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WO2004019981A1 - 非神経細胞の神経細胞への分化成熟法、該剤と該剤探索法 - Google Patents

非神経細胞の神経細胞への分化成熟法、該剤と該剤探索法 Download PDF

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WO2004019981A1
WO2004019981A1 PCT/JP2003/010731 JP0310731W WO2004019981A1 WO 2004019981 A1 WO2004019981 A1 WO 2004019981A1 JP 0310731 W JP0310731 W JP 0310731W WO 2004019981 A1 WO2004019981 A1 WO 2004019981A1
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WO
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cells
differentiation
neuronal
cell
maturation
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PCT/JP2003/010731
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English (en)
French (fr)
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Torao Ishida
Yanjun Zhang
Hiroyo Kondo
Zhifeng Yu
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SCHOOL JURIDICAL PERSON SUZUKA UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCE
Original Assignee
SCHOOL JURIDICAL PERSON SUZUKA UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCE
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Publication date
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to (1) a pharmaceutical having the ability to differentiate non-neuronal cells into neurons without being treated with mitogenic substances and to mature Z or neurons without being treated with mitogenic substances.
  • Differentiation and / or maturation agent characterized by comprising a low-molecular-weight substance having no toxicological tolerance and a prodrug thereof or an active ingredient, and treating or inhibiting malignant neuropathy by this action
  • the differentiation and / or maturation agent causes non-neuronal cells to differentiate into neurons without being treated with a mitogenic agent, and / or A differentiation and / or maturation method characterized by allowing cells to mature without being treated with a cell splitting inducer; (3) transplantation rejection obtained by the differentiation and / or maturation method (4) If necessary, a low molecular weight substance that is toxic to the pharmaceutically acceptable level after the activation, and a neuron that is not likely to be contaminated with a high molecular weight that causes an absorptive reaction and a cancerous neuron.
  • Differentiation and / or differentiation characterized by contacting non-neuronal cells or neurons that have not been treated with mitogenic agents and examining the differentiation of non-neuronal cells into neurons and / or the maturation of neurons Or relates to a method for searching for a maturation agent.
  • JP-A-6-1841 96 vitronectin-derived synthetic peptides, etc.
  • JP-A-8-1 43454 nerve growth factor production enhancer
  • JP-A-8-269061 anti-tumor properties
  • Substance Evolactaene JP-A-8-51 1 935 (selective cell growth)
  • JP-A-9-40697 a novel protein whose expression increases with nerve damage
  • JP-A-9-323928 a neuronal differentiation inducer
  • JP 2000-53571 Prevention / treatment of brain injury
  • JP 2001-1721 96 Neuroral regeneration composition
  • JP 2000-1 25894 Neuroonogenic agent, etc.
  • WOOO / ⁇ 271 2 New Discriminating factor
  • JP 2002-234865 N-alkoxyalkyl-N-alkylamine derivatives, etc.
  • Alzheimer's disease amyotrophic lateral sclerosis, brain tumor, cerebellar degeneration, traffic hydrocephalus, Huntington's disease, frontal lobe irradiation, multiple sclerosis, normal pressure hydrocephalus, Parkinson's disease, Pick's disease, progression Multiple focal leukoencephalopathy, progressive supranuclear palsy, fighting dementia, brain injury, surgical procedure, brain tumor, chronic subdural hematoma, stroke, cerebrovascular dementia, Wilson's bacterial endocarditis, Creutzfeldt 'Jakob disease, Gerstmann' Stroisler 'Shineka's disease, HIV-related disease, neurosyphilis, tuberculosis and fungal meningitis, viral encephalitis, anoxia, B12 deficiency, chronic drug-alcohol-nutrition Sexual abuse, folic acid deficiency, hypertension associated with hyperparathyroidism Luciuemia, hypoglycemia, hypothyroidism, hepatic ence
  • ES cells or neural stem cells have attracted attention.
  • ES cells or neural stem cells are undifferentiated cells, and when a neuronal cell dies, it begins to differentiate to make up for the lost cell. Therefore, there is a possibility of greatly contributing to the maintenance of biological functions.
  • attempts have been made to improve or treat the disease state by transplanting ES cells or neural stem cells to tissues that have lost their function, and specifically differentiating them into cells that express individual biological functions. .
  • ES cells are embryonic stem cells and have the ethical problem of using chick embryos as raw materials and the problem of transplantation antigenicity.
  • neural stem cells only fetal-derived neural stem cells are difficult to obtain, and fetal-derived neural stem cells have ethical issues and transplant antigenicity issues.
  • Bone marrow stromal cells also called bone marrow stromal cells
  • mitogenic agents also called mitogens
  • Nerve cells obtained by treating selected differentiation agents have been published (Special Table 2002-51 3545).
  • the neuronal cells derived from bone marrow cells must be treated with a mitogenic substance in the process, if the mitogenic substance is administered into the body, it may cause abnormal growth of other cells and cause the cells to become cancerous.
  • the nerve cells produced by such a treatment operation are contaminated with cancerous nerve cells, and transplanting them into humans is a problem.
  • bone marrow stromal cells are treated with low molecular differentiation factors such as mercaptoethanol and dibutyryl cyclic AMP, bone morphogenetic factor (BMP), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and fibroblast growth.
  • BMP bone morphogenetic factor
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • fibroblast growth It has been reported that differentiation into nerve cells is caused by the action of macrophage differentiation-promoting factors such as factor (bFGF) and bone morphogenetic protein inhibitor Noggin and demethylating agent 5-azacitidine (M Dezawa et al., Eur. J. Neurosci. 2001 14 pp. 1 771, W. Deng et al., Biochem Biophys Res. Commun. 2001 282 148, D.
  • Such macromolecular differentiation-promoting factors are peptides having a large molecular weight, so that they are easily decomposed in the living body and cannot pass through the blood-brain barrier.
  • Differentiating factors such as ethanol and dibutyryl cyclic AMP, and low molecules such as bone morphogenetic protein inhibitors and demethylating agents are highly toxic and are difficult to put into practical use.
  • neural stem cells and neural progenitor cells which are substantially the same as the autologous or autologous major histocompatibility antigen, they are differentiated outside the body into nerve cells, and drugs that can differentiate the cells are transplanted rather than transplanted to humans. It is considered that it is easier to replenish the lost nerve by differentiating the neural stem cells or neural progenitor cells present in the living body by differentiating them into the nerve cells.
  • a report that 40% of the lost neurons recovered after injection of nerve growth factor after temporarily suspending the cerebral artery of the rat and causing armpit ischemia to injure hippocampal neurons. H. Nakatomi et al., Ce 2002 1 10 ⁇ 429.
  • HMG-CoA reductase inhibitors have cholesterol synthesis inhibitory action, lipid lowering action, arteriosclerosis progression inhibitory action, and exogenous cholesterol absorption inhibitory action, and have low toxicity even after long-term administration. It is used to treat familial hypercholesterolemia and hyperlipidemia or to suppress malignant transformation.
  • HMG-CoA reductase Prevention of secondary heart attack by a combination of an inhibitor and angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor JP-A-8-291 082
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • HMG-CoA reductase inhibitor statins from hematopoietic stem cell-derived cells to endothelium Differentiation into cells Llevadot et al., J.
  • HMG-CoA reductase inhibitors publications (Special Table 2002-536332) and neurodegenerative diseases that improve the nerve transmission rate and blood flow of patients with diabetes mellitus. Based on the fact that patients have low apolipoprotein (ApoE), a neurodegenerative disease patient is treated with a composition that increases the level of ApoE as a therapeutic method for neurodegenerative disease, and a neuronal cell is brought into contact with a test compound.
  • ApoE apolipoprotein
  • a method to search for ApoE-elevating compounds that measure the presence or absence of ApoE elevations in neurons are healthy
  • Administer plasma triglyceride level lowering agents to humans who have Alzheimer's disease on the basis of higher than humans, or lower LDL-C levels and optionally increase HDL levels Presumed to prevent the onset of Alzheimer's disease by lowering the level of plasma sputum liglyceride by coadministration of the drug (Special Table 2002-501 887), and Cholestero at risk for Alzheimer's disease
  • a composition for reducing blood cholesterol levels a method of reducing the production of amino Lloyd protein (Kohyo 2002- 507564).
  • HMG-CoA reductase inhibitors upregulate endothelial cell nitric oxide synthase activity through mechanisms other than preventing the formation of oxidized LDL.
  • HMG-CoA reductase inhibitors There is a possibility of treating or preventing abnormal pulmonary hypertension, ischemic stroke, etc. resulting from abnormally low expression and activity of cellular nitric oxide synthase Published after the present invention (Special Table 2003-51 1 347). In this case as well, since there is no cell for regeneration of nerve cells such as bone marrow cells, the degenerated, decreased, dead or injured or removed nerve cells are not regenerated.
  • Non-neuronal cells are differentiated into nerve cells without treatment with cell division inducers, and Z or nerve cells are induced to divide by treatments for disorders or malignant inhibition agents, and (2) the differentiation and / or maturation agents There is a strong desire to develop differentiation and maturation methods that are characterized by maturation without treatment with substances. Disclosure of the invention
  • the object of the present invention is to (1) have the ability to differentiate non-neuronal cells into neuronal cells without treatment with mitogenic agents and / or to mature neuronal cells without treatment with mitogenic agents.
  • a low molecular weight substance having only a pharmaceutically acceptable range and a differentiation and / or maturation agent characterized by containing Z or a prodrug thereof as an active ingredient, and treating or inhibiting malignant neuropathy by this action A neuropathy disorder characterized by the treatment or malignant suppression agent, and (2) the differentiation and / or maturation agent allows non-neuronal cells to differentiate into neurons without being treated with a mitogenic agent and / or Differentiation and / or differentiation, characterized by maturation of cells without treatment with mitogenic agents Or to provide a maturity method.
  • the present inventors have the ability to differentiate non-neuronal cells into neurons without being treated with mitogens and / or to mature neurons without being treated with mitogens.
  • the composition containing HMG-CoA reductase inhibitor as an active ingredient can be used to treat non-neuronal cells without treating them with mitogenic substances.
  • the present invention was completed.
  • the present invention includes (1) if necessary, containing non-neuronal cells or non-neuronal cell-derived neurons, differentiating non-neuronal cells into neurons without being treated with a mitogenic substance, and / or Differentiation and / or differentiation characterized by the effective component of pharmaceutically acceptable low molecular weight substances and Z or its prodrugs, which have the ability to mature neurons without treatment with mitogenic agents A maturation agent, (2) a differentiation and no-maturation agent as described above, wherein the low molecular weight substance is selected from 3-hydroxy 3-methylglutaryl monocoenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitors, (3) HMG — CoA reductase inhibitors are atorvastatin, itapastatin, kon / ⁇ cutin, sympastatin, dihydrocompactin, darbastatin, pitapastatin, fluindostatin, flupastatin, Vastatin, velpastatin, verostatin, mepastatin, rospastatin, oral
  • Differentiation and / or maturation methods characterized by maturation without treatment with (9) There is a risk of contamination of macrophages that cause transplant rejection and cancerous neurons obtained by the differentiation and / or maturation methods described above. Absent Transcellular, (10) After activation, if necessary, contact a non-neuronal cell or a non-neuronal cell that has not been treated with a mitogenic agent with a low molecular weight substance that is pharmaceutically acceptable, A method for searching for the differentiation and / or maturation agent described above, characterized by examining the differentiation into nerve cells and / or maturation of the nerve cells, (1 1) As an active ingredient, if necessary, neuropathy can be achieved by differentiating non-neuronal cells into neurons without treatment with mitogens and / or maturation without treatment with mitogens.
  • the present invention provides a therapeutic agent for neuropathy or a malignant suppression agent characterized by treating a disease or suppressing malignant transformation.
  • Fig. 1 is a normal light micrograph showing the differentiation of bone marrow stromal cells into neurons by contact with 5 micromole of activated simpastatin for 24 hours in Example 1, with a microscope magnification of 100 times, The length of the scale bar in the figure is 50 micrometers.
  • FIG. 2 is a normal light micrograph showing the differentiation of bone marrow stromal cells into nerve cells by contact with 5 micromolar activated simpastatin 48 hours in Example 1, the magnification of the microscope is 100 times, The length of the scale bar in the figure is 50 micrometers.
  • Fig. 3 shows double immunolabeling specimens of MAP2 (green) and tau (red) showing differentiation of bone marrow stromal cells into neurons by 24-hour contact with 5 micromole of activated simpastatin in Example 1
  • the magnification of the microscope is 100 times, and the length of the scale par in the figure is 50 micrometers.
  • Fig. 4 shows MAP2 (green) and tau (red) double immunolabeling specimens showing the differentiation of bone marrow stromal cells into neurons by 48-hour contact with 5 micromolar activated simpastatin in Example 1
  • the magnification of the microscope is 100 times, and the length of the scale par in the figure is 50 micrometers.
