[go: up one dir, main page]

WO2004018707A2 - Method for identifying single nucleotide polymorphisms (snp) in genes which metabolize medicaments and test kit for carrying out said method - Google Patents

Method for identifying single nucleotide polymorphisms (snp) in genes which metabolize medicaments and test kit for carrying out said method Download PDF

Info

Publication number
WO2004018707A2
WO2004018707A2 PCT/DE2003/002699 DE0302699W WO2004018707A2 WO 2004018707 A2 WO2004018707 A2 WO 2004018707A2 DE 0302699 W DE0302699 W DE 0302699W WO 2004018707 A2 WO2004018707 A2 WO 2004018707A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fitc
allele
pcr
specific
labeled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2003/002699
Other languages
German (de)
French (fr)
Other versions
WO2004018707A3 (en
Inventor
Ralf Neunaber
Pavel Strohner
Joachim Schreiber
Gesine Voigt
Wolf-Hagen Schunck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOTEZ BERLIN-BUCH GmbH
Bio Tez Berlin Buch GmbH
Original Assignee
BIOTEZ BERLIN-BUCH GmbH
Bio Tez Berlin Buch GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOTEZ BERLIN-BUCH GmbH, Bio Tez Berlin Buch GmbH filed Critical BIOTEZ BERLIN-BUCH GmbH
Priority to AU2003269675A priority Critical patent/AU2003269675A1/en
Publication of WO2004018707A2 publication Critical patent/WO2004018707A2/en
Publication of WO2004018707A3 publication Critical patent/WO2004018707A3/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the subject matter of the invention is a set of substances and prescriptions - overall such a set is also referred to as a "kit” - which allows certain polymorphisms in the cytochrome P450 genes (CYP) of a person which are important for drug metabolism to be reliably detected by simple means.
  • kits which allows certain polymorphisms in the cytochrome P450 genes (CYP) of a person which are important for drug metabolism to be reliably detected by simple means.
  • Areas of application are molecular biology and medicine, especially medical diagnostics.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • a large part of the medications used today, especially those with a lipophilic character, are derived from the phase I enzymes of the biotransformation system, the cytochrome P450 Enzymes, metabolized [Gonzales, FJ, Pharmacological Reviews 40, (1989) 243-288; Guengerich et al., Journal of Biological Chemistry 266 (1991) 10019-10022].
  • cytochrome P450 enzymes are divided across families based on their amino acid sequence homology into families (homology> 40% - denoted with an Arabic numeral) and subfamilies (homology> 55% - denoted with a capital letter).
  • CYP2C9 is a family 2, subfamily C, isoform # 9 cytochrome [Nelson et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 1-42].
  • the sometimes extremely high sequence homology in genes of a subfamily must also be given priority when developing genotyping methods that are based on amplification of partial gene sequences.
  • the pseudogenes CYP2D7 and CYP2D8 are> 90% identical to CYP2D6. Reliable detection of individual alleles therefore requires reliable differentiation of the homologous genes (isoforms). Technically, this is possible using discriminatory PCR amplification methods.
  • CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 with their diverse allele variants are among the best characterized and most important for drug metabolism.
  • Experts estimate that these four isoenzymes together convert more than two thirds of all effective components of today's common drugs.
  • a clear compilation of the implemented pharmaceuticals can be found under [http://medicine.iupui.edu/flockhart/].
  • the alleles in the Caucasian population are CYP2C9 * 2, CYP2C9 * 3, CYP2C19 * 2, CYP2D6 * 3, CYP2D6 * 4, 2D6 * 5, 2D6 * 6 and other, less well-studied alleles of CYP2D6 of highest importance [Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59-124; Ingelman-Sundberg M. Toxicology Letters 102-103 (1998) 155-160; Marez et al. Pharmacogenetics 7 (1997) 193-202; De Morais et al. Mol. Pharmacol. 46: 594-598 (1994); Sachse et al.
  • allelic variants of CYP3A4 are currently the subject of intensive research [Eiselt et al. Pharmacogenetics 11 (2001) 447-458; Kuehl et al. Nature Genetics 27 (2001) 383-391; Westlind et al. Biochem. Biophys. Res. Cons. 259 (1999) 201-205].
  • Allelic variants of the cytochrome P450 isoenzymes involved in drug metabolism were initially detected with the aid of the sequence comparison of corresponding isolated cDNAs, or by direct sequencing of PCR fragments obtained from genomic DNA [Sullivan-Klose et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341-349; Wang et al. Pharmacogenetics 5 (1995) 37- 42; Inoue et al. Jpn. J. Hum. Genet. 39 (1994) 337-343].
  • a heterologous expression of pre-sequenced or modified cDNA's in suitable systems and subsequent in vitro characterization could then often prove a connection to drug metabolism [Haining et al. Arch. Biochem. Biophys. 333 (1996) 447-458].
  • Another method for identifying new SNPs uses the sequence-dependent mobility of single-stranded PCR products in urea-polyacrylamide gels to detect mutations [Stubbins et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 429-439 ; Daly et al. Methods Enzymol. 272 (1996) 199-210].
  • a method which has been used frequently in the past for the detection of SNPs is the so-called "Southern blot".
  • a further development of this principle are the "microarray" gene chip processes which are currently still being developed. Both processes are based on an allele-specific hybridization reaction on immobilized PCR fragments or detection probes. In the case of the "microarray” process, the areas of hybridization are by special occupancy processes sometimes only a few nm in diameter.
  • Another, increasingly used, method for the detection of SNPs makes use of the “matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry" (MALDI / TOF-MS).
  • this method also uses an isoform-specific PCR, a subsequent one Purification and allele detection using, for example, hybridized, synthetic oligonucleotides and the subsequent allele-specific incorporation of additional nucleotides by a DNA polymerase beforehand.
  • the sequencing method is comparatively very complex and particularly suitable for the identification of new SNPs. However, it does not detect duplications or deletions of complete genes.
  • the SSCP procedure can capture both and is therefore the method of choice for the early identification of SNPs, but also requires a lot of work or a high degree of automation and thus causes high costs.
  • the RFLP method often requires the replacement of additional nucleotides in the vicinity of the all-terminating position by means of PCR.
  • the digestion is also incomplete in some cases and requires additional validation by means of a positive control or cross-comparison with other alleles.
  • TaqMan technology (Applied Biosystems) - principle: fluorescence detection using a medium-sized hybridization probe.
  • the alley is detected via the 5'-3 'exonuclease activity of a DNA polymerase, which releases quenched 5'-terminal fluorophores (FAM and VIC TM) on perfectly fitting primers. Mismatched primers are released completely intact (i.e. quenched) by the DNA polymerase under the selected conditions, while properly paired primers are released in the unquenched, fluorescent state.
  • FAM and VIC TM quenched 5'-terminal fluorophores
  • the GeneChip CYP450 assay (Affimetrix) is based on a hybridization reaction of allele-specific probes that are immobilized on a “microarray chip” with fluorophore-labeled amplicons.
  • the labeled amplicon is derived from an upstream multiplex PCR, which is intended to ensure isoform-specific amplification via intron-localized primers CYP2C9 * 2 and * 3, as well as 10 alleles of the gene CYP2D6 (from exon 1-9) are offered as complete approaches.
  • the use of this technology requires the very cost-intensive GeneChip Instrument System, as well as the associated GeneChips, reagents - and primer kits.
  • the Code Link TM P450 method (Motorola) is based on the same detection principle as the Affimetrix chip, but uses the detection of 75 CYP450 SNPs (CYP2D6, -2C19, -1A1.1-A2, -2E1, -3A4 and -1B1) a glass slide. It also requires the additional purchase of the very expensive instrumentation and of course the associated reagents and primer kits.
  • the Pharm-O-Kin chip from GenScan Diagnostics is a gene chip based on a glass slide and detects 36 SNP's different P450 isoenzymes as well as other genes relevant for drug transport (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, as well as NAT2 and MDR1).
  • Orchid's SNP-IT system is a device system that was explicitly developed for the medium to high throughput of SNP detection on PCR amplicons. It essentially consists of a robot, which should automatically process the samples, detect the alleles (a wide variety of technologies such as gene chip hybridization assays, sequencing, etc. can be integrated) and perform data analysis (along with statistics). The acquisition costs for these complex devices are correspondingly high.
  • the SureScore TM system from Invitrogen is a SNP detection system based on 96 well plates.
  • the basic technology is the specific incorporation of labeled (biotin or FITC) dideoxynucleotides on a single-stranded, complementary PCR product matrix by a DNA polymerase at the SNP position.
  • the subsequent detection is carried out by a marker-specific antibody that catalyzes a color reaction via a coupled enzyme.
  • the invention is therefore based on the object of developing such a method and at the same time making a test kit available for carrying out the method
  • the invention is implemented according to the claims. It concerns a simplified procedure for the detection of SNP in human CYP genes and a test kit with the following components:
  • Newly developed synthetic oligonucleotides preferably oligonucleotides from Appendix 1, which are suitable for amplifying gene sections in genes of drug metabolism with the aid of the “DNA polymerase chain reaction” technology (PCR) isoform-specifically (IS-PCR) from genomic leukocyte DNA,
  • PCR DNA polymerase chain reaction
  • IS-PCR isoform-specifically
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • SA-MTP's from streptavidin-coated glass slides (SA chip) on which biotinated, isoform-specific, synthetic oligonucleotides are immobilized, which are hybridized with partially single-stranded PCR products which are discriminated by the extension of an allele-specific, terminally FITC-labeled oligonucleotide using Taq DNA polymerase were generated and, by subsequent stringent washing and subsequent detection using fluorometry or photometry, ensure reliable genotyping of the hybridized amplicons.
  • the invention described here makes it possible to collect the therapeutically important findings for individual equipping with the various CYP alleles, even in a few individual patients with low personnel and material costs.
  • the invention uses highly gene-specific oligonucleotide primers, preferably oligonucleotides from Appendix 1, for flanking regions of the allele-determining gene segments in order to amplify them from a background of very homologous cytochromes of the same subfamily by means of discriminatory PCR.
  • the following allele detection can be done using two different methods:
  • biotinated gene-specific oligonucleotides are immobilized on defined spots of a glass slide coated with streptavidin, and the partially single-stranded duplexes are subsequently immobilized with the gene-specific Oligonucleotides hybridized and freed from stringent washing of non-extended, 5'-FITC labeled oligonucleotide primers.
  • the primers and probes used according to the invention enable highly selective allele detection of genomic DNA within a few hours
  • test is carried out as a multiple assay, in which a plurality of individual alleles are detected simultaneously in a specially adapted protocol run on an MTP or several glass object carriers, and
  • Samples consisting of genetically engineered plasmid DNA (pDNA), preferably the plasmid DNA sequences of Appendix 1, which contain allele-specific fragments of CYP gene segments, can be carried as internal controls.
  • pDNA genetically engineered plasmid DNA
  • Appendix 1 plasmid DNA sequences of Appendix 1, which contain allele-specific fragments of CYP gene segments
  • Genomic DNA can be isolated from leukocytes of human blood using standard methods already described (Vogelstein B. and Gillespie D. PNAS, (1979) 76: 615-9).
  • a gDNA concentration of 5-50 ng / ul should be aimed for in order to present a sufficient number of copies when using 0.5-1 ⁇ l gDNA / PCR.
  • the quality of the gDNA can be of crucial importance for the effectiveness of the entire assay and therefore the quality and concentration should be as constant as possible.
  • a 10-fold concentrated polymerase buffer e.g. 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM KCI, 15 mM MgCI); 0.08 ⁇ l dNTP (62.5 mM each); 0.5 ⁇ l each of the 50 ⁇ M primer SP2C9201 (SEQ ID NO 1) and the 5 ′ biotinated primer RP2C9201 (SEQ ID NO 2); 0.5 ul Taq DNA polymerase (5U / ul), 1 ul gDNA; and 16.34 ⁇ l bidest suitable for PCR in a double batch pipetted into PCR tubes.
  • the tubes are then transferred to a commercially available PCR device and subjected to the following PCR regime:
  • samples consisting of genetically engineered plasmid DNA which contain allele-specific fragments of the gene segment CYP2C9 * 2 (SEQ ID NO 38) and the corresponding segment of the wild-type gene CYP2C9 * 1 (SEQ ID NO 37), were also used as internal controls in duplicate carried.
  • the resulting amplification products can be separated by agarose gel electrophoresis in 3.5% agarose gels at 5-10 V / cm gel width for 1-1 1/2 hours and visualized and documented using DNA markers and ethidium bromide staining under UV light.
  • TE-NaCI 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl
  • SDS-WP 0.1 x SSC; 0.1% SDS
  • TE-lysine 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% lysine (w / v)
  • TE-RSA 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.05%
  • Bovine serum albumin (w / v) TE-Tween: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1M EDTA; 100 mM NaCl; 0.1% tween
  • hybridization probes final concentration - 0.5 - or 1 nM prediluted in HP (hybridization buffer) are added to each of the double batches, hybridized for 20 minutes at 37 ° C. and then aspirated.
  • the pDNA contains all-specific fragments of the gene section CYP2C19 * 3 (SEQ ID NO 44) or the corresponding section of the wild-type gene CYP2C19 * 1 (SEQ ID NO 43).
  • a 10-fold concentrated polymerase buffer e.g.
  • TE-NaCI 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl
  • SDS-WP 0.1 x SSC; 0.1% SDS
  • TE-lysine 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% lysine (w / v)
  • TE-RSA 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.05%
  • Bovine serum albumin (w / v) TE-Tween: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.1% tween
  • a SA chip equipped with 32-64 reaction areas (spots) is provided with 3 ⁇ l / spot of a 5 'biotinated 500 pM oligos dissolved in TE-NaCI with the designation B2C193_F (SEQ ID NO 58), 15 minutes at RT incubated in a humidity chamber, then aspirated, washed once with 6 ⁇ SSC at RT.
  • 0.25 ⁇ l of the amplification products obtained in Example 3 are mixed with 1.5 ⁇ l 12 ⁇ SSC, made up to 3 ⁇ l total volume with ddH 2 0, after aspirating the 6 ⁇ SSC buffer in triplicate, pipetted onto individual spots, 30 minutes at RT hybridized with saturated humidity and then aspirated.
  • CYP2C19 * 1 is genetically engineered, double-stranded plasmid DNA with the contained sequence for CYP2C19 WT (SEQ ID NO 43) and accordingly for CYP2C19 * 3 (SEQ ID NO 44);
  • FITC probe 5 'fluoroescein labeled oligonucleotide;
  • Match / Mismatch (Mw) quotient of the average score from 100% complementary and non-complementary allele probe hybrid;
  • nx PE number (s) of FITC primer extension cycles performed.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to a simplified method for identifying SNP in human cytochrome P450 (CYP) genes and to a test kit comprising the following components: 1. Novel synthetic oligonucleotides, suitable for amplifying gene segments in genes that metabolize medicaments, with the aid of isoform-specific (IS-PCR) DNA polymerase chain reaction technology (PCR), from genomic leukocyte DNA, 2. Components enabling the selective, thermostable, single-stranded immobilization of biotinated IS-PCR products on microplates coated with streptavidin (SA-MTP), 3. Test optimized, allele-specific, fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled synthetic oligonucleotides, which guarantee a reliable genotyping of the immobilized amplification products (amplicons), by hybridization, subsequent stringent washing and finally detection using fluorometry or photometry, or alternatively 4. Streptavidin coated glass object carrier (SA chip), on which biotinated, isoform-specific, synthetic oligonucleotides are immobilized, which are hybridized with partially single-stranded PCR products that have been produced by a discriminatory extension of an allele-specific, terminally FITC labeled oligonucleotide using Taq DNA Polymerase and which guarantee a reliable genotyping of the immobilized amplicons by subsequent stringent washing and finally detection using fluorometry or photometry. In comparison with the known high-throughput method, said invention enables clinical findings, which are of therapeutic importance for an individual provision of the different CYP alleles, to be established at low cost in terms of personnel and resources, even for small numbers of individual patients.

