguler la perméabilité vasculaire ou para-cellulaire ou à préserver ou restaurer l'intégrité tissulaire.
Un autre objet de l'invention concerne un composé antagoniste ou inhibiteur de la protéine EHTA, notamment un anticorps, un antisens, un ligand cytotoxique.
L'invention concerne également un procédé de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine EHTA, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN messager correspondant.
Elle concerne encore des procédés de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à interagir avec la protéine ou le gène EHTA, à moduler son expression ou à moduler son activité.
PRODUITS ET DEFINITIONS
Protéine EHTA
Dans le contexte de l'invention, le terme protéine EHTA désigne tout polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, un variant de la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celles-ci. Le terme « variant » désigne en particulier tous les variants naturels de la séquence SEQ ID NO : 2, résultant par exemple de polymorphisme(s), épissage(s), mutations(s), etc. De tels variants naturels peuvent donc comprendre une ou plusieurs mutations ou substitutions, une délétion d'un ou plusieurs résidus, etc. par rapport à la séquence SEQ ID NO : 2. Le terme variant désigne également les polypeptides EHTA ayant pour origine une autre espèce, par exemple de rongeurs, bovins, etc. Avantageusement, le terme protéine EHTA désigne un polypeptide d'origine humaine.
Le terme « variant » inclut également tout variant synthétique d'une protéine EHTA, et notamment tout polypeptide comprenant une ou plusieurs mutations, délétions, substitutions et/ou additions d'un ou plusieurs acides aminés par rapport à la séquence SEQ ID NO 2. De préférence, il s'agit de polypeptides reconnus par un anticorps polyclonal produit à partir de la protéine EHTA de séquence SEQ ID NO 2.
Des variants préférés comportent avantageusement au moins 75% d'identité avec la séquence primaire SEQ ID NO : 2, préférentiellement au moins 80%, plus préférentiellement au moins 85%. Encore plus préférentiellement, les variants préférés comportent au moins 90% d'identité avec la séquence primaire SEQ ID NO : 2, de préférence au moins 95%, 96%, 97% ou 98%. Le degré d'identité peut être déterminé par différentes méthodes et au moyen de logiciels connus de l'homme du métier, comme par exemple selon la méthode CLUSTAL.
Des variants particuliers possèdent une mutation ou une substitution affectant 5 acides aminés au plus de la séquence SEQ ID NO 2.
Typiquement, les variants selon l'invention sont des polypeptides conservant au moins une propriété immunologique, biologique ou pharmacologique de la protéine EHTA de séquence SEQ ID NO :2. Les propriétés biologiques sont notamment la modulation de l'adhésion cellulaire, de la perméabilité para-cellulaire ou de la contraction de jonctions inter-cellulaires. Les propriétés immunologiques sont par exemple la capacité de produire des anticorps reconnaissant la protéine de SEQ ID NO : 2. Comme indiqué, le terme protéine EHTA inclut également des polypeptides comprenant des fragments de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un variant de celle-ci. Il s'agit plus particulièrement des polypeptides comprenant une partie de la séquence SEQ ID NO :2.
Les polypeptides fragments de l'invention contiennent de préférence moins de 200 acides aminés, plus préférentiellement moins de 180 acides aminés, encore plus préférentiellement moins de 150 acides aminés, par exemple moins de 120 acides aminés. Ils comportent avantageusement au moins 5 résidus consécutifs de la séquence de la protéine EHTA. Avantageusement, les polypeptides fragments contiennent au moins une région ou un domaine fonctionnel de la protéine EHTA de séquence SEQ ID NO :2, comme par exemple un domaine d'adressage membranaire, un domaine trans- membranaire, un site de liaison au domaine de type PDZ, un épitope, une structure secondaire (boucle, feuillet, etc.), un site consensus, etc.
L'analyse de la protéine EHTA montre qu'elle comporte des domaines fonctionnels localisés aux positions suivantes :
- domaines trans-membranaires : résidus 14-31, 101-123, 139-162 et 169-190 ;
- site putatif de phosphorylation par PKC : résidus 210-212 ;
- site putatif de phosphorylation sur tyrosine : résidus 214-221 ; - site d'interaction avec les protéines à domaines PDZ : résidus 217-226.
Des polypeptides préférés de l'invention comprennent moins de 200 acides aminés de la séquence SEQ ID NO 2, plus préférentiellement moins de 150, encore plus préférentiellement moins de 100, et comportent au moins les résidus 14-31, 101-123, 139-162, 169-190, 210-212, 214-221 ou 217-226 de la séquence SEQ ID NO 2.
D'autres polypeptides préférés de l'invention comprennent moins de 200 acides aminés de la séquence SEQ ID NO 2 et comportent au moins un domaine antigénique spécifique de la séquence SEQ ID NO 2.
