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WO2004018615A1 - フィブリン含有組成物 - Google Patents

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WO2004018615A1
WO2004018615A1 PCT/JP2003/010692 JP0310692W WO2004018615A1 WO 2004018615 A1 WO2004018615 A1 WO 2004018615A1 JP 0310692 W JP0310692 W JP 0310692W WO 2004018615 A1 WO2004018615 A1 WO 2004018615A1
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WO
WIPO (PCT)
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plasma
fibrinogen
hollow fiber
fibrin
cells
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2003/010692
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuo Tokushima
Nobuya Kitaguchi
Shuichiro Inadome
Takahiro Hori
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Medical Co Ltd
Original Assignee
Asahi Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP03792825A priority patent/EP1538196A1/en
Priority to JP2004530614A priority patent/JPWO2004018615A1/ja
Priority to US10/525,503 priority patent/US20060128016A1/en
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    • C12N2533/50—Proteins
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Definitions

  • the present invention relates to a biological scaffold for tissue regeneration, a method for producing the same, and a production system.
  • regenerative medicine has received great promise as an alternative to conventional methods of organ transplantation and treatment using artificial organs.
  • Research on regenerative medicine includes research on cell and tissue regeneration by replenishing stem cells, such as bone marrow transplantation, wound healing, and repair of skin and organ damage during surgery, and tissue engineering in a narrow sense. It has evolved in two directions: a series of studies captured by concepts.
  • tissue engineering is a study that seeks to repair cells using both scaffolds and cells necessary for cells to survive in vivo.
  • Regenerative medicine requires "cells”, “scaffolds for cell growth and distribution", and "cell growth factors”.
  • scaffolding materials have been required to have biocompatibility so as not to harm the living body, and biodegradability so that the material is decomposed and Z-absorbed together with the formation of new living tissue. It is desired.
  • Fibrin glue is an external adhesive used for tissue adhesion, closure and subsequent wound treatment utilizing the physiological blood coagulation action, and is currently widely used in various surgical procedures. There are also many known techniques for using fibrin glue as a biological scaffold in the field of regenerative medicine (Cell Transplantation, 7, 309-317 s 1998; and Burn, 24, 621-630, 1998).
  • fibrin glue uses cryoprecipitate (cryo) prepared from autologous plasma in order to avoid side effects such as immune reactions such as allergic reaction and shock.
  • cryoprecipitate prepared from autologous plasma
  • self-fibrin glue prepared from autologous plasma is used not only for tissue regeneration but also for adhesion and closure of self-tissue using the blood coagulation action. It can be used for hemostatic applications.
  • the following methods have been known as methods for producing autologous fibrin glue.
  • the method of Casali et al. Is that it takes about 30 hours to prepare buibulin glue from whole blood after freezing for a long time, slowly thawing, and centrifuging.
  • ethanol precipitation method As another method, there is an ethanol precipitation method by Kjaergard (Surg Gynecol 0bstet, 175 (1), July, 1992: hereinafter, this method is referred to as "ethanol method" in the present specification). In this method, plasma obtained from whole blood is added to ethanol on ice water to precipitate fibrinogen.
  • fibrin glue using fibrinogen obtained by the above-mentioned cryo method or ethanol method can be used as a biological scaffold for regenerative medicine and the like.
  • a technique for producing artificial skin by embedding fibroblasts in fibrin gel prepared with fibrinogen obtained by the ethanol method and seeding epithelial cells thereon Japanese Patent Laid-Open No. No.
  • a fibrin gel prepared with fibrinogen obtained by the ethanol method was used to prepare a biological scaffold, and then a keratinocyte culture was prepared and used for transplantation Technology to make epidermal cell layer, fiber A technique for forming a dermal cell layer for transplantation using fibroblasts and keratinocytes (Japanese Patent No. 3134709) is known.
  • fibrin culture was performed using fibrinogen obtained by the Clio method and the ethanol method, and cell proliferation and metabolic capacity of chondrocytes were compared.As a result, the Clio method maintained chondrocyte morphology and maintained cell proliferation. It has been reported that proteoglycin accumulation is more favored (American Journal of Veterinary Research, 59, 514-520, 1998).
  • an ultrafiltration unit having an outlet adapted to be connected to a vacuum source, and first and second openings for concentrating the blood fraction;
  • a first valve connecting a first opening of the ultrafiltration unit to a fluid delivery system for delivery to the filtration unit; and a second opening of the ultrafiltration unit to a purge fluid delivery system.
  • a second valve to be connected, and a device including:
  • An object of the present invention is to provide a high-performance scaffold suitable for cell proliferation and differentiation in regenerative medicine. Furthermore, it is possible to provide a method for producing a fibrin concentrate which is quick and simple, and which is safe and stable without risk of infection.
  • fibrinogen concentrate obtained by a method of short-time cooling and rapid thawing improves the separation of plasma having a specific power cut-off value
  • fibrinogen concentrate obtained by using a membrane is an excellent scaffold for regenerative medicine.
  • a fibrinogen concentration system incorporating a plasma separation membrane, which is a hollow fiber membrane was devised, and the present invention was completed.
  • a fibrin-containing biological scaffold comprising:
  • the fibrinogen concentrate according to (1) wherein the fibrinogen concentrate is obtained by a method comprising a step of cooling the plasma for a short time, a rapid thawing step, and a step of collecting the fibrinogen concentrate.
  • the fibrinogen concentrate is obtained by precipitation from plasma so that the fibrinogen recovery is in the range of 15% to 32% (1) or
  • the fibrin-containing biological scaffold according to (2) The fibrin-containing biological scaffold according to (2).
  • the fibrinogen concentrate obtained by a method comprising a step of cooling the plasma for 10 to 60 minutes, a step of thawing for 15 to 60 minutes, and a step of collecting the fibrinogen concentrate.
  • the fipurin-containing biological scaffold according to any one of (1) to (3).
  • the cooling step is performed at -20 ° C to -40 ° C, and the thawing step is performed at -10 ° C to + 15 ° C.
  • the material of the hollow fiber membrane is a group consisting of hydrophilic polysulfone, EVAL (ethylene-vinyl alcohol copolymer), PAN (polyacrylonitrile), CDA (cellulose diacetate), and CTA (cellulose triacetate).
  • EVAL ethylene-vinyl alcohol copolymer
  • PAN polyacrylonitrile
  • CDA cellulose diacetate
  • CTA cellulose triacetate
  • the fibrinogen concentrate allows human plasma to flow through the hollow portion of the hollow fiber in the plasma component fractionation apparatus, and the liquid mainly flows from the inner wall of the hollow fiber to the outer wall.
  • the fibrin-containing biological scaffold according to any one of (6) to (11), which is obtained from the end of the hollow fiber by permeating the components.
  • the fibrinogen concentrate makes human plasma come into contact with the outer wall of the hollow fiber in the plasma component fractionating apparatus, and at this time, the liquid component is mainly transmitted from the outer wall of the hollow fiber to the inner wall, whereby the hollow fiber is removed.
  • the fibrin-containing biological scaffold according to any one of (6) to (14), which is obtained by concentrating the plasma that is brought into contact with the outside of the fibrin.
  • the fibrinogen activator is thrombin (1) to (1).
  • the fibrin-containing biological scaffold according to any one of the above 9).
  • the cell is selected from the group consisting of vascular endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes, mesenchymal stem cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, liver cells, knee cells and hematopoietic stem cells.
  • the substance released from the platelets includes the following steps:
  • the platelet activating substance is at least one substance selected from the group consisting of ATP, ADP, collagen, and thrombin.
  • the cell proliferation / differentiation stimulating substance is a mixture of a substance released from platelets and a substance released from leukocytes.
  • Cells can be obtained by passing human-derived cells through a filter (2 ⁇ )
  • a method for promoting fibrous tissue regeneration wherein the cell culture or the regenerated tissue according to (37) is applied to a damaged tissue or used as a graft.
  • a method for promoting tissue regeneration comprising a step of adding a mixture of cells and the biological scaffold according to any one of (1) to (23) to a damaged tissue.
  • (40) at least one selected from the group consisting of vascular endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes, mesenchymal stem cells, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, liver cells, ⁇ cells, and hematopoietic stem cells
  • a concentration system for obtaining a fibrin-containing biological scaffold comprising:
  • the material for the hollow fiber membrane is selected from the group consisting of hydrophilic polysulfone, EVAL (ethylene-vinyl alcohol copolymer), PAN (polyacrylonitrile), CDA (cellulose diacetate), and CTA (cellulose triacetate).
  • EVAL ethylene-vinyl alcohol copolymer
  • PAN polyacrylonitrile
  • CDA cellulose diacetate
  • CTA cellulose triacetate
  • the hollow fiber membrane material is made of hydrophilic polysulfone or EVAL (ethylene (45) The system according to (45).
  • the liquid supply device wherein the introduction means introduces human plasma from one of the distribution ports provided in the fractionating device to the inner surface or outer membrane surface of the hollow fiber membrane, and draws out the human plasma from another distribution port.
  • the concentration system according to any one of (41) to (46), which is a suction device.
  • the plasma component fractionating apparatus wherein the crude purification means comprises potting both ends of a hollow fiber membrane contained in a container such that the hollow interior flows outside the container. (41) to (48) ) The enrichment system according to any one of the above.
  • a plasma component fractionating apparatus wherein the rough purification means comprises potting one end of a hollow fiber membrane contained in a container so that the hollow interior flows outside the container, and sealing the other end. 41) The concentrating system according to any one of (48) to (48).
  • the ratio BinZBout between the amount Bin of the patient plasma per unit time flowing into the hollow part and the amount Bout of the fibrinogen concentrated solution collected per unit time from the end of the hollow fiber is in the range of 2 to 20.
  • the human plasma is brought into contact with the outer wall of the hollow fiber in the plasma component fractionating apparatus, and at this time, the liquid component is mainly transmitted from the outer wall of the hollow fiber to the inner wall, and is brought into contact with the outside of the hollow fiber.
  • the plasma is brought into contact with the outer wall of the hollow fiber, (54) The operation method of the concentration system according to (54), wherein when the liquid component is mainly permeated, the pressure in the hollow portion of the hollow fiber is reduced, and the component is permeated into the hollow portion from outside the hollow fiber by suction.
  • a system for producing a fipurin-containing biological scaffold comprising:
  • a system for producing a fibrin-containing biological scaffold comprising:
  • the means for producing a fibrin glue includes a means for mixing a fibrinogen concentrate with a fibrin stabilizing factor and a fibrinogen activating factor (59) to (68). System.
  • a method for producing a fibrin-containing biological scaffold comprising:
  • fractionating human plasma with a plasma component fractionation membrane having a cut-off value of not less than 150,000 daltons and not more than 400,000 daltons, and separating it into fibrinogen concentrate and the remaining fractionated plasma;
  • a method for producing a fibrin-containing biological scaffold comprising:
  • the method includes a step of mixing the remaining fractionated plasma obtained by fractionating with the plasma component fractionation membrane with the plasma separated blood from which the plasma has been separated by the plasma separating means and returning the mixed blood to the human body (70). ) To (74).
  • the step of producing fibrin glue includes a step of mixing a high molecular weight fractionated plasma rich in fibrinogen with a fibrin stabilizing factor and a fibrinogen activating factor (70) to (76) ).
  • a method for producing a high-performance scaffold suitable for cell proliferation and differentiation in regenerative medicine and a method for producing a fast and simple, safe and stable fibrin concentrate without risk of infection And a manufacturing system can be constructed.
  • FIG. 1 is a diagram showing a fiprinogen enrichment system using the Endstop method.
  • FIG. 2 is a diagram showing a fiprinogen enrichment system by the Discard method.
  • FIG. 3 is a diagram showing a fibrinogen enrichment system by the Aspirate method.
  • FIG. 4 is a diagram showing a fibrinogen enrichment system by the Aspirate method incorporated in a blood bag.
  • FIG. 5 is a diagram showing a fibrinogen concentration system (multistage suction) by the Aspirate method incorporated in a blood bag.
  • 1 is the source plasma
  • 2 is mainly the liquid component
  • 3 is the concentrate
  • 4 is the hollow fiber membrane
  • 5 is the inlet of the source plasma
  • 6 is the concentrate outlet
  • 7 is the valve
  • 8 is the end sealed.
  • a closed or looped hollow fiber membrane at the end, and 9 also indicates a hollow fiber membrane with a sealed end or a looped end.
  • FIG. 6 shows an example of a blood processing apparatus incorporating the biological scaffold production system of the present invention.
  • FIG. 7 shows an example of a plasma separation column and a plasma component fractionation column used in the present invention.
  • FIG. 8 shows an example of an activated thrombin plasma preparation device used in the present invention.
  • 11 is a whole blood reservoir with CPD
  • 12 is a plasma reservoir
  • 13 is a filtered plasma reservoir
  • 14 is a concentrated plasma reservoir
  • 15 is a plasma separation column
  • 16 is plasma Component fractionation column
  • 17-20 is pump for blood circuit
  • 21 is blood or plasma inlet
  • 2 2 is the plasma depleted polycytic fraction or concentrated plasma outlet
  • 2 3 is the plasma or filtered plasma outlet
  • 2 4 is a hollow fiber membrane
  • 3 1 is a filtered plasma inlet
  • 3 2 is a plasma storage bag made of chloride chloride
  • Bio scaffold is defined as the material that constitutes the support structure (scaffold) for cells to settle, proliferate, and differentiate in the tissue regeneration field and reconstruct the tissue.
  • the role of biological scaffolds is to secure space for regeneration, supply oxygen and nutrients to cells, and store cell growth factors, in addition to promoting cell colonization, proliferation, and differentiation.
  • Can be Examples of biological scaffolds in actual biological tissues include biopolymers called extracellular matrices such as collagen and Ramiyun.
  • biopolymers called extracellular matrices such as collagen and Ramiyun.
  • fibrin has biological scaffolding activity (Cell Transplantation, 7, 309-317, 1998; and Burn, 24, 62, 630, 1998, etc.). .
  • the fibrin-containing biological scaffold of the present invention contains a mixture of a fibrinogen concentrate and a fibrinogen activator obtained from human plasma by a short-time, crude purification process.
  • the above-mentioned fibrinogen concentrate is obtained by a method comprising, as one form, a step of rapidly cooling plasma, a step of rapidly thawing, and a step of collecting fibrinogen concentrate (for example, a centrifugation step). It is a thing.
  • the above fibrinogen concentrate comprises a cooling step of plasma for 10 minutes to 60 minutes, a thawing step of 15 minutes to 60 minutes, and a step of collecting the fibrinogen concentrate.
  • the cooling step is performed at a temperature of from 120 ° C. to ⁇ 40 ° C.
  • the thawing step is performed at a temperature of from 110 ° C. to 115 ° C.
  • human plasma is used for humans in terms of biocompatibility. When used for animals, it is preferable to use the plasma of the animals.
  • a more specific embodiment of the method for obtaining the above fiprinogen concentrate is as follows.
  • plasma obtained by centrifugation (4 ° C) of whole blood is frozen by standing at a temperature as low as _30 ° C for 30 minutes, then left at _2.5 ° C for 30 minutes. And leave at 12 ° C for 30 minutes. Subsequently, the mixture is allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes, and finally centrifuged (l, 000g x 15 minutes, 1 ° C) to remove the supernatant, thereby obtaining a fibrinogen concentrate.
  • plasma obtained by centrifuging whole blood (1,000 g x 15 minutes, 4 ° C) is frozen at a low temperature of about 30 ° C for 60 minutes, and then frozen. Leave at 5 ° C for 30 minutes, then leave at 4 ° C for 30 minutes. Finally, the supernatant can be removed by centrifugation (1,000 g x 15 minutes, 1 ° C) to obtain a fipurinogen concentrate.
  • the present invention is not limited to the centrifugation operation, since it is also possible to obtain a fibrinogen concentrate by decantation, filtration, etc., in addition to the centrifugation operation.
  • fiprinogen concentrate is obtained from plasma in a short time of 1 to 2 hours (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-511703). Good Clio method.
  • the fibrin-containing biological scaffold of the present invention obtained as described above has a fibrinogen recovery rate of 15 ° /. ⁇ 32 ° /.
  • fibrinogen concentrate obtained by precipitation from plasma so as to be in the range of
  • the activity as a biological scaffold is high if the recovery is adjusted to be in the range of 15 to 32% as described in the Examples.
  • the present inventors have found.
  • the “fibrinogen recovery rate” refers to a value that can be obtained by the following formula.
  • Fibrinogen recovery rate (amount of fipurinogen contained in fibrinogen concentrate / amount of fipurinogen contained in plasma which is a starting material used for preparing fibrinogen concentrate) ⁇ 100.
  • Quantification of fibrinogen is performed by adding thrombin and Ca2 + to a sample, and then measuring the generation time of a fibrin lot by the thrombin time method, weighing the generated clot, and immunoassay using an anti-fibrinogen antibody. However, from the viewpoint of simplicity of the operation, it is preferable to perform the thrombin time method.
  • a fibrinogen concentrate can be suitably obtained in a short time of 1 to 2 hours even by a concentration operation using a plasma component fractionation apparatus having a built-in hollow fiber membrane.
  • the hollow fiber used for the concentration preferably has a cut-off value that does not allow fibrinogen to permeate but mainly permeates liquid components.
  • the cut-off value is defined as the molecular weight of a 90% reject solute (usually using polyethylene glycol).
  • the liquid component mainly refers to a liquid component in which a substance smaller in size than fibrinogen coexists.
  • albumin may or may not pass depending on the purpose and conditions.
  • the preferred cut-off size is 30,000 to 1,500,000 daltons, more preferably 50,000 to 900,000 daltons, and within this range ⁇ 350,000 dalton fibrinogen.
  • the concentration can be effectively concentrated and the throughput can be secured by appropriate operating conditions.
  • a hollow fiber membrane having a more suitable cutoff size can be selected according to the purpose.
  • a molecular weight cutoff of 80,000 to 300,000 is selected, it is possible to simultaneously concentrate growth factors and the like having a relatively small molecular weight, and it is suitably selected according to the purpose.
  • the concentration of relatively low molecular weight components such as growth factors is not high.Comparatively high-molecular matrix proteins are concentrated at the same time as fibrinogen.
  • the pressure rise during the concentration operation can be kept sufficiently low, which is particularly effective in reducing the concentration operation time.
  • the use of membranes with a molecular weight cut-off greater than 350,000 daltons can result in some fibrinogen leakage. Even in this case, if the molecular weight cut off is 1,500,000 daltons or less, a certain enrichment can be obtained, Depending on the conditions, when the concentration is relatively low, for example, even if the concentration is 3 to 5 times, sufficient cell growth ability can be obtained.
  • the concentration of fibrinogen in hollow fibers tends to be concentrated together with fiprinogen, which is useful as a biological scaffold. Even when fibrinogen is highly recovered, its activity as a biological scaffold is often high.
  • the recovery rate of fibrinogen by the hollow fiber method is about 20% when the recovery rate is low, but it can be as high as 100% when the recovery rate is high.
  • the hollow fiber material can be appropriately selected depending on the purpose and conditions.
  • Polyolefin resins such as polyethylene, ethylene / butyl alcohol copolymer, polypropylene, poly-4-methylinole-2-pentene, fluorine resins such as polyvinylidene fluoride resin, ethylene / tetrafluoroethylene resin, and polychlorinated trifluoroethylene resin ,
  • examples include inorganic materials such as glass, alumina, and titanium, and metals such as stainless steel, titanium, and aluminum.
  • the surface inside the pores of the hollow fiber can be appropriately modified.
  • a hollow fiber having a hydrophilic material surface can often effectively avoid clogging, and is suitably selected.
  • the basic method of surface modification is to construct a hydrophilic surface.
  • Known methods can be adopted according to the purpose. For example, it is possible to make the surface hydrophilic by treating it with hot water after irradiation with ionizing radiation. Surface modification is also possible by coating an amphiphilic polymer.
  • hydroxyacrylyl or methacrylic polymers such as hydroxyethyl acrylate, hydroxyshethyl methacrylate, hydroxypropyl acrylate, or hydroxypropyl methacrylate, or amine-sized polymers or polyethylene glycol-based polymers Or hydrophilization by a copolymer or the like thereof.
  • hydroxy Shetyl methacrylate and dimethylaminoethyl methacrylate copolymer have a proven track record as a coating agent for blood treatment and are preferably used (Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-2343641).
  • the graft polymerization method is a method of bonding a chemically hydrophilic polymer to a filter carrier, and has an advantage that there is no fear of elution.
  • the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-185094 is preferably employed.
  • blood treatment materials for example, those which have been used as dialysis membranes and membranes for extracorporeal circulation are preferably used, and hydrophilized polysulfone, hydrophilized polyether sulfone, polyether sulfone 'polyarylate resin polymer alloy, polyallyl Ethersulfone, ethylene-vinyl alcohol copolymer, polyacrylonitrile, cellulose diacetate, cellulose triacetate, hydrophilized polypropylene, polyester coated with a hydrophilic polymer can be preferably used as a material.
