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WO2004083369A2 - Composition de fixation tissulaire - Google Patents

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WO2004083369A2
WO2004083369A2 PCT/FR2004/000608 FR2004000608W WO2004083369A2 WO 2004083369 A2 WO2004083369 A2 WO 2004083369A2 FR 2004000608 W FR2004000608 W FR 2004000608W WO 2004083369 A2 WO2004083369 A2 WO 2004083369A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tissue
sample
paraffin
fixing
composition
Prior art date
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Application number
PCT/FR2004/000608
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English (en)
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WO2004083369A3 (fr
Inventor
Philippe Rochaix
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INSTITUT CLAUDIUS REGAUD
Original Assignee
INSTITUT CLAUDIUS REGAUD
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by INSTITUT CLAUDIUS REGAUD filed Critical INSTITUT CLAUDIUS REGAUD
Priority to CA002518981A priority Critical patent/CA2518981A1/fr
Priority to US10/548,567 priority patent/US20070072167A1/en
Priority to NZ542908A priority patent/NZ542908A/en
Priority to EP04720046A priority patent/EP1601950A2/fr
Priority to AU2004221625A priority patent/AU2004221625B2/en
Publication of WO2004083369A2 publication Critical patent/WO2004083369A2/fr
Publication of WO2004083369A3 publication Critical patent/WO2004083369A3/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the present invention relates to the field of the preservation of tissue samples under optimal conditions, so as to be able subsequently to carry out analyzes in molecular biology in particular from the tissues thus preserved for diagnostic or therapy purposes.
  • the subject of the present invention is a tissue fixing composition allowing the preservation, within the tissue thus fixed, of proteins and nucleic acids so as to allow their analysis in situ or their subsequent extraction from the tissue in question for analysis purposes.
  • tissue samples can provide important information relating to pathophysiological mechanisms such as the inflammatory response, growth or cell differentiation. Advances in the knowledge of such phenomena are at the origin of advances both in terms of diagnosis and treatment. If the freezing of tissue samples (at a temperature lower than or equal to - 80 ° C) remains the standard technique for analysis in molecular biology, its binding nature is recognized by all. Indeed, this technique not only requires appropriate facilities for storing frozen tissue, but also imposes drastic conditions for transporting said tissue so as not to break the cold chain.
  • RNA on fixed and paraffin embedded tissues Three essential conditions are required for the analysis of RNA on fixed and paraffin embedded tissues: 1) a good yield of TARN extraction, 2) a good quality of the extracted RNA, and 3) the absence contamination by genomic DNA (Shibutani 2000).
  • the extraction and analysis of total RNA from tissues fixed in formalin and included in paraffin have been mainly applied for the detection of viral RNA, in the context of hepatitis C for example (Dries 1999; Guerrero 1997).
  • Methacarn has shown its effectiveness (Shibutani 2000), but the main disadvantage of this new fixer is the high toxicity of its constituents. Furthermore, the paraffin inclusion and dewaxing stages do not seem to have a major influence on the quality of protein extraction when the tissues have been fixed using non-bridging fixatives (Shibutani 2000).
  • the present invention proposes to remedy the drawbacks of the prior art by proposing in particular a new tissue fixing composition based on non-toxic chemical compounds preserving the cellular and tissue structures.
  • the tissue fixing composition of the invention has easy handling because it allows the preservation of tissue samples in paraffin block or in dehydrated form in particular.
  • tissue fixing composition of the invention comprises trehalose associated with other compounds. More particularly, this composition comprises: - trehalose at a concentration between 40 and 80 g / 1, preferably between 40 and 70 g / 1 and more preferably still around 60 g / 1,
  • - acetic acid in an amount between 0% and 5% (v / v), preferably between 0.5% and 3% (v / v) and more preferably still around 1% (v / v), and
  • the inventors have also demonstrated that the preparation of the above tissue fixing composition could be carried out optimally in two stages.
  • the first step is to prepare a mixture with only 45% ethanol (stable at 0 ° C) and to add pure ethanol (also stable at 0 ° C) when preparing the final composition in an amount sufficient to obtain the tissue fixing composition of the invention as specified above.
  • This makes it possible in particular to stabilize the preparation products of said composition and to store them in a cold environment so therefore to use them already cooled from the start of the fixing.
  • tissue-fixing composition of the invention it is possible to prepare, in a first step, a mixture comprising 60 g of trehalose, 10 ml of acetic acid, 300 ml of and
  • the above mixture and the pure ethanol must be mixed just before using the final composition, in an amount of 5.5 parts of the mixture and 4.5 parts of ethanol.
  • the final tissue fixing composition includes: 60 g of trehalose, 10 ml of acetic acid, 300 ml of water and 700 ml (250 + 450) of ethanol, which corresponds well to the composition indicated above.
  • the above tissue-fixing composition additionally comprises glycerol in an amount between 0% and 10% (v / v), preferably between 3% and 8% (v / v ) and more preferably still around 6%.
  • composition of the invention may in this case comprise 40 g / 1 of trehalose, 70% ethanol (v / v), 6% glycerol (v / v) 1% acetic acid (v / v) and 23% water (v / v).
  • Glycerol is in fact added to the tissue fixing composition of the invention only in cases where a higher alcohol concentration is necessary, in particular for the purpose of retaining very good nucleic acids.
  • the tissue fixing composition of the invention comprising glycerol makes it possible in particular, by the osmotic action of glycerol, to reduce the amount of trehalose used and to avoid its precipitation in a medium of higher alcoholic concentration.
  • the subject of the present invention is also a method of tissue fixation consisting in immersing the fresh tissue samples in the tissue fixation composition of the invention, at a temperature between 0 and 6 ° C., of preferably between 0 ° and 4 ° C and more preferably still at a temperature of approximately 1 ° C and this, for at least 12 hours, preferably at least 16 hours and more preferably still for approximately 20 hours, depending on the fabric thickness.
  • fresh tissue sample is meant any tissue sample resulting in particular from an animal sample, including a human sample, produced under standard conditions well known to those skilled in the art, it being understood that the fixation must occur as quickly as possible. possible after tissue devascularization in order to best preserve the quality of nucleic acids and in particular RNA.
  • tissue fixing composition of the invention makes it possible to carry out a finer analysis and giving rise to better results and / or yields than those obtained by the use of 'a fixer of the prior art, but they have further improved the method of processing a tissue sample, with the aim of further improving the quality of subsequent biological analyzes.
  • a tissue sample fixed for the purpose of subsequent analysis can be prepared in the context of the present invention according to a treatment method comprising the steps of: a) fixing the sample by means of the tissue fixing composition of the invention, b) dehydration of the sample obtained in a), c) preservation of the sample obtained in b), i) in the dehydrated state, ii) within a resin, or iii) by inclusion in paraffin.