Un autre polypeptide particulier est caractérisé en ce qu'il comprend un fragment de la séquence SEQ ID NO :2 et en ce qu'il comporte au moins un domaine immunogène de la protéine EHTA humaine. La présente demande propose en effet la production de polypeptides fragments de EHTA comportant de préférence une portion immunogène de EHTA, qui sont utilisables pour la production d'anticorps, de tests de dosages, etc. Ces polypeptides peuvent être élaborés en utilisant des algorithmes permettant d'évaluer l'hydrophilicité ou l'antigénicité d'un polypeptide. Au sens de l'invention, le terme "fragment » ou « portion » immunogène désigne toute portion du polypeptide comprenant un épitope, de préférence un épitope T ou B. Un tel fragment comprend donc avantageusement au moins 7 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO :2 , plus préférentiellement au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO :2, encore plus préférentiellement au moins 15 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO :2.
Des fragments particuliers au sens de l'invention conservent une ou plusieurs propriétés de EHTA telles que mentionnées ci-avant. De tels variants ou fragments biologiquement actifs sont utilisables pour mimer l'action de EHTA ou pour produire des anticorps correspondants.
D'autres fragments particuliers au sens de l'invention sont des polypeptides capables d'antagoniser l'activité de EHTA. De tels fragments sont utilisables pour inhiber l'action de EHTA.
Les polypeptides ou protéines EHTA de l'invention peuvent comprendre des résidus hétérologues ajoutés à la séquence d'acides aminés indiquée. Ainsi, un objet de l'invention réside dans un polypeptide comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :2, ou d'un variant de celle-ci, et une partie hétérologue.
La partie hétérologue peut correspondre à des acides aminés, lipides, sucres, etc. Il peut également s'agir de groupe(s) chimique(s), enzymatique(s), radioactif(s), etc. La partie hétérologue peut en particulier constituer un marqueur, un agent de ciblage, un agent stabilisateur, un agent améliorant l'immunogénicité ou facilitant la production, un agent protecteur, un agent facilitant la pénétration du polypeptide dans les cellules, une toxine, ou composé actif, un anticorps, etc.. Les protéines EHTA de l'invention peuvent se présenter sous forme soluble, purifiée ou complexée avec une molécule porteuse telle que KLH ou la sérum-albumine, ou toute autre molécule inerte (par exemple synthétique), telle qu'une bille par exemple. Les polypeptides selon l'invention sont préférentiellement dépourvus de contamination par des protéines naturellement présentes dans leur environnement naturel. Dans un mode de mise en œuvre particulier, les polypeptides sont couplés à une molécule porteuse notamment pour la fabrication d'anticorps. Le couplage peut être réalisé selon des techniques conventionnelles. Les polypeptides peuvent également être conjugués ou fusionnés à toute autre molécule polypeptidique ou peptidique telle que par exemple un peptide, polypeptide ou une protéine biologiquement active.
Les protéines EHTA de l'invention peuvent être fabriquées par toute technique connue en soi de l'homme du métier, notamment par toute technique chimique, biologique, génétique, enzymatique, etc., seule ou en combinaison(s). Des méthodes préférées comprennent l'expression, dans un hôte cellulaire approprié, d'un acide nucléique correspondant ou la synthèse artificielle selon des techniques conventionnelles telles que la synthèse en phase solide.
Les protéines EHTA selon l'invention peuvent être utilisées dans des tests de sélection ou de criblage, dans des méthodes de dosage, pour réguler l'activité de EHTA in vitro ou in vivo, pour la production de médicaments ou vaccins, pour le ciblage de molécules, pour la production d'anticorps anti-EHTA, notamment d'anticorps thérapeutiques, etc.
Gène EHTA
Au sens de l'invention, on entend par « gène EHTA » tout acide nucléique codant une protéine EHTA telle que définie ci-avant. Il peut s'agir d'un ADN ou d'un ARN, d'origine naturelle ou synthétique. Il peut notamment s'agir d'ADN génomique, complémentaire, chimérique, artificiel, d'ARNm, etc. Le gène EHTA peut être sous forme simple-brin ou double-brin. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme de l'art à partir de la séquence SEQ ID NO : 1 et des informations contenues dans la présente demande. Un gène EHTA particulier comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID NO :1 ou d'une séquence complémentaire, ou d'une séquence différente en raison de la dégénérescence du code génétique, ou d'une séquence hybridant avec celles-ci dans des conditions de stringence élevée et codant une protéine EHTA.
Le gène EHTA de l'invention peut être incorporé dans un vecteur de clonage ou d'expression, dans le génome d'une cellule, etc.
Des exemples de vecteurs utilisables pour cloner un gène EHTA de l'invention sont notamment des plasmides, cosmides, épisomes, chromosomes artificiels, virus, phages, etc. On peut citer divers plasmides commerciaux tels que pUC, pcDNA, pBR, etc. Parmi les vecteurs viraux, on peut citer les rétrovirus, adénovirus, AAV, herpès virus, etc. De tels vecteurs constituent des objets particuliers de l'invention.
Le gène ou vecteur peut être introduit dans une cellule hôte, afin de produire une protéine EHTA. Des exemples de cellules utilisables sont notamment des cellules de mammifères, de levure, de plante, d'insecte ou de bactérie. On peut citer des cellules primaires ou des lignées établies de cellules de mammifère. On peut citer comme exemple de cellules de mammifères des hépatocytes, des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des lignées cellulaires telles que MDCK, HepG2, CHO, Véro, 293, etc. Parmi les cellules de bactérie ou de levure, on peut citer notamment E. Coli, Saccharomyces et Kluyveromyces, par exemple. De telles cellules recombinantes constituent des objets particuliers de l'invention.