  • the differentiation and maturation or maturation agent and neuropathy treatment or malignant suppression agent of the present invention contain non-neuronal cells or non-neuronal cell-derived neurons as needed, and treat the non-neuronal cells with a mitogenic substance.
  • Pharmacologically acceptable toxic low molecular weight substances and / or prodrugs thereof capable of differentiating into nerve cells and / or mature without treatment with mitogenic substances. It specializes in doing.
  • the agent of the present invention when further administered to a patient, differentiates non-neuronal cells into neurons without being treated with mitogenic substances and / or matures without treating neurons with mitogenic substances. It has the feature of treating neuropathy diseases or suppressing malignant transformation.
  • the active ingredient of the agent of the present invention contains non-neuronal cells or non-neuronal cell-derived neurons if necessary, and differentiates non-neuronal cells into neurons without being treated with a mitogenic substance, and / or nerves. Any low-molecular-weight substance and / or prodrug thereof having the ability to mature cells without being treated with a mitogenic substance and having a pharmaceutically acceptable range may be used. It can be discovered.
  • a low molecular weight substance having only a pharmaceutically acceptable toxicity means a low molecular weight substance whose toxicity is within a pharmaceutically acceptable range.
  • Toxicity used here includes acute and subacute toxicity, chronic toxicity, teratogenicity, and other serious and frequent side effects outside the pharmaceutically acceptable range.
  • Low molecular weight substances are non-high molecular weight substances such as proteins and high molecular weight peptides, and are low molecular weight substances that can pass through the blood-brain barrier without antigenicity.
  • the agent of the present invention is used to differentiate non-neuronal cells into neurons without being treated with mitogenic substances and / or to mature neurons without being treated with mitogenic substances, or to treat neuropathy diseases by their action. Used to treat or suppress malignancy, and to obtain the method of the present invention and the nerve cell of the present invention.
  • Low-molecular-weight substances and prodrugs thereof that have only toxic tolerances belong to the differentiation and maturation agents of the present invention, neuropathy disease treatments or malignant inhibition agents.
  • a drug that has the ability to differentiate non-neuronal cells into neurons without treatment with mitogens and / or mature neurons without treatment with mitogens As a low molecular weight substance having a toxicologically acceptable range, a 3-hydroxy-3-methylglutaryl monocoenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor or the like is preferable. Can be mentioned.
  • HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl monocoenzyme A
  • HMG-CoA reductase inhibitors are precursors for biosynthesis of various steroids and terpenes including L-cholesterol by HMG-CoA reductase, which is an important rate-limiting enzyme for cholesterol biosynthesis. It is an intermediate for ketone metabolism. A substance that inhibits the reaction of converting HMG-CoA to mevalonic acid.
  • the HMG-CoA reductase inhibitor may be any substance that inhibits the action of the HMG-CoA reductase and is a low-molecular substance that has only a pharmaceutically acceptable toxicity.
  • HMG—CoA reductase inhibitors are not limited to these, but are preferably atorvastatin, itapastatin (also known as NK—104), compactin, simpastatin, dihydrocompactin, darpastatin, pitapastatin, full Pastatin, pravastatin, verpastatin, verostatin, mepastatin, rospastatin, lovastatin, etc., and optical or geometric isomers thereof, and prodrugs thereof, and pharmaceutically acceptable of the above compounds or prodrugs thereof And their hydrates and the like.
  • atorvastatin also known as NK—104
  • compactin simpastatin
  • dihydrocompactin darpastatin
  • pitapastatin full Pastatin
  • pravastatin verpastatin
  • verostatin verostatin
  • mepastatin verostatin
  • rospastatin lovastatin
  • lovastatin etc.
  • optical or geometric isomers thereof and prod
  • HMG—CoA reductase inhibitors can be made by any method, as long as they are pharmaceutically acceptable. Although not limited thereto, exemplifying a method for producing an HMG-CoA reductase inhibitor, atorvastatin is disclosed in US Pat. No.
  • flindindatin is prepared by the method disclosed in European Patent Application Publication No. 363,934A1.
  • Belpasta is prepared by the method disclosed in JP-A-60-500015 (Re 3 4739073) or European patent application 363934
  • pranostatin is prepared by the method disclosed in JP-A-57-2240 (USP 4346227).
  • Chin is produced by the method disclosed in US Pat. No. 5,082,859
  • verostatin is produced by the method disclosed in US Pat. No. 4,448,784 and US Pat.
  • Ross / statin is disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 5-178841 (USP5260440), and Rono ⁇ statin is disclosed in Japanese Patent Laid-Open No.57-163374 (USP4231938). ).
  • the agent of the present invention after activation, if necessary, (1) differentiates non-neuronal cells into neurons without being treated with mitogenic substances, and matures without treating Z or neurons with mitogenic substances. Or (2) Treating neuropathy diseases or suppressing malignant transformation by the action To do.
  • the agent of the present invention allows the agent to contact non-neuronal cells or immature neurons ex vivo, differentiate the non-neuronal cells into neurons without being treated with a mitogenic substance, and Z or It is useful for obtaining neurons for transplantation by maturing them without treatment with mitogens.
  • the agent of the present invention containing a non-neuronal cell or a non-neuronal cell-derived nerve cell can be transplanted into the brain or administered intravenously, so that the non-neuronal cell or non-neuronal cell-derived neuronal cell containing the agent can be converted into the brain.
  • the blood-brain barrier breaks into the Reli brain tissue, where it differentiates and matures into nerve cells to replenish nerve cells and treat neuropathic diseases It is also useful for suppressing malignant transformation.
  • the agent of the present invention that does not contain non-neuronal cells or non-neuronal cell-derived neurons is orally administered before and / or after or simultaneously with the injection of non-neuronal cells or immature nerve cells separately from the agent of the present invention.
  • the cell In contact with the cell in the body by administration or parenteral administration, the cell is differentiated and / or matured in the body, or non-neuronal cells or immature nerve cells are injected into the body from the outside
  • This drug is administered orally or parenterally to bring it into contact with non-neuronal cells or immature nerve cells that are endogenous in the body, and to differentiate and / or mature the cells in the body to treat neuropathy diseases.
  • a medicament containing the same is useful as a preventive and therapeutic agent for diseases caused by various neuronal tissues and neuronal cell regression or cell death.
  • those that do not contain cells are small molecules, and thus can be administered by oral administration or parenteral administration (intramuscular, subcutaneous, intravenous, suppository, etc.) as well as in vitro administration.
  • parenteral administration intramuscular, subcutaneous, intravenous, suppository, etc.
  • in vitro administration when a prodrug is contained in the agent of the present invention, it is preferable to use it after activating it by an appropriate method because a greater effect can be obtained. If the prodrug is not included, it can be used as is. In many cases, the prodrug is activated in the body in the case of in vivo administration, so it is not necessary to activate the prodrug in advance.
  • excipients When preparing an oral preparation, after adding excipients, and if necessary, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, flavoring agents, etc., tablets, coated tablets, Agents, capsules, solutions, syrups, elixirs, oily or aqueous suspensions.
  • excipient include lactose, corn starch, sucrose, glucose, sorbit, and crystal cell loss.
  • binder include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl starch, and polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrant examples include starch, agar, gelatin-free, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium hydrogen carbonate, calcium citrate, dextran, pectin and the like.
  • lubricant examples include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, hydrogenated vegetable oil, and the like.
  • Colorants that are permitted to be added to pharmaceutical products can be used.
  • flavoring agent examples include cocoa powder, heart force brain, aromatic acid, heart force oil, dragon brain and cinnamon powder. These tablets may be appropriately coated on the granules by sugar coating, gelatin coating, or other necessary.
  • injections When preparing injections, add pH adjusters, buffers, stabilizers, preservatives, etc., if necessary, and make subcutaneous, intramuscular, and intravenous injections by conventional methods.
  • the injection may be a solid preparation or a preparation prepared for daily use by lyophilization after storing the solution in a container. Also, A single dose may be stored in a container, or multiple doses may be stored in the same container.
  • the concentration of the agent of the present invention used as a reagent is usually from 0.01 to 1,000 micromolar, preferably from 0.1 to 100 micromolar, more preferably from 1 to 10 micromolar.
  • the dosage may be adjusted according to the age and symptoms, and the optimal concentration varies depending on the type of cells, degree of differentiation, etc., or age and symptoms. It is more desirable to find and administer the optimal concentration for each symptom.
  • the non-neuronal cell used in the present invention means a cell other than a neuronal cell, which can be differentiated into a neuronal cell by the agent of the present invention.
  • Cells that can be differentiated into nerve cells by the agent of the present invention are not limited thereto, but preferably ES cells, neural stem cells, neural progenitor cells, bone marrow stem cells, mesenchymal cells, bone marrow stromal cells, etc. Is mentioned.
  • neural stem cells neural progenitor cells, bone marrow stem cells, mesenchymal cells, bone marrow stromal cells, etc.
  • non-fetal neural stem cells neural progenitor cells, bone marrow stem cells, mesenchymal cells, bone marrow stromal cells, etc.
  • ethics are less problematic and more preferable.
  • non-fetal neural stem cells neural progenitor cells, bone marrow stem cells, mesenchymal cells, bone marrow stromal cells, etc.
  • bone marrow stem cells, mesenchymal cells, bone marrow stromal cells, etc. can be easily obtained and transplanted nerve cells
  • Bone marrow stem cells, mesenchymal cells, and bone marrow stromal cells that are substantially the same as or very similar to autologous or autologous major histocompatibility antigens are preferred as cells to differentiate into cells. It is more preferable as a cell that differentiates or as a cell that is injected into the body and differentiates into a nerve cell in the body.
  • the agent of the present invention when the agent of the present invention is to be regenerated by injecting the agent of the present invention without transplanting nerve cells or injecting non-neuronal cells into the body, the innervated neural stem cells, neural progenitor cells , Bone marrow stem cells, mesenchymal cells, bone marrow stromal cells, etc. differentiate into nerve cells. Therefore, it is more preferable to select non-neuronal cells used in the present invention according to the purpose.
  • the source of non-neuronal cells or nerve cells used in the method of the present invention may be obtained from any place as long as it fits.
  • the intended use is not intended for humans, but for the purpose of obtaining nerve cells to be transplanted into humans, or by injecting into the body to differentiate into nerve cells, or nerves in the body
  • ES cells are transferred from fetal embryos of chicks
  • neural stem cells and neural progenitor cells are transferred from chicks
  • the non-neuronal cells to be used are changed to endogenous non-neuronal cells.
  • a pharmaceutically acceptable, small molecule that has the ability to differentiate non-neuronal cells into neurons without treatment with mitogens and to mature them without treatment with mitogens.
  • the source of non-neuronal cells or neurons used in the method for searching for substances and / or their prodrugs There is no limitation on the source of non-neuronal cells or neurons used in the method for searching for substances and / or their prodrugs.
  • the nerve cell used in the present invention means a nerve cell other than a mature nerve cell, which can be matured by the agent of the present invention.
  • the nerve cell that can be matured by the agent of the present invention is preferably a nerve cell obtained by differentiating non-neuronal cells by the method of the present invention, but is not limited thereto.
  • Neurons and nerves obtained by differentiating non-neuronal cells by methods other than the method of the present invention Stem cells ⁇ Nerve cells naturally differentiated from neural progenitor cells can also be used. Among these neurons, non-neuronal cells that are differentiated without being treated with a mitogenic substance are preferred, so that there is no fear of contamination of macromolecules that cause transplant rejection and cancerous neurons.
  • the cell can be obtained by a method of differentiating an endogenous nerve cell or a non-neuronal cell of the present invention into a nerve cell without treating with a cell division inducer.
  • the nerve cells of the present invention are limited to nerve cells that are not likely to be mixed with macromolecules that cause transplant rejection and cancerous neurons.
  • the nerve cells that are not likely to be mixed with the macrophage that causes transplant rejection of the present invention and cancerous neurons are treated with the method of the present invention, that is, without treating non-neuronal cells with a cell division inducer by the agent of the present invention. It can be obtained by a method of differentiating into nerve cells and / or maturating nerve cells without being treated with a mitogenic substance.
  • the neuron of the present invention is a neuron that is naturally differentiated or a neuron that is as close as possible to a neuron that is naturally differentiated and mature, but is not limited thereto, and is optimal as a neuron for transplantation.
  • the nerve cells of the present invention can be administered in a variety of ways to be suitable for transplantation into the central nervous system when transplanted into the brain. Examples include, but are not limited to, parenteral administration, subarachnoid administration, intraventricular administration, and intrasubstantial administration. In particular, in the case of a patient with an injury in the blood-brain barrier such as a stroke, cells are transferred to brain tissue and differentiated into nerve cells even by intravenous injection.
