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WO2004022752A1 - Ｓｍｇ−１結合タンパク質及びその活性を制御する物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Ｓｍｇ−１結合タンパク質及びその活性を制御する物質のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2004022752A1
WO2004022752A1 PCT/JP2003/011353 JP0311353W WO2004022752A1 WO 2004022752 A1 WO2004022752 A1 WO 2004022752A1 JP 0311353 W JP0311353 W JP 0311353W WO 2004022752 A1 WO2004022752 A1 WO 2004022752A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
activity
present
smgbp1
substance
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2003/011353
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeo Ohno
Tetsuo Ohnishi
Akio Yamashita
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CITY OF YOKOHAMA
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
CITY OF YOKOHAMA
Japan Science and Technology Agency
Japan Science and Technology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by CITY OF YOKOHAMA, Japan Science and Technology Agency, Japan Science and Technology Corp filed Critical CITY OF YOKOHAMA
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Priority to EP03794253A priority patent/EP1541684A4/en
Publication of WO2004022752A1 publication Critical patent/WO2004022752A1/ja
Priority to US11/072,699 priority patent/US20050196797A1/en
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for a substance that regulates SMG-1 binding protein and its activity.
  • the present invention relates to a method for screening an SMG-1 binding protein and a substance that regulates the activity thereof.
  • nonsense codons appear in the protein coding region as a result of substitution, recombination, and mutations such as Z or deletion of the nucleotide sequence of the gene. It is said that the shape is abnormal.
  • Such a gene encodes an abnormal protein that ends prematurely, but mRN m encoding such an abnormal protein is usually not detected. This is because cells have a mechanism to identify and eliminate mRNAs that have nonsense codons at abnormal positions. This mechanism is the mechanism of mRNA degradation caused by nonsense codons
  • Non-Patent Document 1 “Jeans & Development (GENES & DEVE and OPME NT) j, (USA), 2001, Vol. 15, p. 221 5-2228 (Non-Patent Document 1)] However, including human SMG-1 Little is known about the surveillance complex.
  • the nucleotide sequence of the human cDNA encoding the novel polypeptide found by the present inventors was Kawabata, A., Hikiji.T., Kobatake, N., lnagak /, ⁇ ., Ikema, Y., 0kamoto, S., Okitani.R., Ota, T., Suzuki, Y., ObayashiJ.,
  • Non-Patent Document 3 discloses a human phosphatidylinositol kinase (PIK) -related protein kinase (PI KK) which has an important function in cell cycle progression or checkpoint control, and discloses a mRNA servicing mechanism. There is no statement suggesting that.
  • PIK human phosphatidylinositol kinase
  • PI KK protein kinase
  • Non-Patent Document 1 Akira Yamashita et al., "GE NES & DEVE LOPMENT” J, (USA), 2001, Vol. 15, p. 221 5-2228
  • Non-Patent Document 2 Kawabata, A., Hikiji.T., Kobatake,., Inagaki'H.,
  • Non-Patent Document 3 Onishi et al., "Analysis of Structure and Function of Novel pI3K-Related Giant Protein Kinase", “Program of the 22nd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, 1999", 1 999 Year, p. 235 Disclosure of Invention
  • the present inventors have eagerly sought to develop a method capable of artificially controlling the mRNA surveillance mechanism by elucidating the mRNA surveillance mechanism, and as a result, it was found that the mRNA was tightly bound to hSMG-1. A new protein was identified and the entire structure was determined. This molecule is tightly bound to hSMG-1 in cells, and is expected to be greatly involved in the control of kinase activity, localization in cells, and the control of surveillance complex activity. You. Therefore, the present inventor has found that it is one of the molecular target candidates when artificially controlling the mRNA surveillance mechanism. The present invention is based on such findings.
  • an object of the present invention is to provide a novel polypeptide that binds to SMG-1 and a polynucleotide encoding the same, and further provide a screening system for a substance that artificially regulates the mRNA surveillance mechanism. It is in.
  • the present invention relates to (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (2) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and further exhibiting SMGBP1 activity; In one or more positions of the amino acid sequence represented by No. 2, one or more amino acids include a deleted, substituted, and / or inserted amino acid sequence, and further, exhibit SMGBP "I activity. And (4) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and further exhibiting SMGBP1 activity.
  • the present invention relates to polynucleotides encoding these polypeptides.
  • the present invention also relates to an expression vector containing the polynucleotide.
  • the present invention also relates to a transformant containing the polynucleotide.
  • the present invention also relates to an antibody that binds to the polypeptide or a fragment thereof.
  • the present invention also relates to a knockout non-human animal or cell in which the expression of the gene encoding the polypeptide is partially or completely suppressed.
  • the present invention provides (1) a step of bringing the polypeptide, SMG-1 and a test substance into contact with each other under conditions where the SMGBP1 activity of the polypeptide can be exhibited if the test substance does not exist. , as well as
  • a method for screening a substance that regulates the SMGBP1 activity of the polypeptide comprising a step of analyzing whether or not the SMGBP1 activity of the polypeptide is exerted.
  • the present invention provides a method for contacting a cell capable of producing the polypeptide and SMG-1 with a test substance under conditions capable of producing the polypeptide in the absence of the test substance. The step of causing, and
  • the present invention provides a nonsense-mediated substance comprising, as an active ingredient, a substance that regulates SMGBP1 activity of the polypeptide (for example, a substance that regulates SMGBP1 activity of the polypeptide obtained by the screening method). It relates to inhibitors of mRNA degradation.
  • the present invention provides a nonsense mutation comprising, as an active ingredient, a substance that regulates SMGBP1 activity of the polypeptide (for example, a substance that regulates SMGBP1 activity of the polypeptide obtained by the screening method).
  • the present invention relates to a therapeutic and / or prophylactic agent for a disease state caused by generating an early translation stop codon.
  • the present invention provides a nonsense mediator comprising, as an active ingredient, a substance that controls the SMGBP1 activity of the polypeptide (for example, a substance that controls the SMGBP1 activity of the polypeptide obtained by the screening method).
  • promoter of mRNA disintegration comprising, as an active ingredient, a substance that regulates SMGBP1 activity of the polypeptide (for example, a substance that regulates SMGBP1 activity of the polypeptide obtained by the screening method).
  • the present invention provides a method for suppressing nonsense-mediated mRNA decay, comprising administering an effective amount of a substance that controls SMGBP1 activity of the polypeptide to a subject in need of suppressing nonsense-mediated mRNA decay.
  • a method for suppressing nonsense-mediated mRNA decay comprising administering an effective amount of a substance that controls SMGBP1 activity of the polypeptide to a subject in need of suppressing nonsense-mediated mRNA decay.
  • the present invention provides a substance that controls SMGBP1 activity of the polypeptide, a subject requiring treatment and no or prevention of a disease state caused by the occurrence of a premature translation termination codon by nonsense mutation,
  • the present invention relates to a method for treating and preventing or preventing a disease state caused by generating a premature translation termination codon by a nonsense mutation, which comprises administering an effective amount.
  • the present invention also provides a method for promoting nonsense-mediated mRNA decay, which comprises administering an effective amount of a substance that controls the SMGBP1 activity of the polypeptide to a subject in need of promoting nonsense-mediated mRNA decay. About the method.
  • the present invention also relates to the use of a substance that controls the SMGBP1 activity of the polypeptide for producing an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay.
  • the present invention also relates to the use of a substance that controls the SMGBP1 activity of the polypeptide for producing an agent for treating and / or preventing a pathological condition caused by the occurrence of a premature translation termination codon due to a nonsense mutation. .
  • the present invention also relates to the use of a substance that controls the SMGBP1 activity of the polypeptide for producing a promoter of nonsense-mediated mRNA decay.
  • Fig. 1 shows the results of phosphorylation of the immunoprecipitate of human HeLa cell extract obtained using anti-hSMG-1 serum (antiserum C) by autoradiography. It is a drawing.
  • Figure 2 shows the results of autoradiography of the results of phosphorylation of immunoprecipitates of human HeLa cell extracts obtained using two types of hSMG-1 sera (antiserum C or antiserum L). It is a drawing shown by a graph.
  • FIG. 3 is a chromatograph of a human HeLa cell extract using an anion exchange column HiTrapQ.
  • FIG. 4 is a drawing showing the results of Western blotting performed to show the distribution of human SMG-1 in each fraction shown in FIG.
  • FIG. 5 is a drawing showing, by autoradiography, the results of performing a phosphorylation reaction on each immunoprecipitate of h SMG-1 serum of each fraction shown in FIG. 3
  • FIG. 6 is a drawing showing the results of a phosphorylation reaction performed on each immunoprecipitate of h SMG-1 serum of fractions 20 to 31 shown in FIG. 3 by a Western plot.
  • Figure 7 shows the results of SDS-PAGE and silver staining of immunoprecipitates of human HeLa cell extract with anti-hSMG-1 IgG (N antibody). is there.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram showing the primary structure of the AK026858.1 translation product and the position of each sequence corresponding to AP1, AP2, AP3, AP4, AP5, and AP8.
  • Figure 9 shows the results of immunoprecipitation of human HeLa cell extract with anti-hSMG-1 antiserum (antiserum N, antiserum, or antiserum C) using anti-AKO26858.1 translation product antibody. It is a drawing which shows the result of the western blot used.
  • one or more amino acids include a deleted, substituted, and Z or inserted amino acid sequence, and may have SMGBP1 activity.
  • the indicated polypeptide hereinafter referred to as a functionally equivalent variant
  • homology with the Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 comprises a Amino acid sequence is 900/0 above, moreover, polypeptides exhibiting SMGBP 1 activity (hereinafter, referred to as a homologous polypeptide)
  • polypeptide of the present invention “a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2”, binds to SMG-1 (particularly human SMG-1) to form a complex.
  • SMG-1 particularly human SMG-1
  • SMG BP 1 J SMG Binding Protein 1
  • rsMGBP1 activity refers to the activity of binding to SMG-1 (particularly human SMG-1), the activity of being phosphorylated by SMG-1, and / or the activity of SMG-1 through these activities. Means the activity of controlling the action of Further, in the present specification, “J showing SMGBP1 activity” means showing at least one of these activities.
  • SMG-1 is a phosphatidylinositol kinase (PIK) -related protein kinase (PI KK) that is essential for the mRNA surveillance process. It has autophosphorylation ability and simultaneously has nonsense-mediated mRNA decay (nonsense).
  • PIK phosphatidylinositol kinase
  • PI KK phosphatidylinositol kinase
  • NMD mediated mRNA decay
  • a method for determining whether or not a polypeptide to be tested is “J that exhibits SMGBP1 activity” is not particularly limited.
  • a test polypeptide and SMG-1 for example, human SMG-1 is brought into contact with the test polypeptide and SMG- "! The determination can be made by analyzing whether or not a complex with is formed.
  • the method for bringing the test polypeptide into contact with SMG-1 includes, for example, a method in which the test polypeptide and SMG-1 are each separately prepared genetically and contacted, Alternatively, a method may be used in which a polynucleotide encoding a test polypeptide is introduced into cells capable of producing SMG-1, and the test polypeptide and SMG-1 are produced and contacted in the cells. Cut.
  • a method for analyzing a complex of a test polypeptide and SMG-1 includes, for example,
  • phosphorylation is performed under conditions that allow phosphorylation by SMG-1 to confirm the presence or absence of the phosphorylated test polypeptide [for example, Example 1 (2) ⁇ ( Method described in 4)]; or, after performing chromatography, a method for confirming whether the test polypeptide and SMG-1 are present in the same fraction [eg, Examples 2 (2) and (3) The method described in
  • the polypeptide of the present invention ⁇ comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the polypeptide J exhibiting SMGBP1 activity includes, for example, the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and / or A fusion polypeptide consisting of an amino acid sequence with an appropriate marker sequence added to the C-terminus and exhibiting SMGBP1 activity can also be mentioned.
  • a marker sequence that can be used in the polypeptide of the present invention for example, a sequence that facilitates confirmation of polypeptide expression, confirmation of intracellular localization, or purification can be used. Examples thereof include a FLAG tag, a hexa histidine ⁇ tag, a hemagglutinin c tag, and myc-epI. TJP2003 / 011353
  • the functionally equivalent variant of the present invention has one or more (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, at one or more positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2) More preferably, it is 1 to 5), for example, as long as it is a polypeptide that has an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted, and / or inserted, and shows SMGBP1 activity.
  • the origin is not limited to humans.
  • polypeptide includes not only a human variant of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (ie, human SMGBP1), but also organisms other than human (eg, monkey, mouse, rat, Hamsters or dogs). Furthermore, based on a polynucleotide encoding those natural polypeptides (ie, a human-derived variant or a functionally equivalent variant derived from a non-human organism), or represented by SEQ ID NO: 2 It includes polypeptides produced using polynucleotides that have been artificially modified by genetic engineering based on polynucleotides encoding polypeptides consisting of amino acid sequences.
  • Mutants in humans of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or functionally equivalent variants derived from organisms other than humans are represented by SEQ ID NO: 2 by those skilled in the art.
  • SEQ ID NO: 2 Based on the information on the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence (for example, the sequence consisting of the 16th to 2988th bases in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1) , Can be obtained.
  • a known method Example 7 L, Sambrook, J.b., Molecular Cloning—AL aboratory Manua I ", Cold Spring Harbor La) boratory, NY, 1989).
  • an appropriate primer or probe is designed based on information on the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the primer or probe and the target organism [Eg, a mammal (eg, human, monkey, mouse, rat, hamster, or dog)] (eg, a total RNA or mRNA fraction, a cDNA library, or a fur PT / JP2003 / 011353
  • Polypeptide encoding by using polymerase chain reaction (PCR) method (Saiiki, RK et al., Science, 239, 487-491, 1988) or hybridization method using A desired polypeptide can be obtained by obtaining the polynucleotide, expressing the polynucleotide using an appropriate expression system, and confirming that the expressed polypeptide exhibits SMGBP1 activity. .
  • PCR polymerase chain reaction
  • the above-mentioned polypeptide which has been artificially modified by genetic engineering can be produced by a conventional method, for example, site-specific mu tagenesis (Mark, DF et al., Proc. Natl. A USA, 81, 5662-5666, 19984), a polynucleotide encoding a polypeptide is obtained, and the polynucleotide is expressed using an appropriate expression system. By confirming that it exhibits SM GBP1 activity, the desired polypeptide can be obtained.
  • the homologous polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it contains an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and exhibits SMGBP1 activity.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 preferably contains an amino acid sequence having a homology of 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more. it can.
  • BLAST Basic Ioca Ia ingmentsearchtool; Altschul, SF et al., J. Mo., Biol., 215, 403-410, 1990). Means the value obtained by
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the 16th to 16th nucleotides in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide comprising a sequence consisting of the 2988th base or a polynucleotide comprising a sequence consisting of the 16th to 2988th bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be mentioned.
  • the term “polynucleotide” in the present specification includes DNA and RN. 3011353
  • A includes both.
  • the method for producing the polynucleotide of the present invention is not particularly limited. Examples thereof include (1) a method using PCR, and (2) a conventional genetic engineering method (that is, a method using a cDNA library). (A method of selecting a transformed strain containing the desired cDNA from the transformed transformant), or (3) a chemical synthesis method. Hereinafter, each manufacturing method will be sequentially described.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the following procedure.
  • mRNA is extracted from human cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention.
  • a set of two primers capable of sandwiching the full length of mRNA corresponding to the polypeptide of the present invention, or a part thereof Create a pair of primer sets that can sandwich the mRNA region.
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • total RNA containing mRNA encoding the polypeptide of the present invention is extracted from cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention by a known method.
  • the extraction method include the guanidine 'thiocyanate' hot phenol method, the guanidine thiocyanate-guanidine ⁇ hydrochloride method, and the guanidine thiocyanate cesium chloride method. Preferably, it is used.
  • Cells or tissues having the ability to produce the polypeptide of the present invention include, for example, a Northern plotting method using a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention or a part thereof, or a polynucleotide or a polynucleotide of the present invention.
  • the specificity can be determined by an estane blotting method using an antibody specific to the peptide.
  • the extracted mRNA is purified.
  • Purification of mRNA can be performed according to a conventional method. For example, mRNA can be purified by adsorbing it to an oligo (dT) cellulose column and eluted. If desired, mR by sucrose density gradient centrifugation, etc. NA can be further fractionated. Further, even without extracting mRNA, commercially available extracted and purified mRNA can be used.
  • the purified mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of, for example, a random primer, an oligo dT primer, and a primer synthesized in a random or custom manner to synthesize a first-strand cDNA.
  • This synthesis can be performed by a conventional method.
  • PCR is performed using two types of primers sandwiching the full length or a partial region of the target polynucleotide to amplify the target cDNA.
  • the obtained DNA is fractionated by agarose gel electrophoresis or the like. If desired, the desired DNA fragment can be obtained by cleaving the DNA with a restriction enzyme or the like and connecting the DNA fragments.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the following procedure.
  • a single-stranded cDNA was synthesized using a reverse transcriptase, and then a double-stranded cDNA was synthesized from the single-stranded cDNA.
  • the method include the S1 nuclease method (E fstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), the L and method (L and, H. et al., Nucleic Acids Res. , 9, 2251 -2266, 1981), 0. Joon Yoo method (Yoo, OJ-et al., Proc. Natl. Ac a d. Sc, USA, 79, 1009-1. 053, 1983), or O kayama-Berg method (Okayama, H. and Berg, P., MoI. Cell to Biol., 2, 161—170, 1982) And so on.
  • the recombinant plasmid is introduced into Escherichia coli (for example, DH5 strain, HB101 strain, or JM109 strain) and transformed, for example, tetracycline.
  • Escherichia coli for example, DH5 strain, HB101 strain, or JM109 strain
  • Recombinants are selected using drug resistance to ampicillin, kanamycin, or the like as an index.
  • the transformation of the host cell is performed by the method of Hanahan (Hanahan, DJ, Mo to Biol., 166, 557-580, 1983), that is, C a CI 2 , recombinant cells prepared in the presence of MgC I 2 or Rb CI
  • the method can be carried out by adding a DNA form.
  • a phage vector such as a lambda system can be used in addition to the plasmid.