Sonde Nucléique
Un objet particulier de l'invention concerne une sonde nucléique caractérisée en ce qu'elle permet la détection d'un gène EHTA ou d'un ARN correspondant, typiquement par hybridation sélective à partir d'un échantillon. Généralement, la sonde comprend la séquence d'un gène EHTA tel que défini ci-avant ou une partie de celle-ci. Une sonde de l'invention comprend typiquement de 10 à 1000 nucléotides, de préférence de 20 à 800, plus préférentiellement de 50 à 600, et est généralement simple-brin. Un exemple particulier de sonde est représenté par un oligonucléotide spécifique et complémentaire d'une région au moins d'un gène EHTA ou de l'ARN correspondant. L' oligonucléotide est typiquement simple-brin, et comporte généralement de 10 à 100 bases. Un autre exemple de sonde nucléique de l'invention comprend la séquence SEQ ID NO :1 ou la partie codante de celle-ci. Les sondes nucléiques selon l'invention peuvent être marquées, par exemple au moyen de marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, luminescents, etc. Les sondes peuvent être sous forme libre ou immobilisée sur un support (colonne, bille, lame, membrane, etc.).
A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne un produit comprenant au moins un acide nucléique comprenant tout ou une partie spécifique de la séquence SEQ ID NO : 1, immobilisé sur un support. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. L'acide nucléique est préférentiellement immobilisé par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction d'hybridation. Des techniques d'immobilisation de matériels (tels que acides nucléiques, polypeptides, anticorps, etc.) sur des supports ont été décrites dans la littérature, et notamment dans les demandes ou brevets n° EP619 321, WO91/08307, US4,925,785 et GB2,197,720.
Amorce Spécifique
Un autre objet de l'invention concerne une amorce nucléique, permettant l'amplification (sélective) d'un gène EHTA ou d'une partie (spécifique) de celui-ci. Une amorce selon l'invention est avantageusement composée de 3 à 50 bases, de préférence de 5 à 40 et encore plus préférentiellement de 6 à 35 bases. Elle est typiquement simple-brin. Une amorce particulière est complémentaire d'une région au moins du gène EHTA ou de l'ARN correspondant. Un mode de réalisation préféré réside dans une amorce constituée d'un acide nucléique simple-brin comprenant de 6 à 50 nucléotides complémentaires d'une partie au moins de la séquence SEQ ID NO : 1 ou de son brin complémentaire.
L'invention concerne également une paire d'amorces comprenant une séquence sens et une séquence inverse, caractérisée en ce que les amorces de ladite paire s'hybrident avec une région d'un gène EHTA et permettent l'amplification d'au moins une portion de celui-ci. Les amorces peuvent être complémentaires d'une partie de la région codante du gène EHTA, ou des régions régulatrices (promoteur, terminateur, etc.).
Acide Nucléique Inhibiteur
On entend par acide nucléique inhibiteur tout acide nucléique capable d'inhiber la transcription du gène EHTA ou la traduction du messager correspondant.
L'acide nucléique inhibiteur peut comprendre tout ou partie de la séquence du gène EHTA, d'un fragment de celle-ci, du messager de la EHTA, ou d'une séquence complémentaire à celles-ci. L'inhibiteur peut notamment comprendre une région complémentaire d'une partie de la séquence SEQ ID NO :1 et inhiber (ou réduire) sa traduction en protéine. L'inhibiteur est préférentiellement complémentaire d'une portion au moins de la région codante de la séquence SEQ ID NO :1. La complémentarité de l'acide nucléique est préférentiellement parfaite, même si certains mésappariements peuvent être tolérés. L'inhibiteur peut être de l'ADN ou de l'ARN, et il peut s'agit d'un anti-sens, d'un ribozyme (WO 99/32618), d'un AR (WO01/29058 ; WO01/75164), etc., ou d'un vecteur codant pour ceux-ci. Il peut être simple-brin ou double-brin. Sa longueur peut varier entre quelques bases et plusieurs centaines de bases, par exemple jusqu'à la longueur complète de la séquence SEQ ID NO :1 ou de l'ARNm de EHTA. Il peut également s'agir d'un ARN codé par un gène anti-sens. S'agissant d'un oligonucléotide anti-sens ou interférant, il comprend typiquement moins de 100 bases, par exemple de l'ordre de 10 à 50 bases. Cet oligonucléotide peut être modifié pour améliorer sa stabilité, sa résistance aux nucléases, sa pénétration cellulaire, etc. De tels acides nucléiques inhibiteurs représentent des objets particuliers de l'invention, ainsi que des compositions pharmaceutiques les comprenant, en association avec tout véhicule ou excipient acceptable sur la plan pharmaceutique.