Description

VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON EINZELNUKLEOTID-POLYMORPHISMEN (SNP) IN GENEN DES ARZNEIMITTELMETABOLISMUS UND TESTKIT ZUR DURCHFÜHRUNG DES VERFAHRENSMETHOD FOR DETECTING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS (SNP) IN GENES OF MEDICINAL METABOLISM AND TEST KIT FOR CARRYING OUT THE METHOD

BESCHREIBUNGDESCRIPTION

Gegenstand der Erfindung ist ein Satz von Substanzen und Vorschriften - insgesamt wird ein solcher Satz auch als „Kit" bezeichnet - der es gestattet, bestimmte, für den Arzneimittelmetabolismus wichtige Polymorphismen in den Cytochrom P450 Genen (CYP) eines Menschen mit einfachen Mitteln zuverlässig nachzuweisen. Anwendungsgebiete sind die Molekularbiologie und die Medizin, insbesondere die medizinische Diagnostik.The subject matter of the invention is a set of substances and prescriptions - overall such a set is also referred to as a "kit" - which allows certain polymorphisms in the cytochrome P450 genes (CYP) of a person which are important for drug metabolism to be reliably detected by simple means. Areas of application are molecular biology and medicine, especially medical diagnostics.

Polymorphismen in Genen des Arzneimittelmetabolismus stehen mit dem Fortschritt bei der Erforschung der Beziehungen zwischen genetischer Diversität und Arzneimittelunverträglichkeiten im Mittelpunkt des Interesses. Das gilt im besonderen für bestimmte Einzelnukleotidpolymorphismen („Single nucleotide polymorphisms"- SNP's) an Genen des sogenannten Biotransformationssystems. Ein großer Teil der heute verwendeten Medikamente, vor allem solche mit lipophilem Charakter, werden von den Enzymen der Phase I des Biotransformationssystems, den Cytochrom P450 Enzymen, metabolisiert [Gonzales, F. J., Pharmacological Reviews 40, (1989) 243- 288; Guengerich et al., Journal of Biological Chemistry 266 (1991 ) 10019-10022]. Als Folge dieser enzymatischen Reaktionen werden je nach chemischer Struktur des Medikaments, nach Art und Genotyp des Cytochrom P450 Isoenzyms oder infolge nachgeschalteter sogenannter Phase II Enzyme (NAT I u. II, GSTM u. a.) [Brockmüller et al. Toxicology Letters 102-103 (1998) 173-183] die Medikamente entweder physiologisch aktiviert, oder sie werden inaktiviert und zur Ausscheidung vorbereitet. Polymorphismen an diesen Genen sind in der Bevölkerung relativ weit verbreitet und führen zu erheblichen individuellen Unterschieden in den Umsatzraten der betroffenen Arzneimittel. In der Konsequenz können je nach Medikament und Allel individuelle Über- oder Unterdosierungen die Folge sein. Es können sich unerwünschte Nebenwirkungen einstellen, oder aber eine Wirkung kann ganz ausbleiben [Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59-124; Ingelman-Sundberg M. Toxicology Letters 102-103 (1998) 155-160]. Die genaue Kenntnis der genetischen Prädisposition eines Patienten zu solcherart verändertem Arzneimittelstoffwechsel ist dementsprechend für seine individuelle Arzneimitteltherapie von entscheidender Bedeutung. Als Folge konsequenter Genotypisierung von Patienten mit erhöhtem Risiko (z.B. von chronisch kranken Patienten, oder von solchen mit einer entsprechenden Familienanamnese) sind erheblich verminderte Nebenwirkungsrisiken, Kosteneinsparungen, aber auch völlig neuartige Medikationsstrategien denkbar. Praktische Voraussetzung für eine konsequente Genotypisierung vieler einzelner Patienten ist jedoch ein kostengünstiges und zuverlässiges Genotypisierungsverfahren.With progress in researching the relationships between genetic diversity and drug intolerance, polymorphisms in drug metabolism genes are the focus of interest. This applies in particular to certain single nucleotide polymorphisms ("SNPs") on genes of the so-called biotransformation system. A large part of the medications used today, especially those with a lipophilic character, are derived from the phase I enzymes of the biotransformation system, the cytochrome P450 Enzymes, metabolized [Gonzales, FJ, Pharmacological Reviews 40, (1989) 243-288; Guengerich et al., Journal of Biological Chemistry 266 (1991) 10019-10022]. As a result of these enzymatic reactions, depending on the chemical structure of the drug, according to the type and genotype of the cytochrome P450 isoenzyme or as a result of so-called phase II enzymes (NAT I and II, GSTM and others) [Brockmüller et al. Toxicology Letters 102-103 (1998) 173-183], the drugs either physiologically activated or they are inactivated and prepared for excretion, polymorphisms on these genes are relatively widespread in the population and lead to significant individual differences in the sales rates of the medicinal products concerned. As a consequence, individual overdoses or underdoses can result depending on the medication and allele. Undesirable side effects may occur, or an effect may not occur completely [Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59-124; Ingelman-Sundberg M. Toxicology Letters 102-103 (1998) 155-160]. The exact Knowledge of the genetic predisposition of a patient to such a changed drug metabolism is accordingly of crucial importance for his individual drug therapy. As a consequence of the consequent genotyping of patients with an increased risk (e.g. of chronically ill patients or of those with a corresponding family history), considerably reduced risk of side effects, cost savings, but also completely new medication strategies are conceivable. However, a practical prerequisite for consistent genotyping of many individual patients is an inexpensive and reliable genotyping process.

Die Cytochrom P450 Enzyme werden artübergreifend anhand ihrer Aminosäuresequenzhomologie in Familien (Homologie >40% - bezeichnet mit einer arabischen Ziffer) und Subfamilien (Homologie >55% - bezeichnet mit einem Großbuchstaben) unterteilt. Zum Beispiel ist CYP2C9 ein Cytochrom der Familie 2, Subfamilie C, Isoform Nr. 9 [Nelson et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 1-42]. Die zum Teil extrem hohe Sequenzhomologie bei Genen einer Subfamilie muß bei der Entwicklung von Genotypisierungsverfahren, die auf einer Amplifikation von Genteilsequenzen beruhen, denn auch vorrangig berücksichtigt werden. So sind die Pseudogene CYP2D7 und CYP2D8 zu >90% identisch mit CYP2D6. Ein sicherer Nachweis einzelner Allele setzt somit eine sichere Differenzierung der homologen Gene (Isoformen) voraus. Technisch ist dies durch diskriminierende PCR Amplifikationsverfahren möglich.The cytochrome P450 enzymes are divided across families based on their amino acid sequence homology into families (homology> 40% - denoted with an Arabic numeral) and subfamilies (homology> 55% - denoted with a capital letter). For example, CYP2C9 is a family 2, subfamily C, isoform # 9 cytochrome [Nelson et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 1-42]. The sometimes extremely high sequence homology in genes of a subfamily must also be given priority when developing genotyping methods that are based on amplification of partial gene sequences. The pseudogenes CYP2D7 and CYP2D8 are> 90% identical to CYP2D6. Reliable detection of individual alleles therefore requires reliable differentiation of the homologous genes (isoforms). Technically, this is possible using discriminatory PCR amplification methods.