  • the inventors have demonstrated that the conservation of said sample in dehydrated form after it has been fixed by means of the composition of the invention makes it possible not only to carry out analyzes in situ of quality at least equivalent to that of the other known techniques but also made it possible to carry out extractions of nucleic acids of much better quality and more easily than by the implementation of said techniques of the prior art. It is in fact the combination of the implementation of the tissue fixing composition of the invention and the preservation of the sample thus fixed in the dehydrated state which has made it possible to obtain such results.
  • RNAs extracted from tissue samples fixed by the composition of the invention and kept dehydrated have a better quality than when said samples, even fixed with the composition of tissue fixation of the invention were included in the paraffin.
  • a tissue sample can be prepared in accordance with a treatment process comprising the steps of: a) fixing the sample using the tissue fixing composition of the invention, b) dehydrating the sample obtained in a) , c) imbibition of paraffin from the sample obtained in b), d) inclusion in the paraffin of the sample obtained in c), e) obtaining “cuts” from the inclusion block obtained in d) (by cutting the inclusion block into extremely fine “slices” a few microns thick), f) spreading a section obtained in e) on a glass slide and bonding this section, g) dewaxing of the section thus glued, h) coloring of said section.
  • the biological analyzes are then carried out from this section both from the point of view of the visualization of certain constituent elements of the tissue thus prepared and from the extraction of nucleic acids or proteins.
  • the blade is said to be “white blade” because not colorful.
  • the dewaxing of the cut is carried out using successive xylene baths.
  • the tissue sample is then gradually rehydrated using successive alcohol baths at 100 ° C, 80 ° C then 50 ° C, and finally in water. After this rehydration step, the tissue sample is colored.
  • the inventors have surprisingly determined that it is possible to obtain even better results in terms of preserving the morphology of the tissue sample if the white slide, before the dewaxing step, was immersed in a bath comprising 75% (v / v) alcohol, 2% (v / v) formalin, 5% (v / v) acetic acid, 1% (v / v) Tween 20® and 17% (v / v) water for about 5 minutes at room temperature.
  • the present invention relates to any type of tissue sample to be fixed and / or treated, in particular animal tissue samples, including human, pathological or not.
  • the invention applies for example to the fixation and / or treatment of tumor tissues, in particular in the context of the constitution of a tumor library.
  • the fresh tissue samples are immersed in the tissue fixing composition of the invention at about + 1 ° C for at least 12 hours. They are then dehydrated in 3 or 4 successive baths of absolute alcohol for one hour each at a temperature between 0 and 4 ° C and then in an acetone bath of about 1 h at about 4 ° C in 2 baths of acetone of approximately 1 hour each at room temperature.
  • the samples are cut in a microtome ribbon and then dewaxed by 2 successive baths of xylene and 2 baths of absolute ethanol.
  • the extraction uses a lysis buffer (Tris HC1 100 mM pH 7.4, 2% SDS, protease inhibitor TM Sigma) at 95 ° C for 5 minutes and then sonication.
  • a lysis buffer Tris HC1 100 mM pH 7.4, 2% SDS, protease inhibitor TM Sigma
  • Second extraction method The extraction uses a lysis buffer (Tris HC1 50 mM pH 7.5, 150 mM NaCl, Nonidet P40 1%, protease inhibitor TM Sigma) at 4 ° C and grinding.
  • a lysis buffer Tris HC1 50 mM pH 7.5, 150 mM NaCl, Nonidet P40 1%, protease inhibitor TM Sigma
  • the protein samples are resolved on a 10% polyacrylamide gel and transferred to a PVDF membrane.
  • the membrane is stained by incubation for one hour in a solution of AMIDOBLACK TM (0.1% AMIDOBLACK TM Sigma, 45% ethanol, 10% acetic acid).
  • the membrane is incubated with a primary antibody, then a secondary antibody, then is revealed by chemiluminescence (ECL + TM Pierce) according to the manufacturer's recommendations. 3. DNA extraction
  • Trizol TM extraction After dewaxing or cutting frozen samples.
  • Tissue sections 5 ⁇ m thick were produced, spread on slides, dewaxed and then stained with hemalun-eosin for a morphological study.
  • the inventors obtained a very good histological and cytological morphology, both in terms of the epithelial and connective constituents, comparable to that observed in current technique.
  • a post-fixing step (optional) can be carried out: after spreading the sections on slides, the slides are immersed before dewaxing for 5 minutes in AFA supplemented with 1% of Tween 20, then rinsed with water.
  • the preservation quality of the antigenic sites was evaluated by immunohistochemical study using a large battery of monoclonal antibodies (Table 1). This study was carried out on paraffin sections, spread on slides and dewaxed, without reactivation of the antigenic sites (no microwave, nor enzymatic digestion), even if it was recommended by the supplier of the antibody.
  • the peroxidase activity was revealed using the LSAB kit (Dako). For each antibody, the marking obtained on the same tissue type was analyzed in a comparative manner between the usual fixative (AFA) and the fixative composition of the invention (Table 1).
  • the immunoreactivity observed with the tissue fixing composition of the invention is higher than that observed with the usual fixer (AFA) for all of the antibodies tested.
  • AFA usual fixer
  • the use of the composition of the invention makes it possible to suppress the pretreatment, intended to unmask the antigenic sites, even if this is recommended by the supplier laboratory.
  • the extraction yields differ according to the type of extraction buffer: the fixative used.
  • the composition of the invention always keeps yields lower than those of freezing but gives better results than AFA.
  • DNA extraction tests were carried out on tissue samples fixed according to the technique of the invention, fixed in AFA or frozen, a few days after fixing the samples and then repeated a year later.
  • the amount of DNA extracted from the tissues fixed by the composition of the invention was similar to that of frozen tissues, much greater than that of tissues fixed in AFA (Table 3).
  • the DNA extracted during these manipulations was of very high molecular weight.
  • the inventors were able to amplify by PCR a 2800 bp sequence of the BRCA-1 gene.
  • the tissue fixation technique of the invention is therefore compatible with the extraction and analysis of DNA from tissues thus fixed and included in paraffin. Migration of total DNA on agarose gel to
  • RNA extraction tests were carried out on tissue samples fixed according to the technique of the invention, fixed in AFA or frozen, a few days after fixing the samples and then repeated a year later.
  • the amount of RNA extracted from the tissues fixed by the composition of the invention is similar to that of frozen tissues, much greater than that of tissues fixed in AFA (Table 4).
  • the bands corresponding to the 28S and 18S ribosomal RNAs are visible, demonstrating good preservation of the RNAs.
  • the use of the fixing composition of the invention made it possible to obtain the same RNA profile as that obtained by freezing, before inclusion in paraffin.
  • RNA obtained and the absence of contaminating DNA were evaluated by amplification of the Raf gene by RT-PCR.