Anticorps
Un autre objet de l'invention concerne tout anticorps spécifique d'une protéine ou d'un polypeptide EHTA, c'est-à-dire capable de se lier, de préférence de manière sélective, à un tel polypeptide ou protéine. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (e.g., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, poly-fonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal non-humain avec une protéine EHTA ou un fragment de celle-ci comportant un épitope, et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Diverses méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces variées ont été décrites dans l'art antérieur. Typiquement, l'antigène est combiné avec un adjuvant (e. g., Freund's adjuvant) et administré à un animal, par exemple par injection sous- cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins sont collectés et l'immunoglobuline ou le sérum sont séparés.
Les méthodes classiques de production d'anticorps monoclonaux comprennent l'immunisation d'un animal non-humain avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par digestion à l'aide d'une protéase selon les techniques conventionnelles.
L'invention concerne également une méthode de production d'anticorps, comprenant l'injection d'une protéine EHTA telle que définie ci-avant (ou d'un fragment immunogène de celle-ci) à un animal non humain et la récupération des anticorps ou des cellules productrices d'anticorps.
Les anticorps préférés sont des anticorps spécifiques de la protéine EHTA, c'est-à-dire ayant une affinité supérieure pour la protéine EHTA que pour d'autres antigènes, même si une liaison non-spécifique ou moins affine ne peut être exclue.
L'invention concerne également des hybridomes produisant les anticorps monoclonaux décrits ci-dessus et leur utilisation pour produire lesdits anticorps.
Les anticorps de l'invention peuvent être couplés à des fragments hétérologues tels que des toxines, des marqueurs, des médicaments ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. Les marqueurs peuvent être choisis parmi les radio-marqueurs, des enzymes, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc. Les toxines peuvent être choisies parmi la toxine dipthérique, botulique, la ricine, etc.
Les anticorps de l'invention peuvent également être immobilisés sur un support, tel qu'une bille, colonne, gel, puce, etc. A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne un produit comprenant au moins un anticorps spécifique d'une protéine EHTA immobilisé sur un support. Le support peut être solide, plan ou non, régulier ou non, comme par exemple du nylon, verre, plastique, métal, fibre, céramique, silice, polymère, etc., ou tout autre matériau compatible. L'anticorps est préférentiellement immobilisé par une extrémité, dans des conditions laissant la molécule accessible pour une réaction immunologique.
METHODES DE DETECTION/DTAGNOSTTC La présente demande décrit de nouveaux procédés de détection d'une pathologie ou d'une prédisposition à une pathologie chez un sujet, ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une pathologie, comprenant la détermination de la présence, de la quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine EHTA, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN messager correspondant.
La détermination peut être réalisée par différentes techniques, telles que séquençage, hybridation et/ou amplification sélectives. Des méthodes utilisables pour déterminer la présence de protéines (ou domaines protéiques) sont basées par exemple sur des réactions immuno-enzymatiques, telles que ELISA, RIA, ELA, etc. Des techniques utilisables pour déterminer la présence ou l'expression de gènes ou d'ARN sont par exemple la PCR, la RT-PCR, la réaction de ligation en chaîne (LCR), la technique de PCE ou TMA (« Transcriptional Mediated Amplification »), la migration sur gel, l'électrophorèse, notamment la DGGE (« denaturing gel gradient electrophoresis »), etc.
Dans le cas où une étape d'amplification est réalisée, celle-ci met préférentiellement en oeuvre une amorce ou une paire d'amorces telle que définie ci-avant.
Un objet particulier de l'invention concerne l'utilisation d'acides nucléiques complémentaires et spécifiques du gène EHTA pour la détection de cancers, la caractérisation de cancers ou pour le suivi de la progression de cancers, notamment de la formation de métastases. Cette détection peut s'effectuer grâce à des puces à ADN ou par mise en œuvre d'une PCR à partir de biopsie ou de fluides biologiques tels que du sang (le sérum notamment), des urines, du fluide séminal, etc.
L'invention réside également dans la mise au point et l'utilisation de tests immunologiques contenant un ou plusieurs anticorps tels que décrits ci-dessus ou fragments de ces derniers. Ces tests permettent de détecter et/ou mesurer la présence et/ou la quantité de protéine EHTA dans un échantillon biologique, cette quantité étant corrélée à un processus pathologique. Une méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une sonde nucléique telle que définie ci-avant, et la mise en évidence d'une hybridation.
Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec une amorce ou une paire d'amorces telles que définies ci-avant, et la mise en évidence d'un produit d'amplification.
Une autre méthode particulière comprend la mise en contact d'un échantillon provenant d'un sujet avec un anticorps tel que défini ci-avant, et la mise en évidence d'un complexe antigène-anticorps.
Plusieurs tests peuvent réalisés en parallèle, à partir de plusieurs échantillons et/ou en utilisant plusieurs sondes, amorces et/ou anticorps.
Comme indiqué ci-avant, la protéine EHTA est impliquée dans les mécanismes d'adhésion cellulaire, de perméabilité para-cellulaire, d'interaction entre cellules et d'angiogenèse. La surexpression de cette protéine induit un relâchement des liaisons intercellulaires et est observée dans des tissus pathologiques, notamment les tissus cancéreux. La détection ou le dosage de cette protéine (ou de formes altérées) dans un échantillon d'un sujet constitue donc un indicateur de la présence de telles événements pathologiques et de la sévérité de ces pathologies.
