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WO2004069276A1 - 癒着形成防止、抑制又は治療剤 - Google Patents

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WO2004069276A1
WO2004069276A1 PCT/JP2004/001111 JP2004001111W WO2004069276A1 WO 2004069276 A1 WO2004069276 A1 WO 2004069276A1 JP 2004001111 W JP2004001111 W JP 2004001111W WO 2004069276 A1 WO2004069276 A1 WO 2004069276A1
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WO
WIPO (PCT)
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protease inhibitor
preventing
agent
adhesion formation
val
Prior art date
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PCT/JP2004/001111
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English (en)
French (fr)
Inventor
Mizuo Miyazaki
Shinji Takai
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0808—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu

Definitions

  • the present invention relates to a method for preventing adhesion formation using a protease inhibitor. More specifically, the present invention relates to a method for preventing adhesion formation using a serine protease inhibitor, particularly a chymase inhibitor.
  • Postoperative adhesion formation is a major complication following common orthopedic or plastic surgery, eg, heart, chest, gynecology, ophthalmology and abdomen. Pericardial adhesions cause significant problems and increase the morbidity and mortality of reoperational cardiac surgery (J. Invest. Surg. 14: 93 ⁇ 97, 2001). Postoperative peritoneal adhesions are a major cause of complications, such as intestinal atresia, infertility, and pain, in severe cases after abdominal or gynecological surgery (Dig. Surg. 18: 260-73, 2001: Non-Patent Document 2). Many causes have been implicated in adhesion formation, including trauma, dryness, local anemia, infectious peritonitis, and endometriosis, but the pathophysiological nature of adhesion formation is not fully understood .
  • Post-operative adhesions generally occur as a result of a normal wound healing response within 5-7 days after injury. Adhesion formation and non-adhesion re-epithelialization are alternative pathways, both of which start with the action of coagulation, It is thought that this will lead to the construction of a trick. If fibrin deposits are not excessive or removed, fibrin can form fibrin cross-links and form fibrin matrices, thus providing a reserve for adhesions. Crosslinks form the basis of the adherent tissue by cellular elements, including fibroblasts.
  • peritoneal fibrinolytic enzyme protection systems such as the Brasmin system can remove fibrin germana1 and ricks, but surgery dramatically reduces fibrinogen degrading activity, thus creating adhesions.
  • the choice of pathway for formation or re-epithelialization is determined by the surface of the damaged tissue and the extent of fibrinolysis.
  • Non-Patent Document 3 attempts to prevent fibrin deposition have included the use of peritoneal washings to flush fibrinous exudates, surgical techniques to minimize local anemia, and the use of barriers to limit the adhesion of the treated serosal surface. Instead, anti-inflammatory agents such as corticosteroids and non-steroids have been widely used (Clin. Exp. Gynecol. 28: 126-127, 2001: Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 5 A method for removing fibrin deposits by degrading bupurin with a conventional proteolytic enzyme after skeletal formation is under study (Int. Surg. 83: 11-14, 1998: Non-Patent Document 5). A universally effective method for preventing or treating postoperative adhesions has not yet been proven.
  • Mast cells play an important role in inducing the allergic inflammatory response.
  • Mast cells express on their surface receptors that bind the Fc portion of IgE and certain classes of IgG, allowing antibodies to bind to their surface.
  • the interaction between the bound antibody and the antigen results in histamine, serotone, cytokin, and other allergic, Transmitters, such as various enzymes, are released that oppose the development of a sensitive response.
  • Transmitters such as various enzymes, are released that oppose the development of a sensitive response.
  • mast cells are involved in peritoneal adhesion formation (Am. J. Surg. 165; 127-130, 1993: Non-Patent Document 6).
  • Chymase is a chymotrypsin-like serine protease contained in the secretory granules of mast cells. Chymase is a site power-in that activates stem cell factor and has the ability to induce mast cell accumulation. For example, it has been reported that chymase activity was significantly increased in a mouse treatment site after cecal abrasion (J. Surg. Res. 92: 40-44, 2000: Non-Patent Document 8). Thus, chymase-positive mast cells appear to play a role in the development of adhesion formation. However, the pathophysiological role of chymase in the development of adhesion formation remains unclear.
  • chymase inhibitors eg, -aminoalkylphosphonate derivatives ⁇ and other serine protease inhibitors are used to form adhesions to peritoneal or pleural cavity organs and other body parts after wounds caused by surgery or accidents in mammals
  • a method for preventing or suppressing adhesion formation between tissue surfaces in a vertebrate subject by administering to a site on the tissue surface of the subject for a period of time sufficient for tissue repair to prevent or suppress remodeling Offered.