  • Tissue samples were fixed using the tissue fixing composition of the invention and then dehydrated.
  • RNAs were then extracted from these different samples, resolved on 0.8% agarose gel and compared with those extracted from frozen samples. It turns out that the RNAs extracted from paraffin blocks give rise to an attenuation of the bands corresponding to the ribosomal RNAs and the appearance of a slight “smear” suggestive of partial degradation and / or contamination by l DNA. Identical results are obtained after one year of conservation of the samples. However, the RNAs extracted from the samples preserved in dehydrated form have a better quality in the sense that they appear in particular more clearly on the gel (data not shown).
  • paraffin samples are accompanied by a partial degradation of the messenger RNAs and a possible contamination by genomic DNA. Therefore, when the study of nucleic acids is essential, it appears preferable to keep the fixed samples in dehydrated form in an anhydrous medium, without including them in paraffin.
  • TGO hepatic enzyme
  • the formula of the tissue fixing composition of the invention comprises trehalose, ethanol, acetic acid and water (called T6 A7 A01) and may be declined in two forms, one comprising glycerol but no acetic acid (called T4 G6 A7) and the other devoid of acetic acid (called T6 A7).
  • T6 A7 A01 trehalose, ethanol, acetic acid and water
  • T4 G6 A7 acetic acid and water
  • T6 A7 A01 trehalose 60 g / 1; 1% acetic acid (V / V); ethanol 70% (V / V); water 29% (V / V), - T4 G6 A7: trehalose 40 g / 1; glycerol 6% (V / V); ethanol 70% (N / N); water 24% (N / N),
  • T6 A7 trehalose 60 g / 1; ethanol 70% (V / V); water 30% (V / V). • three other fixing compositions of the same formulation but whose trehalose has been replaced by another diose: sucrose:
  • S4 G6 A7 sucrose 40 g / 1; glycerol 6% (V / V); ethanol 70% (N / N); water 24% (V / N), 6.
  • S6 A7 sucrose 60 g / 1; ethanol 70% (V / V); water 30% (V / V).
  • a fresh nude mouse liver was dissected into six equivalent fragments and each of them was fixed in one of the above six fixing compositions according to the protocol reported in the description above.
  • the samples were dehydrated and stored at 4 ° C.
  • This protocol was carried out four times, on different days, from different mouse livers.
  • the proteins were extracted using a weak denaturing extraction buffer (Tris HC1 50 mM pH 7.5, ⁇ aCl 150 mM, ⁇ onldet P40 1%, protease inhibitor TM Sigma) at 4 ° C and assayed according to the technique of Bradford.
  • a weak denaturing extraction buffer Tris HC1 50 mM pH 7.5, ⁇ aCl 150 mM, ⁇ onldet P40 1%, protease inhibitor TM Sigma
  • the measurement of the enzymatic activity of the TGO was carried out by a Konelab 5.0.5 automaton. The results were weighted by the amount of protein and reported as international imity / microgram of protein (IU / ⁇ g of protein).
  • Rupp GM Locker J. Purification and analysis of RNA from paraffin-embedded tissues. Bio Techniques 1988; 6: 56-60.
  • RNA extracted from paraffin-embedded human tissues is amenable to analysis by PCR amplification. Bio Techniques 1991; 11: 304-8.

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Abstract

Composition de fixation tissulaire caractérisée en ce qu'elle comprend : - du tréhalose à une concentration comprise entre 40 g/l et 80 g/l, de préférence d'environ 60 g/l, - de l'éthanol en une quantité comprise entre 40 % et 80 % (v/v), de préférence environ 70 % (v/v), - de l'acide acétique en une quantité comprise entre 0 % et 5 % (v/v), de préférence environ 1 % (v/v), et - de l'eau en une quantité comprise entre 20 % et 60 % (v/v), de préférence environ 29 % (v/v).

Description

COMPOSITION DE FIXATION TISSULAIRE
La présente invention concerne le domaine de la préservation d'échantillons tissulaires dans des conditions optimales, de façon à pouvoir ultérieurement procéder à des analyses en biologie moléculaire notamment à partir des tissus ainsi préservés à des fins de diagnostic ou de thérapie.
La présente invention a pour objet une composition de fixation tissulaire permettant la préservation, au sein du tissu ainsi fixé, des protéines et acides nucléiques de façon à permettre leur analyse in situ ou leur extraction ultérieure du tissu en question à des fins d'analyse.
En matière de pathologie tumorale, l'analyse quantitative et qualitative de l'expression génique dans des échantillons tissulaires peut fournir des informations importantes relatives aux mécanismes physiopathologiques tels que la réponse inflammatoire, la croissance ou la différenciation cellulaire. Les progrès dans la connaissance de tels phénomènes sont à l'origine d'avancées tant en matière de diagnostic que de traitement. Si la congélation des prélèvements tissulaires (à une température inférieure ou égale à - 80°C) reste la technique de référence pour l'analyse en biologie moléculaire, son caractère contraignant est reconnu par tous. En effet, cette technique nécessite non seulement des installations appropriées pour procéder au stockage des tissus congelés, mais également impose des conditions drastiques de transport desdits tissus afin de ne pas rompre la chaîne du froid.
En effet, si pour le diagnostic anatomo-pathologique courant, la fixation et l'inclusion en paraffine des échantillons tissulaires sont largement utilisées car de maniement aisé, notamment pour la conservation des prélèvements, il est à souligner que dans un contexte diagnostique, la congélation demeure cependant indispensable pour certaines analyses, telles que l'histoenzymologie musculaire ou la recherche de transcrits de fusion. Certains anticorps monoclonaux utilisés en immunohistochimie à des fins diagnostiques ne sont également utilisables que sur coupes tissulaires congelées. Dans cet objectif, la mise au point de nouvelles techniques de fixation et traitement des échantillons tissulaires permettant non seulement une préservation intégrale des protéines, mais aussi de la principale cible pour l'analyse en biologie moléculaire des échantillons tissulaires -à savoir les acides nucléiques (ADN ou AKN)- pourrait remédier aux inconvénients de l'art antérieur.
L'avènement d'une nouvelle technique de Fixation préservant les protéines et acides nucléiques de tissus inclus en paraffine offrirait donc de multiples applications, telles que par exemple l'analyse de populations cellulaires définies par microdissection (Fend 1999). Dans l'état actuel de la technique, trois familles de produits sont utilisées pour la fixation des tissus biologiques :
- les aldéhydes (formol, paraformaldehyde, glutaraldehyde...) qui forment avec les molécules biologiques des liaisons covalentes les stabilisant et inhibant les activités enzymatiques, - les alcools (ethanol, méthanol) qui déshydratent les tissus, et
- les acides, en particulier l'acide acétique, qui diminuent les phénomènes de rétraction dus aux alcools et qui précipitent les protéines.