Un autre objet de l'invention réside dans un kit utilisable pour la mise en œuvre d'un procédé tel que défini ci-avant comprenant i. un couple d'amorces ou une sonde ou un anticorps tels que définis ci-avant, et ii. les réactifs nécessaires à l'amplification ou à une réaction d'hybridation ou immunologique. CRIBLAGE DE COMPOSES ACTIFS
La protéine EHTA selon l'invention représente une cible thérapeutique particulièrement intéressante pour le traitement des cancers, de l'angiogénèse, des maladies tissulaires ou pour la régulation de l'adhésion cellulaire ou de la perméabilité para-cellulaire. L'invention permet donc la mise au point de procédés de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés actifs, basés sur une détermination de la capacité de composés tests à interagir avec EHTA, à moduler son expression ou à moduler son activité.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une protéine EHTA telle que définie ci-avant, et la sélection ou l'identification des composés se liant à ladite protéine. Dans ce procédé, la protéine EHTA (ou tout fragment de celle-ci) peut être utilisée sous forme soluble ou immobilisée à un support (colonne, bille, plaque, etc.).
Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec une cellule exprimant une protéine EHTA telle que définie ci-avant, et la sélection ou l'identification de composés modulant l'expression ou l'activité de ladite protéine.
Dans un aufre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un gène EHTA ou un ARN correspondant, et la sélection ou l'identification de composés se liant au dit gène ou ARN. Dans ce procédé, il est possible d'utiliser des portions du gène ou de l'ARN. Dans un autre mode de réalisation, l'invention réside dans une méthode de sélection, d'identification, de caractérisation, d'optimisation ou de production de composés actifs, comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo d'un composé test avec un acide nucléique comprenant la séquence du promoteur du gène EHTA, et la sélection ou l'identification de composés se liant au dit promoteur. Dans une variante particulière, on utilise une construction génétique comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle du promoteur, et l'effet du composé est déterminé par mesure de l'expression du gène rapporteur (ou de variation dans le niveau d'expression, par rapport à une situation contrôle).
La liaison à la protéine EHTA, au gène ou à l'ARN correspondant peut être mesurée par différentes techniques, telles que le déplacement d'un ligand marqué, la migration sur gel, l'électrophorèse, etc. La modulation de l'expression peut être déterminée par dosage des ARN ou des protéines, ou au moyen d'un système rapporteur. Les cellules utilisées peuvent être toute cellule compatible, notamment des cellules eucaryotes ou procaryotes.
Ces cellules peuvent être des cellules de mammifères, des bactéries, des cellules de levure, de plante, d'insecte, etc. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. On peut citer comme exemple de cellules de mammifères des hépatocytes, des fibroblastes, des cellules endothéliales ou des lignées cellulaires telles que MDCK, HepG2, CHO, Véro, 293, etc. Parmi les cellules de bactérie ou de levure, on peut citer notamment E. Coli, Saccharomyces et Kluyveromyces, par exemple.
Le procédé de sélection peut être mis en œuvre dans tout support approprié, comme par exemple une plaque, un tube, une flasque, etc., typiquement dans un support multi- récipients, comme des plaques multi-puits.
Le procédé peut être mis en œuvre pour sélectionner ou identifier un activateur ou un inhibiteur de l'expression ou de l'activité de la protéine EHTA. Pour l'obtention de composés anti-cancéreux, on sélectionne des inhibiteurs de EHTA. A cet égard, un objet particulier de l'invention concerne des méthodes de sélection, d'identification, ou de caractérisation de composés anti-cancéreux, comprenant la mise en contact d'un ou de plusieurs composés tests avec une protéine EHTA, un gène EHTA ou une cellule exprimant une protéine EHTA, et la sélection des composés inhibant l'expression ou l'activité de EHTA ou se liant à celle-ci.
APPLICATIONS THERAPEUTIQUES
La présente demande décrit l'identification d'une nouvelle protéine impliquée dans la réalisation de jonctions inter-cellulaires. Cette protéine, lorsqu'elle est surexprimée, induit un relâchement des jonctions inter-cellulaires, et peut donc réguler la perméabilité para-cellulaire. En outre, cette protéine se trouve surexprimée dans des cellules tumorales, ce qui confirme son rôle dans le relâchement de l'épithélium et son implication dans la formation de métastases. Cette protéine représente donc une cible particulièrement intéressante pour des interventions thérapeutiques visant à réguler l'adhésion ou la perméabilité cellulaire, notamment dans des pathologies liées à l'angiogénèse, la perméabilité épithéliale ou à une prolifération cellulaire incontrôlée ou pathologique.
Une application thérapeutique particulièrement bénéfique réside dans le traitement des pathologies liées à une prolifération cellulaire incontrôlée ou pathologique, notamment les cancers.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la formation de métastases chez les patients atteints de cancers. En effet, il est établi que l'angiogénèse est non seulement essentielle à la croissance d'une tumeur mais est aussi impliquée dans la progression du stade bénin au stade du cancer invasif, et dans la progression de métastases dormantes vers des lésions métastatiques. La possibilité de réguler négativement l'angiogénèse et de renforcer l'adhésion cellulaire permet de réduire la progression métastasique des cancers.