  • Methods for selecting a transformant having the desired cDNA from the transformants obtained in this way include, for example, the following (i) a transformant screening method using a synthetic oligonucleotide probe, (ii) ) A transformant screening method using a probe prepared by PCR, (iii) a transformant screening method using an antibody against the polypeptide of the present invention, or (iv) selective 'hybridization trans'.
  • a transformant screening method using a translation system can be employed. .
  • a transformant having a desired cDNA can be selected by the following procedure.
  • an oligonucleotide corresponding to all or a part of the polypeptide of the present invention is synthesized, and this is used as a probe (labeled with 32 P or 33 P) to obtain a nitrocellulose denatured and immobilized with the DNA of the transformant. Hybridize with a filter or polyamide filter, search for the obtained positive strain, and select it.
  • a nucleotide sequence derived using codon usage can be used, or a plurality of nucleotide sequences obtained by combining possible nucleotide sequences can be used. You can also. In the latter case, the type can be reduced by including inosine.
  • a transformant having the desired cDNA can be selected by the following procedure.
  • oligonucleotides of a sense primer and an antisense primer corresponding to a part of the polypeptide of the present invention are synthesized, and PCR is performed by combining them to encode all or a part of the target polypeptide.
  • Amplify a DNA fragment ( type DN DNA used here may be cDNA or genomic DNA synthesized by reverse transcription from mRNA of a cell producing the polypeptide of the present invention.
  • the DNA fragment thus prepared is labeled with, for example, 32 P or 33 P, Using this as a probe, colony hybridization or plaque hybridization is performed to select a transformant having the desired cDNA.
  • a method for screening a transformant using an antibody against the polypeptide of the present invention a transformant having the desired cDNA can be selected, for example, by the following procedure.
  • a polypeptide is produced on the culture supernatant, intracellularly, or on the cell surface of the transformant, and a desired polypeptide-producing strain is produced using an antibody against the polypeptide of the present invention and a secondary antibody against the antibody.
  • a transformant which is detected and has the desired cDNA is selected.
  • a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure.
  • cDNA obtained from the transformant is blotted on a nitrocellulose filter or the like, mRNA prepared separately from cells having the ability to produce the polypeptide of the present invention is hybridized, and then bound to cDNA. Dissociate the recovered mRNA and recover.
  • the recovered mRNA is injected into an appropriate polypeptide translation system, for example, into oocytes of African alfalfa, or translated into a polypeptide using a cell-free system such as egret reticulocyte lysate or wheat germ. .
  • a transformant having the desired cDNA is selected by detection using an antibody against the polypeptide of the present invention.
  • a method for collecting the polynucleotide of the present invention from the obtained transformant of interest can be obtained by a known method (for example, Sambrook, J. et al., "Molecular CI oning—AL aboratory Manual, Cold Spring Prep. ng Harbor Laboratory, NY, 1989) For example, by separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and cutting out the cDNA region from the obtained plasmid DNA. be able to.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by binding the DNA fragment or the NA fragment.
  • Each DNA is synthesized using a DNA synthesizer [for example, Oligo 100 OM DNA Synthesizer (manufactured by Beckan), or 394 DNA ZRNA Synthesizer (manufactured by App I ied Biosystems X)]. be able to.
  • the polynucleotide of the present invention can be prepared, for example, by the phosphite triester method (Hunkap IIer, M. et al., Nature, 10: 105-111) based on the information of the polypeptide of the present invention. 1, 1 984) and the like, and can also be produced by chemical synthesis of nucleic acids.
  • the codon for the desired amino acid is known per se and may be arbitrarily selected. For example, it can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host to be used (Cranth am, R Et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981).
  • partial modification of the codons of these nucleotide sequences can be performed by a conventional method using a site-specific mutagenesis (Mark rk) using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification.
  • Mark rk site-specific mutagenesis
  • the sequencing of DNA obtained by the various methods described so far can be performed, for example, by the chemical modification method of Maxam-Gilbert (MaXam, AM and Gibert, W., "Methodsin Enzymo Iogy”). , 65, 499—55 9, 1980) ⁇ Performed by dideoxynucleotide chain termination method (Messing, J. and Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982) Can be.
  • Eukaryotic or prokaryotic host cells can be transfected by re-incorporating the isolated polynucleotide of the present invention into the appropriate vector DNA. Also, by introducing an appropriate promoter and a sequence involved in expression into these vectors, the polynucleotide can be expressed in each host cell.
  • the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention.
  • the expression vector of the present invention An expression vector obtained by inserting a nucleotide can be mentioned.
  • the expression vector of the present invention includes an expression vector for producing the recombinant polypeptide of the present invention, and an expression vector for producing the polypeptide of the present invention in vivo by gene therapy.
  • the transformant of the present invention is also transfected with the expression vector or the polynucleotide of the present invention, and is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide can be a cell integrated into the chromosome of the host cell, or it can be a cell containing the polynucleotide in the form of an expression vector containing the polynucleotide according to the present invention.
  • the cells may be cells expressing the polypeptide of the present invention, or cells not expressing the polypeptide of the present invention.
  • the transformant of the present invention can be obtained, for example, by transfection of a desired host cell with the expression vector of the present invention.
  • eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast, and vertebrate cells include, for example, monkey COS cells (GIuzman, Y., Ce II, 23, 175-182, 1981), a dihydrofolate reductase-deficient strain of Chinese hamster ovary cells (CHO) (UrI aub G. and Cansin, LA, Proc. Natl. USA, 77, 421 6-4220, 1980), human embryonic kidney-derived HEK293 cells, and the EBNA-1 gene of Epstein's bar virus introduced into the HEK293 cells. 293-EBN. A cell (Invitrogen), or human-derived 293 T cell (Du Bridge, RB et al., Mo to Ce I to Biol., 7, 379-387, 1987) and the like. .
  • monkey COS cells GIuzman, Y., Ce II, 23, 175-182, 1981
  • CHO Chinese hamster ovary cells
  • CHO Chinese ham
  • a vertebrate cell expression vector those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, and a transcriptional and transcription termination sequence which are usually located upstream of the gene to be expressed can be used. If necessary, those having a replication origin can also be used.
  • the expression vector include, for example, PSV2 dhfr (Subramani, S. et al., Mo. Cell. Bio, 1, 854-864, 19981) with the SV40 early promoter pEF-BOS with the human elongation factor promoter (Mizushima, S and Nagata, S. 'Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), or pCEP4 (In Vitrogen) having a cytomegalovirus promoter. Can be mentioned.
  • COS cells When COS cells are used as host cells, autonomous propagation in cells is possible if an expression vector having an SV40 replication origin is used. Furthermore, those having a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice site can be used.
  • pME18S Maruyama, K. and Takebe, Y., Med. Immuno, 20, 27-32, 1 990
  • p EF—BOS Mizushima, S. and Nagata, S., Nuc Ieic Acids Res s., 18, 5322, 1990
  • pCDM 8 When COS cells are used as host cells, autonomous propagation in cells is possible if an expression vector having an SV40 replication origin is used. Furthermore, those having a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice site can be used. For example, pME18S (Maruyama, K. and Takebe, Y., Med. Immuno, 20, 27-32, 1 990), p EF—BOS (M
  • Examples of the expression vector include a DEAE-dextran method (Lutman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1 308, 1983), calcium phosphate-DNA, Co-precipitation method
  • a vector capable of expressing a neo gene functioning as a G418 resistance marker together with an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, for example, p RS Vn eo (S amb rook, J.b, Mo lecular Cloning-AL aboratory M anua I ", Cold Spring Ha rbor Laboratory, NY, 1989) or p SV2-neo (Southern, PJ and Berg, P., J. Mo to App I. Ge net. '1, 327-341, 1982), etc.
  • p RS Vn eo S amb rook, J.b, Mo lecular Cloning-AL aboratory M anua I ", Cold Spring Ha rbor Laboratory, NY, 1989
  • p SV2-neo Southern, PJ and Berg, P., J. Mo to App I. Ge net. '1, 327-341, 1982
  • a vector for gene therapy a commonly used vector (for example, retrovirus, adenovirus, Sendai virus, etc.) can be used.
  • the transformant of the present invention can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the polypeptide of the present invention in cells.
  • a medium that can be used for the culture various types of commonly used media can be appropriately selected depending on the host cell used.
  • serum components such as fetal calf serum (FBS) were added to a medium such as RPMI-1640 medium or Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM) as necessary.
  • FBS fetal calf serum
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium
  • 293-EBNA cells use a medium such as Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium (DMEM) supplemented with serum components such as fetal bovine serum (FBS) plus G418. Can be.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium
  • the polypeptide of the present invention produced in the cell of the cell may be any of various known types utilizing the physical properties, biochemical properties, and the like of the polypeptide. Separation and purification can be performed by the separation operation method. Specifically, the cell extract containing the polypeptide of the present invention may be treated, for example, with a conventional protein precipitant, ultrafiltration, various liquid chromatography [eg, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption] Chromatography, ion exchanger chromatography, affinity chromatography, or high-performance liquid chromatography
  • various liquid chromatography eg, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption] Chromatography, ion exchanger chromatography, affinity chromatography, or high-performance liquid chromatography
  • the expression of the polypeptide of the present invention can be easily confirmed or purified by fusing the polypeptide of the present invention with the marker sequence in frame.
  • the marker sequence include a FLAG tag, a hexahistidine 'tag, Hemagglutinin 'tag or my cepitope.
  • a protease for example, an oral kinase, factor Xa, or thrombin
  • the marker sequence portion can Can be cleaved and removed.
  • the polypeptide of the present invention By using the polypeptide of the present invention, a substance that controls (eg, suppresses or promotes) the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention can be screened.
  • Human SMGBP1 which is a polypeptide of the present invention, is tightly bound in vivo to human SMG-1 essential for mRNA surveillance, and controls kinase activity, localizes in cells, Furthermore, it is predicted that the activity is greatly involved in controlling the activity of the surveillance complex. Therefore, the substance that regulates the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention may be, for example, a substance that controls nonsense-mediated mRNA decay (NMD) through the control of SMG-1 activity.
  • NMD nonsense-mediated mRNA decay
  • NMD is useful as a candidate for a therapeutic and / or prophylactic agent for various diseases associated with NMD
  • the polypeptide of the present invention itself is used as the SMGBP1 of the polypeptide of the present invention. It can be used as a screening tool for a substance that regulates the activity or a therapeutic and / or prophylactic agent for various diseases associated with NMD.
  • the NMD is a mechanism for recognizing and specifically degrading a nonsense mutant mRNA in which a codon in the middle of the original translation region of a gene has been changed to a stop codon.
  • Examples of various diseases associated with NMD include, but are not limited to, those conditions that are caused by the elimination of mRNA including PTC, and those that are caused by nonsense mutation, or premature translation termination codons due to nonsense mutations. PTC) can be cited.
  • the pathological conditions caused by nonsense-induced PTCs include, but are not particularly limited to, for example, hereditary diseases (eg, decenne muscular dystrophy) and cancers caused by somatic mutations.
  • hereditary diseases eg, decenne muscular dystrophy
  • cancers caused by somatic mutations can be mentioned P2003 / 011353
  • NMD mechanism if the NMD mechanism can be suppressed, a protein fragment having an effective activity can be expressed, so that a pathological condition caused by the presence of a stop codon in the middle of a specific gene, that is, a nonsense mutation of the specific gene It has been theoretically predicted that at least part of the pathological conditions caused by the disease can be eliminated. However, no technique for specifically suppressing only NMD has been known at all.
  • the substance capable of suppressing SMG-1 activity through the control of SMGBP1 activity is NMD Therefore, it is useful as an active ingredient of a completely new type of therapeutic and / or prophylactic agent that can eliminate at least a part of the gene mutation in any pathological condition caused by nonsense mutation of a specific gene. It is.
  • those that can promote SMG-1 activity through the control of SMGBP1 activity are Since it can promote NMD, it can be used as an active ingredient of an NMD promoter, or should be excluded. Useful as
  • Test substances that can be subjected to the screening method of the present invention are particularly limited. Although not specified, for example, various known compounds (including peptides) registered in the chemical file, combinatorial chemistry technology (T errett, NK et al., Tetrahedron, 51, 81 35-81 37, 1995) or a group of compounds obtained by conventional synthetic techniques, or the phage display method (Felici, F. et al., J. Mo., Biol., 222, 310-1 310, 19991). A random peptide group created by application can be used. In addition, culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants or marine organisms, or animal tissue extracts can also be used as test substances for screening. Further, a compound (including a peptide) obtained by chemically or biologically modifying a compound (including a peptide) selected by the screening method of the present invention can be used.
  • the screening method of the present invention comprises:
  • the polypeptide of the present invention, SMG-1 (for example, human SMG-1), and a test substance are prepared under the conditions in which the SMGBP1 activity of the polypeptide can be exhibited if the test substance does not exist.
  • the step of contacting hereinafter referred to as the contacting step
  • an analysis step (2) a step of analyzing whether or not the SMGBP 1 activity of the polypeptide was exerted (hereinafter referred to as an analysis step);
  • the method of bringing the polypeptide of the present invention into contact with the SMG-1 and the test substance is performed under conditions where the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention can be exhibited if the test substance does not exist (ie, However, there is no particular limitation as long as the polypeptide of the present invention can be brought into contact with SMG-1 under conditions that allow the polypeptide to bind to SMG-1).
  • Examples of such a contacting method include a method in which a test polypeptide and SMG-11 are separately prepared by genetic engineering, and the test polypeptide and SMG-1 are contacted with a test substance.
  • test polypeptide and SMG-1 are produced in the cell, and the test polypeptide and SMG-1 " Examples of the method include bringing a test substance into contact with the test substance.
  • the test substance is a substance that suppresses the SMGB P1 activity of the polypeptide of the present invention. Can be determined.
  • methods for analyzing the complex of the polypeptide of the present invention and SMG-1 include, for example,
  • an antibody against either SMG-1 or the polypeptide of the present invention for example, anti-SMG-1 antibody
  • an antibody against the other polypeptide for example, the polypeptide of the present invention
  • a method for confirming the presence or absence of the latter polypeptide by means of an estrogen blot [hereinafter referred to as immunoprecipitation and Western plot combined method; for example, the method described in Example 4 (2) below) ;
  • a method for confirming whether or not the polypeptide of the present invention and SMG-1 are present in the same fraction [hereinafter referred to as a fractionation method; for example, Examples 2 (2) and (2) Method described in 3)]
  • Etc. can be used.
  • the immunoprecipitation is performed using an antibody against either SMG-1 or the polypeptide of the present invention (for example, an anti-SMG-1 antibody).
  • an antibody against either SMG-1 or the polypeptide of the present invention for example, an anti-SMG-1 antibody.
  • a Western plot is performed using an antibody to the polypeptide (eg, an antibody to the polypeptide of the invention). If the latter polypeptide (for example, the polypeptide of the present invention) is detected as a result of Western blot, a complex of the polypeptide of the present invention and SMG-1 is formed (ie, the polypeptide of the present invention) SMGBP 1 activity was exerted).
  • an antibody to the polypeptide eg, an antibody to the polypeptide of the invention.
  • the test substance is a substance that suppresses the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • the test substance is a substance that promotes the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • the immunoprecipitation method and the silver staining method are used in the analysis step, the immunoprecipitation is performed using an antibody (for example, an anti-SMG-1 antibody) against either SMG-1 or the polypeptide of the present invention. Then, electrophoresis is performed, and the presence or absence of the remaining other polypeptide (eg, the polypeptide of the present invention) is confirmed by an appropriate detection method (eg, silver staining). If the latter polypeptide (for example, the polypeptide of the present invention) is detected, a complex of the polypeptide of the present invention and SMG-1 is formed (that is, SMGBP1 of the polypeptide of the present invention). Activity was exhibited).
  • an antibody for example, an anti-SMG-1 antibody
  • electrophoresis is performed, and the presence or absence of the remaining other polypeptide (eg, the polypeptide of the present invention) is confirmed by an appropriate detection method (eg, silver staining). If the latter polypeptide (for example, the polypeptide of
  • the test substance is a substance that suppresses the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • the test substance is a substance that promotes the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • immunoprecipitation is performed using an anti-SMG-1 antibody, and then phosphorylation is performed under conditions that allow phosphorylation by SMG-1. This is performed to confirm the presence or absence of the phosphorylated polypeptide of the present invention. If the polypeptide of the present invention is detected, the polypeptide of the present invention It can be determined that a complex between the polypeptide of the present invention and SMG-1 has been formed (that is, the polypeptide of the present invention exhibited SM GBP1 activity).
  • the test substance is a substance that suppresses the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • the test substance is a substance that promotes the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention and SMG-1 are present in the same fraction after performing chromatography.
  • a complex of the polypeptide of the present invention and SMG-1 was formed (that is, the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention was exhibited). Has been performed).
  • the polypeptide of the present invention and SMG-1 are not present in the same fraction, a complex of the polypeptide of the present invention and SMG-1 is not formed (that is, the polypeptide of the present invention).
  • the test substance is a substance that suppresses the SMGBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • the test substance promotes SM GBP1 activity of the polypeptide of the present invention.
  • SMGBP1 activity modulators may be used alone or, preferably, together with conventional pharmaceutically or veterinarily acceptable carriers or diluents to control NMD [eg, , An animal, preferably a mammal (particularly a human)], or a subject in need of treatment and / or prevention of a condition caused by PTC caused by a nonsense mutation. 11353
  • those that promote SG-1 activity through the control of SMGBP1 activity can promote NMD. It is useful as a candidate for a therapeutic and / or prophylactic agent for a disease state caused by the fact that mRNA including PTC to be eliminated is not eliminated.
  • SMGBP1 activity modulators may be used alone or, preferably, together with conventional pharmaceutically or veterinarily acceptable carriers or diluents, for subjects that need to promote NMD [e.g. , Animals, preferably mammals (especially humans)], or those who need treatment and / or Z or prophylaxis for conditions that are to be eliminated and are not caused by the elimination of mRNA, including PTC. It can be administered in an amount.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, excipients, and the like. Examples include oral preparations such as pills, and parenteral preparations such as injections, external solutions, ointments, suppositories, creams for topical application, and eye drops.