Zu den am besten charakterisierten und für den Arzneimittelmetabolismus bedeutendsten Cytochromen gehören CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4 mit ihren diversen Allelvarianten. [Zu Übersicht und neuestem Stand der bekannten Polymorphismen menschlicher Cytochrom P450 Enzyme siehe [http://www.imm.ki.se/CYPalleles/]. Diese vier Isoenzyme zusammen setzen nach Schätzungen von Experten mehr als zwei Drittel aller wirksamen Bestandteile der heute gängigen Medikamente um. [Eine übersichtliche Zusammenstellung der umgesetzten Pharmazeutika findet sich unter [http://medicine.iupui.edu/flockhart/]. Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, sind in der kaukasischen Bevölkerung die Allele CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, CYP2D6*3, CYP2D6*4, 2D6*5, 2D6*6 sowie weitere, weniger gut untersuchte Allele von CYP2D6 von größter Bedeutung [Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59-124; Ingelman- Sundberg M. Toxicology Letters 102-103 (1998) 155-160; Marez et al. Pharmacogenetics 7 (1997) 193-202; De Morais et al. Mol. Pharmacol. 46 (1994) 594-598; Sachse et al. Am. J. Hum. Genet. 60 (1997) 284-295; Wrighton SA and Stevens JC. Grit. Rev. Toxicol. 22 (1992) 1-21 ; Cholerton et al. Trends Pharmacol. Sei. 13 (1992) 434-439; Saxena et al. Hum. Mol. Genet. 3 (1994) 923-926; Steen et al. Hum. Mol. Genet. 4 (1995) 2251-2257].CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 and CYP3A4 with their diverse allele variants are among the best characterized and most important for drug metabolism. [For an overview and the latest status of the known polymorphisms of human cytochrome P450 enzymes, see [http://www.imm.ki.se/CYPalleles/]. Experts estimate that these four isoenzymes together convert more than two thirds of all effective components of today's common drugs. [A clear compilation of the implemented pharmaceuticals can be found under [http://medicine.iupui.edu/flockhart/]. As shown in Table 1, the alleles in the Caucasian population are CYP2C9 * 2, CYP2C9 * 3, CYP2C19 * 2, CYP2D6 * 3, CYP2D6 * 4, 2D6 * 5, 2D6 * 6 and other, less well-studied alleles of CYP2D6 of highest importance [Wormhoudt et al. Critical Reviews in Toxicolgy 29 (1999) 59-124; Ingelman-Sundberg M. Toxicology Letters 102-103 (1998) 155-160; Marez et al. Pharmacogenetics 7 (1997) 193-202; De Morais et al. Mol. Pharmacol. 46: 594-598 (1994); Sachse et al. At the. J. Hum. Genet. 60: 284-295 (1997); Wrighton SA and Stevens JC. Grit. Rev. Toxicol. 22 (1992) 1-21; Cholerton et al. Trends Pharmacol. Be. 13 (1992) 434-439; Saxena et al. Hum. Mol. Genet. 3 (1994) 923-926; Steen et al. Hum. Mol. Genet. 4 (1995) 2251-2257].

Tabelle 1Table 1

Wichtige allele Varianten humaner Cytochrom P450 Isoenzyme, ihre Enzymaktivität und ihre Häufigkeit (%) in der kaukasischen BevölkerungImportant allelic variants of human cytochrome P450 isoenzymes, their enzyme activity and their frequency (%) in the Caucasian population

Allel Enzymaktivität Häufigkeit ReferenzAllele enzyme activity frequency reference

CYP2C9*2 Vermindert 16 Ingelman-Sundberg (1998)CYP2C9 * 2 Decreased 16 Ingelman-Sundberg (1998)

CYP2C9*3 Vermindert 6 Ingelman-Sundberg (1998)CYP2C9 * 3 Reduced 6 Ingelman-Sundberg (1998)

CYP2C19*2 Keine 10 Ingelman-Sundberg (1998)CYP2C19 * 2 None 10 Ingelman-Sundberg (1998)

CYP2D6*3 Keine 2 Sachse et al. (1997)CYP2D6 * 3 None 2 Sachse et al. (1997)

CYP2D6*4 Keine 23 Marez et al. (1997)CYP2D6 * 4 None 23 Marez et al. (1997)

CYP2D6*5 Keine 2-5 Steen et al. (1995), Sachse et al. (1997)CYP2D6 * 5 None 2-5 Steen et al. (1995), Sachse et al. (1997)

CYP2D6*6 Keine 1-2 Saxena et al. (1994), Sachse et al. (1997)CYP2D6 * 6 None 1-2 Saxena et al. (1994), Sachse et al. (1997)

Die klinische Relevanz der allelen Varianten von CYP3A4 ist zur Zeit Gegenstand intensiver Forschung [Eiselt et al. Pharmacogenetics 11 (2001) 447-458; Kuehl et al. Nature Genetics 27 (2001) 383-391; Westlind et al. Biochem. Biophys. Res. Comun. 259 (1999) 201-205].The clinical relevance of the allelic variants of CYP3A4 is currently the subject of intensive research [Eiselt et al. Pharmacogenetics 11 (2001) 447-458; Kuehl et al. Nature Genetics 27 (2001) 383-391; Westlind et al. Biochem. Biophys. Res. Comun. 259 (1999) 201-205].

Der Nachweis alleler Varianten der am Arzneimittelmetabolismus beteiligten Cytochrom P450 Isoenzyme erfolgte anfänglich mit Hilfe des Sequenzvergleichs entsprechender isolierter cDNA's, oder durch direkte Sequenzierung von aus genomischer DNA gewonnenen PCR Fragmenten [Sullivan-Klose et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341-349 ; Wang et al. Pharmacogenetics 5 (1995) 37- 42 ; Inoue et al. Jpn. J. Hum. Genet. 39 (1994) 337-343]. Durch heterologe Expression vorsequenzierter oder modifizierter cDNA's in geeigneten Systemen und anschließende in vitro Charakterisierung konnte dann oft ein Zusammenhang zum Arzneimittelmetabolismus belegt werden [Haining et al. Arch. Biochem. Biophys. 333 (1996) 447-458]. Ein weiteres Verfahren zur Identifikation neuer SNP's - das SSCP („Single Strand conformational polymorphisms") Verfahren - nutzt die sequenzabhängig unterschiedliche Mobilität von einzelsträngigen PCR Produkten in Harnstoff-Polyacrylamidgelen zum Nachweis von Mutationen [Stubbins et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 429-439; Daly et al. Methods Enzymol. 272 (1996) 199- 210].Allelic variants of the cytochrome P450 isoenzymes involved in drug metabolism were initially detected with the aid of the sequence comparison of corresponding isolated cDNAs, or by direct sequencing of PCR fragments obtained from genomic DNA [Sullivan-Klose et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341-349; Wang et al. Pharmacogenetics 5 (1995) 37- 42; Inoue et al. Jpn. J. Hum. Genet. 39 (1994) 337-343]. A heterologous expression of pre-sequenced or modified cDNA's in suitable systems and subsequent in vitro characterization could then often prove a connection to drug metabolism [Haining et al. Arch. Biochem. Biophys. 333 (1996) 447-458]. Another method for identifying new SNPs - the SSCP ("Single Strand conformational polymorphisms") method - uses the sequence-dependent mobility of single-stranded PCR products in urea-polyacrylamide gels to detect mutations [Stubbins et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 429-439 ; Daly et al. Methods Enzymol. 272 (1996) 199-210].

Das zur Zeit neben der Sequenzierung am häufigsten genutzte Verfahren zum Nachweis von SNP's ist die „Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus" (RFLP) Analyse [Sullivan et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341-349; Wang et al. Pharmacogenetics 5 (1995) 37-42]. Durch Einführung der MADGE (microplate array diagonal gel electrophoresis) Technologie [Day and Humphries Anal. Biochem. 222 (1994) 389-395] wurde es möglich, RFLP oder ARMS (amplification refractory mutation System) [Newton et al. Nucleic Acid Res. 17 (1989) 2503-2516) im 96 Kammer (96 well) Format durchzuführen. Ein in der Vergangenheit oft eingesetztes Verfahren für den Nachweis von SNP's ist der sogenannte „Southern blot". Eine Weiterentwicklung dieses Prinzips sind die zur Zeit noch in der Entwicklung befindlichen „Microarray" Gen Chip Verfahren. Beide Verfahren beruhen auf einer allelspezifischen Hybridisierungsreaktion an immobilisierten PCR Fragmenten, oder Detektionssonden. Im Falle des „Microarray" Verfahrens sind die Areale der Hybridisierung durch spezielle Belegungsverfahren zum Teil nur wenige nm im Durchmesser. Ein anderes, zunehmend eingesetztes, Verfahren zum Nachweis von SNP's macht von der „matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry" (MALDI/TOF-MS) Gebrauch. Dieses Verfahren setzt jedoch ebenfalls eine isoformspezifische PCR, eine anschließende Aufreinigung und den Allelnachweis mittels z.B. hybridisierter, synthetischer Oligonukleotide und den nachfolgenden, allelspezifischen Einbau zusätzlicher Nukleotide durch eine DNA Polymerase voraus.In addition to sequencing, the most frequently used method for the detection of SNPs at the moment is the "restriction fragment length polymorphism" (RFLP) analysis [Sullivan et al. Pharmacogenetics 6 (1996) 341-349; Wang et al. Pharmacogenetics 5 ( 1995) 37-42]. By introducing MADGE (microplate array diagonal gel electrophoresis) technology [Day and Humphries Anal. Biochem. 222 (1994) 389-395] it became possible to use RFLP or ARMS (amplification refractory mutation system) [Newton et al. Nucleic Acid Res. 17 (1989) 2503-2516) in the 96 chamber (96 well) format. A method which has been used frequently in the past for the detection of SNPs is the so-called "Southern blot". A further development of this principle are the "microarray" gene chip processes which are currently still being developed. Both processes are based on an allele-specific hybridization reaction on immobilized PCR fragments or detection probes. In the case of the "microarray" process, the areas of hybridization are by special occupancy processes sometimes only a few nm in diameter. Another, increasingly used, method for the detection of SNPs makes use of the "matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry" (MALDI / TOF-MS). However, this method also uses an isoform-specific PCR, a subsequent one Purification and allele detection using, for example, hybridized, synthetic oligonucleotides and the subsequent allele-specific incorporation of additional nucleotides by a DNA polymerase beforehand.

Das Sequenzierverfahren ist vergleichsweise sehr aufwendig und insbesondere für die Identifizierung neuer SNP's geeignet. Es erfaßt aber weder Duplikationen noch Deletionen kompletter Gene. Das SSCP Verfahren kann zwar beides erfassen und ist daher für die frühe Identifikation von SNP's das Verfahren der Wahl, erfordert jedoch ebenfalls einen hohen Arbeitsaufwand, bzw. einen hohen Automatisierungsgrad und verursacht somit hohe Kosten. Das RFLP Verfahren macht oft mangels geeigneter Restriktionsorte den Austausch zusätzlicher Nukleotide in der Umgebung der alleldeterminierenden Position mittels PCR nötig. Auch ist der Verdau in einigen Fällen nur unvollständig und erfordert eine zusätzliche Validierung mittels Positivkontrolle bzw. Kreuzvergleich mit anderen Allelen. Die auf der allelspezifischen Hybridisierung aufbauenden Verfahren (TaqMan™; Dash™; GeneChip®; Code Link™) stellen eine echte Alternative für den Nachweis bekannter SNP's dar. Im Falle der „Microarray" (GeneChip®; Code Link™) Technologie entsteht jedoch ein besonderes Problem aus dem Anspruch dieser Technologieplattform, große Mengen an Sequenzdaten von nur einem Chip zu erhalten. Mit der Menge steigt die Schwierigkeit, ein gemeinsames Regime für alle auf dem Chip nachzuweisenden Allele zu etablieren. Es werden umfangreiche Kontrollen sowie aufwendige und komplizierte Auswertesysteme erforderlich und somit steigen die Kosten. Für die klinische Diagnostik, sowie für klinische Studien mit vordefinierten, eingegrenzten, objektspezifischen Allelen bietet sich somit eher ein sogenannter „low density Chip" in Form eines Glasobjekträgers mit 32 bis maximal 384 möglichen spezifischen Arealen (spots) an.The sequencing method is comparatively very complex and particularly suitable for the identification of new SNPs. However, it does not detect duplications or deletions of complete genes. The SSCP procedure can capture both and is therefore the method of choice for the early identification of SNPs, but also requires a lot of work or a high degree of automation and thus causes high costs. Due to the lack of suitable restriction sites, the RFLP method often requires the replacement of additional nucleotides in the vicinity of the all-terminating position by means of PCR. The digestion is also incomplete in some cases and requires additional validation by means of a positive control or cross-comparison with other alleles. The methods based on the allele-specific hybridization (TaqMan ™; Dash ™; GeneChip ® ; Code Link ™) represent a real alternative for the detection of known SNPs. However, in the case of "microarray" (GeneChip ® ; Code Link ™) technology arises A particular problem arising from the claim of this technology platform to obtain large amounts of sequence data from just one chip. The amount increases the difficulty in establishing a common regime for all alleles to be detected on the chip. Extensive controls and complex and complex evaluation systems are required and For clinical diagnostics as well as for clinical studies with predefined, limited, object-specific alleles, a so-called "low density chip" in the form of a glass slide with 32 to a maximum of 384 possible specific areas (spots) is more appropriate.