  • the method of the present invention that is, the method of differentiating non-neuronal cells into neuronal cells without being treated with a mitogenic substance and / or maturating nerve cells, is obtained by treating the agent of the present invention with a cell division-inducing substance. It is characterized by contacting non-neuronal cells or neurons.
  • the operations and processes other than the features of the present invention are known operations and processes. For example, the above-mentioned documents (Special Table 2002-513545, M. Dezawa et al., Eur. J. Neurosci. 2001, Volume 14, p. 1771, W. Deng et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001 282 "14 8; D.
  • the method of bringing the agent of the present invention into contact with non-neuronal cells or immature neurons includes (1) the agent of the present invention containing non-neuronal cells or immature neurons.
  • the search method of the present invention should not be treated with a mitogenic substance.
  • a method of searching for a low-molecular-weight substance having only the pharmacologically acceptable toxicity that has the ability to differentiate into a nerve cell and / or to mature the nerve cell without being treated with a mitogenic agent A non-neuronal cell or a neuronal cell that has not been treated with a cell division inducer is contacted with a low-molecular-weight substance that has only a pharmaceutically acceptable toxicity, and the non-neuronal cell is differentiated into a neuronal cell, or the neuronal maturation It is characterized by examining the presence or absence or differentiation into nerve cells and the presence or absence of maturation of the nerve cells.
  • the present invention was reconfirmed based on the results similar to the in vitro differentiation of Example 1 of the present invention of Jieli Chen et al. ("Statins Induce Angiogenesis, Neurogenesis, and Synaptogenesis after Stroke, Annuals of Neurology, 2003, 53, 743)". Has been.
  • Bone marrow was obtained from femur and tibia or human bone marrow aspirates of 10-week-old female SD rats. Human bone marrow is treated with Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium (DMEM) (low concentration glucose) (GIBCO / BRL) and 10% fetal serum (FBS) (HYCLONE), 1 Dilute 1: 1 with 00 units / ml penicillin, 100 micrograms Z ml streptomycin (S IGMA) and centrifuge at 800 grams for 5 minutes in a density gradient.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium
  • FBS fetal serum
  • the supernatant and the interface were combined, diluted to about 20 ml with MEM containing 10% fetal serum, and plated on a plastic flask coated with polyethyleneimine. Rat bone marrow was placed in 10 ml PBS and 5% albumin. Cells were washed in this medium and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes.
  • DMEM low concentration glucose
  • FBS 10% serum
  • SIGMA 100 units Z milliliter penicillin
  • SIGMA 100 micrograms ⁇ / ml streptomycin
  • Cells were cultured in flasks for 1 day to remove non-adherent cells. Thereafter, the cells were cultured every 3 days, and the medium was changed. After the culture almost reached confluence, the cells were detached by trypsin (0.25 / 0 ) treatment. Cells were collected by centrifugation at SOOrpm for 5 minutes. The cells were suspended in the medium, planted in the plastic flask, and cultured in the medium. This operation was repeated 4 times. This procedure did not involve the addition of migens such as epidermal growth factor (EGF) or platelet-derived growth factor (PDGF), which are usually performed in this procedure.
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • Bone marrow stromal cells that have not yet reached confluence are detached from the bottom of the plastic flask and coated with 0.05 mg / ml poly-D-lysine (SIGMA) at a concentration of 10 thousand cells.
  • Well medium plates were planted in DM EM (low concentration glucose) supplemented with 10% fetal serum (FBS), 100 units / ml penicillin, 100 microgram milliliter streptomycin. At this time, dissolve 4 milligrams of the sympastatin prodrug in 100 microliters of ethanol in advance and add 0. IN NaOH to 50 degrees Celsius.
  • BDNF brain-derived growth factor
  • GDNE glial-derived neurotrophic factor
  • NGF nerve growth factor
  • MAP2 and tau staining after washing, the cells were blocked with PBS containing 0.25% Triton X-100 and 5% normal Hedge serum (PBSTS) for 1 hour at room temperature. Cells were then cultured overnight at 4 degrees Celsius in primary antibody solution diluted in PBSTS. After washing with PBS three times, the cells were cultured in a secondary antibody solution diluted with PBSTS at 4 degrees Celsius for 1 hour in the dark. After washing, the cells were embedded in glycerol ZPBS (1: 1) and observed with a fluorescence microscope.
  • PBSTS normal Hedge serum
  • Primary antibody is 1: 200 rabbit monoclonal antibody against rat NSE, 1: 200 mouse monoclonal antibody against rat Neu N, mouse mouse monoclonal antibody against MAP2, 5 micrograms / milliliter, rabbit monoclonal antibody against tau.
  • a biotinylated Hedge antibody against Usagi IgG was diluted to 10 micrograms / milliliter, and a biotinylated horse antibody against mouse IgG to rat IgG was diluted to 10 micrograms / ml.
  • MAP2 is against mouse Cy-3 Hedge antibody (5 micrograms per milliliter) and tau were visualized with a wedge antibody against Usagi Cy2.
  • Bone marrow stromal cells obtained from rat bone marrow were separated and grown on a plastic plate 4 times. It was divided into two types: large flat cells and relatively elongated spindle cells. In contrast, bone marrow stromal cells contacted with 0.25 micromolar, 5 micromolar and 10 micromolar activated simpastatin surprisingly changed morphology after 24 hours. Morphologically altered cells exhibit refraction and rounded cell bodies, exhibiting the character of a neuron-like cell, such as a simple bipolar cell or a highly branched multipolar cell, and synaptic-like morphogenesis It was seen (Fig. 1). After 48 hours, the synaptic morphology of the neuron-like cells became clear (Fig. 2).
  • NES-positive, NeuN-positive, MAP2-positive, and tau-positive morphologically neuron-like cells were continuously cultured in contact with activated cinnostatin. Dendrites extend from cells in a complex manner It was confirmed that nerve cells grew by forming synapses with many surrounding cells. Therefore, it was confirmed that the neuron-like cells that appeared 24 hours after contact with sympastatin were nerve cells themselves. This is the first report of differentiation from non-neuronal cells to neuronal cells within 24 hours.
  • Example 2 Instead of simpastatin in Example I, atorpastatin, itapastatin, compactin, dihydrocompactin, dalpastatin, pitapastatin, fluindstatin, flupastatin, bra / statin, verpastatin, verostatin, In the same manner, rat bone marrow stromal cells were differentiated into neurons without mitogen treatment using mepastatin, rosuvastatin, and oral pastatin separately, and the differentiated neurons were matured.
  • Example 3 Instead of simvastatin in Example 1, a mixture of atorvastatin and flupastatin was used to similarly differentiate rat bone marrow stromal cells into neural cells without mitogen treatment, and the differentiated nerve cells Matured.
  • Bone marrow was obtained from 10 week old female SD rat femur and tibia or human bone marrow aspirate. Human bone marrow is treated with Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium (DMEM) (low concentration glucose) (former CO / BRL) and 10% fetal serum (FBS) (HYCLONE), 100 units noml penicillin, 100 micrograms / Dilute 1: 1 with milliliter streptomycin (SIG MA) and centrifuge at 800 g for 5 minutes in a density gradient.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium
  • FBS fetal serum
  • SIG MA milliliter streptomycin
  • the supernatant and the interface were combined, diluted to approximately 20 ml with MEM containing 10% fetal serum, and plated into plastic flasks co-polymerized with polyethyleneimine.
  • Rat bone marrow was placed in 10 ml PBS and 5% albumin. Cells were washed in this medium and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes.
  • DMEM low concentration
  • FBS 10% serum
  • SIGMA microgram milliliter streptomycin
  • the cells were cultured every 3 days, and the medium was changed. After the culture almost reached confluency, the cells were detached by trypsin (0.25%) treatment. Cells were collected by centrifugation at SOOrpm for 5 minutes. The cells were suspended in the medium, planted in the plastic flask, and cultured in the medium. This operation was repeated 4 times. We did not add mitogens such as epidermal growth factor (EGF) or platelet-derived growth factor (PDGF), which are usually performed in this procedure.
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • LXSN vector (CLONTEGH)
  • green fluorescent protein was coded as an expression marker
  • a retroviral plasmid encoding aminoglycoside phosphotransferase was made as a neomycin (G418) selective marker.
  • LXSN-GFP plasmids were infected with cells (ATCC) that had been phoenix amphotropic packaged using calcium phosphate precipitation. Viral supernatants were collected 48 hours after infection and filtered through a filter with a hole size of 0.45—micrometer. Stored at minus 80 degrees Celsius until use. When the virus was collected, GFP expression was analyzed in the cells that were packaged in the Phoenix amphotropic package.
  • Bone marrow stromal cell transplanted rats were anesthetized with a mixed gas of 4% isoflurane, 66% N20, 30% oxygen, and anesthesia was maintained with a mixed gas of 1.5% isoflurane, 68.5% N20, 30% oxygen. .
  • Blood pressure, gas partial pressure off the blood, and blood glucose levels were monitored at the left femoral artery. Rectal temperature, temporal muscle temperature opposite the middle cerebral artery occlusion, was constantly monitored and maintained at 37.0–37.5 degrees Celsius with a heating pad. According to the method of E. Zea-Longa et al, ischemia was caused in the rat by occlusion of the middle cerebral artery in the tube with suture.
  • the left external carotid artery was tied with a 6-0 silk suture, the distal part was incised, the left internal carotid artery was isolated, and separated from the vagus nerve.
  • the extracranial branch of the left internal carotid artery was tied with 6-0 silk suture at the base of the branch.
  • Simpastatin was orally administered at a rate of 20 mg / kg daily from the same day to the day of the killing of 0 rats with middle cerebral artery occlusion due to occlusion with sutures.
  • simpastatin was not administered to another rat with middle cerebral artery occlusion.
  • Rats that did not receive sympastatin were treated with GFP even 14 days after middle cerebral artery occlusion.
  • Example 5 Instead of simvastatin in Example 4, atorvastatin, itavastatin, compactin, dihydrocompactin, darpastatin, pitapastatin, fluin Dostatin, flupastatin, bra / statin, velpastatin, verostatin, mebastatin, rospastatin, and oral pastatin are administered separately and the same procedure is performed, and the transplanted bone marrow stromal cells artificially undergo cerebral ischemia. It was confirmed that the cells were differentiated into nerve cells and regenerated functionally in the brain.
  • Example 6 In Example 4, instead of simpastatin, a mixture of atorpastatin and flupastatin was administered in the same manner, and the same effect was obtained.
  • Example 7 Evaluation of efficacy against Alzheimer's disease. Eight patients who can read and write in Japanese and can communicate their will to the doctor but have a clinical diagnosis that Alzheimer's disease may be possible, pranostatin sodium, etc. HMG—CoA reductase inhibition The following mini-mental state for non-lactating and non-nursing women who are suspected of having decreased renal function and hepatic metabolism and who have no history of hypersensitivity to the drug. Perform the test. Confirm that the patient has a severity index of 25 or less, and if there is a patient with a severity index of 25 or more, replace it with a patient with a severity index of 25 or less. Also exclude patients who were using the study drug within 4 months prior to the measurement.
  • lipophilic 6-blockers such as cimetidine, probranolol, clonidine, anticholinergics, antidepressants with anticholinergic activity, neuroleptics, putative cognitive enhancers and central nervous stimulators, Or benzodiazepine with a long half-life is prohibited.
  • the score does not consider writing errors. Show a figure with two points, one point, 1 1.1, approximately 5 centimeters in length and one vertex overlapping, and have the patient copy it. If all corners and angles are preserved, and the intersecting area is a rectangle, give one point. 1 point), 30 points in total.
  • the agent of the present invention (1) differentiates non-neuronal cells into neurons without treatment with mitogens and / or matures neurons without treatment with mitogens Ability, and (2) ability to treat or inhibit malignant diseases due to the action. Therefore, when the agent of the present invention is administered in vitro, it is useful for producing nerve cells that are not likely to be mixed with macrophages that cause transplant rejection and cancerous neurons, and non-neural cells or transplant rejection. By administering the present invention into the body before, after, at the same time as, or without injection, nerve cells that are not likely to be contaminated with macromolecules that cause a reaction and cancerous neurons.
