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WO2004022769A2 - Moyens de detection des processus neurodegeneratifs et leurs applications - Google Patents

Moyens de detection des processus neurodegeneratifs et leurs applications Download PDF

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WO2004022769A2
WO2004022769A2 PCT/FR2003/002667 FR0302667W WO2004022769A2 WO 2004022769 A2 WO2004022769 A2 WO 2004022769A2 FR 0302667 W FR0302667 W FR 0302667W WO 2004022769 A2 WO2004022769 A2 WO 2004022769A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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chain
atp synthase
alzheimer
disease
neurodegenerative
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2003/002667
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English (en)
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WO2004022769A3 (fr
Inventor
André Delacourte
Nicolas Sergeant
Annick Wattez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US10/526,899 priority patent/US20060166283A1/en
Priority to EP03769589A priority patent/EP1551994A2/fr
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Publication of WO2004022769A3 publication Critical patent/WO2004022769A3/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the invention relates to means for detecting neurodegenerative processes and their applications.
  • AD Alzheimer's disease
  • Amyloidogenesis which results from a dysfunction of the APP protein
  • DNF neurofUbrillary degeneration
  • the dysfunction of the APP protein is at the very origin of Alzheimer's pathology, but it is the extension of neurofibrillary degeneration in the brain territories which is best correlated with the expression of clinical manifestations. 10 stages of invasion of neurofibrillary degeneration have been determined. The relationship between amyloid deposition and neurofibrillary degeneration is still poorly understood, but there is certainly potentiation of the tau pathology by the dysfunction of the APP protein.
  • the invention is based on the demonstration of a deleterious mechanism which is associated with the process of neurofibrillary degeneration observed during Alzheimer's disease and related pathologies.
  • the molecule of the respiratory chain of the mitochondria and in particular of a protein of the V complex of this respiratory chain. It is a specific localization of the protein and an insolubilization of the ⁇ chain of ATP synthase which then accumulates in degenerating neurons and is closely associated with the tau protein or its polymers ( pathological filaments of neurofibrillary degeneration) observed in particular in Alzheimer's disease.
  • AD46 monoclonal antibody
  • This antibody recognizes pathological fibrillar clusters of DNF on the scale of optical microscopy and PHF (pairs of helical filaments) on the scale of electron microscopy ( Figures 1 and 2).
  • Immunostaining is co-located with the aggregated tau proteins, which are the building blocks of DNF.
  • the AD46 marking sometimes precedes the tau immunostaining of neurofibrillary degeneration, revealed by phospho-dependent and phospho-independent anti-tau antibodies.
  • the labeling of the AD46 antibody being independent of the tau labeling, it demonstrates the existence of a third aggregative process, the essential component of which is the ⁇ chain of the human ATP synthase. Labeling with the AD46 antibody, which sometimes occurs before labeling tau proteins, also demonstrates that it is an early marker of the neurodegenerative process.
  • the mono and two-dimensional immunoblock technique reveals that the AD46 antibody recognizes a major protein and two minor proteins in a homogenate of human brain tissue (Figure 3). These three proteins are different from tau proteins and tau protein catabolism products. Indeed, AD46 does not recognize normal and pathological tau proteins, extracted from homogenates of brain tissue from Alzheimer's patients and controls, any more than the recombinant tau proteins.
  • the ⁇ chain of ATP synthase is indeed a new constituent of DNF, insofar as a polyclonal antibody directed against the ⁇ chain of recombinant ATP synthase recognizes well the human neurons in DNF (FIG. 8) optical and electronic microscopy scale.
  • the ⁇ chain of ATP synthase is not indirectly and secondarily associated with DNF, but directly linked to the degenerative process. Indeed, the study of the distribution of the ⁇ chain of ATP synthase in the various protein fractions of brain tissue of controls and Alzheimer's patients demonstrates that the disappearance of the ⁇ chain of ATP synthase occurs gradually during installation of the DNF process ( Figures 6 and 7).
  • the biological function of the ⁇ chain of ATP synthase indicates that the process of neurofibrillary degeneration during Alzheimer's disease is linked, at least in part, to a singular localization and an accumulation of the protein in the cytoplasm of neurons. in neurofibrillary degeneration. Indirectly, the localization of the ⁇ chain of ATP synthase could alter the process of oxidophosphorylation of the respiratory chain of the mitochondria, or initiate a process of degeneration.
  • the ⁇ chain of ATP synthase is also associated with other biological functions. It could be a me bran receptor for cytokines, such as angiostatin or polypeptide II activator of endothelial cells and monocytes. It is also described in several cellular compartments, such as the plasma membrane, peroxisomes. It could also be a chaperone protein.
  • the association of the ATP synthase ⁇ chain with tau protein aggregates could alter one or more of the biological functions of the ATP synthase ⁇ chain.
  • the invention therefore relates to new markers of the neurodegenerative process, constituted by the ⁇ chain of ATP synthase having undergone pathological modifications resulting from said process.
  • It relates more particularly to the use of the ⁇ chain of ATP synthase having undergone pathological modifications resulting from a neurodegenerative process as a marker for neurodegenerative diseases, including tauopathies.
  • these markers are characterized in that the modifications of the ⁇ chain of ATP synthase are of the functional, localization, structural and / or antigenic type. These markers are particularly suitable for the detection of the neurodegenerative process of any pathology with a process of neurofibrillary degeneration and aggregation of the tau protein, more particularly, the neurodegenerative process of Alzheimer's disease.
  • the functional, localization, structural modifications of the ⁇ chain of ATP synthase presented by the markers according to the invention may be, in particular, its insolubility, its localization in the cytoplasm of the cell and / or the formation of brain aggregates. These modifications can also be conformational and / or post-translational, including maturation.
  • Aggregate formation concerns the alpha chain of ATP synthase alone, or in interaction with tau proteins, to induce tauopathy, that is to say the aggregation of tau proteins.
  • the invention therefore also relates to a method of detection and / or in vitro diagnosis of the neurodegenerative process, characterized in that one of the markers according to the invention is detected in a sample to be analyzed.
  • the method advantageously comprises the use of sets of antibodies directed against the normal protein and / or against modifications of the ⁇ chain of ATP synthase.
  • the method according to the invention is particularly suitable for the detection of the degenerative process of Alzheimer's disease.
  • immunochemical detection in particular by 1D and / or 2D electrophoresis coupled with an immunoblot
  • revelation by polyclonal antibodies or monoclonal antibodies directed against the ⁇ chain of ATP synthase
  • immuno -test and / or radioimmunoassay are varied: immunochemical detection, in particular by 1D and / or 2D electrophoresis coupled with an immunoblot, revelation by polyclonal antibodies or monoclonal antibodies directed against the ⁇ chain of ATP synthase, immuno -test and / or radioimmunoassay.
  • the capture of the pathological ATP synthase alpha chain may be followed by an additional analysis by mass spectrometry: an immunocapture of the pathological ATP synthase alpha chain is then carried out and the products captured by mass spectrometry are analyzed.
  • sample to be analyzed can be used: tissues or neuronal cells, tissues or non-neuronal cells, in particular biological fluids, preferably blood.
  • the diagnostic method according to the invention may also include a step of evaluating the degree of the pathology by establishing an index based on the ratio between the normal rate of ATP synthase ⁇ chains in controls in a defined protein fraction, compared to the rate observed in the advanced stage of Alzheimer's disease.
  • the degree of pathology can be assessed by establishing an index based on modifications of the ⁇ chain of ATP synthase in a patient compared to a control.
  • the detection of functional and / or localization and / or structural and / or antigenic modifications of the ⁇ chain of ATP synthase in peripheral biological fluids and / or in brain tissue and / or in peripheral tissue makes it possible to carry out a early diagnostic test.
  • the neuronal death that occurs during Alzheimer's disease causes the release of tau proteins in the cerebrospinal fluid (CSF).
  • CSF cerebrospinal fluid
  • the presence of the ⁇ chain of ATP synthase in biological fluids, the association of which with tau proteins has been demonstrated, can therefore complement the biological diagnosis in an advantageous manner.
  • the invention allows a new diagnostic approach to neurodegenerative pathologies, in particular Alzheimer's disease.
  • the ⁇ chain of ATP synthase being observed early, sometimes before the aggregation of tau proteins, its detection in biological fluids, and in particular CSF, is a marker of choice, usable for purposes of early diagnosis or determination risk factor.
  • the invention also provides a method for evaluating the pathological interaction of the ⁇ chain of ATP synthase with tau proteins, and vice versa, using appropriate techniques such as, for example, the biosensor, ELISA, immunoprecipitations , mass spectrometry.
  • This method makes it possible to define a pathological transformation index of the ⁇ chain of ATP synthase and / or of the tau protein. It also covers kits for the implementation of the said evaluation method.
  • the methods of detection, diagnosis or evaluation according to the invention can advantageously be used to establish an ante and post-mortem diagnosis of neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease, of the subclinical stage ("mild cognitive impairment” ») At the clinical stage, to carry out a pharmacological screening and therapeutic trials of molecules effective against neurodegenerative pathologies, in particular of the tauopatie or Alzheimer's disease type, and / or to establish and validate cellular models and / or animal models neurodegenerative pathologies, in particular of tauopathy or Alzheimer's disease type.
  • the invention also includes' any animal or cell model, characterized in that it expresses an ⁇ chain of ATP synthase having a fault processing signal or a post-translational modification linked to the degenerative process.
  • models (animal or cellular) expressing the ⁇ chain of ATP synthase in the cytoplasm of cells, that is to say by eliminating the first 47 amino acids which constitute the signal for maturation of the ⁇ chain of ATP synthase for its integration into the V complex of the respiratory chain of the mitochondria. These models should thus reproduce the accumulation of the ⁇ chain of ATP synthase in the cytoplasm.
  • this involves looking for the delocalization of the ⁇ chain of ATP synthase in a reconstituted system, called “cybrid” (Sheehan et al., 1997).