  • Non-patent document 1 Krause et al "J. Invest. Surg. 14: 93-97, 2001
  • Non-patent document 2 Liakakos et al" Dig. Surg. 18: 260-73, 2001
  • Non-Patent Document 3 diZerega and Rogers, The Pertioneum, Springer -Verlag, NY 307-369, 1992
  • Non-patent document 4 Baysal, Clin. Exp. Gynecol. 28: 126-127, 2001 (Non-patent document 5) Hioki et al "Int. Surg. 83: 11-14, 1998
  • Non-patent document 6 Liebman et al "Summer, Am. J. Surg. 165; 127-130, 1993
  • Non-patent document 7 Adachi et al" Surg. Today 29: 51-54, 1999
  • Non-Patent Document 8 Yao et al., J. Surg. Res. 92: 40-44, 2000
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 2002-506817 Publication of the Invention
  • the present invention can be used, for example, for heart, chest, gynecological, ophthalmic, abdominal orthopedic surgery. Alternatively, before or after various surgical procedures including plastic surgery, or when visceral adhesions due to trauma or inflammation are feared, it is possible to effectively prevent and suppress adhesion formation. It is intended to provide drugs.
  • the present inventors have focused on the fact that the formation of adhesions can be prevented by administering at least one effective amount of a protease inhibitor in a sufficient amount for a period of time for tissue repair of a tissue in which adhesion is feared, As a result of intensive studies, they have found that the above object can be solved by intravenous administration, oral administration or transdermal application of a drug containing the protease inhibitor, and completed the present invention.
  • a drug containing an effective amount of at least one protease inhibitor which is applied intravenously, orally, or transdermally, and prevents or suppresses adhesion formation on a tissue surface in a vertebrate subject.
  • therapeutic drugs e
  • chymase inhibitor is a peptide derivative of an aryl diester of a-aminoalkylphosphonic acid
  • the chymase inhibitor is Suc-Val-Pro-Phe p (OPli) 2, prevention of adhesion formation according to the preceding paragraph 4, inhibiting or therapeutic agent,
  • the chymase inhibitor, adhesion formation according to Suc-Val-Pro-PheP ( OPh) preceding 4 is a 2 enantiomers Suc-Val-Pro-L- PheP (OPh) 2 in concentrate Preventive, suppressive or therapeutic agents,
  • the protease inhibitor is administered in combination with a vehicle that maintains an effective local concentration of the protease inhibitor at the site, and wherein the vehicle comprises hyaluronic acid, hydrogel, carboxymethyl cellulose.
  • Dextran, cyclodextran, and a high molecular weight carrier selected from an aggregate comprising the compound, the agent for preventing, suppressing or treating adhesion formation as described in any one of the above items 1 to 8;
  • An agent for preventing, inhibiting or treating adhesion formation comprising the protease inhibitor according to any one of the above items 1 to 9 and a pharmaceutically acceptable diluent or excipient,
  • a method for preventing, suppressing or treating healing which comprises administering the agent for preventing, suppressing or treating healing according to 1.
  • FIG. 1 is a graph showing an average adhesion score when a placebo or Suc-Val-Pro-L-PlieP (OPh) 2 was taken. (Experimental example) Best mode for carrying out the invention
  • the present invention relates to an agent for preventing, inhibiting or treating adhesion formation on a tissue surface in a vertebrate specimen, which comprises intravenously, orally or transdermally applying a drug containing an effective amount of a protease inhibitor. It is.
  • the protea The inhibitor can be administered to the subject, for example, before, during, or after surgical treatment.
  • the drug can be administered, for example, in cases where trauma or inflammatory visceral adhesions are concerned.
  • the agent of the present invention is an agent for preventing, suppressing or treating adhesion formation in a peritoneum of a warm-blooded mammal, wherein the mammal is provided with at least one effective amount of a serine protease inhibitor.
  • a preferred embodiment relates to a method for preventing or inhibiting postoperative adhesion formation using at least one serine protease inhibitor, a chymotrypsin-like serine protease.
  • the agent of the present invention can be applied to humans as the warm-blooded mammal.
  • the protease inhibitor contained in the drug of the present invention is a known substance, and as long as it is purified to such an extent that it can be used as a drug, it can be prepared by various methods.
  • the protease group targeted for the agent for preventing, suppressing or treating adhesion formation of the present invention is preferably a serine protease.
  • the serine protease is a subclass of endopeptidase that cleaves and binds serine in the peptide (Barrett, AJ, In: Protease Inhibitors, Ed.Barrett, AJ et.al, Elsevir, Amsterdam, p. 3-22, 1986).
  • Serine proteases are known per se. For example, a superfamily of two types of serine-lipases, such as chymotribsine / superfamily, actinomycete door, and (Sti'eptomyces) subtilisin 'superfamily, has been reported.
  • Pancreatic pancreatic trypsin inhibitor is a family and basic protease inhibitor (Ketcham, LK et al, In: Atlas of Protein Sequence and Structure, Ed. Dayhoff, MO, p. 131-). 143, 1978) (also known as “BPTI”), (2) Kazal group, (3) Streptomyces subtilin inhibitor group (hereinafter “SSI”), (4) Serpin family (5) Family of soybean trypsin inhibitors (Kunit), (6) Family of potato inhibitors, (7) Bowman-Birk family (Laskowski, M. et al. Ann. Rev. Biochem., 49) : ⁇ ⁇ 593'626, 1980).