  • Alzheimer's disease amyotrophic lateral sclerosis, brain tumor, cerebellar degeneration, traffic hydrocephalus, Huntington's disease, frontal lobe irradiation, multiple sclerosis, normal pressure hydrocephalus, Parkinson's disease, Pick's disease, progressive Multifocal meningitis, Creutzfeldt 'Jakob disease, Gerstmann' Shuiguchi Isla I Shine 1 disease, HIV-related disease, neurosyphilis, tuberculous and fungal meningitis, viral encephalitis, anoxia, B1 2 deficiency, Organ systems such as sexual drug-alcohol-nutrition abuse, folic acid deficiency, hypercalcemia associated with hyperparathyroidism, hypoglycemia, hypothyroidism, hepatic encephalopathy, pulmonary encephalopathy, uremic encephalopathy It is useful for the treatment of neuropathy diseases derived from insufficiency, pellagra, etc., or as a
  • the method of the present invention is a method for differentiating non-neuronal cells into neurons without being treated with a mitogenic substance, and allowing Z or neurons to mature without being treated with a mitogenic substance. This is a method that can treat or suppress malignant diseases. Therefore, the method of the present invention is useful as a method for producing nerve cells that are not likely to be mixed with macrophages that cause transplant rejection and cancerous neurons, and as a method for treating or inhibiting malignant diseases of the aforementioned neuropathy. Useful.
  • the nerve cell of the present invention is a nerve cell that has no fear of contamination of a macromolecule that causes transplant rejection and cancerous nerve cells. Therefore, it is useful not only for naturally differentiated neurons or naturally differentiated and mature neurons, but also for research or therapeutic purposes.
  • the search method of the present invention is a pharmaceutical having the ability to differentiate non-neuronal cells into nerve cells without being treated with mitogenic substances and / or to mature neurons without being treated with mitogenic substances. It is a method to search for low molecular weight substances that have only acceptable tolerance. These methods are useful because they may create useful drugs and reagents.

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Abstract

脳卒中、脳血管性痴呆、アルツハイマー病等神経障害疾患を治療するために、骨髄細胞等非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかないHMG-CoA還元酵素阻害物等低分子物質を有効成分とすることを特徴とする、分化および/または成熟剤ならびにその作用を特徴とする神経障害疾患治療または悪性化抑制剤、および非神経細胞を神経細胞へ分化し、および/または神経細胞を成熟する方法とその方法により得られる神経細胞、ならびにその有効成分を探索する方法を提供する。

Description

明 細 書 非神経細胞の神経細胞への分化成熟法、該剤と該剤探索法 技術分野
本発明は、（1 )非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分 化させ、および Zまたは神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能 力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質およびノまたはそのプロドラ ッグを有効成分とすることを特徴とする分化および または成熟剤ならびに該作用によ リ神経障害疾患を治療または悪性化抑制することを特徴とする、神経障害疾患治療ま たは悪性化抑制剤、（2)該分化および/または成熟剤により、非神経細胞を細胞分裂 誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および または神経細胞を細胞分 裂誘起物質で処理することなく成熟させることを特徴とする、分化および/または成熟 方法、（3)該分化および/または成熟方法により得られる、移植拒絶反応を起す高分 子と癌化神経細胞の混入の恐れがない神経細胞またはそれと同質の神経細胞、（4) 要すれば活性後に、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を、細胞分裂誘起物 質で処理していない非神経細胞または神経細胞に接触させ、非神経細胞の神経細胞 への分化、および または神経細胞の成熟の有無を調べることを特徴とする、分化およ び/または成熟剤を探索する方法に関する。 背景技術
神経障害疾患の治療または悪性化抑制剤として多くの高分子物質または低分子 物質が公開または公表されている (特開平 6— 1 841 96(ビトロネクチン由来合成ぺプ チド等）、特開平 8—1 43454(神経成長因子産生増強剤）、特開平 8— 269061 (抗 腫瘍性物質エボラクタエン)、特表平 8— 51 1 935(選択的細胞増殖)、特開平 9一 406 97(神経損傷に伴い発現が上昇する新規蛋白質)、特開平 9一 323928(神経分化誘 導体)、特開 2000— 53571 (脳損傷の予防'治療剤）、特開 2001 - 1721 96(神経 再生用組成物）、特開 2000— 1 25894(神経分化促進剤等）、 WOOO/Ί 271 2(新 規神経分化因子）、特開 2002— 234865(N-アルコキシアルキル一 N-アルキルアミ ン誘導体等）、特開 2002— 348239(幹細胞'神経前駆細胞の増殖 ·分化促進剤）、 特表 2002— 51 5488(力レボキサ 匕合物等）、特表 2002— 51 6903(N—複素 環式カルボン酸またはカルボン酸等配置電子体の尿素等）、特表 2002— 51 6904(N 一複素環式カルボン酸またはカルボン酸等配置電子体の N—結合スルホンアミド)、特 表 2002— 51 6905(神経学上の傷害および毛髪損失を治療するために使用される AZA—複素環式化合物）、特表 2002— 51 7383(神経学上の傷害および毛髪損失を 治療するために使用される AZA—複素環式化合物）、特表 2002— 519408(医薬化 合物及び組成物として有用な NAALADase 阻害剤）、特表 2002— 520413 (ニュー ロンの成長を及び伸長を刺激するための化合物等）、特表 2002— 523462(神経再 生プロモーター)、特表 2002-526474(環状エステルまたはアミド誘導体)、特表 20 02— 53 1 448 ( N—複素環化合物のカ レボン酸等）、特表 2002— 533421 (NAALAD ァ一ゼ阻害因子を用いる疾患処置法）、特表 2002— 537384(N— [2— ヒドロキシ一 3—（1ーピペリジニル）プロポキシ]ピリジンー1一ォキシドーカルボキシイミ ドイルクロライド等）、特表 2002— 53921 8(神経再生を促進する組成物）、特開 200 3— 130869(脳神経細胞可塑性増強剤）、特表 2003— 500023(ラミニン 8等）、特 表 2003— 503478(神経学的疾患の治療のための —アミノ酸誘導体)、特表 2003 - 503479(N置換化グリシン誘導体）、特表 2003— 503484(アミノアルキル誘導 体)、特表 2003— 504330(神経再生を促進するための組成物等)、特開 2003— 81 959(ベンゼン環縮合 5員複素環式化合物等）、特表 2003— 505508(非環式又は環 式アミド誘導体）、特表 2003— 506356(神経学的疾患の治療のための環状アミン誘 導体）、特表 2003— 50851 2(非ペプチド性サイクリロフィリン結合化合物等)、特表 2 003— 520246(神経保護療法のためのコポリマー 1等））。
しかし、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脳腫瘍、小脳変性症、交通性水 頭症、ハンチントン病、前頭葉への照射、多発性硬化症、正常圧水頭症、パーキンソン 病、ピック病、進行性多巣性白質脳症、進行性核上麻痺、拳闘家痴呆、脳外傷、外科手 術、脳腫瘍、慢性硬膜下血腫、脳卒中、脳血管性痴呆、ウィルソン病細菌性心内膜炎、 クロイツフェルト'ヤコブ病、ゲルストマン 'シュトロイスラー'シャインカ一病、 HIV関連疾 患、神経梅毒、結核性および真菌性髄膜炎、ウィルス性脳炎、無酸素症、 B1 2欠乏症、 慢性的な薬物-アルコール-栄養性乱用、葉酸欠乏症、副甲状腺機能亢進症に伴う高力 ルシゥ厶血症、低血糖、甲状腺機能低下症、肝性脳症、肺性脳症、尿毒素性脳症等の 臓器系不全、ペラグラ等の神経障害疾患は繊維化、免疫反応、血管傷害、栄養と酸素 欠乏、感染等により、神経細胞が退化、減少、細胞死し、または傷害、除外されることに より、組織や臓器がその機能を失い発症すると考えられている。したがって、これらの疾 患を治療または悪化予防の 1つの方法として失われた神経細胞を何らかの方法で補充 する必要がある。
そのため、 ES細胞または神経幹細胞が注目された。 ES細胞または神経幹細胞は 未分化の細胞であり、神経細胞が死滅すると、その失われた細胞を補うように分化を始 め、生体機能の維持に大きく貢献する可能性があるからであった。近年、機能を失った 組織に対して ES細胞や神経幹細胞を移植し、個々の生体機能を発現する細胞へ特異 的に分化させることによリ、当該病態を改善'治療する試みが行われた。しかし、 ES細 胞は胚性幹細胞であり、ヒ卜の胚を原料に用いるという倫理性の問題と移植抗原性の 問題を有する。一方、神経幹細胞の場合も胎児由来の神経幹細胞しか入手が困難であ リ、胎児由来の神経幹細胞は倫理性の問題と移植抗原性の問題を有する。
従って、 ES細胞、胎児由来の神経幹細胞以外の非神経細胞で神経細胞に分化成 熟し得る細胞が注目された。自己の体から容易に入手可能な骨髄間質細胞（骨髄スト ロマ細胞ともいう）に細胞分裂誘起物質 (マイトジェンともいう)で処理し、次いでレチノィ ン酸、成長因子、胎児ニューロン細胞またはその組合せから選択される分化剤を処理し て得られる神経細胞が公表された (特表 2002— 51 3545)。しかし、この骨髄細胞由 来の神経細胞はその工程に細胞分裂誘起物質処理操作が必須のため、細胞分裂誘起 物質を体内投与した場合、他の細胞の異常増殖をもたらし、細胞を癌化させる恐れが あり、また体外投与の場合でも、そういう処理操作で作られた神経細胞に癌化した神経 細胞が混入している可能性があり、これをヒトに移植することは問題である。
そこで細胞分裂誘起物質処理無しに骨髄間質細胞にメルカプトエタノール、ジブチ リルサイクリック AMP等低分子の分化促進因子や骨形成因子 (BMP)、脳由来神経栄 養因子 (BDNF)、線維芽細胞成長因子 (bFGF)等の高分子の分化促進因子や骨形成 タンパク質阻害剤ノジン（Noggin)と脱メチル化剤 5—ァザシチジンを作用させることに より神経細胞に分化することが報告されたことから（M . Dezawaら、 Eur. J . Neurosci. 2001年 1 4卷 1 771頁、 W. Dengら、 Biochem . Biophys . Res . Commun . 2001 年 282巻 1 48頁、 D . Woodburyら、丄 Neurosci . Res . 2000年 61巻 363頁、 J . S anchez— Ramosら、 Exp. Neurol . 2000年 1 64巻 247頁、 J . Kohyyamaら、 Diffe rentiation, 2001年 68巻 235頁）、これらを上記疾患の予防'治療に用いることも考 えられるが、かかる高分子の分化促進因子も、分子量の大きいペプチドであるため、生 体内で容易に分解を受け、また血液脳関門を通過できないことから、投与方法が著しく 限定されるという問題があり、またメルカプトエタノール、ジブチリルサイクリック AMP等 の分化促進因子、骨形成タンパク質阻害剤や脱メチル化剤等の低分子は毒性が高ぐ 実用化は困難である。
また、自家または自家と主要組織適合抗原を実質的に同じくする、神経幹細胞、神 経前駆細胞に関しては体外で分化させて神経細胞にし、それを移植するよりも該細胞を 分化し得る薬剤をヒトに投与して生体内に内在する神経幹細胞または神経前駆細胞を 分化させて神経細胞にすることにより失われた神経の補充を行うことがより容易と考え られる。極最近、ラットの脳動脈を一時的に止めて脇虚血にして海馬の神経細胞に傷害 を与えた後に、神経成長因子を注入すると、失われた神経細胞の 4割が回復したという 報告がある（H . Nakatomiら、 Ce 2002年 1 1 0卷 429頁）。研究としては素晴らしい が、神経成長因子というタンパク質を脳内に注入することは問題である。