L'invention est utilisable notamment pour inhiber la croissance des vaisseaux sanguins dans les tumeurs ou au voisinage de tumeurs.
L'invention est utilisable pour le traitement de différents types de cancers, notamment de tumeurs solides, comme par exemple les cancers du sein, du poumon, de la prostate, du colon, de l'utérus, tête-et-cou, du cerveau (e.g., glioblastome), de la peau, du foie, de la vessie, etc. Elle est particulièrement adaptée au traitement du cancer de la prostate, du sein et du colon.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse.
L'angiogénèse, le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de la vascularure préexistante, a lieu principalement au cours du développement embryonaire. Ce processus est également hautement régulé au stade adulte durant les processus de cicatrisation, d'ovulation et de menstruation. De nombreuses pathologies ont été décrites comme ayant une composante ou un stade lié au phénomène d'angiogenèse. On peut citer entre autres de très nombreux cancers, les rétinopathies liées au diabète, l'athérosclérose, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée. L'invention permet donc de contrôler la l'apparition, la progression ou le développement de ces pathologies chez des patients.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des rétinopathies liées au diabète, de l'athérosclérose, de l'arthrose, de la polyarthrite rhumatoïde, du psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée. Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à favoriser la cicatrisation.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à réguler l'adhésion cellulaire. La régulation de l'adhésion cellulaire est importante dans les greffes d'organes ou de tissus et dans le contrôle de pathologies tissulaires et de la perte de fonction d'organes, notamment liées à une ischémie tissulaire, des oedèmes, etc.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la perméabilité vasculaire ou para-cellulaire.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à préserver ou restaurer l'intégrité tissulaire.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer l' inflammation. L'angiogénèse et l'inflammation sont deux processus étroitement liés et de nombreuses pathologies inflammatoires comportent une composante angiogénique. Un contrôle de l'angiogénèse peut donc résulter en un bénéfice dans certaines pathologies inflammatoires.
Un autre objet de l'invention concerne des méthodes de traitement des pathologies mentionnées ci-dessus, comprenant l'administration à un patient d'une quantité efficace d'un inhibiteur de la protéine EHTA.
Dans le contexte de l'invention, le terme « traitement » désigne le traitement préventif, curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la souffrance, amélioration de la durée de vie, ralentissement de la progression de la maladie), etc. Le traitement peut en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements (chimiothérapie, radiothérapie, thérapie génique, etc.). Les traitements et médicaments de l'invention sont tout particulièrement destinés aux humains.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation combinée d'un inhibiteur de la protéine EHTA et d'un agent de chimiothérapie ou de radiothérapie, pour le traitement d'un cancer, notamment pour inhiber la formation de métastases, tout particulièrement chez des patients atteints de cancer de la prostate, du colon ou du sein.
L'agent de chimiothérapie peut être choisi parmi tous les composés et traitement anti- tumoraux connus, incluant notamment les cytokines, interférons, gènes ou protéines suppresseur de tumeur et les agents chimiques tels que : méthotrexate, vinblastine, adriamycine, cyclophosphamide, Cis-platine, etc.
Au sens de l'invention, le terme « inhibiteur » de la protéine EHTA désigne tout composé, traitement ou composition capable d'inhiber l'expression de la protéine EHTA ou son activité. Il peut s'agir notamment d'un composé, traitement ou composition inhibant la transcription du gène, la maturation des ARNs, la traduction de l'ARNm, la modification post-fraductionnelle de la protéine, sa translocation vers la membrane, etc. Il peut également s'agir d'un composé, traitement ou composition inhibant l'activité de la protéine EHTA, par exemple en inhibant son interaction avec d'autres constituants cellulaires, notamment avec d'autres constituants des jonctions serrées. L'inhibiteur est préférentiellement sélectif, c'est-à-dire sans effet direct et spécifique sur d'autres protéines ou gènes.
Le terme « inhiber » inclut toute réduction de l'expression ou de l'activité de la protéine EHTA, même si celle-ci n'est pas totale. On préfère néanmoins des inhibiteurs capables de réduire in vitro de 20% au moins l'expression ou l'activité de la protéine EHTA, plus préférentiellement de 30% au moins. En outre, des inhibiteurs particulièrement préférés sont des inhibiteurs sélectifs, c'est-à-dire qui agissent principalement sur la protéine EHTA et, dans une moindre mesure ou de manière essentiellement indirecte, sur d'autres cibles ou mécanismes. La sélectivité peut être déterminée en testant l'effet des inhibiteurs sur d'autres protéines cellulaires, notamment sur d'autres protéines impliquées dans la formation de jonctions serrées.
Dans un premier mode de réalisation particulier, le composé est un acide nucléique inhibiteur (e.g., anti-sens, ribozyme, RNAi, etc.) capable d'inhiber la transcription du gène EHTA ou la traduction du messager correspondant. Il s'agit tout particulièrement d'un oligonucléotide antisens ou d'un ARNi, ou d'un gène codant ceux-ci.