  • the system is a concentration system for obtaining a fibrin-containing biological scaffold, comprising:
  • Figures 1 to 5 show an overview of this system.
  • Fig. 1 and Fig. 2 show plasma component fractionation devices in which both ends of a hollow fiber membrane contained in a container are potted so that the hollow interior flows outside the container.
  • the plasma component fractionation device shown in (1) is a device in which one end of a hollow fiber membrane built in a container is potted so that the hollow interior flows outside the container, and the other end is sealed.
  • both ends of the hollow fiber membrane built in the container were bent so that the hollow inside could flow to the outside of the container, and the hollow fiber was bent into a U-shape.
  • a plasma component fractionating apparatus can also be constructed in which both ends of the hollow fiber membrane are potted in the same direction. These systems use one of the distribution ports provided in the above-mentioned fractionating device to connect the inner surface of the hollow fiber membrane or the outer surface.
  • the end of the hollow part is sealed, the plasma is processed, and the concentrated liquid in the hollow part of the hollow fiber is recovered by the recovered liquid (Fig. 1, Endstop method), open the end of the hollow part, and continuously collect the concentrated liquid from the end of the hollow fiber (Fig. 2, Discard method), or when the liquid component is mainly transmitted from the outside to the hollow part (Fig. 3, Aspirate method).
  • the Endstop method has a small volume in the hollow space and therefore has little room to accumulate the target fibrinogen.Therefore, the pressure tends to increase due to clogging during plasma processing. Is preferably adopted.
  • the ratio Bin / Bout of the amount Bin of the patient's plasma flowing into the hollow space per unit time of the hollow fiber and the amount Bout of the fibrinogen concentrated solution collected from the end of the hollow fiber per unit time is as follows: It is preferably from 2 to 20 and more preferably from 5 to 10. Within this range, a pressure increase can be avoided and conditions can be set under which a fiprinogen concentrate can be obtained effectively.
  • the Aspirate method corresponds to the case where the liquid component mainly penetrates from the outside to the hollow part, and may be the case where plasma is transmitted from the outside by pressurization, or the case where the inside of the hollow part is depressurized and aspirated by suction. .
  • suction no pressure is applied to the concentrate side, so that denaturation of the concentrate, which is the target substance, can be prevented. Therefore, it is possible to set a higher pressure than in the case of pressurization.
  • the pressure difference due to suction cannot be set above atmospheric pressure in principle, an efficient concentration operation can be realized with a pressure difference close to atmospheric pressure, for example, a pressure difference of 0.5 MPa or more.
  • the ratio of the amount Cinitial of the patient's plasma to be brought into contact with the outer wall of the hollow fiber to the amount Cend of the obtained fibrinogen concentrate, Cinitial / Cend, is preferably 2 to 20. And more preferably 5 to 10. Within this range, it is possible to set a condition under which a pressure increase can be avoided and a fibrinogen concentrate can be obtained effectively. Furthermore, a range of suitable conditions Aspirate method, the plasma quantities 5 X 10 one 5 ⁇ 5 X 10 one 4 m 3, contacted to the hollow fiber outer surface area 0. 00 l ⁇ lm 2, the difference by the suction The pressure is preferably 0.001 to 0.08 MPa.
  • the amount of the plasma 1 X 10 one 4 ⁇ 4 X 10- 4 m 3 , the outer surface area of the hollow fiber contacting is from 0.01 to 0. 5 m 2, the differential pressure by the suction is from 0.01 to 0 08MPa.
  • FIG. 3 shows a type in which the hollow fiber is introduced into a general module case
  • FIG. 4 shows a type in which the hollow fiber is introduced into a blood bag.
  • the plasma is introduced into the blood bag, and a fibrinogen concentrate can be immediately obtained from the plasma by an aspiration method.
  • FIG. 5 shows a type in which a plurality of bundles of hollow fibers by the Aspirate method are introduced so that a suction operation can be performed in multiple stages. Install vertically as shown in the figure, and perform suction operation from above. If the pressure rises due to clogging, move on to the next stage of suction with the hollow fiber bundle. An appropriate pressure rise is from 0.05MPa to 0.07MPa.
  • any of the Endstop method, Discard method and Aspirate method after obtaining a concentrated solution having a certain concentration, it is possible to concentrate by another operation. For example, this corresponds to a case where the concentration is further added by centrifugation, or a case where a precipitate is formed by freezing and thawing.
  • concentration method By combining the concentration method with the hollow fiber and these concentration methods, it is possible to efficiently obtain a liquid having a high concentration ratio.
  • the fipurin-containing biological scaffold of the present invention also comprises a fibrinogen activator.
  • fibrinogen activator refers to a substance having an action of converting fibrinogen into fibrin, and specifically includes thrombin.
  • thrombin those having the biological activity of thrombin, for example, those obtained by fractionating plasma proteins can be used.
  • thrompoplastin is allowed to act in the presence of Ca 2+ on prothrombin purified from human or pest plasma, preferably from the same human plasma as that used for preparing the fibrinogen concentrate. Can be used. Alternatively, use commercially available pharmacopeia You may.
  • the blending amount of thrombin in the scaffold may be 0, 01 to: L00 units, preferably 0, 1 to 10 units, per 1 mg of fibrinogen concentrate.
  • the fipurin-containing biological scaffold of the present invention contains a substance derived from plasma that is involved in the formation and stabilization of fipurin.
  • plasma-derived substances involved in the formation and stabilization of fibrin include Factor XIII, fibronectin and the like.
  • the fibrin-containing biological scaffold of the present invention can be suitably used for culturing cells used in regenerative medicine such as skin, cartilage, bone, liver, kidney and cornea.
  • Examples of cells include human-derived stem cells (particularly, bone marrow-derived mesenchymal stem cells), endothelial cells, epithelial cells, parenchymal cells (particularly, hepatic parenchymal cells), fibroblasts, keratinocytes, bone cells, and osteoblasts Cells, osteoclasts, hematopoietic stem cells, and the like.
  • the method of cell culture is not particularly limited, but a method of adding a mixture of cells and a medium to a scaffold, leaving the mixture at a predetermined temperature and a predetermined temperature, or the like can be used.
  • the medium is not particularly limited, and either a serum medium or a serum-free medium can be used.
  • Serum media include MEM medium, BME medium, DME medium, ct MEM medium, IMEM medium, ES medium, DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, RPMI medium, and the above.
  • a medium obtained by adding serum to a basal medium such as a mixed medium of the medium, etc. may be mentioned.
  • the atmosphere for cell culture is not particularly limited, and for example, an atmosphere such as a mixture of carbon dioxide and air can be used.
  • the culture temperature of the cell culture is preferably from 10 to 50 ° C, particularly preferably from 30 to 40 ° C, in that the proliferation and differentiation of the cells can be actively performed.
  • Methods for detaching and recovering the culture obtained according to the above method from the scaffold include methods for lowering the ambient temperature or the temperature of the scaffold, replacing the medium with a low-temperature medium, and chelating such as EDTA. Addition of chemicals, treatment with an enzyme such as trypsin or collagenase, and mechanical peeling with a cell scraper. It is.
  • the above-described cell culture may be performed in the presence of a substance that stimulates cell growth and differentiation.
  • a substance that stimulates cell growth and differentiation substances released from platelets obtained by the following method, substances released from leukocytes, and mixtures thereof are suitable.
  • Cell growth factor binding Cell growth factor such as tissue growth factor and the like may be used.
  • the substance released from the platelets include ATP, ADP, collagen, thrombin, and the like.
  • the substances released from the platelets include the following steps:
  • Examples of the first-stage filter used in this step (1) include a filter described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-5088813 and the like.
  • Examples of the second-stage filter used in the step (2) include a filter described in Japanese Patent Publication No. 2-135587 and the like.
  • the platelet activating substance refers to ATP, ADP, epinephrine, collagen, thrombin, trypsin, latex particles and the like.
  • the recovery solution containing the platelet activating substance refers to a solution obtained by dissolving the platelet activating substance in an appropriate buffer such as physiological saline or a phosphate buffer, an albumin solution, or a mixture thereof.
  • the recovery solution containing plate-activating substance is to contact platelets with the above-mentioned platelet-activating substance. Can be obtained by
  • the substances released from the leukocytes are as follows:
  • the leukocyte activating substance is a substance contained in leukocytes themselves and having an activity of stimulating proliferation, differentiation, adhesion, migration and the like of leukocytes (for example, fMLP peptide, TNF, IL-1). , IL-16, etc.) or anti-T cell antibodies.
  • the recovery solution containing the leukocyte activating substance can be obtained by contacting with a surfactant, an appropriate buffer, or a hypotonic solution, or by physically breaking leukocytes.
  • a mixture of substances released from platelets and substances released from leukocytes comprises the following steps:
  • Examples of the first-stage filter used in the step (1) include a filter described in Japanese Patent Publication No. 2-13587.
  • a non-woven type filter (a flat laminated type or a cylindrical laminated type), a hollow membrane type, a porous membrane type filter and the like are suitable.
  • Well-known separation filters such as a leukocyte removal filter and a platelet passage filter (WO 01/32236, etc.), a leukocyte and platelet removal filter (Japanese Patent Publication No. 02-13587, etc.) may be used.
  • the substances released from platelets and leukocytes thus obtained can be used in regenerative medicine without using fibrin glue as a scaffold, and also as a stimulator of differentiation and proliferation.
  • the scaffold of the present invention is excellent in adhesion to fibroblasts, chemotaxis, and cell growth promoting activity, as shown in Examples below. It also has excellent cell proliferation promoting activity on vascular endothelial cells. Furthermore, as shown in the Examples below, the substances released from activated platelets and activated leukocytes obtained by the method of the present invention have a cell growth promoting activity on fibroblasts and vascular endothelial cells. That is, by using the scaffold of the present invention for the treatment of skin damage such as diabetes, obstructive arterial disease (AS0) and other intractable ulcers, so-called wounds, fibroblasts and vascular endothelial cells can be obtained at wound sites. A healing promoting effect can be imparted to the healing process called the inflammatory reaction phase and the growth phase (granulation phase) where migration and proliferation are required. Therefore, the scaffold of the present invention is also effective for treating wounds.
  • a healing promoting effect can be imparted to the healing process called the inflammatory reaction phase and the growth
  • the present invention also provides a system for producing a fibrin-containing biological scaffold.
  • the manufacturing system includes the following means:
  • the system for producing a biological scaffold according to the present invention can be incorporated into, for example, a blood processing apparatus as shown in FIG.
  • the blood processing device passes the blood collected from the living body through the first filtration column (15) for plasma separation, and separates the plasma separated by the first filtration column through the second filtration column (16). It is a system based on the double filtration method of returning to the living body.
  • conventional blood processing equipment removes high molecular fractions such as LDL and VLDL using a second filtration column for fractionating plasma components, and reduces plasma viscosity to reduce arteriosclerosis. It was intended to prevent and treat vaso-occlusion and hyperlipidemia caused by liposome, and the polymer fraction separated by the filtration membrane was discarded.
  • One aspect of the present invention is to obtain a fibrinogen-rich fraction suitable for a material of a fibrin-containing biological scaffold using a polymer fraction that has been conventionally discarded.
  • a filtration membrane having a specific cut-off value is used for the second filtration column for fractionating plasma components.
  • the hollow fiber membrane described in the fibrinogen concentration system may be used.
  • blood is collected through an injection needle or a catheter connected to a blood vessel of a living body.
  • any of conventionally known devices such as a membrane separation type and a centrifugal separation type can be used.
  • a membrane-separated plasma separation device is a device in which a housing is filled with a hollow fiber-type separation membrane having a pore diameter that does not allow blood cells to pass at least. When blood flows inside the hollow fiber, the hollow fiber membrane wall is formed. Through which plasma components are separated.
  • the material of the separation membrane is not particularly limited, and examples thereof include polysulfone, polyethersulfone, polyethylene, polypropylene, senorelose, senorelose acetate, ethylenevinylinolecone ole, polyatarilonitrile, Teflon, and polyester.
  • Such a membrane-separated plasma separation device is particularly preferable in that plasma can be continuously separated from blood at a constant speed.
  • a centrifugal separation type plasma separation device is a device that separates a certain amount of blood by introducing blood into a centrifugal bowl and rotating the bowl to separate blood cells from the specific gravity of blood cells and plasma. At that point, the blood in the bowl is returned to the patient, and new blood is introduced into the bowl and centrifuged.
  • the thus obtained plasma containing a large amount of fibrinogen is obtained.
  • the fraction can be directly used as a raw material for producing a fibrin-containing biological scaffold.
  • the fibrin-containing biological scaffold is obtained by mixing a fibrinogen-rich plasma fraction obtained by the present invention with a fibrin stabilizing factor such as factor ⁇ and a fibrinogen activator such as thrombin monocalcium. Obtained by
  • the remaining fraction obtained by separating the plasma fraction rich in fibrinogen by a filtration membrane is used to prepare multi-thrombin plasma by any method capable of further activating prothrombin to generate thrombin.
  • a thrombin can be produced by adding an optimal concentration of calcium to the fraction and contacting the fraction with a negative surface charge such as silicon beads.
  • the remaining fraction obtained by separating the plasma fraction rich in fibrinogen by the second filtration membrane is used as it is, or mixed with the blood cell-rich fraction obtained by separating the plasma obtained by the plasma separation device. , Can be returned to donors.
  • the plasma fraction rich in fibrinogen separated by the second filtration membrane can be stored.
  • Example 1 Preparation of fibrinogen concentrate by modified cryo method and preparation of biological scaffold containing fipurin
  • the centrifuge tube containing the plasma was transferred into a cooling centrifuge (KUB0TA 3740) in which the temperature in the chamber was set to -2.5 ° C, and left for 30 minutes. Subsequently, the centrifuge tube was transferred to another cooling centrifuge in which the temperature of the first chamber was previously set to 12 ° C., and left for 30 minutes. Then, it was left still for 30 minutes in a refrigerator (SANYO Medicool MPR-510, 4 ° C). Finally, the mixture was centrifuged (1,000 g x 15 minutes, 1 ° C), and the supernatant was removed to obtain a fibrinogen concentrate.
  • KUB0TA 3740 the temperature in the chamber was set to -2.5 ° C, and left for 30 minutes.
  • the centrifuge tube was transferred to another cooling centrifuge in which the temperature of the first chamber was previously set to 12 ° C., and left for 30 minutes. Then, it was left still for 30 minutes in a refrigerator (SANYO Medicool MPR-510
  • Fibrinogen was quantified using a commercially available fibrinogen measurement kit (Fisher Scientific Pacific Hemostasis kit) based on the thrombin time method, and the measurement procedure was in accordance with the manufacturer's instructions.
  • the amount of recovered fipurinogen was 40.2 mg.
  • the fibrin-containing biology was quickly mixed with a fibrin-containing biological concentrate containing 50 mM calcium chloride (Sigma C5080) and a human plasma thrombin solution (Sigma T8885) (5.0 NIH units / ml).
  • a scaffold was prepared.
  • the fibrinogen concentrate and a human plasma thrombin solution containing 50 mM calcium chloride (Sigma C5080) (Sigma T8885) (5.0 NIH units / ml) are quickly mixed in equal volumes, and the fibrin-containing biology is mixed.
  • a scaffold was prepared. Comparative Example 1 (Preparation of fibrinogen concentrate by cryo method and preparation of biological scaffold containing fibrin)
  • a fibrin-containing biological foot is rapidly mixed with an equal amount of a fibrinogen concentrate and a human plasma thrombin solution (Sigma T8885) (5.0 NIH units / ml) containing 50 mM calcium chloride (Sigma C5080). Field materials were made. Comparative Example 2 (Preparation of fibrinogen concentrate and fibrin-containing biological scaffold by ethanol precipitation method)
  • the fibrinogen precipitate was collected by centrifugation at 600 g for 15 minutes to obtain a fibrinogen concentrate.
  • the amount of recovered fibrinogen is 2.7 mg.
  • the fibrinogen concentrate was dissolved at 37 ° C, and a human plasma thrombin solution (Sigma T8885) containing 0.3 volume of 80 mM calcium chloride (Sigma C5080) (5.0 NIH units / ml) was rapidly mixed to produce a fibrin-containing biological scaffold.
  • Test Example 1 proliferation stimulating activity on normal human fetal lung-derived fibroblasts
  • the bottom of the plate was washed with a phosphate buffered saline solution, and suspended in a MEM-E medium (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., 12-102-504) containing 4 mM glutamine and 10% fetal bovine serum 2 was added X 10 4 cells in normal human fetal lung-derived fibroblasts HEL299 (HEL ATCC strain number CCL137), at 37 ° C, 5% C0 2 concentration of the carbon dioxide gas incubator (Tapaiesupe' click Ltd. BNA121D) The cells were cultured for 72 hours. After the culture, non-adherent cells were washed away with a phosphate buffered saline solution which had been heated to 37 ° C in advance.
  • Fiprinogen recovery rate in the fibrinogen concentrates obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2, and the normality of the fipurin-containing biological scaffold prepared using each fibrinogen concentration Proliferation sting on human fetal lung-derived fibroblasts The intense activity is summarized in Table 1 below.
  • Example 1 The ability of the biological scaffold prepared in Example 1 to adhere to fibroblasts was measured. 0.5 ml of the fibrinogen concentrate prepared in Example 1 and 50 calcium chloride
  • the fibrin-containing biological scaffold was washed with a phosphate buffered saline solution, and the fibrin-containing biological scaffold was placed on the bottom of a 24-well multiplate (Nippon Betta Ton Dickinson No. 353 047). Formed. A D-MEM medium (manufactured by Invitrogen) containing 4 mM glutamine and 2% fetal serum was added, and a migration ability measurement chamber equipped with a collagen-coated filter (Nippon Becton Dickinson 353431) was placed on the plate. Place, 2 X 10 4 cells in normal human dermal fibroblasts (Takarabai O Co.
  • HDF- Neo were ⁇ Ka ⁇ , and incubated at 37 ° C, 5% C0 2 thermostat. Two hours later, the cells that migrated to the back of the membrane were observed under a microscope after Giemsa staining.
  • the biological scaffold prepared in Example 1 showed strong migration ability.
  • Test Example 4 proliferation stimulating activity on bone marrow mesenchymal stem cells
  • Example 1 The proliferation activity of the biological scaffold prepared in Example 1 on bone marrow mesenchymal stem cells was examined. And Fuiburino one Gen concentrate 0. 5 ml prepared in Example 1, 50raM chloride calcium ⁇ beam (Sigma Co. C5080) human plasma thrombin solution containing (Sigma Co. ⁇ 8 8 ⁇ 5) (5. 0 NIH units / ml) was quickly mixed in an equal amount, added to a 24-well multiplate (No. 353047, manufactured by Betaton Dickinson Japan), and rapidly stirred to spread over the entire plate to produce a uniform scaffold on the bottom of the plate.
  • Fuiburino one Gen concentrate 0. 5 ml prepared in Example 1, 50raM chloride calcium ⁇ beam (Sigma Co. C5080) human plasma thrombin solution containing (Sigma Co. ⁇ 8 8 ⁇ 5) (5. 0 NIH units / ml) was quickly mixed in an equal amount, added to a 24-well multiplate (No. 353047, manufactured by Betat
  • the bottom of the plate was washed with a phosphate buffered saline solution and suspended in a D-MEM medium containing 4 mM glutamine and 2% fetal bovine serum.
  • 2.5 ⁇ 10 4 normal human bone marrow-derived mesenchymal stem cells was added Takarabaio Co. PT034), it was incubated for 72 hours at 37 ° C, 5% C0 2 concentration of the carbon dioxide gas incubator.
  • As a control the same number of bone marrow mesenchymal stem cells cultured on a plate without a scaffold was used. After the culturing, dead cells were washed away with a phosphate buffered saline solution which had been heated to 37 ° C in advance.
  • Proliferation activity of the biological scaffold prepared in Example 1 on human primary hepatocytes was examined.
  • 0.5 ml of the fibrinogen concentrate prepared in Example 1 and human plasma thrombin solution (T8885, manufactured by Sigma) (5.0 NIH units / ml) containing 50 salted calcium salts (C5080, manufactured by Sigma) was quickly mixed in an equal amount, added to a 24-well multiplate (No. 353047, manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.), and rapidly stirred to spread over the entire plate to produce a uniform scaffold on the bottom of the plate.
  • the plate bottom were washed with phosphate-buffered saline, 4 mM glutamine, 2% ⁇ shea fetus serum containing suspended in D-MEM medium 2.
  • 5xl0 4 of normal human hepatocytes (Takara Bio Inc. C2591 ) was added, and the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 concentration carbon dioxide incubator for 72 hours.
  • the same number of normal human hepatocytes cultured on a plate without a scaffold was used.