De nombreux mélanges fixateurs sont utilisables : formol seul, AFA (alcool + formol + acide acétique), liquide de Bouin (formol + acide picrique + acide acétique) liquide de Duboscq-Brazil (alcool + formol + acide picrique), etc...
Comme indiqué précédemment, il est important de pouvoir conserver, avec ou sans stockage, des prélèvements de tissus, notamment animaux et en particulier humain, de façon à préserver, dans un état aussi proche que possible de leur état naturel, les éléments desdits tissus dont l'analyse sera réalisée ultérieurement. De telles analyses seront réalisées sur des protéines et/ou des acides nucléiques extraits des tissus fixés et conservés à des fins diagnostiques ou thérapeutiques, voire à des fins d'études de certains tissus tels que les tumeurs. Ces analyses nécessitent donc qu'il soit procédé à l'extraction des éléments à analyser selon des rendements convenables et en l'absence de contaminant. La problématique est toutefois quelque peu différente selon que l'on cherche à extraire à partir des tissus fixés et conservés et à des fins d'analyse, des acides nucléiques ou des protéines.
Trois conditions essentielles sont requises pour l'analyse de l'ARN sur tissus fixés et inclus en paraffine : 1) un bon rendement de l'extraction de TARN, 2) une bonne qualité de l'ARN extrait, et 3) l'absence de contamination par l'ADN génomique (Shibutani 2000). A ce jour, l'extraction et l'analyse de l'ARN total à partir de tissus fixés au formol et inclus en paraffine ont été essentiellement appliquées pour la détection des ARN viraux, dans le cadre de l'hépatite C par exemple (Dries 1999 ; Guerrero 1997).
Cependant, une dégradation de l'ARN et une extraction insuffisante gênent considérablement l'analyse, quantitative notamment, des échantillons tissulaires fixés au formol et inclus en paraffine (Rupp 1988 ; Stanta 1991 ; Finke 1993). De plus, la contamination par de l'ADN génomique est un problème fréquemment rencontré (Foss 1994), l'utilisation secondaire de traitements par la DNase après une extraction en phénol/chloroforme et une précipitation à l'éthanol des échantillons d'ARN extraits peut réduire considérablement la quantité d'ARN final.
D'une manière générale, plusieurs études de faisabilité de RT-PCR ont montré que les fixateurs non pontants tels que l'acétone ou le Methacarn (méthanol, chloroforme, acide acétique) sont supérieurs en terme d'efficacité d'amplification des produits par rapport aux fixateurs formaldéhydiques (Koopmans 1993 ; Tyrrell 1995). La fixation à l'acétone (Sato 1991 ; Sato 1992) donne d'excellents rendements d'extraction de l'ARN, mais, outre le caractère contraignant de cette technique (fixation à - 80°C), le niveau de contamination par l'ADN génomique peut être élevé (Shibutani 2000).
C'est dans ce contexte que sont apparus de nouveaux fixateurs basés sur la précipitation protéique tels que le methacarn (Puchtler 1970 ; Mitchell 1985 ; Shibutani 2000) qui préservent l'ARN et les protéines intacts, mais qui ne sont pas dénués d'une certaine toxicité limitant leur usage courant. En ce qui concerne l'inclusion en paraffine, l'un des principaux écueils rencontrés est l'obtention d'ARN de grande taille. Par ailleurs, la contamination des extraits par l'ADN génomique est davantage rapportée pour les tissus fixés et inclus en paraffine que pour les tissus congelés (Rupp 1988 ;Ben-Ezra 1991 ;Von Weizsâcker 1991 ; Foss 1994). Cependant, il semblerait que cet inconvénient soit évité avec les nouveaux fixateurs (methacarn par exemple) (Shibutani 2000).
A l'opposé de l'analyse des acides nucléiques, très peu d'études ont porté sur la possibilité d'extraire les protéines à partir de tissus fixés et inclus en paraffine (Hara 1993 ; Ikeda 1998). Cette méconnaissance s'explique vraisemblablement par le fait que les fixateurs formaldéhydiques, qui sont les plus largement utilisés, créent des liaisons inter protéiques. Là encore, les fixateurs non pontants (acétone, ethanol, methacarn) ouvrent de nouvelles perspectives (Rognum 1980 ; Orstavik 1981 ; Mitchell 1985 ; Conti 1988). Les fixateurs de type acétone n'affectent pas la qualité des protéines, mais les contraintes méthodologiques sont importantes sans offrir d'ava tage majeur par rapport à la traditionnelle congélation.
Le methacarn a montré son efficacité (Shibutani 2000), mais le principal désavantage de ce nouveau fixateur est l'importante toxicité de ses constituants. Par ailleurs, les étapes d'inclusion en paraffine et de déparaffinage ne semblent pas influer de façon majeure la qualité de l'extraction protéique lorsque les tissus ont été fixés à l'aide de fixateurs non pontants (Shibutani 2000).
La présente invention se propose de remédier aux inconvénients de l'art antérieur en proposant notamment une nouvelle composition de fixation tissulaire basée sur des composés chimiques non toxiques préservant les structures cellulaires et tissulaires. De plus, la composition de fixation tissulaire de l'invention présente un maniement aisé car elle permet la conservation des échantillons tissulaires en bloc de paraffine ou sous forme déshydratée notamment.
La particularité de la composition de fixation tissulaire de l'invention repose sur le fait qu'elle comprend du trehalose associé à d'autres composés. Plus particulièrement, cette composition comprend : - du trehalose à une concentration comprise entre 40 et 80 g/1, de préférence entre 40 et 70 g/1 et plus préférentiellement encore environ 60 g/1,
- de l'éthanol en une quantité comprise entre 40 % et 80 % (v/v), de préférence entre 55 % et 75 % (v/v) et plus préférentiellement encore environ 70 % (v/v),
- de l'acide acétique en une quantité comprise entre 0 % et 5 % (v/v), de préférence entre 0,5 % et 3 % (v/v) et plus préférentiellement encore environ 1 % (v/v), et
- de l'eau en une quantité comprise entre 20 % et 60 % (v/v), de préférence entre 25 % et 50 %(v/v) et plus préférentiellement encore environ 29 %
(v/v).
Les Inventeurs ont par ailleurs mis en évidence que la préparation de la susdite composition de fixation tissulaire pouvait être réalisée de façon optimale en deux étapes. Il s'agit tout d'abord de préparer un mélange avec seulement 45 % d'éthanol (stable à 0°C) et d'ajouter de l'éthanol pur (stable également à 0°C) au moment de la préparation de la composition finale en quantité suffisante pour obtenir la composition de fixation tissulaire de l'invention telle que ci-dessus précisée. Ceci permet notamment de stabiliser les produits de préparation de ladite composition et de les stocker en milieu froid afin donc de les utiliser déjà refroidis dès le début de la fixation.