骨髄間質細胞がシュワン細胞に分化することとシュワン細胞の神経細胞保護機能 に着目し、骨髄間質細胞をシュワン細胞に分化させ、その分化させたシュワン細胞を損 傷した神経細胞の周囲に移植し、神経細胞の再生を促すという報告がある（出澤真理、 実験医学、 2002年 20巻 1 31 2頁)。この方法は、自家骨髄間質細胞より分化させたシ ュワン細胞を用いることにより、倫理性の問題と移植抗原性の問題を克服する可能性を 秘めた優れた方法である。この方法に用いる骨髄間質細胞由来シュワン細胞を含む神 経再生用医薬組成物が後日公開された (特開 2003— 61 647)。しかし、その適用は、 切断された神経の再結合の場合に限られ、また、シュワン細胞の分化にサイクリック AMP等の分化促進因子を用いるという前述の問題が残されている。
一方、 HMG— CoA還元酵素阻害剤はコレステロール合成阻害作用、脂質低下作 用、動脈硬化進展抑制作用、外因性コレステロール吸収抑制作用が認められ、かつ長 期投与でも毒性が低いため、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、高 脂血症の治療または悪性化抑制に使われている。
また、実用化には至っていないが、特定の HMG— CoA還元酵素阻害剤とアンジ ォテンシン 2受容体拮抗剤の組み合せ物による心不全の予防若しくは治療 (特開 2002 一 1 45770)、 HMG— CoA還元酵素阻害剤とアンジォテンシン変換酵素（ACE)抑制 剤の組み合せ物による二次心臓発作の危険予防 (特開平 8— 291 082)、 HMG-Co A還元酵素阻害剤とインスリン抵抗性改善薬の組み合せ物による TNA— a抑制 (特開 2 001一 294537)、同組み合せ物による動脈硬化症予防または治療 (特開平 9— 71 5 40)、 HMG— CoA還元酵素阻害剤のスタチンによる造血幹細胞由来細胞から内皮細 胞への分化（ Llevadotら、 J . Clinical Investigation^ 2001年 1 08卷 399頁）ス タチンとポリホスホネートの組み合せ物による骨形成促進とァテローム動脈硬化症治療 (特開 2001— 253827)、 HMG— CoA還元酵素阻害剤とプロスタグランジン'ァゴニ ストの組み合せ物による骨形成増強作（G. Mundyら、 SCIENCE, 1 999年 286巻 1 9 46頁）、セリパスタチンナトリウムの '匱性 HIV— 1に対する効果（特開 2002— 29973)、 HMG— CoA還元酵素阻害剤のアンドロゲン活性アンタゴニスト作用による拒食症の処 置および予防（特表 2001 -51 3572)等の報告がある。
また、 HMG— CoA還元酵素阻害剤に関し、糖尿病に罹患している患者の神経伝 達速度及び神経血流量を改善するという公表 (特表 2002— 536332)や神経変性病 患者がアポリポ蛋白質 (ApoE)が低いことを根拠に神経変性病の治療法法として神経 変性病患者に ApoEのレベルを増加させる組成物を投与する方法と神経細胞と検定化 合物を接触させ、神経細胞の ApoE上昇の有無を測定する ApoE上昇化合物の探索法 (特表 2001 - 51 761 7)、アルツハイマー病を罹病しているヒトの脳の総コレステロ一 ル（TC)と LDLの濃度が健常人より高いことを根拠にアルツハイマー病を罹病している ヒトに血漿トリグリセライドレベル低下剤を投与し、あるいは LDL— Cレベルを低下させ、 HDLレベルを上昇させるために、所望によリコレステロールレベル低下剤を共投与して 血漿卜リグリセライドレベルを低下させることによるアルツハイマー病の発症防止を憶測 し（特表 2002— 501 887)、アルツハイマー病の危険のあるコレステロールのレベル 上昇を伴う個人に対して、血中コレステロールレベルを減少させる組成物を投与し、アミ ロイドタンパク質の産生を減少させる方法 (特表 2002— 507564)の公表がある。
これらの公表は HMG—CoA還元酵素阻害剤の高脂血症治療に用いられた ApoE 上昇、コレステロールレベル低下、 LDLレベル低下等の作用を応用すれば、未だ神経 細胞が退化、減少、細胞死し、または傷害、除外されるに至っていない極初期のァルツ ハイマー病等神経変性病が予防または治療が可能かもしれない。しかし、いくら ApoE 上昇、コレステロールレベル低下、 LDLレベル低下させても、アルツハイマー病等神経 変性病により退化、減少、細胞死し、または傷害、除外されてしまった神経細胞は再生 のもとになる細胞が存在しなければ、再生されない。
また、 HMG-CoA還元酵素阻害物質が酸化 LDLの形成を妨げる以外の機構を通 じ、内皮細胞一酸化窒素合成酵素活性を上方制御し、その結果として、 HMG-CoA還元 酵素阻害物質が、内皮細胞一酸化窒素合成酵素の異常に低い発現およびノまたは活 性から生じる異常の肺性高血圧、虚血性脳卒中等を治療するまたは予防する可能性が 本発明後公表された (特表 2003— 51 1 347)。し力、し、この場合も、骨髄細胞等神経 細胞再生のもとになる細胞が存在しないので、退化、減少、細胞死し、または傷害、除 外された神経細胞は再生されない。
従って、（1 )非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化 させ、および/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能力 を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質およびノまたはそのプロドラッグ を有効成分とすることを特徴とする分化およびノまたは成熟剤ならびに該作用により神 経障害疾患を治療または悪性化抑制することを特徴とする、神経障害疾患治療または 悪性化抑制剤や、（2)該分化および または成熟剤により、非神経細胞を細胞分裂誘 起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および Zまたは神経細胞を細胞分裂 誘起物質で処理することなく成熟させることを特徴とする、分化およびノまたは成熟方 法の開発が強く望まれている。 発明の開示
本発明の目的は、（1 )非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細 胞へ分化させ、および/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟さ せる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質および Zまたはそのプ ロドラッグを有効成分とすることを特徴とする分化およびノまたは成熟剤ならびに該作 用により神経障害疾患を治療または悪性化抑制することを特徴とする、神経障害疾患 治療または悪性化抑制剤や、（2)該分化および または成熟剤により、非神経細胞を 細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および/または神経細胞 を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させることを特徴とする、分化および/ま たは成熟方法を提供することにある。
本発明者らは、斯かる実状に鑑み、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理するこ となく神経細胞へ分化させ、および または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理する ことなく成熟させる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を種々 探索した結果、 HMG— CoA還元酵素阻害剤を有効成分とする組成物に、非神経細胞 を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させる作用と該神経細胞を細 胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる作用があることを見出し、さらに種々研 究した結果、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、（1 )要すれば非神経細胞または非神経細胞由来神経細胞を 含有し、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、およ び/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能力を有する、 薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質および Zまたはそのプロドラッグを有効成 分とすることを特徴とする分化および/または成熟剤、（2)低分子物質が 3—ヒドロキ シー 3 -メチルグルタリル一補酵素 A(HMG—CoA)還元酵素阻害剤から選ばれる、前 述の分化およびノまたは成熟剤、（3) HMG— CoA還元酵素阻害剤がアトルバスタチ ン、イタパスタチン、コン /《クチン、シンパスタチン、ジヒドロコンパクチン、ダルバスタチ ン、ピタパスタチン、フルインドスタチン、フルパスタチン、プラバスタチン、ベルパスタチ ン、ベロスタチン、メパスタチン、ロスパスタチン、口パスタチン、およびそれらの光学また は幾何異性体、およびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラ ッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる、 前述の分化および Zまたは成熟剤、（4) HMG— CoA還元酵素阻害剤がアトルパスタ チンカルシウム水和物、シンパスタチン、フルパスタチンナトリウム、プラバスタチンナト ィゥムから選ばれる、前述の分化および/または成熟剤、（5)非神経細胞が骨髄系非 神経細胞と神経系非神経細胞から選ばれる、前述の分化および Zまたは成熟剤、（6) 骨髄系非神経細胞が骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞から選ばれる、前述の 分化および/または成熟剤、（7)神経系非神経細胞が神経幹細胞と神経前駆細胞か ら選ばれる、前述の分化および または成熟剤、（8)前述の分化および/または成熟 剤により、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、お よび/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させることを特徴と する、分化および または成熟方法、（9)前述の分化および または成熟方法により 得られる、移植拒絶反応を起す高分子と癌化神経細胞の混入の恐れがない神経細胞、 ( 1 0)要すれば活性後に、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を、細胞分裂誘 起物質で処理していない非神経細胞または神経細胞に接触させ、非神経細胞の神経 細胞への分化、および/または神経細胞の成熟の有無を調べることを特徴とする、前 述の分化および または成熟剤を探索する方法、（1 1 )前述の分化およびノまたは成 熟剤を有効成分とし、要すれば活性後に、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理する ことなく神経細胞へ分化させ、および または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理す ることなく成熟させることにより神経障害疾患を治療または悪性化抑制することを特徴と する、神経障害疾患治療または悪性化抑制剤等を提供するものである。 図面の簡単な説明
第 1 図は実施例 1における 5マイクロモルの活性化シンパスタチン 24時間接触に よる骨髄間質細胞の神経細胞への分化を示す普通光顕微鏡写真であり、顕微鏡の ΐ 率は 1 00倍で、図中のスケールバーの長さは 50マイクロメータ一である。 第 2図は実施例 1における 5マイクロモルの活性化シンパスタチン 48時間接触によ る骨髄間質細胞の神経細胞への分化を示す普通光顕微鏡写真であり、顕微鏡の倍率 は 1 00倍で、図中のスケールバーの長さは 50マイクロメーターである。
第 3図は実施例 1における 5マイクロモルの活性化シンパスタチン 24時間接触によ る骨髄間質細胞の神経細胞への分化を示す MAP2(緑色）とタウ（赤色）の二重免疫標 識標本の蛍光光顕微鏡写真であり、顕微鏡の倍率は 1 00倍で、図中のスケールパー の長さは 50マイクロメータ一である。
第 4図は実施例 1における 5マイクロモルの活性化シンパスタチン 48時間接触によ る骨髄間質細胞の神経細胞への分化を示す MAP2(緑色）とタウ（赤色）の二重免疫標 識標本の蛍光顕微鏡写真であり、顕微鏡の倍率は 1 00倍で、図中のスケールパーの 長さは 50マイクロメ一タ一である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の分化およびノまたは成熟剤ならびに神経障害疾患治療または悪性化抑 制剤は、要すれば非神経細胞または非神経細胞由来神経細胞を含有し、非神経細胞 を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および または神経細 胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能力を有する、薬学的許容範囲 の毒性しかない低分子物質および/またはそのプロドラッグを有効成分とすることを特 徵する。本発明剤は、さらに、患者に投与した場合に、非神経細胞を細胞分裂誘起物質 で処理することなく神経細胞へ分化させ、および/または神経細胞を細胞分裂誘起物 質で処理することなく成熟させることにより神経障害疾患を治療または悪性化抑制する という特徴を有する。 本発明剤の有効成分は、要すれば非神経細胞または非神経細胞由来神経細胞を 含有し、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、およ び/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能力を有する、 薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質および/またはそのプロドラッグであれば よぐ例えば、後述する本発明の探索方法で将来発見されるものでも差し支えない。
薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質とは、毒性が薬学的に許容できる範 囲内である低分子物質を意味する。ここで用いる毒性には、急性毒性、亜急性毒性、慢 性毒性、催奇形成等本来の意味の毒性の他、薬学的許容範囲外の重篤かつ高頻度の 副作用も含まれる。
低分子物質とは、タンパク質や高分子のペプチドなど高分子でない物質で、抗原性 がなぐ血液脳関門を通過可能な程度に低分子の物質である。
本発明剤は非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化さ せ、および または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させるため、 またはその作用により神経障害疾患を治療または悪性化抑制するため、ならびに本発 明の方法と本発明の神経細胞を得るために用いる。