Zur Zeit werden Komplettlösungen für den Nachweis von SNP's in Arzneimittel metabolisierenden Genen nur von wenigen Firmen angeboten:At the moment, only a few companies offer complete solutions for the detection of SNPs in genes that metabolize drugs:

• TaqMan Technologie (Applied Biosystems) - Prinzip: Fluoreszenzdetektion mittels mittelständiger Hybridisierungssonde. Der Nachweis des Alleis geschieht über die 5'-3' Exonucleaseaktivität einer DNA Polymerase, welche an perfekt passenden Primern gequenchte 5'endständige Fluorophore (FAM und VIC™) freisetzt. Fehlgepaarte Primer werden von der DNA Polymerase unter den gewählten Bedingungen vollständig intakt (also gequencht) freigesetzt, während richtig gepaarte Primer im ungequenchten, fluoreszierenden Zustand freigesetzt werden. Für CYP2C9*2 und *3; CYP2C19*2 und *3; CYP2D6 * 3, *4, *6, *7 und *8 wird je ein kompletter Kit angeboten. Voraussetzung für den Einsatz dieser Technologie ist jedoch die Anschaffung eines TaqMan Gerätes, sowie der dazugehörigen Zusatzausrüstung. • Der GeneChip CYP450 Assay (Affimetrix) beruht auf einer Hybridisierungsreaktion von allelspezifischen, endständig auf einem „Microarray Chip" immobilisierten Sonden mit Fluorophor markierten Amplikons. Das markierte Amplikon leitet sich aus einer vorgeschalteten Multiplex PCR ab, die über intronlokalisierte Primer eine isoformspezifische Amplifikation gewährleisten soll. Angeboten werden CYP2C9 *2 und *3, sowie 10 Allele des Gens CYP2D6 (von Exon 1-9) als Komplettansätze. Voraussetzung für den Einsatz dieser Technologie ist jedoch die Anschaffung des sehr kostenintensiven GeneChip Instrument Systems, sowie der dazugehörigen GeneChips, Reagenzien - und Primer Kits.• TaqMan technology (Applied Biosystems) - principle: fluorescence detection using a medium-sized hybridization probe. The alley is detected via the 5'-3 'exonuclease activity of a DNA polymerase, which releases quenched 5'-terminal fluorophores (FAM and VIC ™) on perfectly fitting primers. Mismatched primers are released completely intact (i.e. quenched) by the DNA polymerase under the selected conditions, while properly paired primers are released in the unquenched, fluorescent state. For CYP2C9 * 2 and * 3; CYP2C19 * 2 and * 3; CYP2D6 * 3, * 4, * 6, * 7 and * 8 a complete kit is offered. However, the use of this technology requires the purchase of a TaqMan device and the associated additional equipment. • The GeneChip CYP450 assay (Affimetrix) is based on a hybridization reaction of allele-specific probes that are immobilized on a “microarray chip” with fluorophore-labeled amplicons. The labeled amplicon is derived from an upstream multiplex PCR, which is intended to ensure isoform-specific amplification via intron-localized primers CYP2C9 * 2 and * 3, as well as 10 alleles of the gene CYP2D6 (from exon 1-9) are offered as complete approaches. However, the use of this technology requires the very cost-intensive GeneChip Instrument System, as well as the associated GeneChips, reagents - and primer kits.

• Das Code Link™ P450 Verfahren (Motorola) basiert auf demselben Nachweisprinzip wie der Affimetrix Chip, setzt jedoch den Nachweis von 75 CYP450 SNPs (CYP2D6, -2C19, -1A1.1-A2, -2E1, -3A4 und -1B1) auf einem Glasobjektträger um. Es erfordert ebenfalls die zusätzliche Anschaffung der sehr kostenintensiven Instrumentierung sowie natürlich der dazugehörigen Reagenzien und Primer Kits.• The Code Link ™ P450 method (Motorola) is based on the same detection principle as the Affimetrix chip, but uses the detection of 75 CYP450 SNPs (CYP2D6, -2C19, -1A1.1-A2, -2E1, -3A4 and -1B1) a glass slide. It also requires the additional purchase of the very expensive instrumentation and of course the associated reagents and primer kits.

• Der Pharm-O-Kin Chip von GenScan Diagnostics ist ein Genchip auf der Basis eines Glasobjektträgers und weist 36 SNP's verschiedene P450 Isoenzyme sowie andere für den Arzneimitteltransport relevante Gene nach (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, sowie NAT2 und MDR1).• The Pharm-O-Kin chip from GenScan Diagnostics is a gene chip based on a glass slide and detects 36 SNP's different P450 isoenzymes as well as other genes relevant for drug transport (CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, as well as NAT2 and MDR1).

Andere Systeme sind prinzipiell ebenfalls geeignet, Polymorphismen an Arzneimittel metabolisierenden Genen nachzuweisen. Die Oligonukleotidprimer für die PCR und/oder die Alleldetektion mit den dazugehörigen Reportersystemen müssen jedoch vom Anwender gesondert entwickelt werden. Solche Systeme sind:In principle, other systems are also suitable for detecting polymorphisms in genes metabolizing drugs. However, the oligonucleotide primers for PCR and / or allel detection with the associated reporter systems must be developed separately by the user. Such systems are:

• das DASH™ System von Hybaid, beruhend auf der Immobilisierung einzelsträngiger Amplikons auf SA-MTP und anschließender kinetischer Analyse der Schmelzpunkterniedrigung allelspezifischer Hybridisierungssonden. Als Reportersystem wird dabei der interkalierende Fluorophor SYBR Green™ verwendet. Voraussetzung ist die Anschaffung eines relativ kostenintensiven DASH™ Gerätes,• The DASH ™ system from Hybaid, based on the immobilization of single-stranded amplicons on SA-MTP and subsequent kinetic analysis of the lowering of the melting point of allele-specific hybridization probes. The intercalating fluorophore SYBR Green ™ is used as the reporter system. The prerequisite is the purchase of a relatively expensive DASH ™ device,

• das Pyrosequencing System von Pyrosequencing. Bei diesem Verfahren werden in einzelsträngig vorgelegte PCR Produkte, beginnend an einem spezifischen Primer, Einzelnukleotide sequentiell eingebaut. Der erfolgreiche Einbau eines Nukleotides wird dabei über eine Sulfurylase - Luciferase vermittelte Lichtemissionsreaktion detektiert. Überschüssiges Nukleotid wird vor der Zugabe eines weiteren Nukleotids durch Apyraseaktivität abgebaut. Durch sequentiellen Durchlauf aller Nukleotide wird somit ein kurzes bis mittel langes Sequenzieren in 96 well Platten realisiert. Die Technologie setzt die Anschaffung eines eigens für diesen Zweck entwickelten Gerätes, sowie der benötigten Reagenziencocktails voraus und ist daher vergleichsweise kostenintensiv und nur beschränkt einsetzbar,• the Pyrosequencing System from Pyrosequencing. In this method, single-stranded PCR products are presented, starting with a specific one Primer, single nucleotides sequentially incorporated. The successful incorporation of a nucleotide is detected via a sulfur emission - luciferase mediated light emission reaction. Excess nucleotide is degraded by apyrase activity before the addition of another nucleotide. By sequentially running all nucleotides, a short to medium-long sequencing in 96 well plates is realized. The technology requires the purchase of a device specially developed for this purpose, as well as the required reagent cocktails and is therefore comparatively expensive and can only be used to a limited extent.

• das SNP-IT System von Orchid stellt ein Gerätesystem dar, daß explizit für den Mittel- bis Hochdurchsatz von SNP-Nachweisen an PCR Amplikons entwickelt wurde. Es besteht im wesentlichen aus einem Roboter, welcher automatisch die Aufarbeitung der Proben, den Nachweis der Allele (dafür sind unterschiedlichste Technologien wie Gene Chip Hybridisierungsassay, Sequenzierung etc. integrierbar) und die Datenanalyse (nebst Statistik) leisten soll. Für diese aufwendigen Geräte sind die Anschaffungskosten entsprechend hoch.• Orchid's SNP-IT system is a device system that was explicitly developed for the medium to high throughput of SNP detection on PCR amplicons. It essentially consists of a robot, which should automatically process the samples, detect the alleles (a wide variety of technologies such as gene chip hybridization assays, sequencing, etc. can be integrated) and perform data analysis (along with statistics). The acquisition costs for these complex devices are correspondingly high.

• das SureScore™ System von Invitrogen ist ein auf 96 well Platten basierendes SNP Nachweissystem. Basistechnologie ist der spezifische Einbau markierter (Biotin bzw. FITC) Didesoxynukleotide an einer einzelstängigen, komplementären PCR Produktmatrix durch eine DNA Polymerase an der SNP Position. Der anschließende Nachweis geschieht durch einen markerspezifischen Antikörper, der über eine gekoppeltes Enzym eine Farbreaktion katalysiert.• The SureScore ™ system from Invitrogen is a SNP detection system based on 96 well plates. The basic technology is the specific incorporation of labeled (biotin or FITC) dideoxynucleotides on a single-stranded, complementary PCR product matrix by a DNA polymerase at the SNP position. The subsequent detection is carried out by a marker-specific antibody that catalyzes a color reaction via a coupled enzyme.

Die Entwicklung von zuverlässigen Genotypisierungsverfahren, die durch geringen Zeit- und Geräteaufwand und relativ niedrige Kosten gekennzeichnet sind, ist dringend geboten, um eine intensivere klinische Erforschung der Zusammenhänge zwischen Arzneimittelstoffwechsel und Genotyp der beteiligter Enzyme und die Entwicklung hochgradig zuverlässiger und zugleich kostengünstiger, diagnostischer Verfahren zu ermöglichen.The development of reliable genotyping methods, which are characterized by low expenditure of time and equipment and relatively low costs, is urgently required in order to intensify clinical research into the relationships between drug metabolism and genotype of the enzymes involved and to develop highly reliable and, at the same time, inexpensive, diagnostic methods enable.

Der Erfindung liegt demzufolge die Aufgabe zugrunde, ein solches Verfahren zu entwickeln und gleichzeitig ein Testkit zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung zu stellen Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Sie betrifft ein vereinfachtes Verfahren zum Nachweis von SNP in CYP-Genen des Menschen und einen Test Kit mit folgenden Komponenten:The invention is therefore based on the object of developing such a method and at the same time making a test kit available for carrying out the method The invention is implemented according to the claims. It concerns a simplified procedure for the detection of SNP in human CYP genes and a test kit with the following components:

1. Neu entwickelte synthetische Oligonukleotide, vorzugsweise Oligonukleotide der Anlage 1, die geeignet sind, Genabschnitte in Genen des Arzneimittelmetabolismus mit Hilfe der „DNA Polymerase chain reaction" Technologie (PCR) isoformspezifisch (IS-PCR) aus genomischer Leukozyten-DNA zu amplifizieren,1. Newly developed synthetic oligonucleotides, preferably oligonucleotides from Appendix 1, which are suitable for amplifying gene sections in genes of drug metabolism with the aid of the “DNA polymerase chain reaction” technology (PCR) isoform-specifically (IS-PCR) from genomic leukocyte DNA,

2. Komponenten, die es ermöglichen, einzelsträngig biotinierte IS-PCR Produkte auf Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten (SA-MTP) selektiv, thermostabil und einzelsträngig zu immobilisieren,2. Components which enable single-stranded biotinated IS-PCR products to be selectively, thermostably and single-stranded immobilized on streptavidin-coated microtiter plates (SA-MTP),

3. testoptimierte, allelspezifische, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierte, synthetische Oligonukleotide, vorzugsweise Oligonukleotide der Anlage 1 , die entweder durch Hybridisierung, oder alternativ dazu durch diskriminierende Verlängerung einzelsträngiger PCR Produkte mittels Taq- Polymeraseaktivität, nachfolgende stringente Waschung und anschließende Detektion mittels Fluorometrie bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung der hybridisierten Amplikons gewährleisten, oder3. Test-optimized, allele-specific, fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled, synthetic oligonucleotides, preferably oligonucleotides from Appendix 1, which are either by hybridization or alternatively by discriminatory extension of single-stranded PCR products using Taq polymerase activity, subsequent stringent washing and subsequent detection using fluorometry or Ensure reliable genotyping of the hybridized amplicons by photometry, or

4. alternativ zu SA-MTP's - aus Streptavidin beschichteten Glasobjektträgern (SA-Chip) auf denen biotinierte, isoformspezifische, synthetische Oligonukleotide immobilisiert sind, welche mit partiell einzelsträngigen PCR Produkten hybridisiert werden, die durch diskriminierende Verlängerung eines allelspezifischen, endständig FITC markierten Oligonukleotides mittels Taq DNA Polymerase erzeugt wurden und durch nachfolgende stringente Waschung und anschließende Detektion mittels Fluorometrie bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung der hybridisierten Amplikons gewährleisten.4. alternative to SA-MTP's - from streptavidin-coated glass slides (SA chip) on which biotinated, isoform-specific, synthetic oligonucleotides are immobilized, which are hybridized with partially single-stranded PCR products which are discriminated by the extension of an allele-specific, terminally FITC-labeled oligonucleotide using Taq DNA polymerase were generated and, by subsequent stringent washing and subsequent detection using fluorometry or photometry, ensure reliable genotyping of the hybridized amplicons.