  • each inhibitor is determined by the identity of the amino acid at the amino terminus to the site of direct cleavage of the serine protease. This amino acid, known as the P-site residue, is thought to form an acyl bond with serine in the active site of the serine oral protease (LaskowskiLaskowski et al, Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626). , 1980).
  • Preferred serine protease inhibitors contained in the drug of the present invention belong to the senolepine (serpinj family and Bowman'Birk) families, and plasminogen as a serine protease inhibitor for serpin family.
  • activator inhibitors PAI-1, PAI-2, and PAI-3 C1 esterase inhibitor, a-2-antiplasmin, contrapsin, antitrypsin, antithrombin III, proteaone Genexin I, para-1-antichymotribcine, protein C inhibitors, heparin cofactor II and growth hormone regulatory proteins (Carrell et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol "52: 527-535, 1987).
  • Chymotrypsin Suha examples include tissue-type plasminogen activator (t-PA), trypsin, trypsin-like protease, chymotrypsin, plasmin, elastase, perokinase (or non-urine type).
  • Plasminogen activator: u-PA tissue-type plasminogen activator
  • sequence homology is as follows: (1) Specific active site residues, for example, in the case of trypsin, serine at position 195, histidine at position 57 and aspartic acid at position 102 are common; (2) oxyanion hole (E.g., in the case of trypsin, glycine at position 193 and aspartic acid at position 194), (3) cysteine residues that form disulfide bridges in the structure (Hartley, BS, Symp. Soc. Gen. MicrbopL, 24: 152-182 (1974)).
  • Structural homology is (1) common fold (Richrdoson) consisting of two Greek key structures, (2) general factors of catalytic residues, (3) precise conservation of structure in the nucleus (Stroud , RM, Sci. AM., 231: 24-88).
  • the agents of the present invention can include peptide derivatives of arylaryl esters of -aminoalkylphosphonic acids.
  • Cithrombin, human factor XIIa, human factor Xa, human crystal kallikrein, ⁇ cytrypsin, rat skin tryptase, human leukocyte elastase, porcine pancreatic elastase With respect to a number of inhibitors of serine proteases, including shikimotrypsin, human leukocyte cathepsin G, and rat mast cell protease II, these aminoalkyl phosphonate derivatives have been discovered (US Pat. Nos. 5,543,396, 5,686,419). 5952307, etc.).
  • a suitable inhibitor Suc-Val-Pro-PlieP (OPli) 2 is expressed in human plasma. It has a half-life of about 20 hours. This stability is important. Because peritoneal exudates are expected to neutralize most of the protease inhibitors and cause loss of activity.
  • Aminoalkylphosphonic acids are analogous to a-amino acids, and three-letter abbreviations have been named following the superscript P for commonly accepted amino acids.
  • diphenyl ⁇ _ ( ⁇ -benzyloxycarbo-noreamino (N-benzyloxycarbonylamino) ethylphosphonate) for alanine is abbreviated as Cbz-Ala p (OPh) 2 .
  • a peptide with a C-terminal phosphate residue ValP (OPh) 2 an analogue of palin, which is relatively effective and relatively specific, an irreversible specific for elastase and elastase-like enzymes Is an inhibitor.
  • Phenylalanine a C-terminal phosphate residue associated with other aromatic amino acids or long fatty acid side chains, is relatively effective and inhibits relatively specific chymotrypsin and chymotrypsin-like enzymes Agent.
  • lysin, arginine or ⁇ -amino-a- (4-amidinophenyl) methanphosphonate [(4-AmPhGly) p (OPh) 2 ] or ⁇ -amino- ⁇ -(4'Amidinophenylmethyl) methanphosphonate [(4-AmPhe) p (OPh) 2 ] is a relatively effective and relatively stable peptide that is related to the C-terminal diphenyl ester. It is an inhibitor of certain trypsin and trypsin-like enzymes.
  • Mutation of the amino acid sequence at the site of the peptide structure can lead to an inhibitory molecule.
  • Relatively high activity inhibitors generally have the sequence of a P-nitroaulide substrate of a convenient peptide for the particular enzyme.
  • chymotrypsin and Suc-Val-Pro-Phe p (OPh) 2 is a relatively potent inhibitor against the chymotrypsin-like enzymes
  • Suc-Val-Pro-Phe- are suitable substrates for these enzymes It has an amino acid sequence similar to NA.
  • Suitable substrates have amino acid sequences similar to MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-NA and Boc-Val-Pro'Val'NA.
  • Phosphonate inhibitors for serine proteases based on peptide sequences found in relatively effective reversible and irreversible inhibitors for those same serine proteases reported in the paper (Powers and Harper, in Protease Inhibitors, Barrett and Salvesen, eds., Elsevier, p55 "152, 1986; Trainore, DA, Trends in Pharm. Sci. 8: 303.307, 1987).