Dans un autre mode de réalisation, le composé est un peptide comprenant une région de la protéine EHTA et capable d'antagoniser son activité. Le peptide comprend avantageusement 5 résidus consécutifs au moins de la protéine EHTA, plus généralement entre 10 et 100. Le peptide comprend typiquement le site de liaison au domaine PDZ de la protéine EHTA, localisé au niveau des résidus 217 à 226.
Selon un autre mode de réalisation, l'inhibiteur est un anticorps spécifique de la protéine EHTA, ou un fragment ou dérivé d'un tel anticorps, tels que définis ci-avant. De tels anticorps, fragments et dérivés constituent des objets particuliers de la présente demande.
L'anticorps peut également être couplé à un fragment hétérologue, tel qu'une toxine, un médicament ou tout autre agent thérapeutique, de façon covalente ou non, soit directement, soit par l'intermédiaire d'agents de couplage. A cet égard, dans une variante particulière de mise en œuvre, le composé inhibiteur est un ligand cytotoxique spécifique de EHTA. De tels ligands cytotoxiques sont particulièrement adaptés pour le traitement de cancers. Des ligands cytotoxiques spécifiques sont typiquement des molécules comportant une région conférant la cytotoxicité et une région conférant la spécificité vis-à-vis de EHTA. La région conférant la cytotoxicité peut être toute molécule toxique pour une cellule, soit par elle-même, soit de manière conditionnelle ou indirecte (c'est-à-dire en rendant la cellule sensible à un agent chimique ou au système immunitaire du patient, par exemple). La région conférant la spécificité vis-à-vis de EHTA est typiquement un anticorps ou fragment d'anticorps tel que défini ci-avant. Il peut cependant s'agir également de ligands spécifiques de EHTA, notamment d'une partie d'un récepteur ou partenaire cellulaire de EHTA.
Selon un autre mode de réalisation, le composé inhibiteur est un composé chimique, d'origine naturelle ou synthétique, notamment une molécule organique ou inorganique, d'origine végétale, bactérienne, virale, animale, eucaryote, synthétique ou semi- synthétique, capable de moduler l'expression ou l'activité de la protéine EHTA. Un tel inhibiteur est préférentiellement obtenu ou issu d'une méthode de sélection telle que définie ci-avant.
Pour la mise en œuvre des méthodes thérapeutiques définies ci-avant, l'inhibiteur peut être utilisé à différentes doses et selon différents protocoles. En outre, il peut être utilisé seul ou, de préférence, combiné à d'autres agents actifs. L'administration peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, de préférence par injection, typiquement par voie intra-péritonéale, intra-tumotale, infra-dermique, infra-cérébrale, infra-veineuse, intra-artérielle ou intra-musculaire. Les doses administrées peuvent être adaptées par l'homme de l'art. Typiquement, de 0,01 mg à 100 mg / kg environ sont injectés, pour des composés inhibiteurs de nature chimique. Pour des composés nucléiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Pour des anticorps thérapeutiques, les doses peuvent varier par exemple entre 0,01 mg et 100 mg par dose. Il est entendu que des injections répétées peuvent être réalisées, éventuellement en combinaison avec d'autres agents actifs ou tout véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique (ex., tampons, solutions saline, isotonique, en présence d'agents stabilisants, etc.).
L'invention est utilisable chez les mammifères, notamment chez l'être humain. Les résultats présentés dans cette demande illustrent l'implication de la protéine EHTA dans les mécanismes de perméabilité para-cellulaire et sa dérégulation dans des tissus pathologiques, et démontrent l'intérêt d'approches thérapeutiques basées sur la régulation de cette protéine. MATERIELS ET METHODES UTILISES
Toute la partie de biologie moléculaire (clonage, constructions plasmidiques, tranfections, établissement de clones stables, immunofluorescence, ...) a été réalisé en utilisant des protocoles classiques connus de l'homme de l'art.
Le test de mesure de perméabilité paracellulaire a été réalisé de la manière suivante. A J0, environ 105 cellules MDCK transfectées stablement ont été ensemencées à confluence dans des inserts Becton Dickinson Transwell 8 μm semi-perméables définissant une partie basale et une partie apicale (chambre de Boyden). A J+5, du dextran-FITC 3 kDa a été déposé à une concentration de 0.5 mg/ml dans la partie apicale. Une prélèvement dans la partie basale est effectué au cours du temps et l'intensité de fluorescence est mesurée au fluorimètre. Les différentEs cinétiques ont été tracées et un coefficient de perméabilité a été calculé. Les différents résultats sont soutenus par les tests statistiques ANONA et Wilcoxon à 5%.
Les séquences protéiques et nucléiques sont fournies dans la liste de séquence annexée.
LEGENDE DES FIGURES ET RESULTATS OBTENUS
Figure 1 : Analyse par Northern Blot de la distribution tissulaire de l'ARN messager de la protéine EHTA. Ce messager est principalement exprimé dans le poumon, le rein et le cœur.
