WO2004019983A1

WO2004019983A1 - 糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法、分解阻害方法および分解阻害剤

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Publication number: WO2004019983A1
Application number: PCT/JP2003/011046
Authority: WO
Inventors: Hirofumi Doi; Gen Kudo
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; Celestar Lexico Sciences Inc
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd; Celestar Lexico Sciences Inc
Priority date: 2002-08-30
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2004-03-11
Anticipated expiration: 2005-02-28
Also published as: CA2496745A1; AU2003261830A8; JPWO2004019983A1; AU2003261830A1; EP1541173A1; US20070004636A1

Abstract

ｍ−カルパインまたはμ−カルパインが、膵臓β細胞において糖代謝関連遺伝子の発現に関与する転写因子ネットワークを形成する、ヘパトサイトヌクレアーファクター４α（ＨＮＦ−４α）、ヘパトサイトヌクレアーファクター１α（ＨＮＦ−１α）およびインシュリンプロモーターファクター１（ＩＰＦ−１）を分解することを見出し、これら転写因子の分解方法；分解阻害方法；分解阻害剤；これらが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物産生促進剤および産生促進方法；これら転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および／または治療剤並びに防止方法および／または治療方法；カルパインによるこれら転写因子分解を阻害する化合物の同定方法；該同定方法で得られた化合物；さらにカルパイン、これら転写因子、これら転写因子をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる試薬キットを提供した。

Description

明細書糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法、分解阻害方法および分解阻害剤技術分野

本発明は、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法、分解剤、分解阻害方法および分解阻害剤に関する。より詳しくは、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 (h e p a t o c y t, e n u c l e a r f a c t o r 4 α、以 ">HNF -4 aと略称する。）、へパトサイトヌクレア一ファクター l a (h e p a t o c y t e n u c l e a r f a c t o r 1 a , 以下 HNF— 1 と略称する。）およぴィンシユリンプロモーターファクタ一 1 ( i n s u l i n p r o mo t e r f a c t o r 1、以下 I P F _ 1と略称する。）の分解方法、分解剤、分解阻害方法および分解阻害剤に関する。より具体的にはカルパイン，（c a 1 p a i n)、好ましくは m—カルパインまたは μ—カルパインを用いることを特徴とする HNF— 4 (¾、 HNF— 1 ひおょぴ I P F— 1の分解方法おょぴ分解剤に関する。また、カルパイン、好ましくは m—カルパインまたは μ—カルパインによる HNF— 4ひ、 HNF— 1 ひおよび I P F— 1の分解阻害方法および分解阻害剤に関する。さらに、 HNF— 4 α、 HN F— 1 ひおよび I P F— 1のうちの少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法および産生促進剤に関する。また、 HNF— 4 ひ、 HNF— 1 aおよび I P F— 1のうちの少なくとも 1つの分解に起因する疾患、例えば糖尿病の防止方法および Ζまたは治療方法並びに防止剤および Ζまたは治療剤に関する。さらに、 HNF— 4 α、 HNF- 1 αおよび I P F— 1のカルパインによる分解を阻害する化合物の同定方法おょぴ該同定方法により同定された化合物に関する。また、カルパイン、 HNF— 4 ひ、 HNF— l a、 I P F— 1、これらのいずれかをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含んでなる試薬キットに関する。背景技術

カルパイン (EC 3. 4. 22. 1 7) は、カルシウム依存性システィンプ口テアーゼであり、蛋白質を限定的に切断してその構造や機能を変化させる酵素である。カルパインには、構造的特徴、組織局在およびカルシウム要求性などによって分類される多くのアイソザィムが知られており、これらからなるスーパーファミリーを構成している。 .

m—カルパインは、カルパインスーパーファミリーの 1つであり、カルパイン 2とも呼ばれ、多くの組織で発現している（非特許文献 1)。 m—カルパインは 1 mM程度のカルシウム濃度で活性化され、酵素活性を発現する。

μ—カルパインは、カルパイン 1 とも呼ばれ、 m—カルパインと同様に多くの組織で発現している（非特許文献 1および 2)。 μ—カルパインは、 m—カルパインと比較してカルシウム要求性が低く、数十 M程度のカルシウム濃度で活性化され、その酵素活性を発現する。

m—カルパインおよび μ—カルパインにより分解される蛋白質としては、 ρ 5 3ゃレチノィド Xレセプター（RXR)など多くの転写因子が報告されている（非特許文献 3〜5)。カルパインにより分解される蛋白質には、カルパインによって優先的に切断されるアミノ酸モチーフが存在する（非特許文献 6)。例えば、ロイシン残基（L e u) またはバリン残基（V a 1 ) などの疎水性アミノ酸残基に続く、チロシン残基（Ty r )、メチォニン残基（Me t) またはアルギニン残基（A r g) とそれに続くアミノ酸残基との間で切断される。現在、いくつかのカルパィン阻害剤が市販されているが、このような切断モチーフを含むアミノ酸配列からなるぺプチド N— A c e t y 1一 L e u— L e u— M e t _CH〇が m—カルパインの競合阻害剤として知られている（CALB I OCHEM社、非特許文献 7)。また N— A c e t y l—L e u— L e u— N l e— CHOは、 β—力ノレパインの競合阻害剤として知られている（CAL B I OCHEM社、非特許文献 8)。その他、不可逆的カルパイン阻害剤である Ζ— L e u-L e u-Ty r -CH₂ F (非特許文献 9)、 Mu-Va 1 -HP h -CH₂F (非特許文献 1 0 ) および L e u— L e u— P r o—クロロメチノレケトン (Ch l o r ome t h y l k e t o n e) (非特許文献 1 1)、可逆的カルパイン阻害剤である 4一フルオロフェニノレスノレホニノレ (F l u o r o p h e n y l s u l f o n y l ) — V a 1— L e u—CHO (非特許文献 1 2) などが市販されている（CALB I OCHEM 社 )。

カルパインは細胞機能の調節に関与しているため、カルパインの活性制御の不全やその遺伝子の欠損などにより種々の疾患が引き起こされる。例えば、いくつかの糖尿病モデル動物では組織のカルパイン活性が亢進している（非特許文献 1 3および 14)。カルパイン阻害剤により膝島におけるグルコースに対するインシュリン分泌応答が増強されたことから、インシュリンの分泌と作用の調節への力ルパインの関与が示唆されている（非特許文献 1 5)。また、カルパイン 1 0遺伝子の変異と 2型糖尿病罹患率との間の関連性が指摘されている（非特許文献 1 6 および 1 7)。

m—カルパインおよび 2—カルパインについては、外傷性脳損傷、ァルツハイマー病、脳卒中および白内障に関与していることが示唆されている（非特許文献 2)。

一方、 HNF— 4 a、 HNF— 1 αおよび I P F— 1はいずれも転写因子としての機能を有し、種々の遺伝子のプロモーターまたはェンハンサ一に結合し、当該遺伝子の転写を活性化することが知られている。これらは例えば、膝臓の )8細胞において転写因子ネットワークを形成し（非特許文献 1 8)、グルコーストランスポーター 2 (以下 GLUT 2と略称することもある。）、インシュリンおよぴグルコキナーゼなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御すると考えられる。

HNF— 4 は核内レセプターであり、腾臓の j3細胞、肝臓、腎臓および小腸で発現し、コレステロール、脂肪酸およびグルコースなどの代謝や肝臓の発生および分化に関与する物質をコードする種々の遺伝子の転写因子であることが知られている。 HNF— 4 α:は、膝臓の j8細胞における上記転写因子ネットワークにおいて、特に HNF _ 1 αのポジティブレギュレーターとして機能し、インシュリン、 GLUT 2およびダルコキナーゼなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御する（非特許文献 1 8〜2 3)。従来、 HNF— 4 _αのインシュリン遺伝子発現.に対する作用は、 HNF— 1 aレベルの上昇を介した間接的なものであると考えられてきた。しかし、 HNF_4 o;力インシュリン遺伝子プロモーター内で新規に見出されたシスエレメント（c i s e l e m e n t) に結合し、直接的にその発現を調節することが報告された（非特許文献 24)。

HNF— 4 α遺伝子については、遺伝性 2型糖尿病 MOD Υ 1 (M a t u r i t y— o n s e t d i a b e t e s o f t h e y o u n g 1 )の原因這伝子であることが明らかにされている（非特許文献 2 5および 2 6)。

さらに、 HNF— 4 ひ結合部位に自然変異を有するヒト遺伝子が、今までに複数同定されている。プロモーター内の HNF— 4 ひ結合部位に変異を有する変異体が見出されている遺伝子の 1つは、上述の HNF— 1 ひをコードする遺伝子である。 HNF— 1 αプロモーターにおける HNF— 4 α結合部位の変異により Η NF— 4 ひがプロモーターに結合せず、その結果 HNF— 1 αの発現が低減し、遺伝性 2型糖尿 >病 MOD Υ 3が惹起される（非特許文献 2 7)。

かかる遺伝子としてはその他に、血液凝固に関与する因子である第 V I I因子および第 I X因子をそれぞれコードする遺伝子が挙げられる。第 I X因子遺伝子のプロモーターにおける HNF— 4 α結合部位の変異は血友病の原因となる（非特許文献 2 8および 2 9)。また、第 V I I因子遺伝子のプロモーターにおける Η NF-4 α結合部位の変異は重症第 V I I因子欠損症（s e v e r e f a c t o r V I I d e f i c i e n c y) の患者で認められている（非特許文献 3 0)。

HNF - 1 ひはトランスクリプションファクター 1 (TCF— 1 )とも呼ばれ、膝臓の j3細胞、肝臓および腎臓などで発現し、多くの肝特異的遺伝子、例えばァルブミン、フイブリノーゲンや α 1アンチトリプシンなどの遺伝子発現を調節していることが知られている。 HNF— Ι αは、膝臓の jS細胞における上記転写因子ネットワークにおいて、 I P F— 1や HNF— 4 ひの転写を制御している（非特許文献 2 1)。また、 HNF— 1 αが、 GLUT 2およびインシュリンなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御していることを示唆するデータが開示されている (非特許文献 2 2)。例えば、 HNF— 1 αは GLUT 2遺伝子のプロモーター領域に結合してその転写活性を亢進した（非特許文献 2 2)。また、 HNF— 1 ひはィンシュリン遺伝子のプロモーターの A 3領域に結合してその転写活性を亢進した（非特許文献 3 1)。その他、ドミナントネガティブ体の HNF— 1 が滕臓細胞株でインシュリン分泌を低下させたことが報告されている（非特許文献 3 2)。

HNF— 1 ひ遺伝子については、遺伝性 2型糖尿病 MOD Υ 3 (M a t u r i t y— o n s e t d i a b e t e s o f t h e y o u n g 3) の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献 3 3)。

HNF— 1 ctはまた、肝細胞腺腫（ l i v e r a d e n o m a ) との関連も指摘されている。例えば、ァミノ変異による HNF_ 1 αの不活性化が肝細胞腺腫の原因となることが示された（非特許文献 3 4)。また、 HNF— 1 αのノックアウトマウスにおいて肝細胞の異常増殖による著しい肝肥大が認められた（非特許文献 3 5)。肝細胞腺腫は肝細胞癌（h e p a t o c e l l u l a r c a r e i n o ma) へ形質転換する危険性を有する腫瘍なので、. HNF— 1 _αの不活性化は肝細胞腺腫、ひいては肝細胞癌を誘発すると考えられる。

I P F - 1はパンクレアス ·デュオディナムホメオボックス 1 (P a n c r e a s /d u o d e n um h o m e o b o 1 ; P D X— 1 )などとも呼ばれ、睥臓の i3細胞および δ細胞で発現している。 HNF— 4 aのプロモーター領域 Ρ 2には I P F— 1結合部位が存在し、その変異が糖尿病の発症と相関することが報告されている（非特許文献 3 6)。また、 1卩 _ 1が01^17丁 2 (非特許文献 3 7)、インシュリン（非特許文献 3 8)、およびダルコキナーゼ（非特許文献 3 9 ) などの糖代謝関連遺伝子の発現を制御していることを示唆するデータが開示されている。 GLUT 2遺伝子には I P F— 1が直接作用してその発現に関与する（非特許文献 3 7)。 I P F— 1遺伝子については、遺伝性 2型糖尿病 MOD Y 4 (M a t u r i t y— o n s e t d i a b e t e s o f t h e y o u n g 4) の原因伝子であることが明らかにされている（非特許文献 40)。

以下に、本明細書で引用した文献を列記する。

特許文献 1 ：国際公開第 WO 01Z6 7 29 9号パンフレット。

非特許文献 1 ：反町洋之、「生化学」 20 00年、第 72卷、第 1 1号、 p. 1 297— 1 3 1 5。

非特許文献 2 : Hu a n g, Y. e t a 1. , 「 TREND S i n Mo 1 e c u l a r Me d i c i n e」 200 1年，第 7卷， p. 355— 3 6 2。非特許文献 3 ： Ma t s u s i ma -N i s h i wa k i , R. e t a 1. , 「 B i o c h em i c a l a n d B i o p h y s i c a l R e s e a r c h C ommu n i c a t i o n s」 1 9 96年，第 22 5卷， p. 946— 9 5 1 o '

非特許文献 4 : P a r i a t, M., e t a l .，「Mo l e c u l a r a n d C e l l u l a r B i o l o g y」 1 9 9 7年，第 1 7卷， p . 2 806 一 28 1 5。

非特許文献 5 :Wa t t F. e t a l .,「Nu c l e i c Ac i d s R e s e a r c hj 1 9 93年，第 2 1卷， p. 50 92— 5 1 00。

非特許文献 6 : S a s a k i , T. e t a l .，「 J o u r n a l o f B i o l o g i c a l Ch em i s t r y」 1 9 84年，第 259巻， p. 1 2 489 - 1 2494。

非特許文献 7 : R a v i d， T. e t a l .，「 J o u r n a l o f B i o l o g i c a l Ch em i s t r y」 2000年，第 275卷， p. 358 40— 3 5 847。

非特許文献 8 : D e b i a s i， R. L. e t a l .，「 J o u r n a l o f V i r o l o g y」 1 9 9 9年，第 7 3巻， p. 6 9 5— 701。

非特許文献 9 : Du t t , P. e t a 1., 「FEB S L e t t e r」 1 9 98年，第 436卷， p. 36 7— 3 7 1。

非特許文献 1 0 : E s s e r， R. E. e t a l .，「 A r t h r i t i s a n d Rh e uma t i s m」 1 9 94年，第 3 7巻， p. 236— 247。非特許文献 l l : S a s a k i , T. e t a l ., 「 J o u r n a l o f B i o c h em i s t r yj 1 98 6年，第 9 9卷， p. 1 73— 1 79。