  • the diphenyl ester of a-aminoalkylphosphonic acid can be synthesized by the above method (US Pat. No. 5,543,396).
  • the 2 (substituted phenyl) ester of a-aminoalkylphosphonic acid can be prepared by a method using 3 (substituted phenyl) phosphoric acid instead of triphenylphosphorous acid.
  • Perfluoroalkyl diesters can be synthesized by methods involved in transesterification reactions (Szewczyk et al., Synthesis, p. 409-414, 1982).
  • esters of aminoalkylphosphonic acids and their peptides as described above can be achieved by esterification of the phosphonic acid moiety (Bartlett et al "Bioorg. Chem., 14: 356- 377, 1986).
  • a number of additional serine protease inhibitors contained in the agents of the invention are disclosed by U.S. Patents (U.S. Patents 6262069, 5916888, 5900400, 5157019, 4829052, 5723316, 5807829).
  • the identification codes D and L or R and S are used to indicate the absolute configuration of the molecule at the chiral center.
  • the identification codes (+) and (-) or d and 1 are used by compounds to indicate the sign of horizontal polarization rotation. (-) Or 1 means that the compound is turning left, and the compound identification code (+) or d indicates that the compound is turning right.
  • These compounds, called stereoisomers are identical except that they are mirror images of one another. Certain stereoisomers can be represented as enantiomers, and mixtures of such isomers are sometimes referred to as enantiomeric mixtures or enantiomeric racemics.
  • As a method for producing the drug of the present invention means for further increasing the stereoisomeric purity or optical purity and / or reducing adverse effects can be used.
  • chiral refers to a molecule of the non-polymerizable nature of the mirror image partner.
  • achiral refers to a molecule that can polymerize to its mirror image partner.
  • stereoisomers refers to compounds that have the same chemical structure. However, the arrangement of atoms or groups in space is different.
  • enantiomer refers to the non-polymerizable mirror image and the stereoisomer of the other two compounds.
  • diastereomers refer to stereoisomers with two or more asymmetric centers, whose molecules are not mirror images of one another. With respect to chiral center nomenclature, the terms S and R configuration are defined by IUPAC1974 (Reconmiendations for Section E., Fundamental Stereochemistry, Pure Appl. Chem., 45: 13-30, 1976).
  • Enantiomerically enriched and “non-racemic” refer to an optically enriched constituent in which one enantiomer is present as compared to a racemic mixture of enantiomers It is concentrated. Unless otherwise specified, they refer to compositions in which the relative ratio of the desired enantiomer to the undesired enantiomer is 1: 1 or greater.
  • an enantiomerically enriched formulation may have a relative proportion of the desired enantiomer to the undesired enantiomer of at least 50% by weight, preferably at least 75%, and more preferably at least 75%. 80%.
  • the concentrate can be more than 80% by making it a 'fully enantiomerically enriched', 'fully non-racemic' or 'fully optically pure' formulation Which means at least 85%, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, of the desired enantiomer.
  • Enantiomer separation can be achieved by several methods already known. For example, a racemic mixture of two enantiomers can be separated by chromatography ("Chiral Liquid Chromatography", WJ Lough, Ed. Chapman and Hall, New York, 1989). Enantiomers can also be separated by traditional separation techniques. For example, enantiomers can be separated by diastereomeric salt composition and fractional crystallization.For the separation of enantiomers of carboxylic acids, diastereomeric salts can be separated by brucine, quinine, ephedrine, strychnine, etc. The enantiomer is formed by adding an enantiomerically pure chiral base.
  • diastereomeric esters are separated by enantiomerically pure chiral, such as menthol, an enantiomerically enriched carboxylic acid, following separation of the diastereomeric ester to yield free material, hydrolysis and separation. It is formed by adding alcohol.
  • chiral carboxylic or camphorsulfonic acid, tartaric acid, mandelic acid or Addition of sulfonic acid such as lactic acid results in the formation of diastereomeric salts.
  • the active enantiomer can also be synthesized by stereospecific synthesis using known methods to yield only the desired optical isomer.
  • Chiral synthesis can yield products of high enantiomeric purity. However, in some cases, the enantiomeric purity of the product is not particularly high. Experts appreciate the above separation method as further enhancing the enantiomeric concentration obtained by chiral synthesis.
  • the optical density of the enantiomer is determined by methods known from the prior art. For example, an enantiomer sample can be analyzed by high performance liquid chromatography on a chiral chromatography column.
  • the chymase inhibitor as a serine protease inhibitor contained in the drug of the present invention is used for a method for preventing, suppressing or treating adhesion formation in the peritoneum of a warm-blooded mammal, and has at least one effect on the mammal.
  • An appropriate amount of chymase inhibitor can be administered intravenously, orally, or transdermally, such that it is present in a sufficient amount for a period of time for tissue repair.