A titre d'exemple, afin de préparer un litre de la composition de fixation tissulaire de l'invention, il est possible de préparer dans une première étape, un mélange comprenant 60 g de trehalose, 10 ml d'acide acétique, 300 ml d'eau et
250 ml d'éthanol, étant entendu qu'il sera ensuite nécessaire d'y ajouter 450 ml d'éthanol pur.
Dans une seconde étape, le susdit mélange et l'éthanol pur doivent être mélangés juste avant l'utilisation de la composition finale, à raison de 5,5 parties du mélange et 4,5 parties d'éthanol. Ainsi, la composition de fixation tissulaire finale comprend : 60 g de trehalose, 10 ml d'acide acétique, 300 ml d'eau et 700 ml (250 + 450) d'éthanol, ce qui correspond bien à la composition ci-dessus indiquée.
Comme démontré ci-après au moyen des analyses comparatives réalisées dans le cadre de diverses expérimentations mettant en œuvre d'une part la composition de fixation de l'invention et d'autre part le fixateur usuel qu'est l'AFA, il est clair que les résultats obtenus présentent de bien meilleurs résultats lorsque ceux-ci sont réalisés sur des tissus ayant au préalable été fixés par la composition de fixation de l'invention. Ceci apparaît notamment au niveau du tableau 1 rapportant une sensibilité accrue de la détection des sites antigéniques à partir des tissus fixés par la composition de fixation de l'invention mais également au niveau des rendements d'extraction obtenus à partir de tels tissus.
Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, la susdite composition de fixation tissulaire comprend de plus du glycérol en une quantité comprise entre 0 % et 10 % (v/v), de préférence entre 3 % et 8 % (v/v) et plus préférentiellement encore environ 6 %.
A titre d'exemple, la composition de l'invention peut comprendre dans ce cas 40 g/1 de trehalose, 70 % d'éthanol (v/v), 6 % de glycérol (v/v) 1 % d'acide acétique (v/v) et 23 % d'eau (v/v).
Le glycérol n'est en fait ajouté à la composition de fixation tissulaire de l'invention que dans les cas où une concentration alcoolique plus important est nécessaire, en particulier dans le but de conserver des acides nucléiques de très bonne qualité.
La composition de fixation tissulaire de l'invention comprenant du glycérol permet notamment, par l'action osmotique du glycérol, de réduire la quantité de trehalose utilisée et d'éviter sa précipitation dans un milieu de concentration alcoolique plus élevé.
La présente invention a également pour objet un procédé de fixation tissulaire consistant à immerger les échantillons tissulaires frais dans la composition de fixation tissulaire de l'invention, à une température comprise entre 0 et 6°C, de préférence entre 0° et 4°C et plus préférentiellement encore à une température d'environ 1°C et ce, pendant au moins 12 heures, de préférence au moins 16 heures et plus préférentiellement encore pendant environ 20 heures, en fonction de l'épaisseur du tissu. Par « échantillon tissulaire frais », on entend tout échantillon tissulaire résultant notamment d'un prélèvement animal, y compris l'humain, réalisé dans des conditions standards bien connues de l'homme du métier, étant entendu que la fixation doit survenir le plus rapidement possible après dévascularisation tissulaire afin de préserver au mieux la qualité des acides nucléiques et en particulier de l'ARN.
En fait, non seulement les inventeurs ont démontré que l'utilisation de la composition de fixation tissulaire de l'invention permettait de procéder à une analyse plus fine et donnant lieu à de meilleurs résultats et/ou rendements que ceux obtenus par l'utilisation d'un fixateur de l'art antérieur, mais ils ont encore amélioré le procédé de traitement d'un échantillon tissulaire, dans le but d'améliorer encore la qualité des analyses biologiques ultérieures.
Ainsi, les Inventeurs ont mis en évidence qu'un échantillon tissulaire fixé à des fins d'analyses ultérieures peut être préparé dans le cadre de la présente invention selon un procédé de traitement comprenant les étapes de : a) fixation de l'échantillon au moyen de la composition de fixation tissulaire de l'invention, b) déshydratation de l'échantillon obtenu en a), c) conservation de l'échantillon obtenu en b), i) à l'état déshydraté, ii) au sein d'une résine, ou iii) par inclusion en paraffine. De façon tout à fait surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que la conservation dudit échantillon sous forme déshydratée après sa fixation au moyen de la composition de l'invention permettait non seulement de procéder à des analyses in situ de qualité au moins équivalente à celle des autres techniques connues mais permettait également de procéder à des extractions d'acides nucléiques de bien meilleure qualité et de façon plus aisée que par la mise en œuvre desdites techniques de l'art antérieur. C'est en fait la combinaison de la mise en œuvre de la composition de fixation tissulaire de l'invention et de la conservation de l'échantillon ainsi fixé à l'état déshydraté qui a permis d'obtenir de tels résultats.
En effet, la déshydratation et le maintien dans cet état d'un échantillon tissulaire fixé au préalable par la composition de fixation de l'invention comprenant notamment du trehalose permet de préserver non seulement la morphologie cellulaire et tissulaire de l'échantillon mais également les fonctions cellulaires telles que les fonctions enzymatiques. Les Inventeurs ont d'ailleurs mis en évidence, comme indiqué ci-après, que des ARN extraits d'échantillons tissulaires fixés par la composition de l'invention et conservés déshydratés présentent une meilleure qualité que lorsque lesdits échantillons, même fixés avec la composition de fixation tissulaire de l'invention, ont été inclus dans la paraffine.
Par ailleurs, les Inventeurs ont également mis en évidence que les procédés dits « classiques » d'inclusion d'échantillons en paraffine pouvaient également être améliorés dans le cadre de la présente invention. Ainsi, un échantillon tissulaire peut être préparé conformément à un procédé de traitement comprenant les étapes de : a) fixation de l'échantillon au moyen de la composition de fixation tissulaire de l'invention, b) déshydratation de l'échantillon obtenu en a), c) imbibition de paraffine de l'échantillon obtenu en b), d) inclusion dans la paraffine de l'échantillon obtenu en c), e) obtention de « coupes » à partir du bloc d'inclusion obtenu en d) (par découpage du bloc d'inclusion en « tranches » extrêmement fines, de quelques microns d'épaisseur), f) étalement d'une coupe obtenue en e) sur une lame de verre et collage de cette coupe, g) déparaffinage de la coupe ainsi collée, h) coloration de ladite coupe.
Les analyses biologiques sont ensuite réalisées à partir de cette coupe tant du point de vue de la visualisation de certains éléments constitutifs du tissu ainsi préparé que de l'extraction des acides nucléiques ou des protéines.