  • This system consists of evaluating the functioning of the mitochondria obtained from the blood platelets of patients suffering from Alzheimer's disease in a reconstituted cellular system.
  • the addressing of the ⁇ chain of ATP synthase in this system can be evaluated and an addressing index defined (the value 100 corresponding to normal subjects, the value 0 to patients suffering from Alzheimer's disease).
  • the invention also relates to the therapeutic application, insofar as the ⁇ chain of ATP synthase is a precise pharmacological target, which can be modulated by the action of specific inhibitors and activators, of the protein itself and / or its ligands, and / or the V complex of the mitochondrial respiratory chain in general. Indeed, its action relates directly to the process of neurofibrillary degeneration, and can also relate to the metabolism of the APP.
  • kits for detecting the ⁇ chain of ATP synthase for the diagnosis of neurodegenerative diseases, in particular for the detection of Alzheimer's disease, also comes within the scope of the invention.
  • the invention finally provides a diagnostic kit comprising sets of polyclonal and / or monoclonal antibodies directed against patterns of pathological conformation of the ⁇ chain of ATP synthase resulting from a neurodegenerative process. It also covers said antibodies.
  • said kit contains reagents for carrying out an immunochemical assay, in particular of the ELISA type, immunoblotting, Western blots, dots-blots, radioimmunoassay or immunoassay.
  • An additional assay by mass spectrometry is also possible, in order to unambiguously detect alterations in the alpha chain of pathological ATP synthase.
  • Example 3 below also proposes a method for preparing immunological tools against the alpha chain of ATP synthase, comprising the following steps: selective extraction of neurofibrillary degeneration from human tissue affected by a neurodegenerative process, extraction of the ⁇ chain from pathological ATP synthase, use of the ⁇ chain from purified ATP synthase as an antigen for the production of polyclonal antibodies .
  • the clones selected preferably have the following immunological properties:
  • FIGS. 1 and 2 illustrate the immunodetection of neurofibrillary degeneration of the Alzheimer type by the antibody AD46, to the optical and electronic microscopy scale.
  • Figures 3, 4 and 5 relate to the characterization of the proteins detected by AD46, by one-dimensional electrophoresis (fig. 3; 1D), then by two-dimensional electrophoresis (fig. 3; 2D), by mass spectrometry analysis of the spot detected by AD46 (fig. 4), and finally by 2D gel comparison of the immunodetection of AD46 with respect to an antibody directed against the identified protein, namely the ⁇ chain of ATP synthase (fig. 5).
  • FIG. 6 and 7 show the insolubilization of the ⁇ chain of ATP synthase; this disappears from the Triton fractions during the Alzheimers.
  • FIG. 8 illustrates the interaction of the ⁇ chain of ATP synthase with the tau protein; it is extracted and immunoprecipitated with the tau protein.
  • FIG. 9 illustrates a similar immunostaining of neurofribrillary degeneration, on tissue section
  • AD2 Alzheimer's, with an anti-tau antibody (AD2), AD46, and an anti- ⁇ chain of ATP synthase.
  • Figures 10 and 11 relate to the specificity of the detection of neurofibrillary degeneration.
  • Example 1 Demonstration of the implication of the ⁇ chain of ATP synthase in Alzhe ⁇ mer disease (AD).
  • the monoclonal antibody AD46 was obtained using an in vitro immunization kit (Immune System, Bristol, UK) from the substance most insoluble in formic acid in the brain tissue of a patient suffering from Alzheimer's disease.
  • the immunogen was prepared according to the method described by Permanne et al. , 1995.
  • the in vitro immunization kit was used in accordance with the manufacturer's recommendations.
  • the selection of the clone was carried out by immunohistochemistry on sections of brain tissue from patients suffering from Alzheimer's disease. Immunohistochemistry and electron microscopy
  • Immunohistochemistry is performed from fixed and frozen human brain tissue.
  • the 15 ⁇ m sections are left to thaw for 15 min.
  • the endogenous peroxidase activity is neutralized by a treatment with hydrogen peroxide (1% solution) followed by several rinses in water.
  • the sections are then equilibrated in the antibody incubation buffer (PBS, Sigma).
  • the antibody is used at a final dilution of 1/1000 in PBS and the incubation on the section is carried out for 2 hours at room temperature.
  • the section is incubated with the secondary antibody coupled to peroxidase (Horseraddich peroxidase conjugate anti-mouse antibodies, Sigma).
  • the complexes are revealed with a development kit (Fas-tDAB, Sigma) according to the manufacturer's instructions.
  • the electron microscopy protocol is identical to that described by Reig et al. , 1995.
  • samples of human brain tissue were dissected by referring to an anatomical atlas, then homogenized using a Teflon® potter in 10 volumes of 1-D lysis buffer (50 mM Tris-HC1 pH 6.8; 4mM EDTA; 5% (w / v) SDS, 10% (v / v) glycerol, 2% (v / v ) of ⁇ -mercaptoethanol and 0.05% Bromophenol Blue). The samples were brought to 100 ° C for 10 minutes and stored at -80 ° C until used.
  • 1-D lysis buffer 50 mM Tris-HC1 pH 6.8; 4mM EDTA; 5% (w / v) SDS, 10% (v / v) glycerol, 2% (v / v ) of ⁇ -mercaptoethanol and 0.05% Bromophenol Blue.
  • the corresponding buffers are added to the supernatants at the time of use: 1 volume of 1-D lysis buffer (100 mM Tris-HCl pH 6.8; 8mM EDTA; 10% (w / v) SDS; 20% (v / v) of glycerol; 4% (v / v) of ⁇ -mercaptoethanol and 0.1% Bromophenol blue) for a study by one-dimensional electrophoresis or 1 volume of lysis buffer 2-D (7M urea; 2M thiourea; 4% Pharmalytes® 3-10 (w / v); 4% (v / v) Triton X- 100; 20 mM dithiothreitol) for a study by two-dimensional electrophoresis.
  • 1-D lysis buffer 100 mM Tris-HCl pH 6.8; 8mM EDTA; 10% (w / v) SDS; 20% (v / v) of glycerol; 4% (v /
  • the experimental mode used is that described by Greenberg and Davies, 1990 and modified by Goedert et al., 1992.
  • the brain tissue is homogenized using a Teflon potter in a solution containing 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 800 mM NaCl, ImM EGTA and 10% sucrose.
  • the homogenate is centrifuged at 20,000 g for 30 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant is recovered, the pellet is homogenized again according to the same protocol. After centrifugation according to the same parameters previously mentioned, the supernatant is recovered and mixed with the first.
  • N-lauryl sarcosine is added to the homogenate at a final concentration of 1% and it is placed in gentle stirring for 1 hour at room temperature. After centrifugation at 100,000 g for 1 hour, the pellet containing the tau protein aggregates is treated with 1 volume of 1-D lysis buffer.
  • the brain tissue is homogenized using a sintered glass potter in 10 volumes of a solution containing 10 mM
  • the homogenate is centrifuged at 2000 g for 10 minutes at 4 ° C, 100 ⁇ l of starting buffer are added, the whole is stirred for 5 min at room temperature and centrifuged again. The step is repeated twice. The beads are then incubated with
  • the experiments were carried out using the Protean Xi Cell system (Biorad) according to the manufacturer's instructions.
  • the SDS-PAGE were carried out according to the protocols described by Laemmli (1970) for the manufacture of the gel. It is a polyacrylamide gradient gel of between 8 and 15%. 100 ⁇ g of protein are deposited in each lane.
  • the first dimension is carried out according to the protocol described by O'Farrell et al. , 1977.
  • the equipment used for 1 isoelectric focusing is the IEF Protean Cell system (Biorad) according to the manufacturer's instructions.
  • the gel contains 9.5 M urea, 4% Triton X-100 and 4% Pharmalytes 3-10.
  • the polymerization is initiated by the addition of ammonium persulfate and TEMED.
  • the gel is poured into tubes of 20 cm and 2 mm internal diameter. 50 ⁇ l of 2D homogenate are deposited on the anode side of the gel and the isoelectrofocusing is carried out by applying a voltage of 400 volts for 6 hours.
  • the gels are balanced for 30 minutes in an SDS-PAGE buffer (50 mM Tris pH 6.8, 10% glycerol; 2% ⁇ -mercaptoethanol; 2% SDS; 0.05% bromophenol blue) then deposited on "the top of an SDS-PAGE separation gel in an 8-15% polyacrylamide gradient.
  • SDS-PAGE buffer 50 mM Tris pH 6.8, 10% glycerol; 2% ⁇ -mercaptoethanol; 2% SDS; 0.05% bromophenol blue
  • the transfer was carried out using the semi-dry Pharmacia LKB multiphor® transfer system following the manufacturer's instructions (A ersham-Pharmacia Biotech). The proteins were transferred at 0.8 mA / cm 2 onto a Hybond® ECL nitrocellulose membrane (Pharmacia-Amersham).
  • the membrane is incubated for 60 minutes in solution containing 15 mM of Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% of Tween®-20 and 5% of skimmed milk then washed with the same milk-free buffer containing 0, 1% Tween-20 instead of 0.5%.
  • the membrane is incubated, 2 h at room temperature or 1 night at
  • the membrane is washed 3 times for 10 minutes in the milk-free incubation buffer.
  • the membrane is then incubated, 1 h at room temperature, with an anti-mouse goat immunoglobulin coupled to horseradish peroxidase, at a final dilution of 1 / 4000th (v / v) in incubation buffer free of milk.
  • the membrane is washed 3 times in incubation buffer and the immunoreactive polypeptides are revealed using the ECL chemiluminescence kit (Pharmacia-Amersham) according to the manufacturer's instructions.
  • AD2 is an anti-tau antibody directed against a double phosphorylation site on the tau protein, and which serves as a reference for studying neurofibrillary degeneration in AD ( Figure 1: AD2, Alz).
  • the monoclonal antibody AD46 detects neurons in neurofibrillary degeneration of the brain tissue of an Alzheimer patient ( Figure 1: AD46, Alz). No neuronal labeling is observed in the brain tissue of a control subject ( Figure 1: AD2 and AD46, T).