非特許文献 1 2 ： N a t h , R. e t a 1. , 「 B i o c h em i c a l a n d B i o p h y s i c a l R e s e a r c h C ommu n i c a t i o n s」 200 0年，第 274卷， p. 1 6— 2 1。

非特許文献 1 3 : B r o o k s , B. A. e t a l ., 「 Ame r i c a n J o u r n a l o f P h y s i o 1 o g y」 1 98 3年，第 244卷，第 3号， p . C 1 75 _ 1 8 1。

非特許文献 14 : Ko b a y a s h i， S . e t a 1. , 「En d o c r i n o l o g i a J a p o n i c a」 1 98 9年，第 36卷，第 6号， p. 8 3 3 一 844。

非特許文献 1 5 : S r e ema n, S . K. e t a 1. , 「D i a b e t s」 200 1年，第 5 0卷， p. 20 1 3— 20 20。

非特許文献 1 6 : Ho r i k a w a, Y. e t a l .，「N a t u r e G e n e t i c s」 2000年，第 26巻， p. 1 6 3— 1 75。

非特許文献 1 7 : B a i e r , L. J . e t a l .，「 J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n」 2000年，第 1 0 6巻， p. R 6 9— 73。

非特許文献 1 8 ： S h i h, D. Q. e t a 1. , 「 P r o c e e d i n g s o f Th e N a t i o n a l A c a d e my o f S c i e n c e s o f Th e Un i t e d S t a t e s o f Ame r i c a」 200 1 年，第 98巻， p . 14 1 89— 141 9 1。

非特許文献 1 9 :「B I O C l i n i c a」 2002年，第 1 7卷， p. 4 1 0— 4 14。非特許文献 20 : S t o f f e l , M. e t a l .，「 P r o c e e d i n g s o f Th e N a t i o n a l Ac a d emy o f s c i e n c e s o f Th e Un i t e d S t a t e s o f Ame r i c a」 1 9 9 7年，第 94巻， p . 1 320 9— 1 3 214。

非特許文献 2 1 ： S h i h, D. Q. e t a 1. , 「D i a b e t e s」 20 01年，第 50巻， p. 247 2— 2480。

非特許文献 22 ： B a n, N. e t a l .，「D i a b e t e sj 2002年' 第 5 1巻， p. 140 9— 14 1 8。

非特許文献 23 : C a h， J . Y. e t a 1. , 「 E x p e r i me n t a l a n d Mo l e c u l a r Me d i c i n e」 200 1年，第 3 3卷，第 2 号， . 5 9— 6 3。

非特許文献 24 ： B a r t o o v-S h i f ma n, R. e t a 1. , 「J o u r n a 1 o f B i o l o g i c a l Ch em i s t r yj 2002年，第 2 77卷，第 29号， ρ· 2 5 9 1 4— 259 1 9。

非特許文献 25 : Ry f f e l , G. U. e t a l .，「 J o u r n a l o f Mo l e c u l a r En d o c r i n o l o g y」 200 1年，第 27卷， p . 1 1— 29。

非特許文献 26 ：「臨床病理」 2001年、第 49巻、第 2号、 p. 1 6 1— 1 64。

非特許文献 27 ： G r a g n o l i , C . e t a 1. , 「D i a b e t e s」 1 9 9 7年，第 46巻， p. 1 648— 1 65 1。

非特許文献 28 : S l a d e k, F. M. e t a l ., 「 I n Nu c 1 e a r R e c e p t o r s a n d G e n e t i c D i s e a s e」 200 1 年， p. 309 - 3 6 1 E d s . T B Bu r r i s & ERB M c C a b e, S a n D i e g o ; A c a d em i c P r e s s。

非特許文献 29 : Ma r l e n e, J . R. e t a 1. , 「P r o c e e d i n g s o f Th e Na t i o n a l Ac a d emy o f S c i e n c e s o f Th e Un i t e d S t a t e s o f Ame r i c a」 1 9 92年，第 8 9卷， p. 6 300— 6 30 3。

非特許文献 30 ： C a r e w, J . A. e t a 1. , 「B LOOD」 2000 年，第 1 5卷， p. 43 70— 43 72。

非特許文献 3 l : Ok i t a, K. e t a l .，「： B i o c h em i c a l B i o p h y s i c a l R e s e a r c h c ommu n i c a t i o n s」 1 9 9 9年，第 26 3卷， p. 56 6— 5 6 9。

非特許文献 32 ： Wa n g, H. e t a l ., 「EMB O J o u r n a 1」 1 9 9 8年，第 1 7卷，第 22号， p. 6 70 1— 6 7 1 3。

非特許文献 3 3 : Y ama g a t a， K. e t a 1. , 「N a t u r e」 1 9 9 6年，第 384巻， ρ· 45 5— 45 7。

非特許文献 34 : B l u t e a u, 〇. e t a 1. , 「 N a t u r e g e n e t i c s」 2002年，第 3 2卷， p . 3 1 2— 3 1 5。

非特許文献 35 : P o n t o g l i o， M. e t a l ., 「C e l l」 1 9 9 6年，第 84卷， ρ· 5 75— 5 8 5。

非特許文献 36 ： Th oma s , H. e t a 1. , 「： Huma n Mo l e c u l a r G e n e t i c s」 200 1年，第 1 0巻，第 1 9号， p. 208 9 _ 20 9 7。

非特許文献 37 : Wa e b e r , G. e t a l ., 「Mo l e c u l a r E n d o c r i n o l o g y」 1 9 96年，第 1 0卷， ρ · 1 32 7— 1 3 34。非特許文献 38 : Oh l s s o n, H. e t a l ., 「EMB〇 J o u r n a l」 1 9 9 3年，第 1 2卷， p . 42 5 1—42 5 9。

非特許文献 39 : Wa t a d a， H. e t a 1. , 「D i a b e t e s」 1 9 9 6年，第 45卷， p. 14 78— 1 488。

非特許文献 40 : S t o f f e r s , D. A. e t a l .，「N a t u r e g e n e t i c s」 1 9 9 7年，第 1 7卷， p. 1 3 8— 14 1。

非特許文献 41 ： U 1 me r , K. M. 「S c i e n c e」 1 9 83年，第 2 1 9卷， p . 6 6 6— 6 7 1。

非特許文献 4 2 ：「ペプチド合成」（日本国）、丸善株式会社、 1 9 7 5年。非特許文献 4 3 ：「ぺプチド合成（P e p t i d e S y n t h e s i s)」（米国）、インターサイエンス、 1 9 9 6年。

非特許文献 4 4 ： B j o r k l u n d , A. e t a 1 . , 「D i a b e t e s」 2 0 0 0年，第 4 9卷， p . 1 8 4 0— 1 8 4 8。

非特許文献 4 5 ： Ma r u y a m a , K. e t a 1 . , 「 I n t e r n a t i o n a 1 J o u r n a l o f Mo l e c u l a r M e d i c i n e」 2 0 0 0牟，第 5卷， p . 2 6 9— 2 7 3。発明の開示

本発明においては、カルパインと相互作用する蛋白質を見出し、カルパインによる当該蛋白質の分解に起因する疾患の防止手段および/または治療手段を提供すべく種々の検討を重ねた。その結果、カルパインが転写因子の 1つである HN F - 4 αと相互作用することをインシリコで予測し、さらにカルパインによる Η NF— 4 ひの分解を実験的に証明した。さらに、 HNF— 4 ひと滕臓細胞において転写因子ネットワークを形成する HNF _ 1 αおよび I P F— 1がカルパインにより分解されることを見出して、本発明を完成した。

すなわち本発明の一態様は、カルシウムの存在下、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法に関する。

また本発明の一態様は、カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の転写因子分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法に関する。

さらに本発明の一態様は、カルシウムの存在下、 m—カルパインおよび/または μ—カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法に関する。さらにまた本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレアーファクター 4 a , へパトサイトヌクレアーファクター 1 αおよびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、前記いずれかの分解方法に関する。

また本発明の一態様は、カルシウムの存在下、 m—カルパインおよび/または μ—カルパインとへパトサイトヌクレアーファクタ一 4 a ( H N F - 4 a ) を共存させることを特徴とする、 H N F— 4 ひの分解方法に関する。

さらに本発明の一態様は、カルシウムの存在下、 m—カルパインおよび/または μ—カルパインとへパトサイトヌクレア一ファクター 1 ( H N F - 1 a ) を共存させることを特徴とする、 H N F— 1 αの分解方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルシウムの存在下、 m—カルパインおよび Ζ または μ一カルパインとインシュリンプロモーターファクター 1 ( I P F— 1 ) を共存させることを特徴とする、 I P F— 1の分解方法に関する。

また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらに本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

また本発明の一態様は、少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを含む生体外試料をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらに本発明の一態様は、少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを発現している細胞をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。さらにまた本発明の一態様は、細胞が哺乳動物に担持されている細胞である前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

また本発明の一態様は、哺乳動物に担持されている細胞が腾臓 ]3細胞である前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらに本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインィンヒビターから選ばれる 1つ以上の物質である前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパインインヒビターが、 N— Ac e t y 1 —L e u—； L e u— Me t— CH〇、 N— A c e t y 1一 L e u— L e u_N l e _CHO、 Z_L e u— L e u— Ty r— CH₂F、 M u - V a 1— HP h— CH₂ F、 4ーフノレ才ロフエニノレスノレホニノレ (F l u o r o p h e n y l s u l f o n y l ) — V a 1— L e u— CH〇、 L e u— L e u— P h e— C H ₂ C 1 または Z— V a 1 -P h e— CH〇である前記代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むぺプチドである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらに本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号 1から 3のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの連続する 3つ以上のアミノ酸残基からなり、且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むペプチドである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位が L e u_Ty r、 L e u—Me t、 L e u— Ar g、 Va l— Ty r, V a 1—Me tおよび Va 1— Ar gからなる群より選ばれるものである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

また本発明の一態様は、カルパインが m—カルパインおよび Zまたは μ—カルパインである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレアーファクター 4 α、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、 m _カルパインおよび Zまたは i—カルパインの活性を阻害することを特徴とするへパトサイトヌクレアーファクター 4 ctの分解阻害方法に関する。

また本発明の一態様は、 m—カルパインおよび/または ^—カルパインの活性を阻害することを特徴とするへパトサイトヌクレアーファクター 1 ο;の分解阻害方法に関する。

さらに本発明の一態様は、 m—カルパインおよび Zまたは^一カルパインの活性を阻害することを特徴とするィンシュリンプロモーターファクター 1の分解阻害方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパインを活性成分として有効量含んでなる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤に関する。

また本発明の一態様は、カルパインが m—カルパインおよび Zまたは μ—カルパインである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤に関する。

さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレア一ファクタ一 4 a、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよぴインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、 m—カルパインおよび Ζまたは —カルパインを活性成分として有効量含んでなるへパトサイトヌクレアーファクター 4 の分解剤に関する。また本発明の一態様は、 m—カルパインおよび Zまたは/ z—カルパインを活性成分として有効量含んでなるへパトサイトヌクレア一ファクター 1 αの分解剤に関する。

さらに本発明の一態様は、 m—カルパインおよび/または μ—カルパインを活性成分として有効量含んでなるィンシュリンプロモーターファクター 1の分解剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。

また本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。さらに本発明の一態様は、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。さらにまた本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質を活性成分として有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。

また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインインヒビターから選ばれる 1つ以上の物質である前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。

さらに本発明の一態様は、カルパインインヒビターが、 Ν— Ac e t y l— L e u— L e u— M e t— CHO、 N— Ac e t y 1— L e u— L e u— N l e— CHO、 Z— L e u— L e u— Ty r— CH₂F、 Mu - V a 1 -HP h -CH₂ F、 4ーフノレオ口フエニノレスノレホニノレ (F l u o r o p h e n y l s u l f o n y 1 ) - V a 1 -L e u-CHO, L e u— L e u— P h e— C H ₂ C 1または Z -V a 1 -P h e— CHOである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むぺプチドである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤に関する。また本発明の一態様は、カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号 1力ら 3のいずれかに記載のアミノ酸配列のうちの連続する 3つ以上のアミノ酸残基からなり且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのァミノ酸配列を含むぺプチドである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。

さらに本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位が L e u— T y r、 L e u— Me t、 L e u— A r g、 V a l — T y r、 V a 1 -Me tおよび V a l —A r gからなる群より選ばれるものである前記糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパインが m—カルパインおよび Zまたは μ 一カルパインである前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤に関する。

また本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌタレァーファクター 4 a、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよびインシユリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、前記いずれかの分解阻害剤に関する。

さらに本発明の一態様は、 m—カルパインおよび Zまたは μ—カルパインの活性を阻害することを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 a分解阻害剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、 m—カルパインおよび Ζまたは μ—カルパインの活性を阻害することを特徴とする、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 ひ分解阻害剤に関する。

また本発明の一態様は、 m—カルパインおよび Zまたは μ—カルパインの活性を阻害することを特徴とする、インシュリンプロモーターファクター 1分解阻害剤に関する。

さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子をカルパインを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパインが m—カルパインおよび/または^ 一カルパインである前記糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。また本発明の一態様は、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 _α、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよぴィンシユリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの転写因子を m—カルパインおよび Zまたは μ—カルパィンを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。

さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子がィンシュリン遺伝子またはダルコーストランスポーター 2遺伝子である前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法に関する。

.さらにまた本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。

また本発明の一態様は、カルパインが m—カルパインおよび Zまたは一カルパインである前記糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。

さらに本発明の一態様は、 m—カルパインおよび/または μ—カルパインによるへパトサイトヌクレアーファクター 4 a、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよびインシユリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子がィンシュリン遺伝子またはグルコーストランスポーター 2遺伝子である前記いずれかの糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。

また本発明の一態様は、カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法に関する'。さらに本発明の一態様は、カルシウム濃度によりへパトサイトヌクレアーファクタ一 4 a , へパトサイトヌクレア一ファクター 1 およびィンシユリンプロモ一ターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 α、へパトサイ 1、ヌクレアーファクター 1 αおよびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関する。

さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および/またはグルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法および/または治療方法に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレア一ファクター 4、へパトサイトヌクレアーフアクター 1 αおよびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解に起因する疾患の防止方法および Ζまたは治療方法に関する。さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および/または治療方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 a、へパトサイトヌクレアーファクター 1 およびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子おょぴ Zまたはグルコーストランスポーター 2 遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および/または治療方法に関する。

さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 α、へパトサイトヌクレアーフ了クタ一 1 αおよびィンシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関するさらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および Ζまたはグルコーストランスポーター 2 遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糠代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法および Ζまたは治療方法に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 α、へパトサイトヌクレアーファクタ一 1 αおよびィンシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解に起因する疾患の防止方法および/または治療方法に関する。さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および/または治療方法に関する。さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 α、へパトサイトヌクレァーファクター 1 αおよびィンシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法およひンまたは治療方法に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および/またはグルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法およぴ Ζまたは治療方法に関する。

さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および/または治療方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進剤に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、へパトサイトヌクレアーファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレアーファタタ一 1 αおよびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1 つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤に関する。

さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、インジユリン遺伝子および/またはグルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および Ζまたは治療剤に関する。

さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、へパトサイトヌクレアーファクター 4 α、へパトサイトヌクレアーファタター 1 αおよびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解に起因する疾患の防止剤およびまたは治療剤に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および /または治療剤に関する。

また本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、へパトサイトヌクレアーファクター 4 a、へパトサイトヌクレア一ファクタ一 1 ひおよびィンシユリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1 つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および/または治療剤に関する。

さらに本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ィンシュリン遺伝子および/またはグルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤に関する。さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖尿病の防止剤および/または治療剤に関する。

また本発明の一態様は、前記分解阻害方法を用いることを特徴とする、肝細胞：腺腫または肝細胞癌の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

さらに本発明の一態様は、前記分解阻害剤を用いることを特徴とする、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止方法および Zまたは治療方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記分解阻害剤を有効量含んでなる、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止剤およぴ /または治療剤に関する。

また本発明の一態様は、カルパインによる糠代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインによる該転写因子切断を可能にする条件下、カルパインおよび Zまたは該転写因子と被検化合物を接触させ、力ルパインによる該転写因子の分解を検出するシグナルおよび/またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび/またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。

さらに本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインによる該転写因子の切断を可能にする条件下、カルパインおよび/または該転写因子と被検化合物を接触させ、該転写因子量または該転写因子分解物量を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび/またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。さらにまた本発明の一態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインと該転写因子の結合を可能にする条件下、カルパインおよび Zまたは該転写因子と被検化合物を接触させ、カルパインと該転写因子の結合を検出するシグナルおよぴ Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび/またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインと該転写因子の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法に関する。

また本発明の一態様は、カルパインが、 m—カルパインまたは^一カルパインである前記いずれかの同定方法に関する。

さらに本発明の一態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレアーファクタ一 4 α、へパトサイトヌクレアーファクター 1 ひおょぴィンシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つである前記いずれかの同定方法に関する。

さらにまた本発明の一態様は、前記いずれかの同定方法で同定された化合物に関する。

また本発明の一態様は、カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つと、カルパインにより分解される糖代謝関連遺伝子の転写因子、該転写因子をコードするポリヌクレオチドおよぴ該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つとを含んでなる試薬キットに関する。

さらに本発明の一態様は、カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つ、並びにへパトサイトヌクレア一ファクター 4 α、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよびインシュリンプロモーターファクタ一 1およびこれらいずれかをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つを含んでなる試薬キットに関する。

さらにまた本発明の一態様は、カルパインが、 m—カルパインまたは/ 一カルパインである前記試薬キットに関する。図面の簡単な説明

第 1図は m—カルパインまたは μ—カルパインによる H N F— 4 a (配列番号 1 ) の切断認識部位を示す。ァミノ酸配列は 1文字表記し、切断認識部位は下線で示した。

第 2図は m—カルパインまたは μ—カルパインによる H N F— 1 a (配列番号 2 ) の切断認識部位を示す。アミノ酸配列は 1文字表記し、切断認識部位は下線で示した。

第 3図は m—カルパインまたは μ—カルパインによる I P F— 1 (配列番号 3 ) の切断認識部位を示す。ァミノ酸配列は 1文字表記し、切断認識部位は下線で示した。

第 4図は m—カルパインと H N F— 4 αの相互作用をィンシリコで予測した結果を示す。第 4図 Αはヒト m—カルパインとヒト H N F— 4 ひ（配列番号 1 ) とのローカルァライメントの結果、高いスコアを示した領域を表示した。第 4図 B はゥサギ m—カルパインとヒト H N F— 4 α (配列番号 1 ) とのローカルァライメントの結果、高いスコアを示した領域を表示した。アミノ酸配列は 1文字表記した。

第 5図はゥサギ m—カルパインがインビトロでヒト HNF— 4 aをカルシウム存在下で分解したことを説明する。第 5図 Aおよび第 5図 Bはそれぞれ、抗 HN F— 4 α抗体および抗 X p r e s s抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す。図中の +および一は各組成の有無を示す。矢頭は HNF— 4 αのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 6図はヒト m—カルパインとヒト HNF— 4 αが細胞内で結合したことを説明する。レーン 1は m—カルパイン（F LAG— t a g付加）と HNF— 4 α (X p r e s s - t a g付加）を共発現させた細胞試料、レーン 2は m—カルパイン (F LAG— t a g付加）のみを発現させた細胞試料である。第 6図 Aおよび第 6図 Bはそれぞれ、抗 F LAG M2抗体おょぴ抗 X p r e s s抗体を用いたゥエスタンブロッテイング（B l o t ) の結果を示す。図中、 I Pは抗 HNF— 4 α抗体を用いて免疫沈降を行なったことを、 1 y s a t eは免疫沈降していない細胞試料を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。第 7図はヒト m—カルパインがインビトロでヒト HNF— 4 aをカルシウム存在下で分解したことを説明する。ヒト m—カルパインとカルパインスモールサブュニット 1とを共発現させた昆虫細胞のライセートをヒト m—カルパインとして用いた。陰性対照としてカルパイン非発現の昆虫細胞ライセートおよびライセート無添加試料（図中では対照と表示。）を用い、陽性対照としてラット m—力ルパインを用いた。図中の +および一はカルシウムの有無を示している。図は抗 HN F— 4 α抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果であり、矢頭は HNF— 4 aのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。第 8図はヒト μ一カルパインがインビトロでヒト HNF— 4 αをカルシウム存在下で分解したことを説明する。図中の +および一はカルシウムの有無を示している。陽性対照としてゥサギ m—カルパインおよびラット m—カルパインを用いた。図は抗 HNF— 4 α抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果であり、矢頭は HNF— 4 αのパンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 9図はィオノフォアの添加により細胞内で HNF— 4 αが分解されたことを説明する。第 9図 Αおよぴ第 9図 Βはそれぞれ、核画分および細胞質画分における HNF— 4 αの分解を示す。図は抗 HNF— 4 抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果であり、矢頭は HNF— 4 ひの分解物のバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 1 0図はヒト μ一カルパイン、ゥサギ m—カルパインおよぴラット m—カルパインが、インビトロでヒト HNF— 1 αをカルシウム存在下で分解したことを説明する。対照は、カルパイン無添加の試料を表わす。図中の +および一はカルシゥムの有無を示している。上図および下図はそれぞれ、抗 Omn i ZM2 1抗体および抗 HNF— 1 α抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果であり、矢頭は HNF— 1 αのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 1 1図はヒト m—カルパインがィンビトロでヒト HNF— 1 aをカルシウム存在下で分解したことを説明する。ヒト m—カルパインとカルパインスモールサプュニット 1とを共発現させた昆虫細胞のライセートをヒト m—カルパインとして用いた。陰性対照としてカルパイン非発現の昆虫細胞ライセート（図中ではコントロール s f 一 9細胞ライセートと表示。）およぴライセ一ト無添加試料（図中では対照と表示。）を用い、陽性対照としてラット m—カルパインを用いた。図中の +および一はカルシウムの有無を示している。図は抗 HNF— 1 ct抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果であり、矢頭は HNF— 1 aのバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 1 2図はィオノフォアの添加により細胞内で HNF— 1 αが分解されたことを説明する。図は抗 HNF— 1 ひ抗体を用いたウェスタンプロッティングの結果であり、アスタリスク（*) は HNF— 1 αの分解物のバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 1 3図はヒト μ一カルパイン、ゥサギ m—カルパインおよぴラット m—カルパインが、インビトロでヒト I P F_ 1をカルシウム存在下で分解したことを説明する。対照は、カルパイン無添加の試料を表わす。図中の +および一はカルシゥムの有無を示す。第 1 3図 Aおよび第 1 3図 Bはそれぞれ、抗 Xp r e s s抗体および抗 I P F— 1抗体を用いたウェスタンプロッティングの結果である。矢頭およびアスタリスク（*) はそれぞれ、 I P F— 1のバンドおよびカルパインによる I P F— 1の分解物を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 14図はヒト m—カルパインがインビトロでヒト I P F— 1をカルシウム存在下で分解したことを説明する。ヒト m—カルパインとカルパインスモールサブユニット 1とを共発現させた昆虫細胞のライセートをヒト πι_カルパインとして用いた。陰性対照としてカルパイン非発現の昆虫細胞ライセート（図中ではコントロール s f 一 9細胞ライセートと表示。）およぴライセ一ト無添加試料（図中では対照と表示。）を用い、陽性対照としてラット m—カルパインを用いた。図中の +および一はカルシウムの有無を示している。図は抗 I P F— 1抗体を用いたゥエスタンブロッテイングの結果である。矢頭およびアスタリスク（*) はそれぞれ、 I P F— 1のバンドおよびカルパインによる I P F— 1の分解物を示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。

第 1 5図はィオノフォアの添加により細胞内で I P F— 1が分解されたことを説明する。図は抗 I P F— 1抗体を用いたウェスタンプロッティングの結果であり、アスタリスク（*) は I P F— 1の分解物のバンドを示す。図の左列に記載した数値は分子量マーカーの分子量である。 ' . 発明を実施するための最良の形態 '

本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本国特許出願番号第 20 02— 254 9 7 3号、同第 2003— 96 3 70号、同第 2003— 96 3 7 1号および同第 200 3- 96 3 72号からの優先権を請求するものである。本明細書中で使用されている技術的おょぴ科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物などの資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。

以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。本発明においては、 m—カルパインと HN F— 4 αが相互作用することを特許文献 1記載の方法に従ってインシリコ（ i n s i 1 i c o ) で予測した。さらに実験的に、 πι—カルパインが HN F— 4 αと結合すること、および m—力ルパインが HNF— 4 αを分解することを初めて明らかにした。また、 m—カルパインと同じくカルパインスーパーファミリ一に属する β—カルパインが同様に ΗΝ F— 4 ひを分解することを見出した。 m—カルパインが HNF— 4 aと結合してこれを分解すること、および μ—カルパインが HNF— 4 ひを分解することから、 μ一カルパインも HN F— 4 αに結合すると考えられる。

さらに、 HNF _ 4 aと同様、糖代謝関連遺伝子の転写因子として作用する H NF - 1 αおよび I P F _ 1が m—カルパインおよび一カルパインのいずれによっても分解されることを見出した。

カルパインによる切断認識部位のアミノ酸モチーフから、 HN F— 4 α (配列番号 1 ) は m—カルパインまたは μ—カルパインにより、下記 4箇所の切断認識部位で切断されると推定した（第 1図）：アミノ酸配列第 7 9番目のパリン（V) に続くアルギニン（R) とそれに続くリジン（Κ) との間；第 2 1 1番目のロイシン（L) に続くアルギニン（R) とそれに続くァラニン（Α) との間；第 3 0 2番目のロイシン（L) に続くアルギニン（R) とそれに続くセリン（S) との間；および第 3 8 4番目のロイシン（L) に続くメチォニン（Μ) とそれに続くグルタミン（Q) との間。 HNF - 1 a (配列番号 2) は m—カルパインまたは μ—カルパインにより、下記 9箇所の切断認識部位で切断されると推定した（第 2図）：ァミノ酸配列第 1 6 2番目のロイシン（L) に続くチロシン（Υ) とそれに続くトレオニン（Τ) との間；第 1 6 7番目のバリン（V) に続くアルギニン（R) とそれに続くリジン（Κ) との間；第 2 6 2番目のバリン（V) に続くアルギニン（R) とそれに続くパリン（V) との間；第 2 6 4番目のパリン（V) に続くチロシン（Υ) とそれに続くァスパラギン（Ν) との間；第 3 2 0番目のバリン（V) に続くアルギニン（R) とそれに続くアミノ酸残基（不確定であるが、チロシンであるという報告がある）との間；第 4 1 1番目のバリン（V) に続くメチォニン（Μ) とそれに続くトレオニン（Τ) との間；第 4 7 6番目のロイシン（L) に続くメチォニン（Μ) とそれに続くプロリン（Ρ) との間；第 5 0 2番目のロイシン（L) に続くチロシン（Υ) とそれに続くセリン（S) との間；およぴ第 5 9 7番目のロイシン（L) に続くチロシン（Υ) とそれに続くグルタミン（Q) との間。

I P F— 1 (配列番号 3) は m—カルパインまたは μ—カルパインにより、下記 3箇所の切断認識部位で切断されると推定した（第 3図）：アミノ酸配列第 1 3 番目のロイシン（L) に続くチロシン（Υ) とそれに続くリジン（Κ) との間；第 3 6番目のロイシン (L) に続くチロシン (Υ) とそれに続くメチォニン (Μ) との間；および第 1 8 1番目のバリン（V) に続くメチォニン（Μ) とそれに続くロイシン（L) との間。

本明細書においては、アミノ酸を 1文字表記または 3文字表記することがある。また、ペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している 2個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のぺプチドを意味し、ォリゴマーとも称する単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドなどの短鎖ぺプチド、並びに単離された若しくは合成の完全長ポリべプチドゃ単離された若しくは合成の完全長蛋白質などの長鎖ぺプチドを包含する。

このように本発明においては、転写因子としての機能を有する HNF— 4 ひ、 HNF- 1 αおよび I P F— 1力カルパインにより分解されることを明らかにした。 HNF— 4 αは、コレステロール、脂肪酸およびグルコースの代謝や血液凝固などの様々な機能に関与する物質をコードする種々の遺伝子発現を調節している。 HNF— 1 αは、多くの肝特異的遺伝子、例えばアルブミン、フイブリノ一ゲンや α 1アンチトリプシンなどの遺伝子発現を調節している。また、 I P F — 1は、 GLUT 2、インシュリンおよびダルコキナーゼなどの糖代謝関連遺伝子の発現を制御していることが報告されている。転写因子の分解による減少は、それが作用する遺伝子の発現を低減させ、ひいては該遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患に繋がる生体機能の異常を引き起こす。したがって、これら転写因子がそれぞれ作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止および治療が、カルパインによる該転写因子の分解を阻害することにより可能になる。

HNF— 4 a、HNF— 1 αおよび I P F— 1は、それら機能の 1つにおいて、腌臓細胞における転写因子ネットワークを形成し、糖代謝関連遺伝子発現に関与していることが知られている。糖代謝関連遺伝子とは、生体において糖代謝（糖吸収、糖輸送および糖分解など）を調節している物質をコードする遺伝子のことであり、例えばィンシュリン、ダルコキナーゼ、 G LUT 2などが挙げられる。これら糖代謝関連遺伝子の発現に係わる転写因子の減少や機能欠損は、膝臓 /3細胞において転写因子ネットワークの破綻を招き、その結果糖代謝異常を引き起こして糖尿病などの疾患の原因になると考えられる。

糖代謝関連遺伝子の転写因子の減少や機能欠損の原因の 1つとして、例えばその分解が挙げられる。糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害することにより、該転写因子の減少や機能欠損に起因する疾患、あるいは該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止および/または治療が可能になる。これら知見により達成した本発明の 1態様は、カルパインを用いることを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法および分解剤に関する。

糖代謝関連遺伝子の発現に係わる転写因子としては、 HNF— 4 α、 HNF_ 1 aおよび I P F— 1が例示できる。本発明に係る分解方法を適用し得る糖代謝関連遺伝子の転写因子はこれら具体例に限らず、カルパインにより分解されるものである限りにおいて、何れにも適用可能である。カルパインによる分解の検出は、カルパインと転写因子とをカルシウム存在下で接触させた後にウェスタンブ口ット法などの公知方法を使用して実施可能である。

カルパインはカルパインスーパーファミリ一に属するプロテアーゼを全て包含する。カルパインスーパーファミリーに属するプロテアーゼとしては、 m—カルパイン、 ^一カルパイン、カルパイン 3、カルパイン 5、カルパイン 8、カルパイン 9、カルパイン 1 0、カルパイン 1 1、カルパイン 1 2およびカルパイン 1 3などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは m—カルパインまたは一カルパインである。一カルパインは rn—カルパインと比較してカルシゥム要求性が低く、より低濃度のカルシウムで活性化される。そのため、 μ—カルパインは m—カルパインと比較してカルシウム濃度上昇により活性化され易く、生体内で主に作用している可能性が考えられることから、より好ましくは一力ルパインである。これら各プロテアーゼを使用するときは、これらを単独で用いてもよいし、 2つ以上を組合せて用いることもできる。またカルパインは、 1種類の蛋白質を特異的に分解するものに限らず、複数の蛋白質、例えば複数の転写因子の分解に関与するものであってもよい。

本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解剤は、カルパインをその活性成分として有効量含んでなる。

本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法は、カルパインと該転写因子を共存させることを特徴とする。

カルパインはカルシウム依存性プロテアーゼであるため、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子の共存はカルシウム存在下で行なうことが好ましい。カルシゥム濃度は、カルパインのカルシウム要求性を考慮し、カルパインを活性化してそれらの酵素活性を誘発できる濃度を用いる。例えば、 m—カルパインを活性化するためには、好ましくは約 1 mM以上のカルシウム濃度が好適である。 μ— カルパインを活性化するためには、好ましくは約 1 0 /ί Μ以上、より好ましくは約 2 0 μ Μ以上、さらに好ましくは約 3 0 μ Μ以上のカルシウム濃度が好適である。また、カルパインによる H N F— 4 α、 H N F— 1 αおよび I P F— 1の分解はカルシウム依存性であったことから、カルシウム濃度を調節することによりカルパインによるこれら糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を所望の程度に調節することができる。かかるカルシウム濃度の調節を特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法も本発明の範囲に包含される。また、カルパインと転写因子の 1つまたは 2つ以上とを少なくとも含んでなり、カルパインと該転写因子とを共存させることを特徴とする該転写因子の分解系の構築およぴその利用も、本発明において可能である。

糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法および分解系は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。より具体的には、カルパインと転写因子を、例えば試験管内やマルチウエルプレート内で、カルシウムの存在下で共存させて分解させる分解方法および分解系が例示できる。あるいは、カルパインと転写因子を共発現させた細胞を用いた分解方法および分解系を例示できる。発現に用いる細胞は、蛋白質の発現のために一般的に使用されている細胞を使用可能である。これら蛋白質の発現は、公知の遺伝子工学的手法を用いて実現することができる。かかる細胞を用いた分解方法および分解系において、細胞内カルシゥム濃度を調節する、例えば力ルパインが活性化する濃度に調節するためには、ィオノフォアの使用が好適である。ィオノフォアは、 Α 2 3 1 8 7など公知のものを用いることができる。また、非ヒト動物にカルパインをコードする遺伝子、さらに糖代謝関連遺伝子の転写因子をコードする各遺伝子を自体公知の遺伝子ェ学的手法を用いて導入することにより、非ヒト動物における該転写因子の分解方法および分解系を提供することが可能である。 '

本発明において使用するカルパインおよび糖代謝関連遺伝子の転写因子は、これらの 1つまたは 2つ以上を遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、これら蛋白質は、それらの Ν末端側や C末端側に別の蛋白質ゃぺプチドなどを、直接的にまたはリンカ一ペプチドなどを介して間接的に、遺伝子工学的手法などを用いて付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との相互作用およびこれら蛋白質の機能、例えば力ルパインと該転写因子の接触、カルパインの酵素活性および転写因子の機能などが阻害されないような標識化が望ましレ、。標識物質としては、例えば酵素類（グルタチオン S —トランスフェラーゼ、ホースラディッシュパーォキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたは jS _ガラクトシダーゼなど）、タグペプチド類（H i s— t a g、 My c— t a g、 HA- t a g、 F LAG— t a gまたは X p r e s s - t a g など）、蛍光蛋白質類〔グリーン蛍光蛋白質、フルォレセインイソチオシァネート ( f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e) にはフィコエリスリン（p h y c o e r y t h r i n) など〕、マルトース結合蛋白質、免疫グロプリンの F c断片、またはビォチンなどが挙げられる力、これらに限定されない。あるいは放射性同位元素による標識も可能である。標識化するとき、 1種類の標識物質を付加してもよいし複数を組合せて付加することもできる。これら標識物質自体またはその機能を測定することにより、力ルパインによる糖代関連遺伝子の転写因子の分解を検出することが可能である。遺伝子導入に用いるカルパインおよび転写因子をそれぞれコードする遺伝子は、ヒト c DN Aライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。これら遺伝子を適当な発現ベクター DNA、例えば細菌プラスミド由来のベクターなどに自体公知の遺伝子工学的手法で導入し、上記各遺伝子を含有するベクターを得て、遺伝子導入に利用することができる。遺伝子導入は、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて実施可能である。

糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解剤、分解方法および分解系は、該転写因子の機能解明ゃ該転写因子が関与する転写因子ネットワークについての研究、および該転写因子の分解に起因する疾患、例えば糖尿病における該転写因子やカルパインの関与についての分子レベルでの研究などに有用である。また、当該分解方法および分解系を用いて、当該転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法を構築することも可能である。

本発明の別の 1態様は、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤および阻害方法に関する。当該阻害剤および阻害方法は、カルパイン活性を阻害すること、またはカルパインによる当該転写因子の切断を阻害すること、あるいはカルパインと当該転写因子の結合を阻害することを特徴とする。

カルパイン活性の阻害またはカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断の阻害は例えば、カルパインの酵素活性を阻害することにより実施できる。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤は、 1態様において、カルパイン活性を阻害する物質の少なくとも 1つを活性成分として有効量含んでなる。また、本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害方法は、 1態様において、カルパイン活性を阻害する物質の少なくとも 1つを用いることを特徴とする。本発明に係る阻害剤および阻害方法を適用する対象物としては、少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを含む対象物、例えば少なくともこれらを含む生体外試料が挙げられる。転写因子としては、 HNF— 4 a、 HNF 一 1 ひおよび I P F— 1が好ましく例示でき、これらのうち少なくとも 1つと力ルパインとを含む生体外試料が対象物としてより好ましい。また、少なくとも力ルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを発現している細胞、例えば滕臓 ]3細胞など、並ぴにかかる細胞を担持している哺乳動物なども当該対象物に含まれる。カルパイン活性を阻害する効果を有する物質としては、拮抗阻害効果を有するペプチド類、抗体および低分子化合物などが例示できる。具体的には、カルパインインヒビターとして知られている Ν— Ac e t y l -L e u-L e u— Me t 一 CHO、 N-A c Θ t y 1 -L e u-L e u-N l e -CHO, Z— L e u— L e u— Ty r— CH₂F、 Mu - V a l _HP h— CH₂F、 4—フルオロフェニルスノレホニノレ一 V a 1一 L e u_CH〇、 L e u— L e u_P h e _CH₂C 1または Z— V a 1— P h e—CHOなどが例示できる。抗体としては、カルパインまたは糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識して結合する抗体であって、カルパインによる該転写因子の分解を阻害する抗体が挙げられる。かかる抗体としてさらに好ましくは、当該転写因子の機能、例えば転写因子活性を阻害しないものが好適である。抗体は、カルパインまたは当該転写因子自体、これら由来の部分ぺプチド、あるいはこれらが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるぺプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により得ることができる。低分子化合物としては、カルパインの酵素活性を阻害する化合物、好ましくは該酵素活性を特異的に阻害する化合物が挙げられる。かかる化合物は、例えば、本発明に係る分解方法または分解系を利用して、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害するものを同定することにより得ることができる。カルパインを特異的に阻害するとは、カルパインを強く阻害するが、他の酵素は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。

カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断の阻害はまた、カルパインと該転写因子との結合を阻害することにより実施できる。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子分解の阻害剤は、 1態様において、カルパインと該転写因子との結合を阻害する物質の少なくとも 1つを活性成分として有効量含んでなる。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子分解の阻害方法は、 1態様において、カルパインと該転写因子との結合を阻害する物質の少なくとも 1つを用いることを特徴とする。カルパインと当該転写因子との結合の阻害は、例えば両蛋白質が相互作用する部位のァミノ酸配列からなるぺプチドを用いて実施可能である。かかるぺプチドとして、当該転写因子のァミノ酸配列においてカルパインにより切断される部位、すなわち切断部認識位のアミノ酸配列を含むぺプチドが例示できる。例えば、 m—カルパインまたは μ—カルパインの切断認識部位のアミノ酸配列は、 L Y、 L M、 L R、 V Y、 VMまたは V Rであると考えられる。このような切断認識部位のアミノ酸配列を少なくとも 1つ含むぺプチドが好ましい。かかるべプチドは、カルパインによる当該転写因子分解を競合的に阻害すると考えられる。より好ましくは、当該転写因子のァミノ酸配列、例えば配列番号 1、配列番号 2または配列番号 3に記載のァミノ酸配列のうちの連続する 3つ以上のァミノ酸残基からなり、且つカルパインの切断認識部位のアミノ酸配列を含むぺプチドが挙げられる。

カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合の阻害はまた、カルパインと該転写因子の結合部位のアミノ酸配列からなるペプチドを用いて実施可能である。具体的には、 m—カルパインの基質となる H N F— 4 ひ由来のかかるぺプチド、例えばペプチド Y K L L P G (配列番号 5、実施例 1およぴ第 4図を参照）または該ぺプチドを含むぺプチドは、両蛋白質の相互作用を競合的に阻害すると考えられる。

上記ぺプチドは、カルパインまたは糖代謝関連遺伝子の転写因子のァミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、カルパインによる該転写因子の切断および/または力ルパインと該転写因子の結合を阻害するものを選択することにより得ることができる。

このように特定されたペプチドに 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または揷入などの変異を導入したものも、力ルバインと糖代謝関連遺伝子の転写因子の結合を阻害する限りにおいて、本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したペプチドは、さらにカルパインによる当該転写因子の切断を阻害するものが好ましい。変異を有するぺプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または揷入などの変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマーの技術（非特許文献 4 1 ) を利用できる。このような変異の導入において、当該べプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性など）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性ァミノ酸、非極性ァミノ酸、疎水性ァミノ酸、親水性ァミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸など）の間での相互置換は容易に想定される。

カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害し得るぺプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基などを、例えばアミド化修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。特に、ペプチドと他の蛋白質との結合を安定化し、ぺプチドを解離し難くするために通常よく使用される修飾、例えば C末端のアルデヒド化または N末端のァセチル化などの修飾は、力ルパインと当該転写因子の結合を阻害するペプチドの有効性を高めるために有用である。

上記べプチドは、ぺプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、公知文献に記載の方法（非特許文献 42および非特許文献 43) が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。

本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤は、その 1態様において、該転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも 1つを活性成分として有効量含有してなる。このとき、当該転写因子分解の阻害剤は、 1種類の転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも 1つを活性成分として有効量含有してなる阻害剤であることができる。また、各転写因子に対するかかる阻害物質を複数組合せて含有する阻害剤であることもできる。より具体的には、例えば HNF - 4ひ、 HNF— 1 αまたは I P F— 1 とカルパインとの結合阻害物質、 HNF— 4 α、 HNF— 1 αまたは I PF— 1 αのカルパインによる切断阻害物質、カルパイン活性阻害物質の少なくとも 1つを活性成分として有効量含有してなることが好ましい。

本発明に係る糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害方法は、その 1態様において、該転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも 1つを用いることを特徴とする。このとき、当該転写因子分解の阻害方法においては、 1種類の転写因子とカルパインとの結合阻害物質、該転写因子のカルパインによる切断阻害物質、およびカルパイン活性阻害物質の少なくとも 1つを用いることができ、また、各転写因子に対するかかる阻害物質を複数組合せて用いることもできる。より具体的には、例えば HNF— 4ひ、 HNF- 1 αまたは I P F— 1 ひとカルパインとの結合阻害物質、 HNF— 4 α、 HNF— 1 ひまたは I P F— 1 αのカルパインによる切断阻害物質、カルパイン活性阻害物質の少なくとも 1つを用いることが好ましい。

本発明のまた別の 1態様は、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の産生調節方法に関する。本発明に係る糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の産生調節方法は、それらをコードする遺伝子の発現に係る転写因子のカルパインによる分解を調節して、該遺伝子の遺伝子産物の産生を調節することを特徴とする。

糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法の 1態様は、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法であり、該遺伝子発現に係る転写因子のカルパインによる分解を阻害することを特徴とする。当該産生促進方法は具体的には、当該転写因子の分解阻害剤または当該転写因子の分解阻害方法を使用することにより達成できる。上記分解阻害剤を含んでなる、糠代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進剤も本発明の範囲に包含される。

糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法の別の 1態様としては、カルシゥム濃度を調節して該因子の発現に係る転写因子の分解程度を所望の程度に調節することにより、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生を調節する方法が挙げられる。カルシウム濃度を高濃度にしてカルパインを活性化させることにより糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子を分解することができるため、該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の産生を低下させることができる。カルシウム濃度を低濃度にしてカルパインの酵素活性を減弱させることにより、該転写因子の分解を阻害することができるため、当該遺伝子産物の産生を促進することができる。

糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物としては、例えば、該転写因子の結合部位をプロモーターまたはェンハンサー内に有する遣伝子の遺伝子産物が挙げられる。具体的には、 H N F— 4 ひが作用する遺伝子として、 H N F— 4 α結合部位をプロモーターまたはェンハンサー内に有する遺伝子、例えばィンシュリン遺伝子、 H N F _ 1 α遺伝子、血液凝固第 V I I因子遺伝子、および血液凝固第 I X因子遺伝子などが挙げられる。 H N F— 1 αが作 ¾ する遺伝子として、 H N F— 1 α結合部位をプロモーターまたはェンハンサー内に有する遺伝子、例えば、インシュリン遺伝子、 GLUT 2遺伝子、 HNF— 4 ひ遺伝子および I P F— 1遺伝子などが挙げられる。 I P F— 1が作用する遺伝子として、 I P F— 1結合部位をプロモーターまたはェンハンサー内に有する遺伝子、例えば、 GLUT 2遺伝子などが挙げられる。

本発明のさらに別の 1態様は、糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および/または治療剤、並びに当該疾患の防止方法および Zまたは治療方法に関する。当該疾患の防止剤おょぴ Zまたは治療剤は、上記分解阻害剤を含んでなる。当該疾患の防止方法および Zまたは治療方法は、上記分解阻害剤または上記分解阻害方法を使用することにより達成できる。

糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患としては、例えば該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患が挙げられる。例えば HN F— 4 はインシユリン遺伝子に作用し該遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。 HNF— 1 αはィンシュリン遺伝子および GLUT 2遺伝子に作用し、これら遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。また、 HNF— 1 αと H NF— 4 αは互いの遺伝子に転写因子として作用し、その遺伝子産物産生を促進することにより、さらにィンシュリン遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。また、 I P F— :Ui、 G LUT 2遺伝子に作用し遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。また、 I P F— 1は HNF— 4 に転写因子として作用してその発現を促進するため、 HNF— 4 αの産生促進を介してィンシュリン遺伝子の遺伝子産物産生に寄与している。

糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患として具体的には、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患、例えばインシュリンゃ G LUT 2の減少に起因する疾患などが例示できる。より具体的には、糖代謝異常による疾患、例えば糖尿病などが挙げられる。

実際、マウスの滕臓ランゲルハンス島にカルパイン阻害剤を暴露させるとダルコース刺激によるィンシュリン分泌が増加することが報告されている（非特許文献 1 5)。しかし、この報告においては、カルパインと糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子との関連については開示されていない。また、膝島においては、高血糖状態が持続すると細胞内カルシウム濃度が上昇し、グルコース刺激性ィンシュリン分泌の脱感作が起こる（非特許文献 4 4 )。

本発明における知見とこれら情報から、長期の高血糖による細胞内カルシゥム濃度の上昇によりカルパインが活性化され、その結果糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子が分解されるために、瞵臓 ]3細胞での転写因子ネットワークが破綻して糖代謝の異常が起き、ひいては 2型糖尿病と同様の病態が誘発されるという力スケードが存在すると考えられる。

したがって本発明によれば、上記カスケ一ドにおいてカルパインによる糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解を阻害できるため、糖代謝の正常化を図り、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患、例えば糖尿病を防止および/または治療可能である。

H N F - 4 _αは、糖代謝関連遺伝子以外の遺伝子にも転写因子として作用することが知られている。例えば、 H N F— 4 α結合部位が血液凝固第 V I I因子遺伝子または第 I X因子遺伝子のプロモーターまたはェンハンサー部位に存在することが知られている。このことから、これら各遺伝子の遺伝子産物欠乏に起因する出血性疾患、例えば血友病や重症第 V I I因子欠損症が H N F— 4 分解により引き起こされると考えられ、これら疾患の防止および Ζまたは治療に本発明に係る分解阻害剤または分解阻害方法が有用である。

H N F _ l _aは、その不活化が肝細胞腺腫の原因となることが報告されている (非特許文献 3 4 )。このことから、肝細胞腺腫ひいてはそれが形質転換した肝細胞癌が H N F— 1 α分解により引き起こされると考えられ、これら疾患の防止および/または治療に本発明に係る分解阻害剤または分解阻害方法が有用である。本発明のまた別の 1態様は、カルパインによる糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法に関する。該同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。また、本発明に係る分解系または分解方法を利用して、該同定方法を実施可能である。被検化合物としては、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、またはカルパインおよぴ糖代謝関連遺伝子の転写因子の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザィンして得られた化合物などが挙げられる。あるいは、当該転写因子のカルパインによる切断認識部位のぺプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物なども被検化合物として好適である。

具体的には、カルパインによる糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の切断を可能にする条件を選択し、当該条件下でカルパインおよびまたは該転写因子と被検化合物を接触させ、該転写因子の分解を検出するシグナルおよびノまたはマ一力一を使用する系を用いて、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、カルパインによる該転写因子の分解を阻害する化合物を同定できる。カルパインによる転写因子の切断を可能にする条件としては、例えばカルパインを活性化する濃度のカルシウムの存在下であることが挙げられる。また、該条件はインビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、カルパインと当該転写因子を共発現させた細胞を用いることもできる。カルパインおよびノまたは当該転写因子と被検化合物の接触は、カルパインによる当該転写因子の分解反応の前に行なってもよいし、分解反応に共存させることにより行なってもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指し、マーカ一とはそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルとしてはルシフェラーゼ、グリーン蛍光蛋白質、および放射性同位体など、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフエ二コールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子など、または検出用のェピトープタグ、例えば 6 X H i s— t a gなど、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれを用いることもできる。これらシグナルまたはマーカーは、単独で使用してもよく、 2つ以上を組合せて用いてもよい。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者には周知のものである。簡便には、糖代謝関違遺伝子の転写因子の分解は、該転写因子または該転写因子分解物量の存在若しくは不存在および/または変化の測定により検出できる。当該転写因子量または当該転写因子分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはべプチドの検出方法、例えばウエスタンブロッテイング法などを用いて実施できる。あるいは、当該転写因子の分解の検出は、当該転写因子活性の存在若しくは不存在および Zまたは変化の測定により行なうことができる。具体的には、例えば、インシュリン遺伝子に作用する転写因子であるときには、該転写因子とカルパインとを発現している細胞に、インシュリン遺伝子のプロモーター領域をその上流に組み込んだレポ一ター遺伝子を含むプラスミドをトランスフエクシヨンし、被検化合物とこの細胞を接触させた場合のレポーター遺伝子の発現量を、当該被検化合物と接触させなかった場合のレポーター遺伝子の発現量と比較することにより、所望の化合物の同定を行なうことができる。 G L U T 2遺伝子に作用する転写因子であるときには、該転写因子とカルパインとを発現している細胞に、 G L U T 2遺伝子のプ口モーター領域をその上流に組み込んだレポーター遺伝子を含むプラスミドをトランスフエクシヨンし、同様に化合物の同定を実施できる。これら具体例に限らず、カルパインにより分解される転写因子が作用する遺伝子のプロモーター領域を組込んだレポータ一遺伝子を用いて、化合物の同定が可能である。

その他、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子の結合を可能にする条件を選択し、当該条件下でカルパインおよび Zまたは転写因子と被検化合物を接触させ、カルパインと該転写因子の結合を検出するシグナルおよび /またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよびノまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、カルパインによる該転写因子の分解を阻害する化合物を同定できる。カルパインと当該転写因子の結合の検出は、自体公知の検出方法、例えばウェスタンプロッティング法などを用いて実施できる。かかる同定方法で得られた化合物は、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤ある'いは該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物産生促進剤として利用可能である。当該転写因子の分解阻害剤または該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物産生促進剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。医薬組成物の調製において、これら阻害剤および促進剤は、単独で使用することもできるし、複数を組合せて使用することも可能である。

本発明に係る医薬組成物は、通常は 1種または 2種以上の医薬用担体を用いて製造することが好ましい。医薬用担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤や賦形剤などを例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビエルピロリドン、カルボキシビニノレポリマー、ァノレギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリゥム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレンダリコール.、ポリエチレングリコール、ヮセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラタトースなどが挙げられる。これらは、本発明に係る剤形に応じて適宜 1種類または 2種類以上を組合せて使用される。所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、 p H調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製することもできる。本発明に係る医薬組成物は、糖代謝関連遺伝子発現に係る転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤として使用することができる。また、当該疾患の防止方法および/または治療方法に使用することができる。

医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状おょぴ他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断などに応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重 1 k gあたり約 0 . 0 1 g乃至 1 0 0 m g程度、好ましくは約 0 . 1 μ g〜l m g程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いて用量を変更することができる。上記投与量は 1 日 1〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に 1回の割合で間欠的に投与してもよい。本発明に係る医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。あるいは経口による投与も可能である。さらに、経粘膜投与または経皮投与も可能である。腫瘍疾患に用いる場合は、腫瘍に注射などにより直接投与することが好ましい。

投与形態としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソ一ム製剤、シクロデキストリンなどの包接体、シロップ、ェリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従レ、、調合、成形、調製することができる。

散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラタトース、グルコース、シユークロース、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、マグネシゥムステアレート、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。

懸濁剤は、水、シユークロース、ソルビトール、フラクトースなどの糖類、 P E Gなどのグリコール類、油類を使用して製造できる。

注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。リボソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロ口ホルムなど）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。

脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、ォリーブ油などの植物油、 M C Tなど）、乳化剤（リン脂質など）などを混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型など）を用いて、乳ィヒ ·均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンゃ糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖など）が例示される。

シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノールなど）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水などに加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じ X、空隙直径の異なるシクロデキストリン（_α、 /3、 γ型）を適宜選択すればよい。

本発明のさらに別の 1態様は、カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチド、カルパインをコ一ドするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つと、糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子、該転写因子をコードするポリヌクレオチドおよぴ該ポリヌクレオチドを含有するべクターのうちの少なくともいずれか 1つとを含んでなる試薬キットに関する。試薬キットに含まれる転写因子としては好ましくは、 H N F— 4 α、 H N F— l aおよび I P F— 1が例示できる。当該転写因子は複数種類を組合せて試薬キットに含有させることもできる。当該試薬キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用可能である。

また、上記べプチドおよび上記同定方法で得られた化合物からなる試薬およびこれらを含む試薬キットも本発明の範囲に包含される。試薬キットは、カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を検出するためのシグナルおよび Zまたはマーカー、これらの検出剤、反応希釈液、緩衝液、洗浄剤および反応停止液など、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および/または防腐剤などの物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。

これら試薬および試薬キットは、例えば糖代謝関連遺伝子の転写因子ネットヮークについての研究および該転写因子の機能不全や分解に起因する疾患、例えば糖尿病における該転写因子やカルパインの関与についての分子レベルでの研究などに有用である。実施例

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。

実施例 1

(m—カルパインと相互作用する蛋白質のィンシリコでの探索）

m—カルパインと相互作用する蛋白質を、特許文献 1記載の方法に従って予測した。まず、 m—カルパインのアミノ酸配列をある長さのペプチドに分解し、各ぺプチドのァミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なァミノ酸配列を持つた蛋白質をデータベース中で検索した。ついで、得られた蛋白質と m—カルパインとの間でローカルァライメントを行い、ローカルァライメントのスコアの高いものを m—力ルパインと相互作用すると予測した。

解析の結果、 m _カルパイン由来の 6アミノ酸残基からなるぺプチド F K L P P G (配列番号 4 ) と相同性のあるペプチド Y K L L P G (配列番号 5 ) 力肝遺伝子の発現を制御することが知られている核転写因子の一つである H N F— 4 αのアミノ酸配列中に存在することが分かった（第 4図 Αおよび Β )。第 4図 Αはヒト m—カルパインとヒト H N F— 4 αとのローカルァライメントの結果を、第 4図 Bはゥサギ m—カルパインとヒト HNF— 4 o;とのローカルァライメントの結果を示す。ここにおいて、アミノ酸配列は 1文字表記するものである。この結果から、 HNF— 4 αは m—カルパインと相互作用する蛋白質であると予測された。なお、ゥサギ πι—カルパインについて NC B Iデータベースに登録された配列情報には、ヒト m—カルパインの 2 7 9番目のアミノ酸残基以降の配列に相当する領域しか記載がないが、この領域での同一性は 9 4%であることから、 2 7 8番目以前のアミノ酸配列についてもゥサギ m—カルパインはヒト πι—カルパインとほぼ同等と考えられる。

実施例 2

(ゥサギ m—カルパインによるヒト HNF— 4 αの分解）

HNF- 4 αの m—カルパインによる分解を、ゥサギ m—カルパインを用いたインビトロ分解試験で検討した。

<材料〉

HNF— 4 α発現プラスミドを以下のように構築した。まず、ヒト HNF— 4 a c DNAを、ヒト脳 p o 1 y A + RNAから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（R T一 P CR) により獲得した。 P CRエラーと思われる塩基置換は Q u i k C h a n g e S i t e— D i r e c t e d Mu t a g e n e s i s k i t ( CD TARATAGENE社）により修正した。その後、 N末端に H i s— t a gおよび X p r e s s - t a gを付加させる動物細胞用発現プラスミド p c DNA 3. 1 /H i s ( I n v i t r o g e n社）に E c o R Iサイトで組込み、 HNF— 4 ひ発現プラスミドを構築した。クローニングした HNF— 4 a c DNAのァミノ酸翻訳配列は、 NCB Iデータベースのァクセッション番号 XP— 0 0 9 5 1 4 (登録遺伝子名は HNF 4 A。）と同一であった。なお、ァクセッション番号 XP— 0 0 9 5 1 4は、 2 0 0 3年より Sw i s s—P r o tデータベースのァクセッション番号 P 4 1 2 3 5に変更されている。

HNF— 4 ひ発現プラスミドを用い、インビトロでの HNF— 4 α蛋白質の合成を、 TNT Τ 7 Q u i c k C o u p l e d T r a n s c r i p t i o n r a n s 1 a t i o n S y s t e rn (P r o me g a社) を使用して行なった。すなわち、 HNF— 4 α発現プラスミドと TNT T 7 Qu i c k M a s t e r M i xを混合し、メチォニン存在下で 3 0 °Cにて 1. 5時間インキュベーションして HNF— 4 aを合成した。

<方法 >

インビトロにおける蛋白質分解試験は、合成した HNF— 4 αにゥサギの筋肉より抽出した m—カルパイン（P ROTEAS E, C a l c i um A c t i v a t e d N e u t r a l , c a l p a i n, S i gma社）を最終濃度 5 0 μ gZmLとなるように添加し、 2 0 0mM T r i s — HC I (p H 7. 8) Z 1 mM ジチオスレィトール（DTT) Z6mM C a C 1 ₂存在下で 3 7 °Cにて 1時間インキュベーションすることにより行なった。また、カルシウム非存在下での分解試験を行なうために、 6 mM C a C 1 ₂の代わりに 1 0 mM ェチレンジアミン四酢酸（EDTA) を添加した試料を作製して同様にインキュベーションした。インキュベーション後の試料は、等容量の 2 X ドデシル硫酸ナトリゥム (S D S) サンプルバッファー〔4% S D S/ 1 2 5 mM T r i s一 H C 1， H 6. 8/2 0 % グリセ口ール/ 0. 0 1 % ブロムフエノールブノレ一（B P B) / 1 0 % ]3—メノレ力プトェタノ一ノレ (me r c a p t o e t h a n o 1 )〕を加えて 5分間加熱し、 1 0% S D S— PAGEにより分離した。その後、抗 HNF— 4ひ抗体 ZHNF— 4 a (C一 1 9) 抗体（S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y社) および饥 X p r e s s饥体丄 n v i t r o g e n社）を用いてウェスタンブロッテイング法により H N F— 4 αを検出し 7こ。検出 ίま E C L w e s t e r n b l o t t i n g d e t e c t i o n k i t (Am e r s h am P h a r ma c i a B i o t e c h社) を使用して行なった。

ぐ結果〉 .

第 5図 Aおよび Bに示したように、ゥサギ m—カルパインによる HNF— 4 a の分解が認められた。一方、 HNF— 4ひはカルシウム非存在下または m—カルパイン無添加では分解されなかった。ゥサギ m—カルパインとヒト m—カルパインは約 94%の高い相同性を有することから、ヒト m—カルパインも同様に HN F— 4ひを分解すると考えられる。以上の結果から、 HNF— 4 αは m—カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。

実施例 3

(ヒト: m—カルパインとヒト HNF— 4 αの結合解析）

m—カルパインと HNF— 4 αの結合を、細胞内共発現 Ζ免疫沈降法による結合試験により検討した。

く材料 >

m—カルパイン発現プラスミドの構築は以下のように行なった。まず、カルパイン c DNAを、ヒト肝 p o 1 yA + RNA (C I o n t e c h社）から RT ― P C Rにより獲得した。 P CRエラーと思われる塩基置換は Q u i k C h a n g e S i t e— D i r e c t e d u t a g e n e s i s k i tにより修正した。その後、 C末端に F LAG— t a gを付加させる動物細胞用発現プラスミド、 p CMV-T a g 4 (STARATAGENE社）へ S a l— Iサイトで組込み、 m—カルパイン発現プラスミドを構築した。クローユングした m—カルパイン c DNAのアミノ酸翻訳配列は、 NCB Iデータベースのァクセッション番号 AAA 3 5 64 5 (登録遺伝子名は C A P N 2。）と、 73番目おょぴ 74 番目のアミノ酸がメチォニン一アルギニン (MR) からイソロイシン一ダルタミン酸（ I E) に置換されている以外は同一であった。この I Eへの置換は Sw i s s - P r o t (P 1 76 55 ) においてコンフリクト（C o n f l i c t) の記載がある。

'ヒト HNF— 4 発現プラスミドは、実施例 2で調製したものを用いた。

<方法 >

まず、 m—カルパイン遺伝子と HNF— 4 ο;遺伝子を HEK 293 T細胞に共遺伝子導入した。具体的には、細胞数 1. 3 X 1 0⁶の HEK 2 93 T細胞を 3 7でにて5%〇0₂の存在下で4時間培養した後（直径 60 mmシャーレ）、 5 μ gの HNF— 4 α発現プラスミドまたは陰性対照として p c DNA3. 1 /H i sプラスミドを 5 gの m—カルパイン発現プラスミドと共に、 F u GENE 6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n t (R o c h eネェを用レヽてトフンスフエクシヨンした。 2日間培養後、冷却したリン酸緩衝生理食塩水（一）〔以下、 P B S (-) と称する。〕で細胞を洗浄し、 5 0 0 μ 1の細胞溶解バッファー〔2 OmM HE P E S, p H 7. 5/1 5 0 mM N a C 1 / 1 mM EDT A/ 1 % T r i t o n X- 1 0 0/1 mM フエ二ルメチルスルホニルフルオリド (PMS F)〕に懸濁し、氷上で 2 0分間放置した。その後、 4°Cにて 1 5, 0 0 0 r p mで 2 0分間遠心処理し、その上清を回収して細胞ライセート（c e l l 1 y s a t e ) とした。次に、採取したライセートに、 0. 1 %の牛血清アルブミンを含む TB S ( p H 8. 0) で前処理した P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t P l o w (Am e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c h社）を 1 8 1添加し、 4 °Cにて 2時間転倒混和した後、遠心処理により上清を回収した。回収した上清に抗 HNF— 4 抗体 /HNF— 4 a (C - 1 9)抗体を 0. 6 μ g添加し、 4°Cで 1時間転倒混和後、 P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t F l o wを 2 0 μ 1カロえ、さらに 4°Cで 1 時間転倒混和した。その後、遠心処理により P r o t e i n G S e p h a r o s eを回収し、 5 0 0 μ 1 の洗浄バッファー〔5 OmM T r s i — HC 1 , p H 7. 5/ 1 5 OmM N a C l /0. 2 % ノニデット P— 4 0 (N o n i d e t P— 4 0)〕で 3回洗浄した後、 3 0 μ 1の 2 X SD S サンプルバッファーを加えて 5分間加熱後、上清を 1 0% S D S— PAGEにより分離した。その後、抗 F LAG M2抗体（S i gma社）およぴ抗 X p r e s s抗体を用いてウェスタンプロッティング法により結合した蛋白質を検出した。検出は E C L w e s t e r n b l o t t i n g d e t e c t i o n k i t 使用して行なった。

<結果〉

第 6図 Aに示したように、抗 HNF— 4 ひ抗体による免疫沈降（図中 I Pと表示）において、 m—カルパイン（F LAG— t a g付加）は、 HNF— 4 ひ (X p r e s s - t a g付加）と共発現させた試料（図中レーン 1)でのみ共沈した。

HNF-4 非発現細胞では m—カルパインの共沈降は認められなかった。このことから、この共沈降はァガロースビーズへの非特異的結合によるものではなく、 HNF-4 aと m—カルパインの結合を示すものであることが明らかになった。両試料における m—カルパインの発現が同程度であることは、抗 F LAG M2 抗体によるウェスタンブロッテイングの結果により確認した（第 6図 Aの 1 y s a t e参照）。また、細胞内の X p r e s s -HNF- 4 が抗 HNF— 4 抗体により回収されることは、第 6図 Bに示した結果から確認できた。

実施例 4

(ヒト m—カルパインによる HNF— 4 αの分解）

ヒト m—カルパインによるヒト HNF— 4 ο;の分解について検討するために、ヒト m—カルパイン発現昆虫細胞ライセートを用いてインビトロ分解試験を実施した。

く材料〉

ヒト HNF_ 4 aは、実施例 2と同様の方法で、 HNF— 4 α発現プラスミドを用いて作製したものを用いた。

ヒト m—カルパインは、昆虫細胞で発現させたものを用いた。まず、ヒト πι— カルパイン c DNAを実施例 3 と同様に調製した。また、カルパインスモールサブュニット 1 c DNA (c a l p a i n s ma l l s u b u n i t 1 c DNA) をヒト骨格筋 c DNA ( C 1 o n t e c h社）から P C Rにより獲得し、シーケンスにより配列を確認した。カルパインスモールサブユニット 1 c DNAのアミノ酸翻訳配列は、 NCB Iデータベースのァクセッション番号 NP — 0 0 1 74 0 (登録遺伝子名は CAPNS 1。）と同一であった。蛋白質発現はバキュロウィルスを用いた昆虫細胞（夜盗蛾 s f — 9細胞）発現系にて行なった。すなわち、各々の c DNAを p F a s t B a c DUALプラスミド（ I n v i t r o g e n社)に糸且込み、 B a c— t o— B a c B a c u l o v i r u s E x p r e s s i o n S y s t em s ( I n v i t r o g e n社) を用レヽて、 s f 一 9細胞に m—カルパインおよびカルパインスモールサブュニット 1を共発現させた。これら蛋白質を発現させた s f — 9細胞は、冷却した PB S (—）で洗浄後、凍結融解により破砕した。ついで、 2 0mM T r i s— HC 1 (pH 7. 5) /5mM EDTA/ 1 0 mM —メルカプトエタノールを添加し、氷中で超音波処理した後に遠心処理（1 5, O O O r p mで 3 0分間）し、その上清を活性体試料（細胞ライセートと称する。）とした。また、蛋白質非発現 s f — 9 細胞のライセートを同様に調製し、陰性対照として使用した。ライセートの m_ カルパイン活性の有無は、基質としてカゼインを用いて確認した（非特許文献 4 5)。また、陽性対照としてラット m—カルパイン（C a 1 p a i n 2、 r a t r e c o mb i n a n t、 E . c o l i、 C a l b i o c h e m社) を用いた。 <方法〉

インビトロ蛋白質分解試験は、 HNF— 4 αに m—カルパイン、ラット m—力ルパインまたはカルパイン非発現 s f — 9細胞ライセートを添加し、 2 0 0mM T r i s -HC 1 ( p H 7. 8 ) / 1 mM DTT/6 mM C a C 1 ₂存在下で 3 7°Cにて 1時間インキュベーションすることにより行なった。ヒト m—カルパインの反応系での最終濃度は、蛋白質を発現させた s f — 9細胞ライセートの蛋白質濃度で 2. 3 3mgZmLとした。ラット m—カルパインの反応系での最終濃度は 5 9 u n i t/mLとした。さらに、カルパイン無添加の条件下で、上記同様に分解試験を行なった。また、カルシウム非存在下条件として 6 mM C a C 1 ₂の代わりに 1 0 mM E D T Aを添加した試料を作成し、該試料について同様に分解試験を行なった。インキュベーション後の試料は、等容量の 2 X S D S サンプルバッファーを加え 5分間加熱し、 5— 2 0% SD S -PAGE により分離した。その後、抗 HNF— 4 α抗体/ HNF— 4 a (C一 1 9) 抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより HNF— 4 αを検出した。検出は E C L w e s t e r n b l o t t i n g d e t e c t i o n k i tを使用した。 <結果>

第 7図に示すように、ヒト m—カルパインによるヒト HNF— 4 αの分解が認められた。 —方、カルシウム非存在下、非発 ¾s f — 9細胞ライセートおよび力ルパイン無添加ではいずれも HNF— 4 αの分解が認められなかった。これら力ら、 HNF— 4 αはヒト πι—カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。

実施例 5'

(ヒト μ—カルパインによる HNF— 4ひの分解）

ヒト μ—カルパインによるヒト HNF— 4 aの分解試験を、ヒト； u—カルパインを用いてインビトロで実施した。

<材料 >

HNF— 4 α蛋白質は、実施例 2と同様の方法で、 HNF— 4 α発現プラスミドを用いて調製したものを用いた。

μ—カルパインは、ヒト赤血球より抽出したもの（C a l p a i n 1、ヒト e r y t h r o c y t e s、 C a l b i o c h e m社) を用レヽ 7こ。

ぐ方法〉

インビトロ蛋白質分解試験は、 HNF— 4ひに μ—カルパインを最終濃度 50 u n i t/mLとなるように添加し、 200 mM T r i s— HC 1 (pH'7. 8 ) / 1 mM DTT/6 mM C a C 1 ₂存在下で 3 7 °Cにて 1時間インキュベーシヨンすることにより行なった。対照実験としてゥサギ m—カルパイン（実施例 2参照）を最終蛋白質濃度 5 0 gZmL、またはラット m—カルパイン（実施例 4参照）を最終濃度 5 9 u n i t/mLとなるように添加し、上記同様の条件下でインキュベーションした。また、カルシウム非存在下条件として 6mM C a C 1 ₂の代わりに 1 0 mM E D T Aを添加した試料を作成し、該試料について同様に分解試験を行なった。インキュベーション後の試料は、等容量の 2 X S D S サンプルバッファーを加え 5分間加熱し、 5— 20% SDS-PAGE により分離した。 HNF— 4 αの検出は、実施例 4と同様の方法で行なった。 <結果 >

第 8図に示したように、ヒト μ一カルパインによる HN F— 4 αの分解が認められた。一方、 HNF— 4 αはカルシウム非存在下、あるいは ^一カルパイン無添加試料では分解は認められなかった。これら力ら、 HN F— 4 αは ^—カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが判明した。

実施例 6

(ィオノフォア添加によるヒト HNF— 4 ひの分解）

細胞内における HNF— 4 αのカルパインによる分解を検討するため、カルシゥムィオノフォア添加による HNF— 4 α分解試験を実施した。

ぐ方法 >

細胞数 0. 7 X 1 0⁶の11£1 2 9 3 Τ細胞を 3 7。Cにて 5 % C Ο ₂存在下で 2 2時間培養した後（直径 6 0 mmシャーレ）、 2 μ gの HN F— 4 _α発現プラスミド（実施例 2参照）を F U.GENE 6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n tを用いてトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、ィオノフォア A 2 3 1 8 7 4— b r o m o— c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 S i g m a社）を 1 0 μ gZmL添加した培地と交換し、 3時間培養した。陰性対照群はィオノフォアの代わりにジメチルスルホキシド（DMS O) を添加した培地と交換した。所定時間培養後、細胞を冷却した P B S (-) で洗浄し、 3 0 0 μ 1 の低張細胞溶解バッファー（ 1 0 mM HE P E S , p H 7. 5 / l O m M M g C 1 ₂/4 2 mM KC 1 / 1 mM PMS F) に懸濁した後、氷上で 2 0分間放置した。細胞をホモジナイザーで破砕後、 4°Cにて 6 0 0 gで 1 0分間遠心処理し、その上清を細胞質画分、沈殿を核画分として回収した。核画分はさらに 2 X P B S/ 1 % ノニデット P— 4 0Z0. 1 % S D Sからなる溶液に縣濁し、超音波処理にて破砕した。等容量の 2 X S D S サンプルバッファーを加え、 5分間加熱後、その上清を 5— 2 0 % S D S— PAGEにより分離した。 HNF— 4 αの検出は、実施例 4と同様の方法で行なった。

<結果 > 第 9図 Aおよび Bに示したように、ィオノフォア添加により HNF— 4 αの分解が認められた。このことから、 HNF— 4 αは、細胞内においてカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウム依存性システィンプロテアーゼであるカルパインによって分解されたと考えられる。

実施例 7

(カルパインによるヒト HNF— 1 αの分解）

m—カルパインおよび μ—カルパインによる HNF— 1 ひの分解を、インビト口蛋白質分解試験で検討した。

ぐ材料 >

μ—カルパインはヒト由来のもの（実施例 5参照）を使用した。 m—カルパインはゥサギ由来のもの（実施例 2参照）およぴラット由来のもの（実施例 4参照）を使用した。

ヒト HN F— 1 _αは、 HNF— 1 α発現プラスミドを下記のように構築し、該プラスミドを用いて蛋白質の合成を行なうことにより得た。まず、ヒト HN F— 1 a c DNAを、ヒト肝 p o 1 y A ⁺ R N Aから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT- P CR)により獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。その後、 N末端に H i s - t a gおよび X p r e s s - t a gを付加させる動物細胞用発現プラスミド p c DNA 3. 1 /H i sに E c o R Iおよぴ N o t Iサイトで組込み、 HN F— 1 _α発現プラスミドを構築した。クローニングした HN F— 1 c DNAのアミノ酸翻訳配列は、 NC Β Iデータベースのァクセッション番号 Ν Ρ_0 0 0 5 3 6 (登録遺伝子名は T C F 1。）と同一であった。

HN F - 1 α発現プラスミドを用い、 HN F— 1 ひ蛋白質の合成を、 TNT Τ 7 Q u i c k C o u p l e d T r a n s c r i p t i o n/ T r a n s 1 a t i o n S y s t e mを使用してインビトロで行なった。すなわち、 HN F 一 1 ひ発現プラスミドと TNT T 7 Q u i c k Ma s t e r M i xを混合し、メチォニン存在下で 3 0°Cにて 1. 5時間インキュベーションして HN F - l aを合成した。合成した HNF— 1 aに、抗 X p r e s s抗体を添加して 4 °C で 1時間転倒混和後、 P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t F 1 o wを加え、 4°Cでさらに 1時間転倒混和することにより免疫沈降を行なつた。ついで、遠心処理により P r o t e i n G S e p h a r o s eを回収し、洗浄バッファー ( 5 0 mM T r i s — HC 1 , p H 7. 5/ 1 5 0 mM N a C 1 / 0. 2 % ノニデット P— 4 0) で 3回洗浄した後に、 2 0 0 mM T r i s— HC 1 ( p H 7. 8 ) でリンスして 2 0 % スラリーとし、 HNF— 1 α 試料とした（以下 HNF— 1 αスラリーと称する。）。

ぐ方法 >

インビトロにおける蛋白質分解試験は、 HN F— 1 ひスラリーに μ一カルパインまたは m—カルパインを添加し、 2 0 0 mM T r i s — H C 1 (p H 7. 8 ) / 1 mM D TT/ 6 mM C a C 1 ₂存在下で 3 7 °Cにて 1時間インキュベーシヨンすることにより行なった。各カルパインの反応系での最終濃度は、ヒト μ 一カルパインは 5 0 u n i t /mL, ゥサギ m—カルパインは蛋白質濃度として 5 0 μ gZmL、およびラット m—カルパインは 5 9 u n i t /mLとした。対照実験として、 HN F— 1 αスラリーをカルパインを添加せずにカルシウム存在下で同様にインキュベーションした。また、カルシウム非存在下での蛋白質分解試験を行なうために、 6 mM C a C 1 ₂の代わりに 1 0 mM EDTAを添加した試料を作製して同様にインキュベーションした。インキュベーション後の試料は、等容量の 2 X S D S サンプルバッファーを加えて 5分間加熱し、 5— 2 0 % S D S— P AG Eにより分離した。その後、 H i s — X p r e s s領域を認識する抗 Omn i /M2 1抗体（S a n t a C r u z B i o t e c h n o 1 o g y社）およぴ抗 H N F - 1 a抗体/ H N F - 1 a (C一 1 9) 抗体（ S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y社）を用いてウェスタンプロッティング法により HNF— 1 αを検出した。検出は E C L w e s t e r n b l o t t i n g d e t e c t i o n k i tを使用して行なった。

ぐ結果 >

第 1 0図に示したように、ヒト μ—カルパイン、ゥサギ m—カルパインおよびラット m—カルパインによる HNF_ 1ひのインビトロでの分解が認められた。 —方、カルシウム非存在下または m—カルパイン無添加では HNF— 1 αは分解されなかった。以上の結果から、 HNF— 1ひは^一カルパインおょぴ m—カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。

実施例 8

(ヒト m—カルパインによる HNF— 1 αの分解）

ヒト m—カルパインによるヒト HNF— 1 αの分解について検討するために、昆虫細胞で発現させたヒト m—力ルパインを用いてインビトロ蛋白質分解試験を実施した。

<材料 >

ヒト HNF— 1 αは、実施例 7で作製したもの（HNF— 1ひスラリー）を用いた。

ヒト m—カルパインは、実施例 4に記載の方法により昆虫細胞 s f — 9発現系で発現させ、該昆虫細胞ライセートをヒト m—カルパインとして用いた。また、蛋白質非発現 s f — 9細胞のライセートを同様に調製し、陰性対照として使用した。ライセートの m—カルパイン活性の有無は、基質としてカゼインを用いて確認した（非特許文献 45)。また、陽性対照としてラット m—カルパインを用いた。ぐ方法〉

インビトロ蛋白質分解試験は、 m—カルパインとして、 m—カルパインおょぴカルパインスモールサブユニット 1を共発現させた s f - 9細胞のライセートを用いた以外は、実施例 7と同様の方法で行なった。これら蛋白質を発現させた s f — 9細胞ライセートの反応系における最終濃度は、蛋白質濃度 ·として 1. 75 mg/mLとした。ラット m—カルパインの反応系での最終濃度は 59 u n i t ZmLとした。 HNF— l aの検出は、抗 H N F— 1 a抗体 ΖΗ N F— 1ひ (C - 1 9) 抗体のみを用いた以外は実施例 7と同様の方法で行なった。

ぐ結果 >

第 1 1図に示すように、ヒト m—カルパインによるヒト HNF— 1 _αの分解が認められた。一方、カルシウム非存在下、非発現 s f — 9細胞ライセート（図中、コントロール s f _ 9細胞ライセートと表示）およびカルパイン無添加（図中、対照と表示）ではいずれも HN F - 1 αの分解が認められなかつた。これらから、 HNF- 1 αはヒト m—カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。

実施例 9

(ィオノフォア添加によるヒト HNF— 1 αの分解）

細胞內における HNF— 1 αのカルパインによる分解を検討するため、カルシゥムィオノフォア添加による HNF— 1 ひ分解試験を実施した。

<方法 >

細胞数 0. 8 X 1 0⁶の HE Κ 29 3 T細胞を 3 7°Cにて 5 %C0₂存在下で 5 時間培養した後（直径 60mmシャーレ）、 2 μ gの HNF— 1 ひ発現プラスミド (実施例 7参照）を F uGENE 6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n tを用いてトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、ィオノフォア A23 1 8 7 (S i gma社） 1 0 g/mLおよび 0. 2% DMSOを含有する培地と交換し、 4時間培養した。陰性対照群は 0. 2% DM SO含有培地と交換した。所定時間培養後、細胞を冷却した P B S (一）で洗浄し、 3 50 1の低張細胞溶解バッファーに懸濁した後、氷上で 20分間放置した。細胞をホモジナイザ一で破砕後、 4°Cにて 600 gで 1 0分間遠心処理し、その上清を細胞質画分、沈殿を核画分として回収した。核画分はさらに 2 X P B SZ1 % ノニデット P -40/0. 1 % S D Sからなる溶液に縣濁し、超音波処理にて破砕した。細胞 ΐϋ分は、 C o oma s s i e P l u s P r o t e i n A s s a y R e a g e n t K i t ( P I E R C E社）により蛋白質濃度を測定した。作成した各試料は等容量の 2 X SDS サンプルバッファーを加え、 5分間加熱後、その上清を 5— 20% SDS— PAGEにより分離した。 HNF— 1 αの検出は、実施例 8と同様の方法で行なった。

く結果〉第 1 2図に示したように、ィオノフォア添加により HNF— 1 αの分解が認められた。このことから、 HNF— 1 ひは、細胞内においてカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウムイオン依存性システィンプロテアーゼであるカルパインによつて分解されたと考えられる。

実施例 1 0

(カルパインによるヒト I P F— 1の分解）

m—カルパインおよび; u—カルパインによる I P F— 1の分解を、インビトロ蛋白質分解試験で検討した。

<材料 >

μ—カルパインはヒト由来のもの（実施例 5参照）を使用した。 m—カルパインはゥサギ由来のもの（実施例 2参照）およびラット由来のもの（実施例 4参照）を使用した。

ヒト I P F— 1は、 I P F— 1発現プラスミドを下記のように構築し、該プラスミドを用いて蛋白質の合成を行なうことにより得た。まず、ヒト I P F— 1 c DNAを、ヒト肝 p o 1 y A + RNAから RT— P CRにより獲得し、シーケンスにより塩基配列を確認した。その後、 N末端に H i s— t a gおよび Xp r e s s - t a gを付加させる動物細胞用発現プラスミド p c DNA 3. 1 /H i s に B a mH Iおよび E c o R Iサイトで組込み、 I P F— 1発現プラスミドを構築した。クローニングした I P F— 1 c DNAのアミノ酸翻訳配列は、 NCB Iデータベースのァクセッション番号 NP— 000200 (登録遺伝子名は I P F。）と同一であった。

I P F— 1発現プラスミドを用い、 I P F— 1蛋白質の合成を、 TNT T 7 Qu i c k C o u p l e d T r a n s c r i p t i o n/T r a n s l a t i o n S y s t e mを使用してインビトロで行なった。すなわち、 I P F— 1 発現プラスミドと TNT T 7 Q i c k Ma s t e r M i xを混合し、メチォニン存在下で 30°Cにて 1. 5時間インキュベーションして I PF— 1を合成した。ぐ方法〉

インビトロにおける蛋白質分解試験は、 I P F— 1に μ—カルパインまたは i —カルパインを添加し、 200 mM T r i s— HC 1 (p H 7. 8) /1 mM D TT/ 6 mM C a C 1 ₂存在下で 3 7°Cにて 1時間ィンキュベーションすることにより行なった。各カルパインの反応系での最終濃度は、ヒト μ—カルパインは 50 u n i t ZmL、ゥサギ m—カルパインは蛋白質濃度として 50 μ gZ mL、およびラット m—カルパインは 59 u n i tZmLとした。対照実験として、 I P F— 1をカルパインを添加せずにカルシウム存在下で同様にィンキュベーシヨンした。また、カルシウム非存在下での蛋白質分解試験を行なうために、 6 mM C a C 1 ₂の代わりに 1 0 mM E D T Aを添加した試料を作製して同様にインキュベーションした。インキュベーション後の試料は、等容量の 2 X S D S サンプルバッファーを加えて 5分間加熱し、 5— 20% SD S— PAG Eにより分離した。その後、抗 X p r e s s抗体および抗 I P F— 1 (PDX— 1 ) 抗体 ZN - 1 8 (S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y社）を用いてウェスタンブロッティング法により I P F— 1を検出した。検出は E C L we s t e r n b l o t t i n g d e t e c t i o n k i tを使用レて行なった。

く結果〉

第 1 3図 Aおよび Bに示したように、ヒト/ —カルパイン、ゥサギ m—力ルパィンおよびラット m—カルパインによる I P F— 1のインビトロでの分解が認められた。一方、カルシウム非存在下または m—カルパイン無添加では I P F_ 1 は分解されなかった。以上の結果から、 I P F— 1は/ z—カルパインおよび πι— 力ルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らかになった。

実施例 1 1

(ヒト m—カルパインによる I P F— 1の分解）

ヒト m—カルパインによるヒト I P F— 1の分解について検討するために、昆虫細胞で発現させたヒト m—カルパインを用いてインビトロ蛋白質分解試験を実施した。

<材料 >

ヒト I P F— 1は、実施例 1 0で作製したものを用いた。

ヒト m—カルパインは、実施例 4に記載の方法により昆虫細胞 s f — 9発現系で発現させ、該昆虫細胞ライセートをヒト m—カルパインとして用いた。また、蛋白質非発現 s f — 9細胞のライセートを同様に調製し、陰性対照として使用した。ライセートの m—カルパイン活性の有無は、基質としてカゼインを用いて確認した（非特許文献 4 5 )。また、陽性対照としてラット m—カルパインを用いた。ぐ方法〉

インビトロ蛋白質分解試験は、 m—カルパインとして、 m—カルパインおよびカルパインスモールサブュニット 1を共発現させた s f - 9細胞のライセートを用いた以外は、実施例 1 0と同様の方法で行なった。これら蛋白質を発現させた s f 一 9細胞ライセートの反応系における最終濃度は、蛋白質濃度として 2 . 3 3 m g /m Lとした。ラット m—カルパインの反応系での最終濃度は 5 9 u n i t /m Lとした。 I P F— 1の検出は、抗 I P F— 1抗体/ N— .1 8のみを用いた以外は実施例 1 0と同様の方法で行なった。

<結果>

第 1 4図に示すように、ヒト m—カルパインによるヒト I P F— 1の分解が認められた。一方、カルシウム非存在下、非発現 s f — 9細胞ライセート（図中、コントロール s f — 9細胞ライセートと表示）およびカルパイン無添加（図中、対照と表示）ではいずれも. I P F— 1の分解が認められなかった。これら力、ら、 I P F— 1はヒト m—カルパインによりカルシウム存在下で分解されることが明らカこなった。

実施例 1 2 - (ィオノフォア添加によるヒト I P F— 1の分解）

細胞内における I P F— 1のカルパインによる分解を検討するため、カルシゥムィオノフォア添加による I P F— 1分解試験を実施した。ぐ方法 >

細胞数 0. 5 X 1 0⁶の HE K 293 T細胞を 3 7°Cにて 5 %C〇₂存在下で 2 4時間培養した後（直径 6 Ommシャーレ）、 2 _μ gの I P F_ 1発現プラスミド (実施 111 0参照）を FuGENE 6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n tを用いてトランスフエクシヨンした。 2日間培養後、ィオノフォア A23 1 8 7 ( S i g m a社） 1 0 μ g /m Lを添加した培地と交換し、 4時間培養した。陰性対照群は 0. 2% DM S〇含有培地と交換した。所定時間培養後、細胞を冷却した PB S (—）で洗浄し、 350 μ 1の低張細胞溶解バッファーに懸濁した後、氷上で 20分間放置した。細胞をホモジナイザーで破砕後、 4°Cにて 600 gで 10分間遠心処理し、その上清を細胞質画分、沈殿を核画分として回収した。核画分はさらに 2 X P B S/ 1 % ノニデット P— 40/0. 1 % S D Sからなる溶液に縣濁し、超音波処理にて破砕した。核画分および細胞画分は、等容量の 2 X SD S サンプルバッファーを加えて 5分間加熱後、 5— 2 0% SD S— PAGEにより分離した。 1 ? ー 1の検出は、実施例 1 0と同様の方法で行なった。

<結果 >

第 1 5図に示したように、ィオノフォア添加により I P F_ 1の分解が認められた。このことから、 I P F_ 1は、細胞内においてカルシウム濃度の上昇に伴い、カルシウムイオン依存性システィンプロテアーゼであるカルパインによって分解されたと考えられる。

産業上の利用可能性

本発明においては、転写因子としての作用を有する HNF— 4 a、 HNF— 1 αおよび I PF— 1カS、カルパインにより分解されることを見出したことに基づき、カルパインによるこれら転写因子の分解方法、分解阻害方法および分解阻害剤を提供した。これら転写因子は、鸱臓の細胞において転写因子ネットワークを形成しており、インシュリンゃ G L U T 2などの糖代謝関連遺伝子発現に関与していること、および遺伝性 2型糖尿病の原因遺伝子であることが知られている。これらから、カルパインの分解による糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子の減少や機能欠損は糖尿病の原因になると考えられる。したがって、本発明において提供する糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子分解阻害剤および Zまたは該転写因子分解阻害方法により、該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進、例えばィンシユリン遺伝子のィンシユリンの産生促進が可能になる。また、該転写因子が作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止および/または治療が可能になる。具体的には、例えばインシュリンの減少に起因する疾患、より具体的には糖尿病などの防止およぴノまたは治療が可能である。このように本発明は、糖代謝関連遺伝子発現に関与する転写因子の過剰な分解に起因する疾患の防止および/または治療のために非常に有用である。配列表フリーテキスト

配列番号 4 ：ヒト m—カルパインまたはゥサギ m _カルパインとヒト H N F— 4 a (配列番号 1 ) のローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、ヒト m —カルパインまたはゥサギ m—カルパインの部分ぺプチド。

配列番号 5 ：ヒト m—カルパインまたはゥサギ m—カルパインとヒト H N F— 4 a (配列番号 1 ) のローカルァライメントにおいて高いスコアを示す、ヒト H N F - 4 α (配列番号 1 ) の部分べプチド。

Claims

請求の範囲

1. カルシウムの存在下、カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法。

2. カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の転写因子分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法。

3. カルシウムの存在下、 m—カルパインおよび/または一カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを共存させることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解方法。

4. 糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよびィンシユリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、請求の範囲第 1項から第 3 項のいずれか 1項に記載の分解方法。

5. カルシウムの存在下、. m—カルパインおよび /または ^一カルパインとへパトサイトヌクレアーファクター 4 a (HN F - 4 a ) を共存させることを特徴とする、 HN F— 4 αの分解方法。

6. カルシウムの存在下、 m—カルパインおよび/または μ—カルパインとへパトサイトヌクレアーファクター 1 a (HN F - 1 a) を共存させることを特徴とする、 HN F— 1 ひの分解方法。

7. カルシウムの存在下、 m—カルパインおよび/または μ—カルパインとィンシュリンプ口モーターファクター 1 ( I P F— 1 ) を共存させることを特徴とする、 1 ? ー 1の分解方法。

8. カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

9. カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 0. カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 1. 少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを含む生体外試料をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 2. 少なくともカルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子とを発現している

'細胞をカルパイン活性を阻害する物質で処理することを特徴とする、糠代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 3. 細胞が哺乳動物に担持されている細胞である請求の範囲第 1 2項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 4. 哺乳動物に担持されている細胞が滕臓細胞である請求の範囲第 1 3項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 5. カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインインヒビターから選ばれる 1つ以上の物質である請求の範囲第 1 1項から第 14項のいずれか 1項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 6. 力ノレノヽ⁰ィンィンヒビターが、 N— Ac e t y 1一 L e u— L e u -M e t 一 CHO、 N— Ac e t y l— L e u— L e u— N l e _CH〇、 Z— L e u— L e u— Ty r— CH₂F、 Mu— Va 1— HP h— CH₂F、 4ーフノレォロフエニノレスノレホ二ノレ (F l u o r o p h e n y l s u l f o n y l ) 一 V a l— L e u— CHO、し 6 11— 1^ 6 11— 116—〇11₂。 1または2—

V a 1一 P h e— CHOである請求の範囲第 1 5項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 7. カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むぺプチドである請求の範囲第 1 1項から第 1 4項のいずれか 1項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

1 8. カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号 1カゝら 3のいずれかに記載のァミノ酸配列のうちの連続する 3つ以上のアミノ酸残基からなり、且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むぺプチドである請求の範囲第 1 1項から第 1 4項のいずれか 1項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

5 1 9. カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位が L e u

一 T y r、 L e u— M e t、 L e u— A r g、 V a l — T y r、 V a 1 _M e tおよび V a 1 — A r gからなる群より選ばれるものである請求の範囲第 1 8項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

2 0. カルパインが m—カルパインおよび/または μ—カルパインである請求 10 の範囲第 8項から第 1 9項のいずれか 1項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

2 1. 糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレアーファクター 4 «、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 aおよびィンシユリンプロモータ一フアクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、請求の範囲第 8項から第 2 15 0項のいずれか 1項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害方法。

2 2. m—カルパインおよび/または一カルパインの活性を阻害することを特徴とするへパトサイトヌクレアーファクター 4 の分解阻害方法。 —―

2 3. m—カルパインおよび/または μ—カルパインの活性を阻害することを特徴とするへパトサイトヌクレアーファクター 1 の分解阻害方法。

20 24. m—カルパインおよび/またはーカルパインの活性を阻害することを特徴とするインシュリンプロモーターファクター 1の分解阻害方法。

2 5. カルパインを活性成分として有効量含んでなる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤。

2 6. カルパインが m—カルパインおよび Zまたは一カルパインである請求 25 の範囲第 2 5項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤。

2 7. 糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレアーファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレアーファクタ一 1 αおよびィンシユリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、請求の範囲第 25項または第 26項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解剤。

28. m—カルパインおよび/または μ—カルパインを活性成分として有効量含んでなるへパトサイトヌクレアーファクター 4 の分解剤。

29. m—カルパインおょぴ Ζまたは μ—カルパインを活性成分として有効量含んでなるへパトサイトヌクレアーファクター 1 αの分解剤。

30. m—カルパインおよび Zまたは一カルパインを活性成分として有効量含んでなるインシュリンプロモーターファクター 1の分解剤。

3 1. カルパイン活性を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。

32. カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子切断を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。

33. カルパインと糖代謝関連遺伝子の転写因子との結合を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。

34. カルパイン活性を阻害する物質を活性成分として有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。

35. カルパイン活性を阻害する物質が、カルパインを認識する抗体、糖代謝関連遺伝子の転写因子を認識する抗体およびカルパインインヒビターから選ばれる 1つ以上の物質である請求の範囲第 34項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。

36. カルパインインヒビターが、 N— A c e t y 1一 L e u— L e u— M e t 一 CH〇、 N— A c e t y 1 — L e u— L e u— N I e— CHO、 Z - L e u_L e u— Ty r— CH₂F、 Mu— V a 1— HP h— CH₂F、 4—フルオロフェニルスノレホニル (F l u o r o p h e n y l s u l f o n y l ) ― V a l— L e u_CHO、 L e u— L e u_P h e— CH₂C 1または Z—

V a 1一 P h e _CHOである請求の範囲第 3 5項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。 ' 3 7 . カルパイン活性を阻害する物質がカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのァミノ酸配列を含むぺプチドである請求の範囲第 3 4項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解阻害剤。

3 8 . カルパイン活性を阻害する物質が、配列表の配列番号 1から 3のいずれか 5 に記載のアミノ酸配列のうちの連続する 3つ以上のアミノ酸残基からなり且つカルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位の少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むぺプチドである請求の範囲第 3 4項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。

3 9 . カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の切断認識部位が L e u 10 _ T y r、 L e u— M e t、 L e u— A r g、 V a l — T y r、 V a 1 — M e tおよび V a 1 - A r gからなる群より選ばれるものである請求の範囲第 3 8項に記載の糖代謝関連遺伝子の転写因子分解阻害剤。

4 0 . カルパインが m—カルパインおよび/または μ —カルパインである請求の範囲第 3 1項から第 3 9項のいずれか 1項に記載の糖代謝関連遺伝子の転 15 写因子分解阻害剤。

4 1 . 糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレアーファクター 4 _α、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 aおよぴィンシユリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つである、請求の範囲第 3 1項から第 4 0項のいずれか 1項に記載の分解阻害剤。

20 4 2 . m—カルパインおよび Zまたは μ —カルパインの活性を阻害することを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 ひ分解阻害剤。

4 3 . m—カルパインおよび/または μ—カルパインの活性を阻害することを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 1 ひ分解阻害剤。

4 4 . m—カルパインおよびノまたは μ —カルパインの活性を阻害することを 25 特徴とする、インシュリンプロモーターファクター 1分解阻害剤。

4 5 . 糖代謝関連遺伝子の転写因子をカルパインを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。

4 6 . カルパインが m—カルパインおよび/または μ—カルパインである請求の範囲第 4 5項に記載の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。

4 7 . へパトサイトヌクレア一ファクター 4 α、へパトサイトヌクレア一ファタター 1 αおよびィンシユリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの転写因子を m—カルパインおよび Zまたは; 一カルパインを用いて分解することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。

4 8 . 糖代謝関連遺伝子がィ,ンシユリン遺伝子またはグルコーストランスポーター 2遺伝子である請求の範囲第 4 5項から第 4 7項のいずれか 1項に記载の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生阻害方法。

4 9 . カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害することを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。

5 0 . カルパインが m—カルパインおよび Zまたは β一カルパインである請求の範囲第 4 9項に記載の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。

5 1 . m—カルパインおよび Zまたは μ—カルパインによるへパトサイトヌクレアーファクター 4ひ、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよびインシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解を阻害することを特徴とする糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。

5 2 . 糖代謝関連遺伝子がインシユリン遺伝子またはグルコーストランスポーター 2遺伝子である請求の範囲第 4 9項から第 5 1項のいずれか 1項に記載の糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。

5 3 . カルシウム濃度により糖代謝関連遺伝子の分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法。

5 4 . カルシウム濃度によりへパトサイトヌクレアーファクター 4ひ、へパトサイトヌクレアーファクター 1 ひおょぴィンシュリンプロモーターファタター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解程度を変えることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生調節方法。

5 5 . 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。

. 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4ひ、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 aおよびィンシユリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。

. 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、インシユリン遺伝子および/またはダルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。

. 請求の範囲第 8項から第 2 '4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法および/または治療方法。

. 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレア一ファクター 4、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 aおよびィンシュリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解に起因する疾患の防止方法および/または治療方法。

. 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および/または治療方法。

. 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 a、へパトサイトヌクレアーファタター 1 およびィンシュリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および Zまたは治療方法。

. 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、ィンシュリン遺伝子および Zまたはダルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および/または治療方法。

6 3 . 請求の範囲第 8項から第 2 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害方法を用いることを特徴とする、糖尿病の防止方法および/または治療方法。

6 4 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進方法。

6 5 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 αおよぴィンシユリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。

6 6 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、ィンシュリン遺伝子および/またはグルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の産生促進方法。

6 7 . 請求の範囲第 3 1項から第 4' 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止方法およひブまたは治療方法。

6 8 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 およびィンシユリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解に起因する疾患の防止方法および/または治療方法。

6 9 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および zまたは治療方法。

. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、へパトサイトヌクレアーファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレアーファクター 1 αおよびィンシュリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法および Ζまたは治療方法。

. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用いることを特徴とする、インシュリン遺伝子および/またはダルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止方法おょぴノまたは治療方法。

. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を用レ、ることを特徴とする、糖尿病の防止方法および/または治療方法。

. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物産生促進剤。. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレアーファクター 1 およびィンシュリンプロモーターファクター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤。

. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、ィンシュリン遺伝子および/またはグルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の産生促進剤。

. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる医薬組成物。

. 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解に起因する疾患の防止剤および/または治療剤。

7 8 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 α、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 およびィンシュリンプロモーターファタター 1から選ばれる少なくとも 1つの分解に起因する疾患の防止剤および/ または治療剤。

7 9 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖代謝関連遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

8 0 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、へパトサイトヌクレア一ファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 ひおよびインシュリンプロモーターファタター 1から選ばれる少なくとも 1つが転写因子として作用する遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および/または治療剤。

8 1 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、インシュリン遺伝子および/またはグルコーストランスポーター 2遺伝子の遺伝子産物の減少に起因する疾患の防止剤および Zまたは治療剤。

8 2 . 請求の範囲第 3 1項から第 4 4項のいずれか 1項に記載の転写因子分解阻害剤を有効量含んでなる、糖尿病の防止剤および Zまたは治療剤。

8 3 . 請求の範囲第 2 3項に記載の分解阻害方法を用いることを特徴とする、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止方法および/または治療方法。

8 4 . 請求の範囲第 4 3項に記載の分解阻害剤を用いることを特徴とする、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止方法および/または治療方法。

8 5 . 請求の範囲第 4 3項に記載の分解阻害剤を有効量含んでなる、肝細胞腺腫または肝細胞癌の防止剤および/または治療剤。

8 6 . カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子分解を阻害する化合物の同定方法であって、力ルパインによる該転写因子切断を可能にする条件下、力ルパインおよび Zまたは該転写因子と被検化合物を接触させ、力ルパインによる該転写因子の分解を検出するシグナルおよび Zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。

. カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインによる該転写因子の切断を可能にする条件下、カルパインおよび/または該転写因子と被検化合物を接触させ、該転写因子量または該転写因子分解物量を検出するシグナルおよび/またはマーカ一を使用する系を用い、このシグナルおよぴ Zまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインによる該転写因子の切断を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。

. カルパインによる糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解を阻害する化合物の同定方法であって、カルパインと該転写因子の結合を可能にする条件下、カルパインおよび/または該転写因子と被検化合物を接触させ、力ルパインと該転写因子の結合を検出するシグナルおよび/またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよびノまたはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、被検化合物がカルパインと該転写因子の結合を阻害するか否かを決定することを含む同定方法。

. カルパインが、 m—カルパインまたは μ —カルパインである請求の範囲第

8 6項から第 8 8項のいずれか 1項に記載の同定方法。

. 糖代謝関連遺伝子の転写因子が、へパトサイトヌクレアーファクター 4 ひ、へパトサイトヌクレア一ファクター 1 ひおよびインシュリンプロモーターフアクター 1から選ばれる少なくとも 1つである請求の範囲第 8 6項から第 8

9項のいずれか 1項に記載の同定方法。

. 請求の範囲第 8 6項から第 9 0項のいずれか 1項に記載の同定方法で同定された化合物。

. カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つと、カルパインにより分解される糖代謝関連遺伝子の転写因子、該転写因子をコードするポリヌクレオチドおよぴ該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つとを含んでなる試薬キット。 . カルパイン、カルパインをコードするポリヌクレオチドおよびカルパインをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つ、並びにへパトサイトヌクレアーファクター 4 α、へパトサイトヌクレアーファクター 1 αおよびィンシユリンプロモーターファクタ一 1およぴこれらいずれかをコードするポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか 1つを含んでなる試薬キッ卜。

. カルパインが、 m—カルパインまたは μ—カルパインである請求の範囲第 9 2項または第 9 3項に記載の試薬キット。