A l'issue de l'étape f) ci-dessus, c'est-à-dire après étalement et collage d'une coupe obtenue après découpage du bloc d'inclusion de paraffine, la lame est dite « lame blanche » car non colorée.
Classiquement, le déparaffinage de la coupe est réalisé à l'aide de bains successifs de xylène. L'échantillon tissulaire est ensuite réhydraté progressivement à l'aide de bains successifs d'alcool à 100°C, 80°C puis 50°C, et enfin dans l'eau. Après cette étape de réhydratation, l'échantillon tissulaire est coloré.
Les inventeurs ont déterminé de façon surprenante qu'il était possible d'obtenir de meilleurs résultats encore au niveau de la préservation de la morphologie de l'échantillon tissulaire si la lame blanche, avant l'étape de déparaffinage, était plongée dans un bain comprenant 75 % (v/v) d'alcool, 2 % (v/v) de formol, 5 % (v/v) d'acide acétique, 1 % (v/v) de Tween 20® et 17 % (v/v) d'eau, et ce, pendant environ 5 minutes à température ambiante.
En effet, un tel traitement additionnel permet de préserver une bonne morphologie cellulaire, particulièrement utile dans certains cas comme l'analyse des sous populations lymphoïdes par exemple.
La présente invention concerne tout type d'échantillon tissulaire à fixer et/ou à traiter, en particulier des échantillons tissulaires animaux, y compris humains, pathologiques ou non. L'invention s'applique par exemple à la fixation et/ou le traitement de tissus tumoraux, notamment dans le cadre de la constitution d'une tumorothèque.
Les résultats d'expérimentations ci-après permettront de mieux comprendre l'invention. Ils ne sont cependant mentionnés qu'à titre purement illustratif. EXEMPLE 1 : Echantillons inclus dans la paraffine
1. Traitement des tissus. : a) Congélation:
Les échantillons tissulaires frais sont mis dans des cryotubes et plongés directement dans de l'azote liquide (-196°C) puis sont conservés dans un congélateur à -80°C. b) Fixation et inclusion :
Les échantillons tissulaires frais sont immergés dans la composition de fixation tissulaire de l'invention à environ + 1°C pendant au moins 12 heures. Ils sont ensuite déshydratés dans 3 ou 4 bains successifs d'alcool absolu d'une heure chacun à une température entre 0 et 4°C puis dans un bain d'acétone d'environ 1 h à environ 4°C dans 2 bains d'acétone d'environ 1 h chacun à température ambiante.
Les échantillons déshydratés sont incubés dans de la paraffine liquide à 58°C pendant 10 à 15 heures, de préférence 12 heures et inclus en cassette (technique anatomo-pathologique standard). c) Déparaffinage :
Les échantillons sont coupés en ruban au microtome puis sont déparaffinés par 2 bains successifs de xylène et 2 bains d'éthanol absolu.
2. Analyse des protéines a) Extraction et dosage :
Première méthode d'extraction :
L'extraction utilise un tampon de lyse (Tris HC1 lOOmM pH 7,4, SDS 2 %, protease inhibitor™ Sigma) à 95°C pendant 5 minutes puis une sonification.
Seconde méthode d'extraction : L'extraction utilise un tampon de lyse (Tris HC1 50mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Nonidet P40 1 %, protease inhibitor™ Sigma) à 4°C et un broyage.
Le dosage protéique ne pouvant être réalisé selon la technique de Bradford en raison du fort taux de SDS, une procédure de dosage basée sur l'acide bicinchoninique et le sulfate de cuivre a été utilisée. b) Analyse:
Les échantillons protéiques sont résolus sur un gel de polyacrylamide à 10 % et transférés sur membrane PVDF.
Si seul le profil protéique global est recherché, la membrane est colorée par incubation d'une heure dans une solution d'AMIDOBLACK™ (0,1 % AMIDOBLACK™ Sigma, 45 % ethanol, 10 % acide acétique).
Si une immuno-détection est souhaitée, la membrane est incubée avec un anticorps primaire, puis un anticorps secondaire, puis est révélée par chimiluminescence (ECL+™ Pierce) selon les recommandations du fabriquant. 3. Extraction de PADN
Il s'agit d'une extraction phénol/chloroforme classique après déparaffinage ou coupe des prélèvements congelés. 4. Extraction de PA-RN
Il s'agit d'une extraction Trizol™ classique après déparaffinage ou coupe des prélèvements congelés.
RESULTATS 1. Morphologie
Des coupes tissulaires de 5 μm d'épaisseur ont été réalisées, étalées sur lames, déparaffinées puis colorées à l'hémalun-éosine pour une étude morphologique. Les inventeurs ont obtenu une morphologie histologique et cytologique de très bonne qualité, tant au niveau des constituants épithéliaux que conjonctifs, comparable à celle observée en technique courante. Afin d'augmenter la reproductibilité de la qualité des colorations obtenues, une étape de post-fixation (facultative) peut être réalisée : après étalement des coupes sur lames, les lames sont plongées avant déparaffinage 5 minutes dans de l'AFA additionné de 1 % de Tween 20, puis rincées à l'eau. 2. Etude immunohistochimique
La qualité de préservation des sites antigémques a été évaluée par étude irnmunohistochimique à l'aide d'une large batterie d'anticorps monoclonaux (Tableau 1). Cette étude a été réalisée sur coupes en paraffine, étalées sur lames et deparaffmées, sans réactivation des sites antigéniques (pas de micro-ondes, ni de digestion enzymatique), même si celle-ci était recommandée par le fournisseur de l'anticorps. La révélation de l'activité peroxydase a été effectuée à l'aide du kit LSAB (Dako). Pour chaque anticorps, le marquage obtenu sur un même type tissulaire a été analysé de façon comparative entre le fixateur usuel (AFA) et la composition de fixation de l'invention (Tableau 1).
Tableau 1 : Etude immunohistochimique comparative.
Intensité marquage Intensité marquage Anticorps Dilution Prétraitement Composition de Fixateur usuel recommandé fixation de l'invention (AFA)
ACE 1/6 Non +
(Dako)
CoIIagène IV # 1/50 Protéinase K ++- +
(Dako)
CK5/6 # Non +++
(Dako)
CK19 1/100 Non ++- +
(Dako)
Bcl2 § 1/50 Micro-ondes +++ +
(Dako)
Calcitonine § 1/10 Non +
(Dako) nombreuses cellules C rares cellules C
Tableau 1 (suite)
TTF-1 § 1/50 Micro-ondes
(Microm) CD31 1/200 Micro-ondes +++ +
(Dako)
CD15 £ 1/50 Non ++
(immunotech)
CD30 £ 1/2 Micro-ondes -H-
(Dako) nombreuses cellules quelques cellules
CK20 * 1/100 Micro-ondes +++ +++
(Dako) 100 % cellules 50 % cellules
Ki-67 s 1/50 Micro-ondes +++ 0
(Dako)
PCNA$ Non
(Dako)
P53 s 1/50 Micro-ondes
(Dako)
#réactivité étudiée sur le sein, +-H-=marquage intense, § réactivité étudiée sur la thyroïde, ++=marquage modéré, £ réactivité étudiée sur un ganglion, +=marquage faible, réactivité étudiée sur le colon, 0=absence de marquage. $ réactivité étudiée sur un sarcome,
Ainsi, il apparaît que l'immunoréactivité observée avec la composition de fixation tissulaire de l'invention est supérieure à celle observée avec le fixateur usuel (AFA) pour l'ensemble des anticorps testés. Pour l'étude irmnunohistochimique, l'utilisation de la composition de l'invention permet de supprimer le pré-traitement, destiné à démasquer les sites antigéniques, même si celui-ci est recommandé par le laboratoire fournisseur. De plus, si l'on compare l'immunoréactivité obtenue avec la composition de l'invention sans pré-traitement, et celle obtenue avec le fixateur usuel en suivant les recommandations habituelles (micro-ondes), on observe encore un marquage plus intense avec l'utilisation de la composition de fixation de l'invention. 3. Analyse protéique
Les rendements d'extraction diffèrent selon le type de tampon d'extraction : le fixateur utilisés.
Tableau 2 : Extraction protéique d'un léiomyome utérin humain
Tampon « NP40 » Tampon « SDS »
Congélation 200 μg prot /mg de tissu 310 /^g prot /mg de tissu
Composition de fixation de 125 μg prot /mg de tissu 207 μg prot /mg de tissu l'invention
AFA 2,5 μg prot /mg de tissu 5,77 μg prot /mg de tissu
La composition de l'invention garde toujours des rendements inférieurs à ceux de la congélation mais donne des meilleurs résultats que l'AFA. Les profils protéiques obtenus à partir de tissus fixés par la composition de l'invention diffèrent aussi en fonction du tampon d'extraction utilisé : il manque de nombreuses bandes sur les gels faits à partir des extractions par tampon NP40 alors que ceux faits à partir d'extraction par tampon SDS sont relativement semblables à ceux de la congélation (données non montrées). Les protéines provenant de l'extraction par le tampon SDS ont été reconnues, à la taille attendue, en immunotransfert par des anticorps spécifiques de protéines cytosoliques (actine et desmine), nucléaire (Récepteur des Estrogènes =RE) et mitochondriale (Bcl2). Alors que l'intensité du marquage est identique pour la congélation et la composition de l'invention, elle diminue pour les protéines de poids moléculaire élevé tel que RE pour l'AFA (données non montrées). ADN
Des tests d'extraction d'ADN ont été effectués sur des échantillons tissulaires fixés selon la technique de l'invention, fixés dans l'AFA ou congelés, quelques jours après la fixation des prélèvements puis répétés un an plus tard. La quantité d'ADN extrait des tissus fixés par la composition de l'invention était similaire à celle des tissus congelés, très supérieure à celle des tissus fixés en AFA (Tableau 3).
Tableau 3 : Rendement d'extraction d'ADN sur plusieurs types de tissus fixés par la composition de l'invention
Tissu Rendement
Ovaire 7,46 μg ADN /mg de tissu
Mélanome 18,41 μg ADN /mg de tissu Lymphome 6 μg ADN /mg de tissu
Les ADN extraits au cours de ces manipulations étaient de très hauts poids moléculaires. Les Inventeurs ont pu amplifier par PCR une séquence de 2 800 pb du gène BRCA- 1. La technique de fixation tissulaire de l'invention est donc compatible avec l'extraction et l'analyse de l'ADN à partir de tissus ainsi fixés et inclus en paraffine. La migration de l'ADN total sur gel d'agarose à
0,8 % confirme la grande taille des fragments d'ADN obtenus (données non montrées).
ARN
Des tests d'extraction d'ARN ont été effectués sur des échantillons tissulaires fixés selon la technique de l'invention, fixés dans l'AFA ou congelés, quelques jours après la fixation des prélèvements puis répétés un an plus tard. La quantité d'ARN extrait des tissus fixés par la composition de l'invention est similaire à celle des tissus congelés, très supérieure à celle des tissus fixés en AFA (Tableau 4).
Tableau 4 : Rendement d'extraction d'A N de foie de souris
Fixateur Rendement
Congélation 1,3 ± 0,4 μg ARN /mg de tissu
Composition de fixation de 1,1 + 0,2 μg ARN /mg de tissu l'invention
AFA 0,017 ± 0,010 μg ARN /mg de tissu
Les bandes correspondant aux ARN ribosomaux 28S et 18S sont visibles, témoignant d'une bonne préservation des ARN. L'utilisation de la composition de fixation de l'invention a permis d'obtenir le même profil d'ARN que celui obtenu par congélation, avant inclusion en paraffine.
La qualité de l'ARN obtenue et l'absence d'ADN contaminant ont été évaluées par amplification du gène Raf par RT-PCR.
EXEMPLE 2 : Extraction comparative d'ARN
Des échantillons tissulaires ont été fixés au moyen de la composition de fixation tissulaire de l'invention puis déshydratés.
Ces échantillons ont été ensuite répartis en deux groupes équivalents, l'un des groupes a fait l'objet d'inclusion en paraffine, l'autre a fait l'objet d'une conservation sous forme déshydratée dans un récipient hermétique comportant un dessicateur.
Les ARN ont ensuite été extraits de ces différents échantillons, résolus sur gel d'agarose à 0,8 % et comparés à ceux extraits de prélèvements congelés. Il s'avère que les ARN extraits des blocs de paraffine donnent lieu à une atténuation des bandes correspondant aux ARN ribosomaux et l'apparition d'un léger « smear » évocateur d'une dégradation partielle et/ou d'une contamination par de l'ADN. Des résultats identiques sont obtenus après un an de conservation des prélèvements. Or, les ARN extraits des prélèvements conservés sous forme déshydratée présentent une meilleure qualité en ce sens qu'ils apparaissent notamment plus nettement sur le gel (donnée non montrée).
Ainsi, il semble que l'inclusion des prélèvements en paraffine s'accompagne d'une dégradation partielle des ARN messagers et d'une possible contamination par de l'ADN génomique. Donc, lorsque l'étude des acides nucléiques est primordial, il apparaît préférable de conserver les prélèvements fixés sous forme déshydratée dans un milieu anhydre, sans les inclure en paraffine.
EXEMPLE 3 : Mise en évidence de l'effet protecteur spécifique du trehalose lors de la déshydratation des protéines, comparaison avec le saccharose
Afin d'évaluer la protection fonctionnelle des protéines conférée par le trehalose, l'activité d'un enzyme hépatique (TGO) a été mesurée et comparée dans des extraits de protéines provenant de tissus fixés avec différentes compositions de fixation tissulaire.
