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WO2004089359A1 - 骨密度減少の抑制または予防用組成物および飲食品 - Google Patents

骨密度減少の抑制または予防用組成物および飲食品 Download PDF

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WO2004089359A1
WO2004089359A1 PCT/JP2004/005087 JP2004005087W WO2004089359A1 WO 2004089359 A1 WO2004089359 A1 WO 2004089359A1 JP 2004005087 W JP2004005087 W JP 2004005087W WO 2004089359 A1 WO2004089359 A1 WO 2004089359A1
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WO
WIPO (PCT)
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isoxanthohumol
food
drink
hop
active ingredient
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2004/005087
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English (en)
French (fr)
Inventor
Osamu Tajima
Mikio Katayama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kirin Brewery Co Ltd
Original Assignee
Kirin Brewery Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US10/552,447 priority patent/US20070059393A1/en
Priority to DE602004016486T priority patent/DE602004016486D1/de
Priority to EP04726643A priority patent/EP1618875B1/en
Publication of WO2004089359A1 publication Critical patent/WO2004089359A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US12/472,282 priority patent/US20100105766A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/348—Cannabaceae
    • A61K36/3486—Humulus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for suppressing or preventing a decrease in bone density, and a food or drink. More specifically, the present invention relates to a composition for preventing, treating or ameliorating osteoporosis, and a food or drink for preventing, treating or ameliorating osteoporosis.
  • Osteoporosis is a disease characterized by low bone mass and disruption of the fine structure of bone tissue, which leads to increased bone fragility and an increased risk of fracture. Osteoporosis is a major health problem around the world, affecting one in three menopausal women and many elderly men and women. Fractures due to osteoporosis are the third largest cause of bedridden in Japan, for example, and one of the causes of increased medical expenses. In addition, the number of patients is expected to further increase with the progress of an aging society. Therefore, the development of a medicament for preventing, treating or ameliorating osteoporosis is extremely important.
  • vitamin D preparations for example, vitamin D preparations, calcitonin preparations, estrogen preparations, Ivry flavone made, vitamin K 2 formulations, evening Npaku anabolic steroid preparation, and Bisuhosufone Single preparations are known.
  • estrogen preparations are known to be effective in preventing or treating postmenopausal osteoporosis, but they cause irregular bleeding, breast cancer and uterine cancer. It is known that there are side effects such as an increase in raw risk.
  • osteoporosis Treatment of osteoporosis with drugs often takes a long time, and various problems such as the occurrence of side effects due to prolonged administration cannot be ignored.
  • drug-based treatment of osteoporosis is not intended for fundamental treatment, but for symptomatic treatment, such as inhibiting the progression of the disease.
  • a prophylactic or therapeutic agent for osteoporosis that is safe and can be used on a daily basis is desired.
  • it can be said that it is desirable from the viewpoint of safety to find ingredients that have the effect of preventing or treating osteoporosis from foods that have experienced eating.
  • hop lupulin portion yellow granules formed at the base of the inner bract of the cone.
  • Hope is also used as a folk medicine, and is known to have physiological effects such as sedative effects, sleep and sleep effects, appetite enhancement, stomachic effects, and diuretic effects.
  • Hops have long been known to have estrogenic activity (eg, Munch. Med. Wschr. 95, 845 (1953)). Also, in 1999, 8-prenylnaringenin was isolated from hops as a female hormone active substance (J. Clinical Endocrinology & Metabolism 83 (6), 2249-2252 (1999)). Therefore, based on its activity, hop concentrates with significantly increased 8-prenylnaringenin content could be used for the prevention or treatment of postmenopausal osteoporosis, but there is a risk of causing side effects as with estrogen products .
  • isohumulones isoarsenates
  • isoxanthohumol isoxanthohumol.
  • WO01 / 67614 discloses foods and beverages containing a plant-derived growth factor production enhancer, and mentions isoxanthohumol as the growth factor production enhancer. .
  • this growth factor production enhancer has the effect of enhancing the production of hepatocyte enhancing factor (HGF) and nerve growth factor (NGF), and can be used for the treatment of diseases such as liver disorders, gastrointestinal disorders, pneumonia, and diabetes. It is also disclosed.
  • HGF hepatocyte enhancing factor
  • NGF nerve growth factor
  • an isomerized hop-derived component contained in beer or the like has an excellent effect of suppressing or preventing a decrease in bone density. This effect was considered to be effective in preventing, treating or ameliorating osteoporosis. It has also been found that this effect is based on isoxanthohumol, and that the effect of isoxanthohumol is superior to that of its analogous compound xanthohumol. The present invention is based on these findings.
  • an object of the present invention is to provide a composition and a food or drink used for preventing, treating or ameliorating osteoporosis, which have excellent safety and activity.
  • composition for suppressing or preventing bone density loss comprises isoxanthohumol as an active ingredient.
  • the composition according to the present invention may comprise an isomerized hop extract containing isoxanthohumol as an active ingredient.
  • the composition for preventing, treating or ameliorating osteoporosis according to the present invention comprises isoxanthohumol as an active ingredient.
  • the composition for preventing, treating or improving osteoporosis according to the present invention comprises an isomerized hop extract containing isoxanthohumol as an active ingredient.
  • the food or drink for suppressing or preventing bone density loss according to the present invention comprises isoxanthohumol or an isomerized hop extract containing isoxanthohumol.
  • the non-cereal-hop fermented food or drink according to the present invention comprises isoxanthohumol as an active ingredient in an amount such that the daily adult intake of isoxanthohumol is 0.003 to 0.5 mg / kg body weight. Things.
  • the non-animal-hop fermented food or drink according to the present invention comprises isoxanthohumol in an amount such that the isoxanthohumol intake per serving is 0.2 to 3 O mg. It comprises tofumol as an active ingredient.
  • the active ingredient of the composition or food or drink according to the present invention has an excellent effect of suppressing or preventing a decrease in bone density, and further has an effect of increasing bone density. Is also expected.
  • This active ingredient is contained in beer and the like which has been consumed as food and drink for many years. Therefore, the composition or food or drink according to the present invention has little side effects even if the patient or a person who wants to prevent osteoporosis takes or eats for a long time, and is excellent in safety. Further, the composition or the food or drink according to the present invention does not show an estrogenic effect on immature rats even when the dose is 1000 times or more the dose expected to achieve the intended effect.
  • the prevention, treatment or treatment of osteoporosis while avoiding the side effects due to estrogen action such as the case of estrogen preparations, for example, the risk of irregular bleeding, breast cancer and uterine cancer are increased. Excellent effects on improvement can be obtained.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Test 2 of the example.
  • the graph shows the estrogenic activity of isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin as measured by MCF-7 cell growth.
  • IXH represents isoxanthohumol
  • 8PN represents 8-prenylnaringenin
  • E 2 represents 17? -Estradiol.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Test 3-a of the example.
  • the graph shows the results of examining the in vivo estrogenic effect of isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin on young rats.
  • IXH represents isoxanthohumol
  • 8PN represents 8-prenylnaringenin
  • E2 represents 17-estradiol.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Test 3-b of the example.
  • the graph shows the results of examining the in vivo estrogenic effects of isoxanthohumol, 8-prenylnaringenin, and beads on ovariectomized rats.
  • IXH represents isoxanthohumol
  • 8PN represents 8-prenylnaringenin. Or means P ⁇ 0.001.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Test 3-b of the example. The graph shows the results of examining the in vivo estrogenic effects of isoxanthohumol and beer on ovariectomized rats.
  • IXH represents isoxanthohumol
  • E2 represents 17-estradiol.
  • *** means P ⁇ 0.001.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Test 4 of the example. The graph shows the results of examining the effect of isoxanthohumol, 8-prenylnaringenin, and beer on bone density reduction in ovariectomized rats.
  • IXH represents isoxanthohumol
  • 8PN represents 8-prenylnaringenin. * Means P ⁇ 0.05 and *** means P ⁇ 0.001.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Test 4 of the example.
  • the graph shows the results of examining the effect of isoxanthohumol, xanthohumol, isoacid, and beer on bone density reduction in ovariectomized rats.
  • IXH represents isoxanthohumol
  • XNT represents xanthohumol
  • E2 represents 17-estradiol.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of Test 5 of the example.
  • the graph shows the results obtained by examining the effect of barley tea to which isoxanthohumol was added on ovariectomy rats to suppress bone density loss.
  • OmgZL represents barley tea to which isoxanthohumol was not added, and 2 mg / Ls 10 mg / L and 50 mg / L were barley tea to which isoxanthohumol was added.
  • * means ⁇ ⁇ 0.05, ⁇ ⁇ 0.01, and ⁇ ⁇ 0.001, and no isoxanthohumol was added.
  • # means ⁇ ⁇ 0. 05, and means ⁇ ⁇ 0.01.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of Test 5 of the example.
  • the graph shows the results of examining the effect of green tea to which isoxanthohumol was added on ovariectomized rats to inhibit bone density loss.
  • OmgZL represents green tea to which isoxanthohumol was not added
  • 1 Omg / L represents green tea to which isoxanthohumol was added
  • its isoxanthohumol concentration was 1 OmgZL
  • E2 was 17 5- represents estradiol.
  • * means p ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, and p ⁇ 0.001, and no isoxanthohumol was added.
  • # means p ⁇ 0. 05 and ## means p ⁇ 0.01.
  • composition and the food or drink according to the present invention comprise isoxanthohumol or an isomerized hop extract containing isoxanthohumol as an active ingredient.
  • Isoxanthohumol can be obtained by isomerizing commercially available xanthohumol (for example, available from Apin Chemical Company) or high-purity xanthohumol purified from hops.
  • Purification of xanthohumol from a hop can be performed, for example, as follows.
  • the dried hops are extracted with ethanol, and the filtrate after filtration is concentrated under reduced pressure.
  • the obtained concentrate is subjected to a liquid-liquid partition treatment using hexane and an 85% ethanol aqueous solution to separate an ethanol aqueous layer, and the layer is concentrated under reduced pressure.
  • the obtained concentrate is dissolved in chloroform: hexane (5: 2) and passed through a silica gel column, and the fraction eluted with xanthohumol is collected from the obtained fraction.
  • the eluate of the fraction thus collected is concentrated under reduced pressure, and the recrystallization method using hexane and ethyl acetate is repeated, whereby purified xanthohumol can be obtained.
  • Xanthohumol can be isomerized by heating xanthohumol in the presence of an alkali or magnesium oxide, or by applying xanthohumol to other known methods.
  • a specific example of the isomerization treatment is as follows: after dissolving xanthohumol in an alcoholic solvent such as ethanol, adding weakly alcoholic water thereto and heating in the presence thereof (for example, By refluxing at about 93 ° C), xanthohumol can be thermally isomerized into isoxanthohumol.
  • the isoxanthohumol obtained by the isomerization treatment can be concentrated or purified by a known method (for example, filtration, concentration under reduced pressure, lyophilization, etc.) as necessary. Isomerized hop extract
  • the isomerized hop extract means a hop extract obtained by isomerizing a xanthohumol-containing hop extract obtained from hops by an extraction treatment or the like. That is, isomerized hop extract is basically obtained by obtaining an extract (hop extract) derived from the rubulin part of hops and actively isomerizing it.
  • the hop extract can be prepared, for example, by directly extracting or pulverizing a cone or a compact thereof and then subjecting it to an extraction operation.
  • Examples of the extraction operation include an extraction method using an ethanol solvent used as a method for preparing a hop extract used for beer brewing.
  • the extraction operation other commonly used Hop extraction methods may be employed. For example, (1) a method in which hop cones, crushed material, etc. are immersed in a solvent by cold immersion, hot immersion, or the like; (2) A method in which extraction is performed while heating, stirring, and filtering to obtain an extract. Or (3) a percollation method or the like can also be applied in the extraction operation.
  • the crude extract obtained by these extraction operations can be subjected to filtration or centrifugation as necessary to remove solids.
  • the obtained liquid may be used as it is as a pop extract, but may be used after the solvent contained therein is distilled off and a part thereof is concentrated or dried.
  • the extract obtained after concentration or drying may be further purified by washing with an insoluble solvent, or may be further dissolved or suspended in a suitable solvent.
  • the obtained hop extract (liquid) may be used as a dried hop extract extract by conventional means such as drying under reduced pressure and freeze drying.
  • Solvents usable in the extraction include, for example, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as water, methanol, ethanol, propanol and butanol; lower alkyl esters such as ethyl acetate; ethylene glycol, butylene glycol Glycols such as coal, propylene glycol and glycerin; polar solvents such as ethyl ether, acetone and acetic acid; hydrocarbons such as benzene and hexane; known non-polar solvents such as ethers such as ethyl ether and petroleum ether. Organic solvents. These solvents may be used in combination of two or more.
  • an extract containing xanthohumol is obtained using a solvent such as ethanol or water, and the extract is subjected to a supercritical carbon dioxide extraction method to extract the extract contained therein.
  • a hop extract containing more xanthohumol can be obtained.
  • insolubles may be removed from the hop extract by filtration, or the solvent may be evaporated to dryness by concentration under reduced pressure or the like.
  • the hop extract thus obtained contains at least xanthohumol.
  • the obtained hop extract may contain, in addition to xanthohumol, a very small amount of its isomer, isoxanthohumol.
  • the hop extract non-isomerized bopp extract
  • this hop extract is further isomerized to obtain an isomerized hop extract, which is used in the present invention.
  • a hop extract containing xanthohumol is dissolved in an alcoholic solvent such as ethanol, then weakly water is added thereto, and the mixture is heated in the presence thereof.
  • the hop extract is thermally isomerized by refluxing (for example, at about 92 to 93 ° C.) to obtain an isomerized hop extract containing isoxanthohumol.
  • the obtained isomerized hop extract may be concentrated or purified by a known method (for example, filtration, concentration under reduced pressure, lyophilization, etc.) as necessary.
  • the isomerized hop extract is obtained by isomerizing the xanthohumol-containing hop extract obtained by extraction with an ethanol-based solvent. More preferably, at this time, the catabolism is performed by heating and refluxing the hop extract in alkaline water.
  • the ethanol-based solvent refers to a solvent mainly composed of ethanol or ethanol and water.
  • the isomerized hop extract obtained by the isomerization treatment may be directly used for the production of a composition or a food or drink, but it is preferable that the active ingredient in the hop extract is contained at a higher concentration. Get a painting and use it.
  • the isomerized hop extract used as an active ingredient of the composition or food or drink according to the present invention has a higher isoxanthohumol concentration than that obtained by simply isomerizing the hop extract. You can have
  • a commercially available hop extract extracted by various methods may be obtained and isomerized to be used as an isomerized hop extract, but a commercially available isomerized hop extract may be used as it is. You may.
  • the above-mentioned isomerized hop extract containing isoxanthohumol at a high concentration can be obtained by concentrating a normal isomerized hop extract obtained by isomerizing a hop extract extracted from a hop according to a conventional method. It can be easily obtained by adding isoxanthohumol or removing components other than isoxanthohumol.
  • hop extract for example, a hop extract obtained by extracting crushed hop cones with ethanol and fractionating the extract by supercritical carbonic acid extraction to increase the xanthohumol content (for example, Xanthohumol-enriched hop product)
  • Product name j available from Hops teiner
  • Xantho-pure trade name
  • the isomerized hop extract used as an active ingredient of the composition or the food or drink according to the present invention contains isoxanthohumol in an amount of 0.05 to 90% by weight. And more preferably 8 to 90% by weight.