本発明の探索方法によって得られる非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理する ことなく神経細胞へ分化させ、およびノまたは神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理す ることなく成熟させる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質および ノまたはそのプロドラッグは、本発明の分化およびノまたは成熟剤または神経障害疾 患治療または悪性化抑制剤に属する。
非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および //または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能力を有する、薬 学的許容範囲の毒性しかない低分子物質としては、これに制限されるわけではないが、 好ましくは、 3—ヒドロキシー 3 -メチルグルタリル一補酵素 A( HMG— CoA)還元酵素 阻害剤等が挙げられる。
HMG— CoA還元酵素阻害剤とはコレステロール生合成の重要な律速酵素である HMG— CoA還元酵素によリコレステロールをはじめとする各種ステロイドやテルペン生 合成の前駆体で，ケトン体代謝の中間体である HMG— CoAをメバロン酸に変換する反 応を阻害する物質である。 HMG— CoA還元酵素阻害剤としては HMG— CoA還元酵 素の作用を阻害する物質で、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質であればよ い。
HMG— CoA還元酵素阻害剤としては、これに限定されるわけではないが、好まし くは、アトルバスタチン、イタパスタチン（別名 NK—1 04)、コンパクチン、シンパスタチン、 ジヒドロコンパクチン、ダルパスタチン、ピタパスタチン、フルパスタチン、プラバスタチン、 ベルパスタチン、ベロスタチン、メパスタチン、ロスパスタチン、ロバスタチン等、およびそ れらの光学または幾何異性体、およびそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又は それらのプロドラッグの薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水 和物等が挙げられる。
その中でも、ァ卜ルパスタチン、シンパスタチン、フルパスタチン、プラ/ スタチンと その薬学的に許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物等は高脂血症 の治療薬として長年使用されて、その安全性が確認されているという意味でより好ましぐ 具体的にはアトルバスタチンカルシウム水和物、シンパスタチン、フルパスタチンナトリ ゥム、プラバスタチンナ卜ィゥ厶等がこれに限定されるというわけではないが特に好まし し、ものとして挙げられる。 HMG— CoA還元酵素阻害剤は、薬学的に許容することのできる限り、どのような 製法でつくられても差し支えなし、。これに限定するわけではないが、 HMG— CoA還元 酵素阻害剤の製法を例示すると、アトルバスタチンは米国特許第 4, 681 , 893号およ ぴ特開平 3— 58967号（USP5273995)に開示された方法 (こより、イタバスタチン (別名 NK-104)は米国特許第 5, 102， 888号に開示された方法により、コンパクチ ンは米国特許第 4, 804, 770号に開示された方法により、シンバスタチンは特開昭 56 一 122375号（USP4444784)に開示された方法により、ジヒドロコンパクチンは米国 特許第 4, 450, 171号に開示された方法により、ダルパスタチンはヨーロッパ特許出 願 EP738510に開示された方法により、ピタノくスタチンは特開平 1一 279866号（US P5854259及び USP5856336)に開示された方法【こより、フルインドスタチンはョ一 ロッパ特許出願公開第 363, 934A1中に開示された方法により、フルパスタチンは特 表昭 60— 500015号（リ3 4739073)またはョーロッパ特許出願 363934に開 示された方法により、プラノくスタチンは特開昭 57— 2240号（USP4346227)に開示 された方法により、ベルパスタチンは米国特許第 5, 082, 859号に開示された方法に より、ベロスタチンは米国特許第 4, 448, 784号および米国特許第 4， 450, 171号 に開示された方法により、メパスタチンは米国特許第 3, 983, 140号に開示された方 法により、ロス/ スタチンは特開平 5— 178841号（USP5260440)に開示された方 法により、ロノ《スタチンは特開昭 57— 163374号（USP4231938)に開示された方 法により調製することができる。
本発明剤は、要すれば活性後に、（1)非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理す ることなく神経細胞へ分化させ、および Zまたは神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理 することなく成熟させ、または (2)該作用により神経障害疾患を治療または悪性化抑制 する。
したがって、本発明剤は、本剤を体外的に非神経細胞または未熟の神経細胞に接 触させ、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、およ び Zまたは神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させることにより、移 植用の神経細胞を得るために有用である。
非神経細胞または非神経細胞由来神経細胞を含有する本発明剤は、脳内移植ま たは静脈内投与することにより、本剤含有の非神経細胞または非神経細胞由来神経細 胞が、脳内移植の場合は直接、静脈内投与の場合は血液脳関門の壊れた個所よレリ脳 組織に進入し、そこで神経細胞に分化成熟することにより、神経細胞の補充が行われ、 神経障害疾患を治療または悪性化抑制するために有用である。
非神経細胞または非神経細胞由来神経細胞を含有しない本発明剤は、本発明剤 とは別に非神経細胞または未熟の神経細胞を体内に注入する前および または注入 し後、または注入と同時に、経口投与又は非経口投与することにより体内において該細 胞と接触し、体内において該細胞を分化させ、および または成熟させることにより、ま たは外部から非神経細胞または未熟の神経細胞を体内に注入することなぐ本剤を経 口投与又は非経口投与することにより体内において内在する非神経細胞または未熟の 神経細胞に接触させ、体内において該細胞を分化させ、および/または成熟させること により神経障害疾患を治療または悪性化抑制するために有用である。
すなわち、これを含有する医薬は各種神経組織や神経細胞の細胞の退行'減少又 は細胞死に起因する疾患の予防及び治療薬として有用である。
本発明剤のうち、細胞を含まないものは、低分子であることから、体外投与は勿論、 経口投与又は非経口投与 (筋肉内、皮下、静脈内、坐薬など)のいずれでも投与できる。 体外投与の場合は本発明剤中にプロドラッグが含まれているときは、適宜の方法 で活性化してから用いた方がより大きな効果を得るので好ましい。プロドラッグが含まれ ていないときはそのまま用いてよい。体内投与の場合は多くの場合体内でプロドラッグ が活性化するので、プロドラッグを予め活性化しておく必要は少ない。
経口用製剤を調製する場合、賦形剤、さらに必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢 剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により、錠剤、被服錠剤、顆粒剤、カプセ ル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性又は水性の懸濁液剤などとする。賦形 剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セル一ロス などが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテ ル、ェチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラッ ク、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンな どが挙げられる。
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン未、結晶セルロース、炭酸カル シゥム、炭酸水素ナトリウム、クェン酸カルシウム、デキストラン、ぺクチンなどが挙げら れる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコ —ル、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、医薬品に添加することが 許可されているものが使用できる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハツ力脳、芳香酸、 ハツ力油、竜脳、桂皮末などが使用できる。これらの錠剤は、顆粒剤には、糖衣、ゼラチ ン衣、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
注射剤を調製する場合、必要により、 pH 調整剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤など を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に 収納後、凍結乾燥などによって、固形製剤として、用事調製の製剤としてもよい。また、 一投与量を容器に収納してもよぐまた、多投与量を同一の容器に収納してもよい。
本発明剤の試薬としての使用濃度は通常 0. 01から 1 000マイクロモル、好ましく は、 0. 1 ~ 1 00マイクロモルで使用し、更に好ましくは 1〜 1 0マイクロモル、医薬として の投与量は、ヒ卜の場合、成人 1日当たり通常 0. 01〜1 000ミリグラム、好ましくは、 0. "！〜 1 00ミリグラムの範囲で、 1日量を 1日 1回、あるいは 2〜4回に分けて投与する。な お、年齢、症状により適宜増減する。本剤は細胞の種類、分化の程度等、あるいは年齢、 症状により至適濃度が異なるので、細胞ごとに分化の程度ごと、あるいは患者ごと症状 ごとに至適濃度を探し、投与することがより望ましい。
本発明に用いる非神経細胞とは神経細胞以外の細胞で、本発明剤により神経細 胞に分化し得る細胞を意味する。本発明剤により神経細胞に分化し得る細胞としては、 これに限定されるわけではないが好ましくは、 ES細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、骨 髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞等が挙げられる。
ES細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞 等のうち、非胎児性神経幹細胞、神経前駆細胞、骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質 細胞等は ES細胞、胎児由来の神経幹細胞との比較において倫理性で問題が少なぐ より好ましい。
非胎児性神経幹細胞、神経前駆細胞、骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞 等のうち、骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞等は容易に入手し易 移植用の 神経細胞に分化させる細胞としてはより好ましぐ特に自家または自家と主要組織適合 抗原を実質的に同じくするまたは非常に類似する、骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間 質細胞は移植用の神経細胞に分化する細胞として、または体内に注入して体内で神経 細胞に分化する細胞としてより好ましい。 一方、神経細胞の移植や非神経細胞等の体内注入なしに、本発明剤を投与して 体内に内在する神経細胞の再生を行うことを目的にする場合は、内在する神経幹細胞、 神経前駆細胞、骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞等が分化して神経細胞になる。 したがって、目的に応じて本発明に用いる非神経細胞を選ぶことがより好ましい。
本発明の方法に用いる非神経細胞または神経細胞の入手先は使用目的によって 限定の度合いが異なるが、適合する限りどこから入手しても良い。使用目的がヒトを対 象としない場合には限定が少ないが、ヒトに対して移植する神経細胞を得る目的の場合 または体内に注入して体内で分化させて神経細胞にする、または体内で神経細胞を成 熟させる場合は、 ES細胞はヒ卜の胎児胚より、神経幹細胞と神経前駆細胞はヒ卜の月; 児の脳より、骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞等は移植されるヒトまたはそのヒ 卜と主要組織適合抗原が実質的に同じ、または非常に類似するヒ卜の骨髄より無菌的に 採取するのが好ましい。
神経細胞の移植や非神経細胞等の体内注入なしに、本発明剤を投与して体内に 内在する神経細胞の再生を行うことを目的にする場合は、用いる非神経細胞は内在非 神経細胞に限られる。非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ 分化させ、およびノまたは神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる 能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質および/またはそのプロド ラッグを探索する方法に用いる非神経細胞または神経細胞の入手先に限定はない。
本発明に用いる神経細胞とは成熟した神経細胞以外の神経細胞で、本発明剤に より成熟し得る神経細胞を意味する。本発明剤により成熟し得る神経細胞は、非神経細 胞を本発明の方法により分化させて得られる神経細胞が望ましいが、これに限定されな し、。非神経細胞を本発明の方法以外の方法により分化させて得られる神経細胞や神経 幹細胞 ·神経前駆細胞から自然に分化した神経細胞も用いることができる。これら神経 細胞のうち、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく分化させることにより、 移植拒絶反応を起す高分子と癌化神経細胞の混入の恐れがない神経細胞が好ましい。 該細胞は内在する神経細胞または本発明の非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理す ることなく神経細胞へ分化させる方法で得られる。