La formule de la composition de fixation tissulaire de l'invention comporte du trehalose, de l'éthanol, de l'acide acétique et de l'eau (appelée T6 A7 A01) et peut-être déclinée sous deux formes, l'une comportant du glycérol mais pas d'acide acétique (appelée T4 G6 A7) et l'autre dénuée d'acide acétique (appelée T6 A7). Six compositions de fixation ont été préparées comme indiqué ci-après : > trois compositions de fixation de l'invention comprenant du trehalose : 1. T6 A7 A01 : trehalose 60 g/1 ; acide acétique 1 % (V/V) ; ethanol 70 % (V/V) ; eau 29 % (V/V), - T4 G6 A7 : trehalose 40 g/1 ; glycérol 6 % (V/V) ; ethanol 70 % (N/N) ; eau 24 % (N/N),
3. T6 A7 : trehalose 60 g/1 ; ethanol 70 % (V/V) ; eau 30 % (V/V). • trois autres compositions de fixation de même formulation mais dont le trehalose a été remplacé par un autre diose : le saccharose :
4. S6 A7 A01 : saccharose 60 g/1 ; acide acétique 1 % (V/V) ; ethanol 70 % (V/V) ; eau 29 % (V/V),
5. S4 G6 A7 : saccharose 40 g/1 ; glycérol 6 % (V/V) ; ethanol 70 % (N/N) ; eau 24 % (V/N), 6. S6 A7 : saccharose 60 g/1 ; ethanol 70 % (V/V) ; eau 30 % (V/V).
Un foie frais de souris nude a été disséqué en six fragments équivalents et chacun d'eux a été fixé dans l'une des susdites six compositions de fixation selon le protocole rapporté dans la description ci-dessus. Les prélèvements ont été déshydratés et stockés à 4°C.
Ce protocole a été réalisé quatre fois, à des jours différents, à partir de foies de souris différentes.
Les protéines ont été extraites à l'aide d'un tampon d'extraction faiblement dénaturant (Tris HC1 50 mM pH 7.5, ΝaCl 150 mM, Νonldet P40 1 %, protease inhibitor™ Sigma) à 4°C et dosées selon la technique de Bradford.
La mesure de l'activité enzymatique des TGO a été réalisée par un automate Konelab 5.0.5. Les résultats ont été pondérés par la quantité de protéines et rapportés sous forme d'imité intemationale/microgramme de protéine (Ul/μg de protéines).
Ces résultats ont été comparés deux à deux (trois binômes) selon la présence de trehalose ou de saccharose dans la composition de fixation tissulaire testée, toutes choses égales par ailleurs :
- T6 A7 A01 versus S6 A7 A01,
- T4 G6 A7 versus S4 G6 A7, et
- T6 A7 versus S6 A7. Les résultats ont été comparés selon la méthode de Dunnett de comparaison de moyenne après analyse de variance.
Les résultats obtenus sont rapportés dans les tableaux ci-après et sont illustrés par les figures correspondantes.
Tableau I / Figure 1
Figure imgf000020_0001
Test d'égalité de variance : F = 1,3 avec (3,3) D.F. p = 0,836 (two-tail) Hypothèse : il existe une différence entre les deux groupes Variance égale : t = - 3,96 avec 6 D.F. p = 0,007 (two-tail)
Tableau 2 / Figure 2
Figure imgf000020_0002
Test d'égalité de variance : F = 2,29 avec (3,3) D.F. p = 0,514 (two-tail) Hypothèse : il existe une différence entre les deux groupes
Variance égale : t ≈ - 5,43 avec 6 D.F. p = 0,002 (two-tail) Tableau 3 / Figure 3
Figure imgf000021_0001
Test d'égalité de variance : F = 1,13 avec (3,3) D.F. p = 0,922 (two-tail) Hypothèse : il existe une différence entre les deux groupes Variance égale : t = 9,03 avec 6 D.F. p = 0,001 (two-tail)
Conclusion
Quelque soit la composition de fixation tissulaire testée, la présence de trehalose permet d'obtenir de bien meilleurs résultats quant à la préservation de l'activité enzymatique des TGO de foie de souris que ne le fait le saccharose.
REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Composition de fixation tissulaire caractérisée en ce qu'elle comprend :
- du trehalose à une concentration comprise entre 40 g/1 et 80 g/1, de préférence d'environ 60 g/1,
- de l'éthanol en une quantité comprise entre 40 % et 80 % (v/v), de préférence environ 70 % (v/v),
- de l'acide acétique en une quantité comprise entre 0 % et 5 % (v/v), de préférence environ 1 % (v/v), et - de l'eau en une quantité comprise entre 20 % et 60 % (v/v), de préférence environ 29 % (v/v).
2. Composition de fixation tissulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus du glycérol en une quantité comprise entre 0 % et 10 % (v/v), de préférence environ 6 % (v/v).
3. Procédé de fixation tissulaire consistant à immerger les échantillons tissulaires frais dans une composition de fixation tissulaire selon l'une des revendications 1 et 2, à une température comprise entre 0 et 6°C, et de préférence d'environ 1°C, pendant au moins 12 heures, de préférence environ 20 heures.
4. Procédé de traitement d'un échantillon tissulaire comprenant les étapes de : a) fixation dudit échantillon au moyen de la composition de fixation tissulaire selon la revendication 1 ou 2, b) déshydratation de l'échantillon obtenu en a), c) conservation de l'échantillon obtenu en b), a) à l'état déshydraté, ii) au sein d'une résine, ou iii) par inclusion en paraffine.
5. Procédé de traitement d'un échantillon tissulaire selon la revendication 4, dans lequel la conservation de l'échantillon obtenu en b) est réalisée par inclusion en paraffine comprenant les étapes suivantes :
J - imbibition de paraffine de l'échantillon,
- inclusion dans la paraffine de l'échantillon imbibé
- obtention de coupes à partir du bloc d'inclusion,
- étalement d'une coupe sur une lame de verre et collage,
- déparaffinage de la coupe ainsi fixée, 0 - coloration de ladite coupe, caractérisé en ce que l'étape de déparaffinage de la coupe est précédée d'une étape de traitement de la coupe collée sur la lame de verre consistant à plonger l'ensemble lame-coupe dans un bain comprenant 75 % (v/v) d'alcool, 2 % (v/v) de formol, 5 % (v/v) d'acide acétique, 1 % (v/v) de Tween 20® et 17 % (v/v) 5 d'eau.
6. Procédé de traitement d'un échantillon tissulaire selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'étape de fixation de l'échantillon est réalisée conformément au procédé de la revendication 3. 0
1. Composition ou procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé(e) en ce que le tissu est un tissu normal ou pathologique.
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