  • On the scale of electron microscopy neurons in degeneration neurofibrillaria are characterized by an accumulation of pathological filaments. These filaments are made up of aggregated tau proteins called PHF (for Paired Helical Filament). They are also detected closely and specifically by the antibody AD46 ( Figure 2).
  • the AD46 antibody therefore reacts with one or more essential constituents of the pathological filaments of neurofibrillary degeneration ( Figure 2).
  • the monoclonal antibody AD46 detects 3 bands after immunoblots annotated A, B and C with an apparent molecular mass of 55, 47 and 42 kDa (FIG. 3A: lane 1D). After 2D electrophoresis, 4 major spots are marked (Figure 3: 2D part). A single spot corresponds to A, with an isoelectric point of 8.2. Two spots are displayed for B, with isoelectric points 5.0 and 7.0. A single spot is displayed for C with an isoelectric point 5.8 ( Figure 3: part 2D).
  • AD46 Each protein recognized by AD46 was isolated by 2D electrophoresis. Enzymatic digestion with trypsin was carried out in the gel and the peptide fragments recovered were analyzed by mass spectrometry. The identification is summarized in the following table.
  • Id . Identity of proteins confirmed by mass spectrometry (MPF) and immunoblotting (WB). Ref. : reference of proteins according to the nomenclature of the site htt: / / www. expasy. ch /.
  • the molecular weights of the fragments of each protein are used to query Internet databases:
  • a polyclonal antibody directed against the ⁇ chain of ATP synthase was used after 2D electrophoresis (Figure 5: Polyclonal).
  • the ⁇ chain of ATP synthase is detected at an apparent molecular mass (MM) of 55 kDa and an isoelectric point of 8.2.
  • the AD46 antibody also recognizes the same protein; it is indeed the ⁇ chain of ATP synthase ( Figure 5: AD46).
  • the proteins of the brain tissue have been dissociated according to an increasing solubility gradient (cf. material and methods).
  • the most soluble proteins are in the Tris fraction ( Figure 6: 2nd lane of immunoblots) and the less and less soluble proteins are recovered using a detergent such as Triton X-100 (3rd and 4th lane of immunoblots ( Figure 6). and C are not modified in AD (Control immuno-imprints, subclinical Alzheimer, confirmed Alzheimer, Arrows B and C)
  • protein A disappears from the 0.5% fraction Triton X-100 at the subclinical stage AD and in the 0.5% and 2% Triton-XlOO fractions in confirmed Alzheimer's (subclinical and confirmed Alzheimer's immunoblots, arrow A) ( Figure 6).
  • the ⁇ chain of ATP synthase is detected using a polyclonal antibody directed against the ⁇ chain of ATP synthase (FIG. 7: indicated by an arrow: A ( 55 kDa)).
  • the ⁇ chain of ATP synthase is detected at 55 kDa of apparent molecular mass. It is completely absent in the Tris and SDS 2% protein fractions. It is detected in the 0.5 and 2% Triton fractions and in the 0.1% SDS fraction but not in the 1% SDS fraction of the control subject.
  • the 0.5% Triton fraction is absent, weakly detected in the 2% Triton fraction, and detected in the 0.1 and 1% SDS fractions.
  • Neurofibrillary degenerating neurons are detected by monoclonal antibodies AD2 and AD46 on brain tissue of AD patient. Normal human brain tissue is not labeled with the AD46 antibody. A polyclonal antibody directed against the ⁇ chain of ATP synthase detects neurons in neurofibrillary degeneration of the brain tissue of AD patient ( Figure 9). Conversely, antibodies directed against enolases or cytoplasmic actin do not allow not a selective detection of neurofibrillary degeneration neurons in AD.
  • the detection of neurofibrillary degeneration is carried out with the aid of antibodies directed against the alpha chain of the ATP synthase and by immunostaining with antibodies directed against other proteins of the V complex of the mitochondria.
  • the peptides of experiments C and D were synthesized by the company Neosystem (Strasbourg, France) and added with a cysteine (C) at their amino-terminal end to allow coupling to the carrier which is ovalbumin.
  • the polyclonal antibodies were then produced by the company Neosystem, in rabbits.
  • This figure shows the specificity of the association of the alpha chain of ATP synthase with the process of neurofibrillary degeneration.
  • the detection of neurofibrillary degeneration was also carried out using an anti-alpha chain antibody to ATP synthase marketed. Furthermore, the antibodies according to the invention were tested in order to demonstrate their capacity to detect neurofibrial degeneration in other neurodegenerative diseases.
  • ATP synthase alpha chain (A) Detection of neurofibrillary degeneration using a monoclonal antibody directed against the alpha chain of ATP synthase (Molecular Probes, Leiden, Netherlands).
  • Example 3 Method for preparing immunological tools against the pathological ATP synthase alpha chain, in particular against pathological epitopes.
  • the method can include the following steps: Selective extraction of neurofibrillary degeneration from human tissue affected by the degenerative process of Alzheimer's type, using increasingly powerful solubilization buffers (tris, triton, SDS, sarkosyl, formic acid).
  • solubilization buffers tris, triton, SDS, sarkosyl, formic acid.
  • the clones selected should have the following immunological properties:

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Abstract

La présente invention se rapporte à de nouveaux marqueurs du processus neurodégénératif, consititués par la chaîne α de l'ATP synthase ayant subi des modifications. L'invention vise également des méthodes de détection, de diagnostic, des anticorps, des kits et leurs applications.

Description

Moyens de détection des processus neurodégénératifs et leurs applications.
L'invention a pour objet des moyens de détection des processus neurodégénératifs et leurs applications.
Elle vise plus particulièrement de nouveaux marqueurs du processus neurodégénératif, des méthodes de détection et de diagnostic, ainsi que leurs applications thérapeutiques et diagnostiques .
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative qui conduit à la perte des fonctions intellectuelles et donc à l'installation progressive et irréversible d'une démence. L'avenir de cette maladie s'annonce redoutable avec le vieillissement de la population car le facteur de risque majeur est l'âge.
99 % des formes observées sont non-familiales . Pour les formes familiales, les mutations pathologiques sont observées sur le gène APP du chromosome 21, et sur les gènes PSI et PS2 (présénilines 1 et 2) qui se trouvent sur les chromosomes 14 et 1.
Deux processus dégénératifs caractérisent la maladie d'Alzheimer. L' amyloïdogénèse, qui résulte d'un dysfonctionnement de la protéine APP, et la dégénérescence neurofUbrillaire (DNF) , qui correspond à l'accumulation de protéine tau dans les cellules nerveuses.
Le dysfonctionnement de la protéine APP est à l'origine même de la pathologie Alzheimerienne, mais c'est l'extension de la dégénérescence neurofibrillaire dans les territoires cérébraux qui est la mieux _corrélée avec l'expression des manifestations cliniques. 10 stades d'invasion de la dégénérescence neurofibrillaire ont été déterminés. La relation entre les dépôts amyloides et la dégénérescence neurofibrillaire est encore peu connue, mais il y a certainement potentialisation de la pathologie tau par le dysfonctionnement de la protéine APP.
De nombreuses hypothèses ont été formulées pour expliquer la dégénérescence et la mort neuronale. Il semble indéniable que de nombreux facteurs interviennent, dont la perte de fonction de la protéine APP, la neurotoxicicité du peptide amyloïde, l'âge, les phénomènes de réparation neuronale, modulés par 1 ' apolipoprotéine E, la co-morbidité, les réactions immunologiques et inflammatoires, ainsi que le stress oxydatif.
De nombreux travaux suggèrent que l'oxydation pourrait contribuer soit directement, soit indirectement à la mort neuronale dans la maladie d'Alzheimer. Cependant, il n'y a pas d'argumentation moléculaire directe pour justifier cette hypothèse .
L'invention est basée sur la démonstration d'un mécanisme délétère qui s'associe au processus de dégénérescence neurofibrillaire observé au cours de la maladie d'Alzheimer et des pathologies apparentées.
En particulier, elle porte sur la démonstration directe de la participation d'une molécule de la chaîne respiratoire de la mitochondrie et en particulier d'une protéine du complexe V de cette chaîne respiratoire. Il s'agit d'une localisation particulière de la protéine et d'une insolubilisation de la chaîne α de l'ATP synthase qui s'accumule alors dans les neurones en dégénérescence et s'associe étroitement à la protéine tau ou à ses polymères (filaments pathologiques de la dégénérescence neurofibrillaire) observés en particulier dans la maladie d'Alzheimer.
Les recherches menées par les inventeurs les ont amené à mettre au point un anticorps monoclonal, nommé AD46, qui détecte les filaments pathologiques qui s'accumulent dans les neurones en dégénérescence au cours de la maladie d'Alzheimer. Cet anticorps reconnaît les amas fibrillaires pathologiques de la DNF à l'échelle de la microscopie optique et les PHF (paires de filaments en hélice) à l'échelle de la microscopie électronique (Figures 1 et 2). L ' immunomarquage est colocalisé avec les protéines tau agrégées, qui sont les constituants de base de la DNF. Cependant, le marquage AD46 précède parfois 1 ' immunomarquage tau de la dégénérescence neurofibrillaire, révélé par des anticorps anti-tau phospho-dépendants et phospho-indépendants . Le marquage de l'anticorps AD46 étant indépendant du marquage tau, il démontre l'existence d'un troisième processus agrégatif dont le composant essentiel est la chaîne α de 1 'ATP synthase humaine. Le marquage avec l'anticorps AD46 intervenant parfois avant le marquage des protéines tau démontre également qu'il s'agit d'un marqueur précoce du processus neurodégénératif.
La technique d ' immunoempreinte mono et bidimensionnelle révèle que l'anticorps AD46 reconnaît une protéine majeure et deux protéines mineures dans un homogénat de tissu cérébral humain (Figure 3) . Ces trois protéines sont différentes des protéines tau et des produits de catabolisme des protéines tau. En effet, AD46 ne reconnaît pas les protéines tau normales et pathologiques, extraites d'homogénats de tissu cérébral de patients Alzheimer et de témoins, pas plus que les protéines tau recombinantes.