  • the non-adherent cells were washed away with a phosphate buffered saline solution which had been heated to 37 ° C in advance.
  • Example 3 0.2 ml of a 25% trypsin solution (Invitrogen Corporation 15050-065) was added to each well and allowed to stand at 37 ° C in a carbon dioxide gas incubator. Thirty minutes later, liver parenchymal cells were collected, and the number of cells was counted using the CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes) according to the manufacturer's instructions.
  • the biological scaffold prepared under the conditions of Example 1 showed higher proliferative activity on human hepatocytes compared to a control plate without the scaffold.
  • Example 1 improved Clio method
  • hollow fiber membrane method Ibrinogen concentrate was prepared.
  • the centrifuge tube containing the frozen plasma was transferred into a cooling centrifuge (KUB0TA 3740) in which the temperature in the chamber was set to ⁇ 2.5 ° C., and left for 30 minutes. Subsequently, the centrifuge tube was transferred to another cooling centrifuge in which the temperature of the champer was previously set to 12 ° C, and left for 30 minutes. Then, it was left still in a refrigerator (SANYO Medicool MPR-510, 4 ° C) for 30 minutes. Finally, centrifugation (l, 000g x 15 minutes, 1 ° C) was performed, and the supernatant was removed to obtain a fibrinogen concentrate.
  • KUB0TA 3740 the temperature in the chamber was set to ⁇ 2.5 ° C., and left for 30 minutes.
  • the centrifuge tube was transferred to another cooling centrifuge in which the temperature of the champer was previously set to 12 ° C, and left for 30 minutes. Then, it was left still in a refrigerator (SANYO Medicool MPR-510
  • the fibrinogen was quantified using a commercially available fibrinogen measurement kit based on thrombin time (Fisher Scientific Pacific Hemostasis kit), and the measurement procedure was in accordance with the manufacturer's instructions.
  • the amount of recovered fibrinogen was 14.3 mg.
  • a fibrinogen concentrate was prepared using a hollow fiber membrane made of EVAL (EC—50 W, cutoff molecular weight: 300,000 Danoleton) manufactured by Kawasumi Danigaku Co., Ltd. Prepared by Aspirate method. Two bundles of 500 bm pieces of 20 cm were made. One bundle was first immersed in a container containing plasma, and aspirated from the inside of the hollow fiber by a peristaltic pump connected to the inside of the hollow fiber. 10 O mL of plasma was concentrated to 25 mL, and then the next bundle was dipped, aspirated, and concentrated to 8 mL. The time required for the concentration operation was 6 minutes for the first bundle and 11 minutes for the second bundle, for a total of 17 minutes.
  • EVAL EC—50 W, cutoff molecular weight: 300,000 Danoleton
  • Aspirate method Two bundles of 500 bm pieces of 20 cm were made. One bundle was first immersed in a container containing plasma, and aspirated from the inside of the hollow fiber by
  • the concentration of fipurinogen in the concentrate was 8.3 mg / mL. Since the concentration in the source plasma was 1.73 mg / mL, a concentration ratio of 4.8 and a recovery rate of 38% could be obtained.
  • Test Example 6 Cell proliferation stimulating activity on human fetal lung-derived fibroblasts (HEL)
  • HEL human fetal lung-derived fibroblasts
  • the scaffold activity of the biological scaffold prepared in Example 3 on human fetal lung-derived fibroblasts (HEL) was measured based on the cell growth stimulating activity.
  • Various human fibrinogen concentrates prepared in Example 3 (adjusted with a medium so that the fibrinogen concentration becomes 5.63 mg / mL) 0.3 ml was added to a 12-well multiplate (Nippon Becton Dickinson No.
  • the cell proliferation measurement test was performed by a colorimetric method using a CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega Corporation), and the measurement procedure followed the procedure attached to the manufacturer.
  • the number of cells (absorbance at a wavelength of 490 nm) using Tisseel (a biological tissue adhesive manufactured by Baxter) scaffold adjusted to the same fibrinogen concentration as the scaffold was measured. And the relative value when As shown in Table 2, all of the biological scaffolds prepared in Example 3 showed higher cell proliferation activity when Tisseel was used as a scaffold, and it was confirmed that the biological scaffold activity was higher. .
  • a fibrinogen concentrate was prepared using a hollow fiber membrane.
  • the Discard method was adopted.
  • Materials include: (1) hydrophilized polysulfone (cut-off molecular weight 300,000 daltons), (2) EVAL (force cut-off molecular weight 300,000 daltons), (3) PAN (polyatarilonitrile, cut-off molecular weight 200,000, 000 Dalton) and 4CDA (cellulose diacetate, cut-off molecular weight 350,000 Dalton) were used.
  • Each of the small modules having a length of 10 cm and a diameter of 3 cm was filled with 2000 pieces and molded.
  • Bin / Bout was set to 10 and 10 OmL of plasma was processed. The treated plasma volume was 1 OmL / min. The processing time was 10 minutes.
  • Test Example 7 Cell proliferation stimulating activity against ⁇ ⁇ tracheal-derived fibroblasts (CCL-44)) ⁇ ⁇ tracheal-derived fibroblasts (ATCC strain number CCL-44) of the biological scaffold prepared in Example 4 was measured by cell growth stimulating activity.
  • Various fibrinogen concentrates prepared in Example 4 (adjusted with a medium so that the fibrinogen concentration is 5.63 mg / mL) 0.3 ml is added to a 12-well multiplate (Nippon Becton Dickinson No. 3 5 304 4) The mixture was added on top, and 0.02 mL of a CCL-44 cell suspension containing 4 ⁇ 10 4 CCL-44 cells was further added. Add 0.3 mL of 31.3 NIHunits / ml thrombin solution (diluted from Baxta Biological Tissue Adhesive Tisseal) to quickly spread over the entire plate, and stir the plate.
  • Example 5 Preparation of activated platelet and leukocyte-releasing substance and measurement of cell proliferation stimulating activity
  • a filter capturing platelets and leukocytes was prepared as follows.
  • Activated platelets and leukocyte-releasing substances prepared in Example 5 were added to fibroblasts, and cell proliferation stimulating activity was examined.
  • 2 ⁇ 10 4 normal human fetal lung fibroblasts were seeded on a 12-well cell culture plate ( 35 3043, manufactured by Becton Dickinson Japan) (the volume of medium was 1 ml per well).
  • the culture solution was prepared by adding sodium pyruvate (ICN) to DMEM (Invitrogen) to lmM, non-essential amino acid (ICN) and L-glutamine to 2 mM, and a final concentration of 10%.
  • Fetal serum (StemCell Technologies) was added so that As a control, 0.5 NIH units / ml tonbin solution and a phosphate buffered saline solution were added to a 100 ⁇ L culture system.
  • the recovered solution prepared in Example 5 was added thereto at 100 / zL, and cultured in a 5% carbon dioxide incubator for 3 days, and the number of cells was counted.
  • the recovered solution containing activated platelets and leukocyte-releasing substances prepared in Examples 5 and 5 showed higher levels of fibroblasts than the phosphate buffered saline and thrombin solutions as controls. It showed cell growth stimulating activity.
  • the activated platelets and leukocyte-releasing substance prepared in Example 5 were added to vascular endothelial cells, and the cell growth stimulating activity was examined.
  • 2 ⁇ 10 4 normal human umbilical vein endothelial cells were seeded on a 12-well cell culture plate (353043, manufactured by Nippon Becton Dickinson) (the medium volume was 1 ml per well).
  • fetal serum StemCell Technologies
  • An ethylene Z-Butyl alcohol copolymer was used as the hollow fiber membrane. It has an inner diameter of 1750 ⁇ m (EC-50 W; manufactured by Kawasumi Chemical Co., Ltd.).
  • a small module having a length of 100 cm and a diameter of 3 cm was filled with 2000 pieces and molded. Discard method was adopted.
  • Bin / Bout was set to 10 and 5 O mL of plasma was processed, a 7.7 mg / mL concentrated solution of fibrinogen could be obtained.
  • the treated plasma volume was 1 OmL / min, and the treatment time was 5 minutes. Since the concentration of fibrinogen in the plasma of the raw material was 1.7 mg / mL, the concentration ratio was 4.5 times.
  • the Aspirate method was attempted using the same hollow fiber membrane as in Example 6. 500 cm pieces were bundled together, both ends were adhered, immersed in a container containing plasma, and suctioned from the inside of the hollow fiber by a peristaltic pump connected to the inside of the hollow fiber. After concentrating 20 mL of plasma to 40 mL, the fibrinogen concentration was 8.9 mg / mL. Since the concentration in the source plasma was 1.9 mg / mL, a concentration factor of 4.7 times could be obtained.
  • Example 8 The Aspirate method was attempted in the same manner as in Example 7. Four bundles of 500 cm bundles of 20 cm were made.
  • one bundle was immersed in a container containing plasma, and suction was performed from the inside of the hollow fiber by a peristaltic pump connected to the inside of the hollow fiber. Twenty O mL of plasma was concentrated to 60 mL, and then the next bundle was immersed and aspirated. After concentrating to 20 mL, the third bundle was concentrated to 10 mL, and the fourth bundle was concentrated to 5 mL. The time required to complete the concentration operation up to the fourth bundle was 43 minutes. The fibrinogen concentration was 16.3 mg / mL. Since the concentration in the source plasma was 1.8 mg / mL, a 9-fold concentration ratio could be obtained.
  • blood or plasma introduced into the blood or plasma inlet (2 1) passes through the hollow fiber membrane (2 4) and is converted into plasma-depleted polycytic cell fraction and plasma, or concentrated plasma and filtered plasma. It is separated and derived from outlets (2 2) and (2 3).
  • filtered plasma plasma that has passed through the membrane
  • concentrated plasma plasma concentrated without permeating the membrane
  • the fibrinogen concentration of the plasma was 2.8 mg / mL
  • the fibrinogen concentration of the filtered plasma was less than 1 mg / mL
  • the fibrinogen concentration of the concentrated plasma was 42 mg / mL.
  • the filtered plasma was placed in an activated thrombin plasma preparation device consisting of a polyvinyl chloride plasma storage bag (32) filled with physiological saline (33) and silicon beads (34), as shown in Fig. 8. After mixing with calcium-added physiological saline and silicon beads, the mixture was filtered with a filter for removing silicon beads. The filtered plasma was stored as activated thrombin plasma.