本発明の神経細胞は移植拒絶反応を起す高分子と癌化神経細胞の混入の恐れ がない神経細胞に限定される。本発明の移植拒絶反応を起す高分子と癌化神経細胞 の混入の恐れがない神経細胞は、本発明の方法、すなわち、本発明剤により非神経細 胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および/または神経 細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる方法により得られる。
本発明の神経細胞は自然に分化した神経細胞または自然に分化成熟した神経細 胞に限りなく近い神経細胞である.これに限定されるわけではないが、移植用神経細胞 としては最適である.本発明の神経細胞は、脳に移植の場合は中枢神経系に移植する のに適切であるように様々な方法で投与されうる。これに限定されるわけではないが、 非経口投与、くも膜下腔投与、脳室内投与および黒質内投与等が挙げられる。特に、脳 卒中など血液の脳関門に傷害が起こっている患者の場合は静脈内注射によっても細胞 が脳の組織に移行し、神経細胞に分化する。このことは、例えば、頸動脈を一時的に縛 リ、脳梗塞を人工的に起した雌のウィスターラッ卜の尻尾の静脈に雄のウィスターラット の骨髄間質細胞を約 1 X I 06個を 5マイクロモル活性化シンパスタチンを含有する 0. 5 ミリリトルのダルベッコ修飾イーグル溶液に懸濁したものを注入すると、後日、雌ラットの 脳の海馬組織に Y染色体を有する神経細胞を観察することにより静脈注射した雄の骨 髄間質細胞が神経細胞に分化したことを確認できる。 本発明の方法、すなわち、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神 経細胞へ分化させ、および/または神経細胞を成熟させる方法は、本発明剤を細胞分 裂誘起物質で処理していない、非神経細胞または神経細胞に接触させることを特徴と する。本発明の特徴以外の操作や工程は公知の操作や工程でよぐそれらは例えば前 述の文献（特表 2002— 513545、 M. Dezawaら、 Eur. J. Neurosci.2001年 14 巻 1771頁、 W. Dengら、 Biochem. Biophys. Res. Commun.2001年 282巻" 14 8頁、 D. Woodburyら、 J. Neurosci. Res.2000年 61卷 363頁、 J. Sanchez— R amosら、 Exp. Neurol.2000年 164巻 247頁、 J. Kohyyamaら、 Differentiation、 2001年 68卷 235頁、 H. Nakatomiら， Cell、 2002年 110卷 429頁、特表 2001 - 517617)および他の文献（丄 Kunlinら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2001 年 98巻 4710頁）に開示されている。
また、すでに本発明剤の項で説明したように、本発明剤を非神経細胞または未熟 の神経細胞に接触させる方法としては、（1)非神経細胞または未熟の神経細胞を含有 する本発明剤を用いる方法と非神経細胞または未熟の神経細胞を含有しない本発明 剤を体外的に非神経細胞または未熟の神経細胞に接触させる方法、（2)非神経細胞ま たは未熟の神経細胞を体内に注入する前および または注入した後に本発明剤を経 口投与又は非経口投与することにより体内において該細胞に接触させる方法、（3)外 部から非神経細胞または未熟の神経細胞を体内に注入することな 本発明剤を経口 投与又は非経口投与することにより体内において内在する非神経細胞または未熟の神 経細胞に接触させる方法等がある。目的に応じて適宜選択すればよい。これらの工程 も本発明の特徴以外は前述の文献に開示されている。
本発明の探索方法、すなわち、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することな く神経細胞に分化させ、および または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理すること なく成熟させる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を探索する 方法は、要すれば活性後に、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を、細胞分裂 誘起物質で処理していない非神経細胞または神経細胞に接触させ、該非神経細胞の 神経細胞への分化の有無、または神経細胞の成熟の有無または神経細胞への分化と 該神経細胞の成熟の有無を調べることを特徴とる。
すなわち、細胞分裂誘起物質で処理しない非神経細胞または神経細胞を用いるこ とと薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を探索の対象とすることが特徴で、こ の特徴以外の工程は前述の文献に開示されている。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。なお、操作や工程のうち、公知部分の詳細は以下の文献にも 開示されてしゝる。 D. Stokesら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998年 95卷 39 08頁、 R. J. Gersonら、 Am. J. Med.1989年 87巻 28S頁、 P. A. Toddら、 Drug s、 1990年 40巻 583頁、 P. Hofstetterら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.200 2年 99卷 2199頁、 E. Zea— Longaら、 Stroke, 1989年 20巻 84年、メルクマ二ユア ル 17版日本版。
なお、 Jieli Chen らの本発明の実施例 1のインビトロ分化と同様の結果（"Statins Induce Angiogenesis, Neurogenesis, and Synaptogenesis after Stroke 、 Annuals of Neurology, 2003年 53巻 743頁）により、本発明は再確認されている。
実施例 1. インビトロ分化：骨髄は、 10週齢の雌 SDラットの大腿骨と脛骨または ヒト骨髄吸引物から得た。ヒト骨髄を、ダルベッコ修飾イーグル最少必須培地（DMEM) (低濃度グルコース）（GIBCO/BRL)および 10%胎児血清（FBS) (HYCLONE)、 1 00単位/ミリリットルペニシリン、 1 00マイクログラム Zミリリットルストレプトマイシン（S IGMA)で 1： 1に希釈し、密度勾配で、 5分間 800グラムで遠心分離した。上清および界 面を合せ、 1 0%胎児血清を含む MEMで約 20ミリリットルに希釈し、ポリエチレンィミン でコートされたプラスチック製フラスコにプレートした。ラッ卜骨髄を、 1 0ミリリットル PBS および 5%アルブミンに入れた。細胞を、この培地中で洗浄し、 800rpmで 5分間遠心 分離した。
細胞を、 2mMグルタミン、 1 0%血清（FBS)、 1 00単位 Zミリリットルペニシリン、 1 00マイクログラム ^ /ミリリットルストレプトマイシン（SIGMA)を加えた DMEM (低濃度 グルコース）からなる増殖培地中に再懸濁した。細胞を、フラスコ中で 1日間培養し、非 接着細胞を除去した。その後、毎 3日間培養し、培地を交換した。培養物が、コンフルェ ンシ一にほとんど達した後、トリプシン（0. 25。/0)処理を行い、細胞を剥がした。細胞を SOOrpmで 5分間遠心分離して集めた。細胞を上記培地に懸濁し、上記プラスチック製 フラスコに植え、上記培地で培養した。この操作を 4回繰返した。この操作に通常行う 上皮成長因子 (EGF)または血小板由来成長因子 (PDGF)のようなマイ卜ジェン添加はしな かった。
骨髄間質細胞のニューロン様細胞への分化は、次の工程で行った。まだコンフル エンシーに達していない骨髄間質細胞を上記プラスチック製フラスコ底から剥がし、 1 0 , 000細胞数ノ平方センチメートルの濃度で 0. 05ミリグラム/ミリリットルポリ一 D—リ ジン（SIGMA)でコートした 24穴の培地プレートの 1 0%胎児血清（FBS)、 1 00単位/ ミリリットルペニシリン、 1 00マイクログラム ミリリットルストレプトマイシンを加えた DM EM (低濃度グルコース）に植えた。このとき、前もって 4ミリグラムのシンパスタチンのプ ロドラッグを 1 00マイクロリットルのエタノールに溶かし、 0. I Nの NaOHを加え摂氏 50 度で 2時間反応させ、 HCLで pHを 7. 0に調整し、 4ミリグラムノミリリットルの濃度にし、 摂氏 4度で保存しておいた活性化シンパスタチンを 2. 5マイクロモル、 5マイクロモル、 1 0マイクロモル添加して 72時間培養した。通常添加する脳由来成長因子（BDNF)、グ リア由来神経栄養因子 (GDNE)および神経成長因子（NGF)などのニューロン成長因 子は一切加えなかった。
培養した細胞を 4%(wt/Vol)パラホルムアルデヒド固定 0. 1モルリン酸緩衝液 p H7. 4で 30分固定した。神経細胞特異的エノラーゼ（NSE)とニューロン特異的核抗原 (NeuN)染色のため、洗浄後、細胞を 0. 25%トリトン X— 1 00と 50/0正常のヒッジ血清 (PBSTS)を含有する PBSで 1 時間室温でブロックした。次に細胞を PBSTSで希釈し た第 1次抗体液中摂氏 4度で一 B免培養した。 PBSで 3回洗浄した後、室温でアビジン一 ピオチン複合体を 1時間室温で接触させた。 PBSで 3回洗浄した。 MAP2とタウ染色の ためには、洗浄後、細胞を 0. 25%トリトン X—1 00と 5%正常のヒッジ血清（PBSTS) を含有する PBSで 1 時間室温でブロックした。次に細胞を PBSTSで希釈した第 1次抗 体液中摂氏 4度で一晩培養した。 PBSで 3回洗浄した後、細胞を PBSTSで希釈した第 2次抗体液中摂氏 4度で 1時間暗所で培養した。洗浄後、細胞をグリセロール ZPBS ( 1 : 1 )で包埋し、蛍光顕微鏡で観察した。
第 1次抗体はラット NSEに対するゥサギモノクローナル抗体を 1 : 200、ラッ卜 Neu Nに対するマウスモノクローナル抗体を 1 : 200、 MAP2に対するマウスマウスモノクロ ーナル抗体を 5マイクログラム/ミリリットル、タウに対するゥサギモノクローナル抗体を 1 : 200に希釈して用いた。第 2次抗体はゥサギ IgGに対するビォチン化ヒッジ抗体を 1 0マイクログラムノミリリットル、ラット IgGに対するマウス IgGに対するビォチン化ゥマ抗 体を 1 0マイクログラ厶ノミリリットルに希釈して用いた。 MAP2はマウス Cy— 3に対す るヒッジ抗体（5マイクログラムノミリリットル）で可視化し、タウはゥサギ Cy2に対するヒ ッジ抗体で可視化した。
ラッ卜骨髄から得られた骨髄間質細胞を分離し、プラスチックプレート上増殖を 4回 繰返した。大きな平らな細胞と比較的引伸ばされた紡錘体状細胞の 2種類に分かれた。 これに対し、 0. 25マイクロモル、 5マイクロモルと 1 0マイクロモルの活性化したシンパ スタチンが接触した骨髄間質細胞は驚くべきことに 24時間後に形態を変化した。形態 変化した細胞は丸みを帯びた細胞体と屈折を示し、単純な 2極性の細胞や非常に枝分 かれした複雑な多極性の細胞等神経様細胞の性格を示し、シナプス様の形態形成も見 られた (第 1図)。 48時間後には神経様細胞のシナプス形態も明確になった (第 2図）。
活性化したシンパスタチンを接触させた神経細胞様の細胞を 24時間、 48時間、 7
2時間培養後に固定し、神経マ一カーの NSE用に染色した。シンパスタチンを接触させ なかった平板状の骨髄間質細胞は非常に低くしか染色されなかった。しかし、 NSEタン パク質のレベルは検知可能であった。これに対し、活性化したシンパスタチンを接触さ せた神経細胞様の細胞は NSEを顕著に発現させた。我々は次に NeuNの存在につい て調べた。シンパスタチンを接触させなかった平板状の骨髄間質細胞に NeuNが検出 できなかったのに対し、活性化したシンパスタチンを接触させた神経細胞様の細胞は N euNを発現した形態を示した。活性化したシンパスタチンを接触させた神経細胞様の細 胞は細胞体中に MAP2とタウを発現していた（第 3図と第 4図）。これに対し、シンバスタ チンを接触させなかった平板状の骨髄間質細胞は細胞体中に MAP2とタウを発現しな かった。
活性化シンノくスタチンを接触させたまま NES陽性、 NeuN陽性、 MAP2陽性、タウ 陽性の形態学的にも神経細胞様の細胞を培養続けた。細胞から樹状突起が複雑に伸 ぴ、周りの多くの細胞とシナプスを形成し、神経細胞が成長したことが確認された。した がって、シンパスタチン接触 24時間後に出現した神経様細胞は神経細胞そのものであ ることが確認された。非神経細胞から神経細胞へ 24時間以内に分化した報告は、本実 施例が初めてである。
実施例 2 · 実施例" Iにおいてシンパスタチンの代わりに、ァトルパスタチン、ィタパ スタチン、コンパクチン、ジヒドロコンパクチン、ダルパスタチン、ピタパスタチン、フルイン ドスタチン、フルパスタチン、ブラ/くスタチン、ベルパスタチン、ベロスタチン、メパスタチ ン、ロスバスタチン、口パスタチンを別々に用いて同様にラットの骨髄間質細胞をマイト ジェン処理無しに神経細胞に分化させ、その分化させた神経細胞を成熟させた。
実施例 3 . 実施例 1においてシンパスタチンの代わりに、アトルバスタチンとフル パスタチンの混合物を用いて同様にラッ卜の骨髄間質細胞をマイトジェン処理無しに神 経細胞に分化させ、その分化させた神経細胞を成熟させた。
実施例 4. インビポ分化：骨髄を 1 0週齢の雌 SDラッ卜の大腿骨と脛骨またはヒト 骨髄吸引物から得た。ヒト骨髄を、ダルベッコ修飾イーグル最少必須培地（DMEM) (低 濃度グルコース）（G旧 CO/BRL)および 1 0%胎児血清（FBS) ( HYCLONE)、 1 00 単位ノミリリットルペニシリン、 1 00マイクログラム/ミリリットルストレプトマイシン（SIG MA)で 1： 1に希釈し、密度勾配で、 5分間 800gで遠心分離した。上清および界面を合 せ、 1 0%胎児血清を含む MEM で約 20ミリリットルに希釈し、ポリエチレンィミンでコ一 卜されたプラスチック製フラスコにプレートした。ラット骨髄を、 1 0ミリリットル PBSおよび 5%アルブミンに入れた。細胞を、この培地中で洗浄し、 800rpmで 5分間遠心分離した。
細胞を、 2ミリモルグルタミン、 1 0%血清（FBS)、 1 00単位 ミリリットルベニシリ ン、 1 00マイクログラム ミリリットルストレプトマイシン（SIGMA)を加えた DMEM (低濃 度グルコース）からなる増殖培地中に再懸濁した。細胞を、フラスコ中で 1日間培養し、 非接着細胞を除去した。
その後、毎 3日間培養し、培地を交換した。培養物が、コンフルエンシーにほとんど 達した後、トリプシン (0. 25%)処理を行い、細胞を剥がした。細胞を SOOrpmで 5分間 遠心分離して集めた。細胞を上記培地に懸濁し、上記プラスチック製フラスコに植え、上 記培地で培養した。この操作を 4回繰返した。この操作に通常行う上皮成長因子 (EGF) または血小板由来成長因子 (PDGF)のようなマイトジェン添加はしなかった。