L'analyse bidimensionnelle et l'approche protéomique ont permis d'identifier la protéine majeure et les deux protéines mineures détectées par AD46. Les masses moléculaires sont de 42, 47 et 55 kDa (Figure 3) . Après électrophorèse 2D, les points isoélectriques respectifs de chaque polypeptide sont de 5,0, 5,8, 7,0 et 8,2 (Figure 3). La caractérisation par spectrométrie de masse démontre que les polypeptides à 42 et 47 kDa correspondent respectivement à l'actine cytoplasmique, la ga ma-énolase et 1 ' alpha-énolase . L'antigène majeur à 55kDa et de pi 8,2 correspond à la chaîne α de l'ATP synthase (Figures 4 et 5) . Ce résultat pour la chaîne α est confirmé par l'utilisation d'un anticorps polyclonal dirigé contre cette protéine (Figure 6) .
La chaîne α de l'ATP synthase est bien un nouveau constituant de la DNF, dans la mesure où un anticorps polyclonal dirigé contre la chaîne α de l'ATP synthase recombinante reconnaît bien les neurones humains en DNF (Figure 8), à l'échelle de la microscopie optique et électronique .
La chaîne α de l'ATP synthase n'est pas associée indirectement et secondairement à la DNF, mais liée directement au processus dégénératif. En effet, l'étude de la distribution de la chaîne α de l'ATP synthase dans les différentes fractions protéiques de tissu cérébral de témoins et de patients Alzheimer démontre que la disparition de la chaîne α de l'ATP synthase intervient progressivement au cours de l'installation du processus de DNF (Figures 6 et 7) . Alors que la chaîne α de l'ATP synthase (Figures 6 et 7, composante A) détectée par l'anticorps monoclonal AD46 est observée essentiellement dans les fractions Triton 0,5 % et 2 % d'homogénats cérébraux de témoins, elle est absente de la fraction Triton 0,5 % d'homogénats cérébraux de patients Alzheimer au stade infraclinique et absente des fractions 0,5 % et 2% Triton des fractions protéiques d'homogénats de patients Alzheimer (Figure 6) . De la même manière, l'utilisation de l'anticorps polyclonal dirigé contre la chaîne α de l'ATP synthase montre également un déplacement de la solubilité de cette protéine dans des fractions plus insolubles (fractions SDS 0,1 et 1%, Figure 7). L' insolubilisation de la chaîne α de l'ATP synthase suit l'agrégation des protéines tau, comme le montrent les co- marquages la chaîne α de l'ATP synthase / tau (Figure 7) . Cette disparition de la chaîne α de l'ATP synthase est observée spécifiquement dans les régions cérébrales affectées par la dégénérescence neurofibrillaire de patients au stade infraclinique (stades 4 à 7 de Delacourte et al . , 1999) (Figure 6) . Elle est observée dans toutes les régions cérébrales des patients à un stade avancé de la maladie (stades 8 à 10 de Delacourte et al . , 1999) (Figures 6 et 7). De plus, il y a co-immunoprécipitation des protéines tau agrégées et la chaîne α de l'ATP synthase et vice-versa, démontrant l'implication directe de la chaîne α de l'ATP synthase dans le processus agrégatif des protéines tau (Figure 8) . La purification des protéines tau agrégées permet également de co-purifier la chaîne α de l'ATP synthase (Figure 8)
La fonction biologique de la chaîne α de l'ATP synthase indique que le processus de dégénérescence neurofibrillaire au cours de la maladie d'Alzheimer est lié, au moins en partie, à une localisation singulière et une accumulation de la protéine dans le cytoplasme des neurones en dégénérescence neurofibrillaire. Indirectement, la localisation de la chaîne α de l'ATP synthase pourrait altérer le processus d'oxydo- phosphorylation de la chaîne respiratoire de la mitochondrie, ou initier un processus de dégénérescence.
La chaîne α de l'ATP synthase est également associée à d'autres fonctions biologiques. Il pourrait s'agir d'un récepteur me branaire pour des cytokines, telle que 1 ' angiostatine ou le polypeptide II activateur des cellules endothéliales et des monocytes. Elle est également décrite dans plusieurs compartiments cellulaires, telle que la membrane plasmique, les peroxisomes . Il pourrait également s'agir d'une protéine chaperonne. L'association de la chaîne α de l'ATP synthase aux agrégats de protéines tau pourrait altérer une ou plusieurs des fonctions biologiques de la chaîne α de l'ATP synthase. L' invention vise donc de nouveaux marqueurs du processus neurodégénératif, constitués par la chaîne α de l'ATP synthase ayant subi des modifications pathologiques résultant dudit processus .
Elle vise plus particulièrement l'utilisation de la chaîne α de l'ATP synthase ayant subi des modifications pathologiques résultant d'un processus neurodégénératif comme marqueur des maladies neurodégénératives, dont les tauopathies.
En particulier, ces marqueurs sont caractérisés en ce que les modifications de la chaîne α de l'ATP synthase sont de type fonctionnels, de localisation, structurels et/ou antigéniques. Ces marqueurs sont particulièrement adaptés pour la détection du processus neurodégénératif de toute pathologie avec un processus de dégénérescence neurofibrillaire et d' aggrégation de la protéine tau, plus particulièrement, le processus neurodégénératif de la maladie d'Alzheimer.
Les modifications fonctionnelles, de localisation, structurelles de la chaîne α de l'ATP synthase présentées par les marqueurs selon l'invention peuvent être en particulier, respectivement, son insolubilité, sa localisation dans le cytoplasme de la cellule et/ou la formation d'agrégats au niveau du cerveau. Ces modifications peuvent être également de type conformationnel et/ou post-traductionnel, y compris de maturation.
Par « localisation dans le cytoplasme », on exclut en particulier la localisation intra-ribosomale.
La formation d'agrégat concerne la chaîne alpha de l'ATP synthase seule, ou en interaction avec les protéines tau, pour induire la tauopathie, c'est-à-dire l'agrégation des protéines tau.
La découverte de ces nouveaux marqueurs, liés directement au processus dégénératif de la maladie d'Alzheimer, ouvre des perspectives diagnostiques et thérapeutiques de grand intérêt. L'invention vise donc également une méthode de détection et/ou de diagnostic in vitro du processus neurodégénératif, caractérisée en ce qu'on détecte dans un échantillon à analyser un des marqueurs selon l'invention. La méthode comprend avantageusement l'utilisation de jeux d'anticorps dirigés contre la protéine normale et/ou contre des modifications de la chaîne α de l'ATP synthase.
La méthode selon l'invention est particulièrement adaptée à la détection du processus dégénératif de la maladie d 'Alzheimer.
Les techniques utilisées dans une telle méthode sont variées : détection immuno-chimique, en particulier par électrophorêse 1D et/ou 2D couplée à une immunoempreinte, révélation par des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne α de l'ATP synthase, immuno-essai et/ou radioimmuno-essai .
La capture de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique pourra être suivie par une analyse complémentaire par spectrométrie de masse : on effectue alors une immunocapture de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique et on analyse les produits capturés par spectrométrie de masse.
Inversement, et en complément, il est possible de réaliser 1 ' immunocapture des protéines tau pathologiques puis de rechercher et d'identifier tout ou partie de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique associée aux protéines tau, par spectrométrie de masse.
Tout type d'échantillons à analyser peuvent être utilisés : tissus ou des cellules neuronales, tissus ou des cellules non neuronales, en particulier des liquides biologiques, de préférence le sang.
La méthode de diagnostic selon l'invention peut comporter en outre un étape d'évaluation du degré de la pathologie en établissant un indice basé sur le rapport entre le taux normal de chaînes α de l'ATP synthase chez des témoins dans une fraction protéique définie, par rapport au taux observé au stade avancé de la maladie d'Alzheimer.
De manière alternative, le degré de la pathologie peut être évalué en établissant un indice basé sur les modifications de la chaîne α de l'ATP synthase chez un patient par rapport à un témoin.
La détection de modifications fonctionnelles et/ou de localisation et/ou structurales et/ou antigéniques de la chaîne α de l'ATP synthase dans les liquides biologiques périphériques et/ou dans le tissu cérébral et/ou dans des tissu périphériques permet de réaliser un test diagnostique précoce. En particulier, la mort neuronale qui survient au cours de la maladie d'Alzheimer provoque une libération de protéines tau dans le liquide céphalorachidien (LCR) . La présence de la chaîne α de l'ATP synthase dans les liquides biologiques, dont l'association aux protéines tau a été démontrée, peut donc compléter le diagnostic biologique d'une manière avantageuse. L'invention permet une approche diagnostique nouvelle des pathologies neurodégénératives, en particulier de la maladie d'Alzheimer. La chaîne α de l'ATP synthase étant observée précocement, parfois avant l'agrégation des protéines tau, sa détection dans les liquides biologiques, et en particulier le LCR, est un marqueur de choix, utilisable à des fins de diagnostic précoce ou de détermination de facteur de risque.
L'invention propose également une méthode d'évaluation de l'interaction pathologique de la chaîne α de l'ATP synthase avec les protéines tau, et réciproquement, utilisant des techniques appropriées comme par exemple le bio-sensor, l'ELISA, les immunoprécipitations, la spectrométrie de masse. Cette méthode permet de définir un indice de transformation pathologique de la chaîne α de l'ATP synthase et/ou de la protéine tau. Elle vise également les kits pour la mise en œuvre de ladite méthode d'évaluation.
Les méthodes de détection, de diagnostic ou d'évaluation selon l'invention peuvent avantageusement être utilisées pour établir un diagnostic an te et post-mortem des maladies neurodégénératives, en particulier de la maladie d'Alzheimer, du stade infraclinique (« mild cognitive impairment ») au stade clinique, pour réaliser un criblage pharmacologique et des essais thérapeutiques de molécules efficaces contre les pathologies neurodégénératives, en particulier de type tauopatie ou maladie d'Alzheimer, et/ou pour établir et valider des modèles cellulaires et/ou des modèles animaux de pathologies neurodégénératives, en particulier de type tauopathie ou maladie d'Alzheimer.
L'invention couvre également 'tout modèle animal ou cellulaire, caractérisé en ce qu'il exprime une chaîne α de l'ATP synthase présentant un défaut de signal de maturation ou une modification post-traductionnelle liée au processus dégénératif.
Il s'agit, par exemple, de modèles (animaux ou cellulaires) exprimant la chaîne α de l'ATP synthase dans le cytoplasme de cellules, c'est-à-dire en éliminant les 47 premiers acides aminés qui constituent le signal de maturation de la chaîne α de l'ATP synthase pour son intégration au complexe V de la chaîne respiratoire de la mitochondrie. Ces modèles devraient ainsi reproduire l'accumulation de la chaîne α de l'ATP synthase dans le cytoplasme.
Il s'agit en particulier de rechercher la délocalisation de la chaîne α de l'ATP synthase dans un système reconstitué, appelé « cybrid » (Sheehan et al . , 1997). Ce système consiste à évaluer le fonctionnement des mitochondries obtenues des plaquettes sanguines de patients atteints de la maladie d'Alzheimer dans un système cellulaire reconstitué. L'adressage de la chaîne α de l'ATP synthase dans ce système peut être évalué et un index d'adressage défini (la valeur 100 correspondant à des sujets normaux, la valeur 0 à des patients atteints de la maladie d'Alzheimer) .
L'invention vise également l'application thérapeutique, dans la mesure où la chaîne α de l'ATP synthase est une cible pharmacologique précise, qui peut être modulée par action d'inhibiteurs et d' activateurs spécifiques, de la protéine elle-même et/ou de ses ligands, et/ou du complexe V de la chaîne respiratoire de la mitochondrie en général. En effet, son action porte directement sur le processus de dégénérescence neurofibrillaire, et peut également porter sur le métabolisme de 1 'APP .
L'utilisation d'un kit de détection de la chaîne α de l'ATP synthase, pour le diagnostic de maladie neurodégénératives, en particulier pour la détection de la maladie d'Alzheimer, entre également dans le champ de 1' invention.
L'invention propose enfin un kit de diagnostic comprenant des jeux d'anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux dirigés contre des motifs de conformation pathologique de la chaîne α de l'ATP synthase résultant d'un processus neurodégénératif. Elle couvre également lesdits anticorps. De manière avantageuse, ledit kit renferme des réactifs permettant la réalisation d'un dosage immunochimique, en particulier de type ELISA, immuno-empreintes, Western blots, dots-blots, radioimmuno-essai ou immuno-essai . Un dosage complémentaire par spectrométrie de masse est également possible, afin de détecter sans ambiguïté les altérations de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique.
L'exemple 3 ci-après propose également une méthode de préparation d'outils immunologiques contre la chaîne alpha de l'ATP synthase comportant les étapes suivantes : extraction sélective de la dégénérescence neurofibrillaire à partir de tissu humain affecté d'un processus neurodégénératif, extraction de la chaîne α de l'ATP synthase pathologique , utilisation de la chaîne α de l'ATP synthase purifiée comme antigène pour la production d'anticorps polyclonaux.
Pour la production d'anticorps monoclonaux, les clones retenus possèdent de préférence les propriétés immunologiques suivantes :
Détection des processus neurodégénératifs de type Alzheimer par immunohistochimie
Détection de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique
Co-immunoprécipitation des protéines tau pathologiques
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, avec références aux figures 1 à 11 : les figures 1 et 2 illustrent 1 ' immunodétection de la dégénérescence neurofibrillaire de type Alzheimer par l'anticorps AD46, à l'échelle de la microscopie optique et électronique. les figures 3, 4 et 5 sont relatives a la caractérisation des protéines détectées par AD46, par électrophorèse monodimensionnelle (fig. 3 ; 1D) , puis par électrophorèse bi-dimensionnelle (fig. 3 ; 2D) , par analyse par spectrométrie de masse du spot détecté par AD46 (fig. 4), et enfin par comparaison en gel 2D de l' immunodétection de AD46 par rapport à un anticorps dirigé contre la protéine identifiée, à savoir de la chaîne α de l'ATP synthase (fig. 5). les figures 6 et 7 montrent l' insolubilisation de la chaîne α de l'ATP synthase ; celle-ci disparaît des fractions Triton au cours de l' Alzheimérisation. la figure 8 illustre l'interaction de la chaîne α de l'ATP synthase avec la protéine tau ; elle est extraite et immuno-précipitée avec la protéine tau.
La figure 9 illustre un immunomarquage similaire de la dégénérescence neurofribrillaire, sur coupe de tissu
Alzheimer, avec un anticorps anti-tau (AD2), AD46, et un anti-chaîne α de l'ATP synthase.
Les figures 10 et 11 sont relatives à la spécificité de la détection de la dégénérescence neurofibrillaire.
Exemple 1 : Mise en évidence de 1 ' i implication de la chaîne α de l 'ATP synthase dans la maladie d'Alzhe±mer (MA) .
A. Matériel et méthodes
An ticorps monoclonal AD46
L'anticorps monoclonal AD46 a été obtenu à l'aide d'un kit d'immunisation in vitro (Immune System, Bristol, UK) à partir de la substance la plus insoluble en acide formique du tissu cérébral d'un patient atteint de la maladie d'Alzheimer. L' immunogène a été préparé suivant la méthode décrite par Permanne et al . , 1995. Le kit d'immunisation in vi tro a été utilisé suivant les recommandations du constructeur. La sélection du clone a été réalisée par immunohistochimie sur des coupes de tissu cérébral de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Immunohistochimie et microscopie électronique
L' immunohistochimie est réalisée à partir de tissu cérébral humain fixé et congelé. Les coupes de 15μm sont laissées à décongeler pendant 15 min. L'activité peroxydase endogène est neutralisée par un traitement à l'eau oxygénée (solution à 1 %) suivi de plusieurs rinçages dans l'eau. Les coupes sont ensuite équilibrées dans le tampon d'incubation de l'anticorps (PBS, Sigma). L'anticorps est utilisé à une dilution finale de 1/1000 dans le PBS et l'incubation sur la coupe est effectuée 2 heures à température ambiante. Après plusieurs rinçages dans le tampon d'incubation, la coupe est incubée avec l'anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Horseraddich peroxidase conjugate anti-mouse antibodies, Sigma) . Les complexes sont révélés avec un kit de révélation (Fas-tDAB, Sigma) suivant les instructions du constructeur. Le protocole de microscopie électronique est identique à celui décrit par Reig et al . , 1995.
Préparation des échantillons de tissu cérébral humain Les échantillons de tissu cérébral, obtenus après autopsie ou biopsie et conservés à -80°C, ont été disséqués en se référant à un atlas anatomique, puis homogénéisés à l'aide d'un potter en Téflon® dans 10 volumes de tampon de lyse 1-D (50 mM Tris- HC1 pH 6,8 ; 4mM EDTA ; 5 % (p/v) de SDS, 10 % (v/v) de glycérol, 2 % (v/v) de β-mercaptoéthanol et 0,05 % Bleu de Bromophénol) . Les échantillons ont été portés à 100 °C pendant 10 minutes et conservés à -80°C jusqu'à leur utilisation.
Fractionnement des protéines du tissu cérébral humain Les échantillons de tissu cérébral ont été homogénéisés selon un ratio 1/10 (p/v) dans du tampon Tris 10 mM pH 6,8 puis centrifugés à 100 000 g pendant 1 heure à 4°C. Le surnageant (SI) a été conservé et le culot homogénéisé à nouveau dans le même tampon complémenté avec 0,5 % de Triton X-100. Une étape supplémentaire de centrifugation a été effectuée dans les mêmes conditions. Au total, six centrifugations ont ainsi été réalisées après addition successive de 2 % de Triton X-100, 0,5 % de SDS, 1 % SDS et 2 % SDS .
Selon la technique biochimique utilisée, sont ajoutés aux surnageants, au moment de l'utilisation, les tampons correspondants : 1 volume de tampon de lyse 1-D (100 mM Tris- HCl pH 6,8 ; 8mM EDTA ; 10 % (p/v) de SDS ; 20 % (v/v) de glycérol ; 4 % (v/v) de β-mercaptoéthanol et 0,1 % Bleu de Bromophénol) pour une étude par électrophorèse mono- dimensionnelle ou 1 volume de tampon de lyse 2-D (7M urée ; 2M thiourée ; 4 % Pharmalytes® 3-10 (p/v) ; 4% (v/v) Triton X- 100 ; 20 mM de dithiothréitol) pour une étude par électrophorèse bidimensionnelle.
Purification des agrégats de protéines tau des neurones en dégénérescence
Le mode expérimental utilisé est celui décrit par Greenberg et Davies, 1990 et modifié par Goedert et al., 1992. Le tissu cérébral est homogénéisé à l'aide d'un potter en Téflon dans une solution contenant 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 800 mM NaCl , ImM EGTA et 10% de sucrose . L ' homogénat est centrifugé à 20 000g pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant est récupéré, le culot est homogénéisé à nouveau suivant le même protocole. Après centrifugation suivant les mêmes paramètres précédemment cités, le surnageant est récupéré et mélangé au premier. L' homogénat est additionné de N-lauryl sarcosine à une concentration finale de 1% et il est placé en agitation douce pendant 1 heure à température ambiante. Après centrifugation à 100 000g pendant 1 heure, le culot contenant les agrégats de protéines tau est traité par 1 volume de tampon de lyse 1-D. Jmmunoprécipi tation
Le tissu cérébral est homogénéisé à l'aide d'un potter en verre fritte dans 10 volumes d'une solution contenant 10 mM
Tris-HCl pH 7.4, 150 M NaCl. L' homogénat est centrifugé à 27
000g pendant 30 minutes à 4°C suivant la procédure décrite par
Vincent et Davies (1992) . Le surnageant et mélangé avec 10 μl de protéine A/G agarose . L ' homogénat est centrifugé à 2000g pendant 10 min à 4°C. Le surnageant et additionné de 10 μl d'anticorps anti chaîne α de l'ATP synthase, ou 5μl de l'anticorps AD46 ou 5μl de l'anticorps AD2 et il est agité pendant la nuit à 4°C. 10 μl de protéine A/G agarose sont ajouté à 1 ' homogénat et l'ensemble est en agitation pendant 30 min à 4°C. Une série de 3 lavages est effectuée. L ' homogénat est centrifugé à 2000g pendant 10 minutes à 4°C, 100 μl de tampon de départ sont ajoutés, l'ensemble est agité pendant 5 min à température ambiante et centrifugé à nouveau. L'étape est répétée deux fois. Les billes sont ensuite incubées avec
10 volumes de tampon de lyse 1-D et placées à 60 °C pendant 5 min. Le surnageant est utilisé pour les étapes ultérieures d' analyse.