  • a high-performance biological scaffold suitable for tissue regeneration can be provided. Since the fibrin-containing biological scaffold of the present invention has a proliferative activity on various cells, it can prevent bleeding, damage / healing, form artificial bones, artificial skin or artificial organs by adhesion / closure of tissues, and liver transplantation. It is useful for treatments such as surgery, mass production of albumin, and drug metabolism research.
  • a method and system for producing a fibrin-containing biological scaffold which is quick, simple, safe and stable without risk of infection can be obtained.

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Abstract

本発明の課題は、再生医療において細胞増殖・分化を行うのに適した性能のよい足場材の提供することである。本発明によれば、フィブリン組成物を人体組織の再生及び細胞増殖に用いる場合において、ヒト血漿から、短時間・粗精製工程により得られたフィブリノーゲン濃縮物と、フィブリノーゲン活性化物との混合物を含むことを特徴とするフィブリン含有生物学的足場材が提供される。

Description

明 細 書
フイブリン含有組成物
技術分野
本発明は、 組織再生のための生物学的足場材、 その製法及ぴ製造システムに関 わる。 背景技術
近年、 従来から行われてきた臓器移植や人工臓器を用いる治療法にとって代わ る方法として、 再生医療に大きな期待が寄せられている。 再生医療の研究は、 骨 髄移植のような幹細胞の補充による細胞 ·組織の再生、創傷治癒、手術時の皮膚、 臓器の損傷修復を目指した研究と、 狭義の組織工学 （Tissue engineering) とい う概念で捉えられる一連の研究という 2つの方向性で発展してきた。 狭義の組織 工学とは、 細胞が生体内で生着する際に必要な足場 （scaffold) と細胞の両方を 用いて修復しょうとする研究である。 再生医学には 「細胞」、 「細胞の増殖 ·分ィ匕 のための足場」、及び「細胞増殖因子」 が必要である。 これまで足場となる材料に は、 生体に害を与えないための生体親和性、 新しい生体組織の形成と共に材料が 分解 Z吸収されるための生体吸収性が要求されることから生物学的材料が望まれ ている。
フイブリン糊は、 生理的な血液凝固作用を利用して、 組織の接着、 閉鎖及びそ れに続く創傷治療を行うための外用接着剤であり、 現在各種外科手術に広く用い られている。 また、 フイブリン糊を再生医療分野における生物学的足場材に用い る技術も多数知られている （Cell Transplantation, 7、 309-317s 1998；及び、 Burn, 24、 621—630、 1998)。
従来からフイブリン糊は、 ァレルギ一反応ゃショック等の免疫反応等の副作用 を避けるため、 自己血漿から調製したクリオプレシピテート （クリオ） を使用す ることが行われている。 自己血漿から調製した自己フイブリン糊は、 言うまでも なく組織再生用途以外にも、 血液凝固作用を利用した自己組織の接着 ·閉鎖によ る止血用途に用いることが可能である。 これまで自己血フイブリン糊の製造方法 として以下のような方法が知られている。
例えば、 Casaliらの方法は、 長時間冷凍、 緩速解凍後、 遠心分離を行い、 全血 からブイブリ ン糊を調製するのに約 30 時間かかるという方法である
(Transmission, 32、 641-643、 1992 :以下、本明細書において本方法を「クリオ法」 という）。
その概略を説明すると、 まず、全血を採取し、 この全血を遠心分離（l，000g X 15 分、 4 °C)して血漿成分を分離する。次に、遠心分離により得られた血漿成分を超 低温フリーザーに移し、 -80°Cにて 18時間静置して凍結させる、 次に凍結状態の 血漿成分を約 4 °Cの冷蔵庫に入れて、 16時間かけて緩速解凍する。 このような凍 結及び解凍処理を血漿成分に施すと、 血漿成分中にクリオプレシピテート （フィ プリノーゲン/第 1 3因子）が析出する。次に冷却遠心機にて lOOO X gで 15分程 度の遠心分離を行う（4°C)。 解凍後、 さらに再び 4°Cにて 1000 X gで 15分程度の 遠心分離を行い、 沈澱物を回収し、 フイブリノ一ゲン濃縮物とする。 一回目の解 凍、 遠心後に得た沈澱物を乱さぬように注意しながら、 上記条件に従って再度凍 結及び解凍を操り返す場合もある (ダブルクリオ法)。
別の方法として、 Kjaergard によるエタノール沈澱法がある （Surg Gynecol 0bstet、 175 (1)、 July, 1992：以下、 本明細書において本方法を 「エタノール法」 という）。 この方法は、全血から得られた血漿を氷水上でエタノールを添加してフ イブリノ一ゲンを沈澱させる方法である。
上記のクリオ法又はエタノール法で得られたフイブリノ一ゲンを用いたフイブ リン糊は、 再生医療などの生物学的足場材として使用可能であることが報告され ている。 例えば、 エタノール法によって得られたフイブリノ一ゲンで調製したフ イブリンゲル内に繊維芽細胞を包埋して、 その上に上皮細胞を播種することによ り、人工皮膚を作製する技術（特開平 1 0— 2 7 7 1 4 3号公報）、ェタノール法 によって得られたフィブリノ一ゲンで調製したフィブリンゲルで生物学的足場材 を作製し、 その上で角化細胞培養物を作製し、 移植用表皮細胞層とする技術、 繊 維芽細胞と角化細胞により移植用真皮細胞層とする技術 （特許第 3 1 3 4 0 7 9 号公報） 等が知られている。 また、 クリオ法とエタノール法で得られたフィプリ ノーゲンを用いてフィプリン培養を行い、 軟骨細胞の細胞増殖及び代謝能の比較 検討を行った結果、 クリオ法の方が軟骨細胞の形態維持、 細胞増殖、 プロテオグ リ力ン蓄積がより支持されるとレヽぅ報告がある（American Journal of Veterinary Research, 59、 514—520、 1998)。
また、 上記タリォ法を改良し、 短時間冷凍、 急速解凍を行い、 1〜 2時間とい う短時間でフイブリノーゲンを得る方法が知られている（特表 2 0 0 1 - 5 1 3 0 7 3号公報:以下、 本明細書 おいて本方法を「改良クリオ法」という）。 同種角膜 上皮幹細胞を、 血漿を原料として上記の改良クリォ法で作製したフィプリンゲル 内で培養し、 目の表面組織置換体 （角膜置換体） を作製するという報告があるが (Cornea 21 (5)： 505-510、 2002)、 この論文では、 細胞とフイブリン足場材は同一 人由来のものではなく、また足場材としての性能を他法と比較したものでもなレ、。 自家フィプリン糊調製のためのフイブリノ一ゲン製造方法として、 有機溶媒に よる沈殿に続く遠心分離、 あるいは 8回から 1 0回の凍結解凍の繰り返し操作後 に遠心分離を行う装置の開示がある （米国特許第 6 0 8 3 3 8 3号明細書)。 また、 自己フイブリン糊を迅速に調製する方法としてフイブリノ一ゲン濃縮の ために限外ろ過法を用いる方法が提供されている （特表平 1 1—5 0 8 8 1 3号 公報)。 この方法では、血液画分を濃縮するために「真空源に接続するのに適合し た出口、 並びに第 1及び第 2の開口部を有する限外ろ過ユニットと、 前記血液画 分を前記限外ろ過ュニットに送り出すための流体デリバリーシステムに、 前記限 外ろ過ュニットの第 1の開口部を接続する第 1のバルブと、 パージ流体デリバリ 一システムに、前記限外ろ過ュニットの第 2の開口部を接続する第 2のバルブと、 を含む装置」 を用いるものである。
しかし、 この方法では、 ①装置への血漿の導入が閉鎖系にできない、 ②血漿を 採取するための手段が別途必要である、 ③分画分子量が 3 0， 0 0 0ダルトンで あるために、 血漿中のアルブミンなど、 低分子タンパク分画が透過できない。 そ のため、 十分な透水効果が得られず、 フイブリノ一ゲンの高度な濃縮ができず、 結果として、 フイブリン糊製造に際して凝固時間が長く、 安定性の悪い製剤しか 得られない、 ④濃縮倍率が十分でなく、 ろ過濃縮した血漿をさらに濃縮しなけれ ば、 フィプリン糊の製造に至適なフイブリノ一ゲン濃度が得られない、 ⑤分画分 子量が 3 0， 0 0 0ダルトンであるために、 プロトロンビンをフイブリノ一ゲン 濃縮血漿から分離できず、 保存期間中に凝固してしまう可能性がある、 などの問 題点があった。 発明の開示
本発明の課題は、 再生医療において細胞増殖 ·分化を行うのに適した性能のよ い足場材を提供することである。 さらには、 迅速 '簡便で、 感染の危険性のない 安全かつ安定なフィブリン濃縮物の製造方法及び製造システムを提供することで める。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、 短時間冷却及び急速 解凍による方法 （改良クリオ法） により得られたフイブリノ一ゲン濃縮物、 及び 特定の力ットオフ値を有する血漿分離膜を用いることによって得られたフィプリ ノーゲン濃縮物が、 優れた再生医療の足場材であることを見出した。 さらに中空 糸膜である血漿分離膜を組み込んだフイブリノ一ゲン濃縮システムを考案し、 本 発明の完成に至った。
すなわち、 本発明によれば、 以下の発明が提供される。
( 1 ) フイブリン組成物を人体組織の再生及び細胞増殖に用いる場合におい て、 ヒト血漿から、 短時間 ·粗精製工程により得られたフイブリノ一ゲン濃縮物 と、 フイブリノ一ゲン活性化物との混合物を含むことを特徴とするフィプリン含 有生物学的足場材。
( 2 ) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 血漿を短時間冷却工程、 急速解凍ェ 程、 及ぴフイブリノ一ゲン濃縮物を回収する工程を含む方法によって得られたも のである （1 ) に記載のフイブリノ一ゲン含有生物学的足場材。 (3) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 フイブリノ一ゲン回収率が 15%か ら 32%の範囲になるよう血漿から沈殿させて得られたものである （1) または
( 2 ) に記載のフイブリン含有生物学的足場材。
(4) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 血漿を 10分から 60分間の冷却ェ 程、 15分から 60分間の解凍工程、 及ぴフイブリノ一ゲン濃縮物を回収するェ 程を含む方法によって得られたものである （1) 〜 （3) の何れかに記載のフィ プリン含有生物学的足場材。
(5) 冷却工程を- 20°C力 ら- 40°Cで行い、 解凍工程を - 10°Cから + 1 5°Cで行う （3) または （4) に記載のフイブリン含有生物学的足場材。
(6) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 ヒ ト血漿から血漿成分分画装置を用 いて得られたものである （1) に記載のフイブリン含有生物学的足場材。
( 7 ) 前記血漿成分分画装置が血漿成分分画用の中空糸膜を内蔵したもので ある （6) に記載のフィブリン含有生物学的足場材。
(8) 前記中空糸膜の素材が、親水化ポリスルホン、 EVAL (エチレン一ビニル アルコール共重合体）、 PAN (ポリアクリロニトリル）、 CDA (セルロースジァセテ 一ト）、 CTA (セルローストリアセテート） からなる群から選ばれる何れか一つで ある （7) 記載のフィブリン含有生物学的足場材。
(9) 前記中空糸膜素材が、 親水化ポリスルホンまたは EVAL (エチレンービ ニルアルコール共重合体）である（ 8 )に記載のフィブリン含有生物学的足場材。
(10) 前記中空糸膜のカットオフ値が 80， 000ダルトン以上 300， 000ダルトン以下である （6) 〜 （9) の何れかに記載のフイブリン含有生物 学的足場材。
(1 1) 前記中空糸膜の力ットオフ値が 1 50, 000ダルトン以上 400， 000ダルトン以下である （6) 〜 （9) の何れかに記載のフイブリン含有生物 学的足場材。
(12) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 血漿成分分画装置における中空糸 の中空部にヒト血漿を流通させ、 その際に、 中空糸内壁から外壁に主として液体 成分を透過させることにより、中空糸の末端から得られたものである（6)〜（1 1 ) の何れかに記載のフィプリン含有生物学的足場材。
(13) 前記中空部に流入させる単位時間あたりの当該患者血漿の量 Binと、 中空糸末端より単位時間あたりに採取するフイブリノ一ゲン濃縮液の量 Bout と の比 Bin/Bout力 2〜20の範囲である （12) に記載のフイブリン含有生物 学的足場材。
(14) 前記 Bin/Bout比が 5〜10の範囲である （12) または （13) に 記載のフィブリン含有生物学的足場材。
(15) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 血漿成分分画装置における中空糸 の外壁にヒト血漿を接触させ、 その際に、 中空糸外壁から内壁に主として液体成 分を透過させることにより、 中空糸の外部に接触させている血漿を濃縮して得ら れたものである （6) 〜 （14) の何れかに記載のフイブリン含有生物学的足場 材。
(16) 液体成分を透過させる際に、 中空糸の中空部を減圧にし、 吸引によ つて中空糸外部より中空糸内部に透過させる （1 5) に記載のフィブリン含有生 物学的足場材。
(17) 前記中空糸の外壁に接触させる血漿の量 Cinitialと主として液体成 分を透過させて、 中空糸の外部に接触させている当該血漿を濃縮し得られるフィ プリノーゲン濃縮液の量 Cendの比、 Cinitial/Cend比が 2〜20の範囲である（1 5) または （16) に記載のフイブリン含有生物学的足場材。
(18) 前記 Cinitial/Cend比が 5〜10の範囲である （1 5) 〜 （1 7) の何れかに記載のフィブリン含有生物学的足場材。
(19) 前記中空糸の外壁に接触させる当該患者血漿の量が 5 X 10一5〜 5 X 10一4 m3、 接触させる中空糸の外表面積が 0. 00 l〜lm2、 吸引による差 圧が 0. 001〜0. 08 MP aとする （1 5) 〜 （18) の何れかに記載のフ イブリン含有生物学的足場材。
(20) 前記フイブリノ一ゲン活性化物質がトロンビンである （1) 〜 （1 9 ) の何れかに記載のフィプリン含有生物学的足場材。
(21) 前記トロンビンが、 フイブリノ一ゲンと同一人の血液から得られた ものである （20) に記载のフイブリン含有生物学的足場材。
(22) 血管内皮細胞、 線維芽細胞、 角化細胞、 間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨 芽細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 膝細胞及び造血幹細胞からなる群から選ばれる細 胞の培養のために使用する （1) 〜 （21) の何れかに記載のフィブリン含有生 物学的足場材。
(23) 血管内皮細胞、 線維芽細胞、 角化細胞、 間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨 芽細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 膝細胞及び造血幹細胞からなる群から選ばれる少 なくとも一種の細胞を、 生物学的足場材無しあるいは精製フイブリノ一ゲン濃縮 物を対照とした時、 対照を上回る細胞増殖活性を有する （1) 〜 （22) の何れ かに記載のフイブリン含有生物学的足場材。
(24) (1) 〜 （23) の何れかに記載のフィブリン含有生物学的足場材 を用いて細胞を培養することを含む細胞培養または組織再生のための方法。
(25) 前記細胞が、血管内皮細胞、線維芽細胞、角化細胞、間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 膝細胞及ぴ造血幹細胞からなる群から 選ばれる （24) に記載の方法。
(26) 前記細胞が、 フイブリノ一ゲン濃縮物の原料とした血漿を採取した 人と同一人に由来する （24) または （25) に記載の方法。
(27) 細胞増殖 ·分化刺激物質の存在下で培養を行う （24) 〜 （26) の何れかに記載の方法。
(28) 前記細胞増殖 ·分化刺激物質が、 血小板から放出される物質である (27) に記載の方法。
(29) 前記血小板から放出される物質が、 下記の工程：
(1) 赤血球、 血小板、 及ぴ血漿を通過させ、 かつ白血球を吸着する第 1段フィ ルターに全血を通し、 フィルターからの通過画分を得る工程；
(2) (1) で得られた通過画分を、血小板を吸着し、 赤血球を通過させる第 2段 フィルターに通し、 血小板が吸着したフィルターを得る工程；
(3) (2) で得られたフィルターに、血小板活性化物質を含む回収液を通し、活 性化血小板放出物質の含有液を得る工程：を含む方法によって得られる （28) に記載の方法。
(30) 前記血小板活性化物質が、 ATP、 ADP、 コラーゲン、 及ぴトロンビン から成る群から選ばれる少なくとも 1つの物質である （29) に記載の方法。
(31) 前記細胞増殖 ·分化刺激物質が、 白血球から放出される物質である (27) に記載の方法。
(32) 前記白血球から放出される物質が、 下記の工程：
(1) 赤血球、 血小板、 及ぴ血漿を通過させ、 白血球を吸着する第 1段フィルタ 一に全血を通し、 白血球が吸着したフィルターを得る工程；
(2) (1) で得られたフィルターに白血球活性化物質を含む回収液を通し、活性 化白血球放出物質の含有液を得る工程；を含む （31) に記載の方法。
(33) 前記細胞増殖 ·分化刺激物質が血小板から放出される物質と白血球 から放出される物質の混合物である （27) に記載の方法。
(34) 前記血小板から放出される物質と白血球から放出される物質との混 合物が、 下記の工程：
(1) 赤血球と血漿を通過させ、 血小板と白血球を吸着するフィルターに全血を 通し、 血小板と白血球が吸着したフィルタ一を得る工程；
(2) (1) で得られたフィルターに、血小板活性化物質と白血球活性化物質を含 む回収液を通し、 活性化血小板放出物質と活性化白血球放出物質の含有液を得る 工程を
含む方法によって得られることを特徴とする （33) に記載の方法。
(35) 細胞が、人由来の細胞をフィルターに通すことによって得られる（2
4) 〜 （34) の何れかに記載の方法。
(36) フイブリノ一ゲン濃縮物の原料である血漿が、 人血液をフィルター に通すことによって得られたものである （24) 〜 （34) の何れかに記載の方 法。
(37) (24) 〜 （36) のいずれかに記載の方法によって得られる足場 材に坦持された細胞培養物または再生組織。
(38) (37) に記載の細胞培養物または再生組織を、 損傷を受けた組織 に塗布または移植片として用いる糸且織再生促進方法。
(39) (1) 〜 （23) の何れかに記載の生物学的足場材と細胞を混合し た混合物を、 損傷を受けた組織に添加する工程を含む組織再生促進方法。
(40) 前記細胞が、血管内皮細胞、線維芽細胞、角化細胞、間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 腌細胞及び造血幹細胞からなる群から 選ばれる少なくとも一つの細胞である （39) に記載の組織再生促進方法。
(41) フイブリン含有生物学的足場材を得るための濃縮システムであって、 以下の手段：
(1) ヒ ト血漿を血漿成分分画膜によって粗精製する手段；
(2) ヒ ト血漿を前記膜表面に導入する手段；
(3) 前記膜表面からフイブリノ一ゲン濃縮物を得る手段；
を含むフイブリノーゲン濃縮システム。
(42) 前記血漿成分分画膜の力ットオフ値が 80 , 000ダルトン以上 3 00, 000ダルトン以下であることを特徴とする （41) に記載のシステム。
(43) 前記血漿成分分画膜の力ットオフ値が 150， 000ダルトン以上 400， 000ダルトン以下であることを特徴とする（41)に記載のシステム。
(44) 前記血漿成分分画膜が中空糸膜である （42) 又は （43) に記載 の濃縮システム。
(45) 前記中空糸膜の素材が、親水化ポリスルホン、 EVAL (エチレンービニ ルアルコール共重合体）、 PAN (ポリアクリロニトリル）、 CDA (セルロースジァセ テート）、 CTA (セルローストリアセテート） からなる群から選ばれる何れか一 つであることを特徴とする （44) に記載のシステム。
(46) 前記中空糸膜素材が、 親水化ポリスルホン、 または EVAL (エチレン 一ビュルアルコール共重合体） である （45) に記載のシステム。
(47) 前記導入手段が、 前記分画装置に設けた流通口の一つから中空糸膜 の内表面または外膜表面にヒト血漿を導入し、 別の流通口から導出させる送液装 置または吸引装置である （41) 〜 （46) の何れかに記載の濃縮システム。
(48) 前記濃縮物を得る手段が、 前記分画装置に設けた流通口の一つに接 続される濃縮物貯留手段である （41) 〜 （47) の何れかに記載の濃縮システ ム。
(49) 前記粗精製手段が、 容器に内蔵された中空糸膜の両端部を、 中空内 部が容器外部に流通するようにポッティングしてなる血漿成分分画装置である (41) 〜 （48) の何れかに記載の濃縮システム。
(50) 前記粗精製手段が、 容器に内蔵された中空糸膜の一端を中空内部が 容器外部に流通するようにポッティングし、 他端を封止してなる血漿成分分画装 置である （41) 〜 （48) の何れかに記載の濃縮システム。
(51) 血漿成分分画装置における中空糸の中空部にヒ ト血漿を流通させ、 その際に、 中空糸内壁から外壁に主として液体成分を透過させて中空糸の末端よ りフイブリノ一ゲン濃縮液を採取する（49)に記載の濃縮システムの運転方法。
(52) 前記中空部に流入させる単位時間あたりの当該患者血漿の量 Binと、 中空糸末端より単位時間あたりに採取するフイブリノ一ゲン濃縮液の量 Bout と の比 BinZBoutが 2〜20の範囲である （51) に記載の濃縮システムの運転方 法。
(53) 前記 Bin/Bout比が 5〜 10の範囲である （52) に記載の濃縮シス テムの運転方法。
(54) 血漿成分分画装置における中空糸の外壁にヒ ト血漿を接触させ、 そ の際に、 中空糸外壁から内壁に主として液体成分を透過させて、 中空糸の外部に 接触させている当該血漿を濃縮し、 フイブリノ一ゲン濃縮液を得る （50) に記 載の濃縮システムの運転方法。
(55) 血漿を、 中空糸の外壁に接触させ、 その際に、 中空糸外壁から内壁 に主として液体成分を透過させる際、 中空糸の中空部を減圧にし、 吸引によって 該成分を中空糸外部より中空部内に透過させる （54) に記載の濃縮システムの 運転方法。
(56) 前記中空糸の外壁に接触させる血漿の量 Cinitialと主として液体成 分を透過させて、 中空糸の外部に接触させている当該血漿を濃縮し得られるフィ ブリノーゲン濃縮液の量 Cendの比、 Cinitial/Cend比が 2〜20の範囲である（5 5) に記載の濃縮システムの運転方法。
(57) 前記 Cinitial/Cend比が 5〜： L 0の範囲である （54) に記載の濃 縮システムの運転方法。
(58) 前記中空糸の外壁に接触させる当該患者血漿の量が 5 X 10— 5〜5 X 10一4 m3、接触させる中空糸の外表面積が 0. 00 l〜lm2、 吸引による差 圧が 0. 001〜0. 08 MP aとする （54) 〜 （57) の何れかに記載の濃 縮システムの運転方法。
(59) 下記の手段：
( 1 ) カットオフ値が 80, 000ダルトン以上 300， 000ダルトン以下の 血漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの 分画血漿に分離する手段；