  • a chymase inhibitor which is a peptide derivative of arylgester of monoaminoalkylphosphonic acid such as Suc-Val-Pro-PheP (OPh) 2
  • a chymase inhibitor which is a peptide derivative of arylgester of monoaminoalkylphosphonic acid such as Suc-Val-Pro-PheP (OPh) 2
  • enantiomerically concentrated preparations of peptide derivatives of aryl diesters of monoaminoalkylphosphonic acid for example Suc-Val-Pro-L-PheP (OPli) 2
  • the Suc-Val-Pro-L_PheP (OPh) 2 is preferably concentrated to 50%, 80%, preferably 95% or more of the total 2 % of SucVal-Pro-PheP (OPh).
  • the warm-blooded mammal is preferably a human.
  • the concentration method can be obtained by, for example, crystallizing using aceton-ether and rec
  • the agent of the present invention can be prepared and administered as a pharmaceutical composition in the form of a pharmaceutical preparation, alone or together with an appropriate pharmaceutical additive.
  • the administration form of such a pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it is used for oral administration or parenteral administration. Examples thereof include tablets, syrups, and ampoules for injection. Preparations, lyophilized powder for injection, ointments, shipping agents and the like can be used. Preparation into various formulation types can be performed according to a conventional method using well-known formulation additives available to those skilled in the art, for example, diluents and additives.
  • a freeze-dried powder for injection is prepared by dissolving an effective amount of the purified protease inhibitor in a diluent such as distilled water for injection, physiological saline, or an aqueous glucose solution, and if necessary, carboxymethyl sepharose or sodium alginate.
  • a diluent such as distilled water for injection, physiological saline, or an aqueous glucose solution, and if necessary, carboxymethyl sepharose or sodium alginate.
  • Excipients such as lime, stabilizers such as polyethylene glycol, sodium dextran sulfate, amino acids, and human serum albumin; preservatives such as benzyl alcohol, benzalkonium chloride, and phenol; glucose, calcium dalconate, and pro-hydrochloride
  • a soothing agent such as force-in and a pH regulator such as hydrochloric acid, acetic acid, citric acid, sodium hydroxide and the like are added, and the mixture can be produced by a conventional method.
  • the ampoule for injection may be prepared by dissolving an effective amount of the protease inhibitor in a diluent such as distilled water for injection, physiological saline, Ringer's solution, and the like, and if necessary, a solubilizing agent such as sodium salicylate and mannitol; After adding additives such as buffering agents such as sodium citrate and glycerin, isotonic agents such as pudose and added bran, and the above-mentioned stabilizers, preservatives, soothing agents, pH regulators, etc. It can be prepared by sterilization by heat sterilization, sterile filtration or the like. Depending on the type of active ingredient, it may be inactivated during the heat sterilization step, so the sterilization method should be selected appropriately.
  • a solubilizing agent such as sodium salicylate and mannitol
  • additives such as buffering agents such as sodium citrate and glycerin, isotonic agents such as pudose and added bran, and the above-
  • the medicament of the present invention is obtained by using tablets, granules, Formulations suitable for oral and parenteral administration in solid form such as capsules and powders, or in liquid form such as liquids, suspensions, syrups, emulsions, lemonades, ointments and shipping agents It can be formulated and used as a pharmaceutical preparation. If necessary, supplements, stabilizing agents, wetting agents and other customary additives such as lactose, citrate, tartaric acid, stearic acid, magnesium stearate, terra alba, sucrose, corn starch, talc, gelatin, etc. Agar, pectin, peanut oil, olive oil, cocoa oil, ethylene glycol and the like may be added.
  • the agent of the present invention contains an effective amount of at least one protease inhibitor, and is administered at an effective concentration at the site of adhesion formation such that the protease inhibitor is retained for a time sufficient for substantial epithelialization. Can be.
  • the amount and concentration of the protease inhibitor that can be administered are determined in such a range that the concentration sufficient for obtaining the effect, that is, the “effective amount” is the minimum concentration and the “pharmaceutically acceptable” concentration is the maximum concentration. be able to.
  • Protease inhibitor mixtures should be formulated in a suitable dosage form and medium (eg, saline) so that the desired adhesion formation can be prevented, suppressed, or treated at the site where it is desired (abdomen, chest, eyes, heart, gynecological tissue, etc.). Water) and can be applied intravenously, orally or transdermally.
  • transdermal application means to apply or paste an ointment or a preparation prepared in a ship preparation to an affected area, and is distinguished from application to a site on a tissue surface of a subject. You.
  • the term "effective amount” means a sufficient amount of an agent that is slightly or nontoxic and that achieves a desired reaction in the prevention, suppression or treatment of the above-mentioned adhesion formation.
  • the exact amount required will vary from subject to subject, and will vary depending on the species, age, weight, general physical condition, and mode of administration of the subject.
  • An appropriate "effective amount” is based on what is provided here and It can also be determined by universal prior art using the method.
  • “Pharmaceutically acceptable” refers to human or animal tissue that does not have undue toxicity, inflammation, allergic reactions or other problems or complications, in proportion to the proportion of effects and risks. Means a substance, compound, mixture or mode of administration within the scope of sound medical judgment appropriate for contact with the patient.