Durch zusätzliche positive Nachweise der Deletion des CYP2D6 Gens (Allel: CYP2D6*5) und der zum Teil mehrfachen Duplikation desselben Gens (Allel: CYP2D6*2XN) mittels „long distance" PCR mit biotinierten Sense - und FITC markierten Antisense Primern und anschließendem Nachweis, des auf SA-MTP gebundenen Duplexes, wird somit eine Abschätzung des phänotypisch relevanten Genotyps bezüglich der wichtigsten Arzneimittel metabolisierenden Cytochrom P450 Enzyme ermöglicht.Through additional positive evidence of the deletion of the CYP2D6 gene (allele: CYP2D6 * 5) and the sometimes multiple duplication of the same gene (allele: CYP2D6 * 2XN) using "long distance" PCR with biotinated sense and FITC labeled antisense primers and subsequent detection, of the duplex bound to SA-MTP is thus an estimate of the phenotypically relevant Genotype regarding key drug metabolizing cytochrome P450 enzymes.

Im Unterschied zu den bekannten „high-throughpuf-Verfahren ermöglicht es die hier beschriebene Erfindung, auch an wenigen Einzelpatienten bei niedrigen Personal- und Sachkosten die therapeutisch wichtigen Befunde zur individuellen Ausstattung mit den verschiedenen CYP Allelen zu erheben.In contrast to the known “high-throughpuf method”, the invention described here makes it possible to collect the therapeutically important findings for individual equipping with the various CYP alleles, even in a few individual patients with low personnel and material costs.

Die Erfindung nutzt hochgradig genspezifische Oligonukleotidprimer, vorzugsweise Oligonukleotide der Anlage 1 , für flankierende Regionen der allelbestimmenden Genabschnitte, um diese aus einem Hintergrund von sehr stark homologen Cytochromen der gleichen Subfamilie mittels diskriminierender PCR zu amplifizieren. Der folgende Allelnachweis kann mit zwei zum Teil unterschiedlichen Verfahren erfolgen:The invention uses highly gene-specific oligonucleotide primers, preferably oligonucleotides from Appendix 1, for flanking regions of the allele-determining gene segments in order to amplify them from a background of very homologous cytochromes of the same subfamily by means of discriminatory PCR. The following allele detection can be done using two different methods:

1. durch Markierung eines Primers pro alleltragendem Genfragment mit Biotin; Amplifikation allelbestimmender Genabschnitte mit Oligonukleotidprimern gemäß Anlage 1 mittels diskiminierender PCR; anschließende Kopplung der markierten Amplikons an eine thermostabile Streptavidin-Mikrotiterplatte (SA-MTP), vorzugsweise eine SA-MTP der Firma BioTeZ (Patentnummer: DE10020885 A). Die verunreinigende genomische DNA sowie die Komplementärstränge werden anschließend durch stringentes Waschen entfernt; die dann einzelsträngig vorliegenden Amplikons mit allelspezifischen, FITC markierten Oligonukleotiden hybridisiert und danach erneut einer stringenten Waschung unterzogen.1. by labeling a primer per allele-bearing gene fragment with biotin; Amplification of allele-determining gene segments with oligonucleotide primers according to Appendix 1 by means of discriminating PCR; subsequent coupling of the labeled amplicons to a thermostable streptavidin microtiter plate (SA-MTP), preferably an SA-MTP from BioTeZ (patent number: DE10020885 A). The contaminating genomic DNA and the complementary strands are then removed by stringent washing; the amplicons that are then single-stranded are hybridized with allele-specific, FITC-labeled oligonucleotides and then subjected to a stringent wash again.

2. durch asymmetrische PCR zur Erzeugung überschüssiger ssDNA Amplikons, anschließende Hybridisierung mit einem 5'-FITC markiertem Primer, dessen 3"-Ende mit der Position der Mutation korrespondiert, und nachfolgende, allelspezifische Verlängerung des markierten Primers durch diskriminierende Taq-Polymeraseaktivität mit dNTP's zu partiell einzelsträngigen Duplexen. Biotinierte genspezifische Oligonukleotide werden auf definierten Spots eines mit Streptavidin beschichteten Glasobjektträgers immobilisiert. Die partiell einzelsträngigen Duplexe werden nachfolgend mit den immobilisierten, genspezifischen Oligonukleotiden hybridisiert und durch stringente Waschung von nicht verlängerten, 5'-FITC markierten Oligonukleotidprimer befreit. Der Nachweis der allelrepräsentierenden 5'-FITC markierten Oligonukleotide geschieht in beiden Fällen durch anschließenden Anti-FITC-Ak-HRP Elisa. Dieses hochempfindliche Verfahren erlaubt den sicheren Nachweis der in den Ausführungsbeispielen aufgeführten Allele unter Einsatz von Laborstandardgeräten und/oder handelsüblichen Durchlichtscannem.2. by asymmetric PCR to generate excess ssDNA amplicons, subsequent hybridization with a 5'-FITC labeled primer, the 3 " end of which corresponds to the position of the mutation, and subsequent allele-specific extension of the labeled primer by discriminating Taq polymerase activity with dNTP's partially single-stranded duplexes, biotinated gene-specific oligonucleotides are immobilized on defined spots of a glass slide coated with streptavidin, and the partially single-stranded duplexes are subsequently immobilized with the gene-specific Oligonucleotides hybridized and freed from stringent washing of non-extended, 5'-FITC labeled oligonucleotide primers. In both cases, the allele-representative 5'-FITC-labeled oligonucleotides are detected by subsequent anti-FITC-Ak-HRP Elisa. This highly sensitive method permits the reliable detection of the alleles listed in the exemplary embodiments using standard laboratory devices and / or commercially available transmitted light scanners.

Die erfindungsgemäße Vereinfachung in dem hier beschriebenen Verfahren besteht darin, daßThe simplification according to the invention in the method described here is that

1. die erfindungsgemäß eingesetzten Primer und Sonden einen hochselektiven Allel-Nachweis an genomischer DNA innerhalb weniger Stunden ermöglichen, und1. the primers and probes used according to the invention enable highly selective allele detection of genomic DNA within a few hours, and

2. der Test als multipler Assay durchgeführt wird, in dem eine Mehrzahl von einzelnen Allelen in einem speziell angepaßten Protokolldurchlauf auf einer MTP, bzw. mehreren Glasobjekträgem, gleichzeitig erfaßt werden, und2. the test is carried out as a multiple assay, in which a plurality of individual alleles are detected simultaneously in a specially adapted protocol run on an MTP or several glass object carriers, and

3. für den Fall des Nachweises auf einer MTP nur solche Geräte zum Einsatz kommen, die zur Standardausrüstung eines mit PCR bzw. Elisa Methoden befaßten Labors gehören, und3. in the case of detection on an MTP, only those devices are used that belong to the standard equipment of a laboratory dealing with PCR or Elisa methods, and

4. im Falle des Nachweises auf Glasobjekträgem, durch Vorschaltung einer automatisierten Übertragung der IS-PCR Produkte, eine wesentliche Verringerung des personellen und zeitlichen Aufwands, des einzusetzenden Probenmaterials, sowie die Minimierung möglicher Belegungsfehler erzielt werden.4. In the case of detection on glass objects, by means of an automated transfer of the IS-PCR products, a significant reduction in personnel and time, the sample material to be used, and the minimization of possible occupancy errors can be achieved.

Als interne Kontrollen können Proben bestehend aus gentechnisch gewonnener Plasmid DNA (pDNA), vorzugsweise der Plasmid DNA-Sequenzen der Anlage 1, welche allelspezifische Fragmente von CYP-Genabschnitten enthalten, mitgeführt werden.Samples consisting of genetically engineered plasmid DNA (pDNA), preferably the plasmid DNA sequences of Appendix 1, which contain allele-specific fragments of CYP gene segments, can be carried as internal controls.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden. AUSFÜHRUNGSBEISPIELEThe invention will be explained in more detail below by means of exemplary embodiments. EMBODIMENTS

Beispiel 1example 1

Isoformspezifische Amplifikation eines Genabschnitts von CYP2C9 aus genomischer Leukozyten DNA mittels PCRIsoform-specific amplification of a gene segment of CYP2C9 from genomic leukocyte DNA using PCR

a) Isolation der genomischen DNA (gDNA)a) Isolation of genomic DNA (gDNA)

Genomische DNA kann nach bereits beschriebenen Standardverfahren aus Leukozyten des menschlichen Blutes isoliert werden (Vogelstein B. and Gillespie D. PNAS, (1979) 76: 615-9). Hierbei sollte eine gDNA Konzentration von 5-50 ng/ul angestrebt werden, um bei Einsatz von 0,5-1 μl gDNA/PCR Ansatz eine ausreichende Kopienzahl vorzulegen. Der Qualität der gDNA kann bei der Effektivität des gesamten Assay eine entscheidende Bedeutung zukommen und es sollte daher eine möglichst gleichbleibende Qualität und Konzentration angestrebt werden.Genomic DNA can be isolated from leukocytes of human blood using standard methods already described (Vogelstein B. and Gillespie D. PNAS, (1979) 76: 615-9). A gDNA concentration of 5-50 ng / ul should be aimed for in order to present a sufficient number of copies when using 0.5-1 μl gDNA / PCR. The quality of the gDNA can be of crucial importance for the effectiveness of the entire assay and therefore the quality and concentration should be as constant as possible.

b) Ansatz und Durchführung der PCR mit Probanden gDNAb) Preparation and implementation of the PCR with gDNA test subjects

Für je 25 μl Gesamtvolumen/PCR Ansatz werden 2,5 μl eines 10 fach konzentrierten Polymerasepuffers (z.B. 100 mM Tris-HCI (pH 8.0), 500 mM KCI, 15 mM MgCI); 0,08 μl dNTP (62,5 mM jedes); jeweils 0,5 μl der 50 μM Primer SP2C9201 (SEQ ID NO 1 ) und dem 5' biotiniertem Primer RP2C9201 (SEQ ID NO 2); 0,5 μl Taq-DNA Polymerase (5U/μl), 1 μl gDNA ; sowie 16,34 μl für die PCR geeignetes Bidest im Doppelansatz in PCR Gefäße pipettiert. Anschließend werden die Gefäße in ein handelsübliches PCR Gerät überführt und nachfolgendem PCR-Regime unterworfen:For each 25 μl total volume / PCR mixture, 2.5 μl of a 10-fold concentrated polymerase buffer (e.g. 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM KCI, 15 mM MgCI); 0.08 µl dNTP (62.5 mM each); 0.5 μl each of the 50 μM primer SP2C9201 (SEQ ID NO 1) and the 5 ′ biotinated primer RP2C9201 (SEQ ID NO 2); 0.5 ul Taq DNA polymerase (5U / ul), 1 ul gDNA; and 16.34 μl bidest suitable for PCR in a double batch pipetted into PCR tubes. The tubes are then transferred to a commercially available PCR device and subjected to the following PCR regime:

Zyklen Temp. DauerCycles Temp. Duration

1 x 95°C 3 Min.1 x 95 ° C 3 min.