( 2 )前記フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する手段；
(3) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物からフイブリン糊を製造する手段；
(4) 残りの分画血漿を再利用する手段；
を含むフィプリン含有生物学的足場材を製造するためのシステム。
(60) 下記の手段：
( 1 ) カットオフ値が 150, 000ダルトン以上 400， 000ダルトン以下 の血漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残り の分画血漿に分離する手段；
( 2 )前記フイブリノーゲン濃縮物と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する手段； (3) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物からフィプリン糊を製造する手段； (4) 残りの分画血漿を再利用する手段；
を含むフイブリン含有生物学的足場材を製造するためのシステム。
(61) 前記ヒ ト血漿が連続的体外循環によって採取された血漿である （5 9) 又は （60) に記載のシステム。
(62) 前記ヒト血漿を採取する手段が、 全血から血漿を分離する手段を含 む （59) から （6 1) の何れかに記載のシステム。
(63) 前記ヒト血漿を分離する手段が、 重力分離、 遠心分離あるいは膜分 離手段である （59) 〜 （62) の何れかに記載のシステム。
(64) フイブリノ一ゲン濃縮物を得るためのヒト血漿から活性化トロンビ ン血漿を調製する （59) 〜 （63) の何れかに記載のシステム。
(65) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物から活性化トロンビン液を得る （59) 〜 （64) の何れかに記載のシステム。
(66) 血漿成分分画膜によつて分画して得た残りの分画血漿を、 活性化ト ロンビン血漿の調製に用いる （59) 〜 （65) の何れかに記載のシステム。
(67) 血漿成分分画膜によつて分画して得た残りの分画血漿を、 血漿分離 手段によって血漿が分離された血漿分離血液と混合して人体に返還する （59) 〜 （66) の何れかに記載のシステム。
(68) 前記回収手段が、 得られるフイブリノ一ゲン濃縮物を単独ドナー由 来のフイブリノ一ゲン濃縮血漿として貯蔵する手段を含む （59) 〜 （67) の 何れかに記載のシステム。
(69) 前記フイブリン糊を製造する手段が、 フイブリノ一ゲン濃縮物とフ イブリン安定化因子及ぴフイブリノ一ゲン活性化因子と混合する手段を含む （5 9) 〜 （68) の何れかに記載のシステム。
(70) 下記の工程：
( 1 ) カットオフ値が 80, 000ダルトン以上 300, 000ダルトン以下の血 漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの分 画血漿に分離する工程； (2) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物フイブリノーゲンを多く含む高分子分画血漿 と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する工程；
(3) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物フイブリノ一ゲンを多く含む高分子分画血漿 からフィプリン糊を製造する工程；
(4) 及び、 残りの分画血漿を再利用する工程；
を含むフイブリン含有生物学的足場材の製造方法。
― (71) 下記の工程：
(1) カツトオフ値が 150， 000ダルト 以上 400, 000ダルトン以下の 血漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して.、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの 分画血漿に分離する工程； '
(2) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物フイブリノーゲンを多く含む高分子分画血漿 と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する工程；
(3) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物フイブリノ一ゲンを多く含む高分子分画血漿 からフイブリン糊を製造する工程；
(4) 及ぴ、 残りの分画血漿を再利用する工程；
を含むフイブリン含有生物学的足場材の製造方法。
(72) 前記ヒト血漿が連続的体外循環において採取される工程を含む （7 0) 又は （71) に記載の方法。
(73) 前記ヒト血漿を採取する工程が、 全血から血漿を分離する工程を含 む （70) 〜 （72) の何れかに記載の方法。
(74) 血漿を分離する工程が、 重力分離、 遠心分離、 あるいは膜分離工程 である （70) 〜 （73) の何れかに記載の方法。
(75) 血漿成分分画膜によって分画して得た残りの分画血漿を、 血漿分離 手段によつて血漿が分離された血漿分離血液と混合して人体に返還する工程を含 む （70) 〜 （74) の何れかに記載の方法。
(76) 前記回収工程が、 得られるフイブリノ一ゲン濃縮物を単独ドナー由 来のフイブリノ一ゲン濃縮血漿として貯蔵する工程を含む （70) 〜 （75) の 何れかに記載の方法。
( 7 7 ) フイブリン糊を製造する工程が、 フイブリノ一ゲンを多く含む高分 子分画血漿とフイブリン安定化因子及びフイブリノ一ゲン活性化因子と混合する 工程を含む （7 0 ) 〜 （7 6 ) の何れかに記載の方法。
本発明によって、 再生医療において細胞増殖 ·分化を行うのに適した性能のよ い足場材の製造、 さらには、 迅速 ·簡便で、 感染の危険性のない安全かつ安定な フィプリン濃縮物の製造方法及び製造システムを構築することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 Endstop法によるフィプリノーゲン濃縮システムを示す図である。 図 2は、 Discard法によるフィプリノーゲン濃縮システムを示す図である。 図 3は、 Aspirate法によるフィブリノーゲン濃縮システムを示す図である。 図 4は、血液パッグに組み込まれた Aspirate法によるフイブリノ一ゲン濃縮シ ステムを示す図である。
図 5は、血液バッグに組み込まれた Aspirate法によるフイブリノ一ゲン濃縮シ ステム （多段吸引） を示す図である。
図 1〜5において、 1は原料血漿、 2は主として液体成分、 3は濃縮液、 4は 中空糸膜、 5は原料血漿入り口、 6は濃縮液出口、 7はバルブ、 8は、 末端が封 止されたあるいは末端がループ状の中空糸膜、 そして 9も、 末端が封止されたあ るいは末端がループ状の中空糸膜を示す。
図 6は本発明の生物学的足場材の製造システムを組み込んだ血液処理装置の一 例を示す。
図 7は本発明で用いる血漿分離カラムおょぴ血漿成分分画カラムの一例を示す。 図 8は本発明で用いる活性化トロンビン血漿調製装置の一例を示す。
図 6〜 8において、 1 1は C P D添加全血貯留槽、 1 2は血漿貯留槽、 1 3は ろ過血漿貯留槽、 1 4は濃縮血漿貯留槽、 1 5は血漿分離カラム、 1 6は血漿成 分分画カラム、 1 7〜2 0は血液回路用ポンプ、 2 1は血液または血漿入口、 2 2は血漿除去多血球分画または濃縮血漿出口、 2 3は血漿またはろ過血漿出口、
2 4は中空繊維膜、 3 1はろ過血漿入口、 3 2は塩化ビュル製血漿貯留バッグ、
3 3はカルシゥム溶液、 そして 3 4はシリコンビーズを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について具体的に説明する。
「生物学的足場材」とは、 細胞が組織再生の場に定着 ·増殖 ·分化し、 組織を再 構築するための支持構造 （足場） を構成する材料として定義される。 生物学的足 場の役割としては、 上記のとおり、 細胞の定着 ·増殖 ·分化促進以外に再生のた めのスペース確保、 細胞への酸素と栄養素の供給、 細胞増殖因子の貯蔵などが挙 げられる。 実際の生体組織における生物学的足場材としては、 コラーゲン、 ラミ ユン等細胞外マトリクスと呼ばれる生体高分子が挙げられる。 また、 これら生体 高分子以外にも、 各種の合成高分子、 無機材料からなる生物学的足場材の研究開 発が行われている。 最近の研究によればフイブリンが、 生物学的足場材の活性を 有することが報告されている (Cell Transplantation, 7、 309-317、 1998；及ぴ、 Burn, 24、 62ト 630、 1998等）。
本発明のフイブリン含有生物学的足場材は、 ヒ ト血漿から、 短時間 ·粗精製ェ 程により得られたフイブリノ一ゲン濃縮物と、 フイブリノ一ゲン活性化物との混 合物を含んでいる。
上記のフイブリノ一ゲン濃縮物は、 一形態として、 血漿を短時間冷却工程、 急 速解凍工程、 及ぴフィプリノーゲン濃縮物を回収する工程 （例えば、 遠心分離ェ 程） を含む方法によって得られたものである。
具体的には、 上記のフイブリノ一ゲン濃縮物は、 血漿を 1 0分〜 6 0分間の冷 却工程、 1 5分〜 6 0分間の解凍工程、 及びフイブリノ一ゲン濃縮物を回収する 工程を含む方法によって得ることができる。 また、 好ましくは、 冷却工程は一 2 0 °Cからー 4 0 °Cで行い、 解凍工程は一 1 0 °C〜十 1 5 °Cで行うことができる。 原料となる血漿は、 生体適合性の点から、 ヒトを対象とする場合はヒ トの血漿を 用い、 また動物を対象とする場合はその動物の血漿を用いることが好ましい。 上記フィプリノーゲン濃縮物を得るための手法のより具体的な態様は以下の通 りである。 まず、 全血を遠心分離 (4°C)して得た血漿を、 _30°C程度の低温で 30 分間静置して凍結させ、 次に、 _2. 5°Cで 30分間放置し、続いて、 12°Cで 30分間 放置する。続いて、 4°Cで 30分間放置し、最後に遠心分離（l, 000g X 15分、 1 °C) して上清を除去し、 フイブリノ一ゲン濃縮物を得ることができる。 あるいは別法 としては、 全血を遠心分離（l, 000g X 15 分、 4°C)して得た血漿を、 一 30°C程度の 低温で 60分間静置して凍結させた後、 一 5°Cで 30分間放置し、 その後、 4°Cで 30 分間放置する。 最後に遠心分離 （l，000g X 15分、 1 °C) して上清を除去し、 フィ プリノーゲン濃縮物を得ることができる。
なお、 遠心分離操作以外にも、 デカンテーシヨンやろ過等でフイブリノ一ゲン 濃縮物を得ることも可能であるので、 本宪明は遠心分離操作に限定されるもので はない。
これらの方法は、 フィプリノーゲン濃縮物を血漿から 1〜 2時間という短時間 で得る方法であり （特表 2 0 0 1 - 5 1 3 0 7 3号参照）、本明細書において、「改 良クリオ法」 と呼ぶ。
上記のように得られた本発明のフィプリン含有生物学的足場材は、 フイブリノ 一ゲン回収率が 15°/。〜32°/。の範囲になるように血漿から沈澱させて得られたフィ プリノーゲン濃縮物を含む。
上記の冷凍融解による方法 （改良クリオ法） では、 実施例に記載したように、 回収率が 1 5— 3 2 %の範囲になるように調整すると生物学的足場材としての活 性が高いことを本発明者らは見出した。
本明細書において、 「フイブリノ一ゲン回収率」 とは、下記式によって得ること ができる値をいう。
フイブリノーゲン回収率 = (フイブリノーゲン濃縮物中に含まれるフィプリノ 一ゲン量/フイブリノ一ゲン濃縮物の調製に用いる出発物質である血漿中に含ま れるフィプリノーゲン量） X 100。 フイブリノ一ゲンの定量は、 試料にトロンビンと C a 2+を加え、 フイブリンク ロットの生成時間を測定するトロンビン時間法、生成クロットを秤量する重量法、 抗フイブリノ一ゲン抗体を用いる免疫学的測定法等のいずれでもよいが、 操作の 簡便性の点から、 トロンビン時間法で行うことが好ましい。
本発明の別の側面によれば、 フイブリノ一ゲン濃縮液は、 中空糸膜を内蔵した 血漿成分分画装置による濃縮操作によっても、 1〜2時間という短時間で、 好適 に得ることができる。 濃縮に用いる中空糸は、 カットオフ値として、 フイブリノ 一ゲンは透過せず、 主として液体成分は透過する値が好ましい。 カットオフ値と は、 阻止率 9 0 %の溶質 （通常ポリエチレングリコールを用いる） の分子量とし て定義される。 この場合、 主として液体成分とは、 フイブリノ一ゲンよりサイズ の小さな物質の共存する液体成分を指す。 フイブリノ一ゲンよりサイズの小さな 物質として、 アルブミンは、 目的や条件に応じて透過させる場合と透過させない 場合がありうる。 適当な中空糸を選択することによって、 透過液の成分として透 過させる場合あるいは透過させずに濃縮液中に残存させる場合に対応させる。 カットオフサイズとして好ましいのは、 30, 000〜1， 500, 000 ダルトンであり、 さらに好ましくは 50, 000〜900, 000ダルトンである .この範囲であれば〜 350， 000 ダルトンのフイブリノ一ゲンを効果的に濃縮し、 かつ適当な運転条件によって、 処理量を確保することができる. この範囲の中で、 目的に応じて、 さらに好適な カットオフサイズの中空糸膜を選択することができる。 分画分子量 80, 000〜 300, 000 を選択すると、 分子量の比較的小さい、 成長因子なども同時に濃縮する ことが可能であり、 目的によって好適に選択される。 また、 分画分子量 150, 000 〜400, 000 を選択すると、 成長因子等の比較的低分子量成分の濃縮度は高くない 力 比較的高分子のマトリクス蛋白が、 フイブリノ一ゲンと同時に濃縮され、 か つ濃縮操作時における圧力上昇を十分低く維持することができ、 特に、 濃縮操作 時間の短縮において有効である。 分画分子量が 350, 000ダルトンを超える膜を使 用すると、 ある程度のフイブリノ一ゲンのリークが起こりうる。 この場合でも、 分画分子量が 1, 500, 000ダルトン以下であれば、一定の濃縮度を得ることができ、 条件によっては、 濃縮度が比較的低い場合、 たとえば、 3〜5倍の濃縮度であつ ても、 十分な細胞増殖能を得ることができる。
中空糸でのフイブリノ一ゲン濃縮では、凍結融解法（クリオ法、改良クリオ法な ど） とは異なり、 生物学的足場材として有用な成分もフィプリノーゲンと一緒に 濃縮される傾向があり、 フイブリノ一ゲンの回収率が高くても生物学的足場材と しての活性は高いことが多い。 中空糸法でのフイブリノ一ゲン回収率は低い場合 で 2 0 %程度だが、 高い場合は 1 0 0 %近くの高回収率も実現できる。
中空糸素材は目的や条件に応じて適宜選択することができる。 ポリエチレン、 エチレン/ビュルアルコール共重合体、 ポリプロピレン、 ポリ- 4 -メチノレ- 2 -ぺ ンテン等のポリオレフイン樹脂、 ポリフッ化ビニリデン樹脂、 エチレン / テトラ フルォロエチレン樹脂、ポリクロ口トリフルォロエチレン樹脂等のフッ素系樹脂、 ポリスルホン、 ポリスチレン、 アクリル樹脂、 ナイロン、 ポリエステル、 ポリ力 ーボネート、 ポリアクリルアミド、 ポリウレタン等、 その他各種の合成高分子、 ァガロース、 セルロース、 酢酸セルロース、 キチン、 キトサン、 アルギン酸塩等 の天然高分子ハイドロキシアパタイト、 ガラス、 アルミナ、 チタ-ァ等の無機材 料、 ステンレス、 チタン、 アルミニウム等の金属が上げられる。
特に、 疎水性の素材を採用する場合、 中空糸の細孔内表面は適宜改質されてい るものを選択することができる。 たとえば、 素材表面を親水化した中空糸は、 目 詰まりを効果的に回避することができる場合が多く、 好適に選択される。 表面改 質の方法は、 親水性の表面を構築することが基本となる。 公知の方法を目的に応 じて採用することができる。 たとえば、 電離性の放射線照射後、 熱水で処理する ことによって表面を親水化することが可能である。 また、 両親媒性の高分子をコ 一ティングすることによつても表面改質は可能である。 たとえばヒドロキシェチ ルアタリ レート、 ヒ ドロキシェチルメタタリ レート、 ヒ ドロキシプロピルアタリ レート、 ヒ ドロキシプロピルメタクリ レート等のヒ ドロキシァクリルあるいはメ タクリル系の高分子、 あるいはアミン径高分子やポリエチレングリコール系高分 子、 または、 それらの共重合体等による親水化である。 これらの中で、 ヒドロキ シェチルメタクリレートとジメチルァミノェチルメタクリレート共重合体は、 血 液処理のコーティング剤として、 実績があり、 好適に採用される （特開平 1 0— 2 3 4 3 6 1公報)。また、グラフト重合法はフィルター担体に化学的に親水性を 有する高分子を結合させる方法で、 溶出の心配が無いなどの利点を有する。 特開 2 0 0 0 - 1 8 5 0 9 4公報に記載された方法などが好適に採用される。
この中で、 血液処理材料、 たとえば透析膜や体外循環用の膜として使用実績の あるものが好適に採用され、親水化ポリスルホン、親水化ポリエーテルスルホン、 ポリエーテルスルホン 'ポリアリレート樹脂ポリマーァロイ、 ポリアリルエーテ ルスルホン、エチレン一ビュルアルコール共重合体、ポリアクリロニトリル， セ ルロースジァセテート， セルローストリアセテート、親水化ポリプロピレン、親 水性の高分子をコーティングしたポリエステルなどは、 素材として、 好ましく用 いることができる。
ここで、 前記中空糸を組み込んだフイブリノーゲン濃縮システムについて説明 する。 本システムは、 フイブリン含有生物学的足場材を得るための濃縮システム であって、 以下の手段：
( 1 ) ヒ ト血漿を血漿成分分画膜によって粗精製する手段；
( 2 ) ヒ ト血漿を前記膜表面に導入する手段；
( 3 ) 前記膜表面からフイブリノ一ゲン濃縮物を得る手段；
を含むものである。 本システムの概要を図 1〜5に示す。 図 1、 図 2に示したの は、 容器に内蔵された中空糸膜の両端部を、 中空内部が容器外部に流通するよう にポッティングしてなる血漿成分分画装置であり、 図 3〜5に示したのは容器に 内蔵された中空糸膜の一端を中空内部が容器外部に流通するようにポッティング し、 他端を封止してなる血漿成分分画装置である。 なお、 図 3〜5に対応するシ ステムとして、 容器に内蔵された中空糸膜の両端部を、 中空内部が容器外部に流 通するように、 しかも、 中空糸を U字型に曲げて、 中空糸膜の両端部が同方向に 束ねられる形式でポッティングしてなる血漿成分分画装置も構成できる。 これら システムは、 上記分画装置に設けた流通口の一つから中空糸膜の内表面または外 膜表面にヒト血漿を導入し、 別の流通口から導出させる送液装置または吸引装置 であり、 上記分画装置に設けた流通口の一つに接続される濃縮物貯留手段におい て、 フイブリノ一ゲン濃縮液を好適に採取することが出来る。 さらに、 具体的に 説明する。
中空糸の中空部 （内側） から外部 （外側） に透過する場合で、 中空部末端を封 止し、 血漿を処理した後、 回収液によって中空糸の中空部内の濃縮液を回収する 方法 （図 1、 Endstop法）、 中空部末端を開き、 連続的に中空糸末端より濃縮液を 採取する方法 （図 2、 Discard法）、 あるいは、 外部から中空部へ主として液体成 分を透過させる場合 （図 3、 Aspirate法） がある。 Endstop法は、 中空部内の容 積が小さいことから、 目的のフイブリノ一ゲンを蓄積する余裕が少なく、 そのた め、 血漿処理中に目詰まりによる圧力上昇が生じやすいため、 Endstop 法より、 Discard法の方が好適に採用される。 Discard法の場合、 中空糸の単位時間に中 空部に流入させる当該患者血漿の量 Binと、 単位時間に中空糸末端より採取する フイブリノ一ゲン濃縮液の量 Boutとの比 Bin/Boutは、 2〜 2 0であることが好 ましく、 さらに好ましくは 5〜1 0である。 この範囲であれば、 圧力上昇を回避 し、 効果的にフィプリノーゲン濃縮液が得られる条件を設定できる。
Aspirate法は、 外部から中空部へ主として液体成分が透過する場合に相当し、 外部から血漿を加圧することによつて透過させる場合と、中空部内を減圧にして、 吸引によって透過させる場合がありうる。 吸引による場合は、 濃縮液側に圧力を かけないため、 目的物である濃縮液の変性を防ぐことができ、 従って、 加圧によ る場合より高い圧力を設定することが可能となる。 吸引による圧力差は、 原理的 に大気圧以上には設定できないが、 大気圧に近い圧力差、 たとえば 0、 0 5 M P a以上の圧力差によって、 効率的な濃縮操作を実現することができる。 Discard 法と同様に、中空糸の外壁に接触させる当該患者血漿の量 Cinitialと、得られる フイブリノ一ゲン濃縮液の量 Cendとの量の比、 Cinitial/Cendは、 2〜 2 0が好 ましく、 さらに好ましくは 5〜1 0である。 この範囲であれば、 圧力上昇を回避 し、 効果的にフィプリノーゲン濃縮液を得られる条件を設定することができる。 さらに、 Aspirate法の好適な条件の範囲として、 当該血漿の量が 5 X 10一5〜 5 X 10一4 m3、接触させる中空糸の外表面積が 0. 00 l〜lm2、 吸引による差 圧が 0. 001〜0. 08 MP aが好ましい。 さらに好ましくは、 当該血漿の量 が 1 X 10一4〜 4 X 10— 4m3、 接触させる中空糸の外表面積が 0. 01〜0. 5m2、 吸引による差圧が 0. 01〜0. 08MP aである。
特に、 Aspirate法について、図を用いて、詳細に説明する。図 3に示したのは、 中空糸を一般のモジュ一ルケ一スに導入した形式であるのに対して、 図 4に示し たのは血液バッグに該中空糸を導入した形式である。 血液パッグ中に血漿を導入 し、 直ちに該血漿より吸引法によってフィプリノーゲン濃縮液を得ることが可能 になる。図 5に示したのは Aspirate法による中空糸束を複数束導入し、多段に吸 引操作を行うことができるようにした形式である。図のように上下方向に設置し、 上の方から吸引操作を行う。 目詰まりによって圧力上昇が起こったら、 次の段の 中空糸束による吸引に移る。 圧力上昇の目安は 0. 05MPa〜0. 07MPaが適当 である。
Endstop法、 Discard法、 Aspirate法のいずれも一定の濃度を有する濃縮液を 得た後、 別の操作によって濃縮することが可能である。 例えば、 遠心分離によつ てさらに濃縮を加える場合、 あるいは凍結及び解凍によって沈殿を生じさせる場 合などが相当する。 中空糸による濃縮とこれら濃縮法を組み合わせることによつ て、 高い濃縮倍率の液を効率的に得ることが可能となる。
本発明のフィプリン含有生物学的足場材はまた、 フイブリノーゲン活性化物質 を含む。 「フイブリノーゲン活性化物質」 とは、 フイブリノ一ゲンをフイブリンへ 変換する作用を有する物質をいい、 具体的にはトロンビンが挙げられる。
トロンビンとしては、 通常トロンビンとしての生物活性を有するもの、 例えば 血漿蛋白を分画して得られるもの等が使用できる。 例えばヒト又はゥシの血漿か ら、 好ましくはフイブリノ一ゲン濃縮物の調製に用いる血漿と同一人のヒト血漿 から精製したプロ トロンビンに、 C a 2+の存在下でトロンポプラスチンを作用さ せて調製したものを用いることができる。 あるいは、 市販の薬局方収载品を用い てもよい。
足場材におけるトロンビンの配合量は、 フイブリノ一ゲン濃縮物 l mg に対し、 0、 0 1〜： L 0 0単位、 好ましくは 0、 1〜1 0単位とすればよい。
本発明のフィプリン含有生物学的足場材には、 フィプリンの形成と安定化に関 与する血漿由来の物質が含まれている。 フイブリンの形成と安定化に関与する血 漿由来の物質としては、 ファクター XIII、 フイブロネクチン等が挙げられる。 本発明のフイブリン含有生物学的足場材は皮膚、 軟骨、 骨、 肝臓、 腎臓及び角 膜等の再生医療に用いる細胞の培養に好適に用いることができる。細胞としては、 例えば、ヒト由来の幹細胞（特に、骨髄由来間葉系幹細胞）、内皮細胞、上皮細胞、 実質細胞 （特に、 肝実質細胞）、 線維芽細胞、 角化細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨 細胞、 造血幹細胞等が挙げられる。