  • oral agents include, for example, gelatin, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannitol, carboxymethylcellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidone, crystalline cellulose, soy lecithin, sucrose, fatty acid esters, talc, Excipients such as magnesium stearate, polyethylene glycol, magnesium silicate, maleic anhydride, or synthetic aluminum gayate, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, flow promoters, diluents, preservatives It can be produced by a conventional method using a coloring agent, a flavor, a flavoring agent, a stabilizer, a humectant, a preservative, an antioxidant, or the like.
  • parenteral administration methods include injection (subcutaneous, intravenous, etc.) and rectal administration. Of these, injections are most preferably used.
  • a physiological saline or a water-soluble solvent such as Ringer's solution, a water-insoluble solvent such as vegetable oil or fatty acid ester, glucose or sodium chloride, etc.
  • a water-insoluble solvent such as vegetable oil or fatty acid ester, glucose or sodium chloride, etc.
  • a tonicity agent, a solubilizing agent, a stabilizer, a preservative, a suspending agent, an emulsifier, or the like can be optionally used.
  • composition of the present invention is a method of a sustained-release preparation using a sustained-release polymer or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be incorporated into a pellet of ethylene vinyl acetate polymer, and the pellet can be surgically implanted into a tissue to be treated or prevented.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain the active ingredient in an amount of, but not limited to, 0.01 to 99% by weight 0 / o, preferably 0.1 to 80% by weight. .
  • the dosage in the case of using the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately determined depending on, for example, the type of the active ingredient to be used, the type of the disease, the age, sex, weight, and the degree of the symptoms of the patient, or the administration method. It can be administered orally or parenterally.
  • administration form is not limited to pharmaceuticals, and it can be provided in various forms, for example, functional foods and health foods (including beverages), or as feeds in the form of food and drink.
  • Antibodies that react with the polypeptide of the present invention can be obtained by directly administering the polypeptide of the present invention or a fragment thereof to various animals.
  • the DNA vaccine method (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. 91, 951 9-952 3, 1994; or by Donne II y, J.J. et al., J. Infect.Dis., 173, 31 4-320, 1996). it can.
  • the polyclonal antibody is, for example, an animal immunized with an emulsion obtained by emulsifying the polypeptide of the present invention or a fragment thereof in an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) intraperitoneally, subcutaneously, or veinly. (For example, a rabbit, a rat, a goat, or a chicken).
  • a polyclonal antibody can be separated and purified from the serum or eggs thus produced by a conventional polypeptide isolation and purification method. Examples of such separation and purification methods include centrifugal separation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatographic methods with DEAE-cellulose, hydroxyapatite, or protein A agarose. Can be.
  • Monoclonal antibodies can be readily prepared by those skilled in the art by, for example, the cell fusion method of Koehler and Milstein (Koh Ier, G. and M I Istein, C., Nature, 256, 495-497, 1975). It is possible to manufacture.
  • the polypeptide of the present invention or a fragment thereof is emulsified in an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) repeatedly inoculated intraperitoneally, subcutaneously, or vein several times into mice every few weeks. Immunize with After the final immunization, spleen cells are removed and fused with myeloma cells to produce hybridomas.
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • myeloma cells for obtaining hybridomas include myeloma cells having a marker such as hypoxanthine-guanine-phospholiposyltransferase deficiency or thymidine kinase deficiency (for example, mouse myeloma cell line P3 X63Ag 8.U 1) can be used.
  • a marker such as hypoxanthine-guanine-phospholiposyltransferase deficiency or thymidine kinase deficiency
  • polyethylene glycol can be used as the fusion agent.
  • a medium for producing a hybridoma for example, 10 to 30% of a commonly used medium such as Eagle's minimum essential medium, Dulbecco's modified minimum essential medium, or RPMI-1640 is used.
  • Fetal serum can be appropriately added and used.
  • Fusion strains can be selected by the HAT selection method.
  • the screening of hybridomas is performed by using well-known methods such as the ELISA method or immunohistochemical staining method using the culture supernatant, and clones of the hybridomas secreting the desired antibody can be selected.
  • by repeating subcloning by the limiting dilution method it is possible to guarantee the monoclonality of each hybrid.
  • the hybrididoma obtained in this manner can be purified for 2 to 4 days in the medium or 10 to 20 days in the abdominal cavity of BA LBZc mouse pretreated with pristane to obtain a sufficient amount of antibody. Can be produced.
  • the monoclonal antibody thus produced can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional method for isolating and purifying the polypeptide.
  • a separation and purification method include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatography using DEAE-cellulose, hydroxyapatite, or protein A agarose.
  • the monoclonal antibody or an antibody fragment containing a part thereof can also be produced by incorporating all or a part of the gene encoding a null antibody into an expression vector, and introducing the gene into an appropriate host cell (for example, Escherichia coli, yeast, or an animal cell).
  • an appropriate host cell for example, Escherichia coli, yeast, or an animal cell.
  • Antibodies including polyclonal antibodies and monoclonal antibodies separated and purified as described above are digested with a polypeptide-degrading enzyme (for example, pepsin or papain) according to a conventional method.
  • a polypeptide-degrading enzyme for example, pepsin or papain
  • An antibody fragment containing a part of an active antibody for example, pepsin or papain
  • F (ab ') 2 , Fab, Fab', or Fv can be obtained.
  • an antibody reactive with the polypeptide of the present invention can be obtained by the method of Kraxon et al. Or the method of Zebede et al. (CI ackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 19991; or Zebedee, S. Natl. Acad. Sc, USA, 89, 31 75-31 79, 1992), can be obtained as a single chain (sing I echain) Fv or Fab. It is.
  • human antibodies can be obtained by immunizing transgenic L-nick mice (onberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1999), in which the mouse antibody gene is replaced with a human antibody gene. Is also possible.
  • the knocked-out non-human animal of the present invention is not particularly limited as long as the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention is partially or completely suppressed. , Can be manufactured.
  • a non-human animal such as embryo, stem, goat, pig, pig, mouse, or embryonic stem cell such as chicken (Embryonicst em cell).
  • embryonic stem cell such as chicken (Embryonicst em cell).
  • a chimeric individual composed of embryonic stem cell clones and normal cells can be prepared.
  • By crossing the chimeric individual with a normal individual it is possible to obtain an individual having an arbitrary mutation in the gene encoding the polypeptide of the present invention present on the chromosome of the cells of the whole body.
  • knockout non-humans are regarded as individuals in which expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention is partially or completely suppressed. You can get animals.
  • the cells of the present invention in which the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention is partially or completely suppressed, can be obtained from the knockout non-human animal.
  • desired cells eg, human fetal kidney-derived HEK293 cells, 293-EBNA cells obtained by introducing the EBN A-1 gene of Epstein's virus into HEK293 cells, or human-derived cells 293T
  • desired cells eg, human fetal kidney-derived HEK293 cells, 293-EBNA cells obtained by introducing the EBN A-1 gene of Epstein's virus into HEK293 cells, or human-derived cells 293T
  • RNA interference for example, Nature, 411, 494-498, 2002. It is included in the scope of the present invention.
  • a knockout non-human animal by introducing a mutation into any position of the gene encoding the polypeptide of the present invention on the chromosome (for example, the present invention on the chromosome). It is also possible to alter the activity of the gene product by introducing a mutation into the translation region of the gene encoding the polypeptide by substituting, deleting, and / or inserting a base. is there.
  • the degree, timing, and / or tissue specificity of expression can be altered.
  • the expression timing, expression site, and / or expression level can be more positively controlled by combination with the Cre-Io XP system.
  • An example of this is the use of a promoter that is expressed in a specific region of the brain to delete the target gene only in that region [Cell, 87, 7, 1317 (1996) And an organ-specific deletion of a target gene at a target time using a Cre-expressing adenovirus [Science, 278, 5335 (1997)].
  • the expression of the gene encoding the polypeptide of the present invention on the chromosome can also be controlled at any time and in any tissue, and any insertion, deletion, and / or substitution can be performed.
  • a knockout non-human animal having a translation region or an expression control region can be produced.
  • the knockout non-human animal can induce the symptoms of various diseases caused by the polypeptide of the present invention at any time, any degree, and / or any site.
  • the non-human knockout animal of the present invention becomes an extremely useful animal model in the treatment and prevention of various diseases caused by the polypeptide of the present invention.
  • the knockout non-human animal of the present invention can also be used to establish a model animal for a disease caused by a gene different from the gene encoding the polypeptide of the present invention.
  • SMGB P1 knockout mice one of the knockout non-human animals of the present invention, are crossed with various strains of (apparent) normal mice.
  • the latter normal mouse contains a mutant gene having PTC, the mouse obtained by the above-mentioned crossing (for example, a homozygous individual having an SMG BP1 mutation in both homologous chromosomes, or an SMGBP 1 in one of homologous chromosomes)
  • NMD activity will be affected in a mutagenic individual (mutated mouse).
  • mutated mouse mutated mouse
  • hidden symptoms may surface and some diseases may occur, and a new disease model mouse can be established.
  • Example 1 Discovery of h SMG-1 binding protein phosphorylated in a human SMG-1 (h SMG-1) enzyme activity-dependent manner
  • the cells were picked up at 31 par and the cells were collected by centrifugation. After removing PBS, a protease inhibitor [1 mmo I ZL— PMS F (pheny I methy I su I fony I fluoride), 10 // gZm L aprotinin, and 10 ⁇ g Zm L leptin ⁇ F-lysis solution added with [2 Ommo IZ-I Tr-s HCI (pH 7.5), 0.25mo I ZL sucrose, 20mmo I ZL- yS-mercaptoethanol, 1.2mmo I ZL- EG TA, Immol ZL Sodium Orthovanadate, 1 mmo IZL Sodium Fluoride, Immol ZL Sodium Pyrophosphate, 15 Ommo IZL Sodium Chloride, 1% Triton X—1 O 0, and 0 3 mL of 5% nonidet (P40) was added, the mixture was stirred well, and the cells were completely disrupted by sonic
  • GST glutathione S-transferase
  • Protein A Sepharose particles (Amersham Pharmacia) 25
  • 1 mL of the cell extract (centrifuged supernatant) obtained in Example 1 (1) was added, and the mixture was stirred at 4 ° C for 2 hours.
  • the supernatant was removed by centrifugation, washing solution A (0.25moI ZL lithium chloride added to F-lysis solution) was added, and the mixture was stirred gently, and the supernatant was further removed by centrifugation. This operation was then repeated six times to remove non-specific adsorbates.
  • the protein A Sepharose particles collected at the end are mixed with 1X kinase reaction solution [1 Wash once with Ommol / LH epes (pH 7.5), 5 Ommo IZL sodium chloride, 5 Ommo IZL-iS-glyceric phosphate, and 1 mmo I ZL dithiosley I ⁇ (DTT)] Was performed.
  • Divalent metal ion (2 Ommo I / LM g CI 2 or 2 Ommo I / L—MnCI 2 or both) and Z or 1 ⁇ mo I ZL wortmannin [2 Ommo I / LM g CI 2 or both]
  • a buffer solution containing 25 mg of a phytidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) -related protein kinase inhibitor] was added, the mixture was gently stirred, and allowed to stand on ice for about 20 minutes.
  • reaction start solution (5 Ci [r- 32 P] ATP and 10 mol ZL- ATP) 25 m
  • the protein was denatured by incubating at 100 ° C for 4 minutes. This centrifuged supernatant was used as the following analysis sample.
  • the analysis sample was developed by two types of SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with a gel concentration of 6% or 12.5%, and then gel After drying, phosphorylated bands were visualized by autoradiography according to a conventional method.
  • SDS-PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • a 130 kDa protein p130
  • a 70 kDa protein p70
  • phosphorylated protein may be binding proteins that are phosphorylated by the kinase activity of hSMG-1.
  • Example 2 Separation of He La cell extract by liquid column chromatography and phosphorylation in hSMG-1 immune complex
  • HeLa cells were cultured by a conventional method, and the cells were collected in PBS in the same manner as in Example 1 (1). After removing the supernatant by centrifugation, cells containing 0.25% Triton X-100 and a protease inhibitor (0.1 mmo I ZL-PMSF, 10 g gmL mL aprotinin, and 10% gZmL leptin) buffer TG [2 Ommo I ZL— Tris HC I (pH 7.5), 2 mm o IL—EDTA, 2 mmo I ZL— DTT, 1 mmo I ZL sodium orthovanadate , And 10% glycerol] and gently stirred.
  • Triton X-100 0.1 mmo I ZL-PMSF, 10 g gmL mL aprotinin, and 10% gZmL leptin
  • This cell suspension was transferred to a Potter-type homogenizer, and cells were disrupted by 50 strokes of a polytrafluoroethylene whistle (pest I) to extract proteins.
  • a cell extract was obtained by ultracentrifugation (100 OO X g, 60 minutes).
  • the cell extract was filtered through a membrane filter (0.22 jWm poresize; Mi II @ pore company) to obtain a sample for analysis.
  • curve a shows the absorbance at 280 nm (A 280), that is, the relative concentration of the protein
  • line b shows the concentration gradient of sodium chloride.
  • the symbol “f” means a fraction
  • each digit immediately following “f” and each hand-written digit along the curve a is a fraction number.
  • Fig. 4 shows the results.
  • the symbols “WB: P” and “WB: C” indicate the results of Western blot using antiserum P and antiserum C, respectively.
  • the 15th serine residue (Ser15) and the 37th serine residue (Ser37) in the p53 protein are in a sequence that matches the phosphorylation consensus motif of hSMG-1.
  • H is known to be phosphorylated by SMG-1 [Akira Akira Yamashita, “JES & DEVE LO PMENT T” J, (USA), 2001, No. 15 Volume, p.
  • the phosphorylation status of the GS Tp53 (1-58) protein was determined by SDS-PAGE and the antibody against the phosphorylated Ser15 in the p53 protein (anti-P-Ser15 antibody; Shieh, SY et al., Cell. I, 91, 325-334, 19997) or an antibody against phosphorylated Ser37 in p53 protein (anti-P-Ser37 antibody; Kitagawa, M. et al., EMBO J., 15, 7060-). 7069, 1 996).
  • Fig. 6 shows the results.
  • the symbols "WB: -P-Ser15J” and “WB: 1-P-Ser37” are Western blots using an anti-P-Ser15 antibody and an anti-P-Ser37 antibody, respectively. Indicates the result of the blot.
  • the symbols “p-Ser15-p53” and “P-Ser37-p53j” are GST-p53 (1-58) proteins in which Ser15 and Ser37 are phosphorylated, respectively. Means
  • Example 3 Purification and analysis of h SMG-1 complex using antibody column
  • a He La cell extract was prepared in the same manner as in Example 1 (1).
  • a 3 mL volume of protein A sepharose (Amersham—Pharmacia) was added to the cell extract, followed by stirring at 4 ° C. for 30 minutes.
  • the supernatant was obtained by centrifugation. 25 g of normal egret IgG (Santa Cruz) or anti-hSMG-1 IgG (N antibody) 25 / g purified from antiserum N by a conventional method.
  • the above-mentioned centrifugal supernatant was added in half each to A Sepharose 1 O OjUL, and the mixture was stirred at 4 ° C for 2 hours.
  • the antiserum N is the N-terminal fragment of h SMG-1
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • CBB bear dibrillant blue
  • the stained protein of 130 kDa (p130) is cut out from the membrane with a knife.
  • Known methods eg, Akihiko Iwamatsu, Experimental Medicine, Vo, 17, No. 8, 1999, 1351, p. 351) ⁇ Page 1355 Close-up experimental method “Proteomic analysis using a mass spectrometer J, etc.) Proteolytic enzymes in membrane form, complete digestion with ys-C (lysyl endopeptidase), and MALD I — Mass spectrometry of digested fragments was performed using TOFZMS (Matrix Assisted Laser Excitation Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometer).
  • ⁇ 130 was a translation product of ⁇ 026858.1. And was an hSMG-1 binding protein.
  • the AKO 26858.1 translation product did not show any homology to a known functional motif.
  • the numerical value of the homology is based on BLAST (Basiclocala I in gents search tool; AI tschu I, S. F. et al., J. MoI. Bio, 215, 403-410, 1990). .
  • AK026858. 1 DNA which has already been identified by whole length c DN A sequencing project by Sugano Prof. of Tokyo Institute of Medical Science, the plasmid containing the DNA used in this example (P ME (Inserted into 18S) was distributed by the same professor. AK026858. 1 translation product is actually h SMG— 1 conclusion To confirm that it is a synthetic protein, a specific antibody was developed.
  • the plasmid containing AK026858.1 was digested with the restriction enzymes SmaI and MscI, and a DNA fragment of 446 base pairs (from amino acid 563 to amino acid 110 in amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2). (Corresponding to the array that becomes).
  • This DNA fragment was inserted into the SmaI site of Escherichia coli expression vector pGEX-6P-1 (AmershamPharmamacia), and then introduced into Escherichia coli DH5 strain.
  • the E. coli strain having the recombinant plasmid was cultured, and the p130 protein fragment was purified as a fusion protein with GST by a conventional method.
  • a rabbit (New Zealand White) was immunized by a conventional method to obtain an antiserum. Furthermore, a specific antibody (anti-AK026858.1 translation product antibody) was isolated from the antiserum by a conventional method (affinity purification method) using an antigen protein.
  • a He La cell extract was prepared in the same manner as in Example 1 (1), and was prepared in the same manner as in Example 3 (1), using either normal normal heron serum or anti-hSMG-1 antiserum (antiserum). N, antiserum or antiserum C) were used for immunoprecipitation. After the cell extract and the immune complex were developed by SDS-PAGE, they were analyzed by a Western blot method using the anti-AKO2685.81 translation product antibody prepared in Example 4 (1) according to a conventional method.
  • polypeptide of the present invention it is possible to provide a simple screening system for a therapeutic and / or prophylactic agent for a disease state caused by PTC caused by nonsense mutation. Further, the polynucleotide, the expression vector, the transformant, and the antibody of the present invention are useful for producing the polypeptide of the present invention. As described above, the present invention has been described according to the specific embodiments. However, modifications and improvements obvious to those skilled in the art are included in the scope of the present invention.