35 x 95°C 30 Sek.35 x 95 ° C 30 sec.

57°C 30 Sek.57 ° C 30 sec

72°C 45 Sek.72 ° C 45 sec

1 x 72°C 5 Min.1 x 72 ° C 5 min.

4°C Ende Gleichzeitig wurden Proben bestehend aus gentechnisch gewonnener Plasmid DNA (pDNA), welche allelspezifische Fragmente des Genabschnitts CYP2C9*2 (SEQ ID NO 38) und den entsprechenden Abschnitt des Wildtypgens CYP2C9*1 (SEQ ID NO 37) enthalten, als interne Kontrollen ebenfalls im Doppelansatz mitgeführt. Die entstandenen Amplifikationsprodukte können mittels Agarosegelelektrophorese in 3,5% Agarosegelen bei 5-10 V/cm Gelbreite 1-1 Vz Stunden aufgetrennt und mittels DNA Marker und Ethidiumbromid Färbung unter UV Licht visualisiert und dokumentiert werden.4 ° C end At the same time, samples consisting of genetically engineered plasmid DNA (pDNA), which contain allele-specific fragments of the gene segment CYP2C9 * 2 (SEQ ID NO 38) and the corresponding segment of the wild-type gene CYP2C9 * 1 (SEQ ID NO 37), were also used as internal controls in duplicate carried. The resulting amplification products can be separated by agarose gel electrophoresis in 3.5% agarose gels at 5-10 V / cm gel width for 1-1 1/2 hours and visualized and documented using DNA markers and ethidium bromide staining under UV light.

Beispiel 2Example 2

Hybridisierung und allelspezifischer Nachweis der PCR Produkte aus Beispiel 1 an SA-MTP durch stringente Waschung FITC markierter OligonukleotidsondenHybridization and allele-specific detection of the PCR products from Example 1 on SA-MTP by stringent washing of FITC-labeled oligonucleotide probes

Lösungensolutions

TE-NaCI: 10 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCITE-NaCI: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl

HP: 6 x SSC; 0,1 % SDS; 2 x Denhardtsche Lösung (DHL)HP: 6 x SSC; 0.1% SDS; 2 x Denhardtsche solution (DHL)

SDS-WP: 0,1 x SSC; 0,1% SDSSDS-WP: 0.1 x SSC; 0.1% SDS

TE-Lysin: 10 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCI; 2% Lysin (w/v)TE-lysine: 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% lysine (w / v)

TE-RSA: 10 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCI; 0,05%TE-RSA: 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.05%

Rinderserum Albumin (w/v) TE-Tween: 10 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 M EDTA; 100 mM NaCI; 0,1 % TweenBovine serum albumin (w / v) TE-Tween: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1M EDTA; 100 mM NaCl; 0.1% tween

(w/v) TMB: stabilisierte 3, 3', 5, 5!-Tetramethylbenzidin/H202 Lösung der Firma(w / v) TMB: stabilized 3, 3 ', 5, 5 ! -Tetramethylbenzidin / H 2 0 2 solution from the company

DRG Diagnostics (TMBIue)DRG Diagnostics (TMBIue)

Durchführungexecution

Jeweils 2 x 5 μl der in Beispiel 1 entstandenen Amplifikationsprodukte werden im Doppelansatz in eine mit 45 μl TE-NaCI vorbeschickte SA-MTP pipettiert, 20 Minuten bei 37°C unter Schütteln inkubiert und dann abgesaugt. Zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA werden je 50 μl 0,2N NaOH zugegeben, 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) geschüttelt und danach abgesaugt. Dann werden je 50 μl TE- NaCI zugesetzt, über 1 Min. bei RT geschüttelt und nachfolgend abgesaugt. Anschließend werden 50 μl nachfolgend bezeichneter, in HP (Hybridisierungspuffer) vorverdünnter Hybridisierungssonden (Endkonzentration - 0,5 - bzw. 1 nM) zu jeweils einem der Doppelansätze zugegeben, 20 Minuten bei 37°C hybridisiert und anschließend abgesaugt.In each case 2 × 5 μl of the amplification products obtained in Example 1 are pipetted in a double batch into a SA-MTP preloaded with 45 μl TE-NaCl, incubated for 20 minutes at 37 ° C. with shaking and then aspirated. To denature the double-stranded DNA, 50 μl of 0.2N NaOH are added, shaken for 15 minutes at room temperature (RT) and then aspirated. Then 50 .mu.l TE-NaCI are added, shaken at RT for 1 min. And then suctioned off. Then 50 μl of the hybridization probes (final concentration - 0.5 - or 1 nM) prediluted in HP (hybridization buffer) are added to each of the double batches, hybridized for 20 minutes at 37 ° C. and then aspirated.

Hybridisierungssondenhybridization probes

CYP2C9*2:CYP2C9 * 2:

CYP2C9*1 (WT) - FITC-5'-GAGGACCGTGTTCAAGAG -3' (SEQ ID NO 17) CYP2C9*2 (MT) - FITC-5'-TGAGGACTGTGTTCAAGAG -3' (SEQ ID NO 18)CYP2C9 * 1 (WT) - FITC-5'-GAGGACCGTGTTCAAGAG -3 '(SEQ ID NO 17) CYP2C9 * 2 (MT) - FITC-5'-TGAGGACTGTGTTCAAGAG -3' (SEQ ID NO 18)

Durch dreifach wiederholte Zugabe von 50 μl SDS-WP je Well, Inkubation bei 45°C für 11 Minuten und anschließendes Absaugen werden nicht 100% passende Hybridisierungssonden abgewaschen. Nach dem Blocken überschüssiger, unspezifischer Bindungsstellen für Anti-FITC-lgG-POD Konjugate durch 5 Minuten Inkubation in TE-Lysin bei RT werden 50 μl des Anti-FITC-lgG-POD Konjugates in einer Konzentration von 50 ng/ml in TE-RSA zugesetzt, 20 Minuten abgedunkelt bei RT geschüttelt und anschließend abgesaugt. Nach 2 facher Waschung der Wells mit je 50 μl TE-Tween werden 50 μl/well TMB Lösung zugegeben, 12 Minuten bei RT, abgedunkelt geschüttelt, unmittelbar anschließend mit 50 μl 5M H2S04 versetzt und sofort danach in einem handelsüblichen MTP Reader bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 620 bzw. 630 nm vermessen. Repeatedly adding 50 μl SDS-WP per well, incubating at 45 ° C for 11 minutes and then aspirating will not wash off 100% suitable hybridization probes. After blocking excess, nonspecific binding sites for anti-FITC-IgG-POD conjugates by incubation in TE-lysine at RT for 5 minutes, 50 μl of the anti-FITC-IgG-POD conjugate in a concentration of 50 ng / ml in TE-RSA added, shaken darkened at RT for 20 minutes and then suction filtered. After washing the wells twice with 50 μl TE-Tween, 50 μl / well TMB solution are added, shaken darkened for 12 minutes at RT, immediately mixed with 50 μl 5M H 2 S0 4 and immediately afterwards in a commercially available MTP reader Measure 450 nm against the reference wavelength 620 or 630 nm.

Tabelle 2Table 2

Gemessene Optische Dichte bei 450 nm (OD450 nm) ausgewählter CYP2C9 Allele aus pDNA bzw. gDNA (vortypisiert durch RFLP) nach Hybridisierung mit FITC- Sonden und Behandlung entsprechend Beispiel 2Measured optical density at 450 nm (OD450 nm) of selected CYP2C9 alleles from pDNA or gDNA (pre-typed by RFLP) after hybridization with FITC probes and treatment in accordance with Example 2

Allel (Quelle) FITC-Sonde OD450 n Match / MismatchAllele (source) FITC probe OD450 n match / mismatch

CYP2C9*1 WT 2,7 17,5 (pDNA)CYP2C9 * 1 WT 2.7 17.5 (pDNA)

CYP2C9*2 MUT 1 ,9 10,3 (pDNA)CYP2C9 * 2 MUT 1, 9 10.3 (pDNA)

CYP2C9*1/*1 WT 2,7 16,8 (gDNA)CYP2C9 * 1 / * 1 WT 2.7 16.8 (gDNA)

CYP2C9*2/*2 MUT 1 ,8 11 ,1 (gDNA)CYP2C9 * 2 / * 2 MUT 1, 8 11, 1 (gDNA)

CYP2C9*1/*2 WT 2,3 1 ,2 (gDNA)CYP2C9 * 1 / * 2 WT 2.3 1, 2 (gDNA)

CYP2C9*1/*2 MUT 1 ,8 0,8 (gDNA)CYP2C9 * 1 / * 2 MUT 1, 8 0.8 (gDNA)

Legende: CYP2C9*1 (pDNA) ist gentechnisch hergestellte, doppelsträngige Plasmid DNA mit der enthaltenen Sequenz für CYP2C9 WT (SEQ ID NO 37) und entsprechend für CYP2C9*2 (SEQ ID NO 38); CYP2C9*2/*2 bzw. -*1/*1 oder - *1/*2 gDNA sind mittels RFLP genotypisierte, genomische DNA Proben der Allele *1 (WT), *2 (MUT) bzw. *1/*2 (heterozygot); WT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend Wildtypallel und MUT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend CYP2C9*2; OD 45o nm = Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm gegen 620 nm; Match/Mismatch = der Quotient der OD 45o nm aus 100% komplementärem zu nicht komplementärem Allel- Sonden Hybriden. Beispiel 3Legend: CYP2C9 * 1 (pDNA) is genetically engineered, double-stranded plasmid DNA with the contained sequence for CYP2C9 WT (SEQ ID NO 37) and correspondingly for CYP2C9 * 2 (SEQ ID NO 38); CYP2C9 * 2 / * 2 or - * 1 / * 1 or - * 1 / * 2 gDNA are genomic DNA samples genotyped by RFLP of the alleles * 1 (WT), * 2 (MUT) or * 1 / * 2 (heterozygous); WT = FITC labeled oligonucleotide with sequence corresponding to wild type allele and MUT = FITC labeled oligonucleotide with sequence corresponding to CYP2C9 * 2; OD 45 o nm = optical density at a wavelength of 450 nm against 620 nm; Match / Mismatch = the quotient of the OD 45 o nm from 100% complementary to non-complementary allele probe hybrids. Example 3

IS-PCR von CYP2C19*3 aus pDNA mittels asymmetrischer PCR gefolgt von alleispezifischer Verlängerung FITC markierter Oligonukleotide durch Taq DNA PolymeraseIS-PCR of CYP2C19 * 3 from pDNA using asymmetric PCR followed by allspecific extension of FITC-labeled oligonucleotides by Taq DNA polymerase

Ansatz und Durchführung der PCR mit gentechnisch hergestellter pDNA:Approach and implementation of the PCR with genetically engineered pDNA:

Die pDNA enthält allespezifische Fragmente des Genabschnitts CYP2C19*3 (SEQ ID NO 44) bzw. des entsprechenden Abschnitt des Wildtypgens CYP2C19*1 (SEQ ID NO 43). Für je 25 μl Gesamtvolumen/PCR Ansatz werden 2,5 μl eines 10 fach konzentrierten Polymerasepuffers (z.B. 100 mM Tris-HCI (pH 8.0), 500 mM KCI, 15 mM MgCI); 0,2 μl dNTP (62,5 mM jedes); jeweils 0,5 μl des 5 μM Primers SP2C1932 (SEQ ID NO 7) und des 50 μM Primers RP2C9201 (SEQ ID NO 8); 0,25 μl Taq-DNA Polymerase (5U/μl), 1 μl pDNA (50 pg); sowie 20,05 μl für die PCR geeignetes Bidest im Doppelansatz in PCR Gefäße pipettiert. Anschließend werden die Gefäße in ein handelsübliches PCR Gerät überführt und nachfolgendem PCR-Regime unterworfen:The pDNA contains all-specific fragments of the gene section CYP2C19 * 3 (SEQ ID NO 44) or the corresponding section of the wild-type gene CYP2C19 * 1 (SEQ ID NO 43). For each 25 μl total volume / PCR mixture, 2.5 μl of a 10-fold concentrated polymerase buffer (e.g. 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM KCI, 15 mM MgCI); 0.2 µl dNTP (62.5 mM each); 0.5 μl each of the 5 μM primer SP2C1932 (SEQ ID NO 7) and the 50 μM primer RP2C9201 (SEQ ID NO 8); 0.25 ul Taq DNA polymerase (5U / ul), 1 ul pDNA (50 pg); and pipette 20.05 μl bidest suitable for PCR in a double batch into PCR tubes. The tubes are then transferred to a commercially available PCR device and subjected to the following PCR regime:

Zyklen Temp. DauerCycles Temp. Duration

1 x 95°C 2 Min.1 x 95 ° C 2 min.