本発明のフィプリン含有生物学的足場材を用いて上記の細胞を培養する方法に ついて述べる。 細胞培養の方法としては特に制限はないが、 足場材に細胞と培地 の混合物を加え、 所定雰囲気下、 所定温度で放置する方法等を用いることができ る。
培地は、 特に制限はなく、 血清培地及ぴ無血清培地のいずれもが使用可能であ る。 血清培地としては、 MEM培地、 B M E培地、 DME培地、 ct MEM培地、 I ME M培地、 E S培地、 DM— 1 6 0培地、 F i s h e r培地、 F 1 2培地、 WE培地、 R P M I培地、 および上記培地の混合培地等の基礎培地に血清を加え たもの等が挙げられる。
細胞培養の雰囲気については、 特に制限はなく、 例えば、 二酸化炭素と空気の 混合物等の雰囲気が使用できる。 細胞培養の培養温度は、 細胞の増殖 ·分化が活 発に行えるという点で、 1 0〜5 0 °Cが好ましく、 3 0〜4 0 °Cが特に好ましい。 以上の方法に従って得られた培養物を足場材から剥離させ、 回収するための方法 としては、 周囲温度又は足場材の温度を下げる方法、 培地を低温の培地に交換す る方法、 E D T A等のキレート剤の添加、 トリプシン又はコラゲナーゼ等の酵素 処理による方法、 セルスクレーパーによる機械的な剥離による方法などが挙げら れる。
また、 上記の細胞培養は、 細胞増殖，分化刺激物質の存在下で培養を行っても よい。 細胞増殖 ·分化刺激物質としては、 下記の手法にて得られる血小板から放 出される物質、白血球から放出される物質、及ぴこれらの混合物等が好適である。 あるいは、 細胞増殖 ·分化刺激物質として通常再生医療分野で用いられている、 線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、ィンシュリン様増殖因子、 肝細胞増殖因子、 血管内皮細胞増殖因子、 へパリン結合上皮細胞増殖因子、 結合 組織成長因子等の細胞増殖因子等を使用してもよい。
上記の血小板から放出される物質とは、 具体的には、 A T P、 AD P、 コラー ゲン、 トロンビン等が挙げられる。
当該血小板から放出される物質は、 下記の工程：
( 1 ) 赤血球、 血小板、 及び血漿を通過させ、 白血球を吸着する第 1段フィルタ 一に全血を通し、 フィルターからの通過画分を得る工程；
( 2 ) ( 1 ) で得られた通過画分を、血小板を吸着し、赤血球を通過させる第 2段 フィルターに通し、 血小板が吸着したフィルターを得る工程；
( 3 ) ( 2 ) で得られたフィルターに、血小板活性化物質を含む回収液を通し、活 性化血小板放出物質の含有液を得る工程；
を含む方法によって得られる。
この工程 （1 ) で用いる第 1段フィルターの例としては、 特表平 1 1— 5 0 8 8 1 3号公報等に記載のフィルターなどが挙げられる。 また、 工程 （2 ) で用い る第 2段フィルターの例としては、 特公平 2— 1 3 5 8 7号公報等に記載のフィ ルター等が挙げられる。
ここで、血小板活性化物質とは、 A T P、 A D P、ェピネフリン、 コラーゲン、 トロンビン、 トリプシンやラテックス粒子等を言う。 また、 血小板活性化物質を 含む回収液とは、 これらの血小板活性化物質を生理食塩水、 燐酸緩衝液等の適当 な緩衝液、 アルブミン溶液あるいはこれらの混合液に溶解したものを言い、 血小 板活性化物質を含む回収液は、 血小板を上記血小板活性化物質と接触させること により得ることができる。
一方、 上記の白血球から放出される物質は、 下記の工程：
(1) 赤血球、 血小板、 及ぴ血漿を通過させ、 白血球を吸着する第 1段フィルタ
—に全血を通し、 白血球が吸着したフィルターを得る工程；
(2) (1) で得られたフィルターに、 白血球活性化物質を含む回収液を通し、活 性化白血球物質の含有液を得る工程；
を含む方法によって得られることできる。
ここで、 白血球活性化物質とは、 白血球自身に含まれていて白血球の増殖 -分 化 ·接着 ·遊送能等を刺激する活性を有する物質 （例えば f ML Pペプチド、 T NF、 I L—1、 I L一 6等のサイト力イン） あるいは抗 T細胞抗体などが挙げ られる。 白血球活性化物質を含む回収液は、 界面活性剤 ·適当な緩衝液 ·低張液 との接触や、 白血球の物理的破壌等により得ることができる。
さらに、血小板から放出される物質と白血球から放出される物質との混合物は、 下記の工程：
(1) 赤血球と血漿を通過させ、 血小板と白血球を吸着する第 1段フィルターに 全血を通し、 血小板と白血球が吸着したフィルターを得る工程；
(2) (1) で得られたフィルターに、血小板活性化物質と白血球活性化物質を含 む回収液を通し、 活性化血小板放出物質と活性化白血球放出物質の含有液を得る 工程；
を含む方法によって得られる。
工程 （1) で用いる第 1段フィルターの例としては、 特公平 2 _ 13587号 公報に記載のフィルタ一等が挙げられる。
上記の各操作に用いるフィルタ一は、 例えば、 不織布型 （平板状の積層型ある いは円筒状の積層型）、 中空膜糸型、多孔質膜型のフィルタ一等が好適である。 白 血球除去 ·血小板通過フィルター （WOO 1/32236号公報等）、 白血球、血 小板除去フィルター （特公平 02— 1 3587号公報等） など公知の分離フィル ターを用いればよい。 また、 こうして得られた血小板から放出される物質、 およぴ白血球から放出さ れる物質はフイブリン糊を足場材としない再生医療にも、 分化、 増殖の刺激剤と しても用いることができる。
本発明の足場材は,後記実施例に示されるように、線維芽細胞に対する接着能、 走化性、 及ぴ細胞増殖促進活性に優れている。 また、 血管内皮細胞に対する細胞 増殖促進活性にも優れている。 さらに後記実施例に示されるように、 本発明の方 法によつて得られる活性化血小板及び活性化白血球からの放出物質は、 線維芽細 胞及ぴ血管内皮細胞に対する細胞増殖促進活性を有する。 すなわち， 本発明の足 場材を糖尿病、 閉塞性動脈疾患 （AS0)、 その他難治性潰瘍等の皮膚の損傷、 いわ ゆる創傷の治療に用いることにより、 創傷部位において繊維芽細胞及び血管内皮 細胞の遊走 ·増殖が必要とされる、炎症反応期及び増殖期（肉芽期） と呼ばれる治 癒過程に対し、 治癒促進効果を付与することが可能となる。 よって、 本発明の足 場材は、 創傷の治療にも有効である。
本発明はまた、 フイブリン含有生物学的足場材の製造システムをも提供する。 この製造システムは、 下記の手段：
( 1 ) カツトオフ値が 8 0 , 0 0 0ダルトン以上 9 0 0 , 0 0 0ダルトン以下の 血漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの 分画血漿に分離する手段；
( 2 )前記フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する手段；
( 3 ) 前記フイブリノーゲン濃縮物からフィプリン糊を製造する手段；
( 4 ) 残りの分画血漿を再利用する手段；
を含むものである。
本発明の生物学的足場材の製造システムは、 例えば、 図 5に示すような血液処 理装置に組み込むことが可能である。 血液処理装置は、 生体から採取した血液を 血漿分離用の第 1のろ過カラム （1 5 ) に通し、 第 1のろ過カラムによって分離 した血漿は第 2のろ過カラム （1 6 ) によって成分分離して、 生体に返還すると いう 2重ろ過法によるシステムである。 図 5に示すように、 従来の血液処理装置は、 血漿成分を分画するための第 2の ろ過カラムによって、 L D L、 V L D L等の高分子画分を取り除き、 血漿粘度を 下げることによって、 動脈硬化による血管閉塞症や高脂血症を予防 ·治療するた めのものであって、 ろ過膜によつて分離された高分子画分は廃棄していた。 本発明の一つの態様は、 従来廃棄していた高分子画分を利用して、 フイブリン 含有生物学的足場材の材料に適するフィプリノーゲンを多く含む画分を得ようと するもので、 そのために血漿成分分画のための第 2のろ過カラムに特定のカツト オフ値を有するろ過膜を用いることを特徴とする。
血漿成分分画のためのろ過膜としては、 フィプリノーゲン濃縮システムについ て既に説明した中空糸膜を用いればよい。
本発明において、 血液の採取は、 生体の血管に接続された注射針やカテーテル などを通じて行われる。
全血から血漿を採取するための血漿分離装置は、 膜分離型、 遠心分離型等、 従 来公知のいずれの装置も使用することができる。
膜分離型の血漿分離装置とは、 少なくとも血球細胞を通過させない細孔径を有 する中空糸型の分離膜をハウジングに充填したものであり、 中空糸内部に血液を 流すと、 中空糸の膜壁を通って血漿成分が分離される。 分離膜の材質は特に限定 しないが、 例えば、 ポリスルホン、 ポリエーテルスルホン、 ポリエチレン、 ポリ プロピレン、 セノレロース、 酢酸セノレロース、 エチレンビニノレアノレコーノレ、 ポリア タリロニトリル、 テフロン、 ポリエステルなどが例示できる。 このような膜分離 型の血漿分離装置は、 血液から一定速度で連続的に血漿を分離できるという点で 特に好ましい。
また、 遠心分離型の血漿分離装置とは、 血液を遠心ボウルに導入し、 そのボウ ルを回転させることで血球と血漿との比重差により分離を行う装置であり、 一定 量の分離が行われた時点でボウル内の血液は患者に返血され、 また新たな血液が ボゥルに導入され遠心分離される。
本発明においては、 このようにして得られたフイブリノ一ゲンを多く含む血漿 画分をそのままフイブリン含有生物学的足場材の製造原料に用いることができる。 フィプリン含有生物学的足場材は、 本発明で得られたフィブリノ一ゲンを多く 含む血漿画分に第 ΧΠΙ 因子などのフイブリン安定化因子、 およびトロンビン一 カルシウムなどのフイブリノーゲン活性化因子とを混合することによって得られ る。
一方、 ろ過膜によってフィブリノ一ゲンを多く含む血漿分画を分離した残りの 画分は、 さらにプロトロンビンを活性化させトロンビンを生成することのできる 何れかの方法を用いて、 多トロンビン血漿を調製するのに用いることができる。 例えば、 当該画分に至適な濃度のカルシウムを添加し、 さらにシリコンビーズ などの陰性の表面荷電と接触させることで、 このようなトロンビンの生成を行う 事ができる。
さらに、 第 2のろ過膜によってフイブリノ一ゲンを多く含む血漿画分を分離し た残りの画分は、 そのまま、 或いは血漿分離装置により得られる血漿を分離され た血球を多く含む画分と混合され、 供血者に対して返還することができる。
本発明では、 第 2のろ過膜によって分離したフイブリノ一ゲンを多く含む血漿 画分は、 貯蔵する事もできる。
例えば、 血液の粘度が異常に高いために身体末梢などの血管に生じる血液の循 環障害が原因となって起こる視力低下や足先壊疽などの治療のため、 フイブリノ 一ゲンなどの血中高分子蛋白を体外循環法により除去し血液粘度を低下させる、 いわゆるレオフェレ一シスと呼ばれる療法などに於いて、 通常廃棄するフィプリ ノーゲンを多く含む血漿分画を貯留、 凍結または冷蔵保存しておき、 フイブリン 含有生物学的足場材の作製原料とするなどである。 これによつて、 通常廃棄され ている患者血漿を有効に利用して、 患者自身の血液から調製されるいわゆる自己 フイブリン糊を作る事ができるし、 また、 これらを集積することにより、 フイブ リン含有生物学的足場材材料の貯留銀行をつくることができる。 実施例 以下、 実施例により、 本発明をより具体的に説明するが、 本発明は下記の実施 例により限定されるものではない。 実施例 1 (改良クリオ法によるフイブリノ一ゲン濃縮物の調製及びフィプリン含 有生物学的足場材の作製）
健常人よ り 得た新鮮血 400ml [抗凝固剤 と し て 56ml の CPD (Citrate-phosphate-dextrose SIGMA ± C7165) を添加]を、 50ml用遠心チュ ーブ（日本べクトンディキンソン社製 No. 352070)に分注し、遠心分離（l，000g X 15分、 4°C) (KUB0TA社製 3740)にて血漿 235mlを得た。これをフリ一ザ一（EEV-204N Whirlpool社製） に移し、 _ 2 7 °Cにて 30分間静置して凍結させた。 次に血漿の 入った遠心チューブを、 チャンバ一温度を- 2. 5°Cに設定した冷却遠心機 （KUB0TA 社製 3740) 内に移して 30分間放置した。 続いて予めチャンバ一の温度を 12°Cに 設定した、'別の冷却遠心機に遠心チューブを移し、 30分間放置した。 その後、 冷 蔵庫内 （SANYO社製 Medicool MPR- 510、 4°C) に 30分間静置した。 最後に遠心 分離 （l，000g X 15分、 1 °C) を行い、 上清を除去し、 フイブリノ一ゲン濃縮物を 得た。 フイブリノーゲンの定量はトロンビン時間法に基づく市販のフイブリノ一 ゲン測定キット （Fisher Scientific社 Pacific Hemostasisキット） を用い、 測 定手順はメーカー添付の手順書に従った。回収したフィプリノーゲン量は 40. 2m g。原料とした血漿に含まれるフイブリノ一ゲン量の測定結果は 198m gであり、 回収率は 20. 3% (40. 2/198 X 100=20. 3) であった。 フイブリノ一ゲン濃縮物と、 50mM塩化カルシウム （Sigma社製 C5080) を含むヒ ト血漿トロンビン溶液（Sigma 社製 T8885) (5. 0 NIH units/ml) とを素早く等量混合し、 フイブリン含有生物学 的足場材を作製した。 実施例 2 (改良クリオ法 （別法） によるフイブリノ一ゲン濃縮物の調製及ぴフィ プリン含有生物学的足場材の作製）
健常人よ り 得た新鮮血 40ml [抗凝固剤 と して 5. 6ml の CPD (Citrate-phosphate-dextrose SIGMA社製 C7165) を添力 fl]を、 50ml用遠心チュ ーブ（日本べクトンディキンソン社製 No. 352070)に集め、遠心分離（l，000g X 15 分、 4°C) (KUB0TA社製 3740) により、 血漿 20. 5ml を得た。 これをフリーザー
(EEV-204 Whirlpool社製）に移し、一 3 0 °Cにて 6 0分間静置して凍結させた。 次に血漿の入った遠心チューブを、 チャンバ一温度を- 5°Cに設定した冷却遠心機
(KUB0TA社製 3740)内に 30分間放置した。その後、冷蔵庫内（SANYO社製 Medicool MPR- 510、 4°C) に 30分間静置した。 最後に遠心分離 （1, 000g X 15分、 1 °C) を 行い、 上清を除去し、 フイブリノ一ゲン濃縮物を得た。 回収したフイブリノーゲ ン量は 7. 1m gであった。 原料とした血漿に含まれるフイブリノ一ゲン量の測定 結果は 24. 8m gであり、 回収率は 28. 6% (7. 1/24. 8 X 100=28. 6) であった。 フィ ブリノーゲン濃縮物と、 50mM塩化カルシウム （Sigma社製 C5080) を含むヒ ト血 漿トロンビン溶液 (Sigma社製 T8885) (5. 0 NIH units/ml)とを素早く等量混合し、 フィプリン含有生物学的足場材を作製した。 比較例 1 (クリオ法によるフイブリノ一ゲン濃縮物の調製及ぴフイブリン含有生 物学的足場材の作製）
クリオ法によるフイブリノ一ゲン濃縮物の調製は、 Casali らの方法に従った (Transmission, 32、 641-643、 1992)。 健常人より得た新鮮血 40ml [抗凝囱剤と して 5. 6mlの CPD (Citrate-phosphate-dextrose SIGMA社製 C7165)を添加]を、 50ml用遠心チューブ（日本べクトンディキンソン社製 No. 352070) に集め、遠心 分離 （l, 000g X 15分、 4°C) (KUB0TA社製 3740) にて血漿 22. 5mlを得た。 これを 超低温フリ一ザ一（MDF- 293 SANYO社製） に移し、 - 80°Cにて 18時間凍結させた。 次に 4°Cに設定された冷蔵庫 （MPR-311 SANYO社製） 内に移して 16時間放置し、 緩速解凍した。次に冷却遠心機にて l，000g X 15分間遠心分離を行った （4°C)。形 成された沈殿物を乱さぬように注意しながら、 上記条件に従って再度凍結及び解 凍を繰り返した。 解凍後、 再ぴ 4°Cにて l，000g X 15分の遠心分離を行い、 沈殿物 を回収し、 フイブリノ一ゲン濃縮物とした。 回収したフイブリノ一ゲン量は 8. 7 m g、 元の血漿に含まれるフイブリノ一ゲン量の測定結果は 21. 5m gであり、 回 収率は 40. 5% (8. 7/21. 5 X 100=40. 5) であった。 フイブリノ一ゲン濃縮物と 50mM 塩化カルシウム （Sigma社製 C5080) を含むヒト血漿トロンビン溶液（Sigma社製 T8885) (5. 0 NIH units/ml) とを素早く等量混合し、 フイブリン含有生物学的足 場材を作製した。 比較例 2 (ェタノール沈殿法によるフイブリノーゲン濃縮物及ぴフイブリン含有 生物学的足場材の作製）
エタノール法によるフイブリノ一ゲン濃縮物の調製は、 Kjaergard の方法に従 つた (Surg Gynecol Obstet, 175 (1)、 July, 1992)。健常人から得た新鮮血 40ml [抗 凝固剤として 5. 6mlの CPDを添加]を 50ml用遠心チューブ （日本べクトンディキ ンソン社製 No. 352070) に入れ、 600 g X 10分間の遠心分離 （KUB0TA社製 3740) を行い、 血漿を得た。 この血漿を新しい 50ml用遠心チューブに移し、 30分かけ て氷水上（0°C) で 2. 5mlのエタノール （99. 5%和光純薬株式会社製） を時々攪拌 しながら添加することにより、 フイブリノ一ゲンを沈殿させた。 600g X 15分間の 遠心分離によりフイブリノ一ゲン沈殿物を回収し、 フイブリノ一ゲン濃縮物とし た。 回収したフイブリノ一ゲン量は 2. 7m g。 元の血漿に含まれるフイブリノ一 ゲン量の測定結果は 21. 5 m gであり、回収率は 12. 7% (2. 7/21. 5 X 100=12. 7) で あった。 使用まで- 85°Cで貯蔵した。 使用前にフイブリノ一ゲン濃縮物を 37°Cで 溶解し、 0. 3容の 80mM塩化カルシウム （Sigma社製 C5080) を含むヒト血漿トロ ンビン溶液（Sigma社製 T8885) (5. 0 NIH units/ml) をすばやく混合することによ り、 フイブリン含有生物学的足場材を作製した。 試験例 1 (正常ヒト胎児肺由来繊維芽細胞に対する増殖刺激活性）
実施例 1で調製したフイブリン含有生物学的足場材 0. 5mlを 24ゥエルマルチプ レート （日本べクトンディキンソン社製 No. 353047) 上に添カ卩し、 すばやくプレ 一ト全体に行き渡るように攪拌し、 プレート底面に均一な生物学的足場材を作製 した （n=3)。 20分後、 プレート底面をリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し、 4mMグルタ ミン、 10%ゥシ胎仔血清を含む MEM- E培地 （大日本製薬株式会社 12- 102- 504) に 懸濁させた 2 X 104個の正常ヒ ト胎児肺由来繊維芽細胞 HEL299 (HEL ATCC株番号 CCL137) を添加し、 37°C、 5%C02濃度の炭酸ガスインキュベータ （タパイエスぺッ ク社製 BNA121D) にて 72時間培養した。培養後、 あらかじめ 37°Cに加温しておい たリン酸緩衝塩類溶液で非付着細胞を洗浄除去した。 0. 25%トリプシン溶液（ィン ビトロジェン社 15050- 065) 1mlを各ゥエルに添加し、 プレートを 37°C、 炭酸ガ スィンキュベータ内にて静置。 30分後、正常ヒト胎児肺由来繊維芽細胞を回収し、 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes社製） を用いて、 メ 一力一添付の手順書に従い、 同時に調製した正常ヒト胎児肺由来繊維芽細胞の検 量線より、 細胞数を計測した。 実施例 1で作製したフイブリン含有生物学的足場 材上で培養した正常ヒ ト胎児肺由来繊維芽細胞数は、 12. 5±0. 3 X 104個であった (n=3の平均値士標準偏差)。 これは後述するように比較例 1で作製した回収率 4 0 . 5 %のフイブリノーゲン組成物を用いたフイブリン含有生物学的足場材上で 培養した場合よりも有意に増加していた。
同様に実施例 2で作製したフィブリン含有生物学的足場材上で培養した正常ヒ ト胎児肺由来繊維芽細胞対する増殖刺激活性を測定したところ、 8. 4±0. 3 X 104 個であった （n=3の平均値士標準偏差)。
同様に比較例 1で作製したフィプリン含有生物学的足場材上で培養した正常ヒ ト胎児肺由来繊維芽細胞 （HEL) に対する増殖刺激活性を測定したところ、 6. 3土 0. 2 X 104個であった （n=3の平均値士標準偏差)。
同様に比較例 2で作製したフイブリン含有生物学的足場材上で培養した正常ヒ ト胎児肺由来繊維芽細胞に対する増殖刺激活性を測定したところ、 4. 1 ± 0. 2 X 104個であった （n=3の平均値土標準偏差)。
実施例 1及び 2、 並びに比較例 1及び 2で得られたフイブリノ一ゲン濃縮物に おけるフィプリノーゲン回収率及ぴ各フイブリノ一ゲン濃縮物を用いて作製した フィプリン含有生物学的足場材の正常ヒト胎児肺由来繊維芽細胞に対する増殖刺 激活性を下記表 1にまとめた。
Figure imgf000033_0001
試験例 2 (線維芽細胞の接着能）
実施例 1で作製した生物学的足場材の、線維芽細胞に対する接着能を測定した。 実施例 1で作製したフイブリノ一ゲン濃縮物 0. 5ml と、 50 塩化カルシウム
(Sigma社製 C5080)を含むヒト血漿トロンビン溶液（Sigma社製 T8885) (5. 0 ΝΙΗ units/ml) とを素早く等量混合し、 24ウェルマルチプレート （日本べタトンディ キンソン社製 No. 353047)上にフイブリン含有生物学的足場材を作製した（n=3)。 20分後、 フイブリン含有生物学的足場材をリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し、 ½Mグ ルタミン、 2%ゥシ胎仔血清を含む D-MEM培地 (インビトロジヱン社製) に懸濁さ せた 2xl04個の正常ヒト皮膚繊維芽細胞 （タカラバイォ社製 NHDF-Neo) を入れ、 37°C、 5%C02恒温漕にて 60分間ィンキュベートした。 60分後、 ィンキュベータか ら取り出し、あらかじめ 37°Cに加温しておいたリン酸緩衝塩類溶液でプレートを 洗浄し、 付着細胞をメタノールにて固定後、 Giemsa染色を行い、 光学顕微鏡にて 検鏡した。 実施例 1で作製した生物学的足場材上に十分伸展している正常ヒト皮 膚線維芽細胞が接着していることが確認された。 試験例 3 (線維芽細胞細胞に対する遊走能）
実施例 1で作製したフイブリン含有生物学的足場材の線維芽細胞に対する遊走 能を検討した。 実施例 1で作製したフイブリノ一ゲン濃縮物 0. 5mlと、 50mM塩化 カルシウム（Sigma社製 C5080)を含むヒト血漿トロンビン溶液（Sigma社製 Τδ885) (5. 0 NIH units/ml) とを素早く等量混合し、 24ウェルマルチプレート （日本べ クトンディキンソン社製 No. 353047) 上にフィブリン含有生物学的足場材を作製 した （n=3)。 20分後、 フイブリン含有生物学的足場材をリン酸緩衝塩類溶液で洗 浄し、 24ウェルマルチプレート （日本べタ トンディキンソン社製 No. 353047) の 底部にフイブリン含有生物学的足場材を形成させた。 4mM グルタミン、 2%ゥシ胎 仔血清を含む D- MEM培地 （インビトロジェン社製） を加え、 コラーゲンコートし たフィルターを装備した遊走能測定用チャンバ一 （日本べクトンディキンソン社 製 353431) をプレートに載せ、 2 X 104個の正常ヒト皮膚繊維芽細胞 (タカラバイ ォ社製 HDF- Neo) を添カ卩し、 37°C、 5%C02恒温漕にてインキュベートした。 2時間 後、膜の裏側に遊走した細胞を Giemsa染色後に顕微鏡下に観察した。実施例 1で 作製した生物学的足場材は強い遊走能を示した。 試験例 4 (骨髄間葉系幹細胞に対する増殖刺激活性）
実施例 1で作製した生物学的足場材の骨髄間葉系幹細胞に対する増殖活性を検 討した。 実施例 1で作製したフイブリノ一ゲン濃縮物 0. 5mlと、 50raM塩化カルシ ゥム（Sigma社製 C5080)を含むヒト血漿トロンビン溶液（Sigma社製 Τ88δ5) (5. 0 NIH units/ml) とを素早く等量混合し、 24ウェルマルチプレート （日本べタトン ディキンソン社製 No. 353047) 上に添加し、 すばやくプレート全体に行き渡るよ うに攪拌し、 プレート底面に均一な足場材を作製した。 次にプレート底面をリン 酸緩衝塩類溶液で洗浄し、 4mMグルタミン、 2%ゥシ胎仔血清を含む D- MEM培地に 懸濁させた 2. 5 X 104の正常ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（タカラバイォ社製 PT034) を添加し、 37°C、 5%C02濃度の炭酸ガスインキュベータにて 72時間培養した。 対 照として同数の骨髄間葉系幹細胞を足場材の無いプレートに培養したものを用い た。 培養後、予め 37°Cに加温しておいたリン酸緩衝塩類溶液で死細胞を洗浄除去 した。 0. 25%トリプシン溶液 （ィンビトロジェン社 15050-065) lmlを各ゥエルに 添加し、 37°C、 炭酸ガスインキュベータ内で静置。 30分後、 骨髄間葉系幹細胞を 回収し、 メーカー添付の手順書に従い、 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes社製） を用いて、 同時に調製した骨髄間葉系幹細胞の検量線 より、 細胞数を計測した。 実施例 1で作製した生物学的足場材は、 対照である足 場材のないプレートと比較して、 ヒト骨髄間葉系細胞に対する高い増殖活性を示 した。 試験例 5 (ヒト初代肝実質細胞に対する増殖刺激活性）
実施例 1で作製した生物学的足場材のヒト初代肝実質細胞に対する増殖活性を 検討した。 実施例 1で作製したフイブリノ一ゲン濃縮物 0. 5mlと、 50 塩ィ匕カル シゥム（Sigma社製 C5080)を含むヒト血漿トロンビン溶液（Sigma社製 T8885) (5. 0 NIH units/ml) とを素早く等量混合し、 24ウェルマルチプレート （日本べクトン ディキンソン社製 No. 353047) 上に添加し、 すばやくプレート全体に行き渡るよ うに攪拌し、 プレート底面に均一な足場材を作製した。
次にプレート底面をリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し、 4mMグルタミン、 2%ゥシ胎 仔血清を含む D- MEM培地に懸濁させた 2. 5xl04の正常ヒト肝細胞 （タカラバイオ 社製 C2591) を添加し、 37°C、 5%C02濃度の炭酸ガスインキュベータにて 72時間 培養した。 対照として同数の正常ヒト肝細胞を足場材の無いプレートに培養した ものを用いた。 培養後、予め 37°Cに加温しておいたリン酸緩衝塩類溶液で非付着 性細胞を洗浄除去した。 0. 25%トリプシン溶液 （インビトロジェン社 15050-065) lmlを各ゥエルに添加し、 37°C、 炭酸ガスインキュベータ内で静置。 30分後、 肝 実質細胞を回収し、 メーカー添付の手順書に従い、 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes社製） を用いて、 細胞数を計測した。 実施例 1の 条件で作製した生物学的足場材は、対照である足場材のないプレートと比較して、 ヒト肝実質細胞に対する高い増殖活性を示した。 実施例 3
実施例 1と同様の方法 （改良クリォ法） 及び中空糸膜法にて、 ヒト血漿よりフ イブリノーゲン濃縮物を調製した。
健常人より得たプール血漿（複数のドナー由来血漿） 5 O ml [血液量 400m 1に 対して 56mlの比率で CPD (Citrate- phosphate- dextrose SIGMA社製 C7165) を 添カ卩した抗凝固剤入り末梢血より遠心分離法により調製した]を、 50ml 用遠心チ ユーブ （日本べタトンディキンソン社製 No. 352070) に移し、 一 2 7 °Cのフリー ザ一 （EEV-204N Whirlpool社製） にて、 30分間静置させ、 凍結させた。 次に凍結 血漿の入った遠心チューブを、 チャンバ一温度を- 2. 5 °Cに設定した冷却遠心機 (KUB0TA社製 3740) 内に移して 30分間放置した。 続いて予めチャンパ一の温度 を 12°Cに設定した、別の冷却遠心機に遠心チューブを移し、 30分間放置した。そ の後、 冷蔵庫内 （SANYO社製 Medicool MPR - 510、 4°C) に 30分間静置した。 最 後に遠心分離 （l, 000g X 15 分、 1 °C) を行い、 上清を除去し、 フイブリノーゲ ン濃縮物を得た。 フイブリノ一ゲンの定量はトロンビン時間に基づく市販のフィ ブリノーゲン測定キット （Fisher Scientific社 Pacific Hemostasisキット） を 用い、 測定手順はメーカー添付の手順書に従った。 回収したフイブリノ一ゲン量 は 14. 3m g。 原料とした血漿に含まれるフィプリノーゲン量の測定結果は 86. 5 m gであり、 回収率は 16. 5% (14. 3/86. 5 X 100=16. 5) であった。
EVALを素材とする中空糸膜（川澄ィ匕学社製 E C— 5 0 W、 カットオフ分子量 3 0 0 , 0 0 0ダノレトン）によるフイブリノーゲン濃縮物の調製を行った。 Aspirate 法によって調製した。 2 0 c m500本を束ねたものを 2束作成した。 血漿を入れ た容器に、まず 1束浸漬して、中空糸内部に連結したペリスターポンプによって、 中空糸内部より吸引した。 1 0 O mLの血漿を 2 5 mLまで濃縮し、 引き続いて次 の 1束を浸漬し吸引し、 8 mLまで濃縮した。 濃縮操作に要した時間は 1束目 6 分、 2束目 1 1分、 計 1 7分であった。 濃縮液中のフィプリノーゲン濃度は、 8. 3mg/mLとなった。 原料血漿中の濃度が 1. 73mg/mLであったことから、濃縮倍率 4 . 8倍、 回収率 3 8 %を得ることができた。 試験例 6 (ヒ ト胎児肺由来線維芽細胞 （HEL) に対する細胞増殖刺激活性） 実施例 3で作製した生物学的足場材の、 ヒト胎児肺由来線維芽細胞（HEL) に対 する足場活性を細胞増殖刺激活性によつて測定した。 実施例 3で調製した各種ヒ トフイブリノ一ゲン濃縮物 （フイブリノ一ゲン濃度として 5. 63mg/mLになるよう 培地で調整） 0. 3ml を 1 2ウェルマルチプレート (日本べクトンディキンソン社 製 No. 3 5 3 0 4 3 ) 上に添力卩し、 さらに 20, 000個の HEL細胞を含む 0. 02mLの HEL細胞懸濁液を添加した。 0. 3mLの 31. 3 NIH units/mlのトロンビン溶液 （バ クスター社製生物学的組織接着剤 Tisseelに添付のものを希釈して使用）をすば やくプレート全体に行き渡るように添加し、 プレートを攪拌し、 37°C 5 %炭酸ガ スインキュベータ （タバイエスペック社製 BNA121D) 内に静置して、 ゲル化反応 を進行させ、 フイブリン足場材内に HEL細胞が包埋されたものを作製した。 60分 後、 167 μ §/ιΛのァプロチニン （Sigma社 A4529)及び終濃度 10%のゥシ胎仔血清 を含む D- MEM培地 （インビトロジェン社製） を添加し、 同インキュベータ内で 96 時間培養した。 細胞増殖の測定試験は、 CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay キット (プロメガ株式会社) を使用した比色法にて行い、 測定手順は、 メーカー添付の手順書に従った。 細胞増殖試験の測定結果を、 同時 に行った同フイブリノ一ゲン濃度に調整した Tisseel (バクスター社製生物学的 組織接着剤） を足場としたときの細胞数 （波長 490nm における吸光度） を 1. 00 としたときの相対値で示した。 表 2に示すように実施例 3で作製した生物学的足 場材は、 Tisseel を足場とした時に比較していずれも高い細胞増殖活性を示し、 生物学的足場活性が高いことが確認された。
表 2
足場材調製方法 細胞増殖刺激活性
(Tisseelを 1. 00)
中空糸膜法 2. 82
改良クリオ法 1. 89
対照 （Tisseel) 1. 00 実施例 4
実施例 1と同様の方法 （改良クリオ法） 及び中空糸膜法にて、 ゥシ血漿よりフ イブリノ一ゲン濃縮物を調製した。
ゥシ血漿 5 0 ml [血液量 400 m 1 に対して 56ml の比率で CPD
(Citrate-phosphate-dextrose SIGMA社製 C7165)を添加した抗凝固剤入り末梢 血より遠心分離法により調製した]を、 50ml 用遠心チューブ （日本べタトンディ キンソン社製 No. 352070) に移し、 一 2 7。Cのフリーザー （EEV - 204N Whirlpool 社製） にて、 30分間静置させ、 凍結させた。 次に凍結血漿の入った遠心チューブ を、チャンバ一温度を- 2. 5°Cに設定した冷却遠心機（KUB0TA社製 3740) 内に移し て 30分間放置した。 続いて予めチャンバ一の温度を 12°Cに設定した、別の冷却 遠心機に遠心チューブを移し、 30分間放置した。 その後、 冷蔵庫内 （SANYO社製 Medicool MPR- 510、 4°C) に 30分間静置した。 最後に遠心分離 （l，000g X 15分、 1 °C) を行い、 上清を除去し、 フイブリノ一ゲン濃縮物を得た。 フイブリノーゲ ンの定量はトロンビン時間に基づく市販のフイブリノーゲン測定キット （Fisher Scientific社 Pacific Hemostasisキット） を用い、 測定手順はメーカー添付の 手順書に従った。 回収したフイブリノ一ゲン量は 18. 7m g。原料とした血漿に含 まれるフイブリノ一ゲン量の測定結果は 94. l m gであり、 回収率は 19. 9°/0
(18. 7/94. 1 X 100=19. 9) であった。
中空糸膜によるフイブリノ一ゲン濃縮物の調製を行った。 Discard法を採用し た。 素材として、 ①親水化ポリスルホン （カツトオフ分子量 3 0 0， 0 0 0ダル トン）、 ② EVAL (力ットオフ分子量 3 0 0， 0 0 0ダルトン）、 ③ PAN (ポリアタリ ロニトリル、 カットオフ分子量 2 0 0， 0 0 0ダルトン）、 ④ C DA (セルロース ジアセテート、 カットオフ分子量 3 5 0， 0 0 0ダルトン） を用いた。 長さ 1 0 c m、 直径 3 c mの小型モジュールにそれぞれ 2 0 0 0本を充填し、 成形した。 B in/Boutを 1 0に設定し、 1 0 O m Lの血漿を処理した。 処理血漿量は 1 O m L/m i nとした。 処理時間は 1 0分間であった。 原料の血漿中のフィプリノー ゲン濃度が 1. 7mg/mL に対し、 ① 7. 2mg/mL② 8. Img/mL③ 6. 5mg/mL④ 5. 9mg/mLのフ イブリノ一ゲンの濃縮液を得ることができた。 試験例 7 (ゥシ気管由来線維芽細胞 （CCL- 44) に対する細胞増殖刺激活性） 実施例 4で作製した生物学的足場材の、 ゥシ気管由来線維芽細胞（ATCC株番号 CCL-44) に対する足場活性を細胞増殖刺激活性によつて測定した。 実施例 4で調 製した各種ゥシフイブリノーゲン濃縮物 （フイブリノーゲン濃度として 5. 63mg/mLになるよう培地で調整） 0. 3mlを 1 2ウェルマルチプレート （日本べク トンディキンソン社製 No. 3 5 3 0 4 3 ) 上に添カ卩し、 さらに 2 xlO4個の CCL-44 細胞を含む 0. 02mLの CCL- 44細胞懸濁液を添加した。 0. 3mLの 31. 3 NIHunits/ml のトロンビン溶液 (バクスタ一社製生物学的組織接着剤 ティシールに添付のもの を希釈して使用） をすばやくプレート全体に行き渡るように添加し、 プレートを 攪拌し、 37°C 5 %炭酸ガスインキュベータ （タバイエスペック社 BNA121D) 内に 静置して、 ゲル化反応を進行させ、 フイブリン含有生物学的足場材内に CCL - 44 細胞が包埋されたものを作製した。 60 分後、 167 μ ^ιΛ のァプロチェン （Sigma 社 A4529)及び終濃度 10%のゥシ胎仔血清を含む Eagle' s MEM培地（インビトロ ジェン社製） を添加し、 同インキュベータ内で 7 2時間培養した。 細胞増殖の測 定試験は、 CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay キッ ト （プロメガ株式会社） を使用した比色法にて行い、 測定手順は、 メーカー添付 の手順書に従った。 細胞増殖試験の測定結果を、 同時に行った同フイブリノーゲ ン濃度に調整した Tisseelを足場としたときの細胞数 （波長 490nmにおける吸光 度）を 1. 00としたときの相対値で示した。表 3に示すように実施例 4で作製した 生物学的足場材は、 Tisseel を足場とした時に比較していずれも高い細胞増殖活 性を示し、 生物学的足場活性が高いことが確認された。 表 3 CCL-4 細胞に対する細胞増殖刺激活性
Figure imgf000040_0001
実施例 5 (活性化血小板及び白血球放出物質の調製及ぴ細胞増殖刺激活性の測定） 以下のとおり、 血小板及ぴ白血球を捕捉させたフィルターを調製した。
健常人より新鮮末梢血 50ml 〔抗凝固剤として 7. 0mlの CPDを添加〕 を得た。 ポ リエチレンテレフタレートの不織布 （旭化成株式会社、 平均繊維径 2. 6 μ m、 目付 け 90g/m2、 厚み 0. 38mm) を 25πιηι φに打ち抜き、 これを 3枚重ねてカラム （アド バンテック社 ΡΡ- 25) にて保持し、 カラムに末梢血 10mlを流した。 血液処理後、 10ml のリン酸緩衝塩類溶液を 10ml通液し、 洗浄した。 この操作を 3回行い、 計 30mlの'リン酸緩衝塩類溶液で洗浄した。 処理に要する時間はいずれも 15分以内 であった。 処理前後に含まれる血小板及び白血球数を自動血球計数機 （ベックマ ンコールター社）で計数した。不織布フィルタ一層に捕捉された白血球、赤血球、 及ぴ血小板の捕捉率は以下の通りであった。
白血球捕捉率 （85. 3%) 赤血球捕捉率 （8. 3%) 血小板捕捉率 （94. 5%) 次に 0. 5 NIH units/ml トロンビンを含むリン酸緩衝塩類溶液 1 mlをカラムに 通液し、血小板及び白血球放出物質の回収を行った。回収物質は使用まで— 8 0 °C にて凍結保存した。 試験例 8
実施例 5にて調製した活性化血小板及び白血球放出物質を線維芽細胞に添加し、 細胞増殖刺激活性を調べた。 正常ヒト胎児肺線維芽細胞 2 X 104個を 12 ゥュル細 胞培養用プレート （日本べクトンディキンソン社製 353043) に播種した （培地量 はゥエル当たり 1 m 1 )。 培養液は DMEM (ィンビトロジェン社製） にピルビン酸 ナトリウム （ICN社製） を lmM、 非必須ァミノ酸 （ICN社製）、 及び L-グルタミン を 2 mM となるよう添加し、 さらに最終濃度が 10%となるようにゥシ胎児血清 (StemCell Technologies社）を加えた。コントローノレとして 0. 5 NIH units/ml ト 口ンビン溶液及ぴリン酸緩衝塩類溶液を 100 μ L培養系に添カ卩した。これに実施例 5にて調製した回収液を 100 /z L添加し、 5%炭酸ガスインキュベータにて 3日間 培養後、 細胞数を計数した。 表 4に示すように実施例 ·5で作製した活性化血小板 及ぴ白血球放出物質を含む回収液は、 対照であるリン酸緩衝塩類溶液及ぴトロン ビン溶液に比較して、 高レ、線維芽細胞増殖刺激活性を示した。
表 4 血小板及ぴ白血球捕捉フィルター回収液による線維芽細胞増殖刺激活性
Figure imgf000041_0001
試験例 9
実施例 5にて調製した活性化血小板及び白血球放出物質を血管内皮細胞に添カロ し、 細胞増殖刺激活性を調べた。 正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 2 X 104個を 12ゥ ル細胞培養用プレート （日本べクトンディキンソン社製 353043) に播種した（培 地量はゥエル当たり 1 m l )。 培養液はヒト血管内皮細胞培養用無血清基礎培地 (インビトロジェン社製 Cat. No. 11111-044) に最終濃度が 5 %となるようにゥ シ胎児血清 （StemCell Technologies社） を加えた。 コントロールとして 0. 5 NIH units/ml トロンビン溶液及びリン酸緩衝塩類溶液を 100 μ L培養系に添加した。 これに実施—例 5にて調製した回収液を 100 添加し、 5%炭酸； タにて 3日間培養後、 細胞数を計数した。 表 5に示すように実施例 5で作製した 活性化血小板及ぴ白血球放出物質を含む回収液は、 対照であるリン酸緩衝塩類溶 液及びトロンビン溶液に比較して、 高い血管内皮細胞増殖刺激活性を示した。 表 5 血小板及び白血球捕捉フィルタ一回収液による血管内皮細胞増殖刺激活性
Figure imgf000042_0001
実施例 6
中空糸膜としてエチレン Zビュルアルコール共重合体を用いた。 内径 1 7 5 μ mのものである （川澄化学社製 E C— 5 0 W；)。
長さ 1 0 c m、直径 3 c mの小型モジュールに 2 0 0 0本を充填し、成形した。 Discard法を採用した。 Bin/Boutを 1 0に設定し、 5 O m Lの血漿を処理した ところ、 7. 7mg/mLのフイブリノ一ゲンの濃縮液を得ることができた。 処理血漿量 は 1 O m L/m i nで、 処理時間は 5分間であった。 原料の血漿中のフイブリノ 一ゲン濃度が 1. 7mg/mLであるため、 濃縮倍率は 4 . 5倍であった。 実施例 7
実施例 6と同じ中空糸膜を用いて Aspirate法を試みた。 2 0 c m500本を束ね、 両端を接着し、 血漿を入れた容器に浸潰して、 中空糸内部に連結したペリスター ポンプによって、 中空糸内部より吸引した。 2 0 O mLの血漿を 40mLまで濃縮し たところ、 フイブリノ一ゲン濃度は、 8. 9mg/mL となった。 原料血漿中の濃度が 1. 9mg/mLであったことから、 4. 7倍の濃縮倍率を得ることができた。 実施例 8 実施例 7と同様に Aspirate法を試みた。 2 0 c m500本を束ねたものを 4束作 成した。 血漿を入れた容器に、 まず 1束浸漬して、 中空糸内部に連結したぺリス ターポンプによって、 中空糸内部より吸引した。 2 0 O mLの血漿を 60mLまで濃 縮し、 引き続いて次の 1束を浸漬し吸引した。 20mLまで濃縮後、 3束目の濃縮を 行い、 10mLとし、 4束目で 5mLまで濃縮した。 4束目まで濃縮操作が終了するの に要した時間は、 4 3分であった。 フイブリノ一ゲン濃度は、 16. 3mg/mL となつ た。原料血漿中の濃度が 1. 8mg/mLであったことから、 9倍の濃縮倍率を得ること ができた。 実施例 9
図 7に示す構造の血漿分離カラムおょぴ血漿ろ過カラム、 および図 8に示す構 造の活性化トロンビン血漿調製装置を用い、 図 6に示す血液処理用装置を組み立 てた。
図 7において、 血液または血漿入口 （2 1 ) に導入された血液または血漿は、 中空繊維膜 （2 4 ) を透過して、 血漿除去多血球分画と血漿、 または濃縮血漿と ろ過血漿とに分離され、 出口 （2 2 ) 及び （2 3 ) から導出される。
血漿分離カラムとしてはエチレン -ビュルアルコールにてコーティングされた ポリエチレン中空繊維膜 （最大孔径 0. 3 μ ΐη) を使用し、 血漿ろ過装置としてはセ ルロースジァセテート中空繊維膜 （平均孔径 0. 1 m、 カツトオフ分子量 90kDa) を使用した。
CPD加牛全血 500mLを、 一定流速 lOOmL/分で血漿分離カラムに導入し、 200mL の血漿を得た。 さらに得られた血漿を、 一定流速 25 /分で血漿ろ過カラムに導 入し且つ、 膜を通過した血漿 （以下、 ろ過血漿） を一定流速 25mL/分で血漿ろ過 力ラム側面に配置された出口から導出し、 これを活性化トロンビン血漿調製装置 に貯留した。 これと並行して、 膜を透過せず濃縮された血漿 （以下、 濃縮血漿） を、 一定流速 lmL/分で導出し、 これを貯留した。
この処理によって、 ろ過血漿 158mLおよび濃縮血漿 8mLを得ることができた。 また、 血漿ろ過カラム導入前の血漿のフイブリノ一ゲン濃度は、 2.8mg/mL、 ろ過 血漿のフィブリノ一ゲン濃度は lmg/mL未満であり、濃縮血漿のフィブリノ一ゲン 濃度は 42mg/mLであつた。
ろ過血漿は、 図 8に示すカルシウム添加生理食塩水 （3 3) 及ぴシリコンビー ズ （3 4) を充填した塩化ビニル製血漿貯留バッグ （3 2) からなる活性化トロ ンビン血漿調製装置内で、 カルシウム添加生理食塩水及びシリコンビーズと混和 された後、 シリコンビーズを除去する為のフィルターによりろ過された。 ろ過さ れた血漿は、 活性化トロンビン血漿として貯留された。
濃縮血漿 8IBLと活性化トロンビン血漿 5mLとを混合し、 フィプリン含有生物学 的足場材を作製した。 この時、 両液混合から凝固するまでの時間は 2秒未満であ つた。また、作製したフィプリン含有生物学的足場材を室温で 24時間保存したと ころ、 肉眼的変化,は認められなかった。 これらの結果から、 本方法により、 優れ た凝固能力を有し且つ安定な、 フイブリン含有生物学的足場材を調製することが できることが確認された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 組織の再生に適した性能の良い生物学的足場材を提供すること が可能になった。 本発明のフイブリン含有生物学的足場材は、 種々の細胞に対す る増殖活性を有することから、組織の接着'閉鎖による止血、損傷治癒、人工骨、 人工皮膚または人工臓器などの形成、 肝移植手術等の治療や、 アルブミンの大量 生産、 薬物代謝研究等に有用である。
さらに本発明により、 迅速 ·簡便で、 感染の危険性のない安全かつ安定なフィ ブリン含有生物学的足場材の製造方法及び製造システムが得られる。
本願が主張する優先権の基礎となる特願 2 0 0 2 - 24 3 9 2 3及ぴ特願 2 0 0 2 - 244 2 9 4の明細書に記載の内容は全て本明細書の開示の一部として本 明細書中に引用するものとする。

Claims

請求の範囲
1 . フイブリン組成物を人体組織の再生及ぴ細胞増殖に用いる場合において、 ヒト血漿から、 短時間 ·粗精製工程により得られたフイブリノ一ゲン濃縮物と、 フイブリノ一ゲン活性化物との混合物を含むことを特徴とするフィプリン含有生 物学的足場材。
2 . 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、血漿を短時間冷却工程、急速解凍工程、 及ぴフイブリノ一ゲン濃縮物を回収する工程を含む方法によつて得られたもので ある請求項 1に記載のフィブリノ一ゲン含有生物学的足場材。
3 . 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 フイブリノ一ゲン回収率が 1 5 %から 3 2 %の範囲になるよう血漿から沈殿させて得られたものである請求項 1または 2に記載のフイブリン含有生物学的足場材。
4 . 前記フイブリノーゲン濃縮物が、血漿を 1 0分から ' 6 0分間の冷却工程、 1 5分から 6 0分間の解凍工程、 及ぴフイブリノ一ゲン濃縮物を回収する工程を 含む方法によつて得られたものである請求項 1〜 3の何れか【こ記載のフイブリン 含有生物学的足場材。
5 . 冷却工程を- 2 0 °C力ゝら- 4 0 °Cで行い、解凍工程を- 1 0 °Cから + 1 5 °C で行う請求項 3または 4に記載のフイブリン含有生物学的足場材。
6 . 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 ヒ ト血漿から血漿成分分画装置を用い て得られたものである請求項 1に記載のフイブリン含有生物学的足場材。 .
7 . 前記血漿成分分画装置が血漿成分分画用の中空糸膜を内蔵したものであ る請求項 6に記載のフイブリン含有生物学的足場材。
8 . 前記中空糸膜の素材が、親水化ポリスルホン、 EVAL (エチレン一ビュルァ ルコール共重合体）、 PAN (ポリアクリロニトリル）、 CDA (セルロースジァセテー ト）、 CTA (セルローストリアセテート） からなる群から選ばれる何れか一つであ る請求項 7記載のフィプリン含有生物学的足場材。
9 . 前記中空糸膜素材が、 親水化ポリスルホンまたは EVAL (エチレンービニ ルアルコール共重合体）である請求項 8に記載のフィプリン含有生物学的足場材。
1 0 . 前記中空糸膜のカットオフ値が 8 0 , 0 0 0ダルトン以上 3 0 0， 0 0 0ダルトン以下である請求項 6〜 9の何れかに記載のフィプリン含有生物学的 足場材。
1 1 . 前記中空糸膜のカットオフ値が 1 5 0 , 0 0 0ダルトン以上 4 0 0， 0 0 0ダルトン以下である請求項 6〜 9の何れかに記載のフィブリン含有生物学 的足場材。
1 2 . 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 血漿成分分画装置における中空糸の 中空部にヒ ト血漿を流通させ、 その際に、 中空糸内壁から外壁に主として液体成 分を透過させることにより、 中空糸の末端から得られたものである請求項 6〜 1 1の何れかに記載のフィブリン含有生物学的足場材。
1 3 . 前記中空部に流入させる単位時間あたりの当該患者血漿の量 Binと、 中空糸末端より単位時間あたりに採取するフイブリノ一ゲン濃縮液の量 Bout と の比 BinZBoutが、 2〜 2 0の範囲である請求項 1 2に記載のフィブリン含有生 物学的足場材。
1 4 . 前記 Bin/Bout比が 5〜 1 0の範囲である請求項 1 2または 1 3に記載 のフイブリン含有生物学的足場材。
1 5 . 前記フイブリノ一ゲン濃縮物が、 血漿成分分画装置における中空糸の 外壁にヒト血漿を接触させ、 その際に、 中空糸外壁から内壁に主として液体成分 を透過させることにより、 中空糸の外部に接触させている血漿を濃縮して得られ たものである請求項 6〜 1 4の何れかに記載のフィブリン含有生物学的足場材。
1 6 . 液体成分を透過させる際に、 中空糸の中空部を減圧にし、 吸引によつ て中空糸外部より中空糸内部に透過させる請求項 1 5に記載のフィプリン含有生 物学的足場材。
1 7 . 前記中空糸の外壁に接触させる血漿の量 Cinitialと主として液体成分 を透過させて、 中空糸の外部に接触させている当該血漿を濃縮し得られるフイブ リノ一ゲン濃縮液の量 Cendの比、 Cinitial/Cend比が 2〜 2 0の範囲である請求 項 1 5または 1 6に記載のフィプリン含有生物学的足場材。
1 8 . 前記 Cinitial/Cend比が 5〜 1 0の範囲である請求項 1 5〜 1 7の何 れかに記載のフィブリン含有生物学的足場材。
1 9 . 前記中空糸の外壁に接触させる当該患者血漿の量が 5 X 1 0 _ 5〜5 X 1 0一4 m 3、接触させる中空糸の外表面積が 0 . 0 0 l〜l m 2、 吸引による差圧 が 0 . 0 0 1〜0 . 0 8 M P aとする請求項 1 5〜 1 8の何れかに記載のフイブ リン含有生物学的足場材。
2 0 . 前記フイブリノ一ゲン活性化物質がトロンビンである請求項 1〜 1 9 の何れかに記載のフィブリン含有生物学的足場材。
2 1 . 前記トロンビンが、 フイブリノ一ゲンと同一人の血液から得られたも のである請求項 2 0に記載のフィブリン含有生物学的足場材。
2 2 . 血管内皮細胞、 線維芽細胞、 角化細胞、 間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨芽 細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 腠細胞及び造血幹細胞からなる群から選ばれる細胞 の培養のために使用する請求項 1〜 2 1の何れかに記載のフィブリン含有生物学 的足場材。
2 3 . 血管内皮細胞、 線維芽細胞、 角化細胞、 間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨芽 細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 膝細胞及ぴ造血幹細胞からなる群から選ばれる少な くとも一種の細胞を、 生物学的足場材無しあるいは精製フイブリノ一ゲン濃縮物 を対照とした時、 対照を上回る細胞増殖活性を有する請求項 1〜 2 2の何れかに 記載のフィプリン含有生物学的足場材。
2 -4 . 請求項 1〜 2 3の何れかに記載のフィプリン含有生物学的足場材を用 いて細胞を培養することを含む細胞培養または組織再生のための方法。
2 5 . 前記細胞が、 血管内皮細胞、 線維芽細胞、 角化細胞、 間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 腠細胞及び造血幹細胞からなる群から 選ばれる請求項 2 4に記載の方法。
2 6 . 前記細胞が、 フイブリノ一ゲン濃縮物の原料とした血漿を採取した人 と同一人に由来する請求項 2 4または 2 5に記載の方法。
2 7 . 細胞増殖 ·分化刺激物質の存在下で培養を行う請求項 2 4〜 2 6の何 れかに記載の方法。
2 8 . 前記細胞増殖 ·分化刺激物質が、 血小板から放出される物質である請 求項 2 7に記載の方法。
2 9 . 前記血小板から放出される物質が、 下記の工程：
( 1 ) 赤血球、 血小板、 及ぴ血漿を通過させ、 かつ白血球を吸着する第 1段フィ ルターに全血を通し、 フィルターからの通過画分を得る工程；
(2) (1) で得られた通過画分を、血小板を吸着し、赤血球を通過させる第 2段 フィルターに通し、 血小板が吸着したフィルターを得る工程；
(3) (2) で得られたフィルターに、血小板活性化物質を含む回収液を通し、活 性化血小板放出物質の含有液を得る工程：を含む方法によって得られる請求項 2 8に記載の方法。
30. 前記血小板活性化物質が、 ATP、 ADP、 コラーゲン、 及ぴトロンビンか ら成る群から選ばれる少なくとも 1つの物質である請求項 29に記載の方法。
31. 前記細胞増殖 ·分化刺激物質が、 白血球から放出される物質である請 求項 27に記載の方法。
32. 前記白血球から放出される物質が、 下記の工程：
(1) 赤血球、 血小板、 及ぴ血漿を通過させ、 白血球を吸着する第 1段フィルタ 一に全血を通し、 白血球が吸着したフィルターを得る工程；
(2) (1)で得られたフィルターに白血球活性化物質を含む回収液を通し、活性 化白血球放出物質の含有液を得る工程；を含む請求項 31に記載の方法。
33. 前記細胞増殖 ·分化刺激物質が血小板から放出される物質と白血球か ら放出される物質の混合物である請求項 27に記載の方法。
34. 前記血小板から放出される物質と白血球から放出される物質との混合 物が、 下記の工程：
(1) 赤血球と血漿を通過させ、 血小板と白血球を吸着するフィルターに全血を 通し、 血小板と白血球が吸着したフィルターを得る工程；
(2) (1) で得られたフィルターに、血小板活性化物質と白血球活性化物質を含 む回収液を通し、 活性化血小板放出物質と活性化白血球放出物質の含有液を得る 工程を
含む方法によって得られることを特徴とする請求項 33に記載の方法。
35. 細胞が、 人由来の細胞をフィルターに通すことによって得られる請求 項 24〜 34の何れかに記載の方法。
36. フイブリノ一ゲン濃縮物の原料である血漿が、 人血液をフィルターに 通すことによって得られたものである請求項 24~34の何れかに記載の方法。
3 7 . 請求項 2 4〜3 6のいずれかに記載の方法によって得られる足場材に 坦持された細胞培養物または再生組織。
3 8 . 請求項 3 7に記載の細胞培養物または再生組織を、 損傷を受けた組織 に塗布または移植片として用いる組織再生促進方法。
3 9 . 請求項 1〜 2 3の何れかに記載の生物学的足場材と細胞を混合した混 合物を、 損傷を受けた組織に添加する工程を含む組織再生促進方法。
4 0 . 前記細胞が、 血管内皮細胞、 線維芽細胞、 角化細胞、 間葉系幹細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 肝臓細胞、 膝細胞及ぴ造血幹細胞からなる群から 選ばれる少なくとも一つの細胞である請求項 3 9に記載の組織再生促進方法。
4 1 . フィプリン含有生物学的足場材を得るための濃縮システムであって、 以下の手段：
( 1 ) ヒ ト血漿を血漿成分分画膜によって粗精製する手段；
( 2 ) ヒ ト血漿を前記膜表面に導入する手段；
( 3 ) 前記膜表面からフイブリノ一ゲン濃縮物を得る手段；
を含むフイブリノーゲン濃縮システム。
4 2 . 前記血漿成分分画膜の力ットオフ値が 8 0 , 0 0 0ダルトン以上 3 0 0， 0 0 0ダルトン以下であることを特徴とする請求項 4 1に記載のシステム。
4 3 . 前記血漿成分分画膜の力ットオフ値が 1 5 0 , 0 0 0ダルトン以上 4 0 0 , 0 0 0ダルトン以下であることを特徴とする請求項 4 1に記載のシステム。
4 4 . 前記血漿成分分画膜が中空糸膜である請求項 4 2又は 4 3に記載の濃 縮システム。
4 5 . 前記中空糸膜の素材が、親水化ポリスルホン、 EVAL (エチレン一ビニル アルコール共重合体）、 PAN (ポリアクリロニトリル）、 CDA (セルロースジァセテ 一ト）、 CTA (セルロース トリアセテート） からなる群から選ばれる何れか一つ であることを特徴とする請求項 4 4に記載のシステム。
4 6 . 前記中空糸膜素材が、 親水化ポリスルホン、 または EVAL (エチレン一 ビュルアルコール共重合体） である請求項 4 5に記載のシステム。
4 7 . 前記導入手段が、 前記分画装置に設けた流通口の一つから中空糸膜の 内表面または外膜表面にヒト血漿を導入し、 別の流通口から導出させる送液装置 または吸引装置である請求項 4 1〜4 6の何れかに記載の濃縮システム。
4 8 . 前記濃縮物を得る手段が、 前記分画装置に設けた流通口の一つに接続 される濃縮物貯留手段である請求項 4 1〜4 7の何れかに記載の濃縮システム。
4 9 . 前記粗精製手段が、 容器に内蔵された中空糸膜の両端部を、 中空内部 が容器外部に流通するようにポッティングしてなる血漿成分分画装置である請求 項 4 ：!〜 4 8の何れかに記載の濃縮システム。
5 0 . 前記粗精製手段が、 容器に内蔵された中空糸膜の一端を中空内部が容 器外部に流通するようにポッティングし、 他端を封止してなる血漿成分分画装置 である請求項 4 1〜4 8の何れかに記載の濃縮システム。
5 1 . 血漿成分分画装置における中空糸の中空部にヒト血漿を流通させ、 そ の際に、 中空糸内壁から外壁に主として液体成分を透過させて中空糸の末端より フィプリノーゲン濃縮液を採取する請求項 4 9に記載の濃縮システムの運転方法。
5 2 . 前記中空部に流入させる単位時間あたりの当該患者血漿の量 Binと、 中空糸末端より単位時間あたりに採取するフイブリノ一ゲン濃縮液の量 Bout と の比 Bin/Boutが 2〜2 0の範囲である請求項 5 1記載の濃縮システムの運転方 法。
5 3 . 前記 Bin/Bout比が 5〜 1 0の範囲である請求項 5 2に記載の濃縮シス テムの運転方法。
5 4 . 血漿成分分画装置における中空糸の外壁にヒ ト血漿を接触させ、 その 際に、 中空糸外壁から内壁に主として液体成分を透過させて、 中空糸の外部に接 触させている当該血漿を濃縮し、 フイブリノ一ゲン濃縮液を得る請求項 5 0に記 載の濃縮システムの運転方法。
5 5 . 血漿を、 中空糸の外壁に接触させ、 その際に、 中空糸外壁から内壁に 主として液体成分を透過させる際、 中空糸の中空部を減圧にし、 吸引によって該 成分を中空糸外部より中空部内に透過させる請求項 5 4に記載の濃縮システムの 運転方法。
5 6 . 前記中空糸の外壁に接触させる血漿の量 Cinitialと主として液体成分 を透過させて、 中空糸の外部に接触させている当該血漿を濃縮し得られるフイブ リノ一ゲン濃縮液の量 Cendの比、 Cinitial/Cend比が 2〜2 0の範囲である請求 項 55に記載の濃縮システムの運転方法。
57. 前記 Cinitial/Cend比が 5〜 10の範囲である請求項 54に記載の濃 縮システムの運転方法。
58. 前記中空糸の外壁に接触させる当該患者血漿の量が 5 X 10— 5〜5 X 10一4 m3、接触させる中空糸の外表面積が 0. 00 l〜lm2、 吸引による差圧 が 0. 001〜0. 08 MP aとする請求項 54〜 57の何れかに記載の濃縮シ ステムの運転方法。
59. 下記の手段：
( 1 ) カツトオフ値が 80, 000ダルトン以上 300， 000ダルトン以下の 血漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの 分画血漿に分離する手段；
( 2 )前記フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの分画血漿とをそれぞれ回 ¾1する手段；
(3) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物からフィプリン糊を製造する手段；
(4) 残りの分画血漿を再利用する手段；
を含むフイブリン含有生物学的足場材を製造するためのシステム。
60. 下記の手段：
( 1 ) カツトオフ値が 150， 000ダルトン以上 400, 000ダルトン以下 の血漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残り の分画血漿に分離する手段；
(2)前記フイブリノーゲン濃縮物と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する手段；
(3) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物からフィプリン糊を製造する手段；
(4) 残りの分画血漿を再利用する手段；
を含むフィプリン含有生物学的足場材を製造するためのシステム。
61. 前記ヒ ト血漿が連続的体外循環によって採取された血漿である請求項 59又は 60に記載のシステム。
62. 前記ヒト血漿を採取する手段が、 全血から血漿を分離する手段を含む 請求項 59から 6 1の何れかに記載のシステム。
63. 前記ヒト血漿を分離する手段が、 重力分離、 遠心分離あるいは膜分離 手段である請求項 59〜62の何れかに記載のシステム。
64. フイブリノ一ゲン濃縮物を得るためのヒト血漿から活性化トロンビン 血漿を調製する請求項 59〜63の何れかに記載のシステム。
65. 前記フイブリノ一ゲン濃縮物から活性化トロンビン液を得る請求項 5 9〜64の何れかに記載のシステム。
66. 血漿成分分画膜によつて分画して得た残りの分画血漿を、 活性化ト口 ンビン血漿の調製に用いる請求項 59〜65の何れかに記載のシステム。
67. 血漿成分分画膜によつて分画して得た残りの分画血漿を、 血漿分離手 段によつて血漿が分離された血漿分離血液と混合して人体に返還する請求項 59 〜66の何れかに記載のシステム。
68. 前記回収手段が、 得られるフイブリノ一ゲン濃縮物を単独ドナー由来 のフイブリノ一ゲン濃縮血漿として貯蔵する手段を含む請求項 59〜67の何れ かに記載のシステム。
69. 前記フイブリン糊を製造する手段が、 フィプリノーゲン濃縮物とフィ プリン安定化因子及ぴフィプリノーゲン活性化因子と混合する手段を含む請求項 59〜 68の何れかに記載のシステム。
70. 下記の工程：
( 1 ) カットオフ値が 80, 000ダルトン以上 300, 000ダルトン以下の血 漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの分 画血漿に分離する工程；
(2) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物フイブリノ一ゲンを多く含む高分子分画血漿 と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する工程；
(3) 前記フイブリノーゲン濃縮物フイブリノ一ゲンを多く含む高分子分画血漿 からフイブリン糊を製造する工程；
(4) 及び、 残りの分画血漿を再利用する工程；
を含むフィブリン含有生物学的足場材の製造方法。
71. 下記の工程：
(1) カツトオフ値が 150, 000ダルトン以上 400, 000ダルトン以下の 血漿成分分画膜によってヒト血漿を分画して、 フイブリノ一ゲン濃縮物と残りの 分画血漿に分離する工程； ( 2 ) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物ブイプリノーゲンを多く含む高分子分画血漿 と残りの分画血漿とをそれぞれ回収する工程；
( 3 ) 前記フイブリノ一ゲン濃縮物フィプリノーゲンを多く含む高分子分画血漿 からフイブリン糊を製造する工程；
( 4 ) 及び、 残りの分画血漿を再利用する工程；
を含むフィブリン含有生物学的足場材の製造方法。
7 2 . 前記ヒト血漿が連続的体外循環において採取される工程を含む請求項 7 0又は 7 1に記載の方法。
7 3 . 前記ヒト血漿を採取する工程が、 全血から血漿を分離する工程を含む 請求項 7 0〜 7 2の何れかに記載の方法。
7 4 . 血漿を分離する工程が、 重力分離、 遠心分離、 あるいは膜分離工程で ある請求項 7 0〜 7 3の何れかに記載の方法。
7 5 . 血漿成分分画膜によつて分画して得た残りの分画血漿を、 血漿分離手 段によつて血漿が分離された血漿分離血液と混合して人体に返還する工程を含む 請求項 7 0〜 7 4の何れかに記載の方法。
7 6 . 前記回収工程が、 得られるフィプリノーゲン濃縮物を単独ドナー由来 のフイブリノ一ゲン濃縮血漿として貯蔵する工程を含む請求項 7 0〜 7 5の何れ かに記載の方法。
7 7 . フイブリン糊を製造する工程が、 フイブリノ一ゲンを多く含む高分子 分画血漿とフイブリン安定化因子及ぴフイブリノ一ゲン活性化因子と混合するェ 程を含む請求項 7 0〜 7 6の何れかに記載の方法。
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