Électrophorèse 1 -D ou SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfa te- polyacrylamide gel electrophoresis)
Les expériences ont été réalisées à l'aide du système Protean Xi Cell (Biorad) selon les instructions du fabricant. Les SDS- PAGE ont été réalisés selon les protocoles décrits par Laemmli (1970) pour la fabrication du gel. Il s'agit de gel en gradient de polyacrylamide compris entre 8 et 15%. 100 μg de protéines sont déposées dans chaque couloir.
Électrophorèse 2 -D
Ie dimension
La première dimension est effectuée suivant le protocole décrit par O'Farrell et al . , 1977. Le matériel utilisé pour 1' isoélectrofocalisation est le système IEF Protean Cell (Biorad) selon les instructions du constructeur. Le gel contient 9,5 M d'urée, 4 % de Triton X-100 et 4 % de Pharmalytes 3-10. La polymérisation est amorcée par l'addition de persulfate d'ammonium et de TEMED . Le gel est coulé dans des tubes de 20 cm et 2 mm de diamètre interne. 50 μl d' homogénat 2D sont déposés au côté anode du gel et l' isoélectrofocalisation est effectuée par l'application d'une tension de 400 volts pendant 6 heures.
2e dimension
Avant utilisation, les gels sont équilibrés pendant 30 minutes dans un tampon SDS-PAGE (50 mM Tris pH 6 , 8 ; 10 % de glycérol ; 2 % de β-mercaptoéthanol ; 2 % de SDS ; 0,05 % bleu de bromophénol) puis déposés sur "le haut d'un gel de séparation de SDS-PAGE en gradient de polyacrylamide 8-15 %.
Transfert sur membrane de ni trocellulose et Immunoempreinte
Le transfert a été effectué en utilisant le système de transfert semi-sec Pharmacia LKB multiphor® en suivant les instructions du fabricant (A ersham-Pharmacia Biotech) . Les protéines ont été transférées à 0,8 mA/cm2 sur une membrane de nitrocellulose Hybond® ECL (Pharmacia-Amersham) .
La membrane est incubée 60 minutes dans solution contenant 15 mM de Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 % de Tween®-20 et 5 % de lait écrémé puis lavée avec le même tampon exempt de lait et contenant 0,1 % de Tween-20 au lieu de 0,5 %.
La membrane est incubée, 2h à température ambiante ou 1 nuit à
4°C, avec l'anticorps monoclonal AD46 au l/2000ème final dans un tampon d'incubation (15 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1 % de Tween-20 et 4 % de lait écrémé) .
La membrane est lavée 3 fois pendant 10 minutes dans le tampon d'incubation exempt de lait. La membrane est ensuite incubée, lh à température ambiante, avec une immunoglobuline de chèvre anti-souris couplée à la peroxydase de raifort, à une dilution finale de l/4000ème (v/v) dans du tampon d'incubation exempt de lait. La membrane est lavée 3 fois dans du tampon d'incubation et les polypeptides immunoréactifs sont révélés à l'aide du kit de chimioluminescence ECL (Pharmacia-Amersham) selon les instructions du fabricant .
Spectrométrie de masse
Après électrophorèse 2D, une coloration du gel est effectuée. Le gel est fixé durant 30 minutes dans une solution contenant 10 % acide acétique, 50 % éthanol puis coloré dans la même solution contenant 0,5 % de Bleu de Coomassie R250. La décoloration est réalisée dans une 'solution contenant 30 % éthanol et 5 % d'acide acétique jusqu'à obtention d'un fond clair. Les tâches reconnues par l'anticorps monoclonal AD46 sont découpés dans le gel et traité suivant le protocole décrit par Andersen et Mann en 2000. La spectrométrie de masse est réalisée au centre commun de spectrométrie de masse de l'université de Lille 1.
B. Résultats
Immunohistochimie et microscopie électronique
AD2 est un anticorps anti-tau dirigé contre un double site de phosphorylation sur la protéine tau, et qui sert de référence pour étudier la dégénérescence neurofibrillaire dans la MA (Figure 1: AD2 , Alz) . L'anticorps monoclonal AD46 détecte les neurones en dégénérescence neurofibrillaire du tissu cérébral d'un patient Alzheimer (Figure 1: AD46, Alz) . Aucun marquage neuronal n'est observé dans le tissu cérébral d'un sujet témoin (Figure 1: AD2 et AD46, T) . À l'échelle de la microscopie électronique, les neurones en dégénérescence neurofibrillaire se caractérisent par une accumulation de filaments pathologiques. Ces filaments sont constitués de protéines tau agrégées et appelés PHF (pour Paired Helical Filament) . Ils sont également détectés étroitement et spécifiquement par l'anticorps AD46 (Figure 2). L'anticorps AD46 réagit donc avec un ou plusieurs constituants essentiels des filaments pathologiques des neurones en dégénérescence neurofibrillaire (Figure 2) .
Analyse biochimique des antigènes reconnus par l 'anticorps monoclonal AD46
L'anticorps monoclonal AD46 détecte 3 bandes après immuno- empreintes annotées A, B et C de masse moléculaire apparente de 55, 47 et 42 kDa (Figure 3A: couloir 1D) . Après électrophorèse 2D, 4 spots majeurs sont marqués (Figure 3: partie 2D) . Un seul spot correspond à A, de point isoélectrique de 8,2. Deux spots sont visualisés pour B, de points isoélectriques 5,0 et 7,0. Un seul spot est visualisé pour C de point isoélectrique 5,8 (Figure 3 : partie 2D) .
Caractérisation des antigènes reconnus par AD46
Chaque protéine reconnue par AD46 a été isolée par électrophorèse 2D. Une digestion enzymatique par la trypsine a été réalisée dans le gel et les fragments peptidiques récupérés ont été analysés par spectrométrie de masse. L'identification est résumée dans le tableau suivant.
Identité des protéines Organisme Réf. MM/pI MM/pI Id. theo. obs.
C: Actine cytoplasmiqυe Humain P02570 41.6/5.29 42/5.5 MPF/WB
B: γ-énolase (EC 4.2.1.11) Humain P09104 47.1/4.94 47/5.0 MPF/WB
B: α-énolase (EC 4.2.1.11) Humain P06733 47.0/6.99 47/7.0 MPF
A: ATP synthase α-chaîne (EC Humain P25705 55.2/8.28 55/8.2 MPF/WB 3.6.1.34)
Id. : Identité des protéines confirmées par spectrométrie de masse (MPF) et immunoempreinte (WB) . Réf. : référence des protéines suivant la nomenclature du site htt : / /www . expasy . ch/ .
Les masses moléculaires des fragments de chaque protéine sont utilisées pour interroger les banques de données de l' Internet :
(MS-FIT: http: //falcon. ludwig.ucl . ac .uk/ucsfhtm!3 ,2/msf it .htm) Les résultats d'identification ainsi que le score d'identification sont résumés dans le tableau (Figure 4). Ainsi, la protéine A correspond à la chaîne α de l'ATP synthase, les protéines B sont respectivement la gamma énolase et l'alpha énolase et, la protéine C correspond à l'actine cytoplasmique . Il n'existe pas de similarité de séquence entre ces protéines. Notons cependant que l'anticorps monoclonal AD46 présente la plus forte affinité pour la protéine de 55 kDa, la chaîne α de l'ATP synthase.
Validation de la caractérisation de la protéine de 55 kDa en tant que chaîne α de 1 'ATP synthase
Un anticorps polyclonal dirigé contre la chaîne α de l'ATP synthase a été utilisé après électrophorèse 2D (Figure 5: Polyclonal) . La chaîne α de l'ATP synthase est détectée à une masse moléculaire (MM) apparente de 55 kDa et un point isoélectrique de 8,2. L'anticorps AD46 reconnaît également la même protéine ; il s'agit bien de la chaîne α de l'ATP synthase (Figure 5: AD46) .
Changement de solubilité de la chaîne α de l'ATP synthase dans la MA
Les protéines du tissu cérébral ont été dissociées suivant un gradient de solubilité croissant (cf. matériel et méthodes). Les protéines les plus solubles sont dans la fraction Tris (Figure 6: 2e couloir des immuno-empreintes) et les protéines de moins en moins solubles sont récupérées à l'aide de détergent comme le Triton X-100 (3e et 4e couloir des immuno- empreintes (Figure 6) . Les protéines B et C ne sont pas modifiées dans la MA (immuno-empreintes Témoin, Alzheimer infraclinique, Alzheimer confirmé, Flèches B et C) . À l'inverse, la protéine A disparaît de la fraction 0,5 % Triton X-100 au stade infraclinique de la MA et dans les fractions 0,5 % et 2% Triton-XlOO chez des Alzheimer confirmés (immuno- empreintes Alzheimer infraclinique et Alzheimer confirmé, flèche A) (Figure 6) . Il y a donc une perte précoce de la solubilité de la chaîne α de l'ATP synthase dans la MA.
Confirmation de la di spari tion et du changement de solubili té de la chaîne α de 1 'ATP synthase dans la MA
Suivant la même méthodologie que sur la figure 6, la chaîne α de l'ATP synthase est détectée à l'aide d'un anticorps polyclonal dirigé contre la chaîne α de l'ATP synthase (figure 7 : indiquée par une flèche : A (55 kDa) ) . Dans les ho ogénats totaux de tissu cérébral d'un sujet témoin et d'un patient Alzheimer, la chaîne α de l'ATP synthase est détectée à 55 kDa de masse moléculaire apparente. Elle est totalement absente dans les fractions protéiques Tris et SDS 2 %. Elle est détectée dans les fractions 0,5 et 2 % Triton et dans la fraction SDS 0,1 % mais pas dans la fraction SDS 1 %, du sujet témoin. Dans les fractions protéiques du patient Alzheimer, elle est absente la fraction 0,5 % Triton, faiblement détectée dans la fraction 2 % Triton, et détectée dans les fractions 0,1 et 1 % SDS. En conclusion, il y a une diminution de la quantité et une insolubilisation de la chaîne α de l'ATP synthase dans la MA.
Association des modifications des propriétés biochimiques de la chaîne α de l 'ATP synthase avec le processus de dégénérescence neurof ibrillaire
Ces changements de propriétés biochimiques sont associés au processus de dégénérescence neurofibrillaire de la MA. En effet, un co-marquage avec l'anticorps monoclonal AD2 a été réalisé sur la même expérience. Les protéines tau pathologiques (Figure 7: notées Tau 60, 64, 69) sont détectées uniquement dans les fractions du patient Alzheimer et pas du tout dans les fractions du sujet témoin (Figure 7) . Notons qu'en dehors de 1 ' homogénat total, la fraction protéique qui contient la plus grande quantité de protéine tau pathologiques correspond à la fraction 1% SDS (Figure 7) . Cette fraction correspond également à celle où la chaîne α de l'ATP synthase est retrouvée dans la MA et pas chez le témoin. Il existe donc une relation entre le changement de solubilité de la chaîne α de l'ATP synthase et la présence de protéines tau pathologiques qui sont la signature biochimique de la dégénérescence neurofibrillaire dans la MA.
Copurification de la chaîne α de 1 'ATP synthase avec les agrégats de protéines tau et co-immunoprécipi tation des protéines agrégées avec la chaîne α de 1 'ATP synthase Les protéines tau agrégées sont purifiées dans la fraction sarcosyl insoluble et pas du tout les protéines tau de l'individu témoin (Figure 8A: Fraction 100K P, Témoin et Alz) . L'anticorps polyclonal dirigé contre la chaîne α de l'ATP synthase détecte la chaîne α de l'ATP synthase dans la fraction sarcosyl insoluble du patient Alzheimer uniquement (Figure 8A: Fraction 100K P, marquage polyclonal anti-chaîne α de l'ATP synthase) . Ce résultat démontre la copurification de la chaîne α de l'ATP synthase avec les agrégats de protéines tau des neurones en dégénérescence neurofibrillaire et donc l'association direct de la chaîne α de l'ATP synthase dans le processus agrégatif des protéines tau.
Ce résultat est conforté par les expériences d' immunoprécipitation (Figure 8B) . L ' immunoprécipitation de la chaîne α de l'ATP synthase à l'aide de l'anticorps AD46 ou du polyclonal anti-chaîne α de l'ATP synthase révèle la présence de protéines tau hyperphosphorylées, qui sont mises en évidence par un marquage avec l'anticorps monoclonal AD2 ou un polyclonal dirigé contre la région carboxy-terminale de la protéine tau (Figure 8B : les deux couloirs Alz) . Notons que les protéines tau du tissu cérébral d'un individu témoin ne sont pas visualisées suivant la même procédure expérimentale (Figure 8B: les deux couloirs Témoins) . Cela démontre la spécificité de l'association de la chaîne α de l'ATP synthase aux protéines anormalement phosphorylées , constituant de base des agrégats, et pas du tout avec les protéines tau normales. L'association de la chaîne α de l'ATP synthase avec les protéines tau agrégées est donc à relier directement au processus physiopathologique et non une affinité intrinsèque de la chaîne α de l'ATP synthase pour les protéines tau.
Confirmation de 1 ' implication de la chaîne α de l 'ATP synthase dans le processus de dégénérescence neurof ibrillaire dans la MA
Les neurones en dégénérescence neurofibrillaire sont détectés par les anticorps monoclonaux AD2 et AD46 sur du tissu cérébral de patient MA. Le tissu cérébral humain normal n'est pas marqué par l'anticorps AD46. Un anticorps polyclonal dirigé contre la chaîne α de l'ATP synthase détecte les neurones en dégénérescence neurofibrillaire du tissu cérébral de patient MA (Figure 9). À l'inverse, des anticorps dirigés contre les énolases ou l'actine cytoplasmique ne permettent pas une détection sélective des neurones en dégénérescence neurofibrillaire dans la MA.
Les résultats ci-dessus montrent l'existence d'une accumulation spécifique de la chaîne α de l'ATP synthase, associée à des changements précoces des propriétés biochimiques de cette protéine dans la maladie d'Alzheimer est ici démontrée. La chaîne α de l'ATP synthase est donc directement impliquée dans le processus de dégénérescence neurofibrillaire dans la MA, et elle constitue de ce fait une nouvelle cible diagnostique et thérapeutique.
Exemple 2 : détection de la dégénérescence neurof ibrillaire
I. La détection de la dégénérescence neurofibrillaire est effectuée à l'aide d'anticorps dirigés contre la chaîne alpha de 1 'ATP-synthase et par immunomarquage avec des anticorps dirigés contre d'autres protéines du complexe V de la mitochondrie .
Des coupes sériées du cortex temporal d'un patient atteint de la maladie d'Alzheimer ont été utilisées pour réaliser l'analyse immunohistochimique . Les neurones en dégénérescence neurofibrillaire sont indiqués par des flèches.
La figure 10 présente les expériences suivantes :
(A) Détection de la dégénérescence neurofibrillaire à l'aide de l'anticorps monoclonal AD2 , dirigé contre les protéines tau phosphorylées .
Chaîne alpha de l'ATP synthase:
(B) Détection de la dégénérescence neurofibrillaire à l'aide de l'anticorps monoclonal AD46. (C) Détection de la dégénérescence neurofibrillaire à l'aide d'un anticorps polyclonal dirigé contre la partie amino- terminale de la chaîne alpha de l'ATP synthase. L'anticorps polyclonal utilisé a été préparé à partir du peptide suivant
(SEQ ID N°l) correspondant à la région amino-terminale de la chaîne alpha de l'ATP synthase qui débute à l'acide aminé 45 et se termine à l'acide aminé 58 : CKTGTAEMSSILEER
(D) Détection de la dégénérescence neurofibrillaire à l'aide d'un anticorps polyclonal dirigé contre la partie carboxy- terminale de la chaîne alpha de l'ATP synthase. L'anticorps polyclonal utilisé a été préparé à partir du peptide suivant
(SEQ ID N°2) correspondant à la région carboxy-terminale de la chaîne alpha de l'ATP synthase qui débute à l'acide aminé 540 et se termine au dernier acide aminé 553 : CLKEIVTNFLAGFEA
Les peptides des expériences C et D ont été synthétisés par la société Neosystem (Strasbourg, France) et additionnés d'une cystéine (C) à leur extrémité amino-terminale pour permettre le couplage au carrier qui est 1 ' ovalbumine . Les anticorps polyclonaux ont ensuite été réalisés par la société Neosystem, chez le lapin.
Autres protéines du complexe V de la mitochondrie:
(E) Immunomarquage réalisé à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre la chaîne bêta de l'ATP synthase.
(F) Immunomarquage réalisé à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'OSCP (Oligomycin Sensitivity-Conferring Protein) . Les anticorps monoclonaux des expériences E et F ont ete obtenus de la société Molecular Probes (Leiden, Netherlands) .
Résultats :
Cette figure montre la spécificité de l'association de la chaîne alpha de l'ATP synthase avec le processus de dégénérescence neurofibrillaire .
En effet, deux anticorps polyclonaux dirigés contre l'extrémité amino- et l'extémité carboxy-terminale de la chaîne alpha de l'ATP synthase ont été réalisés. Ces deux anticorps marquent les neurones en dégénérescence neurofibrillaire (DNF) dans le tissu cérébral d'un patient atteint de la maladie d'Alzheimer. Le marquage est tout à fait superposable à celui obtenu avec l'anticorps AD46 décrit dans l'exemple 1.
A l'inverse, l'utilisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre d'autres protéines du complexe V de la mitochondrie, complexe auquel la chaîne alpha appartient également, ne marquent pas les neurones en DNF. Ce résultat montre donc la spécificité de l'association de la chaîne alpha de l'ATP synthase au processus de DNF dans la maladie d'Alzheimer.
II. La détection de la dégénérescence neurofibrillaire a également été réalisée à l'aide d'un anticorps anti-chaîne alpha de l'ATP synthase commercialisé . Par ailleurs, les anticorps selon l'invention ont été testé afin de mettre en évidence leur capacité à détecter la dégénérescence neurofibri .llaire dans d'autres maladies neurodégénératives.
La figure 11 présente les expériences suivantes
Chaîne alpha de l'ATP synthase: (A) Détection de la dégénérescence neurofibrillaire à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre la chaîne alpha de l'ATP synthase (Molecular Probes, Leiden, Netherlands).
Autres maladies neurodégénératives:
(B) Détection de la dégénérescence neurofibrillaire dans le cortex frontal d'un patient atteint de la maladie de Pick à l'aide de l'anticorps monoclonal AD46. Les corps de Pick qui sont les structures neuropathologiques intraneuronales caractéristiques de cette pathologie sont indiqués par des flèches .
(C) Détection de la dégénérescence neurofibrillaire dans le cortex frontal d'un patient atteint du syndrome de Down (Trisomie 21) à l'aide de l'anticorps monoclonal AD46. Les neurones en dégénérescence neurofibrillaire sont indiqués par des flèches.
Résultat :
Cette dernière figure montre que l'anticorps monoclonal AD46 détecte également les neurones en DNF d'autres maladies neurodégénératives. La maladie de Pick et la Trisomie 21 est montrée en exemple. La chaîne alpha de l'ATP synthase est donc également impliqué dans le processus de DNF du à d'autres maladie neurodégénératives.
Exempl e 3 : Méthode de préparation d' outils immunologiques contre la chaîne alpha de l 'ATP synthase pathologique, en particulier contre les épitopes pathologiques.
La méthode peut comporter les étapes suivantes : Extraction sélective de la dégénérescence neurofibrillaire à partir de tissu humain affecté par le processus dégénératif de type Alzheimer, en utilisant des tampons de solubilisation de plus en plus puissant (tris, triton, SDS, sarkosyl, acide formique) .
Extraction de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique liée aux protéines tau de la dégénérescence neurofibrillaire par une approche immunologique et biochimique (par exemple, immunoprécipitation de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique par un anticorps polyclonal ou par AD46, puis purification de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique du produit immunoprécipité par électrophorèse, HPLC, ou toute autre méthode appropriée)
Utilisation de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique purifiée comme antigène pour la production d'outils immunologiques polyclonaux ou monoclonaux. Utilisation de la molécule complète comme épitope ou digestion ménagée de la chaîne alpha l'ATP synthase pathologique purifiée, détermination de l' épitope pathologique par immunopurification à l'aide de l'anticorps AD46 et utilisation de l' épitope pour la production d'anticorps polyclonaux, ou monoclonaux.
- Pour la production d'anticorps monoclonaux, sélection des hybridomes obtenus pour les dosages spécifiques des épitopes normaux et pathologiques de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique.
Idéalement, les clones retenus doivent posséder les propriétés immunologiques suivantes:
1. Détection des processus neurodégénératifs de type Alzheimer par immunohistochimie 2. Détection de la chaîne alpha de l'ATP synthase pathologique
3. Co-immunoprécipitation des protéines tau pathologiques
Références
Andersen JS, Mann M (2000) Functional genomics by mass spectrometry. FEBS Letters 480, 25-31. Delacourte A, David JP, Sergeant N, Buée L, attez A,
Vermersch P, et al. (1999) The biochemical pathway of neurofibrillary degeneration in aging and Alzheimer 's disease. Neurology, 52, 1158-65. Greenberg, S. G. and P. Davies (1990) . "A préparation of
Alzheimer paired helical filaments that displays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis . " Proc
Natl Acad Sci U S A 87(15) : 5827-31. Goedert, M., M. G. Spillantini, N. J. Cairns and R. A.
Crowther (1992) . "Tau proteins of Alzheimer paired helical filaments: abnormal phosphorylation of ail six brain isoforms." Neuron 8(1): 159-68. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,
680-5. O'Farrell, PZ, Goodman HM, et al . (1977a). "High resolution two-dimensional electrophoresis of basic as well as acidic proteins." Cell 12(4), 1133-41. O'Farrell, P. H. and P. Z. O'Farrell (1977b). "Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoretic fractionation. " Methods
Cell Biol 16, 407-20. Permanne B, Buée L, David JP, Fallet-Bianco C, Di Menza C,
Delacourte A (1995) Quantitation of Alzheimer' s amyloid peptide and identification of related amyloid proteins by dot-blot immunoassay. Brain Res, 685, 154-62. Reig S, Buee-Scherrer V, Mourton-Gilles C, Defossez A,
Delacourte A, Beauvillain JC, et al. (1995) Immunogold labelling of paired helical filaments and amyloid fibrils by spécifie monoclonal and polyclonal antibodies. Acta
Neuropathol , 90, 441-7. Vincent, I. J. and P. Davies (1992). "A protein kinase associated with paired helical filaments in Alzheimer disease." Proc Natl Acad Sci U S A 89(7): 2878-82.

Claims

REVENDICATIONS
1. Marqueurs du processus neurodégénératif, constitués par la chaîne α de l'ATP synthase ayant subi des modifications pathologiques résultant dudit processus.
2. Marqueurs selon la revendication 1, caractérisés en ce que les modifications de la chaîne α de l'ATP synthase sont de type fonctionnelles, de localisation, structurelles et/ou antigéniques .
3. Marqueurs selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce_ que le processus neurodégénératif est celui de toute pathologie avec un processus de dégénérescence neurofibrillaire et d'agrégation de protéines tau, en particulier, celui de la maladie d'Alzheimer.
4. Marqueurs selon la revendication 3, caractérisés en ce que l'une des modifications fonctionnelles de la chaîne α de l'ATP synthase est son insolubilité.
5. Marqueurs selon la revendication 3 et/ou 4, caractérisés en ce que l'une des modifications de localisation de la chaîne α de l'ATP synthase est sa localisation dans le cytoplasme de la cellule.
6. Marqueurs selon la revendication 3, caractérisés en ce que l'une des modifications structurelles de la chaîne α de l'ATP synthase est la formation d'agrégats au niveau du cerveau.
7. Marqueurs selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils interagissent avec les protéines tau.
8. Méthode de détection et/ou de diagnostic in vitro du processus neurodégénératif, caractérisée en ce qu'on détecte dans un échantillon à analyser un des marqueurs selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend l'utilisation de jeux d'anticorps dirigés contre la protéine normale et/ou contre des modifications de la chaîne α de l'ATP synthase.
10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9 , caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la détection du processus dégénératif de toute pathologie avec un processus de dégénérescence neurofibrillaire et d'agrégation de protéines tau, en particulier celui de la maladie d'Alzheimer.
11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'on utilise une détection immuno- chimique, en particulier par électrophorèse ID et/ou 2D couplée à une immunoempreinte, révélation par des anticorps polyclonaux ou des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne α de l'ATP synthase, immuno-essai et/ou radioimmuno- essai, éventuellement complétée par une analyse de spectrométrie de masse.
12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que les échantillons à analyser utilisés dans ladite méthode comprennent des tissus ou des cellules neuronales, des tissus ou des cellules non neuronales, en particulier des liquides biologiques, de préférence le sang.
13. Méthode de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, caractérisée en ce qu'on évalue en outre le degré de la pathologie en établissant un indice basé sur le rapport entre le taux normal de chaînes α de l'ATP synthase chez des témoins dans une fraction protéique définie, par rapport au taux observé au stade avancé de la maladie d'Alzheimer.
14. Méthode de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 8 à 13, caractérisée en ce qu'on évalue en outre le degré de la pathologie en établissant un indice basé sur les modifications de la chaîne α de l'ATP synthase chez un patient par rapport à un témoin.
15. Applications de la méthode selon les revendications 8 à 14, pour l'aide au diagnostic ante et post -mortem des maladies neurodégénératives, en particulier la maladie d'Alzheimer, du stade infraclinique au stade clinique.
16. Modèle animal ou cellulaire, caractérisé en ce qu'il exprime une chaîne α de l'ATP synthase présentant un défaut de signal de maturation et/ou une anomalie de modification post- traductionnelle .
17. Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 14 ou du modèle selon la revendication 16, pour le criblage pharmacologique et les essais thérapeutiques de molécules efficaces contre les pathologies neurodégénératives, en particulier de type Alzheimer.
18. Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, pour établir et valider des modèles cellulaires et/ou des modèles animaux de pathologies neurodégénératives, en particulier de la maladie d'Alzheimer.
19. Utilisation d'un kit de détection de la chaîne α de l'ATP synthase, pour le diagnostic de maladie neurodégénératives, en particulier pour la détection de la maladie d'Alzheimer.
20. Anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux dirigés contre des motifs de conformation pathologique de la chaîne α de l'ATP synthase résultant d'un processus neurodégénératif.
21. Kit de diagnostic caractérisé en ce qu'il comprend des jeux d'anticorps selon la revendication 20.
22. Kit de diagnostic selon la revendication 21, caractérisé en ce que ledit kit renferme des réactifs permettant la réalisation d'un dosage immunochimique, en particulier de type ELISA, immuno-empreintes, Western blots, dots-blots, radioimmuno-essai ou immuno-essai .
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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NZ586834A (en) 2008-01-18 2013-03-28 Methods of detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
US20130203624A1 (en) 2010-07-23 2013-08-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of Detecting Prenatal or Pregnancy-Related Diseases or Conditions
AU2011280944A1 (en) 2010-07-23 2013-02-28 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting diseases or conditions using phagocytic cells
EP2596116A4 (fr) 2010-07-23 2014-03-19 Harvard College Procédés de détection de maladies/pathologies auto-immunes ou liées au système immunitaire
SG10201505723UA (en) 2010-07-23 2015-09-29 Harvard College Methods for detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
KR101240207B1 (ko) 2010-08-27 2013-03-06 고려대학교 산학협력단 알츠하이머병 조기진단용 단백질성 마커
KR20150035821A (ko) 2012-06-15 2015-04-07 해리 스타일리 질환 또는 병태를 검출하는 방법
WO2013188828A1 (fr) 2012-06-15 2013-12-19 Harry Stylli Méthodes de détection de maladies ou d'états au moyen de cellules infectées en circulation
EP2965077B1 (fr) 2013-03-09 2022-07-13 Harry Stylli Procédés de détection de cancer
EP2965086A4 (fr) 2013-03-09 2017-02-08 Harry Stylli Procédés de détection du cancer de la prostate
EP3693742B1 (fr) 2014-09-11 2022-04-06 Harry Stylli Procédés pour détecter le cancer de la prostate
CN111918875A (zh) * 2018-03-11 2020-11-10 库罗什·沙帕桑 构象-特异性的抗神经毒性tau蛋白的抗体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2332507A1 (fr) * 1998-05-19 1999-11-25 Duke University Recepteur d'angiostatine

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