  • the protease inhibiting compound can be administered at intervals of general action, for example, before, during, or after the completion of the operation.
  • Administration can begin at least 1 to 72 hours, preferably 1 to 48 hours after surgery.
  • administration can be started at least for 1 to 24 hours, preferably 1 to 12 hours after surgery, and in the case of oral administration, the administration can be similarly performed for 1 to 72 hours, preferably 12 to 12 hours.
  • Administration can begin between 4848 hours, more preferably between 12-24 hours.
  • the administration can be started at least for 1 to 72 hours, preferably for 1 to 48 hours after the operation.
  • the period during which postoperative adhesions can be formed is 24 hours to 14 days after the operation, and therefore, in the case of intravenous administration, oral administration, and transdermal application, the agent of the present invention is continued during this period. Can be administered in a controlled manner.
  • the agents of the present invention can be administered at an effective concentration of at least one protease inhibitor at the site of adhesion formation at a dose substantially sufficient for epithelialization.
  • a chymase inhibitor Suc-Val-Pi'o-L-PheP (OPh) 2
  • the effective dose of chymase inhibitor can be selected between 0.0001 and 100 mg per day for 1 kg of adult body weight.
  • 0.0001 to: L00 mg preferably in the range of 0.01 to: Lmg
  • 0.1 The dose can be selected between ⁇ : 100 mg, preferably 0.1-: LOmg.
  • transdermal application it can be applied between 0.0001 and: L000 mg, preferably between 0.1 and 100 mg.
  • Example 1 Example 1
  • Drugs consisting of peptide derivatives of arylgesters of aminoalkylphosphonic acids have been proven and implemented by one of the prior art (Biochemistry, 30, p. 485-493, 1991).
  • the inactive enantiomer in the solution was crystallized and removed from the solution. After removing the block from the active enantiomer in the solution of Boc to which HC1 was added, the sample was coupled with Boc-Val by WSCD-HOBt reaction, and the block was removed again and separated. To this product, succinic anhydride and triethanoamine were added to obtain Suc-Val-Pro-PheP (OPh) 2 . The product was then concentrated by reverse phase HPLC.
  • Phenylacetoaldehyde (28.3 mL, 0.242 mol) was dissolved in 45 mL of acetic acid. Benzyl ester of rubamyl acid (24.4 g, 0.161 mol) and triphenyl phosphite (50.0 g, 0.161 mol) were added to the solution, and 1.5 hours 85. Stirred with C. After evaporation of the organic solvent, the remaining solution was cooled to room temperature, and 400 niL of methanol was added to the solution and allowed to crystallize at -20 ° C.
  • the crystal was crystallized from acetone and recrystallized in the same manner to remove the inactive enantiomer (D-form) to obtain Boc-Pro-L-PheP (OPh) 2 .
  • the remaining solution was concentrated in vacuo, and toluene-ethyl acetate (5: 1) was added as a solubilizing agent to yield 5.10 g of enantiomer and purified on medium pressure silica gel.
  • Boc-Pro-L-Phe p (OPh) 2 (4.98g, 9.05 mmol) was dissolved in 37mL of cold HC1 / Jioki San (4.9 N), and stirred at room temperature for 1 hour. The solution was evaporated and dried in vacuo. The residue was dissolved in 40 niL of DMF, and Boc-Val (2.06 g, 9.50 mmol) and HOBt (1.35 g, 9.96 mmol) were added to the solution. WSCD (1.77 mL, 9.96 mmol) was added dropwise to this solution while being dripped or cooled with ice, and the mixture was stirred at room temperature.
  • Boc-Pro-L-Phe p (OPh) 2 (5.86g, 8.47 mmol) was dissolved was added to 35mL of cold HClZ Jioki San (4.9 N), and stirred at room temperature for 1 hour. The solution was evaporated to dryness in vacuo. The residue was dissolved by adding 35 mL of DMF, and succinic anhydride (1.02 g, 10.2 minol) was added. Triethylamine (2.36 mL, 16.9 mmol) was added dropwise to this solution and stirred at room temperature for 2 hours. While cooling with ice, the pH of the solution was adjusted to pH 1.0 with HC1 solution, and ethyl acetate was added to extract the sample.
  • the extract was washed with saturated brine solution, dried over MgSO 4, to yield the product as Kiiroo I le, filtered in vacuo and concentrated.
  • the oil was concentrated by reverse phase HPLC (separation tube: YMC ODS SH-363-5, 30 X 250 mm, mobile phase: 0.1 TFA, gradient 40-70% MeCN), and 2.30 g (42%) of white powder was obtained.
  • the product was produced and cooled and dried.
  • Adhesion degree 2 Adhesion between several parts of the heart and surrounding tissues is observed, but by towing, the adhesions can be exfoliated and the heart can be exposed.