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Abstract

　ＳＭＧ−１と結合する新規のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド、並びにｍＲＮＡサーベイランス機構を人為的に制御する物質のスクリーニング系を開示する。　前記ポリペプチドは、ＳＭＧ−１と結合する活性、ＳＭＧ−１によりリン酸化される活性、及びこれらの活性を通じてＳＭＧ−１の働きを制御する活性を有する。

Description

明 細 書
SMG-1結合タンパク質及びその活性を制御する物質のスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 SMG— 1結合タンパク質及びその活性を制御する物質のスクリー ニング方法に関する。 背景技術
遺伝子の変異による表現型の異常の 1ノ 4程度は、 遺伝子の塩基配列の置換、 組換え、 及び Z又は欠失などの変異により、 結果的にタンパク質のコード領域に ナンセンスコドンが出現してしまう形の異常であると言われている。 このような 遺伝子は、 途中で終わった異常なタンパク質をコードするが、 通常、 そのような 異常なタンパク質をコードする mRN Αは検出されない。 これは、 異常な位置に ナンセンスコドンを有する mRNAを識別し、 排除する機構を細胞が備えている ことに起因する。 この機構は、 ナンセンスコドンに起因する mRNA分解機構
(あるいは mRNAサーベイランス機構） と呼ばれ、 ヒトの遺伝性疾患の症状に も大きく反映していると同時に、 免疫担当細胞の成熟に伴って生ずる異常な mR N Aを排除する生理的な役割を有することも示唆されている。 しかし、 その分子 機構に関しては、 脊椎動物では未だにほとんど不明である。
本発明者及ぴその共同研究者は、 ヒト SMG— 1 (h SMG- 1 ) というプロ ティンキナーゼ分子がヒ卜 U P F 1をリン酸化することが、 mRNAサーベイラ ンスの過程に必須であることを明らかにし、 既に発表している [山下暁朗ら，
「ジーンズ■アンド■デベロップメント （G E N E S & DEVEし OPME NT) j , (米国） ， 2001年， 第 1 5巻， p. 221 5-2228 (非特許 文献 1 ) ] 。 しかしながら、 ヒト SMG— 1を含むサーベイランス複合体につい ては未だにほとんど不明である。
なお、 今回、 本発明者が見出した新規のポリペプチドをコードするヒト c DN Aの塩基配列が、 Kawabata, A. , Hikiji.T., Kobatake, N. , lnagak/,Η. , Ikema, Y. ,0kamoto, S. , Okitani.R. , Ota, T. , Suzuki, Y. , ObayashiJ. ,
ishi, T. , Shibahara, T. , Tanaka, T. , Nakamura, Y. , Isogai, T. and Sugano, S. "NEDO human cDNA sequencing project. " Homo sapiens cDNA... [ i :10439815]. Datasheet, [on I i ne] . Entrez Nucleotides database, National Center for Biotechnology Information. Entrez accession No: AK026858. [retrieved on 2002-09-02] . Retrieved from the Internet: く URL: http://www. ncbi. nlm. nih. gov： 80/entrez/query. fc i？ cmd=Retr i eve&db=nuc I eot i de& I i st一 u i ds=10439815&d opt=GenBank> (非特許文献 2) に報告されている。 しカヽし、 この文献には、 この c D N Aを発現してポリペプチドを取得したことも、 前記ポリぺプチドの機能に. ついても、 全く開示がない。
また、 本発明者が見出した新規ポリべプチドと近似の分子量を有するタンパク 質 p 1 40が、 本発明者により、 大西ら， 「新規 p I 3 K関連巨大プロテインキ ナーゼの構造と機能の解析」 ， 「1 999年度第 22回日本分子生物学会年会プ ログラム '講演要旨集」 ， 1 999年， p. 235 (非特許文献 3) に開示され ている。 しかしながら、 前記文献は、 細胞周期の進行又はチェックポイント制御 に重要な機能を示すヒトフォスファチジルイノシトールキナーゼ （P I K) 一関 連タンパク質キナーゼ （P I KK) について開示するものであり、 mRNAサー ペイランス機構に関する開示もそれを示唆する記載も全くない。
(非特許文献 1 ) 山下暁朗ら， 「ジーンズ'アンド 'デベロップメント （GE NES & DEVE LOPMENT) J , (米国） ， 2001年， 第 1 5卷， p. 221 5-2228
(非特許文献 2) Kawabata, A. , Hikiji.T. , Kobatake, . , Inagaki'H. ,
Ikema.Y..Okamoto, S. , Okitani.R. , Ota, T.， Suzuki, Y. , ObayashiJ. ,
Nishi, T. , Shibahara, T. , Tanaka, T. , Nakamura, Y. , Isogai, T. and Sugano, S. "NEDO human cDNA sequencing project. " Homo sapiens cDNA... [gi :10439815]. Datasheet, [online]. Entrez Nucleotides database, National Center for Biotechnology Information. Entrez accession No: AK026858. [retrieved on 2002-09-02] . Retrieved from the Internet: く URL: http://www. ncbi. nlm. nih. gov： 80/entrez/query. fcg i？ cmd=Retr i eve&db=nuc I eot i de& I i st—u i ds=10439815&d 2003/011353
3
opt=GenBank>
(非特許文献 3) 大西ら， 「新規 p I 3 K関連巨大プロテインキナーゼの構造 と機能の解析」 ， 「1 999年度第 22回日本分子生物学会年会プログラム '講 演要旨集」 , 1 999年， p. 235 発明の開示
本発明者は、 mRN Aサーベイランス機構を解明することにより、 mRNAサ 一べィランス機構を人為的に制御可能な方法を開発することを目的として、 鋭意 探求したところ、 hSMG— 1と強固に結合した新規タンパク質を同定し、 全構 造を決定した。 この分子は、 細胞内で hSMG— 1に強固に結合しており、 キナ ーゼ活性の制御や細胞内の局在化、 更にはサーベイランス複合体の活性制御に大 きく関わっていることが予測される。 従って、 mRN Aサーベイランス機構を人 為的に制御する際の分子標的候補の一つであることを本発明者は見出した。 本発 明はこのような知見に基づくものである。
従って、 本発明の課題は、 SMG— 1と結合する新規のポリペプチド及びそれ をコードするポリヌクレオチドを提供し、 更には、 mRN Aサーベイランス機構 を人為的に制御する物質のスクリーニング系を提供することにある。
本発明は、 （1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 (2) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 SMGBP 1活性を 示すポリペプチド、 （3) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1又は複数の箇 所において、 1又は複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 及びノ又は挿入されたアミ ノ酸配列を含み、 しかも、 SMGBP "I活性を示すポリペプチド、 又は （4) 配 列番号 2で表されるァミノ酸配列との相同性が 90 %以上であるアミノ酸配列を 含み、 しかも、 SMGBP 1活性を示すポリペプチドに関する。
また、 本発明は、 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関す る。
また、 本発明は、 前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
また、 本発明は、 前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドに結合する抗体又はその断片に関する。 TJP2003/011353
4 また、 本発明は、 前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が部分的に又は 完全に抑制されたノックァゥト非ヒ卜動物又は細胞に関する。
また、 本発明は、 （1 ) 前記ポリペプチドと、 SMG— 1と、 試験物質とを、 前記試験物質が存在しなければ前記ポリペプチドの S M G B P 1活性が発揮可能 な条件下で、 接触させる工程、 及び
(2) 前記ポリべプチドの SMGBP 1活性が発揮されたか否かを分析する工程 を含む、 前記ポリべプチドの SMGBP 1活性を制御する物質のスクリーニング 方法に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチド及び SMG— 1を産生可能な細胞と、 試験 物質とを、 前記試験物質が存在しなければ前記細胞が前記ポリべプチドを産生可 能な条件下で、 接触させる工程、 及び
(2) 前記ポリべプチドの SMGBP 1活性が発揮されたか否かを分析する工程 を含む、 請求項 1に記載の前記ポリべプチドの SMGBP 1活性を制御する物質 のスクリーニング方法に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質 （例え ば、 前記スクリーニング方法で得られた、 前記ポリペプチドの S M G B P 1活性 を制御する物質） を有効成分として含有する、 ナンセンス媒介 mRN A崩壊の抑 制剤に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質 （例え ば、 前記スクリーニング方法で得られた、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性 を制御する物質） を有効成分として含有する、 ナンセンス変異により早期翻訳終 止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療及び 又は予防剤に関する。 また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質 〖例え ば、 前記スクリーニング方法で得られた、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性 を制御する物質） を有効成分として含有する、 ナンセンス媒介 mRN A崩壊の促 進剤に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を、 ナ ンセンス媒介 m RNA崩壊の抑制が必要な対象に、 有効量で投与することを含む ナンセンス媒介 mRN A崩壊を抑制する方法に関する。 P2003/011353
5 また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を、 ナ ンセンス変異によリ早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療 及びノ又は予防が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 ナンセンス変異 によリ早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態を治療及びノ又は予 防する方法に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を、 ナ ンセンス媒介 m R N A崩壊の促進が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 ナンセンス媒介 m R N A崩壊を促進する方法に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質の、 ナ ンセンス媒介 mRN A崩壊の抑制剤を製造するための使用に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質の、 ナ ンセンス変異によリ早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療 及び 又は予防剤を製造するための使用に関する。
また、 本発明は、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質の、 ナ ンセンス媒介 mRN A崩壊の促進剤を製造するための使用に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗 h SMG— 1血清 （抗血清 C) を用いて得られたヒト H e L a細胞 抽出液の免疫沈降物について、 リン酸化反応を実施した結果をォー卜ラジオグラ フィ一により示す、 図面である。
図 2は、 2種類の hSMG— 1血清 （抗血清 C又は抗血清 L) を用いて得られ たヒト H e L a細胞抽出液の免疫沈降物について、 リン酸化反応を実施した結果 をオートラジオグラフィ一により示す、 図面である。
図 3は、 ヒト H e L a細胞抽出液の陰イオン交換カラム H i T r a pQによる クロマトグラフである。
図 4は、 図 3に示す各分画におけるヒト SMG— 1の分布を示すために実施し たウェスタンプロット法の結果を示す、 図面である。
図 5は、 図 3に示す各分画の h SMG— 1血清による各免疫沈降物について、 リン酸化反応を実施した結果をォートラジオグラフィーにより示す、 図面である ( 図 6は、 図 3に示す分画 20~ 31の h SMG— 1血清による各免疫沈降物に ついて、 リン酸化反応を実施した結果をウェスタンプロットにより示す、 図面で める。
図 7は、 ヒト H e L a細胞抽出液の抗 h SMG— 1 I g G (N抗体） による免 疫沈降物について、 SDS— PAGEを実施した後、 銀染色した結果を示す、 図 面である。
図 8は、 AK026858. 1翻訳産物の一次構造と、 AP 1、 AP 2、 AP 3、 AP 4, AP 5、 及び A P 8に対応する各配列の位置を示す説明図である。 図 9は、 ヒト H e La細胞抽出液の抗 h S M G— 1抗血清 （抗血清 N、 抗血清 し、 又は抗血清 C) による免疫沈降物について、 抗 A KO 26858. 1翻訳産 物抗体を用いるウェスタンブロッ卜の結果を示す、 図面である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
[1 ] 本発明のポリべプチド
本発明のポリべプチドには、
( 1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド；
(2) 配列番,号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 SMGBP 1活性を 示すポリべプチド；
(3) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1又は複数の箇所において、 1又は 複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び Z又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 し かも、 SMGBP 1活性を示すポリペプチド （以下、 機能的等価改変体と称す る） ；並びに
( 4 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列との相同性が 900/0以上であるァミノ 酸配列を含み、 しかも、 SMGBP 1活性を示すポリペプチド （以下、 相同ポリ ペプチドと称する）
が含まれる。
本発明のポリべプチドである 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポ リペプチド」 は、 SMG— 1 (特にはヒト SMG— 1 ) と結合して複合体を形成 することのできる、 991個のアミノ酸残基からなる新規タンパク質である。 本 発明者は、 このポリペプチドが SMG— 1結合活性を有することから、 「SMG B P 1 J (SMG B i n d i n g P r o t e i n 1 ) と命名した。
本明細書において、 rsMGBP 1活性」 とは、 SMG— 1 (特にはヒト SM G-1 ) と結合する活性、 SMG— 1によりリン酸化される活性、 及び 又はこ れらの活性を通じて SMG— 1の働きを制御する活性を意味する。 また、 本明細 書において、 「SMGBP 1活性を示す J とは、 これらの活性の少なくとも 1つ を示すことを意味する。
なお、 SMG— 1は、 mRN Aサーベイランスの過程に必須なフォスファチジ ルイノシトールキナーゼ （P I K) —関連タンパク質キナーゼ （P I KK) であ リ、 自己リン酸化能を有すると同時に、 ナンセンス媒介 mRN A崩壊 （n o n s e n s e— me d i a t e d m R N A d e c a y ； NMD) の必須因子であ る UP F 1ZSMG— 2 [S u n, Xら， P r o c. N a t に Ac a d. S c に USA, 1 998年， 95, p. 1 0009— 1 001 4 ；及び B h a t t a c h a r y a, A. ら， Rn a, 2000年， 6, p. 1 226-1 235] をリン酸化する活性を有するタンパク質であり、 S M G— 1の活性が N M Dを正 に制御している [山下暁朗ら， 「ジーンズ■アンド 'デベロップメント （GEN ES & DEVE LOPMENT) J ， （米国） ， 2001年， 第 1 5巻， p 221 5-2228] 。
本明細書において、 試験対象であるポリペプチドが 「SMGBP 1活性を示 す J か否かを判定する方法は、 特に限定されるものではない力 例えば、 試験ポ リペプチドと SMG— 1 (例えば、 ヒト SMG— 1 ) とを接触させ、 試験ポリぺ プチドと SMG— "！との複合体が形成されるか否かを分析することにより、 判定 することができる。
前記判定方法において、 試験ポリペプチドと SMG— 1とを接触させる方法と しては、 例えば、 試験ポリペプチド及び SMG—1を、 それぞれ別々に遺伝子ェ 学的に調製し、 それらを接触させる方法、 あるいは、 試験ポリペプチドをコード するポリヌクレオチドを、 SMG— 1を産生可能な細胞に導入し、 細胞内で試験 ポリペプチド及び SMG— 1を産生させ、 接触させる方法などを挙げることがで ぎる。
また、 前記判定方法において、 試験ポリペプチドと SMG— 1との複合体を分 析する方法としては、 例えば、
SMG— 1又は試験ポリペプチドのいずれか一方に対する抗体 （例えば、 抗 SM G— 1抗体） を用いて免疫沈降を行なった後、 残るもう一方のポリペプチドに対 する抗体 （例えば、 抗試験ポリペプチド抗体） を用いるウェスタンプロットによ リ、 後者のポリペプチドの存在の有無を確認する方法 [例えば、 後述の実施例 4 (2) に記載の方法] ；
SMG— 1又は試験ポリペプチドのいずれか一方に対する抗体 （例えば、 抗 SM G— 1抗体） を用いて免疫沈降を行なった後、 電気泳動し、 適当な検出法 （例え ば、 銀染色） により、 残るもう一方のポリペプチド （例えば、 試験ポリぺプチ ド） の存在の有無を確認する方法 [例えば、 実施例 3 (1 ) に記載の方法] ； 抗 SMG— 1抗体を用いて免疫沈降を行なった後、 SMG— 1によるリン酸化が 可能な条件下でリン酸化を実施し、 リン酸化された試験ポリべプチドの存在の有. 無を確認する方法 [例えば、 実施例 1 (2) 〜 （4) に記載の方法] ；又は クロマトグラフィーを実施した後、 試験ポリペプチド及び S M G— 1が同一分画 に存在するか否かを確認する方法 [例えば、 実施例 2 (2) 及び （3) に記載の 方法]
などを挙げることができる。
本発明のポリペプチドである 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 し かも、 SMGBP 1活性を示すポリペプチド J としては、 例えば、 配列番号 2で 表されるアミノ酸配列の N末端及び 又は C末端に、 適当なマーカー配列等が付 加されたアミノ酸配列からなり、 しかも、 SMGBP 1活性を示す融合ポリぺプ チドを挙げることができる。
本発明のポリべプチドで用いることのできるマーカー配列としては、 例えば、 ポリペプチドの発現の確認、 細胞内局在の確認、 あるいは、 精製等を容易に行な うための配列を用いることができ、 例えば、 F LAGタグ、 へキサーヒスチジ ン■タグ、 へマグルチニン■タグ、 又は m y cェピ I ^一プなどを挙げることがで さる。 TJP2003/011353
9 本発明の機能的等価改変体は、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1又は複 数の箇所において、 1又は複数個 （好ましくは 1〜 1 0個、 より好ましくは 1〜 7個、 更に好ましくは 1〜5個） 、 例えば、 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 SMGBP 1活性を示すポ リペプチドである限り、 特に限定されるものではなく、 その起源もヒトに限定さ れない。