Figure 2 : Analyse par microscopie à fluorescence de la localisation cellulaire de la protéine EHTA. La phase ouverte de lecture de EHTA a été clonée en phase avec la protéine EGFP. Des cellules HMEC-1 ont été transfectées avec cette construction plasmidique et des clones stables ont été sélectionnés. Cette image montre une concentration du signal fluorescent à la jonction entre plusieurs cellules, ce type d'image est observé également après transfection stable avec d'autres membres de la famille des claudins. Figure 3 : Partie gauche: analyse par microscopie à fluorescence de la localisation cellulaire de la protéine EHTA. La phase ouverte de lecture de EHTA a été clonée en phase avec la protéine EGFP. Des cellules MDCK ont été transfectées avec cette construction plasmidique et des clones stables ont été sélectionnés. Cette image montre une concentration du signal fluorescent à la jonction entre plusieurs cellules, ce type d'image est observé également après transfection stable avec la claudin 1 (partie droite de la figure).
Figure 4 : Mesure du passage d'une molécule de dextran marquée au FITC au travers d'une monocouche de cellules MDCK transfectées stablement soit avec la protéine EHTA fusionnée avec l'EGFP (EHTA-EGFP), soit avec l'EGFP seule (EGFP). On observe une plus forte perméabilité pour le clone transfecté avec la protéine de fusion EHTA-EGFP. Un coefficient de perméabilité a été calculé en normalisant les résultats par la surface occupée par la monocouche de cellules (partie droite de la figure).
Figure 5 : Analyse de l'expression de l'ARN messager de EHTA par PCR quantitative en temps réel (QPCR). Des biopsies de la partie tumorale (tumor) d'une part et de tissus péritumoraux (normal) d'autre part ont été isolées chez le même patient atteint de cancer de la prostate. Les ARN extraits à partir de ces biopsies ont été rétrotranscrits et utilisés dans des expériences de QPCR. Les résultats ont été normalisés par l'expression de la beta-tubuline. On observe une expression 3.5, 8.2 et 1.9 fois plus forte dans la partie tumorale par rapport à la partie normale chez les patients A, B et C, respectivement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers.
2. Utilisation selon la revendication 1, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la formation de métastases chez les patients atteints de cancers.
3. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber l'angiogénèse dans ou au voisinage de tumeurs.
4. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des rétinopathies liées au diabète, de l'athérosclérose, de l'arthrose, de la polyarthrite rhumatoïde, du psoriasis, ainsi que les pathologies liées à une cicatrisation retardée.
5. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à réguler la perméabilité vasculaire ou para-cellulaire.
6. Utilisation d'un inhibiteur de la protéine EHTA pour la préparation d'un médicament destiné à préserver ou restaurer l'intégrité tissulaire.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la protéine EHTA est un acide nucléique inhibiteur capable d'inhiber de manière spécifique la franscription du gène EHTA ou la traduction de l'ARN messager correspondant.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que l'acide nucléique inhibiteur de la protéine EHTA est un ARNi, un acide nucléique anti-sens ou un ribozyme, ou un vecteur codant pour celui-ci.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que P inhibiteur de la protéine EHTA est un anticorps spécifique de la protéine EHTA.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la protéine EHTA est un ligand cytotoxique spécifique de la protéine
EHTA.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'inhibiteur de la protéine EHTA est un antagoniste peptidique comprenant les résidus 217 à 226 de la séquence SEQ ID NO :2.
12. Utilisation selon l'une des revendications I à 3 et 7 à ll, caractérisée en ce que l'inhibiteur est utilisé en combinaison avec un agent de chimiothérapie ou de radiothérapie.
13. Ligand cytotoxique spécifique de la protéine EHTA, caractérisé en ce qu'il comprend une région conférant la cytotoxicité et une région conférant la spécificité pour la protéine EHTA.
14. Procédé de détection chez un sujet d'un cancer ou d'une pathologie liée à l'angiogénèse ou d'une prédisposition à une telle pathologie ou de suivi de l'évolution ou du stade d'avancement d'une telle pathologie ou de l'efficacité d'un traitement, comprenant la détermination de la présence, de la quantité (relative ou absolue) ou de la distribution, dans un échantillon dudit sujet, de la protéine EHTA, de son expression, de formes altérées de celle-ci ou du gène ou ARN messager correspondant.
15. Procédé de sélection, criblage, caractérisation, optimisation ou production de composés anti-cancéreux, comprenant une étape de détermination de la capacité d'un composé test à interagir avec la protéine ou le gène EHTA, à moduler son expression ou à moduler son activité.
16. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant un acide nucléique codant une protéine EHTA.
17. Cellule recombinante, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur selon la revendication 16 ou un acide nucléique codant une protéine EHTA, et en ce qu'elle exprime une protéine EHTA.
18. Méthode de traitement d'une pathologie liée à l'angiogénèse chez un sujet, comprenant l'administration au sujet d'une quantité efficace d'un inhibiteur de la protéine EHTA.
19. Méthode pour inhiber la vascularisation d'une tumeur chez un patient atteint d'un cancer, comprenant l'administration au sujet d'une quantité efficace d'un inhibiteur de la protéine EHTA.
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