35 x 95°C 30 Sek.35 x 95 ° C 30 sec.

55°C 30 Sek.55 ° C 30 sec

72°C 45 Sek.72 ° C 45 sec

1 x 72°C 5 Min. Pause1 x 72 ° C 5 min break

und nach Zusatz von 0,5 μl/PCR Gefäß eines der 50 μM, 5' FITC markierten, allelspezifischen Primer 2C1931AS (SEQ ID NO 56) bzw. 2C1933AS (SEQ ID NO 57) erneutand after addition of 0.5 μl / PCR tube one of the 50 μM, 5 ′ FITC-labeled, allele-specific primers 2C1931AS (SEQ ID NO 56) or 2C1933AS (SEQ ID NO 57) again

1 x 95°C 2 Min.1 x 95 ° C 2 min.

59°C 45 Sek.59 ° C 45 sec

72°C 3 Min. einer allelspezifischen Primenterlängerung unterworfen, anschließend kurzfristig bei 4°C aufbewahrt und nachfolgend weiterverarbeitet.72 ° C 3 min. subjected to an allele-specific prime extension, then briefly stored at 4 ° C and subsequently processed.

Beispiel 4Example 4

Hybridisierung und alleispezifischer Nachweis der PCR Produkte aus Beispiel 3 an Streptavidin beschichtete Glasobjekträgem (SA-Chips) durch stringente Waschung FITC markierter PrimerverlängerungsprodukteHybridization and all-specific detection of the PCR products from Example 3 on streptavidin-coated glass object carriers (SA chips) by stringent washing of FITC-labeled primer extension products

Lösungensolutions

TE-NaCI: 10 mM Tris-HCI (pH 7.5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCITE-NaCI: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl

6 x SSC: 0,09 M Na-Citrat-HCI (pH 7.0); 0,9 M NaCI6 x SSC: 0.09 M Na citrate HCl (pH 7.0); 0.9 M NaCl

SDS-WP: 0, 1 x SSC; 0, 1 % SDSSDS-WP: 0.1 x SSC; 0.1% SDS

TE-Lysin: 10 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCI; 2% Lysin (w/v)TE-lysine: 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 2% lysine (w / v)

TE-RSA: 10 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCI; 0,05%TE-RSA: 10mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.05%

Rinderserum Albumin (w/v) TE-Tween: 10 mM Tris-HCI (pH 7,5); 1 mM EDTA; 100 mM NaCI; 0,1 % TweenBovine serum albumin (w / v) TE-Tween: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.1% tween

(w/v) TMB (p): präzipitierende, stabilisierte 3, 3', 5, 5'-Tetramethylbenzidin/H202 (w / v) TMB (p): precipitating, stabilized 3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine / H 2 0 2

Lösung der Firma SeramunSolution from Seramun

Durchführungexecution

Ein mit 32-64 Reaktionsarealen (Spots) ausgestatteter SA-Chip wird mit jeweils 3 μl/ Spot eines 5' biotinierten, in TE-NaCI gelösten 500 pM Oligos mit der Bezeichnung B2C193_F (SEQ ID NO 58) versehen, 15 Min. bei RT in einer Humiditätskammer inkubiert, anschließend abgesaugt mit 1 mal mit 6 x SSC bei RT gewaschen. Jeweils 0,25 μl der in Beispiel 3 entstandenen Amplifikationsprodukte werden mit 1 ,5 μl 12 x SSC versetzt, mit ddH20 auf 3 μl Gesamtvolumen aufgefüllt, nach Absaugen des 6 x SSC Puffers im Dreifachansatz auf einzelne Spots pipettiert, 30 Minuten bei RT bei gesättigter Humidität hybridisiert und anschließend abgesaugt. Durch 3 fache, stringente Waschung des SA-Chips mit 20 ml SDS-WP für jeweils 5 Min. bei 46°C werden nicht verlängerte, FITC markierte Mismatch Extensionprimer abgewaschen, während korrekt gepaarte, in der Extensionreaktion verlängerte Match 5' FITC- Primer/Template Kombinationen auf dem SA-Chip verbleiben. Nach dem Blocken überschüssiger, unspezifischer Bindungsstellen für Anti-FITC-lgG-POD Konjugate durch 5 Min. Inkubation in TE-Lysin bei RT werden 2 μl eines Anti-FITC-lgG-POD Konjugates in TE-RSA (1 μg/ml) zugesetzt und abgedunkelt 20 Minuten in gesättigter Humidität bei RT inkubiert. Nach 2 facher Waschung des SA-Chips mit 5 ml TE- Tween werden 2 μl/Spot der TMB (p) Fertiglösung zugegeben und abgedunkelt in gesättigter Humidität über 15 Minuten bei RT inkubiert. Die sofort anschließende Vermessung der auftretenden Violettfärbung erfolgt in einem handelsüblichen Durchlichtscanner (Agfa Scanwise) bei einer Auflösung von 250 dpi. Die Auswertung der gescannten Bilder erfolgt mit Hilfe einer neuentwickelten, speziell auf das SA- Chip Design und das verwendete farbgebende Reagenz abgestimmten Analysesoftware und wird als auf 100% normierte Wertetabelle im Excel Format als Score Werte ausgegeben. A SA chip equipped with 32-64 reaction areas (spots) is provided with 3 μl / spot of a 5 'biotinated 500 pM oligos dissolved in TE-NaCI with the designation B2C193_F (SEQ ID NO 58), 15 minutes at RT incubated in a humidity chamber, then aspirated, washed once with 6 × SSC at RT. In each case 0.25 μl of the amplification products obtained in Example 3 are mixed with 1.5 μl 12 × SSC, made up to 3 μl total volume with ddH 2 0, after aspirating the 6 × SSC buffer in triplicate, pipetted onto individual spots, 30 minutes at RT hybridized with saturated humidity and then aspirated. 3 times, stringent washing of the SA chip with 20 ml of SDS-WP for 5 min. At 46 ° C in each case, not extended, FITC marked mismatch extension primers are washed off, while correctly paired match 5 'FITC extended in the extension reaction Primer / template combinations remain on the SA chip. After blocking excess, non-specific binding sites for anti-FITC-IgG-POD conjugates by 5 min. Incubation in TE-lysine at RT, 2 μl of an anti-FITC-IgG-POD conjugate in TE-RSA (1 μg / ml) are added and incubated darkened for 20 minutes in saturated humidity at RT. After the SA chip has been washed twice with 5 ml of TE-Tween, 2 μl / spot of the TMB (p) finished solution are added and the mixture is darkened and incubated at RT in saturated humidity for 15 minutes. The immediately subsequent measurement of the violet color that occurs is carried out in a commercially available transmitted light scanner (Agfa Scanwise) with a resolution of 250 dpi. The scanned images are evaluated with the aid of a newly developed analysis software specially tailored to the SA chip design and the coloring reagent used and are output as a 100% standardized table of values in Excel format as score values.

Tabelle 3Table 3

Ergebnisse der Messung der CYP2C19*1 bzw. - *3 pDNA Allele entsprechend Beispiel 4Results of the measurement of the CYP2C19 * 1 or - * 3 pDNA alleles according to Example 4

Allel FITC-Sonde Score (Mw ± Stdw, n = 3) 1 x PE 2 x PEAllele FITC probe score (Mw ± Stdw, n = 3) 1 x PE 2 x PE

MUT 1 ± 1 2 ± 3MUT 1 ± 1 2 ± 3

CYP 2C 19*1CYP 2C 19 * 1

WT 82 + 13 85 ± 1WT 82 + 13 85 ± 1

MUT 70 ± 16 81 ± 4MUT 70 ± 16 81 ± 4

CYP 2C 19*3CYP 2C 19 * 3

WT 6 + 2 26 ± 9WT 6 + 2 26 ± 9

Match / Mismatch (Mw) 1 x PE 2 x PEMatch / Mismatch (Mw) 1 x PE 2 x PE

CYP 2C19*1 WT 82 43CYP 2C19 * 1 WT 82 43

CYP 2C 19*3 MUT 12 3CYP 2C 19 * 3 MUT 12 3

Legende: CYP2C19*1 ist gentechnisch hergestellte, doppelsträngige Plasmid DNA mit der enthaltenen Sequenz für CYP2C19 WT (SEQ ID NO 43) und entsprechend für CYP2C19*3 (SEQ ID NO 44); FITC-Sonde = 5' Fluoroescein markiertes Oligonukleotid; WT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend Wildtypallel und MUT = FITC markiertes Oligonukleotid mit Sequenz entsprechend CYP2C19*3; Score ( W ± stdw, π = 3) = Mittelwerte von auf 100% normierten Scorewerten ± Standardabweichung bei Dreifachansatz; Match/Mismatch (Mw) = Quotient der mittleren Scorewerte aus 100% komplementärem und nicht komplementärem Allel - Sonden Hybrid; n x PE = Zahl (n) der durchgeführten FITC- Primer extension Zyklen. Legend: CYP2C19 * 1 is genetically engineered, double-stranded plasmid DNA with the contained sequence for CYP2C19 WT (SEQ ID NO 43) and accordingly for CYP2C19 * 3 (SEQ ID NO 44); FITC probe = 5 'fluoroescein labeled oligonucleotide; WT = FITC labeled oligonucleotide with sequence corresponding to wild type allele and MUT = FITC labeled oligonucleotide with sequence corresponding to CYP2C19 * 3; Score ( W ± stdw, π = 3) = mean values of score values standardized to 100% ± standard deviation with triple approach; Match / Mismatch (Mw) = quotient of the average score from 100% complementary and non-complementary allele probe hybrid; nx PE = number (s) of FITC primer extension cycles performed.