例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド （すなわち, ヒト SMGBP 1 ) のヒトにおける変異体が含まれるだけでなく、 ヒ卜以外の生 物 （例えば、 サル、 マウス、 ラッ卜、 ハムスター、 又はィヌ） 由来の機能的等価 改変体が含まれる。 更には、 それらの天然ポリペプチド （すなわち、 ヒト由来の 変異体、 あるいは、 ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体） をコードするポリ ヌクレオチドを元にして、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からな るポリべプチドをコードするポリヌクレオチドを元にして、 遺伝子工学的に人為 的に改変したポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリペプチドのヒ卜における変異 体、 あるいは、 ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体は、 当業者であれば、 配 列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドをコ一ドするポリヌクレ ォチドの塩基配列 （例えば、 配列番号 1で表される塩基配列における第 1 6番目 〜第 2988番目の塩基からなる配列） の情報を基にして、 取得することができ る。 なお、 遺伝子組換え技術については、 特に断りがない場合、 公知の方法 （例 7Lば、 S amb r o o k, J. b, Mo l e c u l a r C l o n i n g— A L a b o r a t o r y M a n u a I " , Co l d S p r i n g H a r b o r La b o r a t o r y, NY, 1 989 ) に従って実施することが可能であ る。
例えば、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプローブ を設計し、 前記プライマー又はプローブと、 目的とする生物 [例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 サル、 マウス、 ラッ卜、 ハムスター、 又はィヌ） ] 由来の試料 (例えば、 総 RNA若しくは mRN A画分、 c DNAライブラリ一、 又はファー P T/JP2003/011353
10 ジライブラリー） とを用いてポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) 法 （S a i k i , R. K. ら， S c i e n c e, 239, 487-491 , 1 988) 又はハイブ リダイゼーション法を実施することにより、 ポリべプチドコードするポリヌクレ ォチドを取得し、 そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、 発現 したポリべプチドが S MGBP 1活性を示すことを確認することにより、 所望の ポリべプチドを取得することができる。
また、 前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、 常法、 例えば， 部位特異的突然変異誘発法 （s i t e— s p e c i f i c mu t a g e n e s i s ； M a r k , D. F. ら， P r o c. N a t l . A c a d. S c i . USA, 81 , 5662-5666, 1 984 ) により、 ポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを取得し、 そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ, 発現したポリぺプチドが S M GBP 1活性を示すことを確認することにより、 所 望のポリぺプチドを取得することができる。
本発明の相同ポリぺプチドは、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列との相同性 が 90%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 SMGBP 1活性を示すポリ ペプチドである限り、 特に限定されるものではないが、 配列番号 2で表されるァ ミノ酸配列に関して、 好ましくは 95%以上、 より好ましくは 98%以上、 更に 好ましくは 99 %以上の相同性を有するァミノ酸配列を含むことができる。
なお、 本明細書における前記 「相同性」 とは、 BLAST (Ba s i c I o c a I a I i n g m e n t s e a r c h t o o l ; A l t s c h u l , S. F. ら， J. Mo に B i o l . , 21 5, 403— 41 0， 1 990) により 得られた値を意味する。
[2] 本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレ ォチドである限り、 特に限定されるものではなく、 例えば、 配列番号 1で表され る塩基配列における第 1 6番目〜第 2988番目の塩基からなる配列からなるポ リヌクレオチド、 あるいは、 配列番号 1で表される塩基配列における第 1 6番目 〜第 2988番目の塩基からなる配列を含むポリヌクレオチドを挙げることがで きる。 なお、 本明細書における用語 「ポリヌクレオチド」 には、 DNA及びRN 3011353
11
Aの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、 特に限定されるものではないが、 例 えば、 （1 ) PCRを用いた方法、 （2) 常法の遺伝子工学的手法 （すなわち、 c DN Aライブラリーで形質転換した形質転換株から、 所望の c DN Aを含む形 質転換株を選択する方法） を用いる方法、 又は （3) 化学合成法などを挙げるこ とができる。 以下、 各製造方法について、 順次、 説明する。
前記 （1 ) の PCRを用いた方法では、 例えば、 以下の手順により、 本発明の ポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、 本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒ卜細胞又は組織か ら mRN Aを抽出する。 次いで、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ ォチドの塩基配列に基づいて、 本発明のポリべプチドに相当する mRN Aの全長 を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセット、 あるいは、 その一部の mRN A領域を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセットを作成する。 抽出した前 記 mRNAを錶型とする逆転写酵素—ポリメラーゼ連鎖反応 （RT— PCR) を 行なうことにより、 本発明のポリぺプチドの全長 c D N A又はその一部を得るこ とができる。
より詳細には、 まず、 本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織 から、 本発明のポリべプチドをコ一ドする mRN Aを含む総 RN Aを既知の方法 により抽出する。 抽出法としては、 例えば、 グァニジン 'チオシァネート 'ホッ 卜■フエノール法、 グァニジン■チオシァネート一グァニジン■塩酸法、 又はグ ァニジン■チオシァネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、 グァニジ ン■チオシァネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。 本発明のポリぺプ チドの産生能力を有する細胞又は組織は、 例えば、 本発明のポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンプロッティング法、 ある いは、 本発明のポリべプチドに特異的な抗体を用いたゥエスタンブロッティング 法などにより特定することができる。
続いて、 抽出した mRN Aを精製する。 mRN Aの精製は常法に従えばよく、 例えば、 mRN Aをオリゴ （d T) セルロースカラムに吸着後、 溶出させること により精製することができる。 所望により、 ショ糖密度勾配遠心法等により mR N Aを更に分画することもできる。 また、 mRN Aを抽出しなくても、 市販され ている抽出精製済みの mRN Aを用いることもできる。
次に、 精製された mRN Aを、 例えば、 ランダムプライマー、 オリゴ d Tブラ イマ一、 及びノ又はカスタム合成したプライマーの存在下で、 逆転写酵素反応を 行ない、 第 1鎖 c DN Aを合成する。 この合成は、 常法によって行なうことがで きる。 得られた第 1鎖 c DNAを用い、 目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の 領域を挟んだ 2種類のプライマーを用いて PC Rを実施し、 目的とする c DN A を増幅することができる。 得られた D N Aをァガロースゲル電気泳動等によリ分 画する。 所望により、 前記 DN Aを制限酵素等で切断し、 接続することによって 目的とする DN A断片を得ることもできる。
前記 （2) の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、 例えば、 以下の手順 により、 本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、 前記の PCRを用いた方法で調製した mRN Aを錶型として、 逆転写酵 素を用いて 1本鎖 c DN Aを合成した後、 この 1本鎖 c DN Aから 2本鎖 c DN Aを合成する。 その方法としては、 例えば、 S 1ヌクレアーゼ法 （E f s t r a t i a d i s , A. ら， Ce l I , 7 , 279-288, 1 976) 、 L a n d 法 （L a n d, H. ら， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 9, 2251 -2266, 1 981 ) 、 0. J o o n Y o o法 （Yo o， O. J - ら， P r o c . N a t l . Ac a d. S c に USA, 79, 1 049-1 053, 1 9 83) 、 又は O k a y ama— Be r g法 (O k a y a m a , H. 及び B e r g, P. , M o I . Ce l に B i o l . ， 2, 1 61— 1 70, 1 982) などを 挙げることができる。
次に、 前記 2本鎖 c DN Aを含む組換えプラスミドを作製した後、 大腸菌 （例 えば、 DH5 株、 HB 1 01株、 又は JM 1 09株） に導入して形質転換させ, 例えば、 テトラサイクリン、 アンピシリン、 又はカナマイシン等に対する薬剤耐 性を指標として、 組換体を選択する。 宿主細胞の形質転換は、 例えば、 宿主細胞 が大腸菌の場合には、 H a n a h a nの方法 （H a n a h a n, D. J. , Mo に B i o l . , 1 66, 557-580, 1 983) 、 すなわち、 C a C I 2, MgC I 2、 又は Rb C Iを共存させて調製したコンビテント細胞に、 前記組換 え DN A体を加える方法により実施することができる。 なお、 ベクターとしては、 プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、 目的の cDN Aを有する形質転換株 を選択する方法としては、 例えば、 以下に示す （ i ) 合成オリゴヌクレオチドプ ローブを用いる形質転換株スクリーニング法、 （ii) PCRにより作製したプロ ーブを用いる形質転換株スクリーニング法、 （iii) 本発明のポリペプチドに対 する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、 又は （iv) セレクティブ 'ハイ ブリダィゼーシヨン■ トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング 法を採用することができる。 .
前記 （ i ) の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリー二 ング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DN Aを有する形質転換株を 選択することができる。
すなわち、 本発明のポリべプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチ ドを合成し、 これをプローブ （32P又は33 Pで標識する） として、 形質転換株の DN Aを変性固定したニトロセルロースフィルター又はポリアミドフィルターと ハイブリダィズさせ、 得られた陽性株を検索して、 これを選択する。 なお、 プロ ーブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、 コドン使用頻度を用いて導い たヌクレオチド配列とすることもできるし、 あるいは、 考えられるヌクレオチド 配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。 後者の場合には, イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
前記 （U) の PCRにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニン グ法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DN Aを有する形質転換株を選 択することができる。
すなわち、 本発明のポリべプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアン チセンスプライマ一の各オリゴヌクレオチドを合成し、 これらを組合せて PCR を行ない、 目的ポリべプチドの全部又は一部をコードする DN A断片を増幅する ( ここで用いる錶型 DN Aとしては、 本発明のポリべプチドを産生する細胞の mR N Aより逆転写反応にて合成した c DN A、 又はゲノム DN Aを用いることがで きる。 このようにして調製した DNA断片を、 例えば、 32P又は33 Pで標識し、 これをプローブとして用いてコロニーハイプリダイゼーシヨン又はプラークハイ ブリダイゼーションを行なうことにより、 目的の c DNAを有する形質転換株を 選択する。
前記 （iii) の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリ 一二ング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DN Aを有する形質転換 株を選択することができる。
すなわち、 形質転換株の培養上清、 細胞内、 又は細胞表面にポリペプチドを産 生させ、 本発明のポリべプチドに対する抗体及び前記抗体に対する 2次抗体を用 いて、 所望のポリペプチド産生株を検出し、 目的の c DN Aを有する形質転換株 を選択する。
前記 （iv) のセレクティブ■ハイブリダィゼーシヨン■ トランスレーション系 を用いる形質転換株スクリーニング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DNAを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、 形質転換株から得られる c DN Aを、 ニトロセルロースフィルター 等にブロッ卜し、 本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製し た m R N Aをハイブリダィズさせた後、 c D N Aに結合した m R N Aを解離させ, 回収する。 回収された mRN Aを適当なポリペプチド翻訳系、 例えば、 アフリカ ッメガエルの卵母細胞へ注入したり、 あるいは、 ゥサギ網状赤血球ライゼート又 は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、 ポリペプチドに翻訳させる。 本発明のポリべ プチドに対する抗体を用いて検出して、 目的の c D N Aを有する形質転換株を選 択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、 公知の方法 （例えば、 S amb r o o k, J. ら， "Mo l e c u l a r C I o n i n g— A L a b o r a t o r y Ma n u a l , Co l d S p r ι n g H a r b o r La b o r a t o r y, NY, 1 989) に従って実施す ることができる。 例えば、 細胞よりプラスミド DNAに相当する画分を分離し、 得られたプラスミ ド DN Aから cDN A領域を切り出すことにより行なうことが. できる。
前記 （3) の化学合成法を用いた方法では、 例えば、 化学合成法によって製造 したり N A断片を結合することによって、 本発明のポリヌクレオチドを製造する ことができる。 各 DNAは、 DNA合成機 [例えば、 O l i g o 1 00 OM D N A S y n t h e s i z e r (B e c km a n社製） 、 又は 394 DNA ZRNA S y n t h e s i z e r ( A p p I i e d B i o s y s t ems X 製） など] を用いて合成することができる。
また、 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリペプチドの情報に基づいて, 例えば、 ホスフアイ卜■ トリエステル法 （H u n k a p ί I I e r , M. ら， N a t u r e, 1 0, 1 05-1 1 1 , 1 984 ) 等の常法に従い、 核酸の化学合 成により製造することもできる。 なお、 所望アミノ酸に対するコドンは、 それ自 体公知であり、 その選択も任意でよく、 例えば、 利用する宿主のコドン使用頻度 を考慮して、 常法に従って決定することができる （C r a n t h am, R. ら， N u c l e i c Ac i d s Re s. ， 9, r 43 - r 74, 1 981 ) 。 更 に、 これら塩基配列のコドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコードす る合成ォリゴヌクレオチドからなるブラィマーを利用した部位特異的突然変異誘 発 (s i t e s p e c i f i c mu t a g e n e s i sノ (Ma r k, D . F. ら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 81 , 5662-5 666, 1 984) 等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られる DNAの配列決定は、 例えば、 マキ サム—ギルバー卜の化学修飾法 （Ma X am, A. M. 及び G i I b e r t , W. , "Me t h o d s i n En z ymo I o g y" , 65 , 499— 55 9, 1 980) ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法 （Me s s i n g, J. 及ぴ V i e i r a , J. , G e n e, 1 9, 269-276, 1 982) 等により行 なうことができる。
[3] 本発明の発現ベクター及び形質転換体
単離された本発明のポリヌクレオチドを、 適当なベクター DN Aに再び組込む ことにより、 真核生物又は原核生物の宿主細胞をトランスフエクシヨンすること ができる。 また、 これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわ る配列を導入することにより、 それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを 発現させることが可能である。 P T/JP2003/011353
16 本発明の発現ベクターは、 本発明のポリヌクレオチドを含む限り、 特に限定さ れるものではなく、 例えば、 用いる宿主細胞又は導入対象細胞に応じて適宜選択 した公知の発現ベクターに、 本発明のポリヌクレオチドを挿入することによリ得 られる発現ベクターを挙げることができる。 本発明の発現ベクターには、 本発明 の組換えポリべプチドを製造するための発現ベクターと、 遺伝子治療により体内 で本発明のポリべプチドを産生させるための発現ベクターとが含まれる。
また、 本発明の形質転換体も、 本発明の前記発現ベクター又はポリヌクレオチ ドでトランスフエクシヨンされ、 本発明のポリヌクレオチドを含む限リ、 特に限 定されるものではなく、 例えば、 本発明のポリヌクレオチドが、 宿主細胞の染色 体に組み込まれた細胞であることもできるし、 あるいは、 本発明によるポリヌク レオチドを含む発現ベクターの形で含有する細胞であることもできる。 また、 本 発明のポリペプチドを発現している細胞であることもできるし、 あるいは、 本発 明のポリべプチドを発現していない細胞であることもできる。 本発明の形質転換 体は、 例えば、 本発明の発現ベクターにより、 所望の宿主細胞をトランスフエク シヨンすることにより得ることができる。
例えば、 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 及び酵母等の細胞が含ま- れ、 脊椎動物細胞としては、 例えば、 サルの細胞である COS細胞 （G I u zm a n, Y. ， C e I I， 23, 1 75-1 82, 1 981 ) 、 チャイニーズ■ハ ムスター卵巣細胞 （CHO) のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株 （U r I a u b G. 及び C h a s i n , L. A. ， P r o c. N a t l . Ac a d. S c i . U S A, 77, 421 6-4220, 1 980) 、 ヒト胎児腎臓由来 H EK293 細胞、 前記 H EK293細胞にェプスタイン 'バーウィルスの EBNA— 1遺伝 子を導入した 293— EBN A細胞 （ I n v i t r o g e n社） 、 又はヒト由来 細胞である 293 T細胞 （D u B r i d g e, R. B. ら， Mo に Ce I に B i o l . , 7， 379-387, 1 987) 等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現べクターとしては、 通常発現しょうとする遺伝子の上流に 位置するプロモーター、 RN Aのスプライス部位、 ポリアデニル化部位、 及び転， 写終結配列等を有するものを使用することができ、 更に必要により、 複製起点を 有しているものも使用することができる。 前記発現ベクターの例としては、 例え 1フ ぱ、 SV40の初期プロモーターを有する pSV2 d h f r (S u b r a m a n i， S. ら， Mo に Ce l l . B i o に , 1 , 854-864, 1 981 ) ヒ卜の延長因子プロモーターを有する p E F— BOS (M i z u s h i m a , S 及び N a g a t a, S . ' Nu c l e i c Ac i d s Re s. , 1 8， 53 22， 1 990) 、 又はサイトメガロウィルスプロモーターを有する p CE P 4 ( I n V i t r o g e n社） 等を挙げることができる。
宿主細胞として COS細胞を用いる場合には、 発現ベクターとして S V40複 製起点を有しているものを使用すれば、 細胞内で自律増殖が可能である。 更に、 転写プロモーター、 転写終結シグナル、 及び RNAスプライス部位を備えたもの を用いることができ、 例えば、 pME 1 8S (Ma r u y ama, K. 及び T a k e b e, Y. ， Me d. I mm u n o に ， 20, 27-32, 1 990) 、 p E F— BOS (M i z u s h i m a , S. 及び N a g a t a , S. , N u c I e i c Ac i d s Re s. , 1 8， 5322, 1 990) 、 又は p C D M 8
(S e e d, B. ， N a t u r e, 329, 840-8 2, 1 987) 等を挙 げることができる。
前記発現ベクターは、 例えば、 DEAE—デキストラン法 （Lu t hma n, H . 及び M a g n u s s o n, G. , N u c l e i c Ac i d s Re s. ， 1 1， 1 295-1 308, 1 983 ) 、 リン酸カルシウム一 D N A共沈殿法
(G r a h am, F. L . 及び v a n d e r Ed, A. J. , V i r o l o g y , 52, 456— 457, 1 973 ) 、 市販のトランスフエクシヨン試薬
(例えば、 F uGENETM6 T r a n s f e c t i o n Re a e n t ； B o e r i n g e r Ma n n h e i m社製） を用いた方法、 あるいは、 電気パス ル穿孔法 （N e uma n n, E. ら， EMBO J - , 1， 841 -845, 1 982) 等により、 COS細胞に取り込ませることができる。
更に、 宿主細胞として CHO細胞を用いる場合には、 本発明のポリペプチドを コードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、 G41 8耐性マーカー として機能する n e o遺伝子を発現することのできるベクタ一、 例えば、 p RS Vn e o (S amb r o o k, J. b, Mo l e c u l a r C l o n i n g ― A L a b o r a t o r y M a n u a I " , Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, NY, 1 989) 又は p SV2— n e o (S o u t h e r n , P. J. 及び Be r g, P. ， J. Mo に A p p I . Ge n e t . ' 1， 327-341 , 1982) 等をコ ■ トランスフエク卜し、 G41 8耐性のコ口ニーを選択することにより、 本発明のポリぺプチドを安定に産生す る卜ランスフエクシヨンされた細胞を得ることができる。
遺伝子治療のベクターとしては、 一般的に使用されているベクタ一 （例えば、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 又はセンダイウィルス等） を用いることがで きる。
本発明の形質転換体は、 常法に従って培養することができ、 前記培養により細 胞内に本発明のポリべプチドが生産される。 前記培養に用いることのできる培地 としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択すること ができる。 例えば、 COS細胞の場合には、 例えば、 RPM I— 1 640培地又 はダルベッコ修正イーグル最小必須培地 （DMEM) 等の培地に、 必要に応じて 牛胎仔血清 （FBS) 等の血清成分を添加した培地を使用することができる。 ま た、 293— EBN A細胞の場合には、 牛胎仔血清 （FBS) 等の血清成分を添 加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地 （DMEM) 等の培地に G41 8を 加えた培地を使用することができる。
本発明の形質転換体を培養することにより、 前記細胞の細胞内に生産される本 発明のポリべプチドは、 前記ポリべプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用 した各種の公知の分離操作法により、 分離精製することができる。 具体的には、 本発明のポリペプチドを含む細胞抽出液を、 例えば、 通常のタンパク質沈殿剤に よる処理、 限外濾過、 各種液体クロマトグラフィー [例えば、 分子ふるいクロマ トグラフィ一 （ゲル濾過） 、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換体クロマ卜グ ラフィー、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 又は高速液体クロマトグラフィー
(HP LC) 等] 、 若しくは透析法、 又はこれらの組合せ等により、 本発明のポ リベプチドを精製することができる。
本発明のポリべプチドは、 マーカー配列とインフレームで融合して発現させる ことにより、 本発明のポリペプチドの発現の確認、 又は精製等が容易になる。 前 記マーカー配列としては、 例えば、 F LAGタグ、 へキサーヒスチジン 'タグ、 へマグルチニン 'タグ、 又は my cェピトープなどを挙げることができる。 また. マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、 プロテアーゼ （例えば、 ェンテ 口キナーゼ、 ファクター Xa、 又はトロンビンなど） が認識する特異的なアミノ 酸配列を挿入することにより、 マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼによリ 切断除去することが可能である。
[4] 本発明のスクリーニング方法
本発明のポリべプチドを用いると、 本発明のポリべプチドの SMGBP 1活性 を制御 （例えば、 抑制又は促進） する物質をスクリーニングすることができる。 本発明のポリぺプチドであるヒ卜 SMGBP 1は、 mRN Aサーベイランスの過 程に必須なヒト SMG—1と生体内で強固に結合しており、 キナーゼ活性の制御 や細胞内の局在化、 更にはサーベイランス複合体の活性制御に大きく関わってい ることが予測される。 従って、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御 する物質は、 例えば、 SMG— 1活性の制御を介して、 ナンセンス媒介 mRN A 月月 ¾ (n o n s e n s e— me d i a t e d m R N A d e c a y ； NMD; を制御することが可能であるはずであるので、 N M Dが関連する種々の疾病の治 療及び 又は予防剤の候補物質として有用であり、 本発明のポリぺプチドそれ自 体を、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質、 あるいは、 N MDが関連する種々の疾病の治療及び 又は予防剤のスクリーニングツールとし て使用することができる。
なお、 NMDとは、 遺伝子の本来の翻訳領域の途中のコドンが終止コドンに変 異したナンセンス変異 m RN Aを認識して、 特異的に分解する機構である。
NMDが関連する種々の疾病としては、 例えば、 排除されるべき、 PTCを含 む mRN Aが排除されないことが原因で生じる病態、 あるいは、 ナンセンス変異 によリ早期翻訳終止コドン （p r ema t u r e t r a n s l a t i o n t e r m i n a t i o n c o d o n ： PTC) を生じることが原因で生じる病態 を挙げることができる。
ナンセンス変異により PTCを生じることが原因で生じる病態としては、 特に 限定されるものではないが、 例えば、 遺伝性疾患 （例えば、 デセンヌ型筋ジスト 口フィー症） 、 あるいは、 体細胞変異によって生じる癌などを挙げることができ P2003/011353
20 る。 重要な点は、 ゲノムの変異によって生じる全ての疾患の中で、 「ナンセンス 変異により PTCを生じる」 というメカニズムに応じてこれが当てはまるという 点である。
ゲノムの変異により生ずる疾患の 1 4は、 特定遺伝子の途中に終止コドンが 生じてしまうことに起因すると言われている。 その結果、 前記遺伝子が本来コ一 ドする全長ポリぺプチドからなるタンパク質が発現されないばかりでなく、 N M D機構の存在によリ、 前記遺伝子が本来コードする全長ポリべプチドの N末端側 部分断片からなるタンパク質断片も、 ほとんど発現されないこと力 その原因と されている。 し力、し、 遺伝子の途中に終止コ ドンが存在したとしても、 遺伝子の 種類又は終止コドンの位置によっては、 タンパク質断片の状態でも、 全長ポリべ プチドと同程度の、 あるいは、 最小限必要な活性を有する場合も少なくない。 こ の場合、 NMD機構を抑制することができれば、 有効な活性を有するタンパク質 断片の発現が可能となるため、 特定遺伝子の途中に終止コドンが存在するために 生じる病態、 すなわち、 特定遺伝子のナンセンス変異による病態の少なくとも一 部を解消することができることが理論的に予測されている。 しかし、 従来、 NM Dのみを特異的に抑制する手法は、 全く知られていない。
本発明のスクリーニング方法により選択された、 本発明のポリべプチドの SM GBP 1活性を制御する物質の内、 SMGBP 1活性の制御を介して S M G— 1 活性を抑制することのできる物質は、 N M Dを特異的に抑制することが期待でき. 従って、 特定遺伝子のナンセンス変異によるあらゆる病態について、 少なくとも 一部について遺伝子変異を解消することができるという全く新しいタィプの治療 及び 又は予防剤の有効成分として有用である。
あるいは、 本発明のスクリーニング方法により選択された、 本発明のポリぺプ チドの SMGBP 1活性を制御する物質の内、 SMGBP 1活性の制御を介して SMG- 1活性を促進することのできる物質は、 NMDを促進することができる ので、 NMDの促進剤の有効成分として、 あるいは、 排除されるべき、 PTCを 含む mRN Aが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び Z又は予防剤の 有効成分として有用である。
本発明のスクリーニング方法にかけることのできる試験物質としては、 特に限 定されるものではないが、 例えば、 ケミカルファイルに登録されている種々の公 知化合物 （ペプチドを含む） 、 コンビナトリアル 'ケミストリー技術 （T e r r e t t , N. K. ら， T e t r a h e d r o n, 51 , 81 35-81 37, 1 995) 又は通常の合成技術によって得られた化合物群、 あるいは、 ファージ ' ディスプレイ法 （F e l i c i , F. ら， J. Mo に B i o l . ， 222, 3 01 -31 0, 1 991 ) などを応用して作成されたランダム■ぺプチド群を用 いることができる。 また、 微生物の培養上清、 植物若しくは海洋生物由来の天然 成分、 又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験物質として用いることが できる。 更には、 本発明のスクリーニング方法により選択された化合物 （ぺプチ ドを含む） を、 化学的又は生物学的に修飾した化合物 （ペプチドを含む） を用い ることができる。
本発明のスクリーニング方法は、
(1 ) 本発明のポリペプチドと、 SMG— 1 (例えば、 ヒト SMG— 1 ) と、 試 験物質とを、 前記試験物質が存在しなければ前記ポリペプチドの S M G B P 1活 性が発揮可能な条件下で、 接触させる工程 （以下、 接触工程と称する） と、
(2) 前記ポリべプチドの SMGBP 1活性が発揮されたか否かを分析する工程 (以下、 分析工程と称する） と
を含む。
前記接触工程において、 本発明のポリペプチドと SMG— 1と試験物質とを接 触させる方法は、 試験物質が存在しなければ本発明のポリぺプチドの SMGBP 1活性が発揮可能な条件下 （すなわち、 本発明のポリペプチドが SMG— 1と結 合可能な条件下） で、 両者を接触させることができる限り、 特に限定されるもの ではない。 このような接触方法としては、 例えば、 試験ポリペプチド及び SMG 一 1を、 それぞれ別々に遺伝子工学的に調製し、 試験ポリペプチドと SMG— 1 と試験物質とを接触させる方法、 あるいは、 試験ポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを、 SMG— 1を産生可能な細胞に導入し、 試験物質存在下にて、 細胞内で試験ポリペプチド及び SMG— 1を産生させ、 試験ポリペプチドと SM G— " Iと試験物質とを接触させる方法などを挙げることができる。
前記分析工程では、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性が発揮されたか 2003/011353
22 否かを分析する。 より具体的には、 例えば、 本発明のポリペプチドと SMG— 1 との複合体が形成されたか否かを分析する。
分析工程において、 本発明のポリペプチドと SMG— 1との複合体が形成され ていないと判定された場合には、 試験物質は、 本発明のポリペプチドの SMGB P 1活性を抑制する物質であると判断することができる。
分析工程において、 本発明のポリペプチドと SMG— 1との複合体を分析する 方法としては、 例えば、
SMG— 1又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体 （例えば、 抗 SMG— 1抗体） を用いて免疫沈降を行なった後、 残るもう一方のポリペプチド に対する抗体 （例えば、 本発明のポリペプチドに対する抗体） を用いるゥエスタ ンブロットにより、 後者のポリペプチドの存在の有無を確認する方法 [以下、 免 疫沈降及びウェスタンプロット併用法と称する；例えば、 後述の実施例 4 (2) に記載の方法] ；
SMG— 1又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体 （例えば、 抗 SMG— 1抗体） を用いて免疫沈降を行なった後、 電気泳動し、 適当な検出法 (例えば、 銀染色） により、 残るもう一方のポリペプチド （例えば、 本発明のポ リペプチド） の存在の有無を確認する方法 [以下、 免疫沈降及び銀染色併用法と 称する；例えば、 実施例 3 (1 ) に記載の方法] ；
抗 SMG— 1抗体を用いて免疫沈降を行なった後、 SMG— 1によるリン酸化が 可能な条件下でリン酸化を実施し、 リン酸化された本発明のポリべプチドの存在 の有無を確認する方法 [以下、 免疫沈降及びリン酸化反応併用法と称する；例え ば、 実施例 1 (2) 〜 （4) に記載の方法] ；又は
クロマトグラフィーを実施した後、 本発明のポリべプチド及び SMG— 1が同一 分画に存在するか否かを確認する方法 [以下、 分画法と称する；例えば、 実施例 2 (2) 及び （3) に記載の方法]
などを使用することができる。
分析工程において前記免疫沈降及びウェスタンブロット併用法を用いる場合に は、 SMG— 1又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体 （例えば, 抗 SMG— 1抗体） を用いて免疫沈降を行なった後、 残るもう一方のポリべプチ 11353
23 ドに対する抗体 （例えば、 本発明のポリペプチドに対する抗体） を用いてウェス タンプロットを実施する。 ウェスタンブロットの結果、 後者のポリペプチド （例 えば、 本発明のポリペプチド） が検出されれば、 本発明のポリペプチドと SMG —1との複合体が形成された （すなわち、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1 活性が発揮された） と判定することができる。 一方、 後者のポリペプチド （例え ば、 本発明のポリペプチド） が検出されなければ、 本発明のポリペプチドと SM G— 1との複合体が形成されていない （すなわち、 本発明のポリペプチドの SM GBP 1活性が発揮されていない） と判定することができ、 更に、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの S M G B P 1活性を抑制する物質であると判断すること ができる。 同様にして、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性 を促進する物質であることも判断することができる。
分析工程において前記免疫沈降及び銀染色併用法を用いる場合には、 SMG— 1又は本発明のポリペプチドのいずれか一方に対する抗体 （例えば、 抗 SMG— 1抗体） を用いて免疫沈降を行なった後、 電気泳動し、 適当な検出法 （例えば、 銀染色） により、 残るもう一方のポリペプチド （例えば、 本発明のポリべプチ ド） の存在の有無を確認する。 後者のポリペプチド （例えば、 本発明のポリぺプ チド） が検出されれば、 本発明のポリペプチドと SMG— 1との複合体が形成さ れた （すなわち、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性が発揮された） と判 定することができる。 一方、 後者のポリペプチド （例えば、 本発明のポリべプチ ド） が検出されなければ、 本発明のポリペプチドと SMG—1 との複合体が形成 されていない （すなわち、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性が発揮され ていない） と判定することができ、 更に、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性を抑制する物質であると判断することができる。 同様にして、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの S M G B P 1活性を促進する物質であるこ とも判断することができる。
分析工程において前記免疫沈降及ぴリン酸化反応併用法を用いる場合には、 抗 SMG— 1抗体を用いて免疫沈降を行なった後、 SMG— 1によるリン酸化が可 能な条件下でリン酸化を実施し、 リン酸化された本発明のポリべプチドの存在の 有無を確認する。 本発明のポリペプチドが検出されれば、 本発明のポリペプチド と SMG— 1との複合体が形成された （すなわち、 本発明のポリペプチドの SM GBP 1活性が発揮された） と判定することができる。 一方、 本発明のポリぺプ チドが検出されなければ、 本発明のポリべプチドと SMG— 1との複合体が形成 されていない （すなわち、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性が発揮され ていない） と判定することができ、 更に、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの S M G B P 1活性を抑制する物質であると判断することができる。 同様にして、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性を促進する物質であるこ とも判断することができる。
分析工程において前記分画法を用いる場合には、 クロマ卜グラフィーを実施し た後、 本発明のポリべプチド及び SMG— 1が同一分画に存在するか否かを確認 する。 本発明のポリペプチド及び SMG— 1が同一分画に存在すれば、 本発明の ポリペプチドと SMG—1との複合体が形成された （すなわち、 本発明のポリぺ プチドの SMGBP 1活性が発揮された） と判定することができる。 一方、 本発 明のポリぺプチド及び SMG— 1が同一分画に存在しなければ、 本発明のポリべ プチドと SMG— 1との複合体が形成されていない （すなわち、 本発明のポリべ プチドの SMGBP 1活性が発揮されていない） と判定することができ、 更に、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの SMGBP 1活性を抑制する物質であると 判断することができる。 同様にして、 試験物質が、 本発明のポリペプチドの SM GBP 1活性を促進する物質であることも判断することができる。
[5] 本発明の医薬組成物
本発明のスクリーニング方法により選択することのできる SMGBP 1活性を 制御する物質の内、 SMGBP 1活性の制御を介して SMG— 1活性を抑制する 物質は、 NMDを抑制することが可能であり、 ナンセンス変異により PTCを生 じることが原因で生じる病態の治療及び Z又は予防剤の候補物質として有用であ る。 このような SMGBP 1活性制御物質は、 それ単独で、 あるいは、 好ましく は薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、 NMDを抑制することが必要な対象 [例えば、 動物、 好ましくは哺乳動物 （特に はヒト） ] 、 あるいは、 ナンセンス変異により PTCを生じることが原因で生じ る病態の治療及び Z又は予防が必要な対象に、 有効量で投与することができる。 11353
25 一方、 本発明のスクリーニング方法により選択することのできる S M G B P 1 活性を制御する物質の内、 S M G B P 1活性の制御を介して S G - 1活性を促 進する物質は、 N M Dを促進することが可能であり、 排除されるべき、 P T Cを 含む m R N Aが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び 又は予防剤の 候補物質として有用である。 このような S M G B P 1活性制御物質は、 それ単独 で、 あるいは、 好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の 担体又は希釈剤と共に、 N M Dを促進することが必要な対象 [例えば、 動物、 好 ましくは哺乳動物 （特にはヒト） ] 、 あるいは、 排除されるべき、 P T Cを含む m R N Aが排除されないことが原因で生じる病態の治療及び Z又は予防が必要な 対象に、 有効量で投与することができる。
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、 特に限定がなく、 例えば、 散剤、 細 粒剤、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 懸濁液、 ェマルジヨン剤、 シロップ剤、 ェキ ス剤、 若しくは丸剤等の経口剤、 又は注射剤、 外用液剤、 軟膏剤、 坐剤、 局所投 与のクリーム、 若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、 例えば、 ゼラチン、 アルギン酸ナトリウム、 澱粉、 コーン スターチ、 白糖、 乳糖、 ぶどう糖、 マンニット、 カルボキシメチルセルロース、 デキストリン、 ポリビニルピロリ ドン、 結晶セルロース、 大豆レシチン、 ショ糖, 脂肪酸エステル、 タルク、 ステアリン酸マグネシウム、 ポリエチレングリコール, ケィ酸マグネシウム、 無水ゲイ酸、 又は合成ゲイ酸アルミニウムなどの賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 界面活性剤、 滑沢剤、 流動性促進剤、 希釈剤、 保存剤、 着色剤， 香料、 矯味剤、 安定化剤、 保湿剤、 防腐剤、 又は酸化防止剤等を用いて、 常法に 従って製造することができる。
非経口投与方法としては、 注射 （皮下、 静脈内等） 、 又は直腸投与等が例示さ れる。 これらのなかで、 注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、 注射剤の調製においては、 有効成分の他に、 例えば、 生理食塩水若し <はリンゲル液等の水溶性溶剤、 植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶 剤、 ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防 腐剤、 懸濁化剤、 又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、 本発明の医薬組成物は、 徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法 3
26 を用いて投与してもよい。 例えば、 本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポ リマーのペレツ卜に取り込ませて、 このペレツトを治療又は予防すべき組織中に 外科的に移植することができる。
本発明の医薬組成物は、 これに限定されるものではないが、 0. 01〜99重 量0 /o、 好ましくは 0. 1〜80重量％の量で、 有効成分を含有することができる。 本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、 例えば、 使用する有効成分の種 類、 病気の種類、 患者の年齢、 性別、 体重、 症状の程度、 又は投与方法などに応 じて適宜決定することができ、 経口的に又は非経口的に投与することが可能であ る。
また、 投与形態も医薬品に限定されるものではなく、 種々の形態、 例えば、 機 能性食品や健康食品 （飲料を含む） 、 又は飼料として飲食物の形で与えることも 可能である。
[6] 本発明の抗体
本発明のポリペプチドに反応する抗体 （例えば、 ポリクローナル抗体又はモノ クローナル抗体） は、 各種動物に、 本発明のポリペプチド、 又はその断片を直接 投与することで得ることができる。 また、 本発明のポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドを導入したプラスミ ドを用いて、 DN Aワクチン法 （R a z， E. ら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 91 , 951 9-952 3 , 1 994 ;又は D o n n e I I y, J. J . ら, J. I n f e c t. D i s. , 1 73, 31 4-320, 1 996 ) によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、 例えば、 本発明のポリペプチド又はその断片を適当な アジュバント （例えば、 フロイント完全アジュバントなど） に乳濁した乳濁液を, 腹腔、 皮下、 又は静脈等に免疫して感作した動物 （例えば、 ゥサギ、 ラット、 ャ ギ、 又は二ヮ卜リ等） の血清又は卵から製造することができる。 このように製造 された血清又は卵から、 常法のポリべプチド単離精製法によりポリクローナル抗 体を分離精製することができる。 そのような分離精製方法としては、 例えば、 遠 心分離、 透析、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 又は DEAE—セルロース、 ハイ ドロキシァパタイト、 若しくはプロ亍イン Aァガロース等によるクロマトグラフ ィ一法を挙げることができる。 3
27 モノクローナル抗体は、 例えば、 ケーラーとミルスタインの細胞融合法 （Ko h I e r , G. 及び M i I s t e i n, C. ， N a t u r e, 256, 495— 497, 1 975) により、 当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、 本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント （例えば, フロイント完全アジュバントなど） に乳濁した乳濁液を、 数週間おきにマウスの 腹腔、 皮下、 又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。 最終免疫後, 脾臓細胞を取り出し、 ミエローマ細胞と融合してハイプリ ドーマを作製する。
ハイプリ ドーマを得るためのミエローマ細胞としては、 例えば、 ヒポキサンチ ンーグァニン一ホスホリポシルトランスフエラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠 損のようなマーカーを有するミエ口一マ細胞 （例えば、 マウスミエローマ細胞株 P3 X63Ag 8. U 1 ) を利用することができる。 また、 融合剤としては、 例 えば、 ポリエチレングリコールを利用することができる。 更には、 ハイプリ ドー マ作製における培地として、 例えば、 イーグル氏最小必須培地、 ダルベッコ氏変 法最小必須培地、 又は RPM I— 1 640などの通常よく用いられている培地に, 1 0〜30%のゥシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。 融合株は、 HA T選択法により選択することができる。 ハイプリ ドーマのスクリーニングは培養 上清を用い、 E L I S A法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、 目的の抗体を分泌しているハイプリ ドーマのクローンを選択することができる。 また、 限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、 ハイプリ ド 一マの単クローン性を保証することができる。 このようにして得られるハイプリ ドーマは、 培地中で 2~4日間、 あるいは、 プリスタンで前処理した B A LBZ c系マウスの腹腔内で 1 0〜 20日間培養することで、 精製可能な量の抗体を産 生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、 培養上清又は腹水から常法のポ リベプチド単離精製法によリ分離精製することができる。 そのような分離精製方 法としては、 例えば、 遠心分離、 透析、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 又は DE AE—セルロース、 ハイドロキシァパタイト、 若しくはプロテイン Aァガロース 等によるクロマトグラフィ一法を挙げることができる。
また、 モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、 前記モノクロ一 ナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、 適当な 宿主細胞 （例えば、 大腸菌、 酵母、 又は動物細胞） に導入して生産させることも できる。
以上のように分離精製された抗体 （ポリク口一ナル抗体及びモノクローナル抗 体を含む） について、 常法により、 ポリペプチド分解酵素 （例えば、 ペプシン又 はパパイン等） によって消化を行ない、 引き続き、 常法のポリペプチド単離精製 法により分離精製することで、 活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、 例えば,
F (a b' ) 2、 Fa b, F a b' 、 又は F vを得ることができる。
更には、 本発明のポリペプチドに反応する抗体を、 クラクソンらの方法又はゼ ベデらの方法 （C I a c k s o n , T. ら， N a t u r e, 352, 624-6 28， 1 991 ;又は Z e b e d e e, S. ら， P r o c. N a t l . A c a d. S c に USA, 89, 31 75-31 79, 1 992 ) により、 一本鎖 （ s i n g I e c h a i n) F v又は Fa bとして得ることも可能である。 また、 マ ウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジ： Lニックマウス （し o n b e r g, N. ら， N a t u r e, 368, 856-859, 1 994) に 免疫することで、 ヒト抗体を得ることも可能である。
[7] 本発明のノックアウト非ヒ卜動物及び細胞
本発明のノックァゥト非ヒト動物は、 本発明のポリべプチドをコードする遺伝 子の発現が部分的に又は完全に抑制されている限り、 特に限定されるものではな く、 それ自体公知の方法により、 作製することができる。
例えば、 本発明のポリヌクレオチドを含有してなる組換えベクターを用い、 目 的とする非ヒト動物、 例えば、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 又は ニヮトリ等の胚性幹細胞 （emb r y o n i c s t em c e l l ) において. 染色体上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法
[例えば、 N a t u r e, 326, 61 1 0, 295 (1 987) ；又は C e I I , 51， 3， 503 (1 987) 等] により不活化するか、 あるいは、 任意の 配列と置換した変異クローンを作製する [例えば、 N a t u r e, 350, 63 1 5, 243 (1 991 ) ] 。 胚性幹細胞の変異クローンを用い、 動物の受精卵 の胚盤胞 （b l a s t o c y s t) への注入キメラ法又は集合キメラ法等の手法 P T/JP2003/011353
29 により、 胚性幹細胞クローンと正常細胞とからなるキメラ個体を調製することが できる。 このキメラ個体と正常個体との掛け合わせにより、 全身の細胞の染色体 上に存在する本発明のポリべプチドをコ一ドする遺伝子に任意の変異を有する個 体を得ることができ、 更に、 その個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変 異が入ったホモ個体の中から、 本発明のポリべプチドをコ一ドする遺伝子の発現 が部分的に又は完全に抑制された個体としてノックァゥト非ヒト動物を得ること ができる。
更に、 前記ノックアウト非ヒト動物から、 本発明のポリペプチドをコードする 遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制された、 本発明の細胞を得ることができ る。
あるいは、 所望の細胞 （例えば、 ヒト胎児腎臓由来 HE K293細胞、 前記 H E K 293細胞にェプスタイン'パ一ウィルスの EBN A— 1遺伝子を導入した 293— EBN A細胞、 又はヒ卜由来細胞である 293 T細胞） に対して、 例え ば、 R N A干渉法 （例えば、 N a t u r e, 41 1 , 494-498, 200 2) により、 細胞内在性の SMGBP— 1の発現を抑制することができ、 これら の細胞も本発明の範囲に含まれる。
また、 染色体上の本発明のポリべプチドをコ一ドする遺伝子の任意の位置へ変 異を導入することにより、 ノックァゥト非ヒト動物を作製することも可能である ( 例えば、 染色体上の本発明のポリべプチドをコ一ドする遺伝子の翻訳領域中へ、 塩基を置換、 欠失、 及び 又は挿入等させて変異を導入することにより、 その遺 伝子産物の活性を改変させることも可能である。
また、 その発現制御領域への同様な変異を導入することにより、 例えば、 発現 の程度、 時期、 及び 又は組織特異性等を改変させることも可能である。 更に、 C r e- I o X P系との組合せにより、 より積極的に発現時期、 発現部位、 及び 又は発現量等を制御することも可能である。 このような例として、 脳のある特 定の領域で発現されるプロモーターを利用して、 その領域でのみ目的遺伝子を欠 失させた例 [Ce l l , 87, 7， 1 31 7 (1 996) ] や、 C r eを発現す るアデノウイルスを用いて、 目的の時期に、 臓器特異的に目的遺伝子を欠失させ た例 [S c i e n c e, 278, 5335 (1 997) ] が知られている。 TJP2003/011353
30 従って、 染色体上の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子についても、 こ のように任意の時期や組織で発現を制御することができ、 また、 任意の挿入、 欠 失、 及び 又は置換をその翻訳領域や発現制御領域に有するノックァゥト非ヒ卜 動物を作製することができる。 ノックアウト非ヒト動物は、 任意の時期、 任意の 程度、 及び 又は任意の部位で、 本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の 症状を誘導することができる。 このように、 本発明のノックアウト非ヒ卜動物は, 本発明のポリべプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な 動物モデルとなる。
更には、 本発明のノックアウト非ヒト動物は、 本発明のポリペプチドをコード する遺伝子とは異なる遺伝子に起因する疾患のモデル動物を樹立するのに用いる こともできる。 例えば、 本発明のノックアウト非ヒト動物の 1つである SMGB P 1ノックアウトマウスと、 種々の系統の （見かけ上の） 正常マウスとを掛け合 わせる。 後者の正常マウスが、 PTCを有する変異遺伝子を含む場合、 前記掛け 合わせにより得られたマウス （例えば、 相同染色体の双方に SMG BP 1変異が 入ったホモ個体、 あるいは、 相同染色体の一方に SMGBP 1変異が入ったへテ 口個体） では、 NMD活性が影響を受けることが予想され、 例えば、 NMDが抑 制された場合には、 前記変異遺伝子に由来する mRN Aが増加する。 その結果、 或る変異遺伝子については、 隠れていた症状が表面化し、 何らかの疾患が生じる ことがあり、 新たな疾患モデルマゥスを樹立することができる。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。
実施例 1 ： ヒト SMG—1 (h SMG- 1 ) の酵素活性依存的にリン酸化される h SMG- 1結合タンパク質の発見
( 1 ) 細胞の培養及び回収と細胞抽出液の調製
ヒ卜 H e L a細胞 （ATCC : CCし一 2) を常法に従って培養し、 1 07細 胞まで増やした。 培養皿上の細胞を、 氷冷したリン酸緩衝溶液 （p h o s p h a t e— b u f f e r e d s a l i n e ； PBS) で洗浄した後、 セルスクレイ TJP2003/011353
31 パーで搔き取り、 遠心操作により細胞を集めた。 P BSを除いた後、 プロテア一 ゼ阻害剤 [ 1 mmo I ZL— PMS F (p h e n y I m e t h y I s u I f o n y I f l u o r i d e) 、 1 0 // gZm Lァプロチニン、 及び 1 0 μ gZm L ロイぺプチン〗 を添加した F—リシス液 [2 Ommo I Zし一 T r ί s H C I (p H 7. 5) 、 0. 25mo I ZLスクロース、 20mmo I ZL— yS—メル カプトエタノール、 1. 2mmo I ZL— EG T A、 I mmo l ZLオルトバナ ジン酸ナトリウム、 1 mmo I Z Lフッ化ナトリゥム、 I mmo l ZLピロリン 酸ナトリゥム、 1 5 Ommo I ZL塩化ナトリゥム、 1 %トリ トン （T r i t o n) X— 1 O 0、 及び 0. 5%ノニデット （N o n i d e t ) P 40] 3mLを 加えよく攪拌し、 更に、 超音波処理により細胞を完全に破砕した。 1 5分間の遠 心操作 （1 5000回転） により上清を回収し、 細胞抽出液とした。
(2) 免疫沈降
本実施例では、 抗 h S M G— 1血清として、 抗血清 C [山下暁朗ら， 「ジーン ズ■アンド■デベロップメント （G E N E S & D EV E LO PM E N丁） 」 (米国） , 200 1年， 第 1 5巻， p. 22 1 5- 2 228] を使用した。 抗血 清 Cは、 h SMG— 1の C末側断片 [h SMG— 1のアミノ酸配列 （365 7ァ ミノ酸） における第 307 6番目〜第 3542番目のアミノ酸残基からなる配列 に相当] をグルタチオン S—トランスフェラーゼ （g l u t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s e ; G S T) との融合タンパク質 （分子量 =約 7 0 k D a) として大腸菌で発現させ、 それを免疫源として得られた抗血清である。 予め抗 h SMG— 1血清 （抗血清 C) 1 O jW L又はその免疫前血清 （p r e) 1 0 Lを結合させておいたプロテイン Aセファロース粒子 （Ame r s h a m P h a r m a c i a社） 25 | Lに、 それぞれ、 実施例 1 ( 1 ) で得られた細胞 抽出液 （遠心上清） 1 m Lを加え、 4°Cで 2時間攪拌した。 遠心操作により上清 を除き、 新たに洗浄液 A ( F—リシス液に 0. 25mo I ZL塩化リチウムを加 えたもの） を加えて穏やかに攪拌した直後、 更に遠心操作で上清を除いた。 この 操作をこの後 6回繰り返し、 非特異的吸着物を除去した。
(3) リン酸化反応
最後に回収されたプロテイン Aセファロース粒子を、 1 Xキナーゼ反応液 [ 1 Ommo l /L-H e p e s (p H 7. 5) 、 5 Ommo I ZL塩化ナトリウム、 5 Ommo I Z L— iS—グリセ口リン酸、 及び 1 mm o I ZLジチオスレィ I ^一 ル （DTT) ] で一度洗浄操作を行なった。 2 Xキナーゼ反応液に 2価金属ィォ ン （2 Ommo I /L-M g C I 2若しくは 2 Ommo I /L— M n C I 2又はそ の両方） 及び Z又は 1 〃mo I ZLウォートマンニン [フォスファチジルイノシ トール 3—キナーゼ （P I 3—キナーゼ） 関連タンパク質キナーゼの阻害剤] を 加えた緩衝液 25 しを加えて軽く攪拌し、 氷上で 20分ほど静置した。 更に反 応開始液 （5 C i [r— 32P] AT P及び 1 0 mo l ZL— ATP) 25m
I を加えて軽く攪拌し、 30°Cで 1 5分間反応させた。 2 XSDSサンプルバッ ファー [200mmo I /L-T r i s HC I (p H 6. 8) 、 4%ドデシル硫 酸ナトリウム （SDS) 、 1 2%jS—メルカプトエタノール、 20%グリセロー ル、 及び 0. 02%ブロモフエノールブルー] 50 jU Lを加えて反応を停止させ、
1 00°Cで 4分間保温してタンパク質を変性させた。 この遠心上清を以下の解析 試料として使用した。
(4) リン酸化タンパク質の解析
高分子量から低分子量にわたるリン酸化タンパク質を分離能よく解析するため、 解析試料をゲル濃度 6 %又は 1 2. 5 %の 2種の S D Sポリアクリルァミ ドゲル 電気泳動 （SDS— PAGE) で展開した後、 ゲルを乾燥し、 常法に従ってォー トラジオグラフィーにてリン酸化バンドを可視化した。
結果を図 1に示す。 図 1において、 記号 Γ32Ρ」 は、 32 Ρを用いたオートラジ ォグラフィ一による結果であることを示す。 記号 「 +」 及び 「一 j は、 それぞれ, ウォー卜マンニンの存在下及び不在下でリン酸化反応を実施したことを示す。 記 号 「 I PJ は免投沈降 ( i mm u n o p r e c ί p i t a t i o nノ ¾：届、味し、 記号 「C3」 及び Γρ r e」 は、 それぞれ、 免疫沈降において、 抗血清 C及びそ の免疫前血清を用いたことを示す。 泳動パターンの右端に示す各分子量 （例えば,
「205 kDa」 ） 及び各矢印は、 分子量マーカーとして用いた各種タンパク質 の分子量及びその泳動位置を示す。 泳動パターンの左端に示す記号 「p p 43 OJ 、 ΓΡ ρ 400」 、 Γρ ρ 1 30」 、 及び Γρ ρ 70」 は、 それぞれ、 その 数字が示す分子量を有するタンパク質が、 リン酸化されていることを示す。 図 1に示すように 40Q kDa及び 430 k D aの位置にリン酸化バンドが検 出された。 これらのバンドは h SMG— 1の自己リン酸化によるものであること が、 以下の事実から支持される。 すなわち、 この 2つのリン酸化バンドの位置は、 ウェスタンプロット法で検出される h SMG— 1の分子量と一致した。 また、 こ れらのバンドは、 免疫前血清を用いた免疫沈降物では検出されなかった。 また、 h SMG— 1もその一員である P I 3—キナーゼ関連タンパク質キナーゼの阻害 剤であるウォートマンニン存在下では、 そのリン酸化バンドが顕著に減弱した。 更に、 P I 3—キナーゼ関連タンパク質キナーゼはその活性 （自己リン酸化活性 も含む） に対して 2価金属イオンとして M gより M nを要求する傾向があるが、 本免疫沈降実験でも M nを加えた場合により強い 430 k D aタンパク質及び 4 00 k D aタンパク質のリン酸化が見られた。
ここで、 h SMG— 1の自己リン酸化の強弱に完全に対応する形で、 1 30 k D aのタンパク質 （p 1 30) 及び 70 k D aのタンパク質 （p 70) の 2種の タンパク質がリン酸化タンパク質として検出された。 これらは、 h SMG— 1の キナーゼ活性でリン酸化される結合タンパク質の可能性がある。
この可能性を支持するために、 抗血清 Cの代わりに、 別の抗 hSMG— 1血清 である抗血清 Lを用いて、 前記の免疫沈降及びリン酸化反応を実施した。 なお、 抗血清 Lは、 h SMG— 1の N末側断片 [h SMG— 1のアミノ酸配列 （365 7アミノ酸） における第 864番目〜第 1 059番目のアミノ酸残基からなる配 列に相当] を GSTとの融合タンパク質 （分子量 =約 50 kDa) として大腸菌 で発現させ、 それを免疫源として得られた抗血清である。
結果を図 2に示す。 図 2において、 記号 「32 p」 は、 32Pを用いたオートラジ ォグラフィ一による結果であることを示し、 記号 「WB： C3」 は、 抗血清 Cを 用いたウェスタンブロッ卜の結果であることを示す。 記号 「C一 p r e」 、 「CJ 、 「L— p r e j 、 及び 「し」 は、 それぞれ、 免疫沈降において、 抗血清 Cの免疫前血清、 抗血清 C、 抗血清 Lの免疫前血清、 及び抗血清 Lを用いたこと を示す。
抗血清 Cを用いた場合だけでなく、 h SMG— 1の異なる部位を抗原とする抗 血清し抗体を用いた場合にも、 1 30 k D a及び 70 k D aの 2種のタンパク質 TJP2003/011353
34 がリン酸化タンパク質として検出されたことから、 前記の可能性が更に強まつた c この結果は、 抗血清 Cで非特異的に免疫沈降されるタンパク質が偶然 h SMG— 1でリン酸化されるのではないことを示している。
実施例 2 ： H e La細胞抽出液の液体カラムクロマトグラフィーでの分離と h S MG- 1免疫複合体におけるリン酸化反応
( 1 ) 細胞抽出液の調製
以下の操作はすべて 4°C以下にて行なった。
3 X 109細胞の H e L a細胞を常法で培養し、 実施例 1 (1 ) と同様の方法 で細胞を PBS中に回収した。 遠心操作により上清を除いた後の細胞に、 0. 2 5%トリ トン X— 1 00及びプロテア一ゼ阻害剤 （0. 1 mmo I ZL— PMS F、 10〃 gZmLァプロチニン、 及び 1 0〃 gZmLロイぺプチン） を添加し た緩衝液 TG [2 Ommo I ZL— T r i s HC I (p H 7. 5) 、 2mm o I L—EDTA、 2mmo I ZL— DTT、 1 mmo I ZLォルトバナジン酸ナ トリウム、 及び 1 0%グリセロール] 35m Lを加え、 静かに攪拌した。 この細 胞懸濁液をポッター （P o t t e r) 型ホモジナイザーに移し、 ポリ亍トラフル ォロエチレン製のぺッスル （p e s t I Θ) を 50ス卜ロークさせることで細胞 を破砕し、 タンパク質を抽出した。 超遠心操作 （l OO O OO X g, 60分間） により細胞抽出液を得た。 細胞抽出液を膜フィルター （0. 22jWm p o r e s i z e ； M i I I ί p o r e社） で濾過して解析用試料とした。
(2) 液体カラムクロマトグラフィー
まず陰イオン交換カラム H i T r a p Q (5mL樹脂体積； P h a r ma c i a社） を 4本連結し、 液体カラムクロマグラフィーシステム F P LC (P a r ma c i a社） に接続し、 緩衝液 A (緩衝液 TGに 0. 1 %トリ トン X— 1 00 を添加したもの） で平衡化した。 実施例 2 (1 ) で調製した解析用試料をカラム に添加して、 緩衝液 Aで充分に洗浄した後、 緩衝液 A中で緩衝液 B (緩衝液 Aに 1 mo I /L塩化ナトリウムを添加したもの） の割合を 85分間で 0~60<½に 直線的に上昇させていくことで、 タンパク質を樹脂から溶離させた。 なお、 流速 は 1. 5mLZ分とした。 F P LCシステム付属の自動分画分取装置 （フラクシ ヨンコレクター） を用いて、 2分間/分画 （約 3mL) の割合で溶出物を連続的 3011353
35 に分取した。 また、 タンパク質の溶出の程度を 280 nmの吸光度でモニターし た。
結果を図 3に示す。 図 3において、 曲線 aは、 280 nmにおける吸光度 （A 280) 、 すなわち、 タンパク質の相対濃度を示し、 直線 bは、 塩化ナトリウム の濃度勾配を示す。 記号 「 f 」 は分画を意味し、 「f に 」 の直後に続く各 数字、 及び曲線 aに沿って並ぶ手書きの各数字は、 それぞれ、 分画番号である。
( 3 ) 各分画からの h S M G— 1の免疫沈降とリン酸化反応
各分画 （1 0 1_相当量） を、 抗 h SMG— 1抗体 C又は抗 h SMG— 1抗体 Pを用いてウェスタンブロット解析した。
結果を図 4に示す。 記号 「WB ： P」 及び 「WB ： C」 は、 それぞれ、 抗血清 P及び抗血清 Cを用いたウェスタンブロッ卜の結果であることを示す。
分画 25〜分画 28に h SMG— 1が濃縮して溶出することが判明した。 各分画 600 Lを用いて、 実施例 1 (2) 及び実施例 1 (3) と同様の方法 で免疫沈降及びリン酸化反応を行なった。 但し、 免疫沈降に用いる抗体 （抗血清 C) は 1 / LZ分画とし、 リン酸化反応に用いる 2 Xキナーゼ反応液には、 2価 金属イオンとして 1 Ommo I L一 Mn C I 2を添加し、 ウォー卜マンニンは 添加しなかった。 更に、 2 Xキナーゼ反応液には、 外部基質として GST— p 5 3 (1 -58) タンパク質 2 gを加えた。 なお、 GST— p 53 (1 -58) タンパク質は、 p 53タンパク質 （アミノ酸残基数 =393) の第 1番目〜第 5 8番目のアミノ酸からなる部分断片と、 GSTとの融合タンパク質であり、 p 5 3タンパク質における第 1 5番目のセリン残基 （S e r 1 5) 及び第 37番目の セリン残基 (S e r 37) は、 h S M G— 1のリン酸化共通モチーフと一致する 配列中にあり、 h SMG—1によりリン酸化されることが知られている [山下暁 朗ら， 「ジーンズ■アンド 'デベロップメント （G EN ES & DEVE LO PMEN T) J , (米国） ， 2001年， 第 1 5巻， p. 221 5-2228] リン酸化反応後、 反応液を S DS— P AG E¾びオートラジオグラフィ一によ つて解析した。 結果を図 5に示す。 カラムで分画しても、 h SMG— 1の自己リ ン酸化能及び外部基質リン酸化能と、 P 1 30及び p 70とを分離することがで きないことから、 hSMG— 1は、 常に、 p 1 30及び p 70と挙動を共にして 03011353
36 いることが強く示唆される。
次に、 分画 20〜分画 31を用いて、 実施例 1 (2) 及び実施例 1 (3) と同 様の方法で免疫沈降及びリン酸化反応を行なった。 但し、 リン酸化反応に用いる 2 Xキナーゼ反応液には、 外部基質として GST— p 53 (1 -58) タンパク 質 2jt gを加え、 反応開始液の A TPの濃度を 1 mm o I /しとし、 放射性 AT Pは加えなかった。 また、 反応時間は 1時間とした。
GS T-p 53 (1 -58) タンパク質のリン酸化状態を、 SDS— PAGE と、 p 53タンパク質におけるリン酸化 S e r 1 5に対する抗体 （抗 P— S e r 1 5抗体； S h i e h, S. Y. ら， Ce l I , 91 , 325-334, 1 99 7) 又は p 53タンパク質におけるリン酸化 S e r 37に対する抗体 （抗 P— S e r 37抗体； K i t a g awa, M. ら， EMBO J . , 1 5, 7060- 7069, 1 996) によるウェスタン法とで解析した。
結果を図 6に示す。 図 6において、 記号 「WB ： ー P— S e r 1 5J 及び 「WB ： 一 P— S e r 37」 は、 それぞれ、 抗 P— S e r 1 5抗体及び抗 P— S e r 37抗体を用いたウェスタンブロッ卜の結果であることを示す。 記号 「p 一 S e r 1 5— p 53」 及び 「P— S e r 37— p 53j は、 それぞれ、 S e r 1 5及び S e r 37がリン酸化された GS T— p 53 (1 -58) タンパク質を 意味する。
実施例 3 :抗体カラムによる h S M G - 1複合体の精製と解析
( 1 ) 免疫沈降
実施例 1 (1 ) と同様の方法で H e La細胞抽出液を準備した。 細胞抽出液に 3 m Lの体積のプロテイン Aセファロース （Ame r s h a m— P h a r m a c i a社） を加え、 4°Cにおいて 30分間攪拌処理した。 遠心操作により上清を得 た。 正常ゥサギ I gG (S a n t a C r u z社） 25 gを、 あるいは、 常法 によリ抗血清 Nから精製した抗 hSMG— 1 I gG (N抗体） 25/ gを予め結 合させておいたプロテイン Aセファロース 1 O OjU Lに、 前記の遠心上清を半量 ずつ加え、 4°Cで 2時間攪拌した。 なお、 抗血清 Nは、 h SMG— 1の N末断片
[h SMG- 1のアミノ酸配列 （3657アミノ酸） における第 1番目〜第 1 0 6番目のァミノ酸残基からなる配列に相当] を GSTとの融合タンパク質として 大腸菌で発現させ、 それを免疫源として得られた抗血清である。
遠心操作により上清を除き、 新たに F—リシス液を加えて更に攪拌した直後、 更に遠心操作で上清を除いた。 この操作をこの後 6回繰り返し、 最後に回収され たプロテイン Aセファロース粒子に、 2 X S DS—サンプルバッファー 1 00〃 しを加えて 1 00°Cで 4分間煮沸した。 遠心操作で得た上清を解析用試料とした c この解析用試料の 1 Z20量を常法に従って SDS— PAGEし、 銀染色を行 なった。 結果を図 7に示す。 1 30 kDa付近に、 正常ゥサギ I gGによる免疫 沈降物中には見られないバンドが、 抗 hSMG— 1 I gG抗体による免疫沈降物 中に含まれることを発見した。 この際、 430 kDa付近には、 免疫沈降された h SMG- 1と思われるバンドが検出された。
(2) 質量分析
解析用試料の 1 4量を S D S— P A G Eし、 常法に従ってポリビニリデンジ フルオリ ド （PVDF) 膜 （ィモビロン C； ミリポア社） に転写した。 転写後の 膜にクマ一ジブリリアン卜ブルー （CBB) 液を加えた後、 素早く水につけ、 洗 浄した後、 乾燥し、 膜状に転写され、 染色されたタンパク質を観察した。 430 k D aと思われるバンドと、 1 30 k D aのリン酸化タンパク質と思われるバン ドが確認された。
染色された 1 30 k Daのタンパク質 （p 1 30) を膜からナイフで切り出し. 公知の方法 （例えば、 岩松明彦、 実験医学、 Vo に 1 7、 No. 8、 1 999 年、 第 1 351頁〜第 1 355頁のクローズアップ実験法 「質量分析計を用いた プロ亍オーム解析 J など） に従って、 膜状でタンパク質をタンパク質分解酵素し y s -C (リジルエンドぺプチダーゼ） で完全消化し、 MALD I— TOFZM S (マトリックスアシステツドレーザー励起イオン化法一飛行時間型質量分析 計） を用いて消化断片の質量分析を行なった。
その結果、 表 1に示す 8種類の L y s— C消化断片 （AP 1 ~AP 8) の質量 を決定することに成功した。 公知のタンパク質一次構造データベースを検索し、 8つの質量のうち、 6つのタンパク質断片 （AP 1、 AP2、 AP3、 AP4、 AP 5、 及び AP 8) が、 公知のデータベースに登録されている c DN Aクロー ン AK026858. 1の翻訳産物から予想されるし y s— C消化断片と一致し た。 図 8に、 A K 026858. 1翻訳産物の一次構造 （配列番号 2で表される アミノ酸配列） と、 ΑΡ 1、 ΑΡ 2、 ΑΡ3、 ΑΡ4、 ΑΡ5、 及び A Ρ 8に対 応する各配列の位置を示す。 このことから、 ρ 1 30が ΑΚ026858. 1の 翻訳産物であり、 h SMG—1結合タンパク質であることが推測された。 AKO 26858. 1翻訳産物には、 既知の機能モチーフに相同性を示す部分はなかつ た。 その一方で、 AK026858. 1翻訳産物に相同性が高いタンパク質をコ 一ドすると考えられる遺伝子がショウジヨウバエ （CG6729 ；相同性 =4 1 %) 及び線虫 （K04 B 1 2. 3 ；相同性 =41 <½) にも存在しており、 この タンパク質は、 進化的に保存されたタンパク質であると考えられた。 なお、 前記 相同性の数値は、 BLAST (Ba s i c l o c a l a I i n gme n t s e a r c h t o o l ； A I t s c h u I , S . F . ら， J. M o I . B i o に ， 21 5, 403-41 0, 1 990) による。
表 1
ぺプチド 一 対応配列 ―
A P 1 784, 54 784. 54 0. 00 配列番号 3
A P 2 1 031 61 1 031. 58 0. 03 配列番号 4
A P 3 1 069 55 1 069. 47 0. 08 配列番号 5
A P 4 1 301 7 1 1 301. 65 0. 06 配列番号 6
AP 5 1 599 86
A P 6 21 96 1 0
A P 7 2392 28 2392. 27 0. 01 配列番号 7
A P 8 251 9 26 251 9. 20 0. 06 配列番号 8 実施例 4 ：抗 p 1 30抗体の調製及び発現タンパク質の解析
( 1 ) 抗体の調製
AK026858. 1 DNAは、 東京大学医科学研究所の菅野教授らによる全 長 c DN A塩基配列決定プロジェクトにより既に同定されていたものであり、 本 実施例で用いた前記 DNAを含むプラスミド （PME 1 8Sに挿入してある） は, 同教授より分与された。 AK026858. 1翻訳産物が実際に h S M G— 1結 合タンパク質であることを確認するため、 その特異抗体を開発した。
AK026858. 1を含むプラスミドを制限酵素 Sm a I及び M s c Iで消 化し、 446塩基対の DN A断片 （配列番号 2で表されるアミノ酸配列における 第 563番目〜第 7 1 0番目のアミノ酸からなる配列に対応） を取得した。 この DN A断片を大腸菌発現べクタ一 p GEX— 6 P— 1 (Am e r s a m P h a r ma c i a社） の Sma I部位に揷入した後、 大腸菌 D H 5株に導入した。 組み換えプラスミドを有する大腸菌株を培養し、 常法により、 p 1 30タンパク 質断片を G S Tとの融合タンパク質として精製した。 精製した融合タンパク質を 抗原とし、 常法によリウサギ （N ew Z e a l a n d Wh i t e種） を免疫 し、 抗血清を得た。 更に、 抗原タンパク質を用いる常法 （ァフィニティー精製 法） により、 抗血清から特異抗体 （抗 AK026858. 1翻訳産物抗体） を分 取した。
(2) p 1 30の H eし a細胞における発現と免疫沈降法による h S M G— 1結 合性の確認
H e L a細胞抽出液を実施例 1 (1 ) と同様の方法により調製し、 実施例 3 (1 ) と同様の方法により、 正常ゥサギ血清、 あるいは、 抗 h SMG— 1抗血清 (抗血清 N、 抗血清し、 又は抗血清 C) を用いて免疫沈降した。 細胞抽出液及び 免疫複合体を SDS— PAGEで展開した後、 常法に従って、 実施例 4 (1 ) で 調製した抗 AKO 26858. 1翻訳産物抗体を用いるウェスタンブロット法で 解析した。
結果を図 9に示す。 図 9において、 記号 Γ I p」 は免疫沈降 （ i mmu n o p r e c i p i t a t i o n) を意味し、 記号 「NJ 、 「し」 、 及び Γ CJ は、 そ れぞれ、 免疫沈降において、 抗血清 N、 抗血清し、 及び抗血清 Cを用いたことを 示す。 また、 記号 「WBJ は、 ウェスタンブロットの結果であることを示す。 まず、 細胞抽出液に 1 30 kDaの分子量を有するタンパク質が特異的に検出 されることから、 この抗体が AK026858. 1翻訳産物を認識することがで きることが判明した。 また、 同じ分子量を有するタンパク質が、 抗血清 N、 抗血 清し、 又は抗血清 Cのいずれで免疫沈降した場合にでも検出された。 一方、 正常 ゥサギ血清で免疫沈降した場合には、 そのようなタンパク質は検出されないこと から、 最終的に AK026858. 1翻訳産物は h S M G— 1の特異的結合タン パク質であることが判明した。 その分子量から h SMG— 1免疫沈降物中でリン 酸化される 1 30 k D aタンパク質であることが強く示唆される。 産業上の利用可能性
本発明のポリぺプチドによれば、 ナンセンス変異により PTCを生じることが 原因で生じる病態の治療及び 又は予防剤の簡便なスクリーニング系を提供する ことができる。 また、 本発明のポリヌクレオチド、 発現ベクター、 形質転換体、 及び抗体は、 本発明のポリべプチドを製造するのに有用である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 （2) 配 列番号 2で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 SMGBP 1活性を示すポリ ペプチド、 （3) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1又は複数の箇所におい て、 1又は複数個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列 を含み、 しかも、 SMGBP 1活性を示すポリペプチド、 又は （4) 配列番号 2 で表されるァミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配列を含み、 し かも、 SMGBP 1活性を示すポリペプチド。
2. 請求項 1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
3. 請求項 2に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
4. 請求項 2に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
5. 請求項 1に記載のポリべプチドに結合する抗体又はその断片。
6. 請求項 1に記載のポリべプチドをコ一ドする遺伝子の発現が部分的に又は完 全に抑制されたノックァゥト非ヒト動物又は細胞。
7. (1 ) 請求項 1に記載のポリペプチドと、 SMG— 1と、 試験物質とを、 前 記試験物質が存在しなければ前記ポリペプチドの S M G B P 1活性が発揮可能な 条件下で、 接触させる工程、 及び
( 2 ) 前記ポリペプチドの S M G B P 1活性が発揮されたか否かを分析する工程 を含む、 前記ポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質のスクリーニング 方法。
8. (1 ) 請求項 1に記載のポリペプチド及び SMG— 1を産生可能な細胞と、 試験物質とを、 前記試験物質が存在しなければ前記細胞が前記ポリぺプチドを産 生可能な条件下で、 接触させる工程、 及び
(2) 前記ポリべプチドの SMGBP 1活性が発揮されたか否かを分析する工程 を含む、 請求項 1に記載の前記ポリペプチドの S M G B P 1活性を制御する物質 のスクリーニング方法。
9. 請求項 1に記載のポリべプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を有効成 分として含有する、 ナンセンス媒介 mRN A崩壊の抑制剤。
1 0. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を有効 成分として含有する、 ナンセンス変異により早期翻訳終止コドンを生じることが 原因で生じる病態の治療及び Z又は予防剤。
1 1. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を有効 成分として含有する、 ナンセンス媒介 mRN A崩壊の促進剤。
1 2. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を、 ナ ンセンス媒介 m RNA崩壊の抑制が必要な対象に、 有効量で投与することを含む, ナンセンス媒介 mRN A崩壊を抑制する方法。
1 3. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を、 ナ ンセンス変異によリ早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療 及び 又は予防が必要な対象に、 有効量で投与することを含む、 ナンセンス変異 によリ早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態を治療及び 又は予 防する方法。
1 4. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質を、 ナ ンセンス媒介 m RNA崩壊の促進が必要な対象に、 有効量で投与することを含む, ナンセンス媒介 mRN A崩壊を促進する方法。
1 5. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質の、 ナ ンセンス媒介 m R N A崩壊の抑制剤を製造するための使用。
1 6. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質の、 ナ ンセンス変異により早期翻訳終止コドンを生じることが原因で生じる病態の治療 及び 又は予防剤を製造するための使用。
1 7. 請求項 1に記載のポリペプチドの SMGBP 1活性を制御する物質の、 ナ ンセンス媒介 m R N A崩壊の促進剤を製造するための使用。
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