  • adhesion degree 4 was 3 cases (37.5%), adhesion degree 3 was 2 cases (25%), adhesion degree 1 was 1 case (12.5%), and the rest was 0 (25%) In contrast, in the Suc-Val-Pro-L-PheP (OPh) 2 administration group, adhesion degree 4 was 1 case (12.5%), adhesion degree 2 was 1 case (12.5%), and the rest was 0 ( 75%), and the degree of adhesion was significantly reduced.
  • the agent for preventing, suppressing or treating adhesion formation of the present invention is useful for preventing adhesion by intravenous administration, oral administration or transdermal application, and is useful after orthopedic or plastic surgery. It is useful not only for adhesions of inflammatory organs but also for adhesions of inflammatory organs.

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Abstract

本発明の課題は、例えば、心臓、胸部、婦人科的、眼病、腹部等の整形外科的あるいは形成外科的な手術を含む様々な外科的工程の前若しくは後に、又は外傷若しくは炎症等の起因による内臓癒着が危惧される場合に、効果的に癒着形成を防止、抑制又は治療を可能とする薬剤を提供することである。静脈内投与、経口投与又は経皮適用することによる少なくとも１の効果的な量のプロテアーゼ阻害剤を含む薬剤による。該プロテアーゼ阻害剤は、好ましくはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、該セリンプロテアーゼ阻害剤はキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤である。具体的には、キマーゼ阻害剤であり、Suc-Val-Pro-PheP(OPh)2であるα‐アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体であり、好ましくは鏡像異性体Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2である。

Description

癒着形成防止、 抑制又は治療剤
本出願は、 参照によりここに援用されるところの、 日本特許出願番号 特願 2003-028743からの優先権を請求する。 明
技術分野
田
本発明はプロテアーゼ阻害剤を使用した癒着形成予防方法に関する。 さらに詳しくは、 本発明はセリンプロテアーゼ阻害剤、 特にキマーゼ阻 害剤を使用した癒着形成予防方法に関する。
背景技術
術後癒着形成は、 例えば心臓、 胸部、 婦人科、 眼科および腹部等の一 般的な整形外科的あるいは形成外科的な手術後におこる主要な合併症で ある。 囲心癒着は顕著な問題を引きおこし、 再手術の心臓外科手術の罹 病率や死亡率を増加させる（J. Invest. Surg. 14:93·97, 2001：非特許文 献 1 )。 術後の腹膜癒着は、 腹部や婦人科手術後において、 重症な場合に は腸閉鎖症、 不育症、 痛みなどの合併症を伴う罹病の主な原因となって レヽる（Dig. Surg. 18:260-73,2001：非特許文献 2 )。 トラウマ、 乾燥、 局 部貧血、 伝染性由来の腹膜炎、 子宮内膜症を含む多くの原因が癒着形成 に関係あるとされる一方、 癒着形成の病態生理学的本質は完全には理解 されてはいない。
術後癒着は、 一般的に傷害後 5〜7日内の通常創傷治癒反応の結果と しておこる。 癒着形成と非癒着再上皮形成は代替経路であり、 いずれも 共に凝固の作用から開始し、 それはカスケ一ド反応でフィプリンゲルマ トリ ックスの構築へ結びつくものと考えられる。 フィプリン沈着が過剰 又は除去されないと、 フイブリンが架橋を形成することにより、 フイブ リンゲルマトリッタスが形成され癒着の予備軍となり うる。 架橋は線維 芽細胞を含む細胞要素により癒着組織の基礎となる。 これに対してブラ スミンシステムのような腹膜の錄維素溶解酵素保護システムはフイブリ ンゲルマ 1、リックスを陣去することができるが、 外科手術は劇的にフィ プリノゲン分解活動を衰退させるので、 癒着形成又は再上皮形成のいず れの経路を選択するかは損傷した組織表面及びフイブリン溶解の程度に より決定される。
癒着形成に対する予防と治療に対する様々な試みが行われてきたが、 限られた成果と好ま しく ない副作用を残すだけであつた（The Pertione m, Springer-Verlag, NY 307.369, 1992：非特許文献 3 )。 例 えば、 フイブリン沈着を予防する試みとして、 腹膜洗浄で線維素性滲出 液を洗い流すもの、 局部貧血を最小限に抑える手術技術、 治療漿膜表面 の付着を制限する障壁の使用などが試されてきた。 かわって、 コルチコ ステロイ ドゃ非ステロイ ド系などの抗炎症剤が広く使用されるようにな つた（Clin. Exp. Gynecol. 28:126-127， 2001：非特許文献 4 )。 骨格形成 後に従来のタンパク質分解酵素でブイプリンを分解してフィプリン沈着 を除去する方法は研究中である（Int. surg. 83:11-14, 1998：非特許文献 5 )。 術後癒着の形成防止又は治療方法として普遍的に効果的な方法は、 まだ立証されているとはいえない。