Claims

PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) in humanen CYP2-Genen unter Verwendung der Primer und/oder Sonden gemäß Anlage 1.1. Method for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNP) in human CYP2 genes using the primers and / or probes according to Appendix 1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit den beschriebenen Primern eine hochselektive Amplifikation der betreffenden CYP2- Allele erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that a highly selective amplification of the relevant CYP2 alleles takes place with the described primers. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mit den beschriebenen Primern und/oder Sonden ein Nachweis der betreffenden CYP2- Allele zu Kontrollzwecken in artifiziellen Plasmiden, vorzugsweise Plasmiden gemäß Anlage 1 , erfolgt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the described primers and / or probes are used to detect the relevant CYP2 alleles for control purposes in artificial plasmids, preferably plasmids according to Appendix 1. 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mit den beschriebenen Primern und/oder Sonden in einem Hybridisierungsassay ein Nachweis der betreffenden CYP2-Allele in genomischer DNA erfolgt.4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that with the described primers and / or probes in a hybridization assay, the relevant CYP2 alleles are detected in genomic DNA. 5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl homozygote als auch heterozygote Trägers des betreffenden Allele nachgewiesen werden.5. The method according to claim 1-4, characterized in that both homozygous and heterozygous carrier of the allele in question are detected. 6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der Hybridisierungsassay auf Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten erfolgt.6. The method according to claim 1-5, characterized in that the hybridization assay on streptavidin coated microtiter plates. 7. Verfahren nach Anspruch 1-6, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:7. The method according to claims 1-6, characterized by the following process steps: a) Markierung eines Primers pro Genabschnitt mit Biotin;a) labeling of one primer per gene segment with biotin; b) Amplifikation allelbestimmender Genabschnitte mit Oligonukleotidprimem gemäß Anlage 1 mittels diskriminierender PCR;b) amplification of allele-determining gene segments with oligonucleotide primers according to Appendix 1 by means of discriminatory PCR; c) Kopplung der markierten Amplikons an thermostabile Streptavidin- Mikrotiterplatten; d) Entfernung der verunreinigenden genomischen DNA sowie der Komplementärstränge durch stringentes Waschen;c) coupling the labeled amplicons to thermostable streptavidin microtiter plates; d) removing the contaminating genomic DNA and the complementary strands by stringent washing; e) Hybridisierung der einzelsträngig vorliegenden gebundenen Amplikons mit allelspezifischen, FITC markierten Oligonukleotiden;e) hybridization of the single-stranded bound amplicons with allele-specific, FITC-labeled oligonucleotides; f) Entfernung der nicht gebundenen FITC markierten Oligonukleotide durch Waschen;f) removal of the unbound FITC-labeled oligonucleotides by washing; g) Detektion der allelrepräsentierenden FITC markierten Oligonukleotide unter Verwendung eines Anti-FITC-Ak-HRP ELISAs.g) Detection of the allele-representative FITC-labeled oligonucleotides using an anti-FITC-Ak HRP ELISA. 8. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der Hybridisierungsassay auf Streptavidin beschichteten Glasobjekträgem erfolgt.8. The method according to claim 1-5, characterized in that the hybridization assay is carried out on streptavidin-coated glass objects. 9. Verfahren nach Anspruch 8 gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:9. The method according to claim 8 characterized by the following process steps: a) Erzeugung überschüssiger ssDNA Amplikons durch asymmetrische PCR;a) Generation of excess ssDNA amplicons by asymmetric PCR; b) Hybridisierung mit einem 5X-FITC markierten Primer, dessen 3'-Ende mit der Position der Mutation korrespondiert;b) hybridization with a 5 X -FITC-labeled primer, the 3 'end of which corresponds to the position of the mutation; c) allelspezifische Verlängerung des 5 -FITC markierten Primers durch diskriminierende Taq-Polymeraseaktivität mit dNTP's zu partiell einzelsträngigen Duplexen;c) allele-specific extension of the 5 FITC labeled primer by discriminatory Taq polymerase activity with dNTP's to partially single-stranded duplexes; d) Immobilisierung von biotinierten genspezifischen Oligonukleotiden auf definierten Spots des Streptavidin beschichteten Glasobjektträgers;d) immobilization of biotinated gene-specific oligonucleotides on defined spots of the streptavidin-coated glass slide; e) Selektive Hybridisierung der partiell einzelsträngigen Duplexe mit den passenden genspezifischen Oligonukleotiden auf den passenden Spots; f) Entfernung der nicht verlängerten, 5 -FITC markierten Primer durch stringente Waschung;e) selective hybridization of the partially single-stranded duplexes with the appropriate gene-specific oligonucleotides on the appropriate spots; f) removal of the non-extended, 5 -FITC-labeled primers by stringent washing; g) Detektion der allelrepräsentierenden FITC markierten Oligonukleotide unter Verwendung eines Anti-FITC-Ak-HRP ELISAs.g) Detection of the allele-representative FITC-labeled oligonucleotides using an anti-FITC-Ak HRP ELISA. 10. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1-9 umfassend folgende Komponenten:10. Test kit for performing the method according to claims 1-9 comprising the following components: a) Oligonukleotide, die geeignet sind, Genabschnitte in Genen des Arzneimittelmetabolismus, vorzugsweise in Cytochrom P450 Genen (CYP) mit Hilfe der „DNA Polymerase chain reaction" Technologie (PCR) isoformspezifisch (IS-PCR) aus genomischer Leukozyten-DNA zu amplifizieren, vorzugsweise Oligonukleotide gemäß Anlage 1 ;a) Oligonucleotides which are suitable for amplifying gene segments in genes of drug metabolism, preferably in cytochrome P450 genes (CYP) with the aid of the “DNA polymerase chain reaction” technology (PCR) isoform-specifically (IS-PCR) from genomic leukocyte DNA, preferably Oligonucleotides according to Appendix 1; b) Komponenten, die es ermöglichen, einzelsträngig biotinierte IS-PCR Produkte auf Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten (SA-MTP) selektiv, thermostabil und einzelsträngig zu immobilisieren,b) components which make it possible to selectively, thermostably and single-strand immobilize single-stranded biotinated IS-PCR products on streptavidin-coated microtiter plates (SA-MTP), c) testoptimierte, allelspezifische, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierte synthetische Oligonukleotide, die durch Hybridisierung, nachfolgende stringente Waschung und anschließende Detektion mittels Fluorometrie bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung der immobilisierten Amplifikationsprodukte (Amplikons) gewährleisten; oderc) test-optimized, allele-specific, fluorescein isothiocyanate (FITC) labeled synthetic oligonucleotides which ensure reliable genotyping of the immobilized amplification products (amplicons) by hybridization, subsequent stringent washing and subsequent detection by means of fluorometry or photometry; or d) alternativ dazu Streptavidin beschichtete Glasobjektträger (SA-Chip) auf denen biotinierte, isoformspezifische, synthetische Oligonukleotide immobilisiert sind, welche mit partiell einzelsträngigen PCR Produkten hybridisiert werden, die durch diskriminierende Verlängerung eines allelspezifischen, endständig FITC markierten Oligonukleotides mittels Taq DNA Polymerase erzeugt wurden und durch nachfolgende stringente Waschung und anschließende Detektion mittels Fluorometrie bzw. Photometrie eine sichere Genotypisierung der hybridisierten Amplikons gewährleisten. d) Alternatively, streptavidin-coated glass slides (SA chip) are immobilized on which biotinated, isoform-specific, synthetic oligonucleotides are immobilized, which are hybridized with partially single-stranded PCR products that were generated by discriminatory extension of an allele-specific, terminally FITC-labeled oligonucleotide using Taq DNA polymerase and ensure reliable genotyping of the hybridized amplicons by subsequent stringent washing and subsequent detection using fluorometry or photometry. 1. Oligonukleotide und Plasmid DNA Teilsequenzen gemäß Anlage 1, sowie deren Varianten, die analoge Eigenschaften aufweisen. 1. Oligonucleotides and plasmid DNA partial sequences according to Appendix 1, as well as their variants, which have analog properties.
PCT/DE2003/002699 2002-08-15 2003-08-07 Method for identifying single nucleotide polymorphisms (snp) in genes which metabolize medicaments and test kit for carrying out said method Ceased WO2004018707A2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003269675A AU2003269675A1 (en) 2002-08-15 2003-08-07 Method for identifying single nucleotide polymorphisms (snp) in genes which metabolize medicaments and test kit for carrying out said method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10237691.3 2002-08-15
DE2002137691 DE10237691B4 (en) 2002-08-15 2002-08-15 Method for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNP) in genes of drug metabolism and test kit for carrying out the method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004018707A2 true WO2004018707A2 (en) 2004-03-04
WO2004018707A3 WO2004018707A3 (en) 2004-07-08

Family

ID=31197052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2003/002699 Ceased WO2004018707A2 (en) 2002-08-15 2003-08-07 Method for identifying single nucleotide polymorphisms (snp) in genes which metabolize medicaments and test kit for carrying out said method

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2003269675A1 (en)
DE (1) DE10237691B4 (en)
WO (1) WO2004018707A2 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1561823A1 (en) * 2004-02-04 2005-08-10 Biotez Berlin-Buch GmbH Method for the detection of single nucleotid polymorphisms (SNP) of genes of drug metabolism and test system for performing such a method
EP1781812A4 (en) * 2004-06-30 2008-10-15 Tm Bioscience Pgx Inc Method of detecting mutations in the gene encoding cytochrome p450-2c9

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005266805B2 (en) * 2004-07-30 2010-10-28 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Method of detecting mutations in the gene encoding Cytochrome P450-2C19

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8228098A (en) * 1997-07-02 1999-01-25 University Of Bristol, The Method of determining the genotype of an organism using an allele specific oligonucleotide probe which hybridises to microsatellite flanking sequences
EP1108065A1 (en) * 1998-08-28 2001-06-20 Sangtec Molecular Diagnostics AB A method for measuring a patient's ability to metabolise certain drugs
US6183963B1 (en) * 1998-10-23 2001-02-06 Signalgene Detection of CYP1A1, CYP3A4, CYP2D6 and NAT2 variants by PCR-allele-specific oligonucleotide (ASO) assay
WO2000066770A2 (en) * 1999-05-03 2000-11-09 Biotez Berlin-Buch Gmbh Method for producing a chemically and thermally stable solid phase matrix for polymerase chain reaction (pcr) and dna hybridisation assay
GB0021286D0 (en) * 2000-08-30 2000-10-18 Gemini Genomics Ab Identification of drug metabolic capacity

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1561823A1 (en) * 2004-02-04 2005-08-10 Biotez Berlin-Buch GmbH Method for the detection of single nucleotid polymorphisms (SNP) of genes of drug metabolism and test system for performing such a method
EP1781812A4 (en) * 2004-06-30 2008-10-15 Tm Bioscience Pgx Inc Method of detecting mutations in the gene encoding cytochrome p450-2c9
AU2005259786B2 (en) * 2004-06-30 2011-03-10 Luminex Molecular Diagnostics, Inc. Method of detecting mutations in the gene encoding cytochrome P450-2C9

Also Published As

Publication number Publication date
DE10237691A1 (en) 2004-03-04
DE10237691B4 (en) 2010-01-28
AU2003269675A1 (en) 2004-03-11
WO2004018707A3 (en) 2004-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69233458T2 (en) NUCLEIC ACIDIFYING BY POLYMERASE EXTENSION OF OLIGONUCLEOTIDES USING TERMINATOR MIXTURES
DE60220025T2 (en) METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE MAJORITY OF RNA SEQUENCES
DE69430485T2 (en) IMMOBILIZED MISPARATION - FORMING PROTEIN FOR DETECTING OR CLEANING MUTATIONS OR POLYMORPHISMS
DE69434314T2 (en) POLYMORPHISM OF MONONUCLEOTIDES AND THEIR USE IN GENANALYSIS
DE69929542T2 (en) COMPLEXITY MANAGEMENT AND ANALYSIS OF GENOMIC DNA
DE60034878T2 (en) A method of amplifying a nucleic acid sequence using a chimeric primer
DE60009323T2 (en) METHODS AND COMPOSITIONS FOR LINEAR ISOTHERMAL AMPLIFICATION OF POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES
DE69531542T2 (en) LIGASE / POLYMERASE-MEDIATED ANALYSIS OF GENETIC ELEMENTS OF SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS AND THEIR USE IN GENETIC ANALYSIS
DE60131903T2 (en) DIRECT MULTIPLEX CHARACTERIZATION OF GENOMIC DNA
DE69432586T2 (en) METHOD FOR GENERATING SINGLE-STRENGTH DNA MOLECULES
DE69421277T2 (en) NUCLEIC ACID SEQUENCE ANALYSIS BY THE METHOD OF PARALLEL PRIMER EXTENSION
DE69432919T2 (en) Methods for the detection of specific polynucleotides
US20170016057A1 (en) Complexity Management of Genomic DNA
DE69003477T2 (en) Methods for the detection of nucleic acids.
DE60213803T2 (en) HAPPIER MAPPING
EP2113574A1 (en) Substances and methods for a DNA based profiling assay
DE69605803T2 (en) DETECTION OF MALFUNCTIONS BY CUTTING WITH A RESOLVASE ON A SOLID CARRIER
DE60038109T2 (en) Method for analyzing AFLP reaction mixtures using primer extension techniques
DE19911130A1 (en) Methods for identifying chromosomal regions and genes
DE10237691B4 (en) Method for the detection of single nucleotide polymorphisms (SNP) in genes of drug metabolism and test kit for carrying out the method
EP1561823A1 (en) Method for the detection of single nucleotid polymorphisms (SNP) of genes of drug metabolism and test system for performing such a method
KR20200070935A (en) KASP primer set based on SNP for discriminating Korean melon cultivar and F1 hybrid purity checking and uses thereof
DE102004006477A1 (en) Process for demonstrating the presence of single nucleotide polymorphism in human genes, comprises using a priming agent
DE69329532T2 (en) ELF HIGH INFORMATIVE POLYMORPHE REPEATED MICROSATELLITE DNS MARKER
Pruvost et al. From genes to phenotypes–Evaluation of two methods for the SNP analysis in archaeological remains: Pyrosequencing and competitive allele specific PCR (KASPar)

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP