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WO2004003199A1 - 核酸若しくは遺伝子の新規取得方法 - Google Patents

核酸若しくは遺伝子の新規取得方法 Download PDF

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Publication number
WO2004003199A1
WO2004003199A1 PCT/JP2003/008311 JP0308311W WO2004003199A1 WO 2004003199 A1 WO2004003199 A1 WO 2004003199A1 JP 0308311 W JP0308311 W JP 0308311W WO 2004003199 A1 WO2004003199 A1 WO 2004003199A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
primer probe
obtaining
reaction
species
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/008311
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shinya Kurata
Yoichi Kamagata
Yuji Sekiguchi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Kankyo Engineering Co Ltd
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Kankyo Engineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST, Kankyo Engineering Co Ltd filed Critical National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Publication of WO2004003199A1 publication Critical patent/WO2004003199A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to a method for searching for and obtaining a novel useful nucleic acid or gene existing in one system in nature. Specifically, using a consensus base sequence for a nucleic acid species having a known identical function, the nucleic acid in the system is amplified, and a new or identically functional nucleic acid species is searched for from the amplified nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for obtaining a novel useful nucleic acid (including a gene) from among them. Background art
  • an object of the present invention is to detect and measure a plurality of useful nucleic acid groups having the same function simultaneously, quickly, simply, and with high sensitivity from all nucleic acids existing in one system in nature. And next!
  • the present invention provides a method for selectively and quickly and easily obtaining only those novel and useful nucleic acids by using (1) / (2).
  • the present inventors conducted nucleic acid amplification using a nucleic acid probe labeled with a substance such as a fluorescent substance or a quencher substance and having a consensus base sequence to a known nucleic acid, and performed the nucleic acid concentration or amplification before amplification. Copy number measurement, analysis of temperature dissociation curve of amplification products, It was found that the above problems could be solved by combining type analysis, base sequence analysis, anchor PCR method, and the like. The present invention has been completed based on strong knowledge.
  • a method for obtaining a nucleic acid comprising at least the following steps:
  • nucleotide sequence is decoded and determined based on the nucleic acid species preferentially in concentration or the broad nucleic acid species specified as a new or the same functional nucleic acid species in the above 2), and identified as the new or the same functional nucleic acid species.
  • a new or identically functional nucleic acid species is specified from among the amplified nucleic acid species thus obtained.
  • nucleic acid species containing at least a partial nucleotide sequence or a full-length nucleotide sequence of a nucleic acid species of the same or new function is obtained.
  • a method for obtaining a nucleic acid comprising at least the following steps:
  • linker 11 and linker 12 At least one kind of linker pair (hereinafter, referred to as linker 11 and linker 12) is added to the above-mentioned restriction enzyme-treated product 1), and a ligation reaction is performed. 3) Divide the reaction product described in 2) into two (one is A and the other is B), and perform the following reaction.
  • A For A, perform the following reactions (a) and (b) simultaneously or sequentially: (a) At least one antisense primer probe is added to A, and a nucleic acid extension reaction is performed.
  • a nucleic acid extension reaction is performed by adding at least one kind of antisense adapter primer probe to A or the reaction product of the above (a).
  • At least one kind of sense primer probe is added to B, and a nucleic acid extension reaction is performed.
  • At least one kind of sense adapter primer probe is added to B or the reaction product of the above (c) to perform a nucleic acid extension reaction.
  • nucleic acid treated with the restriction enzyme is a nucleic acid treated with the restriction enzyme for the polymorphism analysis according to the above 1,
  • An acquisition method is provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing a state where a restriction enzyme fragment of a nucleic acid and a linker are bound.
  • FIG. 2 shows a temperature dissociation curve of a QP-PCR product.
  • FIG. 3 is a diagram showing a curve obtained by differentiating the temperature dissociation curve of FIG. -O- No. 1 -m- No. 4 -0- No. 7
  • Fig. 4 shows the T-RFLP pattern of sample (sample) No. 4.
  • FIG. 5 is a diagram showing a T-RFLP pattern of sample (sample) No. 5.
  • At least one type means one or more types.
  • nucleic acid or gene is collectively referred to simply as “nucleic acid”.
  • nucleic acid species refers to a group of nucleic acids and / or genes having identical functions.
  • the “function” means biologically significant. And it has the function of nucleic acid (DNA, RNA) itself and its expression product (mRNA, protein).
  • mRNA, protein examples of the function of the nucleic acid itself include, in the case of DNA, a base sequence other than structural genes such as a promoter, a regulator, a terminator, and the like.
  • RNA the base sequence of the active site of an enzyme such as ribozyme can be mentioned.
  • Wear In the case of an expression product, for example, a base sequence that controls the structure of the protein and a base sequence that controls the enzyme activity and the like can be mentioned. These are merely examples of some of the functions to explain them. Therefore, the present invention is not limited by these examples.
  • Concentration-preferred nucleic acid species '' means, when multiple nucleic acid species are present, the highest (high) or relatively high concentration in terms of concentration based on the electrophoresis electrophoresis pattern or as a result of quantification. (Approximately 1 to 5 from the ranking) It is a nucleic acid species. It does not distinguish between before and after nucleic acid amplification. -In the present invention, the “nucleic acid contained in a sample” may be simply referred to as a target nucleic acid or a target nucleic acid.
  • the term "measuring nucleic acid” or “measuring nucleic acid concentration” refers to not only quantifying the concentration of a target nucleic acid, but also performing quantitative detection, qualitative detection, It simply means the ability to simply measure or simply monitor the fluorescence intensity of the nucleic acid amplification system.
  • the data thus obtained was analyzed by the method of Kurata et al. (EP Patent Publication, EP1 046 717 A9), and the concentration (copy number, etc.) existing in one system was analyzed. ) Shall be included.
  • nucleic acid contained in the sample” of the present invention is not limited to a specific nucleic acid for the purpose of detection and measurement, but refers to an unspecified nucleic acid that can be unintentionally detected by the method of the present invention. Shall be included. Of course, it includes genes and the like. These nucleic acids may be mixed. Regardless of the concentration. That is, specific and unspecified detectable nucleic acids that are considered to be useful in the present and future, present in one system. Nucleic acids include DNA, RNA and their modifications. In the present invention, these nucleic acids may be referred to as target nucleic acids.
  • the consensus primer probe means that the nucleotide sequence of the primer probe hybridizing to the complementary nucleotide sequence is part or all of a consensus nucleotide sequence site recognized from a group of known nucleic acid species having the same function. Let's look at the primer probe that hybridizes.
  • the “consensus sequence” is defined as defined in molecular biology and includes consensus sequences with known nucleic acids, as well as consensus sequences with known nucleic acids.
  • linkers linker 1 and linker 1
  • an antisense primer probe an antisense primer probe
  • sense primer probe an antisense primer probe
  • sense Or specifically, the antisense adapter primer probe
  • optical character refers to various absorption spectra or fluorescence emission spectra of fluorescent substances and quencher substances that label primer probes, and their absorption intensity, polarization, fluorescence emission, fluorescence intensity, fluorescence lifetime. Characteristics such as fluorescence, polarization and anisotropy! /, U (when collectively referred to as "fluorescence intensity", there is power S.) It also refers to the property obtained by comprehensively evaluating the measurement values of at least one fluorescent substance or the like, which is labeled on a primer probe, at at least one or more measurement wavelengths. For example, a fluorescence intensity curve of a nucleic acid denaturation reaction is one of them.
  • the term “from the change or the amount of change in the fluorescence intensity” refers to a homogenous solution labeled with a fluorescent substance and Z or toluene on the amplified nucleic acid, not only the change in the fluorescence intensity based on the amplified nucleic acid of the present invention.
  • the system nucleic acid probe is hybridized, the change or the amount of change in the fluorescence intensity before and after the hybridization is included.
  • a complex of a primer probe and a nucleic acid by hybridization of a primer probe and a corresponding nucleic acid is referred to as a hybrid, a hybrid complex, or simply a nucleic acid-primer complex or a primer. It is called a nucleic acid complex.
  • Nucleic acid polymerases have the ability to synthesize nucleic acids. Typical examples are DNA polymerases, RNA polymerases, reverse transcriptases (reverse
  • DNA polymerase it may or may not have exonuclease activity. It may be either purified or unpurified crude enzyme.
  • the origin of the enzyme is not particularly limited. Preferably, those having heat resistance are preferred.
  • the amino acid sequence of the enzyme may be modified by genetic engineering, and then included.
  • Preferred examples include ent (exo-) DNA Polymerase (from Thermococcus litoralis, Tgo (exo-) D Polymerase ⁇ ThermoSequenase DNA
  • the fluorescent substance (sometimes referred to as a fluorescent dye) in the present invention is a kind of fluorescent substance generally used for measurement and detection of nucleic acid, which is labeled on a nucleic acid probe.
  • fluorescein or derivatives thereof for example, fluorescein isothiocyanate (FITC) or derivatives thereof
  • Alexa 488 Alexa 532
  • Cy3, Cy5, 6-joe EDANS
  • Rhodamine 6G R6G
  • tetramethylrhodamine TMR
  • tetramethylrinorhodamine isothiocyanate tetramethylrhodamine
  • BODIPY isothiocyanate
  • x- rhodamine x- rhodamine
  • Texas Red Texas red
  • Bodepi BODIPY
  • FL trade name: Morekiyura 1 probe (Molecular Probes) Co., Ltd., the United States; BODIPY tips Rere The same applies hereinafter.
  • BODIPY BODIPY FL / OS ⁇ BODIPY (BODIPY) FL / ce.
  • BODIPY PODIPY
  • TAMRA TAMRA
  • AMRA AMRA
  • FITC EDANS, Texas Red, 6-joe, TMR, Alexa 488, Alexa 532, BODIPY FL / C3, BODIPY R6G, BODIPY (BODIPY) FL, BODEPY ( BODIPY) FL C6, BODIPY (TMR), TMD, BODIPY (BODIPY) 5-FAM, BODIPY (BODIPY) 493,503, BODIPY (BODIPY) 564, BODIPY (BODIPY) 581, Cy3, Cy5, x-Rhodamine, etc. It can be cited as suitable.
  • a quencher substance is a substance that acts on the fluorescent substance to suppress or extinguish its light emission.
  • the luminescence of the fluorescent substance is subjected to a quenching effect by the quencher substance.
  • the present invention has four inventions, and is characterized by a combination of a nucleic acid amplification method, a Tm value analysis method, a polymorphism analysis method, and an anchor PCR method.
  • the sample containing at least one kind of nucleic acid referred to in the present invention can survive in any place in nature, for example, sewage, paddy fields, uplands, mountains, swamps, animal bodies, and various organs of animals. It is collected at a location or when it survives vigorously and cannot be specifically limited. It also includes various cells of various organisms. It may be one containing all the nucleic acids in the system or one containing-part. The nucleic acid may or may not be subjected to nucleic acid extraction. Nucleic acid is as defined above.
  • nucleic acid amplification reaction For each of these samples, perform a nucleic acid amplification reaction on at least one type of nucleic acid to confirm nucleic acid amplification. In this case, it is preferable to measure the concentration or copy number of the amplified nucleic acid before and / or after amplification at the same time as the amplification reaction.
  • the nucleic acid amplification method refers to a method for amplifying a nucleic acid in vitro.
  • PCR method LCR method (ligase chain reaction) s ⁇
  • AS force method AS force method
  • ICAN Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids
  • LAMP method LAMP method
  • NASR A method NASR A method
  • RCA method TAMA method
  • UCAN method Shall be included.
  • the PCR method may be of any type. For example, quantitative PCR methods, Anotime quantitative PCR method, RT-PCR, RNA-primed PCR, Stretch PCR, reverse PCR, PCR using Alu sequence, multiplex PCR, mixed primer probe PCR, and PCR using PNA can be performed.
  • the PCR method also includes a method of analyzing a melting curve or a method of analyzing nuclear sensitivity amplified by PCR.
  • a quantitative PCR method or a real-time quantitative PCR method is employed.
  • any primer can be used as long as the present invention can be achieved, and at least one type of forward-type and reverse-type primer probes can be used. It is preferable to use a consensus primer probe that also provides a mold force.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed on the assumption that a nucleic acid having a consensus base sequence (a nucleic acid having the same function) exists in a sample.
  • the consensus primer probe is a fluorescent substance-labeled consensus primer probe labeled with at least one fluorescent substance in a forward type and / or a reverse type.
  • the at least one fluorescent substance-labeled consensus primer probe it is preferable to use at least one Q probe or sunrise probe. The details of the primer probe will be described later.
  • the present invention also relates to a fluorescent substance-labeled consensus primer probe comprising at least one forward-type or reverse-type fluorescent substance, each of which has a different consensus base sequence and a different fluorescent level.
  • a method for obtaining a nucleic acid using a fluorescent substance-labeled consensus primer probe labeled with a fluorescent substance that gives a luminescent color is also a method for obtaining a nucleic acid using a fluorescent substance-labeled consensus primer probe labeled with a fluorescent substance that gives a luminescent color.
  • the nucleic acid to be amplified may be a plurality of nucleic acid species having the same function.
  • nucleic acid species that have a A function a nucleic acid species having a B functions may be simultaneously amplified (where, A and B are not equal.) 0
  • a plurality of fluorescent substance-labeled consensus primer probes each having a different consensus base sequence and labeled with a fluorescent substance giving a different fluorescent emission color, a plurality of the same functional nucleic acid species are subjected to one reaction. It may be amplified by the system.
  • the concentration or copy of the amplified nucleic acid before and after amplification or after amplification can be measured irrespective of the type of nucleic acid in the sample, which is also preferable.
  • the amplified nucleic acid species a concentration-priority nucleic acid species before or after amplification is specified. That is, the amplified nucleic acid species amplified by using one consensus primer probe is not necessarily one species! / ⁇ . Thus, it is preferred to identify high-level nucleic acid species at high concentrations.
  • the amplification product is electrophoresed using a known 0.5% (w / v) to 1.5% (w / v) agarose gel or 6 to 8% (w / v) polyacrylamide gel ( Bioengineering Experiments, 97-163, 1993, edited by The Society of Biotechnology, Japan, published by Baifukan), or easily analyzed or analyzed by the general HPLC method (with various fillers) or the sequencer method. Can be identified.
  • the electrophoresis method, the HPLC method, and the sequencer method are preferably performed under conventionally known conditions! Examples of the sequencer include ABI 373A (ABI's sequencer),
  • ABI377 (Sequencer of ABI), Biofocus 3000 (Biorat) and the like can be mentioned.
  • This procedure involves gradually increasing the temperature of the amplified nucleic acid (eg, from 50 ° C to 95 ° C) until the nucleic acid is completely denatured at low temperatures, in which a short time interval (eg, (The interval corresponding to a temperature rise of 2 ° C to 0.5 ° C). Also in this case, it is preferable to use a fluorescent substance-labeled consensus primer probe. Appropriate data can be obtained. This is specifically shown in the following and Examples.
  • Tm value a specific temperature dissociation curve
  • Tm value a nucleic acid species showing a specific temperature dissociation curve
  • the identification method can be easily performed by analyzing or analyzing the amplified product by a known electrophoresis method, HPLC method, sequencer method or the like as described above.
  • the polymorphism analysis method may be any method as long as the object of the present invention can be achieved, and is preferably performed by a known method.
  • the object of the present invention can be achieved by using the T-RFLP method, the SSCP method, the CFLP method, the ARMS method, the direct-sequence method, and the MPH method.
  • the T-RFLP method can be suitably used in the present invention. Therefore, the method will be described below as one example of the present invention.
  • the gene is amplified by a quantitative PCR method using the Q probe as a primer probe, particularly a real-time quantitative PCR method, and the initial gene amount before amplification is measured. Then, the polymorphism is analyzed by the T-RFLP method based on the amplified nucleic acid.
  • the nucleic acid amplified using the Q probe as a primer probe has its 5 'end labeled with the fluorescent substance of the present invention.
  • the procedure includes the following steps (a) to (c).
  • the amplified nucleic acid is treated (digested) with a restriction enzyme.
  • restriction enzyme is not particularly limited.
  • the concentration used is also not particularly limited since it varies depending on the kind of the target restriction enzyme. As an example, 0.01 to 10 units / ⁇ l, preferably (here, 0.1 to 1. Ounits /; U1).
  • the above-mentioned processed product is analyzed and analyzed for gene fragments.
  • the polymorphism analysis method of the present invention only a gene fragment labeled with a fluorescent substance is analyzed and analyzed by an electrophoresis method, an HPLC method, a sequencer method, or the like. That is, each band and each peak are detected based on the fluorescence intensity value. Detection can be performed using conventional analytical instruments currently available on the market. For example, ABI 373A (sequencer from ABI), ABI 377 (sequencer from ABI), Biofocus 3000 (Biorat) and the like can be mentioned.
  • the appearance of a plurality of bands or a plurality of peaks in the analysis means that a polymorphism exists.
  • polymorphism does not exist.
  • the ratio of the fluorescence intensity value of each band or each peak is the abundance ratio of the polymorphism.
  • the amount of the target gene before PCR may be measured in some cases.Therefore, by multiplying the measured value by the ratio of the polymorphism, the initial presence of the polymorphism can be determined. The quantity will be required.
  • This polymorphism analysis' analysis 0 0 If because without using electrophoresis method can identify a new or the same functional nucleic acid species concentration Assured nucleic acid species in the amplified nucleic acid
  • the above procedure that is, the procedure may proceed to the next procedure only by any one of the items 1) to 3), but it is preferable to extend over a plurality of items.
  • these procedures make it possible to identify a new or the same functional nucleic acid species in the amplified nucleic acid.
  • the nucleic acid fragment obtained by the polymorphism analysis is partially decoded and determined.
  • cycle sequence reaction reagent kit
  • thermoSequenase (Amersham), AmpliTaqKS (Per km Elmer)) and a sequence determination reaction by a cycle sequence method (fluorescent substance-labeled primer probe method, fluorescent substance-labeled terminator method). It is convenient to carry out the reaction using a commercially available automatic fluorescence sequencer (row A; JBI, ABI3739 / 377 (PerkinElmer)). And the sequencer (such as PJ9600,
  • nucleotide sequence information obtained from the 'Decoding' of 4 above a new or identically functional nucleic acid species is specified from among the amplified nucleic acid species.
  • nucleic acid species having the same function is the same as a known nucleic acid species only based on information on the nucleotide sequence of the nucleic acid species having the same function determined in this procedure. This is because the amplified nucleic acid does not necessarily amplify the entire base sequence of the same functional nucleic acid species.
  • the primer probe may be in the same form as described in 1 above. The details are described later.
  • the amplification method can be performed in the same manner as in the above 1.
  • novel or functional nucleic acid species is ligated to a vector, and a clone library of the new or functional nucleic acid can be prepared.
  • a probe labeled with a fluorescent substance it is preferable to use a probe labeled with a fluorescent substance! This is because the product labeled with the fluorescent substance does not become a substrate for ligation with the vector, which is indispensable in the cloning and sequence steps.
  • Microbial cells eg, Escherichia coli, yeast, etc.
  • animal or plant cultured cells may be transformed with the novel or functional nucleic acid (gene) linked to the vector, and gene expression may be examined. Then, the expression level and / or the function of the expression product (eg, a physiological activity such as an enzyme activity) are measured.
  • the expression level and / or the function of the expression product eg, a physiological activity such as an enzyme activity
  • the nucleic acid may be directly inserted into the cell.
  • suitable vectors include YAC, BAC and the like.
  • the method of ligation to the vector may be performed by blunt-end cloning, TA cloning, clawing using a restriction enzyme, or the like.
  • the ligation method shown in the second invention You may do the same.
  • a host bacterium such as Escherichia coli can be used to prepare a clone library by a conventional method.
  • the procedure of the first invention has the following features.
  • the invention is preferably carried out in the following order with respect to the nucleic acid species contained in the sample.
  • the procedure 4 is performed in the order of higher nucleic acid species before or after amplification of the amplified nucleic acid.
  • the procedure 4 is performed in the order of higher nucleic acid species before and after amplification of the amplified nucleic acid having a specific temperature dissociation curve (Tm value).
  • the procedure 4 is performed in the order of nucleic acid species having higher concentrations before or after amplification of the amplified nucleic acid specified as a new or target nucleic acid.
  • the invention is carried out in the following order for a sample containing a nucleic acid.
  • the procedure 4 is performed in the order of samples containing nucleic acid species having a high concentration of the amplified nucleic acid before amplification.
  • the amplified nucleic acids identified as new or identically functional nucleic acid species are identified in the order of samples containing nucleic acid species with high concentrations before amplification, or as newly or identically functional nucleic acid species.
  • Step 4 is performed in the order of the samples containing a large number of amplified nucleic acid species.
  • Primer probes that can be suitably used in the PCR method of the present invention are as follows, for example.
  • Fluorescent substance whose fluorescence intensity changes when hybridized to the complementary base sequence of the target nucleic acid
  • Any type of probe can be used as long as it is a quality-labeled nucleic acid probe and can be used as a primer for PCR.
  • a consensus primer probe is suitable. Therefore, in the present invention, they are also referred to as consensus primer probes and consensus probes.
  • this probe can amplify many genes if the consensus base sequence is a promoter region.
  • the nucleotide sequence has a consensus or is common to the nucleotide sequence encoding the S protein of the probe, all the genes having the same function can be amplified.
  • primer probe examples include an oligonucleotide force, a free OH group at the 3-position of the terminal ribose or deoxyribose, and a phase of the target nucleic acid.
  • This is a fluorescent substance-labeled primer probe formed from an oligonucleotide containing a base sequence that hybridizes to a capture base sequence, and having the property of changing an optical character by hybridizing to a complementary base sequence.
  • the S primer probe one labeled with a fluorescent substance and / or a quencher substance, preferably an interaction between the fluorescent substances, preferably between the fluorescent substances, or between the fluorescent substance and G (Guayun) ), which are labeled with a fluorescent substance and Z or quencher, which interact with each other.
  • the Q probe KURATA et al., Ucleic acids Research, 2001, vol. 29, o. 6 e34
  • the optical character change is a fluorescence quenching phenomenon
  • the optical character change increases the fluorescence emission
  • Ucleic acid Research, 1292-1305 page, vol. 30, o. 6, 2002 azarenko et al., Ucleic acids Res., 25, 2516-2521, 1997.
  • a preferred example can be mentioned.
  • the present invention is not limited to this example.
  • the PCR method using the Q probe is called QP-PCR. Quenching primer or label means probe.
  • the preferred form of the Q probe has at least the following characteristics.
  • the whole primer probe may hybridize with the target nucleic acid. It is used as a primer for PCR by the hybridization.
  • the base sequence at the 5 ′ terminal site hybridizes with or does not hybridize with the complementary base sequence, and contains the base sequence.
  • the labeling position of the fluorescent substance may be either the sugar moiety on the fifth side and / or its phosphate moiety or base moiety.
  • the site is not necessarily the terminal or the site as long as it is on the 5 'side. Preferably it is the 5 'end.
  • a probe having a basic force C (cytosine) at the labeling site is desirable.
  • C basic force
  • the Q probe and the target nucleic acid hybridize they are separated from the base of the target nucleic acid complementary to the labeled base by 1 to 3 bases (the base of the target nucleic acid complementary to the labeled base is 1
  • G guanine
  • a G base may be present.
  • the C need not hybridize to the target nucleic acid in the sample. This is because G complementary to the C is synthesized during the nucleic acid amplification reaction.
  • An arbitrary base sequence may be interposed between C and the hybridizing base sequence.
  • the intervening base sequence has the number of bases;! To 30, preferably 1 to 20.
  • the nucleotide sequence may be any, but Suitably contains C.
  • the fluorescence intensity can be reduced by the above phenomenon when hybridized with the PCR amplification product. The decrease is proportional to the concentration of the corresponding nucleic acid.
  • the sunrise probe consists of a single-stranded oligonucleotide whose terminal or terminal site (preferably at the 5 'end) is a single fluorescent substance, and which itself emits fluorescence in another region (in the chain).
  • a quencher substance and an acceptor fluorescent substance (in this case, the terminal or the fluorescent substance at the terminal part is called a donor fluorescent substance)
  • a donor fluorescent substance is generally labeled.
  • the nucleic acid is not hybridized to the corresponding nucleic acid, a stem-loop structure is formed between the labeled bases due to the homology of the base sequence in the probe molecule. Due to the formation of the structure, the fluorescent substance and the quencher substance are arranged at positions close to each other.
  • the FRET phenomenon occurs, and the fluorescence emission of the fluorescent substance is suppressed.
  • the probe hybridizes to the corresponding nucleic acid, the stem 'loop structure is broken. Then, the FRET phenomenon is eliminated and the fluorescence emission of the light substance increases.
  • the concentration of the corresponding nucleic acid is proportional to the increase in the fluorescence intensity of the fluorescent substance in the measurement system.
  • a PCR method using the probe is called a sunrise PCR method.
  • the probe is designed so that at least the base sequence at the 3′-terminal site hybridizes to the target nucleic acid, and the 3′-terminal OH group of the 3′-terminal ribose or deoxyribose is free.
  • the whole primer probe may hybridize with the target nucleic acid. It is used as a primer for PCR by the hybridization.
  • part or all of the nucleotide sequence hybridizes to the complementary nucleotide sequence of the target nucleic acid.
  • any nucleotide sequence may be used as long as it contains a nucleotide sequence that hybridizes to a part or all of a consensus nucleotide sequence recognized by a group of known nucleic acid species having the same function.
  • the concentration of the primer probe used is not particularly limited since various concentrations are changed depending on the purpose, that is, the concentration of the nucleic acid contained in the sample.
  • concentration of the nucleic acid contained in the sample 0.01-1. 01 ⁇ , preferably 0.1-1.
  • the target nucleic acid to be amplified is labeled with a fluorescent substance.
  • the primer probe of the present invention can be prepared by a conventionally known method.
  • Species of primer probe oligonucleotides are suitable for use with commercially available nucleic acid synthesizers (lane; tJ, ABI394 (Perkin Elmer, USA)).
  • any of the conventionally known labeling methods can be used (Applied and
  • n 3 to 8, preferably 6.
  • a labeled oligonucleotide can be synthesized by binding the labeling substance having SH group reactivity or a derivative thereof to the spacer.
  • the oligonucleotide labeled with the labeling substance thus synthesized can be purified by reverse phase chromatography or the like to obtain the target nucleic acid primer and nucleic acid probe of the present invention.
  • the 3 ′ terminal base of the oligonucleotide can be labeled.
  • a phosphate group is introduced, and for example,-(CH 2 ) n -SH is introduced as a spacer to the OH group of the phosphate group.
  • n is 3-8, preferably 4-7.
  • a labeled oligonucleotide can be synthesized by binding the above-mentioned labeling substance having a reactivity to an amino group or SH group or a derivative thereof to the spacer.
  • bases in the oligonucleotide strand can be labeled.
  • the amino group or the ⁇ H group of the base is labeled with the labeling substance of the present invention in the same manner as in the method of the 5 'or 3' end (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, pp. 32-38 (1998)).
  • kit reagents for example, Unilink
  • the labeling substance molecule can be bound to the oligoliponucleotide according to a conventional method.
  • the oligonucleotide synthesized in this manner can be purified by chromatography such as reverse phase or the like to obtain the target nucleic acid primer probe of the present invention.
  • a nucleic acid amplification method particularly a PCR method, or a real-time quantitative PCR method using the above-described primer probe, and a data analysis method for determining the concentration or copy number of an amplified nucleic acid before amplification at the same time as nucleic acid amplification.
  • the annealing reaction, nucleic acid extension reaction, and nucleic acid denaturation reaction of a primer probe (forward type, riverse type) with a target nucleic acid are defined as one cycle, and by repeating this cycle, nucleic acid amplification is performed.
  • This is a method for real-time monitoring (measurement) of changes in the optical character of a PCR reaction system in a state in which the amplified nucleic acid is denatured and in a state of a primer-nucleic acid complex at at least one measurement wavelength. Then, it is a method of determining the concentration of the target nucleic acid before amplification of the curve force of the change rate of the fluorescence intensity obtained by measuring at least one measurement wavelength.
  • the purpose of the PCR reaction is achieved by performing the reaction up to a cycle in which the nucleic acid is amplified exponentially and then examined. Known reaction conditions may be used. Specific examples are shown in the examples. In the above-mentioned PCR method, the actual measurement is carried out using a measurement 'data analyzer (which naturally includes a device equipped with an electronic recording medium recording the procedures of those methods).
  • the actual measurement of the real-time quantitative PCR method used in the present invention and the method of analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method may be performed by a known method.
  • the method of KURATA et al. KURATA et al., Ucleic Acids
  • the real-time quantitative PCR method currently consists of a reaction device that performs PCR, a device that detects changes in the optical character of a fluorescent substance at at least one measurement wavelength, and a user interface, that is, a program for each step of the data analysis method. And the record that recorded it A computer-readable recording medium ( ⁇ 1 J: Sequence Detection Software System) and a computer configured to control them and analyze data. These devices are measured in real time using at least one measurement wavelength. I have. Therefore, the measurement of the present invention is also performed by such an apparatus.
  • the device used in the present invention may be any device that can monitor PCR in real time using at least one measurement wavelength.
  • ABI PRISM TM 7700 base distribution system detection system (Sequence detection system SDS 7700) (Perkin 'Elmer 1 to Applied' Bio-systems, Inc. (Per kin Elmer Applied Biosytems, Inc., USA)
  • light cycler one TM system (Roche die ⁇ Diagnostics sticks stock company, Germany ) Etc. can be mentioned as particularly suitable.
  • the above-mentioned PCR reaction apparatus is an apparatus that repeatedly performs a thermal denaturation reaction, an annealing reaction, and a nucleic acid extension reaction of a target nucleic acid (for example, it can be repeatedly performed at a temperature of 95 ° C, 60 ° C, or 72 ° C).
  • the detection system is equipped with an argon laser for fluorescence excitation, a spectrograph, a CCD camera, and at least one fluorescence measurement channel.
  • a computer-readable recording medium in which each procedure of the data analysis method is programmed and recorded is used by being installed in a computer, controlling the above system via the computer, and outputting from the detection system. It records a program that analyzes and processes the data obtained.
  • the data analysis program recorded on the computer-readable recording medium is a process for measuring the fluorescence intensity at each cycle, and the measured fluorescence intensity is displayed on a computer display as a function of the cycle, that is, as an amplification plot of PCR.
  • the process shown above the process of calculating the PCR cycle number (threshold cycle number: Ct) at which the fluorescence intensity starts to be detected, the process of creating a calibration curve for determining the copy number of the sample nucleic acid from the Ct value, the data of each of the above processes, The process of printing the plot values, the color!
  • the first characteristic is that the nucleic acid to be analyzed in each cycle corresponds to the nucleic acid obtained in the real-time quantitative PCR method, and the amplified nucleic acid in each cycle is compared with a method of analyzing data obtained at each measurement wavelength
  • the primer probe is hybridized to the primer probe (which specifically hybridizes)
  • the fluorescence intensity value of the fluorescent substance obtained by labeling the primer probe is determined by the hybridization between the primer probe and the nucleic acid in each cycle (ie, , A primer-nucleic acid complex) is dissociated, and is an arithmetic processing step of correcting with the fluorescence intensity value of the fluorescent substance, that is, a correction arithmetic processing step.
  • the fluorescence intensity value of the fluorescent substance that has labeled the primer probe when the nucleic acid that has been amplified is hybridized to the primer probe corresponding to (specifically hybridizes to) the nucleic acid” For example, 40 to 85 ° C, preferably 50 to 80 in each cycle of PCR.
  • 0 means a reaction system in which the reaction is completed. The actual temperature depends on the length of the amplified nucleic acid.
  • the “fluorescence intensity value of the fluorescent substance when the primer-nucleic acid complex is dissociated” refers to a reaction system for heat denaturation of nucleic acid in each cycle of PCR, specifically, a reaction temperature of 90 to: ° C, preferably 94-96 ° C, and the fluorescence intensity value of the reaction system when measured at the measurement wavelength related to the fluorescent substance of the primer probe in the reaction system in which the reaction is completed (hereinafter, referred to as The same is true.)
  • any process can be used as long as it meets the object of the present invention, but specifically, the following [Equation 1] or the female formula 2]
  • a process including the following process can be exemplified.
  • the second feature is that, in each cycle, [Equation 1] or [Layer] substitutes the corrected calculation processing value by [Equation 2] into the following [Equation 3] or [Equation 4], and changes the fluorescence between each sample.
  • This is a data analysis method that calculates the amount (fluorescence change rate or fluorescence change rate) and compares them.
  • f a Force calculated by (Equation 1) or (Equation 2), force of any number of cycles before change in f n is observed Normally, for example, 10 to 40 cycles Preferably, 15 to 30 cycles, more preferably 20 to 30 cycles are employed. ]
  • the third feature is
  • A, b arbitrary numerical values, preferably integer values, more preferably natural numbers.
  • F n Fluorescence change amount in n cycles calculated by (Equation 3) or (Equation 4) (Fluorescence change Conversion ratio or fluorescence conversion ratio)].
  • reaction system for measuring the standard nucleic acid and the reaction system for measuring the target nucleic acid may be used together or separately.
  • the data analysis method is particularly effective when the real-time quantitative PCR method is used to measure the amount of decrease in the emission of a fluorescent substance.
  • a fourth feature is a method for analyzing the temperature dissociation curve (melting curve) of the amplified nucleic acid of the present invention, and a method for analyzing data obtained by a method for obtaining the Tm value of the nucleic acid by performing the PCR method of the present invention. It is.
  • the temperature is gradually increased (for example, from 50 ° C to 95 ° C) until the nucleic acid is completely denatured at a low temperature.
  • Measuring the fluorescence intensity of at least one measurement wavelength at a short time interval e.g., an interval corresponding to a temperature rise of 0.2 ° C to 0.5 ° C
  • the process of displaying the measurement result of wavelength on the display as a function of time that is, the process of displaying the melting curve of nucleic acid, the differentiation of this melting curve and the differential value (one dFZdT, F: fluorescence intensity, T: time ),
  • the process of displaying the value on the display as a derivative, and the process of finding the inflection point of the derivative force is provided.
  • the fluorescence intensity increases with each increase in temperature.
  • a process of performing a calculation process of dividing the fluorescence intensity value at the time of the nucleic acid extension reaction in each cycle, preferably at the end of the PCR reaction by using the fluorescence intensity value at the time of the thermal denaturation reaction More favorable results are obtained.
  • the temperature dissociation curve of the amplified nucleic acid of the first invention can be measured.
  • the base sequence is designed based on the data of the result of the partial base sequence decoding, and a currently known method is used. Can be prepared.
  • “Anchored PCR method” refers to the use of an antisense primer probe and / or a sense primer probe and a sense adapter primer probe and / or an antisense adapter primer probe as shown in FIG. This is a PCR method for nucleic acid amplification (Experimental Medicine, Vol. 15, No. 7, pp. 52-59, 1997).
  • linker 1 and linker 1 2 refers to an oligonucleotide pair having a region where two oligonucleotide chains are hybridized and each other has a hybridized region and a non-hybridized region. .
  • linker 11 one is referred to as linker 11 and the other as linker 12.
  • Anchor Used in the PCR method also called anchor (see Fig. 1).
  • the base sequence may be arbitrary.
  • an “antisense primer probe” is a single type of a single-stranded oligonucleotide probe.
  • a nucleic acid for example, in the case of DNA
  • a sense strand a nucleic acid (for example, in the case of DNA) base sequence having genetic information
  • an antisense strand is a primer probe that contains at least a base sequence that hybridizes to the antisense strand (ie, contains a part or all of the base sequence of the sense strand) (see FIG. 1).
  • the meaning of “at least” means that the signal may be hybridized over a part of the linker region in addition to the antisense strand.
  • the “sense primer probe” refers to a primer probe that hybridizes to the sense strand in the opposite direction to the antisense primer probe (see FIG. 1).
  • sense adapter primer probe or “antisense adapter primer probe” means that the nucleotide sequence of the probe is at least the nucleotide sequence of the linker, especially the non-acceptable region (where linker 11 and linker 12 It contains a base sequence that does not hybridize (see Figure 1).
  • bases that hybridize to the base sequence portion of the nucleic acid contained in the sample May contain an array.
  • An antisense primer probe or a sense primer probe hybridizes to an extended nucleic acid that has been extended and synthesized, and becomes a primer for a PCR reaction.
  • the meaning of “at least” means that the base sequence may have a base sequence region that extends beyond the non-complementary region.
  • the sense adapter primer probe contains a non-complementary nucleotide sequence of the linker on the sense strand of the target nucleic acid.
  • the antisense adapter primer probe contains the non-complementary nucleotide sequence of the linker on the antisense strand.
  • the relationship between the antisense or sense primer probe and the sense or antisense adapter primer profile is that one is a forward primer and the other is a reverse primer.
  • the sense adapter primer probe and the antisense adapter primer probe may be common (identical). The ones shown in Figure 1 are common (identical).
  • a nucleic acid obtaining method characterized by at least the following procedures (see Fig. 1): 1) At least one kind of restriction enzyme treatment is performed on a sample containing at least one kind of nucleic acid. .
  • the restriction enzyme treatment may be performed in the same manner as in the method described in the section of polymorphism analysis of the first invention.
  • the reaction for example, in the case of Accl, it is preferable to inactivate the restriction enzyme by heating at 65 ° C for 30 minutes. Care must be taken because the inactivation temperature and time vary depending on the restriction enzyme.
  • the treated product is, for example, spin column (MicroconPCR) (Millipore
  • linker 11 and linker 12 At least one pair of linkers (hereinafter, referred to as linker 11 and linker 12) is added to the restriction enzyme-treated product of (1), and a ligation reaction is performed.
  • the ligation reaction of the present invention can be carried out by a conventional known method such as blunt-end ligation and TA binding reaction (Experimental Medicine, pp. 12-19, Vol. 15, No. 7, 1997, sheep It is not particularly limited as long as it is performed at an earthworks company.
  • the ligation reaction format depends on, for example, the structure of the terminal end of the nucleic acid fragment generated by the restriction enzyme treatment. If the 5 'end of the nucleic acid fragment is phosphorylated, there is no linker Processing is fine.
  • the 5 'end of the linker may be phosphorylated with a kit reagent, and the nucleic acid fragment may be treated with phosphatase.
  • kit reagents Experimental Medicine, pp. 12-19, Vol. 15, No. 7, 1997, Yodosha).
  • Hirakatadaira's Blu-Daiichi Blunting kit (TAKARA BIO INC.), Ligation reaction DNA Ligation Kit Ver. 2 (TAKARA BIO INC.), 5, phosphorylation
  • MEGALABEL TM (TAKARA BIO INC.) And the like.
  • T-Vector Kits Novagen, TA Cloning Kits (Invitrogen), PGEM-T Vector System (Promega), etc. Specific procedures, reaction conditions, etc. are attached to the kit reagents. If you follow the protocol.
  • the reaction may or may not be purified.
  • purification it is convenient to use the above-mentioned spin column.
  • the purified product is preferably dried and dissolved in a small amount of sterile water to increase the concentration of the ligated nucleic acid. Transfer this DNA to the next anchor PC
  • At least one antisense primer probe is added to A, and a nucleic acid extension reaction is performed.
  • a nucleic acid extension reaction is performed by adding at least one kind of anti-adapter primer probe to A or the reaction product of (a).
  • Reaction conditions may be the same as the above PCR reaction conditions.
  • the concentration of the antisense primer / probe added is 0.0 :! ⁇ S imol / L, preferably 0.1-0.5 tmolZL, and the concentration of the adapter probe added is 0.101-2 molZL, preferably 0.1-0.5 ⁇ mol / L. is there.
  • the nucleic acid extension reaction time is:! To 1800 sec, preferably 10 to 400 sec.
  • polymerases such as DNA and RNA, those similar to those described in the PCR can be used.
  • the working concentration is 0.01-:! OuZ reaction solution (20 ⁇ l), preferably 0 :! 33 u / reaction solution (20 ⁇ l).
  • Reaction temperature The degree may be the same as the PGR reaction described above. For example, it is 40 to 85 ° C, preferably 50 to 80 ° C.
  • Reaction temperature The degree may be the same as the PGR reaction described above. For example, it is 40 to 85 ° C, preferably 50 to 80 ° C.
  • At least one kind of sense primer probe is added to B, and a nucleic acid extension reaction is performed.
  • At least one kind of sense adapter primer probe is added to B or the reaction product of the above (c) to perform a nucleic acid extension reaction.
  • Reaction conditions may be the same as described above.
  • the antisense primer probe and the sense primer probe it is preferable to use a probe labeled with at least one of the aforementioned violet substances. This is because the reaction product can be confirmed by performing a dissociation curve analysis of the reaction product. Then, the labeling position of the fluorescent substance is preferably a base on the 5 ′ side of the oligonucleotide. In that case, it is preferable that the amino group is C amino group or OH group. Among these, it is particularly preferable to use the above-mentioned Q probe type.
  • the nucleic acid extension reaction is performed using a plurality of kinds of fluorescent substance-labeled antisense primer probes and a plurality of kinds of anti-adapter primer probes.
  • the nucleic acid extension reaction may be performed using a plurality of types of fluorescent substance-labeled sense primer probes and a plurality of types of sense adapter primer probes.
  • the plurality of types of sense primer probes and antisense primer probes each have a different base sequence and are at least one type labeled with a fluorescent substance giving a different fluorescent emission color.
  • a plurality of at least one antisense primer probe and at least one Z or at least one sense primer probe labeled with at least one fluorescent substance, and the plurality of fluorescent substance labeled probes are different from each other.
  • a method for obtaining a nucleic acid using at least one fluorescent substance-labeled antisense primer probe and a Z or at least one sense primer probe, which has a base sequence and is labeled with a fluorescent substance giving a different fluorescent emission color. is there.
  • a plurality of types of useful nucleic acids (target genes) can be obtained.
  • the final reaction product of step 3), which proceeds to step 4) may be purified by various electrophoresis methods or various HPLC methods. Further, the object of the present invention can be sufficiently achieved even with the final reaction solution itself.
  • the PCR product of step 4) of the second invention may be subsequently separated by electrophoresis as described above. Then, the useful nucleic acid (target gene) is separated from the linker with a restriction enzyme, whereby the useful nucleic acid can be separated. It is preferred that the linker be cut off with a restriction enzyme before electrophoresis before separation by electrophoresis.
  • the size of the target base sequence portion in the target nucleic acid that is, the size of the target nucleic acid (target gene) is determined and obtained by the series of procedures of the second invention.
  • the expression amount and Z or expression product of the nucleic acid (gene) separated as described above are examined in the same manner as in the first invention.
  • the sample containing at least one nucleic acid of the second invention is at least one of the following:
  • the final product according to the first invention that is, the final reaction solution (product), or a product that is separated and purified (for example, separated and purified by various electrophoresis methods and various HPLC methods). That is, a nucleic acid identified as a new or the same functional nucleic acid species in the first invention or a nucleic acid containing the same.
  • the invention that has been treated with the restriction enzyme of the second invention is the invention that uses the restriction enzyme treatment for polymorphism analysis in the first invention.
  • the invention uses the information obtained in the first invention.
  • the novel useful nucleic acid thus obtained is preferably ligated to a vector by blunt-end cloning, TA cloning, cloning using a restriction enzyme, or the like to prepare a clone library. It is also preferable to use a novel useful nucleic acid linked to a vector to transform an appropriate expression cell (for example, Escherichia coli, yeast, etc.) and to test the actual expression. This is because even a nucleic acid recognized as a single nucleic acid by the electrophoresis method is not necessarily substantially single. Thus, the separated and obtained nucleic acid finally becomes a new useful nucleic acid.
  • the useful nucleic acid (target gene) present in one system in nature can be simply and quickly detected, and the concentration thereof can be determined.
  • Stool Quickly isolates a new useful nucleic acid (target gene). From the data of this examination result, the entire base sequence of the novel useful nucleic acid (gene) is determined, and it is clear that the nucleic acid is a novel useful nucleic acid (gene). Then, a novel useful gene is obtained. Since the data thus obtained is recognized as any polymorphic nucleic acid, it is very useful for modifying the genetically engineered base sequence of the next gene.
  • the fourth invention is a fluorescent substance-labeled primer probe. That is, it is a primer probe that can simply and quickly detect and measure the useful nucleic acid (target gene) existing in one system in nature, know its concentration, and separate the useful nucleic acid (target gene).
  • 3′-terminal ribose or deoxylipose 3′-OH group power Oligonucleotide containing S-free and complementary base sequence that hybridizes to the complementary base sequence formed and hybridizes to the complementary base sequence to form an optical character Is a phosphor-labeled primer having the property of changing. And it is a fluorescent substance labeling primer comprising at least one of the following.
  • the 5 'end is C (cytosine).
  • C may or may not hybridize to the complementary base sequence of the target nucleic acid. Good.
  • the base sequence does not hybridize with the complementary base sequence of the target nucleic acid or hybridizes with the complementary base sequence of the target nucleic acid between the complementary base sequence that hybridizes with C and does not hybridize with the base sequence of the target nucleic acid.
  • Arbitrary base sequence intervenes.
  • the intervening base sequence has 1 to 20 bases.
  • a fluorescent substance-labeled primer comprising at least one of the following.
  • the terminal is C (cytosine).
  • the intervening base sequence has the number of bases
  • any base sequence portion that does not hybridize to the target nucleic acid may have a hairpin structure.
  • nucleotide sequences of the consensus primer probes, linker-1, linker-1, target gene-specific antisense primer probe, target gene-specific sense primer probe, and adapter primer probe used in this example are as follows.
  • the base sequence is 5 'on the right and 3 on the left.
  • Consensus primer probe 1 forward type (consensus system IJ underlined, 5, terminal phosphate group is labeled with BODIPY FLC6):
  • GGTTACCTTGTTACGACTT Consensus primer probe 1 and consensus primer probe 2 are primers targeting a highly conserved region of the eukaryotic 16S rRNA gene, and are capable of PCR-amplifying all the eukaryotic 16S rRNA gene.
  • Linker 1 (the underlined portion does not hybridize to one of the oligonucleotides, sequence):
  • Linker 2 (a sequence in which the underlined portion does not hybridize to one of the oligonucleotides):
  • Antisense primer probe that specifically hybridizes to the target gene (the underline hybridizes to the nucleotide sequence of the antisense strand of the nucleic acid contained in the sample, and the phosphate group at the 5 'end is labeled with BODIPY FLC6 ):
  • a sense primer probe that specifically hybridizes to the target gene (the underlined portion is hybridized to the base sequence of the sense strand of the nucleic acid contained in the sample, and is labeled with the 5'-terminal phosphate group S BODIPY FLC6). ):
  • the sense primer probe and antisense primer probe are primers specific to the 16S rRNA gene of Escherichia coli used as model target genes.
  • Adapter primer probe (The underlined part will hybridize to the nucleic acid synthesized during the gene amplification process.
  • the phosphate group at the 5 'end is labeled with BODIPY FLC6.):
  • the adapter primer probe has the same sequence as the non-extrapolative region of the linker (the region where the linkers 1 and 2 have hybridized to each other). Therefore, it hybridizes to the base sequence of the amplified nucleic acid extended from the sense primer probe or antisense primer probe, and becomes a primer for the subsequent PCR reaction.
  • Figure 1 shows the state when the linker has been ligated to the restriction enzyme fragment site containing the target gene (16S rRNA gene of Escherichia coli). Shown.
  • the model target gene (Escherichia coli 16S rRNA gene) in the type III sample was quantified, and the ability to identify a sample containing a large amount of the target gene (Escherichia coli 16S rRNA gene) was verified.
  • samples were prepared by adding Escherichia coli genomic DNA at varying concentrations to DNA samples extracted from activated sludge, and nucleic acid amplification and quantification of the samples were performed by a real-time quantitative PCR method.
  • a gas test was performed which enabled identification of a sample containing a large amount of the target gene (Escherichia coli 16S rRNA gene).
  • Activated sludge which is known to contain almost no Escherichia coli, collected from food wastewater treatment equipment was used as a sample.
  • Type I DNA containing the model target gene Esscherichia coli 16S rRNA gene
  • Escherichia coli genomic DNA was Escherichia coli genomic DNA (Takara Shuzo).
  • the nucleic acid was extracted from the activated sludge using a BiolOl kit (for soil), and further purified using a Wizard DNA Clean-Up system. Next, the absorbance at 260 nm / 280 nm, and the DNA concentration were measured. The extracted DNA was a 120: ⁇ / 1-extract. And the extracted DN A known concentration of E. coli genomic DNA (10 5, 10 s, 10 7 copies E. coli genomic DNA equivalent) added and the ⁇ sample.
  • QP-PCR method As a real-time quantitative PCR method, a method (hereinafter, referred to as QP-PCR method) using Quenching primers (consensus probes 1 and 2 composed of a Q probe) was applied.
  • Denaturation reaction 95 ° C, 15 sec; Annealing: 53 ° C, 5 sec; extension and detection: 72 ° C, SOsec; Measurement device: Light cycler system (manufactured by Roche) (hereinafter referred to as “light cycler” for convenience); Fluorescence detection channel used: Channel 1 (Ex, 470 nm; Em,
  • Reaction solution total volume 20 ⁇ 1; rTaq polymerase (Takara Shuzo), 0.5 U reaction (20 ⁇ l); XlObuffer attached to rTaq polymerase, 2.0 ⁇ l / reaction (20 ⁇ l); dNTPs final concentration, each 2 mM; Mg ++ ion concentration, final concentration 2 mM; bovine serum albumin (BSA), final concentration 0.25 mg / ml; activated sludge extracted DNA, ⁇ . ⁇ 1 / reaction (20 ⁇ 1); E. coli genomic DNA, ⁇ . ⁇ 1 reaction (20 ⁇ l); final concentration of each primer probe (consensus primers 1 and 2), 100 nM; Taq start solution (Clontech, 0.4 ⁇ 1 / reaction (201)).
  • Quantification of all 16S rRNA genes contained in the samples was performed by QP-PCR.
  • Table 1 shows the results of quantification of all 16S rRNA genes in the sample by QP-PCR.
  • a dissociation curve of the obtained amplification product was prepared.
  • the instrument used a light cycler system, and the temperature was changed from 0.1 to 60 ° C at 0.1 ° C / sec, during which the fluorescence was continuously measured. Since the product obtained by the QP-PCR method has BODIPY FL modification at the terminal C base, the amount of fluorescence increases as the product dissociates and becomes single-stranded. Therefore, it was possible to easily obtain a dissociation curve of the amplification product.
  • FIG. 3 shows a dissociation peak obtained by differentiating the dissociation curve of FIG.
  • the dissociation peak is obtained by differentiating the dissociation curve. Therefore, the approximate Tm value can be obtained from the position of this peak apex.
  • the dissociation peak was detected at around 85 ° C.
  • An amplification product having the same fragment length as the target amplification product was confirmed by electrophoresis (Data not shown), and it was confirmed that the amplification product having a dissociation peak near 85 ° C was a specific product Was done.
  • the dissociation peak of the product obtained in Sample No. 1 was around 75 ° C. From this, it was confirmed that the product obtained in Sample No. 1 was a non-specific amplification product. This non-specific amplification product was presumed to be a primer dimer with its Tm value.
  • the dissociation curve of the obtained product can be easily prepared, it is possible to quickly determine whether the amplification product is specific or not. is there.
  • composition ratio of each gene is determined from the peak height ratio, and this composition ratio is multiplied by the total 16S rRNA gene amount quantified in the QP-PCR method step to obtain the copy number of each gene (polymorphism). Was calculated.
  • Example 1 sample No. 5 capable of amplifying the target gene to be a priority species in terms of concentration, activated sludge extracted DNA (60 ng Z At 1) and 0.24 pg Z 1 E. coli genomic DNA (about 100 An attempt was made to screen a target nucleic acid (Escherichia coli 16S rRNA gene) from a sample (sample No. 8) obtained by mixing equal amounts of E. coli. If an unknown sample such as a natural environment sample is the target sample, cloning and sequencing are performed on the amplified products of all identically functional genes obtained by the QP-PCR method, and a new gene (polymorphism) sequence is determined. Then, in order to perform the anchor PCR method, it is necessary to prepare an antisense primer probe and a sense primer probe specific to a novel gene.
  • activated sludge extracted DNA 60 ng Z At 1
  • 0.24 pg Z 1 E. coli genomic DNA about 100
  • the Escherichia coli 16S rRNA gene was assumed to be an unknown gene (target gene), and the study was carried out. Therefore, the steps of closing and sequencing were omitted.
  • the antisense primer probe and the sense primer probe specific to Escherichia coli were designed based on Escherichia coli 16S rRNA gene sequence information known in advance.
  • the restriction enzyme fragment was bound to the linker by the following method. First, add Linker 1 and Linker 1 to 1.5 ⁇ M and 1.M, respectively, and bind them beforehand.After that, add all of the sample No. 5 and Sample No. 8 treated restriction enzyme treated sump noles. Was. 1.5 units of 4 DNA ligase was added to this solution, and a ligation reaction was performed at 16 ° C for 24 hours. The ligated sample was purified by a spin column (MicroconPCR). The purified DNA solution was dried and dissolved with 101 of sterile water. This DNA solution was used as type I DNA for anchor QP-PCR performed in the following steps.
  • the reactant was split into two, one as A and the other as B.
  • the nucleotide sequence of the product obtained in 7) was decoded by a direct sequence using the dye terminator method (Experimental Medicine, Volume 15, pages 29 to 35, 1997, Youtosha).
  • the sequence primer is Consensus Primer Probe 2
  • Sequencer used ABI PRISM TM 310.
  • the target gene was E. coli 16S rRNA gene and 100% The base sequences matched. From the above results, it was suggested that the target gene could be easily and rapidly obtained by PCR reaction between the products obtained by the two anchor QP-PCR and the anchor QP-PCR.
  • the method of the present invention requires that (1) amplification and quantification of all identically functional nucleic acid (gene) species can be performed. (2) It was suggested that simultaneous quantification of polymorphism of each nucleic acid (gene) constituting the same functional nucleic acid (gene) was possible.
  • polymorphism analysis T-RFLP
  • T-RFLP polymorphism analysis
  • novel nucleic acid (gene) polymorphisms obtained in the process of real-time quantitative PCR, the partial sequence of the novel nucleic acid (gene) polymorphism is decoded, and this information is obtained. Based on this, it is possible to create primers specific to polymorphisms of novel nucleic acids (genes).
  • target nucleic acids (genes) can be directly and selectively separated from the specified sample by anchor QP-PCR using a specific primer.
  • target nucleic acids (genes) can be directly and selectively separated from the specified sample by anchor QP-PCR using a specific primer.
  • it was not possible to separate target nucleic acids (genes) from samples with low abundance of target nucleic acids (genes) it was important to identify Sex was suggested.

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Abstract

自然界の一系内に存在する全核酸の中から複数の同一機能を有する有用核酸群を同時に、迅速且つ簡便に、且つ高感度で検出・測定し、次いでそれらから新規な有用核酸のみを選択的に迅速且つ容易に取得できる、既知の同一機能を有する核酸種にコンサンセス（consensus）な塩基配列を用いて、系内の核酸を増幅し、増幅された核酸の中から新規又は同一機能核酸種を検索し、又はそれらの中から新規有用核酸（遺伝子を含む。）を取得する方法である。

Description

明細書
' 核酸若しくは遺伝子の新規取得方法 技術分野
本発明は、自然界の一系内に存在する新規有用核酸若しくは遺伝子の検索方法 及び取得方法に関する。詳しくは、既知の同一機能を有する核酸種にコンサンセス (consensus)な塩基配列を用いて、系内の核酸を増幅し、増幅された核酸の中から 新規又は同一機能核酸種を検索し、又はそれらの中から新規有用核酸 (遺伝子を含 む。）を取得する方法に関する。 背景技術
自然界の一系内に存在する全核酸の中から複数の有用核酸を検出'測定し、複数 の有用な核酸を取得するシステマチックな方法としては、現在、ダイバーサ社が使用し ている技術があるが (米国特許第 6, 054, 267号明細書、米国特許第 5, 763, 239号 明細書、米国特許第 6, 001, 574号明細書、米国特許第 6， 171， 820号明細書、米 国特許第 5， 965, 408号明細書、米国特許第 6， 168, 919号明細書、米国特許第 6, 174， 673号明細書参照）、有用遺伝子を優先種として含む試料を特定できないので、 有用遺伝子を検出し分離する技術には課題が多レ、。 発明の開示
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、自然界の一系内に存在する全核酸の中から 複数の同一機能を有する有用核酸群を同時に、迅速且つ簡便に、且つ高感度で検 出 ·測定し、次！/ヽでそれらカゝら新規な有用核酸のみを選択的に迅速且つ容易に取得で きる方法を提供することで る。
本発明者らは鋭意検討した結果、蛍光物質、クェンチヤ一物質等の物質で標識され、 且つ既知核酸にコンセンサスな塩基配列を有する核酸プローブを用いて、核酸増幅を 行い、増幅前の核酸濃度又はコピ 数の測定、増幅産物の温度解離曲線の解析、多 型分析、塩基配列解析、アンカー PCR方法等を組合せることにより上記課題が解決で きることを知見した。本発明は力かる知見に基づいて完成されたものである。
即ち、本発明は、
1.少なくとも次の手順からなることを特徴とする核酸の取得方法： ，
1)少なくとも 1種の核酸を含む試料について、核酸増幅方法により少なくとも 1種の核 酸にっレ、て核酸増幅反応を行レ、、核酸増幅を確認する。
2)少なくとも次の（1)〜（3)の何れか 1項の手順の操作を行レヽ、増幅核酸中の濃度的 優先核酸種、又は新規若しくは同一機能核酸種を特定する。
(1)増幅核酸について、電気泳動、 HPLC、及び Z又はシークェンサ一分析を行う。 (2)増幅核酸にっレヽて温度解離曲線 (Tm値)を測定する。
(3)増幅核酸にっレ、て多型解析を行う。
3)前記 2)で、濃度的優先核酸種、又は新規若しくは同一機能核酸種と特定された增 幅核酸種にっレヽて、塩基配列を解読 ·決定し、新規若しくは同一機能核酸種と特定さ れた増幅核酸種の中から新規若しくは同一機能核酸種を特定する。
4)前記 3)カゝら得られる塩基配列情報に基づいて、増幅核酸種の中から新規若しくは 同一機能核酸種を確認する。
5)前記 4)カゝら得られる塩基配列情報に基づ！/ヽて、新規若しくは同一機能核酸種に特 異的なプライマープローブを設計する。
6)前記 5)で設計されたプライマープローブを用レ、る核酸増幅方法により、前記 1)に記 載の核酸を含む試料について、新規若しくは同一機能核酸種の増幅を行う。
7)前記 6)の増幅核酸について、新規若しくは同一機能核酸種の一部の塩基配列又は 全長の塩基配列を少なくとも含む核酸種を取得する。又、
2.少なくとも次の手順からなることを特徴とする核酸の取得方法：
1 )少なくとも 1種の核酸を含む試料にっレ、て、制限酵素処理を行う。
2)少なくとも 1種のリンカ一対 (以下、リンカ一 1、リンカ一 2という。）を前記 1)の制限酵 素処理物に添加し、ライゲーシヨン (ligation)反応を行う。 3)前記 2)に記載の反応 物を二つに分け (一方を Aとし、他方を Bとする。）、次の反応を行う。
(1) Aについて、次の（a)及び (b)の反応を同時又は逐次的に行う： (a)少なくとも 1種のアンチセンスプライマープローブを、 Aに添加し、核酸伸長反応を 行う。
(b)少なくとも 1種のアンチセンスアダプタープライマープローブを、 A又は前記 (a)の 反応物に添加して、核酸伸長反応を行う。
(2) Bについて、次の（c)及ぴ (d)の反応を同時又は逐次的に行う：
(c)少なくとも 1種のセンスプライマープローブを、 Bに添加し、核酸伸長反応を行う。
(d)少なくとも 1種のセンスアダプタープライマープローブを、 B又は前記 (c)の反応物 に添加して、核酸伸長反応を行う。
4) A及び Bの最終反応物を混合して、新たなプライマープローブを添加せずに PCR反 応を行う。又、
3.少なくとも 1種の核酸を含む試料が、前記 1のものと同じである前記 2に記載の核酸 の取得方法、又、
4.制限酵素で処理された核酸が、前記 1に記載の多型解析のために制限酵素で処理 された核酸である前記 2に記載の核酸の取得方法、又、
5.少なくとも 1種の核酸を含む試料が、前記 1記載の最終物即ち最終反応液 (物)、又 はその分離'精製物である ものである前記 2に記載の核酸の取得方法、又、
6.前記 1又は 2に記載の核酸の取得方法で取得された核酸種にっレ、て遺伝子発現の 検定を行い、当該核酸種の中から新規有用核酸を取得することを特徴とする核酸の取 得方法、を提供する。 図面の簡単な説明
第 1図は、核酸の制限酵素断片とリンカ一の結合した状態を示す図。
第 2図は、 QP— PCR産物の温度解離曲線を示す図。
-0- No. 1 ~B~ No. 4 -O- No. 7
-·- No. 2 ~Δ~ No. 5
Figure imgf000004_0001
第 3図は、図 2の温度解離曲線を微分した曲線を示す図。 -O- No. 1 -m- No. 4 -0- No. 7
-秦 No. 2 ~ r No. 5
-O- No. 3 No. 6 第 4図は、試料 (サンプル） No. 4の T- RFLPパターンを示す図。
第 5図は、試料 (サンプル) No. 5の T- RFLPパターンを示す図。
符号の説明
1：アダプタープライマープローブと同じ配列
2 :リンカ一 2
3 :制限酵素断片 (センス配列）
4：アンチセンスプライマープローブ結合位置
5 :リンカ一 1
6：制限酵素断片 (アンチセンス配列）
7 :センスプライマープローブ結合位置 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を更に詳細に説明する前に本発明で使用する用語を説明又は定義する。 本 発明において用いる用語は、特別な定義がない場合は、現在、分子生物学、遺伝学若 しくは遺伝子工学、微生物学若しくは微生物工学等で一般的に使用されて！/ヽる用語と 同じ意味である。
「少なくとも 1種」とは、 1種若しくは複数種の意味である。
「核酸若しくは遺伝子」のことを単に「核酸」ど総称する。
「同一機能核酸種」とは、同一機能を有する核酸及び/又は遺伝子のグループのこと を意味する。本発明において、当該「機能」とは、生物学的に意味のあることをいう。そ して核酸 (DNA、 RNA)自体の機能とその発現物 (mRNA、蛋白質)の機能力ある。核 酸自体の機能としては、例えば、 DNAの場合、プロモター（promoter)、レギユレター (regulator)、タミネタ一（terminator)等の構造遺伝子以外の塩基配列を挙げる ことができる。 RNAの場合、リボザィム等の酵素活性部位の塩基配列を挙げることがで きる。発現物の場合は、例えば、蛋白質の構造を支配する塩基配列、又、酵素活性等 を支配する塩基配列を挙げることができる。これらは「機能」を説明するために、その一 部を例示したに過ぎない。それで、これらの例示を以て本発明は限定されない。
「濃度的優先核酸種」とは、複数の核酸種が存在した場合、電気泳動の泳動パターン から、又、定量した結果とし濃度的に最も多い (高い)か、又は比較的に多レ、 (順位から して、約 1位乃至 5位くらい)核酸種のことである。それは、核酸増幅前又は増幅後を区 別しないものとする。 - 本発明においては、「試料中に含まれる核酸」のことを単に標的核酸又は目的核酸と いう場合がある。
本発明において「核酸を測定する」、或いは「核酸濃度を測定する」なる用語は、標的 核酸の濃度を定量することは勿論のこと、定量的検出をすること、定性的検出をするこ と、核酸増幅系の蛍光強度を単に測定する力若しくは単にモニタリングすること等を意 味するものとする。又、このようにして得られたデーターを公知の蔵田らの方法 (EP特 許公開公報、 EP1 046 717 A9号)で解析して、 1つの系内に存在している濃度（コピ 一数等)を求める操作等も含めるものとする。
上記の理由で、本発明の「試料に含まれる核酸」とは、検出'測定を目的とした特定の 核酸とは限らず、意図せずとも本発明の方法により検出され得る不特定の核酸をも含 むものとする。勿論遺伝子等を含む。それらの核酸が混在していてもよい。濃度の大小 も問わない。即ち、一つの系内に存在する現在及ぴ未来において有用と考えられる特 定及び不特定の検出され得る核酸である。核酸は DNA、 RNA及ぴそれらの修飾物を 含むものである。本発明においては、これらの核酸を標的核酸という場合がある。
本発明において、コンセンサスプライマープローブとは、相捕的塩基配列にハイプリ ダイズする当該プライマープローブの塩基配列が、既知の同一機能を有する核酸種群 から認識されるコンセンサスな塩基配列部位の一部又は全部にハイブリダィズするプラ イマ一プローブのことをレ、う。「コンセンサスな配列」とは、分子生物学で定義されてレ、る 既知核酸とのコンセンサス配列の他に、既知核酸との共通配列をも含むものとする。
Qプローブ及びサンライズプローブについては後記した。又、リンカ一対 (リンカ一 1、 リンカ一 2)、アンチセンスプライマープローブ、センスプライマープローブ及ぴセンス若 しくはアンチセンスアダプタープライマープローブにつレ、ても、具体的に後記した。
「光学的キャラクター」なる用語は、プライマープローブを標識する蛍光物質、クェン チヤ一物質等の各種の吸収スペクトル、若しくは蛍光発光スペクトル、及びそれらの吸 収強度、偏光、蛍光発光、蛍光強度、蛍光寿命、蛍光偏光、蛍光異方性等の光学的特 性等のこと！/、う (「蛍光強度」で総称する場合力 Sある。 )。又、プライマープローブ等に標 識されている少なくとも 1つの蛍光物質等について少なくとも 1種以上の測定波長で測 定された測定値を総合的に評価して得た性質のこともいう。例えば、核酸の変性反応 の蛍光強度曲線等もその 1つである。
本発明において、「蛍光強度の変化若しくは変化量から」なる用語は、本発明の増幅 核酸に基づく蛍光強度の変化だけでなぐ当該増幅核酸に、蛍光物質及び Z又はタエ ンチヤーで標識された均一溶液系核酸プローブをノヽイブリダィズさせたときの、そのハ イブリダィゼーシヨン前後の蛍光強度の変化若しくは変ィ匕量をも含めるものとする。 本発明にぉレ、ては、プライマープローブと対応核酸とのハイプリダイゼーシヨンによる プライマープローブと核酸の複合体のことをハイブリッド、又はノヽイブリツド複合体、又は 単に、核酸'プライマー複合体又はプライマ一核酸複合体という。
核酸ポリメラーゼとは、核酸を合成する能力を有するものである。代表的な例として、 DNAポリメラーゼ類、 RNAポリメラーゼ類、逆転写酵素類（reverse
transcriptase )、リガーゼ類を挙げることができる。
DNAポリメラーゼの場合は、ェキソヌクレアーゼ活性を有していても、有さなくてもよ レ、。精製されたもの若しくはされない粗酵素の状態のどちらでもよい。又、酵素の起源 (微生物、動物、植物）につレ、ては特に限定されない。好適には耐熱性を有するものが よい。本発明においてはこれら以外にも、遺伝子工学的に前記酵素のアミノ酸配列が 改変されたあのち含めるあのとする。
好適な具体例として、 ent (exo- ) DNA Polymerase (サーモコッカス'リトラリス由 来、 Tgo (exo- ) D Polymerase^ ThermoSequenase DNA
Polymerase ( Armersham %h$^s AmpliTagGold polymerases T7 Sequenase DNA Polymerase^ Taq、 LaTaq ( TAKARA BIO INC . )、 Pfu ( STRATAGENE ¾h)、 KOD (TOYOBO社）等を挙げることができる。 本発明でいう蛍光物質 (蛍光色素という場合もある。）とは、一般に核酸プローブに標 識して、核酸の測定'検出に用いられている蛍光物質の類である。例えば、フルォレセ イン（fluorescein)又はその誘導体類 (例えば、フルォレセインイソチオシァネート (fluorescein isothiocyanate) (FITC)若しくはその誘導体等）、 Alexa 488、 Alexa 532、 Cy3、 Cy5、 6 - joe、 EDANS、ローダミン（rhodamine) 6G(R6G)又はそ の誘導体 (例えば、テトラメチノレローダミン（tetramethylrhodamine) (TMR)、テト ラメチノレローダミンイソチオシァネート（tetramethylrhodamine
isothiocyanate) (TMRITC)、 x—ローダミン（x— rhodamine)、テキサスレッド (Texas red)、ボデピー（BODIPY) (商標名） FL (商品名；モレキユラ1 プローブ (Molecular Probes)社製、米国； BODIPY こつレヽて fま以下同様である。）、ポデピ 一（BODIPY) FL/OS^ボデピー（BODIPY) FL/ce.ポデピー（BODIPY) 5— FAM、ポ デピー（BODIPY) TMR又はその誘導体（例えば、ボデピー（BODIPY) TR、ポデピー (BODIPY) R6G、ボデピ一（BODIPY) 564、ボデピー（BODIPY) 581、、ボデピー (BODIPY) 493/503、タムラー（TAMRA)等を挙げることができる。
上言己の中でも、 AMRA, FITC；、 EDANS,テキサスレッド、 6- joe, TMR、 Alexa 488、 Alexa 532、ポデピー（BODIPY) FL/C3、ボデピー (BODIPY) R6G、ポデピー (BODIPY) FL、ボデピー（BODIPY) FL C6,ボデピー（BODIPY) TMR,ボデピー (BODIPY) 5 - FAM、ポデピー（BODIPY) 493,503、ボデピー (BODIPY) 564、ポデ ピ——（BODIPY) 581、 Cy3、 Cy5、 x-Rhodamine等を好適なものとして挙げることカで きる。
クェンチヤ一物質とは、前記蛍光物質に作用して、その発光を抑制若しくは消光する 物質である。例えば、 Dabcyl、 NFQ、 QSY7 (モノレキユラ1 プローブ）、 QSY33(モルキ ユラ一 ·プロ一フ )、 Ferrocene又はその誘導体、 methyl viologen, Ν,Ν' - dimethyl— 2, 9— diazopyrenium等、好適には Dabcyl, NFQ等を挙げ、ること力で きる。
前記のような、蛍光物質及ぴクェンチヤ一物質を、オリゴヌクレオチドの特定の位置に 標識することにより、蛍光物質の発光は、クェンチヤ一物質によりクェンチング効杲を受 ける。 以下、本発明の特徴を説明する。
本発明の目的を達成するため、 1つの試料中に多く含まれる核酸又は 1つの試料中 で本発明の核酸増幅方法により多く増幅される核酸を検索することと同時に、自然界よ り得られる多くの試料の中から、同一機能を有する核酸を多く含む試料を選択 (スクリー ユング)するのが更なる本発明の目的である。それで、当該目的に適うように手順が構 成されている。
本発明は 4つの発明力 なつているが、核酸増幅方法、 Tm値解析方法、多型解析方 法、アンカー PCR方法の組合せに特徴を有するものである。
A.第 1発明：
次の手 からなつている。
1.少なくとも 1種の核酸を含む試料を少なくとも 1種を用意する。
本発明でいう少なくとも 1種の核酸を含む試料とは、自然界の任意の場所、例えば、 汚水、水田地、畑地、山地、沼地、動物体內、動物の各種臓器内等の生物が生存でき る箇所又は力 て生存したところで採取されるものであり、特別に限定できるものではな い。又、各種生物の各種細胞をも含めるものとする。系内の全核酸を含むものでも、― 部を含むものでもよい。又、核酸抽出を施されたものでも、されないものでもよい。核酸 とは前記の定義のとおりである。
2.この試料の各々について、少なくとも 1種の核酸について核酸増幅反応を行い、核 酸増幅を確認する。この場合、増幅反応と同時に増幅核酸の増幅前及び/又は増幅 後の濃度若しくはコピー数を測定しておくのが好適である。
本発明でレヽぅ核酸増幅方法とは、インビトロ（in vitro)で核酸を増幅する方法のこ とをレ、う。公知、未公知を問わなレ、。例えば、 PCR方法、 LCR方法（ ligase chain reaction) s丄、 AS力—法、 ICAN ( Isothermal and Chimeric primer- initiated Amplification of Nucleic acids )方法、 LAMP方法、 NASR A方法、 RCA方法、 TAMA方法、 UCAN方法等を全て含めるものとする。好適には 少なくとも 1種のフォワード（forward)型及びリパース（reverse)型からなるプライマ 一プローブを用 ヽる、少なくとも 1種の PCR方法である。
前記 PCR方法はどのような形式のものでも採用できる。例えば、定量的 PCR方法、リ ァノレタイム定量的 PCR方法、 RT-PCR、 RNA-primed PCR、 Stretch PCR、逆 PCR、 Alu配列を利用した PCR、多重 PCR、混合プライマープローブ PCR、 PNAを用いた PCRを拳げることができる。そして、当該 PCR方法は、 PCRにより増幅した核敏につい て、融解曲線の解析若しくは分析の方法等をも含むものとする。好適には定量的 PCR 方法若しくはリアルタイム定量的 PCR方法を採用する。
PCR方法に用いる少なくとも 1種のフォワード型及びリバース型力 なるプライマープ ローブとしては、本発明を達成できるものであれば、どのようなものでもよいが、少なくと も 1種のフォワード型及ぴリバース型力もなるコンセンサスプライマープローブを用いる のが好適である。本発明においては、試料中にコンセンサス塩基配列を有する核酸 (同一機能を有する核酸)が存在すると仮想して核酸増幅反応を行う。更に、 当該コン センサスプライマープローブが、フォワード型及び/又はリバース型にぉレヽて、少なくと も 1種の蛍光物質で標識された蛍光物質標識コンセンサスプライマープローブであるも のが好適である。少なくとも 1種の蛍光物質標識コンセンサスプライマープローブとして は、少なくとも 1種の Qプローブ若しくはサンライズプローブを用いるのが好ましい。当該 プライマープローブの具体的には後記した。
核酸増幅反応において、核酸增幅反応が起こったことを確認する。これは、蛍光物質 標識コンセンサスプライマープローブ、特に、 Qプローブ若しくはサンライズプローブを 用いることにより容易にできる。即ち、核酸増幅反応系の蛍光キャラクターの変化量をリ アルタイムで測定し、その測定値から確認できる。又、場合によっては、同日きにこの蛍 光物質標識コンセンサスプライマープローブを用レ、る PCR方法では、増幅核酸の増幅 前の濃度若しくはコピー数を測定できる。これらの具体的方法については後記した。 本発明は、又、少なくとも 1種のフォワード型及ぴリバース型カゝらなる蛍光物質標識コ ンセンサスプライマープローブが、複数のものであり、各々、異なったコンセンサス塩基 配列を有し、且つ異なった蛍光発光色を与える蛍光物質で標識された蛍光物質標識コ ンセンサスプライマープローブを使用する核酸の取得方法でもある。
即ち、本発明においては、 1つの核酸増幅反応系において、増幅対象の核酸は、複 数種の同一機能核酸種であってもよい。例えば、当該反応系において、 A機能を有す る核酸種、 B機能を有する核酸種を同時に増幅してよい (但し、 Aと Bは等しくない。 )0 各々異なったコンセンサス塩基配列を有し、且つ異なった蛍光発光色を与える蛍光物 質で標識された、複数の蛍光物質標識コンセンサスプライマープローブを用いて、複 数種の同一機能核酸種を一つの反応系で増幅してもよレヽ。そして核酸増幅反応系の 蛍光強度の測定に際しては、複数種の測定波長で測定するのが好適である。それで、 測定装置は複数の測定波長で同時に測定できるものを使用するのがよい。例えば、ス マートサイクラ一システム (タカラバイオ株式会社)等を挙げることができる。その他の具 体例は後記の PCR方法の箇所に記載した。この核酸増幅方法においては、試料中の 核酸種の多少にとらわれずに増幅核酸の増幅前及びノ又は増幅後の濃度若しくはコ ピーを測定しておくことができ、又、好適である。
3.少なくとも次の：!）〜 3)の何れか 1項の手順を行い、濃度的優先核酸種又は新規核 酸種若しくは同一機能核酸種 (以下、新規若しくは同一機能核酸種という。）を特定す る。
1)増幅核酸種の中で、増幅前若しくは増幅後の濃度的優先核酸種を特定する。 即ち、 1種のコンセンサスプライマープローブを用レ、て増幅された増幅核酸種は必ずしも 1種 ではな！/ヽ。それで、濃度の高レヽ核酸種を特定するのが好適である。この場合、増幅産 物を公知の 0. 5% (w/v)〜l. 5% (w/v)のァガロースゲル又は 6〜8% (w/v)の ポリアクリルアミドゲルを用いる電気泳動方法 (生物工学実験書、 97〜163ページ、 19 93年、日本生物工学会編、培風館出版）、若しくは一般的（各種充填剤をもつ) HPLC 方法、、シークェンサ一方法で分析又は解析することにより容易に特定できる。尚、電 気泳動方法、 HPLC方法、シークェンサ一方法は従来公知の条件で行うことが好まし!/、。 シークェンサ一としては、例えば、 ABI 373A (ABI社のシークェンサ一）、
ABI377 (ABI社のシークェンサ一）、 Biofocus 3000 (バイオラット社)等を挙げるこ とができる。
2) (a)増幅核酸について温度解離曲線 (Tm値)を測定する。
この手順は増幅核酸について、低い温度カゝら核酸が完全に変性するまで、温度を 徐々に上げる過程 (例えば、 50°Cから 95°Cまで）、この過程において、短い時間間隔 (例えば、 0. 2°C〜0. 5°Cの温度上昇に相当する間隔)で蛍光強度を測定する過程力、 らなっている。この場合も蛍光物質標識コンセンサスプライマープローブを用いると、好 適なデータが得られる。具体的には後記及ぴ実施例で示した。
(b)温度解離曲線の中に、特異的な温度解離曲線 (Tm値)が検出された場合は、特異 的な温度解離曲線 (Tm値)を示す核酸種を特定する。特定する方法は前記同様に増 幅産物を公知の電気泳動方法若しくは HPLC方法、シークェンサ一方法等で分析又は 解析することにより容易にできる。
3)増幅核酸にっレヽて多型解析を実施し、新規若しくは同一機能核酸種を特定する。 多型解析方法は、本発明の目的を達成できる方法であれば、如何なる方法でもよい 、公知の方法で行うのが好適である。例えば、 T-RFLP方法、 SSCP方法、 CFLP方 法、 ARMS方法、 direct-sequence方法、 MPH方法のレ、ずれを使用しても本発明の 目的が達成できる。
前記の各種方法の中でも T-RFLP方法が本発明において好適に利用できる。そこで、 本発明の一つの例として、以下に当該方法を説明する。
Qプローブをプライマープローブとして用いる定量的 PCR方法、特にリアルタイム定 量的 PCR方法で、遺伝子を増幅し、且つ増幅前の初期遺伝子量を測定する。そして、 その増幅核酸にっレ、て、 T-RFLP方法で多型を解析する。尚、 Qプローブをプライマー プローブとして用いて増幅された核酸は 5 '末端が本発明の蛍光物質で標識されてい る。
即ち、次の（a)〜（c)の手順からなる。
(a)先ず、増幅核酸を制限酵素で処理 (消化)する。
制限酵素の種類は特に限定されない。好適には、例えば、 EhYCI、 PflFI , Earェェ、
Sap. SexAェ、 Ascl、 Fsel、 NotI、 Pad. Pme、 Sbfl、 Sfil、 Sg AI, Swal.
Hhal、 Alul、 Mspl等を挙げることができる。
使用濃度も目的'制限酵素の種類により種々変化するので特に限定されない。一例と して、 0. 01〜10units/ ^ l、好適 (こ ίま 0. 1〜1. Ounits/ ;U 1である。
反応条件は、制限酵素の種類により異なるため、一概にはいえないが、公知のもので よレ、。制限酵素の試薬キットに添付されてレ、るプロトコールに準じればよい。一例の制
P艮酵素にっレ、て実施例に示した。
(b)前記のようにして消化された遺伝子断片について、加熱変性して、一本鎖化する ことが好適である。この変性処理も公知の通常の条件で行うことができる。例えば、 9 7°C、 5分処理後、氷中にて冷却する。
(c)遺伝子断片の分析'解析
前記の処理物について、遺伝子断片の分析'解析をする。本発明の多型解析方法で は、蛍光物質で標識された遺伝子断片だけを、電気泳動方法、 HPLC方法、シークェ ンサ一方法等で分析し、解析することになる。即ち、蛍光強度値で各パンド、各ピーク を検出する。検出は現在市販されてレヽる通常の分析機器を使って行うことができる。例 えば、 ABI 373A (ABI社のシークェンサ一）、 ABI 377 (ABI社のシークェンサ一）、 Biofocus 3000 (バイオラット社)等を挙げることができる。
本発明において、前記分析で、複数のバンド、又は複数のピークが出現することは多 型が存在することになる。シングルバンド又はシングルピークの場合は多型が存在しな レ、ことになる。各バンド又は各ピークの蛍光強度値の比は、とりもなおさず多型の存在 比になる。前記の本発明の定量的 PCR方法では PCRを行う前の標的遺伝子の量が測 定され得る場合があるので、この測定値に前記の多型の比を乗ずれば、多型の初期存 在量が求められることになる。この多型分析'解析により、電気泳動方法を使用せずとも 増幅核酸中の新規若しくは同一機能核酸種の濃度的優先核酸種を特定できる場合が め 00
多型に関して、このようにしてデータを出す方法は、本発明の Qプローブを用いる定 量的 PCR方法を使用することにより初めて可能になるものである。
上記の一連の手順操作で、検出された核酸がどのような多型のもの力判明する。又、 その濃度も計算できるようになる。
本発明において、この方法だけで、新規若しくは同一機能核酸種を特定することがで きる場合が出てくる。例えば、試料中に存在する新規若しくは同一機能核酸が 1種若し くは 2種の場合である。
上記の手順、即ち、 1)〜3)のいずれか 1項だけで次の手順へ進んでもよいが、好ま しくは複数項にまたがった方がよい。例えば、 1)→2)→3)、 2)→1)→3)、 3)→2)→ 1)、 1)→2)、 1)→3)、 2)→3)、 2)→1)、 3)→1)、 3)→2)の如くである。好適には 1) →2)→3)、 2)→1)→3)である。これは、単に例示であって、この例示により本発明は 限定されるものではない。
本発明において、これらの手順で、増幅核酸の中に新規若しくは同一機能核酸種を 特定することが可能となる。
4.前記 3)の情報に基づいて、増幅核酸種について塩基配列を解読'決定する。
好適には前記多型解析で得られる核酸断片について部分的塩基配列の解読'決定 する。この場合、サイクルシークェンス反応試薬キット
(thermoSequenase (Amersham)、 AmpliTaqKS (Per km Elmer) )を用レヽ飞、 サイクルシークェンス方法 (蛍光物質標識プライマープローブ方法、蛍光物質標識ター ミネーター方法）によりシークェンス決定反応を行うのが好適である。当該反応は巿販さ れてレヽる自動爱光シークェンサ一（ィ列; ¾Jま、 ABI3739/377 (PerkinElmer ))を用レヽ て行うのが便利である。そして、シークェンサ一等（例えば、 PJ9600、
Vistra (Amersham)、 CATALYST (PerkinElmer) )を禾 lj用して塩基配歹 (Jを解析し、 塩基配列を決定する（実験医学（Experimental Medicine) ,p.29〜
35,Vol.l5,No.7, 1997年，羊土社)。具体的手順は市販のシークェンサ一又は試 薬キットに添付されてレ、る手順書に従うのがよレ、。
5.前記 4の塩基配列の解読'決定から得られる塩基配列情報に基づいて、増幅核酸 種の中から新規若しくは同一機能核酸種を特定する。
得られた塩基配列情報を既知めものと比較検討することにより、容易にできる。例えば、
Entrezの Nucleotides
database (htt ： / /www. ncbi . nlm. nih. gov: 80 /entrez /query . f cgx?d b=Nucleotide)、 EBI/EMBL (http： //www . ebi . ac . uk/embl)、
NCBI/GenBank (htt ： / /www. ncbi . ) lm. nih . gov/Genbank/index . html
)、 DDB J ( ht tp : / / www . ddb j . nig . ac . j p/Welcome- j .html)にアクセスし、既 知の塩基配列とコンピュータで比較検討すればよい。
尚、本手順の決定された同一機能核酸種の塩基配列の情報だけで、同一機能核酸 種は既知のものと同じものであると決めることはできない。増幅核酸は同一機能核酸種 の全塩基配列を増幅してレ、るとは限らなレ、からである。
6.前記 5から得られる塩基配列情報に基づいて、新規若しくは同一機能核酸種に特 異的なプライマープローブを設計する。
プライマープローブは前記 1と同様の形態 '形式でよい。具体的には後記に示した。
7.前記 6で設計されたプライマープローブを用いる核酸増幅方法により、前記 1に記載 の核酸を含む試料について、新規若しくは同一機能核酸種の増幅を行う。
増幅方法は、前記 1と同様に行うことができる。
8.前記 2の増幅核酸の中から新規若しくは同一機能核酸種の全長を取得する。 公知 の一般的方法で取得できる。例えば、 0. 5〜： L 5% (w/v)ァガロースを用レヽる電気泳 動方法で分離してもよぐ又、新規若しくは同一機能核酸種の全長をプラスミドに組み 込むクローユング方法を採用してもよい (実験医学、 15卷、 12〜19ページ、 1997年、 羊土社)。このようにして、上記の一連の手順操作で、新規若しくは同一機能核酸種の 全長の塩基配列のサイズが判明し、且つ取得されることになる。
このようにして取得された新規若しくは同一機能核酸種は、ベクターに連結され、新 規若しくは同一機能核酸のクローンライブラリー作成ができる。尚、クローニング及びシ ークエンスを念頭に置レ、た PCRを行う場合は、蛍光物質で標識されて!/、なレ、プライマ 一プローブを用いるのが好適である。これは蛍光物質で標識された産物は、クローニン グ&シークェンスの工程で不可欠なベクターとのライゲーシヨンの基質にならないため である。
ベクターに連結された新規若しくは同一機能核酸 (遺伝子)を用いて、微生物 (例え ば、大腸菌、酵母等)、動物又は植物の培養細胞を形質転換して、遺伝子発現を検討 するのがよい。そして、発現量及び/又は発現産物の機能 (例えば、酵素活性等の生 理的活性等)を測定する。この操作により新規有用核酸を特定することが可能となる。 新規若しくは同一機能核酸の発現量及び Z又は発現産物の機能を検討するには、 当該核酸を前記細胞に直接挿入してもよレヽ。
これらは、従来公知の方法で容易に達成できる（実験医学， p . 12〜
19, Vol . l5 , No . 7 , 1997年，羊土社)。 f列えば、、好適なベクターとしては、 YAC、 BAC 等を挙げることができる。
ベクターに連結する方法は、平滑末端クローニング、 TAクローニング、制限酵素を利 用したクローユング等で行ってよレヽ。又、第 2発明の箇所に示したライゲーシヨン方法と 同様に行ってよい。
クローンライブラリー作成は、従来通常の方法で行ってよぐ例えば大腸菌等のホスト 菌が利用できる。
本第 1発明の手順については、以下の特徴を有する。
試料中に含まれる核酸種にっレヽては下記の順で発明が実施されるのが好適である。
(1)前記 3の 1)においては、増幅核酸の増幅前若しくは増幅後の濃度が高レヽ核酸種の 順に、手順 4を実施する。
(2)前記 3の 2)においては、特異的な温度解離曲線 (Tm値)を示す増幅核酸の増幅 前若しくは増幅後の濃度が高レヽ核酸種の順に、手順 4を実施する。
(3)前記 3の 3)においては、新規或いは標的の核酸と特定された増幅核酸の増幅前 若しくは増幅後の濃度が高い核酸種の順に、手順 4を実施する。
又、核酸を含む試料については下記の順で発明が実施されるのが好適である。 (1) 前記 3の 1)においては、増幅核酸の増幅前の濃度が高い核酸種を含む試料の順に、 手順 4を実施する。
(2)前記 3の 2)においては、特異的な温度解離曲線 (Tm値)を示す増幅核酸の増幅 前の濃度が高い核酸種を含む試料の順に、又は特異的な温度解離曲線 (Tm値)を示 す増幅核酸種を多く含む試料の多レヽ順に、手順 4を実施する。
(3)前記 3の 3)においては、新規若しくは同一機能核酸種と特定された増幅核酸の増 幅前の濃度が高い核酸種を含む試料の順に、又は新規若しくは同一機能核酸種と特 定された増幅核酸種を多く含む試料の順に、手順 4を実施する。
(4)前記 4におレヽては、新規若しくは同一機能核酸種と特定された増幅核酸の増幅前 の濃度が高い核酸種を含む試料の順に、又は新規若しくは同一機能核酸種と特定さ れた増幅核酸種を多く含む試料の順に、手順 4を実施する。
本発明の PCR方法に好適に用いることができるプライマープローブは例示するなら ば、下記のようなものである。
フォワードプライマープローブとリバースプライマープローブを使用するにれは以下 の記載においても同様である。 ) 0
標的核酸の相補的塩基配列にハイブリダィズしたとき、蛍光強度が変化する蛍光物 質標識核酸プローブで、且つ PCRのプライマーとして利用できるものであればどのよう な形式のプローブでもよレ、。そして、コンセンサスプライマープローブが好適である。 それで、本発明においては、コンセンサスプライマープローブ、コンセンサスプローブ ともいう。それで、このプローブは、コンセンサスな塩基配列がプロモター領域であるな らば、数多くの遺伝子を増幅させることができる。又、当該プローブの塩基配列力 Sタン パク質をコードする塩基配列にコンセンサスなもの、若しくは共通するものであるならば、 同一機能遺伝子群を全て増幅することができる。
好適に用レヽることができるプライマープローブとしては、具体的には、オリゴヌクレオチ ド力 なり、 3，末端のリボース又はデォキシリボースの 3，位の OH基がフリーであり、且 つ、標的核酸の相捕的塩基配列にハイブリダィズする塩基配列を含むオリゴヌクレオチ ドから形成され、相補的塩基配列にハイブリダィズすることで光学的キャラクターが変化 する特質を有する蛍光物質標識プライマープローブである。
Sプライマープローブの形式としては、蛍光物質及び/又はクェンチヤ一物質で 標識されているもの、好適には、蛍光物質間の相互作用、好適には、蛍光物質間、又 は蛍光物質と G (グァユン)間で相互作用をおこす蛍光物質及ぴ Z又はクェンチヤ一物 質で標識されてレ、るものである。
具体的には、光学的キャラクター変化が蛍光消光現象である Qプローブ (KURATA et al . , ucleic acids Research, 2001 , vol . 29 , o . 6 e34)、又、光学的キヤ ラタター変化が蛍光発光増加であるサンライズプローブ（Mackay et al . , ucleic acid Research, 1292-1305page , vol . 30 , o . 6 , 2002 , azarenko et al . , ucleic acids Res . , 25、 2516- 2521 , 1997 )の類を最も好適な例として 挙げることができる。しかしながら、本発明においてはこの例に限定されるものではな レ、。
Qプローブを使用する PCR方法は QP— PCRと称される。 Quenching primer或 レヽは probeとレ、う意味である。
前記 Qプローブの好適な形態は、以下の少なくともレ、ずれか 1の特質を有するもので める。
(a) 1本鎖のオリゴヌクレオチドからなり、少なくとも 3'末端部位の塩基配列は、標的核 酸にノヽイブリダィズするように設計されており、 3'末端のリボース又はデォキシリボース の 3'位の OH基がフリーである。勿論プライマープローブ全体が標的核酸とハイブリダ ィズするものでも構わない。そのハイブリダイセ'ーシヨンにより、 PCRのプライマーとして 利用される。
(b) 5'末端部位 (鎖中でもよい、又、 5'末端でもよい。以下同様。）の塩基配列が C (シ トシン）を含むものである。
(c)前記 (b)において、 5'末端部位の塩基配列に含まれる Cに蛍光物質が標識されて いる。
(d)前記 (c)において、 5'末端部位の塩基配列が相補的塩基配列とハイブリダィズす るか若しくはしなレ、塩基配列を含むものである。
(e)前記 (d)において、相補的塩基配列とハイブリダィズしない塩基配列を塩基数にし て;!〜 20塩基を含むものである。
(f)当該プローブ力標的核酸にノヽイブリダィズしたとき、又、核酸増幅反応中、プローブ に標識されてレ、る蛍光物質の蛍光発光が減少する。
前記を例示すると、以下のようなものである。
その蛍光物質の標識位置は 5，側の糖部位及ぴ Z又はそのリン酸部位、塩基部位の どちらでもよい。そしてその部位は 5'側であればよぐ必ずしもその末端若しくはその部 位でなくともよい。好適には 5'末端である。
そして Qプローブの場合、標識部位の塩基力 C (シトシン)であるものが望ましい。し かし、必ずしも、 Cである必要はなぐ Qプローブと標的核酸がハイブリダィズしたとき、 標識塩基に相補する標的核酸の塩基から 1〜3塩基離れて (標識塩基に相補する標的 核酸の塩基を 1と数える。）標的核酸に G (グァニン)が存在すればよい。又、当該プロ ーブの標識部位から:!〜 3塩基離れて (標織塩基を 1と数える。 ) G塩基が存在してもよ レ、。
又、 5'末端が Cである場合、当該 Cが試科中の標的核酸とハイブリダィズしなくともよ い。これは、核酸増幅反応中に当該 Cに相補的な Gが合成されるからである。そして、 C とハイブリダィズする塩基配列の間に任意な塩基配列が介在してもよレヽ。介在塩基配 列が塩基数；!〜 30、好ましくは、 1〜20である。塩基配列は、任意のものでよいが、好 適には Cを含むものである。このようなプライマープローブである場合、 PCRの増幅産 物とハイブリダィズしたとき、前記の現象により蛍光強度を減少させることができる。減少 量が対応核酸の濃度に比例する。
サンライズプローブの形態は、 1本鎖のオリゴヌクレオチドからなり、その末端若しくは 末端部位 (好ましくは 5'末端側）が 1つの蛍光物質で、他の領域 (鎖中）に一つの自ら は蛍光を発しなレ、クェンチヤ一物質 (又、ァクセプター蛍光物質 (この場合、末端若しく は末端部の蛍光物質はドナー蛍光物質という。））が一般的に標識されている。そして、 対応核酸にハイブリダィズしていないときは、プローブ分子内の塩基配列の相同性から、 標識された塩基間でステム（stem) ·ループ (loop)構造を形成する。当該構造の形成 により、蛍光物質とクェンチヤ一物質が互いに近い位置に配置される。当該配置により FRET現象がおこり、蛍光物質の蛍光発光が抑制される。しかしながら、プローブが対 応核酸とハイブリダィズすると、ステム'ループ構造が壊れる。そうすると FRET現象が 解消し、 光物質の蛍光発光が増大する。対応核酸の濃度は、測定系の蛍光物質の 蛍光強度の増加量に比例する。当該プローブを用いる PCR方法をサンライズ PCR方 法という。
そして当該プローブは少なくとも 3'末端部位の塩基配列は、標的核酸にハイブリダィ ズするように設計されており、 3，末端のリボース又はデォキシリボースの 3 '位の OH基 がフリーである。勿論プライマープローブ全体が標的核酸とハイブリダィズするものでも 構わなレ、。そのハイブリダィゼーシヨンにより、 PCRのプライマーとして利用される。
前記どちらのプライマープローブにおいても、塩基配列の一部若しくは全部は、標的 核酸の相補的塩基配列にハイブリダィズするものである。具体的には、既知の同一機 能を有する核酸種群カゝら認識されるコンセンサスな塩基配列の一部又は全部にハイブ リダィズする塩基配列を含むものであればよい。
プライマープローブの使用濃度は、目的により、即ち、試料に含まれる核酸の濃度等 により種々の濃度を変化させるので特に限定されない。一例を挙げるならば、 0. 01〜 1. Ο μ ΜΖ 、好ましく ίま 0. 1〜0. である。
そして、増幅される標的核酸は蛍光物質で標識される。
尚、前言己のプライマープローブは従来公知の方法で、作成できる。本発明で用いる各 種のプライマープローブのオリゴヌクレオチドは、市販されてレ、る核酸合成機を使用す るの力 S好適である（列; tJま、、 ABI394 ( Perkin Elmer社製、 USA) )。
オリゴヌクレオチドに蛍光物質及ぴ Z又はクェンチヤ一物質を標識するには、従来公 知の標識法のうちの所望のものを利用することができる (Applied and
Environmental Microbiology, 63卷、 1143〜1147頁、 1997年）。例えば、 5' 末端に前記標識物質分子を結合させる場合は、先ず、常法に従って 5'末端のリン酸基 にスぺーサ一として、例えば、 - (CH2 ) n-SHを導入する。これらの導入体は市販されて いるので市販品を購入してもよい (Midland Certified Reagent Company)。こ の場合、 nは 3〜8、好ましくは 6である。このスぺーサ一に SH基反応性を有する前記標 識物質又はそれらの誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成で きる。このようにして合成された前記標識物質で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相 等のクロマトグラフィー等で精製して本発明の標的核酸プライマー及び核酸プローブと することができる。
又、オリゴヌクレオチドの 3'末端塩基も標識できる。
この場合は、リボース又はデォキシリボースの 3，位 Cの OH基にスぺーサ一として、例 えば、 - (CH2) n -腿 2を導入する。これらの導入体も前記と同様にして市販されてレ、るの で市販品を購入してもよい (メドランド 'サーティファイド 'レージント 'カンパニー
(Midland Certified Reagent Company) )。又、リン酸基を導入して、リン酸基 の OH基にスぺサ一として、例えば、 - (CH2) n-SHを導入する。これらの場合、 nは 3〜 8、好ましくは 4〜7である。このスぺーサ一にアミノ基、 SH基に反応性を有する前記標 識物質又はそれらの誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成で きる。
又、オリゴヌクレオチドの鎖中塩基も標識できる。
塩基のアミノ基又は〇H基を 5'又は 3'末端の方法と同様にして本発明の前記標識物 質で標識すれ {ま、ょレヽ（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225、 32— 38頁（1998年））。 ァミノ基に導入する場合、キット試薬 (例えば、 Uni- link
aminomodifier ( CLONTECHネ±¾、米国）、フルォ-リポーターキット
(FluoReporter Kit ) F - 6082、 F-6083, F - 6084、 F - 10220 (レヽずれも Molecular Probes社製、米国））を用いるのが便利である。そして、常法に従って当 該オリゴリポヌクレオチドに前記標識物質分子を結合させることができる。
このようにして合成されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製 して本発明の標的核酸プライマープローブとすることができる。
現在は委託合成で任意のものが入手できる（ (株）日本遺伝子研究所
(http： //www . ngrl . co · j p) )。又、商品化されてレ、るものを入手してもよ！/ヽ。
前記したプライマープローブを用いて、核酸増幅方法、特に PCR方法、又はリアルタ ィム定量的 PCR方法について、又、核酸増幅と同時に増幅核酸の増幅前の濃度若し くはコピー数を求めるデータ解析方法について、以下に記述する。 リアルタイム定量 的 PCR方法は、プライマープローブ（forward型、 riverse型）と標的核酸のァニー リング反応、核酸伸長反応、核酸変性反応を 1サイクルとして、このサイクルを繰り返す ことにより、核酸増幅を行レヽながら、増幅核酸が変性された状態とプライマー '核酸複合 体状態の PCR反応系の光学的キャラクターの変化を少なくとも 1種の測定波長でリアル タイムでモニタリング (測定)する方法である。そして、少なくとも 1種の測定波長で測定 して得られる蛍光強度の変化率のカーブ力 増幅前の標的核酸の濃度を決める方法 である。 PCRの反応は、核酸が指数関数的に増幅してレヽるサイクルまで反応を行うこと により目的が達成される。反応条件は公知のものでよい。具体的には実施例に示した。 上記の PCR方法において、実際の測定は、測定'データ解析装置 (それらの方法の手 順を記録した電子記録媒体を装備したものも当然含むものとする。 )を用いて測定をす る。
即ち、本発明に利用するリアルタイム定量的 PCR方法の実際の測定、それによつて 得られるデータを解析する方法は公知の方法で行えばよい。好適には、 KURATAら の方法 (KURATA et al . , ucleic Acids
Research, 2001 , vol . 29 , No . 6 , e34)を挙げ、ること力できる。
具体的には以下の通りである。
リアルタイム定量的 PCR方法は、現在、 PCRを行わせる反応装置、少なくとも 1種の 測定波長で蛍光物質の光学的キャラクター変化を検出する装置、ユーザーインターフ エース、即ち、データ解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンビユー タ読み取り可能な記録媒体（另1 J称： Sequence Detection Software System)、 及びそれらを制御し、データ解析するコンピュータ力 構成される装置で、少なくとも 1 種の測定波長を用いて、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこの ような装置で行われる。
以下に、先ず、本発明の方法に用いるリアルタイム定量的 PCRの解析装置から説明 する。本発明において用レ、る装置は、 PCRを少なくとも 1種の測定波長を用いてリアル タイムでモニタリングできる装置であればどのような装置でもよレ、が、例えば、 ABI PRISMTM7700塩基配歹 lj検出システム（Sequence Detection System SDS 7700 ) (パーキン 'エルマ1 ~·アプライド 'バイオシステム社 (Per kin Elmer Applied Biosytems社、 USA) )、ライトサイクラ一™システム（ロシュ ·ダイァグノスティックス株式 会社、ドイツ)等を特に好適なものとして挙げることができる。
尚、前記の PCR反応装置は、標的核酸の熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸 長反応を繰り返し行う装置 (例えば、温度を 95°C、 60°C、 72°Cに繰り返し行うことがで きる。）である。又、検出システムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフ並 ぴに CCDカメラ、少なくとも 1種の蛍光測定用チャンネルを装備している。更に、データ 解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記 録媒体は、コンピュータにインストールされて使用され、コンピュータを介して上記のシ ステムを制御し、検出システムから出力されたデータを解析処理するプログラムを記録 したものとなっている。
コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されてレヽるデータ解析用プログラムは、 サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サイクルの関数とし て、即ち PCRの amplification plotとしてコンピュータのディスプレー上に表示 する過程、蛍光強度が検出され始める PCRサイクル数 (threshold cycle number : Ct )を算出する過程、 Ct値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作成 する過程、前記各過程のデータ、プロット値を印字する過程、カゝらなって!/ヽる。 PCRが 指数的に進行してレヽる場合、 PCR開始時の測定対象の PCR反応開始前の標的核酸 のコピー数の Log値と、 Ctとの間には直線関係が成り立つ。従って標準核酸の既知量 のコピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の標的核酸を含むサンプルの Ctを 検出することにより、標的核酸の PCR開始時の初期コピー数を計算できる。
以下に各特徴について記す。
第 1の特徴は、リアルタイム定量的 PCR方法で得られ、且つ、各測定波長について得 られたデータを解析する方法にぉレヽて、各サイクルにおける増幅した分析対象の核酸 が当該核酸に対応する（特異的にハイプリダイズする)プライマープローブにハイブリダ ィズしたときの当該プライマープローブを標識してレ、た蛍光物質の蛍光強度値を、各サ ィクルにおける当該プライマープローブと当該核酸がハイブリダィズしたもの（即ち、プ ライマー ·核酸複合体)が解離したときの前記蛍光物質の蛍光強度値により補正する演 算処理過程、即ち、補正演算処理過程である。
「： t曾幅した核酸が当該核酸に対応する (特異的にハイブリダィズする)プライマープロ ーブにハイプリダイズしたときの当該プライマープローブを標識していた蛍光物質の蛍 光強度値」とは、具体的に例示すると、 PCRの各サイクルにおける 40〜85°C、好ましく は 50〜80。Cの反応温度を有する核酸伸長反応或いはアニーリングのときの反応系に おけるプライマープローブを標識していた蛍光物質の蛍光強度値 (より具体的には当 該蛍光物質に関わる測定波長で測定した、当該反応系の蛍光強度値)を挙げることが できる（以下、同様である。 )0そして、反応が完了した反応系を意味する。実際の温度 は増幅した核酸の長さに依存する。
又、「前記のプライマー ·核酸複合体が解離したときの前記蛍光物質の蛍光強度値」 とは、 PCRの各サイクルにおける核酸の熱変性の反応系、具体的には、反応温度 90 〜： LOO°C、好ましくは 94〜96°Cのときのもので、反応が完了した反応系におけるプライ マープローブの蛍光物質に関わる測定波長で測定した場合の反応系の蛍光強度値を 例 できる（以下、同様である。 ) o
ネ甫正演算処理過程の補正演算処理としては本発明の目的に合致するものであれば どのようなものでもよレ、が、具体的には、次の〔数式 1〕或いはほ女式 2〕による処理過程 を含むものを例示することができる。
fn=fhyb,nZ n,n 〔数式 1〕
f„ = fden,n/fhyb,n 〔数式 2〕
〔式中、 fn:〔数式 1〕或いは〔数式 2〕により算出された n7火サイクルにおける補正演算処理値、 fhyb,n: n次サイクルにおける、増幅した核酸が当該核酸に対応するプライマープローブ とハイブリダィズしたときの反応系の蛍光強度値、
fden,n： n次サイクルにおける、前記のプライマー'核酸複合体力 S解離したときの前記蛍 光物質の蛍光強度値〕
第 2の特徴は、各サイクルにおける〔数式 1〕或レヽは〔数式 2〕による補正演算処理値を 次の〔数式 3〕或レ、は〔数式 4〕に代入し、各サンプル間の蛍光変化量 (蛍光変化割合或 いは蛍光変化率)を算出し、それらを比較するデータ解析方法である。
Fn=fn/fa 〔数式 3〕
Fn=fa/fn 〔数式 4〕
〔式中、
Fn :n次サイクルにおける、〔数式 3〕或いは〔数式 4〕により算出された蛍光変化量 (蛍光 変化割合或!/ヽは蛍光変化率)、
fn： n次サイクルにおける〔数式 1〕或レ、は〔数式 2〕による補正演算処理値
fa:〔数式 1〕或いは〔数式 2〕による補正演算処理値で、 fnの変化が観察される以前の任 意のサイクル数のものである力 通常は、例えば、 10〜40サイクルのもの、好適には 1 5〜30サイクルのもの、より好適には 20〜30サイクルのものが採用される。〕
第 3の特徴は、
(3. 1)〔数式 3〕或いは〔数式 4〕により算出された蛍光変ィ匕量 (蛍光変化割合或いは蛍 光変化率)のデータを用いて、〔数式 5〕、〔数式 6〕或いは〔数式 7〕による演算処理する 過程、
logb (Fn)、 ln (Fn) 〔数式 5〕
logb{ ( 1— Fn) XA}、 ln{ ( 1一 Fn) XA} 〔数式 6〕
logb{ (Fn— 1 ) XA}、 ln{ (Fn— 1 ) XA} 〔数式 7〕
〔式中、
A、 b :任意の数値、好ましくは整数値、より好ましくは自然数である。そして、 A= 100、 b=10のときは、 { (Fn- 1 ) XA}は百分率（％)で表わされる。
Fn:〔数式 3〕或いは〔数式 4〕により算出された nサイクルにおける蛍光変化量 (蛍光変 化割合或いは蛍光変ィ匕率)〕。
(3. 2)前記 (3. 1)の演算処理値が一定値に達したサイクル数 (Ct値)を求める演算処 理過程、
(3. 3)既知濃度の標準核酸を含む試料におけるサイクル数 (Ct値)と反応開始時の標 準核酸の初期コピー数の関係式を計算する演算処理過程、
(3. 4)標的核酸を含む試料における PCR開始時の標的核酸のコピー数を求める演算 処理過程、
を有するデータ解析方法である。そして、 (3. 1)→(3. 2)→(3. 3)→(3. 4)の順から なる過程が好適である。
尚、前記方法において、標準核酸を測定する反応系と標的核酸を測定する反応系を 一緒にしてもよぐ又、別々にしてもよい。
又、前記データ解析方法は、リアルタイム定量的 PCR方法が蛍光物質の発光の減少 量を測定するものである場合に特に有効である。
第 4の特徴は、前記の本発明の増幅核酸の温度解離曲線 (融解曲線)の分析方法、 又、本発明の PCR方法を行って核酸の Tm値を求める方法によって得られるデータを 解析する方法である。
即ち、本発明の PCR方法により増幅された核酸について、低い温度カゝら核酸が完全 に変性するまで、温度を徐々に上げる過程 (例えば、 50°Cから 95°Cまで）、この過程に おいて、短い時間間隔 (例えば、 0. 2°C〜0. 5°Cの温度上昇に相当する間隔)で、少 なくとも 1種の測定波長の蛍光強度を測定する過程、少なくとも 1種の測定波長につい ての測定結果を時間の関数としてディスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解 曲線を表示する過程、この融解曲線を微分して微分値 (一 dFZdT、 F:蛍光強度、 T: 時間）を得る過程、その値を微分値としてディスプレー上に表示する過程、その微分値 力 変曲点を求める過程からなる、解析方法である。本発明においては、蛍光強度は 温度が上力 ¾ごとに増加する。本発明においては、各サイクルにおける核酸伸長反応 時、好ましくは PCR反応終了時の蛍光強度値を熱変性反応時の蛍光強度値を用いて 割る演算処理する過程を上記の過程に追加することにより、より好ましい結果が得られ る。 . 前記のようにして第 1発明の増幅核酸の温度解離曲線の測定ができる。
第 1発明において、標的核酸に特異的プライマープローブの設計と調製を行う必要が あるが、前記部分的塩基配列の解読の結果のデータに基づレヽて塩基配列を設計して、 現在公知の方法により調製することができる。
B.第 2発明：
具体的に説明する前に本発明において使用する用語を定義する。
「アンカード（anchored) PCR方法」とは、図 1に示されるように、アンチセンスプライ マープローブ及ひン又はセンスプライマープローブとセンスアダプタープライマープロ ーブ及び/又はアンチセンスアダプタープライマープローブを用いて核酸増幅を行う P CR方法である（実験医学、 15卷、 No. 7、 52〜59ページ、 1997年）。
「リンカ一対（リンカ一 1、リンカ一 2)」とは、二本のオリゴヌクレオチド力 なり、互いの オリゴヌクレオチド鎖がハイブリダィズする領域と、ハイブリダィズしなレヽ領域を有するォ リゴヌクレオチドペアのことをいう。本発明では、一方をリンカ一 1と他方をリンカ一 2とレヽ う。アンカー PCR方法において使用されるもので、アンカーともいう（図 1参照）。塩基配 列は任意でもよい。
「アンチセンスプライマープローブ」とは、 1本鎖のオリゴヌクレオチド力 なる 1種のプ ライマープローブである。 2本鎖の標的核酸が存在した場合、遺伝情報をもった核酸 (例えば、 DNAの場合)塩基配列のことをセンス鎖という。そして、それに相補する 1方 の鎖をアンチセンス鎖という。それで、この場合、少なくともアンチセンス鎖にハイブリダ ィズする塩基配列を含む（即ち、センス鎖の塩基配列の一部又は全部を含む)プライマ 一プローブのことをいう（図 1参照)。「少なくとも」の意味は、アンチセンス鎖の他にリン カー領域の一部にまたがってノヽィブリダィズしてもょレヽとレヽぅ意味である。「センスプライ マープローブ」とは、アンチセンスプライマープローブとは逆でセンス鎖にハイブリダィ ズするプライマープローブのことをいう（図 1参照)。
「センスアダプタープライマープローブ」、「アンチセンスアダプタープライマープロ一 プ」とは、当該プローブの塩基配列が少なくともリンカ一の塩基配列、特に非相捕的領 域部分 (リンカ一 1とリンカ一 2が互いにハイブリダィズしない塩基配列（図 1参照)）を含 むものである。一方、試料に含まれる核酸の塩基配列の部分にハイブリダィズする塩基 配列を含んでもょレ、。アンチセンスプライマープローブ又はセンスプライマープローブ 力 伸長合成されてきた伸長核酸にハイブリダィズし、 PCR反応のプライマーとなる。 「少なくとも」の意味は、当該非相補的領域からはみ出た塩基配列領域を有していても よいということである。
センスアダプタープライマープローブは、標的核酸のセンス鎖の方のリンカ一の非相 補的塩基配列を含むものである。アンチセンスアダプタープライマープローブは、アン チセンス鎖の方のリンカ一の非相補的塩基配列を含むものである。 アンチセンス若し くはセンスプライマープローブとセンス若しくはアンチセンスアダプタープライマープロ 一フの闋係は一方を forward primerとすると他方は reverse primerで、ある。 尚、センスアダプタープライマープローブとアンチセンスアダプタープライマープロ一 ブは共通（同一）のものであってもよレ、。図 1に示されているのは共通（同一）のものであ る。
少なくとも次の手順カゝらなることを特徴とする核酸の取得方法（図 1参照）： 1)少なくと も 1種の核酸を含む試料にっレ、て、少なくとも 1種の制限酵素処理を行う。
この場合の制限酵素処理は第 1発明の多型解析の項に記した方法と同様に行えばよ い。反応後、例えば Acclの場合、 65°C、 30分間加熱処理して制限酵素を失活させる ことが好ましい。失活温度及び時間は、制限酵素によって異なるため注意が必要である。 又、当該処理物を、例えば、スピンカラム（MicroconPCR) (Millipore
Corporation Bedf ord、 MA、 USA;以下同様である。）を用いて精製してもよいし、 しなくともよい。反応バッファ一は、制限酵素試薬に付属のものを用るのが便利である。 第 2発明における、「少なくとも 1種の核酸を含む試料」は、第 1発明と同様である。 2)少なくとも 1種のリンカ一対 (以下、リンカ一 1、リンカ一 2という。）を前記（1)の制限酵 素処理物に添加し、ライゲーシヨン（ligation)反応を行う。
本発明のライゲーシヨン反応は、平滑末端連結結合反応 (blunt- end ligation) , TA結合反応等の通常の公知方法（実験医学、 p . 12〜19、 Vol . 15、 No . 7、 1997年、 羊土社)で行えばよぐ特に限定されない。
ライゲーシヨン反応形式は、例えば、前記制限酵素処理により生成した核酸断片の末 端の構造に依存する。核酸断片の 5'末端がリン酸ィ匕されているならば、リンカ一は無 処理でよい。リンカ一の 5，末端をキット試薬でリン酸ィ匕し、核酸断片をフォスファターゼ 処理しておいてもよい。そして、例えば、平滑末端連結結合反応の場合は、市販の各 種キット試薬を利用すると便利である（実験医学、 p . 12〜19、 Vol . 15、 No . 7 , 1997 年、羊土社）。一 ί列として、平端平'滑ィ匕一 Blunting kit (TAKARA BIO INC . )、連 結反応一 DNA Ligation Kit Ver . 2 (TAKARA BIO INC . )、 5，リン酸化一
MEGALABEL™ (TAKARA BIO INC . )等を挙げることができる。 TA結合の場合は、 T -Vector Kits (Novagenネェ、 TA Cloning Kits ( Invitrogen社)、 PGEM-T Vector System ( Promega社)等を挙げることができる。具体的手順、反応条件等は キット試薬に添付されてレ、るプロトコールに従えばょレ、。
反応物は精製してもよぐしなくともよい。精製する場合は、前記スピンカラムを使用し て行うのが便利である。
次のアンカー PCR反応のために、精製物を乾燥して、少量の滅菌水に溶かしてライ ゲーシヨンされた核酸の濃度を高めるのが好適である。この DNA物を次のアンカー PC
R反応の鍀型 DNAとする。
リンカ一等の塩基配列の具体的例は実施例に示した。
3)前記 (2)に記載の反応物を二つに分け (一方を Aとし、他方を Bとする。）、次の反応 を行う。
(1) Aにつ!/ヽて次の（a)及び (b)の反応を同時又は逐次的に行う：
(a)少なくとも 1種のアンチセンスプライマープローブを、 Aに添加し、核酸伸長反応を 行う。
(b)少なくとも 1種のアンチアダプタープライマープローブを、 A又は前記 (a)の反応 物に添加して、核酸伸長反応を行う。
反応条件は前記の PCR反応条件と同様でよい。例えば、当該アンチセンスプライマ 一プローブの添加濃度は 0. 0：！〜 S i mol/L、好適には 0. 1〜0. 5 t molZLで、ァ ダプタープローブの添加濃度は 0, 01〜2 molZL、好適には 0. 1〜0. 5 μ mol/L である。核酸伸長反応時間は:!〜 1800sec、好適には 10〜400sec、 DNA、 RNA等 のポリメラーゼ類は、前記 PCRに記載したものと同様のものが使用できる。使用濃度は 0. 01〜： !OuZ反応液（20 μ 1)、好ましくは 0.：！〜 3u/反応液（20μ 1)である。反応温 度は前記の PGR反応と同様でよい。例えば、 40〜85°C、好ましくは 50〜8O°Cである。 (2) Bについて、前記 Aと同様にして、次の（c)及び (d)の反応を同時又は逐次的に行 5：
(c)少なくとも 1種のセンスプライマープローブを、 Bに添加し、核酸伸長反 を行う。 (d)少なくとも 1種のセンスアダプタープライマープローブを、 B又は前記 (c)の反応物 に添加して、核酸伸長反応を行う。
4) A及ぴ Bの最終反応物を混合して、新たなプライマーを添加せずに前記の： PCRの 記載と同様の条件にて PCR反応を行う。
反応条件は前記と同様でよい。
アンチセンスプライマープローブ及ぴセンスプライマープローブは、前記の紫光物質 の少なくとも 1種で標識されたプローブを使用するのが好適である。それは、反応生成 物の解離曲線解析を行って、反応生成物を確認できるからである。そして、蛍光物質の 標識位置は、オリゴヌクレオチドの 5'側の塩基であることが好ましい。その場合、 Cのァ ミノ基又は OH基であることが好適である。これらの中でも、特に前記 Qプローブタイプ を使用するのが好適である。
本発明におレヽて、複数種の蛍光物質標識アンチセンスプライマープローブと複数種 のアンチアダプタープライマープローブを用いて前記の核酸伸長反応を行ってょレ、。 又、同様に、複数種の蛍光物質標識センスプライマープローブと複数種のセンスァダ プタープライマープローブを用いて前記の核酸伸長反応を行ってよい。この場合、複 数種のセンスプライマープローブ、アンチセンスプライマープローブは、各々異なった 塩基配列を有し、且つ異なった蛍光発光色を与える蛍光物質で標識された少なくとも 1 種のものである。
即ち、少なくとも 1種の蛍光物質で標識された少なくとも 1種のアンチセンスプライマー プローブ及び Z又は少なくとも 1種のセンスプライマープローブが複数のものであり、当 該複数の蛍光物質標識プローブが、各々異なった塩基配列を有し、且つ異なった蛍光 発光色を与える蛍光物質で標識された少なくとも 1種の蛍光物質標識アンチセンスプラ イマ一プローブ及び Z又は少なくとも 1種のセンスプライマープローブを用いる核酸の 取得方法である。この場合、複数種の有用核酸（目的遺伝子)が取得できる。 第 2発明において、手順 4)に移行する手順 3)の最終反応生成物は、各種の電気泳 動方法、各種の HPLC方法で精製してもよい。又、最終反応液そのものでも、十分に 本発明の目的が達成できる。
第 2発明の手順 4)の PCR産物は、その後、前記同様の電気泳動で分離されてもよい。 そして、制限酵素で有用核酸（目的遺伝子)とリンカ一を切り離すことにより、有用核酸 を分離することができる。又、電気泳動で分離する前に、制限酵素で、リンカ一を切り離 してから電気泳動にかけるのが好適である。
このようにして、上記の第 2発明の一連の手順操作で、標的核酸中の目的塩基配列 部分、即ち、標的核酸（目的遺伝子）のサイズが判明し、且つ取得されることになる。 前記のようにして分離された核酸 (遺伝子）は、第 1発明の場合と同様にして、その発 現量及び Z又は発現産物が検討される。
力、くして新規有用遺伝子が取得される。
C.第 3の発明
第 1発明と第 2発明を結合する発明である。即ち、少なくとも次のいずれか 1項に該当 する発明である。
1)第 2発明の少なくとも 1種の核酸を含む試料は、少なくとも次の何れか 1項である：
(1)第 1発明のものと同一である、
(2)第 1発明に記載の最終物即ち最終反応液 (物)、又はその分離'精製物であるもの (例えば、各種の電気泳動方法、各種の HPLC方法の処理にて分離'精製されたもの）、 即ち、第 1発明におレヽて新規若しくは同一機能核酸種と特定された核酸若しくはそれを 含むもの。
2)第 2発明の制限酵素処理されたものが、第 1発明において、多型解析'分析のため に制限酵素処理されたものを用レ、る発明である。
3)第 1発明で得られた情報を利用する発明である。
4)第 1発明で開発された新規若しくは同一機能核酸種と特定された核酸種の塩基配 列を利用する発明である。即ち、当該塩基配列の一部又は全部にハイブリダィズできる 塩基配列を、アンチセンスプライマープローブ又はセンスプライマープローブの塩基配 列が含んでいるものである。 5)第 1発明におレ、て使用したコンセンサスプライマ一プローブの塩基配列の一部又 は全部を、アンチセンスプライマープローブ及び/又はセンスプライマープローブの塩 基配列が含んでレ、るものである。
このようにして取得された新規有用核酸は、平滑末端クローニング、 TAクローニング、 制限酵素を利用したクローニング等でベクターに連結し、クローンライブラリーを作成す るのが好適である。又、ベクターに連結した新規有用核酸を用いて、適当な発現用細 胞 (例えば、大腸菌、酵母等)を形質転換して実際の発現を検定してみることが好適で ある。電気泳動方法で単一な核酸と認識された核酸でも必ずしも実質的に単一である とは限らなレ、からである。このようにして、分離'取得された核酸は最終的に新規有用核 酸となる。
このようにして、第 1発明と第 2発明を連結することにより、自然界の一つの系に存在 する有用核酸（目的遺伝子)を簡便'迅速に検出'測定して、その濃度を知り、且つ簡 便迅速に新規有用核酸（目的遺伝子)が分離される。この検討結果のデータから、新規 有用核酸 (遺伝子)の全塩基配列が決定され、且つ、新規有用核酸 (遺伝子)であるこ とが判明する。そして、新規有用遺伝子が取得される。尚、このようにして得られたデー タは如何なる多型の核酸であると認識されるので、次の遺伝子の遺伝子工学的塩基配 列の改変に大いに役立つ。
D.第 4発明
第 4発明は蛍光物質標識プライマープローブである。即ち、自然界の一つの系に存 在する有用核酸（目的遺伝子)を簡便'迅速に検出'測定して、その濃度を知り、且つ 有用核酸（目的遺伝子)が分離できるプライマープローブである。
3'末端のリボース又はデォキシリポースの 3'位の OH基力 Sフリーであり、且つ相補的 塩基配列にハイブリダィズする塩基配列を含むオリゴヌクレオチド力 形成され、相補 的塩基配列にハイブリダィズすることで光学的キャラクターが変化する特質を有する蛍 光物質標識プライマーである。そして、以下の少なくとも一つを具備する蛍光物質標識 プライマーである。
1) 5'末端が C (シトシン)である。
2)前記 1)において、 Cが標的核酸の相補的塩基配列とハイブリダィズしてもしなくとも よい。
3)前記 2)において、標的核酸の相補的塩基配列とハイプリダイズしないか又はハイ プリダイズする Cとハイプリダイズする相捕的塩基配列の間に標的核酸の相補的塩基 配列とハイブリダィズしないか又はハイブリダィズする任意な塩基配列が介在する。
4)前記 3)におレ、て、その介在塩基配列が塩基数 1〜20である。
より好適には、以下の少なくとも一つを具備する蛍光物質標識プライマーである。
(1) 5，末端が C (シトシン)である。
(2)前記（1)において、 Cが標的核酸の相補的塩基配列とハイブリダィズしない。
(3)前記（2)において、標的核酸の相補的塩基配列とハイブリダィズしない Cとハイブ リダィズする相補的塩基配列の間に任意の塩基配列が介在する。
(4)前記（3)において、その介在塩基配列が塩基数;!〜 20である。
尚、標的核酸にハイブリダィズしなレヽ任意の塩基配列部分は、ヒアピン (hairpin)構 造をとつていてもよい。 実施例
次に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
1)オリゴヌクレオチドの塩基配列
本実施例にて使用したコンセンサスプライマープローブ、リンカ一 1、リンカ一 2、標的 遺伝子特異的アンチセンスプライマープローブ、標的遺伝子特異的センスプライマー プローブ、アダプタープライマープローブの塩基配列は以下のものである。尚、塩基配 列は右が 5 '末端で左が 3，末端である。
(合成一本鎖 DNAの塩基配列）
コンセンサスプライマープローブ 1 (フォワード型) (アンダーラインの箇所がコンセンサ スな配歹 IJ、 5，末端のリン酸基が BODIPY FLC6で標識されている。 )：
CAGA6TTTGATCCTGGCTCAG
コンセンサスプライマープローブ 2 (リバース型) (アンダーラインの箇所力 Sコンセンサス な配列）：
GGTTACCTTGTTACGACTT コンセンサスプライマープローブ 1及びコンセンサスプライマープローブ 2は真性細菌 16S rRNA遺伝子の保存性の高い領域をターゲットとしたプライマーであり、真性細菌 の 16S rRNA遺伝子を全て PCR増幅可能である。
リンカ一 1 (アンダーラインの箇所が一方のオリゴヌクレオチドとハイブリダィズしなレ、配 列）：
CGGAATTCATTAACCCTCACTAAAGGGTGATC
リンカ一 2 (アンダーラインの箇所が一方のオリゴヌクレオチドとハイブリダィズしなレヽ配 列）：
£AI£GATCACCCTTTAGTGCC
標的遺伝子に特異的にハイブリダィズするアンチセンスプライマープローブ（アンダ 一ラインの箇所が試料に含まれる核酸のアンチセンス鎖の塩基配列にハイブリダィズ する、 5'末端のリン酸基が BODIPY FLC6で標識されている。 )：
ctcgtcagcaaagcagcaag
標的遺伝子に特異的にハイブリダィズするセンスプライマープローブ (アンダーライン の箇所が試料に含まれる核酸のセンス鎖の塩基配列にハイブリダィズする、 5 '末端の リン酸基力 S BODIPY FLC6で標識されてレヽる。）：
cttactactttgctgacgag
センスプライマープローブとアンチセンスプライマープローブはモデル標的遺伝子と して採用した大腸菌の 16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーである。
アダプタープライマープローブ (アンダーラインの箇所が遺伝子増幅過程で合成され る核酸にノヽイブリダィズする。 5'末端のリン酸基が BODIPY FLC6で標識されてい る。）：
CGGAATTCATTAACCCT
アダプタープライマープローブは、リンカ一の非相捕的領域 (リンカ一 1とリンカ一 2が ハイブリダィズしてレヽなレ、領域)と同じ配列を有して！/、るため、センスプライマープロ一 ブ或いはアンチセンスプライマープローブから伸長した増幅核酸の塩基配列にハイブ リダィズし、その後の PCR反応のプライマーとなる。標的遺伝子（大腸菌の 16S rRNA 遺伝子)を含む制限酵素断片部位にリンカ一力 Sライゲーシヨンされた際の状態を図 1と して示した。
2)オリゴヌクレオチド及びプライマープローブの調製：本実施例で使用した各種のオリ ゴヌクレオチド及ぴ各種のプライマープローブは全て委託合成により入手した ( (株）日 本遺伝子研究所 (http： I /www . ngrl . co . j p) ) 0
実施例 1
本実施例では、铸型サンプル中のモデル標的遺伝子（大腸菌 16S rRNA遺伝子）の 定量を実施し、標的遺伝子 (大腸菌 16S rRNA遺伝子)を多量に含むサンプルの特定 が可能である力検証した。
具体的には、活性汚泥から抽出した DNAサンプルに大腸菌ゲノム DNAを濃度を変 化させて添加した複数種の試料を用意し、当該サンプルについて核酸の増幅と定量を リアルタイム定量的 PCR方法を行い、多型解析方法で増幅産物を解析することにより、 標的遺伝子（大腸菌 16S rRNA遺伝子)を多量に含む試料の特定が可能であるカゝ検 証した。 '
1)サンプル
食品排水水処理装置より採取された大腸菌をほとんど含まないことが既知である活性 汚泥をサンプルとして用いた。モデル標的遺伝子 (大腸菌 16S rRNA遺伝子)を含む 铸型 DNAは、大腸菌ゲノム DNA (宝酒造社製)とした。
2)活性汚泥力、らの核酸の抽出と鎵型サンプルの調製
活性汚泥より、 BiolOlキット（土壌用）を用いて核酸を抽出し、更に Wizard DNA Clean-Up systemを用レヽて精製した。次に 260nm/280nmの吸光度力、ら、 DNA 濃度を測定した。当該抽出 DNAは 120:^/ 1—抽出液であった。当該抽出した DN Aに大腸菌ゲノム DNAを既知濃度 (大腸菌ゲノム DNA換算で 105、 10s、 107コピー） 添加し、铸型サンプルとした。
3)リアルタイム定量的 PCR方法
リアルタイム定量的 PCR方法として Quenching primer (Qプローブからなるコンセ ンサスプローブ 1及ぴ 2)を用いた手法 (以下 QP—PCR法という。）を適用した。
4) QP_PCR反応条件
変性反応： 95°C、 15sec ;アニーリング： 53°C、 5sec ;伸長（extention)及び検出： 72°C、 SOsec;測定装置:ライトサイクラ一システム (ロッシュ社製）（以下、便宜上、ライ トサイクラ一という。 )；使用した蛍光検出用チャンネル:チャンネル 1 (Ex, 470nm;Em、
5)反応液
反応液全量：20^1; rTaqポリメラーゼ (宝酒造觀）、 0.5Uノ反応（20 μ 1 )； rTaq polymeraseに付属の X lObuf f er、 2.0μ l/反応（20μ 1)； dNTPs 最終濃度、 各 2mM;Mg++イオン濃度、最終濃度 2mM;牛血清アルブミン (BSA)、最終濃度 0.25mg /ml；活性汚泥抽出 DNA、 Ι.Ομ 1/反応（20 μ 1)；大腸菌ゲノム DNA、 Ι.Ομ 1ノ反 応（20μ 1)；各プライマープローブ (コンセンサスプライマー 1及ぴ 2)の最終濃度、 100nM;Taq start溶液（クローンテック社製、 0.4 ^ 1/反応（20 1)。
6) <3?—？〇1にょる全163 rRNA遺伝子の定量
QP— PCRによって、サンプル中に含まれる全 16S rRNA遺伝子の定量を実施した。 検量線は、大腸菌ゲノムを標準核酸として用いて作成した。 log Rn (蛍光消光率) = 0.2に設定し、 Ct値を求めた。 QP— PCRによる試料中の全 16S rRNA遺伝子の定 量結果を表 1に示す。
表 1 試料中の全 16S rRNA遺伝子の定量結果
Figure imgf000036_0001
活性汚泥抽出 DNAのみを 60ng添加した系（サンプル No. 3)の定量値は 1 . 2 X
107コピーであった。活性汚泥抽出 DNA60ngと大腸菌ゲノム DNAを 24ng ( 107コピ 一分)添加した系（サンプル No. 6)では、ほぼ添加した量の定量値の上昇が見られた。 活性汚泥抽出 DNAを添加せずに大腸菌ゲノム DNAのみを 107コピー分添加した系
(サンプル No. 7)では、ほぼ理論どおりの定量値が得られた。活性汚泥抽出 DNA添 加量を 0 . 6ng添力卩した系（サンプル No. 2)では、 DNA添加量がサンプル No. 3の 1 ノ100であるため 1 . 2 X 105コピー付近の定量値が想定された力 ほぼ理論通りの結 果（1. 5 X 105コピー）が得られた。これらの結果より、本法 (QP— PCR方法）にて全同 一機能核酸 (遺伝子)を定量できることが示唆された。 し力し、 DNA添カ卩量がサンプル No. 3の 1/10 , 000である系（サンプル No. 1)で は、 1. 2 X 102コピー付近の定量値が想定された力 S、理論値より約 50倍高い定量値 (5 . 2 X 103コピー）が得られた。これは、添加した铸型 DNAが低コピーであったため、 非特異的産物の増幅が優先的に起こったためと考えられた。
7)温度解離曲線
前記で実施した QP— PCR反応後、得られた増幅産物の解離曲線を作成した。装置 はライトサイクラ一システムを使用し、 60〜90°Cを 0 . 1°C/秒で温度変化させ、その間 蛍光を連続的に測定した。 QP—PCR方法で得られた産物は、末端の C塩基が BODIPY FL修飾されているため、産物が解離し 1本鎖になることにより蛍光量が増大す る。このため簡便に増幅産物の解離曲線を得ることが可能であった。
その結果を図 2、図 3に示した。図 3は、図 2の解離曲線を微分した解離ピークである。 解離ピークは、解離曲線を微分したものである。このため、このピーク頂点の位置から、 おおよその Tm値を知ることができる。サンプル No. 2〜7については、 85°C付近に解 離ピークが検出された。目的の増幅産物と同様の断片長を示す増幅産物が、電気泳 動により確認されたことから（Data not shown)、 85°C付近に解離ピークをもつ増幅 産物は特異的産物であることが確認された。
サンプル No. 1で得られた産物の解離ピークは 75°C付近であった。このこと力ゝら、サ ンプル No. 1で得られた産物は非特異的増幅産物であることが確認された。この非特 異的増幅産物は、その Tm値カゝらプライマーダイマーと推察された。
このように、 QP—PCR方法では、得られた産物の解離曲線を簡便に作成することが 可能であるため、迅速に増幅産物が特異的である力、否かの判定を行うことが可能であ る。
8)T— RFLP方法による多型の分析'解析
大腸菌ゲノム DNAと活性汚泥抽出 DNAの両方を铸型としたサンプル No. 4、サンプ ル No. 5の増幅産物をスピンカラム (MicroconPCR)を用いて精製した。精製物を制 限酵素 Hhal (認識部位： GCGZC、 Z記号は切断個所)で 0/N (—晩)処理した。 制限酵素処理を行った DNA溶液にっレ、て加熱変性処理を行った後、シークェンサ 一（ABI PRISMTM310、 PE Applied Biosystems)にて T - RFLP解析を行った。 そのピークパターンを図 4、図 5に示す。ピーク高の比より各遺伝子 (多型)の構成比を 求め、この構成比に QP— PCR方法の工程で定量した全 16S rRNA遺伝子量を掛け ることで、各遺伝子 (多型)のコピー数を算出した。
その結果を表 2として示す。添加した大腸菌ゲノム DNAから算出されるサンプル No. 4及びサンプル No. 5中における大腸菌 16S rRNA遺伝子は、それぞれ 105コピー、 106コピーである力 全 16S rRNA遺伝子量と構成比力 算出された大腸菌 16S rRNA 遺伝子は、それぞれ 1 · 3 X 105コピー、 1 . 1 X 106コピーであり、ほぼ理論値通りの定 量値を得ることができた。以上の結果より、コンセンサスプライマーを用いた QP— PCR 方法により全同一機能遺伝子数を求め、更に QP—PCR産物を T- RFLP解析し遺伝 子 (多型)の構成比を求めることで、同一機能遺伝子を構成する各遺伝子 (多型)を正 確に定量できることが示唆された。
表 2 T— RF L P方法の結果
Figure imgf000039_0001
コンセンサスプライマーを用いた QP—PCRでは、同一機能を有する遺伝子の共通 配列をターゲットとして PCR増幅を実施するため、既知な遺伝子 (多型)だけではなく、 同一機能を有する未知な遺伝子 (多型)も同時に増幅させることができる。既知な遺伝 子 (多型）の T- RFLP断片長は予め知ることができるので、それ以外の T-RFLP断片が 存在すれば、対象サンプル中に新規な遺伝子 (多型)が存在することを確認すること力 S できる。よって本法は、同一機能遺伝子を構成する遺伝子 (多型)群にぉレ、て、既知な 遺伝子 (多型)のみならず、新規な遺伝子 (多型)も定量することが可能である。従って、 本法により新規な有用遺伝子を多量に含むサンプルを迅速に特定ィ匕することが可能と なる。
実施例 2
1)核酸を含む試料
実施例 1にて標的遺伝子を濃度的に優先種となるように増幅できるサンプル No. 5と、 活性汚泥抽出 DNA(60ngZ At 1 )と 0 .24pgZ 1の大腸菌ゲノム DNA(16S rRNA 遺伝子として約 100コピー）を等量混合した試料 (サンプル No. 8)より、標的核酸 (大 腸菌 16S rRNA遺伝子）のスクリーニングを試みた。自然環境サンプル等の未知サン プルが対象サンプルであれば、 QP—PCR方法で得られた全同一機能性遺伝子の增 幅産物についてクローニング&シークェンスを実施し、新規な遺伝子 (多型)配列を 定した上で、アンカー PCR方法を行うために、新規な遺伝子に特異的なアンチセンス プライマープローブ及ぴセンスプライマープローブを作成する必要性がある。
しかしながら今回は、実験の便宜上、大腸菌 16S rRNA遺伝子を未知な遺伝子 (標 的遺伝子）と仮定し検討を実施したため、クロー-ング&シークェンスの工程は省レ、た。 大腸菌に特異的なアンチセンスプライマープローブ及びセンスプライマープローブは、 予め既知であった大腸菌 16S rRNA遺伝子配列情報を基に設計した。
2)制限酵素処理
'制限酵素: EsmHl
サンプル No. 5及びサンプル No. 8の DNA溶液を、 120ngZl00 μ 1—反応液とな るように添加し、 EamHI (ニューイングランドバイオラボネ: fc$¾を用いて、一昼夜 37°Cに て制限酵素処理した。制限酵素は、 5unit/l00 μ 1一反応液の最終濃度となるよう 添加した。反応後、 80°Cで 20分間加温することで、制限酵素を失活させた後、スピン力 ラム (MicroconPCR)を用いて精製した。反応バッファ一は、制限酵素試薬に添付さ れているものを用いた。
3)制限酵素断片とリンカ一との結合反応 (ライゲーシヨン反応）
T4 DNAリガ一ゼを用レヽて制限酵素断片とリンカ一との結合を以下の方法で実施した。 最初にリンカ一 1とリンカ一 2を、それぞれ 1. 5 ^ M、 1. M添加し、事前に結合させ た後に、サンプル No. 5、サンプル No. 8の制限酵素処理済みサンプノレを全量添加し た。この溶液に、 4 DNAリガーゼを 1. 5units添加し、 16°Cにて 24時間ライゲーショ ン反応を実施した。ライゲーシヨンされたサンプルは、スピンカラム (MicroconPCR)に て精製した。精製された DNA溶液を乾燥し、滅菌水 10 1で溶解させた。この DNA溶 液を以下の工程で実施するアンカー QP— PCRの铸型 DNAとした。
4)前記反応物の分割
前記反応物は二つに分割して一方を Aとし、他方を Bとした。
5)標的遺伝子に特異的なプライマープローブを用いての、前記ライゲーシヨン反応物 を铸型とする標的核酸の伸長反応 (以下、アンカー QP— PCRと呼ぶ） 標的遺伝子特 異的アンチセンスプライマープローブとアダプタープライマープローブによる増幅反応 (A)と標的遺伝子特異的センスプライマープローブとアダプタープライマープローブに よる増幅反応 (B)における反応組成液と反応条件は伸長時間を除いて実施例 1の QP —PCRの条件と同様である。アンカー QP—PCRの伸長時間は 180secとした。前の 行程で得られたリンカ一が付加された核酸溶液 (全量： 10 μ 1)は、増幅反応 (Α)と増 幅反応 (Β)の铸型として、それぞれ 5 μ ΐずつ使用した。
6)結果
サンプル No. 5を铸型とした系では増幅反応 A及ぴ増幅反応 Bともに蛍光消光が確 認されたことより、何らかの遺伝子の増幅が確認された。反応終了後、増幅産物の解離 曲線を描いた。その結果、約 90°C付近に Tm値を有する增幅産物であることが明らかと なった。プライマーダイマーは鎖長が短いため、 Tm値はこれより低い（70°C付近)。よ つて、得られた産物はプライマーダイマーではなレ、ことが推察された。サンプル No. 8 を錡型とした系では増幅反応 A及ぴ増幅反応 Bともに蛍光消光が確認されたが、反応 終了後の解離曲線解析の結果、約 75°C付近に Tm値を有する増幅産物であることが 明ら力となった。よって、サンプル No. 8を铸型とした系では特異的増幅が起こらず、プ ライマーダイマーが合成されたものと判断された。サンプル No. 8では、標的遺伝子量 力 S100コピーと少なレ、ため、標的遺伝子の增幅よりプライマーダイマーの合成が優先的 に起こったためと考えられる。
7)アンカー QP— PCR産物を铸型としたプライマー非添加の PCR反応
サンプノレ No . 5を铸型としたアンカー QP— PCR反応 A及びアンカ一 QP— PCR反応 Bの反応物を混合して、プライマーを添加しないで PCRを行った。反応組成液及び反 応条件は、アンカー QP— PCRと同様である。本 PCR反応は蛍光消光力 S確認された時 点で反応を停止させた。得られた産物は、スピンカラム (MicroconPCR)にて精製し た。
8)シークェンス
7)で得られた産物について、ダイターミネータ一法 (実験医学、 15巻、 29〜35ぺー ジ、 1997年、羊土社）によるダイレクトシークェンスにてその塩基配列を解読した。シー クエンスプライマーはコンセンサスプライマープローブ 2、
EullO OR ( 5 ' -TTGCGCTCGTTGCGGGACT-3 ' )、
Eu80 OR ( 5 ' -CATCGTTTACGGCGTGGAC-3 ' )、
Eu500R ( 5 ' -GTATTACCGCGGCTGCTGG-3 ' )
を使用した。シークェンサ一は ABI PRISM™310を使用した。
9)結果
反応 Aで得られた産物と反応 Bで得られた産物同士による PCR反応で得られた産物 の塩基配列を決定した結果 (16S rRNA遺伝子の全長)、標的遺伝子とした大腸菌 16S rRNA遺伝子と 100%塩基配列が一致した。以上の結果より、 2つのアンカー QP 一 PCRとアンカー QP— PCRで得られた産物同士の PCR反応により、標的とした遺伝 子を簡便且つ迅速に取得可能であることが示唆された。
しかしながら、標的遺伝子量の少なレヽサンプノレ No. 8を铸型とした系では、アンカー QP— PCRの工程でプライマーダイマーが合成され標的遺伝子を取得することが不可 能であった。このようにアンカー QP—PCR工程で用レ、る铸型中には、標的遺伝子が一 定量以上存在しなレヽと特異的な遺伝子増幅が得られなレヽことが示唆された。 以上の結果より、標的遺伝子の存在量を事前に知ることにより、スクリーニングに要す る労力を大幅に低減できることが示唆された。
10)結論
実施例により、本発明の手法は、（1)全同一機能核酸 (遺伝子)種の増幅 ·定量が可 能であること。 (2)同一機能核酸 (遺伝子)を構成する各核酸 (遺伝子)の多型の同時定 量が可能であることが示唆された。又、本手法では、多型解析 (T一 RFLP)より、各核 酸 (遺伝子）の多型が新規であるカゝ、既知であるかの判定とその構成比を知ることが可 能である。よって、同一機能核酸 (遺伝子)を構成する各核酸 (遺伝子)の多型のうち、 新規又は標的とする核酸 (遺伝子)の多型の存在量を知ることが可能となる。よって、標 的核酸 (遺伝子）が多レ、試料を特定ィヒすることが可能であることが示された。
又、リアルタイム定量的 PCRの過程で得られた新規な核酸 (遺伝子）の多型を多く含 む PCR産物を用いて、新規な核酸 (遺伝子）の多型の部分配列を解読し、この情報を 基に新規核酸 (遺伝子)の多型に特異的プライマーを作成することが可能である。 本発明の実施例では、特定化された試料より標的核酸 (遺伝子)を、特異的プライマ 一を使用するアンカー QP—PCRにより直接的且つ選択的に分離可能であることが示 された。又、標的核酸 (遺伝子)の存在量の少ない試料からは標的核酸 (遺伝子)の分 離が不可能であったことから、標的核酸 (遺伝子)が多レ、試料を特定ィヒすることの重要 性が示唆された。
このように本発明は、
(1)標的核酸 (遺伝子)が多い試料を特定ィ匕すること、
(2)特定ィ匕する工程で得られた産物の部分配列を解読し、新規核酸 (遺伝子）に特異 的プライマーを作成すること (既知な核酸 (遺伝子）が標的であればこの工程は不要）、
(3)特異的プライマーを用いて選択的に狙った核酸 (遺伝子)の多型のみを分離するこ とにより、新規核酸 (遺伝子)或いは標的核酸 (遺伝子）（多型)を迅速且つ簡便に分離 可能な手法であることが示された。 産業上の利用可能性
上記のように本発明方法により、自然界の一系内に存在する新規有用核酸 (遺伝子
等）の検出'測定及び取得'分離が簡便且つ迅速にできるようになった。

Claims

請求の範囲
1. 少なくとも次の手順カゝらなることを特徴とする核酸の取得方法： 1)少なくとも 1種の 核酸を含む試料について、核酸増幅方法により少なくとも 1種の核酸について核酸増 幅反応を行!/ヽ、核酸増幅を確認する。
2)少なくとも次の（1)〜（3)の何れか 1項の手順の操作を行レ、、増幅核酸中の濃度的 優先核酸種、又は新規若しくは同一機能核酸種を特定する。
(1)増幅核酸について、電気泳動、 HPLC、及び Z又はシークェンサ一分析を行う。
(2)増幅核酸にっレヽて温度解離曲線 (Tm値)を測定する。
(3)増幅核酸について多型解析を行う。
3)前記 2)で、濃度的優先核酸種、又は新規若しくは同一機能核酸種と特定された増 幅核酸種について、塩基配列を解読'決定し、新規若しくは同一機能核酸種と特定さ れた増幅核酸種の中から新規若しくは同一機能核酸種を特定する。
4)前記 3)カゝら得られる塩基配列情報に基づいて、増幅核酸種の中から新規若しくは 同一機能核酸種を確認する。
5)前記 4)力 得られる塩基配列情報に基づレ、て、新規若しくは同一機能核酸種に特 異的なプライマープローブを設計する。
6)前記 5)で設計されたプライマープローブを用レヽる核酸増幅方法により、前記 1)に記 載の核酸を含む試料について、新規若しくは同一機能核酸種の増幅を行う。
7)前記 6)の増幅核酸につ!/ヽて、新規若しくは同一機能核酸種の一部の塩基配列又は 全長の塩基配列を少なくとも含む核酸種を取得する。
2. 核酸増幅方法が、少なくとも 1種のフォワード型及ぴリバース型力 なるコンセンサ スプライマープローブを用いた定量的 PCR方法若しくはリアルタイム定量的 PCR方法 である請求項 1に記載の核酸の取得方法。
3. 少なくとも 1種のフォワード型及ぴリバース型力 なるコンセンサスプライマープロ ープが、フォワード型及ぴ 又はリバース型において、少なくとも 1種の蛍光物質で標 識された蛍光物質標識コンセンサスプライマープローブである請求項 2に記載の核酸 の取得方法。
4. 前記の蛍光物質標識コンセンサスプライマープローブが複数のものであり、各々、 異なったコンセンサス塩基配列を有し、且つ異なった蛍光発光色を与える蛍光物質で 標識されたものである請求項 3に記載の核酸の取得方法。
5. 前記の蛍光物質標識プライマープローブが少なくとも 1種の Qプローブ若しくはサ ンライズプローブである請求項 3又は 4に記載の核酸の取得方法。
6. 増幅核酸が、複数種の同一機能核酸種である請求項 1に記載の核酸の取得方 法。
7. 多型解析を、増幅核酸を制限酵素処理した後、当該処理物につレヽて行うものであ る請求項 1に記載の核酸の取得方法。
8. 濃度的優先核酸種と新規若しくは同一機能核酸種が同一である請求項 1に記载 の核酸の取得方法。
9. 濃度的優先核酸種の順に、又はそれを含む試料の順に請求項 1に記載の 3)の塩 基配列の解読'決定を実施する請求項 1に記載する核酸の取得方法。
10. 核酸増幅と同時に増幅核酸の増幅前及び/又は増幅後の濃度若しくはコピー 数を測定する請求項 1に記載の核酸の取得方法。
11. 少なくとも次の手順からなることを特徴とする核酸の取得方法：
1)少なくとも 1種の核酸を含む試料について、制限酵素処理を行う。
2)少なくとも 1種のリンカ一対 (以下、リンカ一 1、リンカ一 2という。）を前記 1)の制限酵 素処理物に添加し、ライゲーシヨン (ligation)反応を行う。 3)前記 2)に記載の反応 物を二つに分け (—方を Aとし、他方を Bとする。 )、次の反応を行う。
(1) Aについて、次の（a)及ぴ (b)の反応を同時又は逐次的に行う：
(a)少なくとも 1種のアンチセンスプライマープローブを、 Aに添加し、核酸伸長反応を 行う。
(b)少なくとも 1種のアンチセンスアダプタープライマープローブを、 A又は前記 (a)の 反応物に添加して、核酸伸長反応を行う。
(2) Bについて、次の（c)及ぴ (d)の反応を同時又は逐次的に行う：
(c)少なくとも 1種のセンスプライマープローブを、 Bに添加し、核酸伸長反応を行う。
(d)少なくとも 1種のセンスアダプタープライマープローブを、 B又は前記 (c)の反応物 に添加して、核酸伸長反応を行う。
4) A及ぴ Bの最終反応物を混合して、新たなプライマープローブを添加せずに PCR反 応を行う。
12. 少なくとも 1種の核酸を含む試料が請求項 1に記載のものと同じものである請求 項 11に記載の核酸の取得方法。
13. 制限酵素で処理された核酸が、請求項 1に記載の多型解析のために制限酵素 で処理された核酸である請求項 11に記載の核酸の取得方法。
14. 少なくとも 1種のアンチセンスプライマープローブ及び Z又は少なくとも 1種のセ ンスプライマープローブが少なくとも 1種の蛍光物質で標識されたものである請求項 11 に記載の核酸の取得方法。
15. 少なくとも 1種の蛍光物質で標識された少なくとも 1種のアンチセンスプライマー プローブ及び 又は少なくとも 1種のセンスプライマープローブが複数のものであり、当 該複数の蛍光物質標識プローブ力 各々異なったコンセンサス塩基配列を有し、且つ 異なった蛍光発光色を与える蛍光物質で標識された少なくとも 1種の蛍光物質標識ァ ンチセンスプライマープローブ及び/又は少なくとも 1種のセンスプライマープローブで - ある請求項 14に記載の核酸の取得方法。
16. 少なくとも 1種のアンチセンスプライマープローブ及び/又は少なくとも 1種のセ ンスプライマープローブが、請求項 1に記載の新規若しくは同一機能核酸の塩基配列 を一部又は全部を含むものである請求項 11又は 14に記載の核酸の取得方法。
17. 少なくとも 1種のアンチセンスプライマープローブ及び/又はセンスプライマープ ロープが、 Qプローブの 1種である請求項 11に記載の核酸の取得方法。
18. 少なくとも 1種のセンスアダプタープライマープローブ及び/又は少なくとも 1種 のアンチセンスアダプタープライマープローブが同一のものである請求項 11に記載の 核酸の取得方法。
19. 少なくとも 1種の核酸を含む試料が、請求項 1に記載のものと同じものである請求 項 11に記載の核酸の取得方法。
20. 少なくとも 1種の核酸を含む試料が、請求項 1に記載の最終物即ち最終反応液 (物）、又はその分離'精製物である請求項 11に記載の核酸の取得方法。
21. 請求項 1又は 11に記載の核酸の取得方法で取得された核酸種について遺伝子 発現の検定を行い、当該核酸種の中力 新規有用核酸を取得することを特徴とする核 酸の取得方法。
22. 遺伝子発現方法が、ベクター方法である請求項 21に記載の核酸の取得方法。
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