  • a product containing a high concentration of isoxanthohumol can be produced (that is, without giving excessive bitterness).
  • purified isoxanthumol or a hop extract with an increased xanthohumol content eg, Xanthohumol-enriched nop product (trade name), Hopsteiner Isomerized hop extract containing a high concentration of isoxanthohumol, which is obtained by isomerizing products containing about 80% xanthohumol (Xantho-pure (trade name), available from Hopsteiner).
  • Xantho-pure trade name
  • menopausal osteoporosis The mechanism of onset of menopausal osteoporosis is complex and diverse, and many aspects have not yet been elucidated. There is a limit in explaining the effectiveness of prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis based on estrogen agonist activity alone. In fact, in Japan, for example, preparations without estrogen agonist activity are mainly used clinically due to their side effects.
  • isoxanthohumol significantly improved the decrease in bone density due to the blockage of estrogen secretion from the ovaries. This suggests that isoxanthohumol may directly or indirectly act on osteoclasts to suppress bone resorption.
  • isoxanthohumol was found to have estrogenic activity in in vitro experiments, but was observed in ovariectomized rats in young rats. No uterine hypertrophy was observed even at a dose of at least 1000 times that attaining the effect of improving bone density reduction (see Test 3 in Examples described later). This suggests that isoxanthohumol has a different mechanism from the female hormone 17-estradiol, namely its interaction with estrogen receptor, but its selectivity for bone tissue over uterus. Is estimated to be high.
  • the composition or food or drink according to the present invention can suppress and improve the bone density reduction. Alternatively, it can be used for the purpose of prevention. Where possible, the composition or food or drink according to the invention may be used to increase bone density. Therefore, the composition or food according to the present invention can be used for preventing, treating or ameliorating osteoporosis. '
  • bone density refers to the amount of minerals such as calcium per fixed volume in the bones of a target mammal, and can be measured by a conventional method.
  • conventional methods include a method using X-rays (eg, DXA method, MD method, pQCT method) and a method using ultrasonic waves (eg, QS method). In the present invention, it can be measured, for example, according to Test 4 in Examples described later.
  • the method comprises administering or ingesting a mammal with an effective amount of isoxanthohumol or an isomerized hop extract containing isoxanthohumol.
  • a method for preventing is provided.
  • a method for preventing osteoporosis which comprises administering or ingesting a mammal with an effective amount of isoxanthohumol or isomerized hop extract for preventing, treating or ameliorating. Methods for treating or improving are provided.
  • the “effective amount” can be selected according to the dose of isoxanthohumol as described below.
  • the order to produce the inhibition or prevention composition for decreasing bone density, isoxanthohumol or c or even of another present invention the use of an isomerized hop extract is provided According to an embodiment, there is provided use of isoxanthohumol or isomerized hop extract for producing a composition for preventing, treating or ameliorating osteoporosis.
  • composition according to the present invention comprises isoxanthohumol or isomerized hop extract as an active ingredient.
  • composition according to the invention can be administered orally or parenterally.
  • Oral preparations include granules, powders, tablets (including sugar-coated tablets), pills, capsules, syrups, emulsions, and suspensions.
  • Parenteral preparations include injections (eg, subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections), instillations, and external preparations (eg, nasal preparations, transdermal preparations, ointments) ) And suppositories (eg, rectal suppositories, vaginal suppositories). These preparations can be formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier by a method commonly used in the art.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include excipients, binders, diluents, additives, flavors, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents, preservatives, etc.
  • excipients include excipients, binders, diluents, additives, flavors, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents, preservatives, etc.
  • magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, sugar, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, low-melting-point wax, cocoa yuichi, etc. are used as carriers.
  • Bisuhosufone Ichito preparations include preparations Can be manufactured, for example, as follows.
  • Oral preparations include, for example, excipients (eg, lactose, sucrose, starch, mannitol), disintegrants (eg, calcium carbonate, calcium carboxymethylcellulose), binders (eg, modified starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrroli) Don, hydroxypropylcellulose) or a lubricant (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 600) is added to the active ingredient and compression molded, and then, if necessary, taste masking, enteric coating or It can be produced by coating by a method known per se for the purpose of sustainability.
  • excipients eg, lactose, sucrose, starch, mannitol
  • disintegrants eg, calcium carbonate, calcium carboxymethylcellulose
  • binders eg, modified starch, gum arabic, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrroli) Don, hydroxypropylcellulose
  • a lubricant eg
  • the coating agent examples include ethylcellulose, hydroxymethylcellulose, polyoxyethylene glycol, cellulose acetate phthalate, hydroxypropylmethylcellulose phthalate and Eudragit (Rome's Doy, methacrylic acid / acrylic acid copolymer). , Gelatin, Pullulan or the like can be used.
  • Injectables are prepared by dispersing the active ingredient in a dispersant (for example, Tween 80 (manufactured by Atlas Pada Co., USA), HCO 60 (manufactured by Nikko Chemicals), polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, sodium alginate, etc.) , Preservatives (eg, methyl paraben, propyl paraben, benzyl alcohol, chlorobutanol, phenol), tonicity agents (eg, sodium chloride, glycerin, sorbitol, glucose, invert sugar), and aqueous solvents (eg, Manufactured by dissolving, suspending or emulsifying in distilled water, physiological saline, Ringer's solution, etc.
  • a dispersant for example, Tween 80 (manufactured by Atlas Pada Co., USA), HCO 60 (manufactured by Nikko Chemicals), polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, sodium alginate
  • oily solvents eg, vegetable oils such as olive oil, sesame oil, cottonseed oil, corn oil, and propylene glycol.
  • additives such as a solubilizing agent (for example, sodium salicylate, sodium acetate), a stabilizer (for example, human serum albumin), and a soothing agent (for example, benzalkonidum chloride, proforce hydrochloride) are added. It may be added.
  • compositions include a pH regulator (for example, carbonic acid, phosphoric acid, citric acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide), a preservative (for example, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzalkonidium chloride). ) May be further included.
  • a pH regulator for example, carbonic acid, phosphoric acid, citric acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide
  • a preservative for example, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzalkonidium chloride.
  • Suppositories can be prepared by preparing the active ingredient as an oily or aqueous solid, semi-solid or liquid composition.
  • an oily or aqueous base can be used.
  • the oleaginous base used in the composition includes glycerides of higher fatty acids (eg, cocoa butter, witepsol (manufactured by Dynamite Nobel)), intermediate fatty acids (eg, miglyols (manufactured by Dynamite Nobel)), or Vegetable oils (eg, sesame oil, soybean oil, cottonseed oil).
  • Aqueous bases include polyethylene glycols, Propylene glycol.
  • Examples of the aqueous gel base include natural gums, cellulose derivatives, vinyl polymers, and acrylic acid polymers.
  • the food or drink according to the present invention contains the active ingredient according to the present invention in an effective amount.
  • the active ingredient according to the present invention can be blended with the food or drink as it is or in the form of the composition described above. More specifically, the food or drink according to the present invention is prepared as a food or drink by directly or isomerizing the active ingredient according to the present invention or the above-mentioned ground hops or extract, various proteins, sugars, fats, trace amounts It may be prepared by further blending elements, vitamins, etc., or added to general food and drink.
  • “food and drink” is not limited to pharmaceuticals, and is not particularly limited as long as it can be ingested by mammals, and may be in any form of liquid, semi-liquid or solid It may be.
  • foods and beverages include, for example, beverages.
  • Foods and beverages also include those classified as health foods, functional foods, foods for specified health uses, and foods for the sick.
  • “food and drink” can be used to include feed when used for mammals other than humans.
  • the active ingredient in the present invention has a bone loss suppressing or preventing action.
  • the present invention is applied to health foods and functional foods taken as daily food supplements, foods containing one or more kinds of minerals such as calcium and magnesium, and vitamins such as vitamin K.
  • a food or drink can be provided which has functions of preventing, treating and improving the occurrence of osteoporosis, and preventing the osteoporosis spare group from shifting to osteoporosis.
  • the food or drink according to the present invention is a food or drink suitable for a consumer who wants to increase bone density or prevent its decrease, or a food or drink suitable for a consumer concerned about bone health, that is, a so-called specific Health food, can be provided as
  • ⁇ food for specified health use '' as used herein means that when manufacturing or selling food for the purpose of suppressing or preventing loss of bone density, each country may be subject to any legal restrictions in terms of health.
  • a certain food or drink is a food or drink suitable for a consumer who wants to increase bone density or prevent its decrease, or a food or drink suitable for a consumer concerned about bone health, that is, a so-called specific Health food.
  • foods and drinks include carbohydrate-containing foods and drinks such as rice, rice, bread and pasta; Western confectionery such as cookies and cakes; Japanese confectionery such as buns and yokan; candy and gums , Yogurt, pudding, and other confections such as frozen desserts and frozen desserts; various youth, soft drinks, milk drinks, tea drinks, functional drinks, nutritional supplements, non-alcohol beers, etc .; Beverages: processed products using eggs, fish and shellfish (squid, yuko, shellfish, eel, etc.) Processed products of livestock meat (including offal such as levers) (including delicacies).
  • the food or drink is a non-cereal-hop fermented food or drink.
  • non-food-hop fermented food or drink refers to a food or drink that does not contain a fermentation component (eg, beer, low-malt beer) obtained by performing fermentation using at least hop and food.
  • the non-cereal-hop fermented food / beverage product refers to a food / beverage product other than a fermented beverage containing hops as a raw material such as beer and low-malt beer.
  • the food or drink includes tea drinks, milk drinks, and yogurt.
  • the food or drink is a beverage.
  • tea drink refers to a drink for infusing tea leaves (tea leaves), which are evergreen trees of the genus Periflorida, or leaves or grains of plants other than tea trees, and is fermented tea, semi-fermented tea, and unfermented tea. Both types of tea are included.
  • tea beverages include Japanese tea (eg, green tea, barley tea), black tea, herbal tea (eg, jasmine tea), Chinese tea (eg, Chinese green tea, oolong tea), and Hojicha.
  • a milk beverage refers to a beverage made from raw milk, milk, or the like, or a food produced using these as a raw material.
  • milk and other raw materials for example, nutrient-enriched milk, flavored milk, and sugar-decomposed milk
  • processed milk such as milk as a raw material.
  • Yogurt includes hard, soft and drink types, as well as processed yogurt products made from yogurt.
  • the active ingredient or hop bitterness is It is preferable to use it in a range that does not affect the taste of the rice cake, or to take measures to mask the bitter taste.
  • foods and drinks derived from a hop such as a beer, a non-alcoholic beer, and a low-malt beer may already contain a certain amount or more of the active ingredient of the present invention. That is, such known isoxanthohumol-containing foods and drinks are not simply foods to which a pop component is added, but foods and drinks produced through a process of isomerization of a pop component. In the case of such foods and drinks, they can be used as they are as foods and drinks according to the present invention. Further, by blending isoxanthohumol or an extract containing the same or isomerized hop extract with these foods and drinks. The desired effect can be further enhanced or the effective intake can be reduced.
  • isoxanthohumol-containing food and drink examples include beer.
  • the content of isoxanthohumol in beer is, for example, from 0.04 to 3.4 mg / L as described above, but in beer, isohumulone, which is a bitter component, and has estrogenic activity. It also contains prenylnaringenin.
  • prenylnaringenin it is known that the content of 8-prenylnaringenin in beer varies widely from 1/6 to 1/3 of the isoxanthohumol content (J. Chromatogr. A 832, 97-107 1999).
  • hop extract in an isomerized form than to use purified isoxanthohumol from the viewpoint of cost.
  • isomerized hop extract when using isomerized hop extract in foods and drinks, it is desirable to consider the sensory points due to bitterness caused by isohumulones and the like. In this case, increase the hop extract or isoxanthohumol content with increased xanthohumol content. It is preferred that the content of isofumone in the food or drink relative to isoxanthohumol be relatively reduced by using the increased isomerized hop extract. Alternatively, the amount of hop, hop extract, or isomerized hop extract may be increased after masking the bitter component.
  • purified isoxanthohumol may be added to the food production process or final product, or isomerization may occur during the production process. If there is a step that causes a reaction, purified xanthohumol may be added before the step.
  • composition or food or drink according to the present invention is a hop extract component or a derivative thereof that has been ingested by humans as food or drink for many years, and therefore has low toxicity and is useful in mammals (eg, humans, mice, rats, rabbits, Can be safely used for dogs, cats, cats, dogs, horses, bush, monkeys, etc.).
  • mammals eg, humans, mice, rats, rabbits, Can be safely used for dogs, cats, cats, dogs, horses, bush, monkeys, etc.
  • the composition according to the present invention is used for the purpose of increasing the bone density of a mammal to be administered or suppressing, improving or preventing the decrease in the bone density (preferably, for the purpose of preventing, treating or improving osteoporosis)
  • the dose can be determined depending on the recipient, age and weight of the recipient, symptoms, administration time, dosage form, administration method, drug combination, and the like.
  • the active ingredient according to the present invention is orally administered as a medicament
  • 10 mgZkg: body weight, preferably in the range of 0.01 to 1 OmgZkg body weight can be administered once or several times daily in divided dose units.
  • the amount per adult is 5 mg / kg body weight per day as the amount of isoxanthohumol (30 mg per day per adult per day).
  • Amount can be administered in the following range, preferably in the range of lmg ⁇ kg body weight 'day or less.
  • the composition according to the present invention has an isoxanthohumol intake per adult ranging from 0.003 to 5 mgZkg body weight per day (per adult per 60 kg body weight per day). Isoxanthohumol intake in the range of 0.2-300 mg). More preferred In other words, the lower limit of the isoxanthohumol intake is 0.013 mg / kg body weight per day as the intake per adult (0 kg per adult per 60 kg body weight per day). 8 mg) or more, and more preferably 0.02 mg / kg body weight per day (1.2 mg per day for an adult weighing 60 kg per person).
  • the food or drink according to the present invention has an isoxanthohumol intake per adult ranging from 0.003 to 0.5 rng / kg body weight per day (one adult weighing 60 kg). Isoxanthohumol so that the daily intake of isoxanthohumol is in the range of 0.2 to 30 mg). More preferably, the lower limit of the isoxanthohumol intake is 0.013 mg / kg body weight per day as an intake per adult (0. 8 mg) or more, and more preferably 0.02 mg / kg body weight per day (1.2 mg per day for an adult with a body weight of 60 ⁇ per day).
  • the lower limit of isoxanthohumol intake is 0.00 SmgZkg body weight per day as an adult per person ((0,0 mg per adult per 60 kg body weight per day. 2 mg) is equivalent to administering 10 ml / kg of a test reagent with a concentration of 2 mg of isoxanthohumol, which was confirmed to be effective in Experiments 4 and 5 in the Examples described below.
  • the value obtained by converting the ratio of the body surface area of rat to that of the human is also obtained. 0 ⁇ 02 mg / kg body weight ⁇ day ((The daily intake per adult of 60 kg body weight is 1.2 mg).
  • the upper limit of isoxanthohumol intake is 0.5 mg / kg body weight per day for an adult ((3 adults per 60 kg body weight per day).
  • Omg) or less is based on the degree of dissolution of isoxanthohumol and eating experience, and a value higher than this does not deny the effect of suppressing bone density loss. Therefore, if possible, the food or drink may contain isoxanthohumol in an amount equal to or greater than the upper limit.
  • the food or drink has an isoxanthohumol intake per serving of 0.2 to 30 mg, more preferably 0.8 to 30 mg, and still more preferably 1.2 to 3 Omg. It contains isoxanthohumol in such an amount as follows.
  • the amount of isoxanthohumol taken at one time refers to the amount of isoxanthohumol contained in foods and drinks that a human consumes during eating behavior. Therefore, if there are foods and drinks that are supposed to be consumed by humans in a single eating behavior, “the amount of isoxanthohumol per serving” is the amount of isoxanthohumol contained in such foods and drinks. Equivalent to the amount of the mall.
  • the form of foods and drinks that humans expect to consume in a single eating behavior depends on the physical factors such as weight, age, gender, physical fitness, health status, etc., of the subjects who are expected to consume the foods and drinks. Can be set as appropriate by considering the expected environment or climate. For example, such food and beverage forms include beverages enclosed in containers in units ranging from 100 to 50 Oml (preferably 100 to 350 ml).
  • the isoxanthohumol intake (0.2 to 3 Omg) Isoxanthohumol. Therefore, the concentration of isoxanthohumol in this beverage ranges from 2 to 300 mg / L.
  • the 35 Oml beverage contains the isoxanthohumol intake (0.2 to 30 mg). ))
  • the beverage will have a concentration of isoxanthohumol in the range of 0.5 ⁇ to 85.7 mg / L.
  • Beer Korean Beer (Kirin Lager Beer (trade name), manufactured by Kirin Brewery Co., Ltd. (Japan)) (hereinafter abbreviated as "beer")
  • powdery hop extract Xanthohumol Enriched Product (trade name) containing a large amount of xanthohumol )
  • Xantho-pure trade name, both manufactured by Hopsteiner
  • HP LC analysis was confirmed by HP LC analysis and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy.
  • HP LC conditions for purity confirmation were as follows:
  • Hop extract (Xanthohumol Enriched Product (trade name)) 1 was added to water 11 ⁇ , and the mixture was boiled in a autoclave at 100 ° C for 120 minutes to be isomerized. After cooling to room temperature, the supernatant was filtered using filter paper to obtain a filtrate. Then, 800 ml of the filtrate was extracted using 1000 ml of Jetil ether. The jetilayer layer was dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. Thereafter, 2 Oml of ethyl acetate was added, and the mixture was again dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated under reduced pressure to about 1 ml.
  • the purity of the purified isoxanthohumol was confirmed by HPLC analysis and nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum measurement in the same manner as in the case of the above-mentioned purification from beer.
  • HP LC analysis confirmed that the purity of isoxanthohumol was greater than 98%.
  • Example C Formulation preparation
  • the following components were finely powdered, sufficiently stirred so as to form a uniform mixture, and then 0.2 g each was filled in a pullulan capsule or a gelatin capsule to prepare a capsule preparation.
  • the estrogen activity of the test substance was measured using the cell proliferation of MCF-7 cells derived from estrogen-sensitive human breast cancer as an index.
  • the cell line used expressed estrogen receptor, and enhanced cell proliferation was observed in the presence of estrogen-like substances. Therefore, estrogen activity was measured by measuring cell proliferation of this cell line using Cell Counting Kit (manufactured by Dojindo Laboratories).
  • the measurement of cell proliferation of MCF_7 cells using the Cell Counting Kit was performed using the WST-1 reagent [2- (4,5-dimethylthiazol-1-yl)]-2,5 —The formazan generated from diphenyltetrazolium, monosodium salt (2- (4,5-dimethylchiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium, monosodiuin salt) j is converted to a microplate reader (SOFTmax (Molecular Devices) )) was used to measure the absorbance at 450 nm.
  • WST-1 reagent [2- (4,5-dimethylthiazol-1-yl)]-2,5 —The formazan generated from diphenyltetrazolium, monosodium salt (2- (4,5-dimethylchiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium, monosodiuin salt) j is converted to a microplate reader (SOFTmax (Molecular Devices
  • Dextran-Coated Charcoal contains 10% fetal calf serum (Gibco), which has been removed by adsorbing endogenous raw I steroid, and further contains penicillin and streptomycin (each of which is included).
  • fetal calf serum Gibco
  • penicillin and streptomycin each of which is included.
  • 10,000 units, 1 mg / ml N Gibco, 0.1 mM non-essential amino acid (Gibco), ImM sodium pyruvate (Gibco), and l / g / ml insulin (human recombinant) MCF-7 cells were pre-cultured for 3 days using a DMEM medium containing 27.5 USP unit / mg: (Sigma)).
  • a cell suspension having a concentration of 8 ⁇ 1 OellsZml of the MCF-7 cells was prepared, and this was inoculated on a 96-well plate at 100-well.
  • the medium in the wells was replaced with a medium containing the test substance 0.1% ( ⁇ / ⁇ ) dissolved in dimethyl sulfoxide, and the culture was continued.
  • the medium in the gel was replaced again with a fresh medium containing the test substance, and on day 7 of culture, cell proliferation was measured using the Cell Counting Kit.
  • estradiol manufactured by Sigma
  • dimethyl sulfoxide dimethyl sulfoxide
  • the beer was degassed, applied to an ENVI-18 column (10 g, 60 ml, manufactured by Supelco) and eluted sequentially with 20%, 50%, 80% aqueous methanol and 180 ml of methanol, respectively.
  • the estrogen activity of each fraction was measured according to the method described above. As a result, the activity was confirmed in each of the eluted fractions of 80% methanol and methanol.
  • n-hexane 1: 7, 1: 4 and ethyl acetate were eluted in this order.
  • HP LC conditions were as follows:
  • the mass (MS) spectrum of the substance contained in Fr 8 was measured using a mass spectrometer (DX303 manufactured by JEOL Ltd.) according to the EI-MS method. At that time, ions were observed at mZz 354. This was consistent with the standard spectral pattern of isoxanthohumol.
  • 1 ⁇ 8 5111 was dissolved in 600/1 heavy dimethyl sulfoxide, and 1H-NMR, 13C-NMR ⁇ and 1H-NMR were measured using a nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometer (UNITY plus 500 type (manufactured by Varian)). Measurement of NOE SY-1D confirmed that the active ingredient of Fr8 was isoxanthohumol.
  • the analyzer used was an HP LC (HP1100 (Agilent)) connected to a triple-stage mass spectrometer (MSZMS) (Quattro Ultima (Micromass)).
  • HPLC HP1100 (Agilent)
  • MSZMS triple-stage mass spectrometer
  • Quattro Ultima Quattro Ultima (Micromass)
  • the conditions of the mass spectrometer were such that the ionization was electrospray ionization (E S 1_), the precursor ion was 338.3, the product ion was 218.8, the Cone voltage was 80 V, and the Collision energy was 20 eV.
  • FrI O contained a high concentration of 8-prenylnaringenin.
  • the analyzer used was a HPLC (HP1100 (manufactured by Agilent)) connected to a triple-stage mass spectrometer (MS MS) (Quattro Ultima (manufactured by Micromass)).
  • HPLC conditions at this time were as follows: Moving bed: Liquid A (acetonitrile), Liquid B (distilled water), and Liquid A 55% ⁇
  • the mass spectrometer conditions were electrospray ionization (ESI-1) for ionization, and both compounds were simultaneously quantitatively analyzed in MRM mode.
  • Quantitative ions and ionization conditions were as follows: for isoxanthohumol, precursor ion 352.8, product ion 232.8, Cone voltage 80 V, and Collision energy 18 eV.
  • the precursor ion was 338 ⁇ 3
  • the product ion was 218.8
  • the Cone voltage was 80 V
  • the Collision energy was 20 eV.
  • Estrogenic activities of purified isoxanthohumol and chemically synthesized 8-prenylnaringenin were measured in the same manner as in Test 1. However, at this time, the concentration of the test substance in the medium for culturing MCF-7 cells was set as follows.
  • Isoxanthohumol it said medium concentration, 1 ⁇ 0x l 0- 5, 1. 0x 10 ⁇ 1. 0 ⁇ 10- 7, 1 ⁇ Ox l O- 8, 1. 0x l 0_ 9, and 1 . 0 X 10 - 1 ° was added to a mo 1 / L.
  • Isoxanthohumol and 8-prenylnaringenin are both Gen activity. When these activities were compared to estradiol, the active is about 10 5 times the Isoki Santofumoru, 8-prenylnaringenin in one 10 2 Baidea.
  • Test 3 Evaluation of estrogen activity in vivo
  • the rats used were prepared as follows. First, 20-day-old Wistar female rats (available from Nippon Charles River Co., Ltd.) were selected so that the weight difference of each animal was within 10% of the average body weight, and then randomly selected as 6 animals per group. The animals were divided into groups and bred with water and AI N-76A (Clea Japan) freely.
  • isoxanthohumol or 8-prenylnaringenine is administered at a dose of 1, 5 or 25 mg once / day for 3 days at a dose of 10 ml / kg per day for 3 days.
  • a solvent peanut oil
  • 17 ⁇ -estradiol was orally administered at a dose of 400 zg / k day.
  • the uterus was removed from the rat, and its weight was weighed to measure the in vivo estrogen activity.
  • Isoxanthohumol unlike estradiol or 8-prenylnaringen, was found to have no, or only very weak, in vivo estrogenic activity on young rats.
  • the ovaries of a 9-week-old female SD rat were excised, and from the next day, the test substance was administered by gavage at a gastric volume of 1 O ml Zkg once daily for 28 days using an oral probe. .
  • the control group and the sham operation group were orally administered with a 0.8% aqueous ethanol solution in the same manner. As a positive control, 17? -Estradiol was used.
  • Beer domestic Pilsuna beer
  • isoxanthohumol contains 2.1 mg / g of isoxanthohumol and 43 g of 8-prenylnaringenin.
  • this was once freeze-dried and then dissolved in water to remove ethanol and used as a test substance in the test.
  • Isoxanthohumol is prepared by dissolving isoxanthohumol in a 0.8% aqueous ethanol solution so that it will have the same, 5-fold, and 20-fold concentration as that contained in beer. Was.
  • 'Xanthohumol an isomer of isoxanthohumol (ADin chemical A liquid diluted with water, prepared so that xanthohumol has the same concentration (2.1 mg / L) as isoxanthohumol contained in beer.
  • Bone density was measured by collecting rat femurs and measuring the trabecular bone density at the distal end using a PQCT (Peripheral Quantitative Computed Tomography) bone density analyzer (XCT-960A (Norland Stratech). )). The results were as shown in FIG. 5 and FIG.
  • ovariectomized group trabecular bone density in the femur was reduced, but was significantly improved by beer and isoxanthohumol administration. No such improvement was observed for 8-prenylnaringenin, which is considered to have the highest contribution of estrogen activity in beer.
  • isoarsenic acid containing xanthohumol disohumulones bone resorption inhibiting activities have already been reported by the Pit Formation Assay, but no activity similar to isoxanthohumol was observed in these.
  • the bilateral ovaries of a 9-week-old female SD rat were excised, and from the next day, the test solution was intragastrically orally administered at a dose of 1 Oml Zkg using an oral sonde once a day for 28 days. Water was orally administered to the control group and the sham operation group in the same manner. As a positive control, 17-estradiol dissolved in peanut oil was used and administered subcutaneously in an amount of 10 1gZkg / day.
  • Barley tea extracted in the same manner as in Example D, but not containing isoxanthohumol, Barley tea containing isoxanthohumol at concentrations of 2 mg / L, 10 mg / L, and 50 mg / L, respectively.
  • the measurement of the bone density was performed in the same manner as in Test 4 described above.
  • the cancellous bone density in the femur of the ovariectomized group (OVX) was lower than that in the sham-operated group, but the bone density of the group that received the drink containing isoxanthohumol was lower than that of the control that received water. Significantly higher than the group, an improvement effect on bone density reduction was observed. On the other hand, in the case of a beverage containing no isoxanthohumol, no improvement effect on bone density reduction was observed.
  • Green tea is generally considered to contain a large amount of tea-powered techin, which is known to suppress the activity of osteoclasts involved in bone resorption (Biocheiu Biophys Res Commun 292 (1), 94-101 (2002) )).
  • tea-powered techin which is known to suppress the activity of osteoclasts involved in bone resorption.
  • no effect of suppressing osteopenia in ovariectomized rats was observed. Therefore, even in the case of green tea, the improvement effect on bone density reduction was recognized only by adding isoxanthohumol (Fig. 8).

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Abstract

本発明は、イソキサントフモールまたは異性化ホップエキスを有効成分として含んでなる、骨密度減少の抑制または予防用の組成物、またはそのような用途の飲食品に関する。本発明によれば、エストロゲン製剤を使用した場合に起こりうる副作用の問題を回避しつつ、骨密度減少の抑制または予防をすることができる。

Description

明 細 書 骨密度減少の抑制または予防用組成物および飲食品 [発 明 の 背 景]
発明の分野
本発明は、 骨密度減少の抑制または予防用組成物、 および飲食品に関する。 さ らに詳しくは、 本発明は、 骨粗鬆症の予防、 治療または改善用組成物、 および骨 粗鬆症の予防、 治療または改善用の飲食品に関する。
背景技術
骨粗鬆症は、 低骨量と骨組織の微細構造の破綻とによつて特徴づけられる疾患 であり、 骨の脆弱性亢進と骨折危険率の増大に結びつく疾患である。 骨粗鬆症は 世界中で大きな健康問題となっており更年期女性の 3人に 1人、 高齢者の多くが 男女とも罹患している。 骨粗鬆症による骨折は、 例えば日本国において 「寝たき り」 となる原因の第 3位であり、 医療費の増加を招く原因の一つにもなる。 また、 高齢化社会の進展に伴い、 その患者数はさらに増加するものと考えられる。 この ため、 骨粗鬆症を予防、 治療または改善するための医薬の開発はきわめて重要で あるといえる。
4 0歳代以降に徐々に進行する骨量減少の要因は、 加齢に伴って腸管からの力 ルシゥム吸収性が低下するためであり、 また体内ビ夕ミン D 3量の低下により力 ルシゥムに関するホメォス夕シスを保っために副甲状腺ホルモンの分泌が亢進す るためと推定される。 中でも女性の場合には、 骨形成を促進し、 かつ、 骨吸収を 抑制していた女性ホルモンが更年期に減少し、 その結果、 急激な骨量減少がもた らされることが多い。
現在までのところ、 臨床的に使用されている骨粗鬆症治療製剤としては、 例え ば、 ビタミン D製剤、 カルシトニン製剤、 エストロゲン製剤、 イブリフラボン製 剤、 ビタミン K 2製剤、 夕ンパク同化ステロイ ド製剤、 およびビスホスフォネ一 ト製剤が知られている。 このうちエストロゲン製剤は、 閉経後骨粗鬆症の予防ま たは治療に有効であることが知られているが、 不正出血、 乳がんや子宮ガンの発 生リスクを上昇させるなど副作用が伴うことが知られている。
薬剤による骨粗鬆症の治療は、 長期間にわたることが多く、 投与の長期化によ る副作用の発現など種々の問題が無視できない。 このため、 現在までのところ、 薬剤による骨粗鬆症の治療は、 根本的な治療を目的としたものではなく、 疾病の 進行を抑制するなどの対症療法によるものである。
また、 骨粗鬆症に関しては予防的な措置を講じることは極めて重要であると考 えられている。 しかしながら、 薬剤投与による日常的な骨粗鬆症の予防は、 経済 性、 安全性の面から実現されるには至っていない。
したがって、 安全性に優れ、 日常的に使用可能な骨粗鬆症の予防または治療剤 が望まれている。 この場合、 食経験のある食品から、 骨粗鬆症の予防または治療 効果のある成分を見出すことは、 安全性の面からも望ましいといえる。
一方、 薬物投与療法以外の骨粗鬆症の予防のためには、 カルシウムをはじめと する種々の栄養素の適切な摂取と同時に過剰なアルコール摂取の制限、 禁煙、 運 動などの生活習慣の改善が提言されている。 薬物は、 生体にとって異物であり、 副作用を念頭においた治療が必要であることからも、 非薬物的な治療法は有効で ある。 中でも、 日々摂取する食事による療法は重要であると考えられており、 骨 粗鬆症の予防、 治療または改善に効果のある優れた食品の開発が望まれている。 ホヅプは、 ョ一ロヅパ原産のクヮ科多年草 (学名： Hmmilus luplus ) であり、 一般的には、 その毬果 （雌花が成熟したもの） をホップと呼んでいる。 ホップは、 ビールの苦味、 香りづけに用いられることで有名であり、 長く人々が摂取してき ている。 この苦味および香りは、 ホップのルプリン部分 （毬果の内苞の根元に形 成される黄色の顆粒） よりもたらされる。 ホヅプは、 民間薬としても用いられて おり、 鎮静効果、 入眠および安眠効果、 食欲増進、 健胃作用、 および利尿作用な どの生理効果が知られている。
ホップ成分であるフムロン類ゃキサントフモールについては、 in vitroの実験 によって骨吸収抑制作用を有していることが示されている （特開平 7— 3 3 0 5 9 4号公報、 特開平 7— 2 8 5 8 5 6号公報、 および Biosci Biotech Biochem 61( 1 )， 158-159 ( 1997) ) 。 また、 ビール摂取によって骨密度の減少が抑制され、 これがホップ由来の活性であることも報告されている （形山幹生ら、 モデルラットにおけるビールの骨密度減少抑制効果」 、 第 5 6回日本栄養 '食糧 学会大会 講演要旨集 （社団法人日本栄養 ·食糧学会） 、 平成 1 4年 （2 0 0 2 年） 6月 2 0日発行、 3 2 6頁、 31- 10p) 。
ホヅプにエストロゲン活性があることは以前から知られている （例えば Munch . Med. Wschr.95, 845 ( 1953 )) 。 また 1 9 9 9年になって、 ホップから女性ホル モン活性物質として 8—プレニルナリンゲニンが単離されている （J. Clinical Endocrinology & Metabolism 83(6) , 2249-2252 ( 1999 )) 。 したがって、 その活 性に基づき、 8—プレニルナリンゲニン含量を著しく高めたホップ濃縮物を閉経 後骨粗鬆症の予防または治療に利用することも考えられるが、 エストロゲン製剤 の場合と同様に副作用を生じるリスクがある。
ホヅプ成分の異性化物としては、 例えばイソフムロン類 （イソひ酸類） 、 イソ キサントフモールが知られている。 これらは、 ビール製造の過程 （麦汁煮沸工程 中） において、 添加されたホップ成分が異性化されることによってビール中に生 じる。 因みに、 ビール中のイソキサントフモール含有量は、 0 . 0 4〜3 . 4 m g/Lであるとの報告がある （J. Chromatogr . A 832 ( 1999 ) p97-107) 。 同様 にビール中のィソフムロン類の含有量は、 最も含有量の多いと思われるタイプの ビ——レ (Foreign Extra Stout： Guiness Malays isa Berhad 社製：出典 Brauind ustrie ) で約 6 0 m gZLであるとの報告がある。
W 0 0 1 / 7 6 6 1 4には、 植物由来の成長因子産生増強物質を含む食品およ び飲料等が開示されており、 この成長因子産生増強物質としてイソキサントフモ ールが挙げられている。 またこの成長因子産生増強物質が、 肝細胞増強因子 （H G F ) および神経成長因子 （N G F ) の産生増強作用を有し、 肝障害、 胃腸障害、 肺炎、 糖尿病等の疾患の治療用途へ利用可能なことも開示されている。
しかしながら、 イソキサントフモールの骨粗鬆症改善作用に関しては本発明者 らの知る限り、 何も知られていない。 イソフムロン類は、 前記特開平 7— 3 3 0 5 9 4号公報において、 フムロン類と併記して有効成分として挙げられているが、 ここにはィソフムロン類が骨吸収抑制作用を有するとの具体的証拠は一切示され ていない。 [発 明 の 概要]
本発明者らは、 今般、 ビール等に含まれる異性化されたホップ由来成分が、 骨 密度減少を抑制もしくは予防する優れた効果を有することを見出した。 この効果 は、 骨粗鬆症の予防、 治療または改善に有効であると考えられるものであった。 またこの効果がイソキサントフモールに基づくものであって、 イソキサントフモ —ルの効果はその類似化合物であるキサントフモールの効果に比べてより優れて いることを見出した。 本発明はこれらの知見に基づくものである。
よって本発明は、 骨粗鬆症を予防、 治療または改善するために用いられる組成 物および飲食品であって、 優れた安全性と活性を有するもの提供をその目的とす る。
本発明による骨密度減少の抑制または予防用組成物は、 イソキサントフモール を有効成分として含んでなる。 また本発明によるこの組成物は、 イソキサントフ モールを含有する異性化ホップエキスを、 有効成分として含んでなるものであつ てもよい。
本発明による骨粗鬆症の予防、 治療または改善用組成物は、 イソキサントフモ ールを有効成分として含んでなる。 - また本発明による骨粗鬆症の予防、 治療または改善用組成物は、 イソキサント フモールを含有する異性化ホップエキスを有効成分として含んでなる。
本発明による骨密度減少の抑制もしくは予防用の飲食品は、 イソキサントフモ ール、 またはィソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを含んでなる ものである。
本発明による非穀物-ホップ発酵型の飲食品は、 成人 1日あたりのイソキサン トフモール摂取量が 0 . 0 0 3〜0 . 5 m g/k g体重となる量でイソキサント フモールを有効成分として含んでなるものである。
本発明の別の態様によれば、 本発明による非榖物-ホップ発酵型の飲食品は、 1回当たりのイソキサントフモール摂取量が、 0 . 2 ~ 3 O m gとなる量でイソ キサントフモールを有効成分として含んでなるものである。
本発明による組成物または飲食品の有効成分は、 骨密度減少を抑制または予防 する優れた効果を有するものであり、 さらに骨密度を増大させる効果を示すこと も期待される。 この有効成分は、 長年飲食品として飲用されてきたビール等に含 まれている。 したがって、 本発明による組成物または飲食品は、 患者または骨粗 鬆症の予防を望む者が長期間にわたって服用または喫食しても副作用がほとんど なく、 安全性に優れている。 また、 本発明による組成物または飲食品は、 目的と する効果が期待される用量の 1000倍以上の用量の場合であっても、 幼若ラヅ トに対してエストロゲン作用が見られない。 このため、 本発明によれば、 ェスト ロゲン製剤の場合のようなエストロゲン作用を介した副作用、 例えば、 不正出血、 乳がんや子宮ガンの発生リスクの上昇を回避しつつ、 骨粗鬆症の予防、 治療また は改善に関する優れた効果を得ることができる。
[図面の簡単な説明]
図 1は、 実施例の試験 2の結果を示すグラフである。 グラフは、 MCF—7細 胞の増殖を指標とする、 ィソキサントフモールおよび 8—プレニルナリンゲニン のエストロゲン活性を示す。 図中、 I XHはイソキサントフモール、 8PNは 8 ープレニルナリンゲニン、 および E 2は 17 ?—エストラジオールを表す。
図 2は、 実施例の試験 3—aの結果を示すグラフである。 グラフは、 幼若ラッ トに対するイソキサントフモールおよび 8—プレニルナリンゲニンの in vivoェ ストロゲン作用を調べた結果を表す。 図中、 I XHはイソキサントフモール、 8 PNは 8—プレニルナリンゲニン、 および E 2は 17 ?—エストラジオ一ルを表 す。 また *は P<0. 05および * * *は P< 0. 001を意味する。
図 3は、 実施例の試験 3— bの結果を示すグラフである。 グラフは、 卵巣摘出 ラヅトに対するイソキサントフモール、 8—プレニルナリンゲニン、 およびビー ルの in vivoエストロゲン作用を調べた結果を表す。 図中、 IXHはイソキサン トフモール、 および 8 PNは 8—プレニルナリンゲニンを表す。 また は P < 0. 001を意味する。
図 4は、 実施例の試験 3— bの結果を示すグラフである。 グラフは、 卵巣摘出 ラヅトに対するイソキサントフモール、 およびビールの in vivoエストロゲン作 用を調べた結果を表す。 図中、 IXHはイソキサントフモール、 および E2は 1 7 ?—エストラジオ一ルを表す。 また ***は P<0. 001を意味する。 図 5は、 実施例の試験 4の結果を示すグラフである。 グラフは、 卵巣摘出ラヅ トに対するイソキサントフモール、 8—プレニルナリンゲニン、 およびビールの 骨密度減少抑制作用を調べた結果を表す。 図中、 IXHはイソキサントフモール、 および 8 PNは 8—プレニルナリンゲニンを表す。 また *は Pく 0. 05および ***は P<0. 001を意味する。
図 6は、 実施例の試験 4の結果を示すグラフである。 グラフは、 卵巣摘出ラッ トに対するイソキサントフモール、 キサントフモール、 イソ 酸およびビールの 骨密度減少抑制作用を調べた結果を表す。 図中、 IXHはイソキサントフモール、 XNTはキサントフモール、 ひはイソひ酸含有ホップエキス、 および E2は 17 ?—ェストラジオ一ルを表す。 また *は Pく 0. 05および * は P< 0. 0 01を意味する。
図 7は、 実施例の試験 5の結果を示すグラフである。 グラフは、 卵巣摘出ラヅ トに対するイソキサントフモールを添加した麦茶の骨密度減少抑制作用を調べた 結果を表す。 図中、 OmgZLはィソキサントフモールを添加していない麦茶を 表し、 2 mg/Ls 10 mg/L、 および 50 mg/Lはイソキサントフモール を添加した麦茶であって、 それぞれのイソキサントフモール濃度を表し、 E2は 1 β—エストラジオールを表す。 また、 水を投与したコントロール群に対して *は ρ<0. 05、 は ρ<0. 01、 および は ρ<0. 001である ことを意味し、 またイソキサントフモールを添加していない麦茶に対して、 #は ρ<0. 05、 は ρく 0. 01であることを意味する。
図 8は、 実施例の試験 5の結果を示すグラフである。 グラフは、 卵巣摘出ラッ トに対するィソキサントフモールを添加した緑茶の骨密度減少抑制作用を調べた 結果を表す。 図中、 OmgZLはイソキサントフモールを添加していない緑茶を 表し、 1 Omg/Lはィソキサントフモールを添加した緑茶であってそのィソキ サントフモール濃度が 1 OmgZLであることを表し、 E2は 17 5—エストラ ジオールを表す。 また、 水を投与したコントロール群に対して *は p< 0. 05、 は p<0. 01、 および は p<0. 001であることを意味し、 また イソキサントフモールを添加していない緑茶に対して、 #は p<0. 05、 ## は p<0. 01であることを意味する。 [発明の具体的説明]
ィソキサントフモール
本発明による組成物および飲食品は、 前記したように、 有効成分としてイソキ サントフモール、 またはイソキサントフモールを含有する異性化ホヅプエキスを 含んでなる。
イソキサントフモールは、 市販のキサントフモール （例えば、 Apin chemical 社より入手可能） 、 またはホップより精製される高純度のキサントフモールを、 異性化することによって得ることができるものである。
ホヅプからのキサントフモールの精製は、 例えば下記のようにして行うことが できる。 乾燥ホップをエタノール抽出し、 ろ過後ろ液を減圧濃縮する。 次いで、 得られた濃縮物に、 へキサンと 8 5 %エタノール水溶液を用いた液—液分配処理 を行って、 エタノール水溶液層を分取し、 この層を減圧下で濃縮する。 得られた 濃縮物をクロ口ホルム：へキサン ( 5 : 2 ) に溶解させ、 シリカゲル系カラムに 通して、 得られる画分の内から、 キサントフモール溶出画分を分取する。 分取さ れた画分の溶出液を減圧濃縮し、 へキサンおよび酢酸ェチルを用いた再結晶法を 繰り返すことによって、 精製キサントフモールを得ることができる。
キサントフモールの異性化は、 キサントフモールを、 アルカリまたは酸化マグ ネシゥムの存在下において加熱するか、 またはその他の公知の方法にキサントフ モールを付すことによって行うことができる。
異性化処理の具体例を挙げると、 キサントフモールをエタノール等のアルコー ル性溶媒に溶解した後、 ここに弱アル力リ性の水を加えて、 その存在下において 加熱 （例えば、 9 2 ~ 9 3 °C程度） して還流することによって、 キサントフモー ルを熱異性化して、 イソキサントフモールとすることができる。 異性化処理によ り得られたイソキサントフモールは、 必要に応じて、 公知の方法 （例えば、 ろ過、 減圧濃縮、 凍結乾燥等） により濃縮したり、 精製したりすることができる。 異性化ホップエキス
本発明において、 異性化ホップエキスとは、 ホップから抽出処理等により得ら れるキサントフモール含有ホップエキスを異性化することによって得られるホッ プエキスを意味する。 すなわち、 異性化ホヅプエキスは、 基本的には、 ホップの ルブリン部に由来する抽出物 （ホップエキス） を得、 これを積極的に異性化する ことによって得られるものである。
ホップエキスは、 例えば毬花やその圧縮物をそのままもしくは粉砕した後、 抽 出操作に供することによって、 調製することができる。
抽出操作としては、 例えば、 ビール醸造に用いられるホップエキスの調製法と して用いられる、 エタノール溶媒による抽出法が挙げられる。 また該抽出操作と しては、 その他の一般に用いられるホヅプ抽出法を採用してもよい。 例えば、 ( 1 ) 溶媒中にホップの毬花、 その粉砕物などを冷浸、 温浸等によって浸漬する 方法； （2 ) 加温し攪拌しながら抽出を行い、 濾過して抽出液を得る方法；また は （3 ) パーコレ一シヨン法等も、 前記抽出操作において適用することができる。 これら抽出操作によって得られた粗抽出物は、 必要に応じて、 ろ過または遠心 分離に付すことによって固形物を除去することができる。 得られた液は、 これを そのままホヅプエキスとして用いてもよいが、 そこに含まれる溶媒を留去して一 部を濃縮または乾燥させた後、 用いてもよい。 また、 濃縮または乾燥後に得られ た抽出物は、 さらに非溶解性溶媒を用いて洗浄して精製してもよく、 またこれを さらに適当な溶剤に溶解もしくは懸濁させてもよい。 さらに本発明においては、 得られたホップエキス （液体） を、 減圧乾燥、 凍結乾燥等の慣用の手段によって、 ホップ抽出エキス乾燥物として、 これを使用してもよい。
前記抽出において使用可能な溶媒としては、 例えば、 水、 メタノール、 ェタノ —ル、 プロパノールおよびブ夕ノール等の炭素数 1〜4の低級アルコール；酢酸 ェチルエステル等の低級アルキルエステル；エチレングリコ一ル、 ブチレングリ コール、 プロピレングリコール、 グリセリンなどのグリコール類；ェチルェ一テ ル、 アセトン、 酢酸等の極性溶媒；ベンゼンやへキサン等の炭化水素；ェチルェ —テルや石油エーテルなどのエーテル類等の非極性溶媒の公知の有機溶媒が挙げ られる。 これら溶媒は、 2種以上を組み合わせてもよい。 本発明の一つの好ましい態様によれば、 エタノール、 水などの溶媒を用いてキ サントフモールを含む抽出液を得、 該抽出液を超臨界二酸化炭素抽出法に付して、 そこに含まれるひ酸、 および/?酸画分を除去することによって、 キサントフモー ルをより多く含むホップエキスを得ることができる。 この場合、 必要に応じて、 前記ホップエキスから不溶物をろ過によって除去したり、 減圧等により濃縮して 溶媒を乾固させてもよい。
このようにして得られたホップエキスは、 キサントフモールを少なくとも含有 するものである。 このとき、 得られたホップエキスが、 キサントフモールに加え その異性化物であるイソキサントフモ一ルを極少量含む場合がある。 このような 場合、 このホップエキス (非異性化ボップエキス) を本発明においてそのまま使 用してもよい。 しかしながら、 通常は、 このホップエキスをさらに異性化するこ とによって、 異性化ホップエキスを得、 これを本発明において使用する。
ホップエキスの異性化は、 ホップエキスを、 アルカリまたは酸化マグネシウム の存在下において加熱するか、 またはその他の公知の方法にホップエキスを付す ことによって行うことができる。 これにより、 ホップエキス中のキサントフモ一 ルはィソキサントフモールに変換される。
異性化処理の具体例を挙げると、 キサントフモールを含むホップエキスを、 ェ 夕ノール等のアルコール性溶媒に溶解した後、 ここに弱アル力リ性の水を加えて、 その存在下において加熱 (例えば、 9 2〜9 3 °C程度） して還流することによつ て、 ホップエキスを熱異性化して、 イソキサントフモールを含む異性化ホップェ キスを得ることができる。 得られた異性化ホップエキスは、 必要に応じて、 公知 の方法 （例えば、 ろ過、 減圧濃縮、 凍結乾燥等） により濃縮したり、 精製したり してもよい。 なお、 前記異性化処理において使用する弱アルカリ性 （例えば、 p H 8 . 5〜9 . 5 ) の水として、 例えば、 飲料用アルカリイオン水などのような 市販の水 （例えば、 ボトルドウォー夕一） を使用することが、 安全性の観点から は望ましい。 市販の飲料の水であれば、 摂取されてきた経験が充分にあるなど、 安全性が高い。 また、 ビール醸造の麦汁煮沸過程で熱異性化されて生成する反応 様式と前記異性化処理は本質的に同等であるので、 飲食品を提供する観点からは 安全性が高い。 したがって、 本発明の一つの好ましい態様によれば、 異性化ホップエキスは、 エタノール系溶媒による抽出に.より得られたキサントフモール含有ホップエキス を、 異性化することによって得られるものである。 より好ましくは、 このとき異 性化は、 ホップエキスを、 アルカリ性の水中において加熱還流することによって 行われる。 ここでエタノール系溶媒とは、 主としてエタノールまたはエタノール と水とからなる溶媒などをいう。
本発明においては、 前記異性化処理により得られた異性化ホップエキスを組成 物または飲食品の製造に直接使用しても良いが、 好ましくは、 その中の有効成分 をさらに高濃度で含有する分画物を入手してこれを使用する。
したがって本発明の好ましい態様によれば、 本発明による組成物または飲食品 の有効成分として使用する異性化ホップエキスは、 ホップエキスを単に異性化し て得られるものよりもさらに高いイソキサントフモール濃度を有するものである ことができる。
本発明においては、 種々の方法で抽出された市販のホップエキスを入手して、 これを異性化して異性化ホップエキスとして使用してもよいが、 市販されている 異性化ホップエキスをそのまま使用してもよい。
また前記したイソキサントフモールを高濃度に含む異性化ホップエキスは、 ホ ヅプより抽出されたホップエキスを異性化して得られる通常の異性化ホップェキ スを、 慣用の方法にしたがって、 濃縮したり、 イソキサントフモールを添加した り、 またはイソキサントフモール以外の成分を除去したりすることによって、 容 易に得ることができる。
また市販のホップエキスとして、 例えば、 ホップ毬花粉砕物をエタノール抽出 した後、 超臨界点炭酸抽出法により分画し、 キサントフモール含有量を高めてな るホップエキス (例えば、 Xanthohumol -enriched hop product 品名 j、 Hops teiner社より入手可能） 、 および、 キサントフモールが約 8 0 %含まれる製品 (Xantho-pure (商品名） 、 Hopsteiner社より入手可能） が存在する。 これらを 異性化することによって、 イソキサントフモールを高濃度に含む異性化ホップェ キスを製造することができる。
なお、 これらのエキスより、 さらに有効成分を高濃度に含有する分画物を前記 等の方法も含めて濃縮して得ることができることは言うまでもない。 本発明のより好ましい態様によれば、 本発明による組成物または飲食品の有効 成分として使用する異性化ホップエキスは、 イソキサントフモールを、 0 . 0 0 5〜9 0重量％含有してなるものであり、 さらに好ましくは、 8〜9 0重量％含 有してなるものである。
また、 飲食品において、 飲食品の製造工程に加熱工程等のキサントフモールを 異性化する工程がある場合には、 前述したホップエキス、 好ましくは通常のホヅ プエキスに比べてキサントフモール含有量を高めたホップエキスを、 飲食品の当 該加熱工程前に加えておくことによって、 最終製品中にイソキサントフモールを 含有させてもよい。 このような飲食品の代表的な例として、 ビール、 発泡酒等を 挙げることができる。 ビール、 発泡酒では、 麦汁煮沸工程で上記ホップエキスを 添加することにより、 最終製品中にィソキサントフモールを含有させることがで きる。 キサントフモール含有量を高めたホップエキスをこのような形で使用すれ ば、 ビールの苦味成分であるイソフムロン類の濃度を必要以上に高めることなく
(すなわち過度の苦味を与えることなく） 、 イソキサントフモールを高濃度に含 有した製品を製造できる。 もちろんこのような異性化工程がある場合でも、 前述 のように、 精製イソキサントフモール、 或いは、 キサントフモール含有量を高め たホップエキス (例、 Xanthohumol -enriched nop product (商品名) 、 Hopstein er社より入手可能） 、 さらにキサントフモールが約 8 0 %含まれる製品 (Xantho -pure (商品名） 、 Hopsteiner社より入手可能） 等を異性化してなるイソキサン トフモールを高濃度に含む異性化ホップエキスを、 製造工程または最終製品に添 加する態様を除外するものではない。 用途
卵巣摘出した動物およびヒトにおいては、 破骨細胞の活性化、 および骨吸収の 増加が認められる。 しかしながら、 通常、 女性ホルモンを加えることによりこれ らに伴う骨量の減少は見られなくなる。 このような作用がどのようにして発現す るかはまだ明らかではないが、 骨吸収に関与するサイ ト力イン I L 1、 I L 6、 T G F ?、 プロス夕グランジン Eなどが複雑に関与していると考えられている。 また、 女性ホルモンの欠乏によって、 骨吸収が亢進することに加え、 小腸からの カルシウム吸収が抑制されることも骨量減少の原因と考えられる。
さらに、 女性ホルモンは核内レセプ夕一と結合することによってその活性を発 現するが、 近年、 ひ、 /5の 2つのタイプのレセプ夕一が存在することが明らかと なっている。 近年、 ある器官には女性ホルモンとして作用するが、 別の組織に対 しては拮抗的に作用する薬剤 （S E R M) の開発が進んでおり、 副作用の少ない 薬剤として期待が寄せられている。 このように器官によって作用が異なるメカ二 ズムを 2種類のレセプ夕一タイプから説明することが検討されている。
閉経性の骨粗鬆症の発症メカニズムは複雑多岐にわたり、 いまだ解明されてい ない部分も多く、 エストロゲンァゴニスト活性のみから閉経後骨粗鬆症の予防、 治療の有効性を説明するのは限界がある。 事実、 例えば日本国においては、 その 副作用からエストロゲンァゴニスト活性がない製剤が主として臨床的に使用され ている。
後記する卵巣摘出ラットを用いた実施例の試験 4に示すように、 イソキサント フモールは、 卵巣からのエストロゲン分泌が遮断されることによる骨密度低下を 有意に改善した。 このことから、 イソキサントフモールは、 破骨細胞に直接的ま たは間接的に作用して骨吸収を抑制している可能性が推測される。 一方、 実施例 の試験 2に示すようにィソキサントフモールには in vitroの実験においてエスト ロゲン活性を有することが明かになっているが、 幼若ラヅトにおいては卵巣摘出 ラヅ卜で認められた骨密度減少改善作用が発現する 1 0 0 0倍以上の投与量にお いても、 子宮肥大作用が認められなかった (後述する実施例の試験 3参照) 。 こ のことから、 イソキサントフモールは、 女性ホルモンである 1 7 ?—エストラジ オールとは異なる機構、 すなわちエストロゲンレセプ夕一との相互作用はあるも のの、 子宮よりも骨組織への選択性が高いものと推測される。
したがって、 従来のエストロゲン製剤による薬物療法の場合には、 不正出血、 乳がんや子宮ガンの発生リスクの上昇などの副作用が懸念されるのに対して、 本 発明による有効成分を用いた場合には、 前記副作用を回避しつつ、 骨粗鬆症を予 防、 治療、 または改善することができる。
したがって、 本発明による組成物または飲食品は、 骨密度減少の抑制、 改善も しくは予防を目的として使用することができる。 可能であれば、 本発明による組 成物または飲食品を、 骨密度を増大させるために使用してもよい。 よって、 本発 明による組成物または食品は、 骨粗鬆症の予防、 治療または改善に用いることが できる。 '
ここで 「骨密度」 とは、 対象となる哺乳動物の骨における、 一定容積当たりの カルシウム等のミネラル量のことをいい、 慣用の方法により測定することができ る。 そのような慣用の方法としては、 X線を用いる方法 （例えば、 D X A法、 M D法、 p Q C T法） および超音波を用いる方法 （例えば、 Q U S法） が挙げられ る。 本発明においては、 例えば、 後述する実施例の試験 4にしたがって測定する ことができる。
本発明によれば、 有効量のイソキサントフモールまたはイソキサントフモール を含有する異性化ホップエキスを哺乳動物に投与するかまたは摂取させることを 含んでなる、 哺乳動物の骨密度減少を抑制または予防する方法が提供される。 ま た本発明によれば、 予防、 治療または改善上の有効量のイソキサントフモールま たは異性化ホップエキスを、 哺乳動物に投与するかまたは摂取させることを含ん でなる、 骨粗鬆症を予防、 治療または改善する方法が提供される。 ここで 「有効 量」 は、 後述するようなイソキサントフモールの投与量にしたがって選択するこ とができる。
本発明の別の態様によれば、 骨密度減少の抑制もしくは予防用組成物を製造す るための、 イソキサントフモールまたは異性化ホップエキスの使用が提供される c また本発明のさらに別の態様によれば、 骨粗鬆症の予防、 治療または改善用組成 物を製造するための、 ィソキサントフモールまたは異性化ホップエキスの使用が 提供される。 組成物および飲食品
本発明による組成物は、 イソキサントフモールまたは異性化ホップエキスを有 効成分として含んでなるものである。
ここで 「有効成分として含んでなる」 とは、 所望する剤型に応じた薬学上許容 されうる担体を含んでいてもよいことは当然として、 併用可能な他の薬剤を含有 する場合も包含する意味である。
本発明による組成物は、 経口投与または非経口投与することができる。 経口剤 としては、 顆粒剤、 散剤、 錠剤 （糖衣錠を含む） 、 丸剤、 カプセル剤、 シロップ 剤、 乳剤、 懸濁剤が挙げられる。 非経口剤としては、 注射剤 （例えば、 皮下注射 剤、 静脈内注射剤、 筋肉内注射剤、 腹腔内注射剤） 、 点滴剤、 外用剤 （例えば、 経鼻投与製剤、 絰皮製剤、 軟膏剤） 、 坐剤 （例えば、 直腸坐剤、 膣坐剤） が挙げ られる。 これらの製剤は、 当分野で通常行われている手法により、 薬学上許容さ れうる担体とともに製剤化することができる。
薬学上許容されうる担体としては、 賦形剤、 結合剤、 希釈剤、 添加剤、 香料、 緩衝剤、 增粘剤、 着色剤、 安定剤、 乳化剤、 分散剤、 懸濁化剤、 防腐剤等が挙げ られ、 例えば、 炭酸マグネシウム、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク、 砂糖、 ラクト一ス、 ぺクチン、 デキストリン、 澱粉、 ゼラチン、 トラガント、 メチルセ ルロース、 ナトリウムカルボキシメチルセルロース、 低融点ヮヅクス、 カカオバ 夕一等を担体として使用することができる。
併用可能な他の薬剤としては、 例えば、 アミノ酸、 抗生物質、 ビタミン D製剤、 カルシトニン製剤、 エストロゲン製剤、 イブリフラボン製剤、 ビタミン K 2製剤、 タンパク同化ステロイド製剤、 およびビスホスフォネ一ト製剤などが挙げられる 製剤は、 例えば下記のようにして製造することができる。
経口剤は、 例えば賦形剤 （例えば、 乳糖、 白糖、 デンプン、 マンニトール） 、 崩壊剤 （例えば、 炭酸カルシウム、 カルボキシメチルセルロースカルシウム） 、 結合剤 （例えば、 化デンプン、 アラビアゴム、 カルボキシメチルセルロース、 ポリビニールピロリ ドン、 ヒドロキシプロピルセルロース） 、 または滑沢剤 （例 えば、 タルク、 ステアリン酸マグネシウム、 ポリエチレングリコール 6 0 0 0 ) を有効成分に添加して圧縮成形し、 次いで必要により、 味のマスキング、 腸溶性 もしくは持続性の目的のため自体公知の方法でコ一ティングすることにより製造 することができる。 コーティング剤としては、 例えばェチルセルロース、 ヒドロ キシメチルセルロース、 ポリオキシエチレングリコール、 セルロースアセテート フタレート、 ヒドロキシプロピルメチルセルロースフ夕レートおよびオイドラギ ヅ ト （ローム社製、 ドィヅ、 メタアクリル酸 ·アクリル酸共重合物） 、 ゼラチン、 プルランなどを用いることができる。
注射剤は、 有効成分を分散剤 （例えば、 ツイーン（Tween) 8 0 (アトラスパゥ ダ一社 （米国） 製） 、 H C O 6 0 (日光ケミカルズ製） 、 ポリエチレングリコ一 ル、 カルボキシメチルセルロース、 アルギン酸ナトリウムなど） 、 保存剤 （例え ば、 メチルパラベン、 プロピルパラベン、 ベンジルアルコール、 クロロブタノ一 ル、 フヱノール）、 等張化剤 （例えば、 塩化ナトリウム、 グリセリン、 ソルビト —ル、 ブドウ糖、 転化糖） などと共に、 水性溶剤 （例えば、 蒸留水、 生理的食塩 水、 リンゲル液等） または油性溶剤 （例えば、 オリ一ブ油、 ゴマ油、 綿実油、 コ —ン油などの植物油、 プロピレングリコール） などに溶解、 懸濁または乳化する ことにより製造することができる。 この際、 所望により溶解補助剤 （例えば、 サ リチル酸ナトリウム、 酢酸ナトリウム）、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミ ン） 、 無痛化剤 (例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力イン） 等の添加物 を添加してもよい。
外用剤は、 有効成分を固状、 半固状または液状の組成物とすることにより製造 することができる。 例えば、 上記固状の組成物は、 有効成分をそのまま、 または 賦形剤 （例えば、 ラクト一ス、 マンニトール、 デンプン、 微結晶セルロース、 白 糖） 、 増粘剤 （例えば、 天然ガム類、 セルロース誘導体、 ァクリル酸重合体) な どを添加して混合し、 粉状とすることにより製造できる。 上記液状の組成物は、 注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。 半固状の組成物は、 水性もしく は油性のゲル剤、 または軟骨状のものがよい。 また、 これらの組成物は、 いずれ も p H調節剤 (例えば、 炭酸、 リン酸、 クェン酸、 塩酸、 水酸化ナトリウム) 、 防腐剤 (例えば、 パラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブ夕ノール、 塩化ベン ザルコニゥム） などをさらに含んでいてもよい。
坐剤は、 有効成分を油性または水性の固状、 半固状または液状の組成物とする ことにより製造できる。 この場合、 油性または水性基剤を使用することができる。 該組成物に用いる油性基剤としては、 高級脂肪酸のグリセリド （例えば、 カカオ 脂、 ウイテプゾル類 （ダイナマイトノーベル社製） ） 、 中級脂肪酸 （例えば、 ミ グリオール類 （ダイナマイトノ一ベル社製） ） 、 または植物油 （例えば、 ゴマ油、 大豆油、 綿実油） が挙げられる。 水性基剤としては、 ポリエチレングリコール類、 プロピレングリコールが挙げられる。 また、 水性ゲル基剤としては、 天然ガム類、 セルロース誘導体、 ビニール重合体、 アクリル酸重合体が挙げられる。 本発明による飲食品は、 本発明による有効成分を有効量含有してなるものであ る。
ここで 「有効成分を有効量含有してなる」 とは、 個々の飲食品を通常喫食され る量摂取した結果に、 後述するような範囲で有効成分が摂取されるような量で有 効成分を含有することをいう。 本発明による飲食品には、 本発明による有効成分 をそのまままたは上記のような組成物の形態で、 飲食品に配合することができる。 より具体的には、 本発明による飲食品は、 本発明による有効成分または前述する ホップの粉碎物もしくは抽出物をそのまままたは異性化して、 飲食品として調製 したもの、 各種タンパク質、 糖類、 脂肪、 微量元素、 ビタミン類等をそれらにさ らに配合して調製したもの、 または、 一般の飲食品へ添加したものであってもよ い。
本発明において、 「飲食品」 は、 医薬以外のものであって、 哺乳動物が摂取可 能なものであれば特に制限はなく、 その形態も液状、 半液体状または固体状のい ずれのものであってもよい。 このため飲食品には、 例えば飲料の形態も包含され る。 また飲食品には、 健康食品、 機能性食品、 特定保健用食品、 病者用食品のよ うな分類のものも包含される。 さらに 「飲食品」 は、 ヒト以外の哺乳動物を対象 として使用される場合には、 飼料を含む意味で用いることができる。
本発明における有効成分は、 骨量減少抑制または予防作用を有する。 このため、 日常摂取する食品ゃサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品、 好適に は、 カルシウム、 マグネシゥム等のミネラル類、 ビタミン K等のビタミン類を 1 種以上含有する食品等に、 本発明の有効成分を配合することによって、 骨粗鬆症 の発症の予防、 治療および改善、 並びに骨粗鬆症予備群の骨粗鬆症への移行防止 といった機能を併せ持つ飲食品を提供することができる。
よって、 本発明による飲食品は、 骨密度を高めることもしくはその低下防止を 希望する消費者に適した飲食品、 または、 骨の健康が気になる消費者に適した飲 食品、 すなわち所謂、 特定保健用食品、 として提供することができる。 なお、 こ こでいう特定保健用食品とは、 骨密度減少の抑制もしくは予防を目的として食品 の製造または販売等を行う場合に、 保健上の観点から、 各国において法上の何ら かの制限を受けることがある飲食品をいう。
飲食品の具体例としては、 飯類、 麵類、 パン類およびパス夕類等の炭水化物含 有飲食品；クッキーやケーキなどの洋菓子類、 饅頭や羊羹等の和菓子類、 キャン ディ一類、 ガム類、 ヨーグルトやプリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；ジ ユース、 清涼飲料水、 乳飲料、 茶飲料、 機能性飲料、 栄養補助飲料、 ノンアルコ ールビール等の各種飲料； ビール、 発泡酒等のアルコール飲料；卵を用いた加工 品、 魚介類 （イカ、 夕コ、 貝、 ゥナギなど） ゃ畜肉 （レバ一等の臓物を含む） の 加工品 （珍味類を含む） などが挙げられる。
好ましくは、 飲食品は、 非穀物-ホップ発酵型の飲食品である。 ここで 「非榖 物-ホップ発酵型の飲食品」 とは、 少なくともホップと榖物とを原料として発酵 を行うことによって得られる発酵成分 (例えばビール、 発泡酒） を含有しない飲 食品をいう。 すなわち、 非穀物-ホップ発酵型の飲食品とは、 ビールおよび発泡 酒のような原料としてホップを含む発酵飲料以外の飲食品をいう。 飲食品として 非榖物-ホップ発酵型のものを使用して、 これに、 イソキサントフモールを有効 量添加することにより、 骨の健康の回復、 維持または増進を図ることができる。 本発明の一つのより好ましい態様によれば、 飲食品としては、 茶飲料、 乳飲料、 ヨーグルトが挙げられる。 本発明の別の一つの好ましい態様によれば、 飲食品は、 飲料である。
ここで茶飲料とは、 ヅバキ科の常緑樹である茶樹の葉 （茶葉） 、 または茶樹以 外の植物の葉もしくは穀類等を煎じて飲むための飲料をいい、 発酵茶、 半発酵茶 および不発酵茶のいずれも包含される。 茶飲料の具体例としては、 日本茶 (例え ば、 緑茶、 麦茶） 、 紅茶、 ハーブ茶 （例えば、 ジャスミン茶） 、 中国茶 （例えば、 中国緑茶、 烏龍茶） 、 ほうじ茶等が挙げられる。
ここで乳飲料とは、 生乳、 牛乳等またはこれらを原料として製造した食品を主 原料とした飲料をいい、 牛乳等そのもの材料とするものの他に、 例えば、 栄養素 強化乳、 フレーバー添加乳、 加糖分解乳等の加工乳を原料とするものも包含され る。 またヨーグルトには、 ハードタイプ、 ソフトタイプ、 ドリンクタイプのいずれ のものも包含され、 さらにヨーグルトを原料とする加工ョ一グルト製品も包含さ れる。
本発明による有効成分またはホップの粉砕物もしくは抽出物を異性化したもの を、 一般食品の原料に添加配合して食品とする場合は、 後述するように、 有効成 分もしくはホップの苦みが飲食品の味に影響しない範囲で用いるか、 または苦味 がマスクされるような工夫をすることが好ましい。
また、 ビ一ル、 ノンアルコールビール、 発泡酒などのようなホヅプ由来の飲食 品には、 一般的に、 本発明における有効成分が既に一定量以上含まれていること がある。 すなわち、 このような公知のイソキサントフモール含有飲食品は、 単に ホヅプ成分を添加したものでなく、 ホヅプ成分が異性化される工程を経て製造さ れた飲食品である。 このような飲食品の場合、 これらをそのまま本発明による飲 食品として使用することができるが、 さらに、 これら飲食品に、 イソキサントフ モールもしくはそれを含むエキス、 または異性化ホップエキスを配合することに よって、 所望の効果をさらに増強することができ、 または有効摂取量を低減させ ることができる。
公知のイソキサントフモール含有飲食品の例としては、 ビールが挙げられる。 ビール中におけるイソキサントフモール含有量は、 前記したように例えば 0 . 0 4〜3 . 4 m g/Lであるが、 ビール中には、 その苦味成分であるイソフムロン 類やエストロゲン活性を有する 8—プレニルナリンゲニンも含有されている。 例 えば、 ビール中における 8—プレニルナリンゲニンの含有量は、 イソキサントフ モール含有量の 6分の 1〜 1 3 3分の 1と広い幅があることが知られている （J. Chromatogr . A 832 , 97-107 1999 ) 。
本発明による飲食品においては、 精製したィソキサントフモ一ルを用いるより は、 ホップエキスを異性化させた形で用いることがコスト的な問題からは有利で あると考えられる。
また、 飲食品中に異性化ホップエキスを使用する場合には、 イソフムロン類等 により生ずる苦味による官能的な点も考慮することが望ましい。 この場合、 キサ ントフモール含有量を高めたホップエキスまたはイソキサントフモール含有量を 高めた異性化ホヅプエキスを用いて、 イソキサントフモールに対するィソフム口 ン類の飲食品中における含有量を相対的に低くすることが好ましい。 あるいは、 苦味成分をマスクした上で、 ホップ、 ホップエキス、 または異性化ホップエキス の添加量を増加させてもよい。
なお、 飲食品においても、 コスト的な問題がほとんど無いのであれば、 精製ィ ソキサントフモールを食品の製造工程または最終製品中に添加してもよいし、 ま たは、 製造工程中に異性化反応をもたらす工程がある場合には該工程前に精製キ サントフモールを添加しておいてもよい。
本発明による組成物または飲食品は、 人類が飲食品として長年摂取してきたホ ップ抽出成分またはその誘導物であることから、 毒性も低く、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥシ、 ゥマ、 ブ夕、 サル等) に対 し安全に用いることができる。
本発明による組成物を、 投与する哺乳動物の骨密度の増大またはその骨密度減 少の抑制、 改善もしくは予防を目的として用いる場合 （好ましくは、 骨粗鬆症の 予防、 治療または改善を目的として用いる場合） 、 その投与量は、 受容者、 受容 者の年齢および体重、 症状、 投与時間、 剤形、 投与方法、 薬剤の組み合わせ等に 依存して決定できる。 例えば、 本発明による有効成分を医薬として経口投与する 場合、 成人一人あたり、 0. 01〜： L 0 OmgZkg体重、 好ましくは 0. 02 〜50mgZkg体重、 非経口的に摂取する場合は 0. 005〜10mgZkg: 体重、 好ましくは 0. 01〜 1 OmgZkg体重の範囲で 1日 1回または数回の 投与単位に分割して投与することができる。
異性化ホップエキスを有効成分として用いた場合には、 成人一人あたりの摂取 量が、 イソキサントフモール量として 5 mg/kg体重 ' 日 （成人 1人 1日あた り 30 Omgの範囲の摂取量） 以下の範囲、 好ましくは lmg^kg体重 ' 日以 下の範囲となるように投与することができる。
本発明の好ましい態様によれば、 本発明による組成物は、 成人一人あたりのィ ソキサントフモール摂取量が、 0. 003〜5 mgZkg体重 ' 日の範囲 （体重 60 k gの成人 1人 1日あたりのイソキサントフモール摂取量が 0. 2〜300 mgの範囲） となるような量のイソキサントフモールを含んでなる。 より好まし くは、 前記イソキサントフモール摂取量の下限値は、 成人一人あたりの摂取量と して、 0. 013mg/kg体重 ' 日 （体重 60 k gの成人 1人 1日あたりの摂 取量として 0. 8mg) 以上であり、 さらに好ましくは、 0. 02mg/kg体 重 '日 （体重 60kgの成人 1人 1日あたりの摂取量として 1. 2mg) 以上で あ
本発明の好ましい態様によれば、 本発明による飲食品は、 成人一人あたりのィ ソキサントフモール摂取量が、 0. 003〜0. 5 rng/k g体重 ' 日の範囲 (体重 60kgの成人 1人 1日あたりのイソキサントフモール摂取量が 0. 2〜 30mgの範囲） となるような量のイソキサントフモールを含んでなる。 より好 ましくは、 前記イソキサントフモール摂取量の下限値は、 成人一人あたりの摂取 量として、 0. 013mg/kg体重 '日 （体重 60kgの成人 1人 1日あたり の摂取量として 0. 8mg) 以上であり、 さらに好ましくは、 0. 02 mg/k g体重■ 日 （体重 60 ^の成人1人1日あたりの摂取量として 1 · 2mg) 以 上である。
なおここで、 イソキサントフモール摂取量の下限値である、 成人一人あたりの 摂取量としての 0. 00 SmgZkg体重 ·日 （ （体重 60 kgの成人 1人 1日 あたりの摂取量としての 0. 2mg) は、 後述する実施例の実験 4および実験 5 において、 効果の確認されたイソキサントフモール濃度 2 mgZLの被験試薬を 10 ml/kg投与した場合に相当し、 詳しくは、 この投与量をラヅ卜とヒ卜の 体表面積の比から換算して得られた値である。 またこの投与量をラットの体重当 たりの値に換算して得られた値は成人一人あたりの摂取量では 0 · 02mg/k g体重 · 日 （ （体重 60 kgの成人 1人 1日あたりの摂取量は 1. 2mg) であ る。
また飲食品の場合のィソキサントフモール摂取量の上限値が、 成人一人あたり の摂取量として 0. 5mg/kg体重 · 日 （ （体重 60kgの成人 1人 1日あた りの摂取量として 3 Omg) 以下であるとしたのは、 イソキサントフモ一ルの溶 解度および食経験を考慮したものであり、 それ以上の値であっても、 骨密度減少 の抑制効果が否定されるものではない。 したがって、 可能であれば、 前記上限値 以上の量のィソキサントフモールを含む飲食品であってもよい。 本発明の一つの好ましい態様によれば、 飲食品は、 1回当たりのイソキサント フモール摂取量が、 0. 2〜30mg、 より好ましくは 0. 8~30mg、 さら に好ましくは 1. 2〜3 Omgとなる量でイソキサントフモールを含んでなるも のである。
ここで 「1回当たりのイソキサントフモール摂取量」 とは、 ヒトが 1回当たり 喫食行動において摂取する飲食品中に含まれるイソキサントフモール量をいう。 したがって、 ヒトが 1回の喫食行動で摂取することを想定した飲食品がある場合 には、 「1回当たりのイソキサントフモール摂取量」 は、 そのような飲食品中に 含まれるイソキサントフモール量に相当する。
ヒトが 1回の喫食行動で摂取することを想定した飲食品の形態は、 飲食品の摂 取が予想される対象者の体重、 年齢、 性別、 体力、 健康状態等の身体的要因や、 摂取が予想される環境または気候等を考慮することにより適宜設定することがで きる。 例えば、 そのような飲食品の形態としては、 100〜50 Oml (好まし くは 100〜 350ml) の範囲の量の単位で容器に封入された飲料が挙げられ る。
1回で摂取することを想定した飲食品の形態が、 10 Omlのボトル入り飲料 である場合には、 その 10 Omlの飲料には、 前記イソキサントフモール摂取量 (0. 2〜3 Omg) に相当する量のィソキサントフモールが含まれることにな る。 したがって、 この飲料のイソキサントフモール濃度は、 2〜300 mg/L の範囲となる。 同様に、 1回で摂取することを想定した飲食品の形態が、 350 mlのボトル入り飲料である場合には、 その 35 Omlの飲料には、 前記イソキ サントフモール摂取量 （0. 2〜30mg) に相当する量のイソキサントフモ一 ルが含まれることになり、 この飲料のイソキサントフモール濃度は、 0. 5 Ί〜 85. 7mg/Lの範囲となる。
さらに具体例を挙げて説明すると、 このような飲食品の形態について、 100 ml、 200 mlおよび 350 m 1の各容量単位のボトル入り飲料中のィソキサ ントフモール濃度は下記表 Aの通りである。 表 A
Figure imgf000024_0001
上記表を利用するかまたは換算して、 飲料のイソキサントフモール濃度を設定 することによって、 所望する容量単位を 1回に摂取することを想定した飲料を、 容易に調製することができる。
[実 施 例]
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定され るものではない。
製造例：
例 A： イソキサントフモールの精製
ビール (キリンラガービール (商品名) 、 キリンビール株式会社 (日本国) 製） (以下において 「ビール」 と略す) 、 およびキサントフモールを多く含む粉 末状のホップエキス (Xanthohumol Enriched Product (商品名) および Xantho - p ure (商品名) 、 ともに Hopsteiner社製) からのィソキサントフモールの精製例 を以下に示す。
ビールからの精製
ビール 100 Omlを脱気し、 その 800mlを 100 Omlのジェチルェ一 テルを用いて抽出した。 ジェチルエーテル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、 減 圧濃縮した。 その後、 酢酸ェチル 20mlを加え、 再度、 無水硫酸ナトリウムで 脱水し、 約 lmlまで減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィ ― (Kieselgel60, 10 g) を用いて分画した。 カラムは 30 %酢酸ェチル /n 一へキサンを用いて洗浄した後、 60%酢酸ェチル /n—へキサンを用いて溶出 した。 溶出画分を減圧乾固し、 メタノール 3 m'lに溶解させ、 さらに蒸留水 3 m 1を加え、 これを HPLCによりさらに精製した。 HPLCの条件は下記の通り であった：
移動層： 45%ァセトニトリル、 および 55%蒸留水、
カラム： YMC- 0DS- AQ 25x250顧 （YMC社製） 、
ガードカラム： YMC-0DS-AQ 25 x 50mm (YMC社製） 、
流速： lOmlZ分、 注入量 3ml、
検出器波長： UV290nm。
精製されたィソキサントフモールの純度を、 HP L C分析および核磁気共鳴 (NMR) スペクトル測定によって確認した。 純度確認のための HP L Cの条件 は、 下記の通りであった：
移動層： A液 （ァセトニトリル） 、 B液 （蒸留水） 、 および A液 20%〜 100%によるグラジェント溶出、
カラム： YMC -hydrosphere C184.6x250丽 (YMC社製) 、
流速： lml /分、 注入量 5〃 1、
検出器波長： UV290nm。
この HP L C分析によって、 イソキサントフモールの純度が 98%以上である ことが確認された。
精製されたィソキサントフモール 1 mgを 800 mlの重メタノールに溶解し、 核磁気共鳴 （NMR) スペクトル装置 (JNM-A400 (日本電子社製) ) を 用いて 1 H— NMR測定を行った。
この NMR測定よつて、 単離精製されたイソキサントフモールの化学シフトは 文献で報告されている値と一致し、 単一組成であることが確認された。
ホップエキスからの精製 1
ホップエキス （Xanthohumol Enriched Product (商品名） ） 1 を水11^に加 え、 これをォ一トクレーブにて 100°Cで 120分間煮沸して、 異性化した。 室 温に冷ました後、 上清をろ紙を用いてろ過して、 ろ液を得た。 次いで、 ろ液 80 0mlを 1000mlのジェチルェ一テルを用いて抽出した。 ジェチルェ一テル 層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、 減圧濃縮した。 その後、 酢酸ェチル 2 Oml を加え、 再度、 無水硫酸ナトリウムで脱水し、 約 lmlまで減圧濃縮した。 これ をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （Kieselgel60, 10 g) を用いて分画 した。 カラムは 30%酢酸ェチル /n—へキサンを用いて洗浄した後、 60%酢 酸ェチル n—へキサンを用いて溶出した。 溶出画分を減圧乾固し、 メタノール 3mlに溶解させ、 さらに蒸留水 3mlを加え、 これを HP L Cによりさらに精 製した。 HPLCの条件は下記の通りであった：
移動層： 45%ァセトニトリル、 および 55%蒸留水、
カラム，： YMC-ODS- AQ 25 X 250 mm、
ガ一ドカラム： YMC- ODS- AQ 50 x 25 mm、
流速： 10ml Z分、 注入量 3 m 1、
検出器波長： UV290nm。
精製されたィソキサントフモールの純度を、 前記したビールからの精製の場合 と同様にして、 HPLC分析および核磁気共鳴 (NMR) スぺクトル測定によつ て確認した。
HP L C分析によって、 イソキサントフモールの純度が 98%以上であること が確認された。
NMR測定よつて、 単離精製されたイソキサントフモールの化学シフトは文献 で報告されている値と一致し、 単一組成であることが確認された。
ホップエキスからの精製 2
ホップエキス (Xantho-pure (商品名） ) 2. 5 g'を、 50mlのエタノール に溶解し、 ここに 50mlの 10 N水酸化ナトリゥム水溶液および蒸留水を加え 500mlにメスアップした。 これを、 沸騰水浴中で 1時間煮沸し異性化した後、 室温に冷まし、 ここに 12 Nの塩酸を 45 ml添加した。 次いで、 得られた溶液 を、 冷却後グラスウールフィル夕一にて吸引ろ過した。 ろ取物に 1. 2Lのェ一 テルおよび 0. 8 mlの蒸留水を加えて、 液液分配抽出を 2回行って、 得られた エーテル層を減圧乾固した。 これに少量の酢酸ェチルおよびへキサンを加えて、 再結晶を繰り返し、 純度 98%以上のイソキサントフモールを得た。 例 B ： ホップエキスの異性化
キサントフモールを約 80 %含む市販のホップエキス （Xantho-pure (商品 名） ） 18 gを、 2 Lのエタノールに溶解し、 ここに pH 8. 5〜9. 5の弱ァ ルカリ性のボトルドウオーター （アルカリイオンの水 （商品名） 、 キリンビバレ ヅジ社製） 18 Lを加えた。 これを 92〜 93 °Cにおいて 2時間、 還流下で熱異 性化した。 次いで、 不溶物をろ紙にてろ過した後、 ろ液を減圧濃縮し、 凍結した これを凍結乾燥することによって、 粉末状の異性化ホヅプエキス約 18 g¾得た c この粉末状異性化ホップエキスは、 イソキサントフモールを約 70%含有するも のであった。
なお、 前記例 Aの 「ホップエキスからの精製 2」 の欄と同様にして精製を行う ことによって、 純度 98%以上のイソキサントフモールを得ることができた。 例 C ： 製剤の調製
下記成分を細かく粉末にし、 均一な混合物になるように充分攪拌した後、 これを 0. 2 gずつプルランカプセルまたはゼラチンカプセルに充填して、 カプセル製 剤を調製した。
例 Bで得られた異性化ホップエキス 20 g
コーンスターチ 1880 g
ナ夕ネ硬化油 100 g 例 D ： 飲食品の調製 （ィソキサントフモール含有飲料の調製)
市販の麦茶用の麦 40 gに、 2 Lの沸騰した湯を加えた後、 これを 5分間煮沸 して麦茶を抽出した。 ここにそれそれ 2 mg/L、 1 Omg/Lヽ および 50m gZLの濃度となるようにィソキサントフモールを添加して、 イソキサントフモ —ル含有麦茶飲料を調製した。 ここでイソキサントフモールは、 前記例 Aの 「ホ ヅプエキスからの精製 2」 において得られたものを使用した。
同様にして、 市販の緑茶葉 50 gに、 2 Lの沸騰した湯を加えた後、 これを 5 分間煮沸して緑茶を抽出した。 ここに 10mg/Lの濃度となるようにイソキサ ントフモールを添加して、 ィソキサントフモール含有緑茶飲料を調製した。 評価試験：
試験 1 ： ビール中のエストロゲン活性成分の特定
1 -a) エストロゲン活性の測定法
被検物質のエストロゲン活性を、 エストロゲン感受性ヒト乳癌由来 MCF— 7 細胞の細胞増殖を指標として測定した。 使用した細胞株は、 エストロゲンレセプ 夕一を発現しており、 エストロゲン様物質の存在下では細胞増殖の亢進が認めら れるものであった。 したがって、 この細胞株の細胞増殖を Cell Counting Kit (同仁化学研究所製） を用いて測定することによって、 エストロゲン活性を測定 した。
該 Cell Counting Kitによる M C F _ 7細胞の細胞増殖の測定は、 細胞内に取 り込まれた WS T— 1試薬 [2— (4, 5—ジメチルチアゾ一ル一 2—ィル) ― 2， 5—ジフェニルテトラゾリウム， モノナトリウム塩 (2- (4，5- dimethylchiaz ol-2-yl )-2, 5-diphenyltetrazolium, monosodiuin salt ) j から生じるフオルマ ザンを、 マイクロプレートリーダ一 （SOFTmax (Molecular Devices社製） ） を用 いて 450 nmの吸光度を測定することによって行った。
より具体的には、 Dextran -Coated Charcoal (Sigma社製) に内因' I生ステロイ ド を吸着させて除去した牛胎仔血清 （Gibco社製） を 10%含み、 さらにぺニシリ ンおよびストレプトマイシン (それそれ 10000単位、 1 mg/mlN Gibco 社製） 、 0. 1 mM非必須アミノ酸 （Gibco社製） 、 ImMピルビン酸ナトリウ ム (Gibco社製) 、 および、 l /g/mlインスリン (ヒト組換え体 27.5USP un it/mg: (Sigma社製） ） を含む D M E M培地を用いて、 MCF— 7細胞を 3日間 前培養した。 この MCF— 7細胞の濃度 8 x 1 O ellsZmlの細胞懸濁液を調製 し、 これを 96ゥエルプレ一ト上に 100 1ノゥエルで播種した。 培養 1日後、 ジメチルスルホキシドに溶解した被検物質 0. 1%(ν/ν)を含む培地によってゥ エル内の培地を交換し、 さらに培養を続けた。 培養 4日目に再度被検物質を含む 新しい培地でゥヱル内培地を交換し、 培養 7日目に Cell Counting Kitを用いて 細胞増殖を測定した。
なお、 .陽性対照物質としては、 最も強力な内因性エストロゲンである 1 Ί β— エストラジオール （Sigma社製） のジメチルスルホキシド溶液を用いた。
1一 b) ビール中のエストロゲン活性成分の探索
ビールを脱気し、 ENVI— 18カラム （10 g、 60ml、 Supelco社製） に供し、 20%、 50%、 80%メタノール水溶液、 およびメタノール各 180 mlで順次溶出した。
各画分のエストロゲン活性を前記方法にしたがって測定したところ、 80%メ 夕ノールおよびメ夕ノ一ルの各溶出画分に活性が確認された。
8〇％メ夕ノ一ル、 およびメ夕ノ一ルの各溶出画分を併せて減圧乾固しシリ力 ゲルカラムクロマトグラフィー （Kiesel gel 60, 10g Merck社製） に供し、 n —へキサン、 酢酸ェチル： n—へキサン = 1 : 7, 1 : 4の混合溶媒、 酢酸ェチ ルの順に段階的に溶出した。
得られた各画分のエストロゲン活性を測定したところ、 酢酸ェチル： n—へキ サン = 1 ： 7、 1 ： 4画分に活性が確認された。
これら活性が確認された画分を減圧乾固し、 メ夕ノ一ルに溶解して H P L Cに よる分画に供した。 HP LCの条件は下記の通りであった：
移動層： A液 （ァセトニ卜リル） 、 B液 （蒸留水） 、 A液 40%〜： L 00 %によるリニアグラジェント溶出、
カラム： YMC -hydrosphere C18 10 x 250mm (YMC社製） 、
ガードカラム： YMC-hydrosphere C1810x30腿 （YMC社製） 、 流速： 2. 5ml Z分、 注入量 80 u 1、
検出器波長： UV 290 nmo
HP L Cによって 2分間ごとにフラクションを採取し、 各フラクションのエス トロゲン活性を前記方法にしたがって測定した o
結果は下記の通りであった。
保持時間 14分〜 16分において得られたフラクション （Fr8) と、 保持時 間 18分〜 20分において得られたフラクション （Fr l O) とにそれぞれエス トロゲン活性があることが認められた。
この内、 F r 8に含まれる物質の質量 （MS) スペクトル測定を、 質量分析計 (DX303 日本電子社製） を用いて E I— MSの手法にしたがって行なったと ころ、 mZz 354にイオンが観測された。 これはイソキサントフモールの標準 スペクトルパターンと一致するものであった。 さらに、 1^8の5111 を600 / 1の重ジメチルスルホキシドに溶解し、 核磁気共鳴 （NMR) スペクトル装置 (UNITY plus 500型 （バリアン社製） ） を用いて 1H— NMR、 13C— NMRヽ および NOE S Y— 1 Dの測定を行ったところ、 F r 8の活性成分がィソキサン トフモールであることが確認された。
また Fr 10について、 HPLC質量 （MS) スぺクトル分析を行った。
分析装置は HP LC (HP1100 (アジレント社製） ） にトリプルステージ型質量 分析計 （MSZMS) (Quattro Ultima (マイクロマス社製） ） を接続して用い た。 このときの HPLC条件は下記の通りであった：
移動層： A液 （ァセトニトリル） 、 B液 （蒸留水） 、 および A液 55%〜 90%によるリニアグラジェント溶出、
カラム ： Capcell Pack C182. Ox 150腿 （株式会社資生堂製） 、
流速： 0. 2ml /分、 注入量 5 / lo
また質量分析計の条件は、 イオン化をエレクトロスプレーイオン化方式 (E S 1_) とし、 プリカ一サ fオン 338. 3、 プロダクトイオン 218. 8、 C o ne電圧 80V、 Co l l i s i o nエネルギー 20 e Vとした。
測定の結果、 Fr l Oには 8—プレニルナリンゲニンが高濃度に含まれている ことが確認された。
1 - c) ビール中のィソキサントフモールおよび 8ープレニルナリンゲニ ンの分析
ビール lmlを、 ジェチルエーテル 5mlを用いて 2回抽出して、 窒素乾固し た。 これを、 内部標準として 2. 4—ジヒドロカルコンを 40 ppb含む 50% メタノール水溶液に溶解し、 分析試料とした。
分析装置は HPLC (HP1100 (アジレント社製） ） にトリプルステージ型質量 分析計 （MS MS) (Quattro Ultima (マイクロマス社製） ） を接続して用い た。 このときの HPLC条件は下記の通りであった： 移動層： A液 （ァセトニトリル） 、 B液 （蒸留水） 、 および A液 55%〜
90%によるリニアグラジェント溶出、
カラム： Capcell Pack C182.0xl50mm、
流速： 0. 2ml /分、 注入量 5 / 1。
質量分析計の条件は、 イオン化をエレクトロスプレーイオン化方式 (ES I 一） とし、 MRMモードにて両化合物を一斉定量分析した。 定量イオンおよびィ オン化条件は、 イソキサントフモールについては、 プリカーサ一イオン 352. 8、 プロダクトイオン 232. 8、 C one電圧 80 V、 Co l l i s i onェ ネルギ一 18 e Vとした。 8—プレニルナリンゲニンについては、 プリカーサ一 イオン 338 · 3、 プロダクトイオン 218. 8、 C one電圧 80 V、 Co l 1 i s i o nエネルギー 20 e Vとした。 , 分析の結果、 試験に用いたビール中のイソキサントフモール濃度は 2. 1 mg /Lであり、 8—プレニルナリンゲニンの濃度は 43 zg/Lであった。 試験 2 ： インビトロ （in vitro) におけるエストロゲン活性評価
精製ィソキサントフモールおよび化学合成された 8—プレニルナリンゲニンの エストロゲン活性を、 試験 1と同様にして測定した。 ただしこのとき、 MCF- 7細胞培養用の培地における被検物質の濃度を次のように設定した。
イソキサントフモールは、 該培地中の濃度が、 1 · 0x l 0-5、 1. 0x 10 ~ 1. 0χ 10-7、 1 · Ox l O-8、 1. 0x l 0_9、 および 1. 0 X 10 -1 °mo 1/Lとなるように添加した。
8—プレニルナリンゲニンは、 該培地中の濃度が、 1. 0x l 0—7、 1. 0 X
10一8、 1. 0x l 0—9、 1. 0x 10— 10、 1. 0 X 10-11、 および 1. 0 X 10— 12mo 1ZLとなるように添加した。
陽性対照としての 17 ?—ェストラジオ一ルは、 該培地中の濃度が、 6. 3 X 10— 1. 6 x 10- 3. 9x 10一12、 1. 0 x 10一12、 1. 0x 10 一13、 および 1. 0 X 10—14mo 1/Lとなるように添加した。
結果は図 1に示される通りであった。
ィソキサントフモールおよび 8—プレニルナリンゲニンはいずれも、 エストロ ゲン活性を示した。 これらの活性をエストラジオールと比較したところ、 イソキ サントフモールの活性は約 10— 5倍、 8—プレニルナリンゲニンは 10— 2倍であ つに。 試験 3 ： インビボ （in vivo) におけるエストロゲン活性評価
3 -a) 幼若ラットにおける評価
in vivoにおけるエストロゲン作用について、 幼若 Wistar系雌性ラヅトを用い て評価した。
使用したラットは次のようにして準備した。 まず、 20日齢の Wistar系雌性ラ ヅト (日本チヤ一ルスリバー社より入手可能) を各動物の体重差が平均体重の土 10%以内となるよう選別後、 1群 6匹として無作為に群分けし、 水および AI N-76 A (日本クレア社製） を自由摂取させ飼育した。
1日間の予備飼育の後、 イソキサントフモールまたは 8—プレニルナリンゲニ ンを、 1、 5、 または 25 mgノ kg/日で 1日 1回、 3日間、 10ml /kg の液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。 コントロール群としては溶 媒 （落花生オイル） を同様にして経口投与し、 また陽性対照としては 17 ^—ェ ストラジオールを用い、 これを 400 zg/k 日の量で同様にして経口投与 した。 最終投与の約 24時間後にラットから子宮を摘出し、 その重量を秤量する ことによって in vivoにおけるエストロゲン活性を測定した。
結果は図 2に示される通りであった。
ィソキサントフモールは、 エストラジオール、 または 8—プレニルナリンゲ二 ンとは異なって、 幼若ラヅトに対し in vivo エストロゲン活性を有しないか、 ま たは極めて微弱な活性を示すに過ぎないことが判明した。
3— b) 卵巣摘出ラットにおける評価
9週齢の雌性 SD系ラット （日本チヤ一ルスリバ一社より入手可能） の両側卵 巣を摘出し、 1群 6匹として無作為に群分けし、 水ぉょびAIN_76A (日本 クレア社製） を自由摂取させ飼育した。 手術翌日より被検物質を 1日 1回、 28 日間、 1 OmlZkgの液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。 イソキサントフモールについては、 ビールに含まれる濃度と同等、 5倍、 20 倍になるように、 イソキサントフモールを 0 . 8 %エタノール水溶液に溶解した ものをそれぞれ調製し、 これらを用いた。 コントロール群、 偽手術群には、 0 . 8 %エタノール水溶液を同様にして経口投与した。 陽性対照としては 1 1 β—ェ ストラジオ一ルを用い、 これを 2 / g/k 日の量で皮下投与した。
結果は図 3および図 4に示される通りであつた。
卵巣摘出群 （O V X) の子宮重量は偽手術群と比較して有意に低く、 イソキサ ントフモール投与群によっても子宮重量の有意な回復は認められなかった。 試験 4 ： 卵巣摘出後骨粗鬆症における骨密度減少に対する改善効果
9週齢の雌性 S D系ラヅトの両側卵巣を摘出し、 翌日より被検物質を一日 1回、 2 8日間、 1 O m l Zk gの液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。 コントロール群、 偽手術群には 0 . 8 %エタノール水溶液を同様にして経口投 与した。 陽性対照としては 1 7 ?—エストラジオールを用い、 これを
日の量で皮下投与した。
ビール (国産ピルスナ一ビール) は、 イソキサントフモールを 2 . 1 m g/ 含有し、 また 8—プレニルナリンゲニンを 4 3〃gZL含有するものである。 こ こではこれを一度、 凍結乾燥した後に水に溶解することによってエタノールを除 去して、 これを被検物質として試験に供した。
イソキサントフモールについては、 ビールに含まれる濃度と同等、 5倍、 2 0 倍になるように、 イソキサントフモールを 0 . 8 %エタノール水溶液に溶解した ものをそれそれ調製し、 これらを用いた。
さらに、 ビールにおける骨粗鬆症の予防活性に寄与する主要成分を同定するた めに、 さらに以下の被検液を調製して試験に供した：
'イソ α酸を 3 0 %含むホップエキス （Iso-Extract (Hopsteiner社製） ） を◦. 8 %エタノール水溶液で希釈した希釈液であって、 イソひ酸濃度がビール と同等濃度 （3 0 m gZL ) になるよう調製した液、
• 8—プレニルナリンゲニンの水希釈液であって、 8—プレニルナリンゲ二 ンがビール中に含まれる濃度と同等になるよう希釈した液、 および
'イソキサントフモールの異性体であるキサントフモール （ADin chemical 社製） の水希釈液であって、 キサントフモールがビールに含まれるイソキサント フモールと同等濃度 （2 . l m g/L ) となるように調製した液。
骨密度の測定は、 ラヅ トの大腿骨を採取し、 遠位骨端部の海綿骨骨密度を P Q C T (Peripheral Quantitative computed tomography ) 骨密度測定装置 （XCT-9 60A (ノーランド ·ストラテック社製） ) を用いて特定することにより行なった。 結果は図 5および図 6に示される通りであった。
卵巣摘出群 （O V X) の大腿骨における海綿骨骨密度は減少していたが、 ビー ルおよびイソキサントフモール投与により有意に改善された。 このような改善は、 ビール中のエストロゲン活性寄与率が最も大きいと考えられる 8—プレニルナリ ンゲニンには認められなかった。 また、 キサントフモールゃィソフムロン類を含 むイソひ酸については、 Pit Formation Assayによって骨吸収阻害活性がすでに 報告されているが、 これらについてもイソキサントフモールのような活性は認め られなかった。
前記試験 3にもあるように、 卵巣摘出ラットにおいては骨密度減少抑制活性を 示す用量、 および、 それよりも 2 0倍の用量の場合でも、 イソキサントフモール は子宮重量増加作用を示さなかった。 また、 幼若ラットにおいては骨密度減少抑 制効果が認められる用量の 1 2 5 0倍の投与量においても子宫重量増加作用は認 められなかった。 試験 5 ： ィソキサントフモール含有飲料のラット骨密度減少に対する改善効 里
9週齢の雌性 S D系ラットの両側卵巣を摘出し、 翌日より被検溶液を一日 1回 2 8日間、 1 O m l Zk gの液量を経口ゾンデを用いて胃内強制経口投与した。 コントロール群、 偽手術群には水を同様にして経口投与した。 陽性対照として は、 落花生油に溶解した 1 7 ?—ェストラジオ一ルを用い、 これを 1 0〃gZk g/日の量で皮下投与した。
被検溶液としては、 前記例 Dにしたがって、 下記のものを用意した：
-前記例 Dと同様にして抽出された麦茶であってイソキサントフモールを含 有していない麦茶、 'イソキサントフモールをそれぞれ 2 mg/L、 10mg/L、 および 50 mg/Lの濃度で含有する麦茶、
•前記例 Dと同様にして抽出された緑茶であってイソキサントフモールを含 有していない緑茶、 および
-イソキサントフモールを 1 OmgZLの濃度で含有する緑茶。
骨密度の測定は前記試験 4の場合と同様にして行った。
結果は図 7および図 8に示される通りであった。
卵巣摘出群 （OVX) の大腿骨における海綿骨骨密度は、 偽手術群と比較して 減少していたが、 ィソキサントフモールを含有する飲料を投与した群の骨密度は 水を投与したコントロール群よりも有意に高く、 骨密度減少に対する改善効果が 認められた。 一方、 イソキサントフモールを含有しない飲料の場合には、 骨密度 減少に対する改善効果は認められなかった。
緑茶は、 一般的に、 骨吸収作用に関わる破骨細胞の活性を抑制することが知ら れている茶力テキンを多く含むとされてる (Biocheiu Biophys Res Commun 292 (1)， 94-101(2002)) 。 しかしながら、 イソキサントフモールを含有しない緑茶 飲料の場合には卵巣摘出ラットの骨密度減少抑制効果は認めらなかった。 したが つて、 緑茶の場合でも、 イソキサントフモールを添加することによって初めて骨 密度減少に対する改善効果が認められた （図 8) 。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . イソキサントフモールを有効成分として含んでなる、 骨密度減少の抑制 または予防用組成物。
2 . イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、 有効成分とし て含んでなる、 骨密度減少の抑制または予防用組成物。
3 . 異性化ホップエキスが、 エタノール系溶媒による抽出により得られたキ サントフモール含有ホップエキスを、 異性化することによって得られるものであ る、 請求項 2に記載の組成物。
4 . 異性化が、 ホップエキスを、 アル力リ性の水中において加熱還流するこ とによって行われる、 請求項 3に記載の組成物。
5 . 医薬組成物である、 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
6 . 骨粗鬆症の予防、 治療または改善用である、 請求項 1〜5のいずれか一 項に記載の組成物。
7 . ィソキサントフモールを有効成分として含んでなる、 骨密度減少の抑制 または予防用飲食品。
8 . イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、 有効成分とし て含んでなる、 骨密度減少の抑制または予防用飲食品。
9 . 異性化ホップエキスが、 エタノール系溶媒による抽出により得られたキ サントフモール含有ホップエキスを、 異性化することによって得られるものであ る、 請求項 8に記載の飲食品。
10. 異性化が、 ホップエキスを、 アルカリ性の水中において加熱還流する ことによって行われる、 請求項 9に記載の飲食品。
1 1. 健康食品、 機能性食品、 特定保健用食品、 または病者用食品である、 請求項 7〜10のいずれか一項に記載の飲食品。
12. 骨粗鬆症の予防、 治療または改善用である、 請求項 7〜 1 1のいずれ か一項に記載の飲食品。
13. 飲料の形態である、 請求項 7〜 12のいずれか一項に記載の 食品。
14. 非ホップ飲料である、 請求項 13に記載の飲食品。
15. 茶飲料である、 請求項 14に記載の飲食品。
16. 乳飲料である、 請求項 14に記載の飲食品。
17. ョ一グルトである、 請求項 7〜 12のいずれか一項に記載の飲食品。
18. 成人 1日あたりのィソキサントフモール摂取量が 0. 003〜0 · 5 mg/k g体重となる量でイソキサントフモールを含んでなる、 請求項 Ί〜 17 のいずれか一項に記載の飲食品。
19. 1回当たりのイソキサントフモール摂取量が、 0. 2〜30mgとな る量でイソキサントフモールを含んでなる、 請求項 7〜17のいずれか一項に記 載の飲食品。
20. 成人 1日あたりのイソキサントフモール摂取量が 0. 003〜0. 5 m g/k g体重となる量でィソキサントフモールを有効成分として含んでなる、 非穀物-ホップ発酵型の飲食品。
2 1 . 1回当たりのイソキサントフモール摂取量が、 0 . 2〜3 0 m gとな る量でイソキサントフモールを有効成分として含んでなる、 非穀物-ホップ発酵 型の飲食品。
2 2 . 成人 1日あたりのイソキサントフモール摂取量が 0 . 0 0 3〜0 . 5 m g/k g体重となる量で、 イソキサントフモールを含有する異性化ホヅプェキ スを、 有効成分として含んでなる、 非穀物-ホップ発酵型の飲食品。
2 3 . 1回当たりのィソキサントフモール摂取量が、 0 . 2〜3 O m gとな る量で、 イソキサントフモールを含有する異性化ホップエキスを、 有効成分とし て含んでなる、 非穀物-ホップ発酵型の飲食品。
2 4 . 茶飲料である、 請求項 2 0〜2 3のいずれか一項に記載の非穀物 -ホ ップ発酵型の飲食品。
2 5 . 乳飲料である、 請求項 2 0 ~ 2 3のいずれか一項に記載の非穀物 -ホ ップ発酵型の飲食品。
2 6 . ヨーグルトである、 請求項 2 0〜 2 3のいずれか一項に記載の非穀物
-ホップ発酵型の飲食品。
2 7 . 有効量の請求項 1〜4のいずれか一項に記載の有効成分を、 哺乳動物 に投与するかまたは摂取させることを含んでなる、 哺乳動物の骨密度減少を抑制 または予防する方法。
2 8 . 有効量の請求項 1〜4のいずれか一項に記載の有効成分を、 哺乳動物 に投与するかまたは摂取させることを含んでなる、 骨粗鬆症を予防、 治療または 改善する方法。
2 9 . 骨密度減少の抑制または予防用組成物を製造するための、 請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の有効成分の使用。
3 0 . 骨粗鬆症の予防、 治療または改善用組成物を製造するための、 請求項 1 ~ 4のいずれか一項に記載の有効成分の使用。
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