LXSN ベクター（CLONTEGH)を用いて発現マーカーとして緑蛍光タンパク質をコ一 ドし、ネオマイシン（G41 8)選択性マーカ一としてアミノグリコシドポスホトランスフェラ一 ゼをコードしたレトロウイルス性のプラスミドをつくった。カルシウムリン酸沈殿を用いて フェニックスアンホトロピックパッケェジした細胞（ATCC)に LXSN— GFPプラスミドを感 染させた。感染後 48時間後にウィルス性の上清を集め、穴の大きさが 0. 45—マイク ロメ一トルのフィルタ一で濾した。使うまで摂氏マイナス 80度で保存した。ウィルスを採 取した時にフェニックスアンホトロピックパッケェジした細胞の GFP の発現を解析して確 認した。
約 1 00， 000個の骨髄間質細胞を 20%加熱不活化した FCSを含む完全培地の 入った 21 . 0平方センチメートルのプレートに蒔き、一B免培養した。翌日 2. 5ミリリットル の 20%加熱不活化した FCSを含む完全培地中で該細胞を 500マイクロリットルのウイ ルス上清液と 8マイクログラム/ミリリットルのポリプレン（Sigma)と混合して感染させ た。ウィルス感染した日を第 1日とした。第 2日にウィルス感染操作を繰返した。第 3日 に培養液を 20%の非加熱 FBSを含む新しい完全培地と交換した。第 4日に細胞を 20 0マイクログラムノミリリットルの G41 8(Sigma)を含む完全培地の入った 55. 0平方セ ンチメートルのプレー卜に 1 : 3の割合で分け、 21日間選択した。 GFPプラスミドが遺伝 子に入り込んだ骨髄間質細胞を得た。この細胞の増殖を 3回繰返して増やした。
雄の SDラットに "I 37CSを 9. 0(900rads)の強度つで照射した。照射 24時間後に このラットの尾つぼの静脈に GFPプラスミドが遺伝子に入り込んだ骨髄間質細胞約 5， 0 00， 000個 1ミリリットルを注入した。骨髄間質細胞移植ラットを 8週間飼育した。
骨髄間質細胞移植ラットを 4%イソフルラン、 66%N20、 30%酸素の混合ガスで 麻酔し、 1 . 5%のイソフルラン、 68. 5%N20、 30%酸素の混合ガスで麻酔を維持し た。血圧、血液沖のガス分圧、血糖値を左の大腿骨動脈でモニターした。直腸温度、中 大脳動脈閉塞の反対側の側頭筋温度、を常時モニターして、加熱パッドで摂氏 37. 0— 37. 5度に維持した。 E. Zea— Longa等の方法に従い、縫合糸による管内中大脳動脈 閉塞によってラッ卜に虚血を起した。すなわち、左外頸動脈を 6— 0絹縫合糸で結び、遠 位を切開し、左内頸動脈を分離し、迷走神経から離した。左内頸動脈の頭蓋外枝をそ の枝分れの根元のところで、 6— 0絹縫合糸で結んだ。円形チップの付いた 3— 0外科 用単層ナイロン縫合糸を外頸動脈断片を通して左内頸動脈に導き、その頸動脈の枝分 れ部分より 20ミリメートル過ぎたところで、 90分間結び、その後直ぐ解いた。
縫合糸による閉塞による中大脳動脈閉塞を起したラッ M 0匹に対して、即日より殺 す日まで毎日 20ミリグラム /キログラムの割合でシンパスタチンを経口投与した。対照 として中大脳動脈閉塞を起した別のラッ卜 1 0匹に対してシンパスタチンを投与しなかつ た。
中大脳動脈閉塞後第 1， 3， 7 , 1 4日にこれらのラット 2匹ずつをキシラジン 1 0ミリ グラム Zキログラムとケタミン 80ミリグラム /キログラムで麻酔して殺した。直ちに、生 理的食塩水で還流し、続いて 4%ノ ラフオルムアルデヒドで還流した。脳組織を 2ミリメ 一トル間隔で 7等分の環状ブロックに切断した。前頭面で」各切断ブロックから 6マイクロ メートルの厚さの切片をつくり、実施例 1と同様に GFPと NeuNに対 る二重免疫標識し た。シンパスタチンを投与したラッ卜は中大脳動脈閉塞後第 3日に殺した群から GFPと N euNの二重陽性が認められ、日数に比例して二重陽性が強くなつた。
シンパスタチンを投与しなかったラットは中大脳動脈閉塞後 1 4日になっても GFPと
NeuNの二重陽性は確認できなかった。このことから、移植した骨髄間質細胞が脳血管 の関門を通って、脳内に浸潤し、シンパスタチンによって神経細胞へ分化したことが確 認された。
殺さなかったラットは 3ヶ月間シンパスタチンを投与した。対照ラットにシンバスタチ ンを投与しなかった。このラットについて高架式十字迷路試験を行った。高架式十字迷 路試験とは高架式の十字形の細長い平板の一方にラッ卜の餌を置き、他方の一つにラ ットを放すと、ラッ卜は最初は試行錯誤で十字路の一方の行き止まりまで行き、そこに餌 が無いことを知って、十字路にもどり、別の道を行《そうこうしているうちにラッ卜が餌の 置いてある端にたどりつく。もう一度実験をすると記憶力のあるラットは迷うことなぐ餌 がおいてある道を進み餌にありつく。しかし、記憶力の悪し、ラッ卜は 1回目と同様に試行 錯誤を繰返す。この試験によリラッ卜の記憶力が測定できる。シンパスタチンを投与しな かったラッ卜は餌にたどり着くまでに多くの時間を要し、記憶力が極度に低下していた。 これに対し、シンパスタチンを投与したラッ卜は餌にたどり着くまでの時間が短ぐある程 度の記憶力を回復しており、シンバスタチンにより再生した神経細胞は機能性があるこ とを示唆した。
実施例 5. 実施例 4においてシンパスタチンの代わりに、アトルバスタチン、イタバ スタチン、コンパクチン、ジヒドロコンパクチン、ダルパスタチン、ピタパスタチン、フルイン ドスタチン、フルパスタチン、ブラ/くスタチン、ベルパスタチン、ベロスタチン、メバスタチ ン、ロスパスタチン、口パスタチンを別々に投与して同様の操作をし、移植骨髄間質細 胞が人工的に脳虚血を起させたラッ卜の脳内で神経細胞へ分化させ、かつ 経細胞機 能的に再生させたことを確認した。
実施例 6. 実施例 4においてシンパスタチンの代わりに、ァトルパスタチンとフル パスタチンの混合物を投与して同様の操作をし、同様の効果を得た。
実施例 7 . アルツハイマー病に対する薬効評価。日本語で読み書きができ、自分 の意志を医者に伝えることが可能であるがアルツハイマー病の可能性ありという臨床診 断を受けている患者 8人で、プラノくスタチンナトリウム等 HMG— CoA還元酵素阻害剤 に過敏症の既往歴がなぐ腎機能と肝代謝が低下している疑いがなぐかつ妊娠または 妊娠している可能性のある人および授乳婦以外の人に対して、下記ミニメンタルステ一 ト試験を行う。なお、患者は重症度の指標が 25以下であることを確認し、重症度の指標 が 25以上の患者はいる場合は、重症度の指標が 25以下である患者と入れ替える。ま た、測定前 4ヶ月以内に治験薬を使用していた患者は除外する。また、シメチジン、プロ ブラノロ一ル等親油性 6遮断剤やクロ二ジン、抗コリン作動薬、および抗コリン活性を有 する抗うつ剤、神経弛緩剤、推定認識力増強物質および中枢神経刺激物質、または半 減期が長いべンゾジァゼピンは投与を禁止する。
ミニメンタルステート試験の内容:見当識（1 .今の年は？ 1点、季節は？ 1点、曜日 は？ 1点、日付は？ 1点、月は？ 1点、 2.私たちが今いる県の名前は？ 1点、郡の名前 は？ 1点、市/町の名前は？ 1点、階数は？ 1点、は？ 1点、住所ノ建物の名前は？ 1 点）、記銘カ（3 .医師が 3つの物の名前を書く秒かけて言う。医師が言った後で次に患 者に 3つ全部の名前を尋ねる。患者が 3つ全てを正しく言えるまで答えを繰返させる。 3 点）、注意と計算 (4. 1 00から続けて 7を引かせる。正しい答え 1つにつき 1点与える。 5 回答えたところで終える。 5点）、想起（5.質問 3で覚えた 3つの物の名前を尋ねる。正 しい答え 1つにつき 1点与える。 3点）、言語 ( 6.医師が鉛筆と時計を指す。患者に医師 が指した物の名前を言わせる。 2点、 7 .患者に「いいえ、もし、そして、しかし」と言わせ る。 1点、 8.患者に 3段階の命令を与え、それに従ってもらう。「右手で紙をつまみ上げ てください。紙を半分に折ってください。紙を机の上に置いてください。」3点、 9.患者に 次の指示を読ませ、それに従ってもらう。「目を閉じてください。 J 1点、 1 0.患者に自由 に 1つの文章を書いてもらう。文章には守護つと目的語 1つを含み、しかも意味をなして いる必要がある。
得点には書字の誤りは考慮しない。 1点、 1 1 . 1辺が約 5センチメートルの 2つの五 角形が 1頂点だけ重なった図形を見せ、患者に書き写させる。全ての角および角度が 保たれており、しかも交わった領域が四角形をなしていれば 1点をあたえる。 1点）、合 計 30点。
医師の管理下に被験者に市販の医療用ブラパスタチンナトリウム 1 0ミリグラム錠 を 1日 2回、 6ヶ月間投与する。 6力月後にミニメンタルステート試験を行う。ミニメンタル ステート試験によリブラパスタチンナトリウム投与による見当識、記銘力、注意と計算、 想起、言語の改善を確認できる。 産業上の利用可能性
本発明剤は、（1 )非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ 分化させ、および/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる 能力、ならびに（2)該作用により神経障害疾患を治療または悪性化抑制する能力を有 する。したがって、本発明剤を体外投与することによリ、移植拒絶反応を起す高分子と 癌化神経細胞の混入の恐れがない神経細胞をつくるために有用であり、また非神経細 胞または移植拒絶反応を起す高分子と癌化神経細胞の混入の恐れがない神経細胞を 体内に注入する前または注入した後、または注入と同時に、または注入せずに、本発 明剤を体内投与することにより、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脳腫瘍、小 脳変性症、交通性水頭症、ハンチントン病、前頭葉への照射、多発性硬化症、正常圧 水頭症、パーキンソン病、ピック病、進行性多巣膜炎、クロイツフェルト 'ヤコブ病、ゲル ストマン'シュ卜口イスラ一'シャインカ一病、 HIV関連疾患、神経梅毒、結核性および真 菌性髄膜炎、ウィルス性脳炎、無酸素症、 B1 2欠乏症、慢性的な薬物-アルコール-栄 養性乱用、葉酸欠乏症、副甲状腺機能亢進症に伴う高カルシウム血症、低血糖、甲状 腺機能低下症、肝性脳症、肺性脳症、尿毒素性脳症等の臓器系不全、ペラグラ等由来 の神経障害疾患の治療または悪性化抑制薬として有用である。
本発明の方法は、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ 分化させ、および Zまたは神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる 方法であり、該作用により神経障害疾患を治療または悪性化抑制することができる方 法である。したがって、本発明方法は移植拒絶反応を起す高分子と癌化神経細胞の混 入の恐れがない神経細胞をつくる方法として有用であり、また前述の神経障害疾患を 治療または悪性化抑制する方法として有用である。
本発明の神経細胞は移植拒絶反応を起す高分子と癌化神経細胞の混入の恐れ がない神経細胞である。したがって、自然に分化した神経細胞または自然に分化成熟し た神経細胞に限りなく、研究用または治療用として有用である。 本発明の探索方法は、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細 胞へ分化させ、および/または神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟さ せる能力を有する、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を探索する方法である。 これらの方法により有用な医薬品や試薬を創出する可能性があるので有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 要すれば非神経細胞または非神経細胞由来神経細胞を含有し、非神経細胞を細 胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および/または神経細 胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させる能力を有する、薬学的許容 範囲の毒性しかない低分子物質およびノまたはそのプロドラッグを有効成分とする ことを特徴とする分化および Zまたは成熟剤。
2. 低分子物質が 3—ヒドロキシー 3—メチルダルタリルー補酵素 A(HMG— CoA)還 元酵素阻害剤から選ばれる、請求の範囲 1 に記載の分化および/または成熟剤。
3. HMG— CoA還元酵素阻害剤がアトルパスタチン、イタパスタチン、コンパクチン、 シンパスタチン、ジヒドロコンパクチン、ダルパスタチン、ピタパスタチン、フルインド スタチン、フルパスタチン、プラバ'スタチン、ベルパスタチン、ベロスタチン、メパスタ チン、ロスバスタチン、ロノ スタチン、およびそれらの光学または幾何異性体、およ びそれらのプロドラッグ、ならびに上記化合物又はそれらのプロドラッグの薬学的に 許容することのできるそれらの塩ならびにそれらの水和物から選ばれる、請求の範 囲 2に記載の分化およびノまたは成熟剤。
4. HMG— CoA還元酵素阻害剤がアトルバスタチンカルシウム水和物、シンバスタチ ン、フルパスタチンナトリウム、ブラパスタチンナトイゥ厶から選ばれる、請求の範囲 2 に記載の分化および Zまたは成熟剤。
5. 非神経細胞が骨髄系非神経細胞と神経系非神経細胞から選ばれる、請求の範囲
1 から 4に記載の分化および/または成熟剤。
6. 骨髄系非神経細胞が骨髄幹細胞、間葉系細胞、骨髄間質細胞から選ばれる、請 求の範囲 5 に記載の分化および または成熟剤。
7. 神経系非神経細胞が神経幹細胞と神経前駆細胞から選ばれる、請求の範囲 5 に記載の分化および Zまたは成熟剤。
8. 請求の範囲 1 から 7 に記載の分化および Zまたは成熟剤により、非神経細胞 を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ分化させ、および Zまたは神 経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟させることを特徴とする、分化 および または成熟方法。
9. 請求の範囲 8 に記載の方法により得られる、移植拒絶反応を起す高分子と癌化 神経細胞の混入の恐れがない神経細胞またはそれと同質の神経細胞。
10. 要すれば活性後に、薬学的許容範囲の毒性しかない低分子物質を、細胞分裂誘 起物質で処理していない非神経細胞または神経細胞に接触させ、非神経細胞の神 経細胞への分化、および Zまたは神経細胞の成熟の有無を調べることを特徴とす る、請求の範囲 1 に記載の分化および または成熟剤を探索する方法。
11. 請求の範囲 1 から 7 に記載の分化および/または成熟剤を有効成分とし、要 すれば活性後に、非神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく神経細胞へ 分化させ、および Zまたは神経細胞を細胞分裂誘起物質で処理することなく成熟さ せることにより神経障害疾患を治療または悪性化抑制することを特徴とする、神経 障害疾患治療または悪性化抑制剤。
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