マスト細胞はァレルギー性の炎症反応の誘導において重要な役割をは たしている。マスト細胞はその表面に IgEの Fc部及びあるクラスの IgG を結合させる受容体を発現し、 それらの表面に抗体が結合するのを可能 にさせる。 結合した抗体と抗原の相互作用により、 結果として、 マス ト 細胞からヒスタミン、 セロト-ン、 シトキン、 その他アレルギー性、 過 敏性の反応の発生に対抗する様々な酵素等の伝達物質が放出される。 加 えて、 マスト細胞は腹膜癒着形成に関わっているとの指摘もある（Am. J.Surg. 165； 127-130, 1993：非特許文献 6 )。 ラットモデルで、 マスト 細胞の活性化、 滞留を抑制するマスト細胞安定剤が癒着形成の減衰に効 果があるとの報告がある（Surg. Today 29:51-54， 1999：非特許文献 7 )。 また、 マスト細胞欠乏マウスにおける癒着形成が、 正常マウスに比べ顕 著に軽症である事をも立証されている（J. Surg. Res. 92:40-44, 2000：非 特許文献 8 )。これらの報告はマス ト細胞が癒着形成に密接に関わってい ることを示すものである。 しかしながら、 マスト細胞の正確な役割や、 マス ト細胞から放出されたいずれの物質が癒着に関係するのかはまだ明 らかにされていなレ、。
キマーゼは、 マスト細胞の分泌顆粒に含まれるキモトリプシン様セリ ンプロテアーゼである。 キマーゼは、 幹細胞因子を活性化させるサイ ト 力インであり、 マス ト細胞蓄積誘導能を有する。 例えば、 盲腸擦過後の マウスの治療サイ トにおいて、 キマーゼ活性が顕著に増加したことが報 告されている （J. Surg. Res. 92:40-44, 2000：非特許文献 8 )。 つまり、 キマーゼ陽性マスト細胞は癒着形成の発生に関し、 役割を担っているよ うである。 しかしながら、 癒着形成の発生におけるキマーゼの病態生理 学的な役割はいまだ不明確である。 キマーゼと癒着形成の関係を解明す るために、 現在、 我々はキマーゼに対し効果のあるプロテアーゼ阻害剤 の癒着形成の防止、 抑制手段としての使用効杲について研究している。 心臓、 胸部、 婦人科的、 眼病、 腹部の外科手術を含む様々な外科的ェ 程の後に効果的に癒着形成を防止、 抑制する方法に対する顕著な要望が ある。 癒着の予防に関し、 中皮細胞によるプラスミノゲン活性剤の合成 及び/又は分泌を促進させること等による方法が開示されている （特表 2002-506817号公表公報：特許文献 1 )。 また、 プロテアーゼ阻害剤を使用した癒着の形成、 再形成を防止，阻 害するための方法について、 我々は米国に出願中である。 ここではキマ ーゼ阻害剤 (例： -aminoalkylphosphonate derivativesゃその他セリ ンプロテアーゼ阻害剤を使用して、 哺乳類における外科手術又は事故等 による創傷後の腹膜又は胸膜腔の器官、 その他の身体部位に対する癒着 形成'再形成を防止、抑止するために、被検体の組織表面のある部位に、 組織修復に十分の一定期間投与することにより脊椎動物被検体内の組織 表面間の癒着形成を防止、 抑制する方法を提供した。
しかしながら、 これらの方法は、 組織表面に薬剤を投与するものであ り、 該投与方法であれば、 投与時期は外科手術後の一定期間に限定され るため、 癒着の防止及び抑止に十分とはいえない。 さらに、 炎症等によ り生体内で癒着が起こる場合もあり うるが、 この場合にも従来の方法で は処理することができない。
(非特許文献 1 ) Krause et al" J. Invest. Surg. 14:93-97， 2001 (非特許文献 2 ) Liakakos et al" Dig. Surg. 18:260-73,2001
(非特許文献 3 ) diZerega and Rogers, The Pertioneum, Springer -Verlag, NY 307-369, 1992
(非特許文献 4 ) Baysal, Clin. Exp. Gynecol. 28:126-127， 2001 (非特許文献 5 ) Hioki et al" Int. surg. 83:11- 14， 1998
(非特許文献 6 ) Liebman et al"夏， Am. J.Surg. 165； 127- 130, 1993 (非特許文献 7 ) Adachi et al" Surg. Today 29:51-54, 1999
(非特許文献 8 ) Yao et al., J. Surg. Res. 92:40-44， 2000
(特許文献 1 ) 特表 2002-506817号公表公報 発明の開示
本発明は、 例えば、 心臓、 胸部、 婦人科的、 眼病、 腹部の整形外科的 あるいは形成外科的な手術を含む様々な外科的処理の前、若しくは後に、 叉は外傷若しくは炎症等の起因による内臓癒着が危惧される場合に、 効 果的に癒着形成を防止、 抑制を可能とする薬剤を提供することを目的と する。
本発明者らは、 少なくとも 1の効果的な量のプロテアーゼ阻害剤を、 癒着が危惧される組織の組織修復に十分量一定期間投与することで、 癒 着形成を防止可能としたことに着目し、 鋭意研究を重ねた結果、 該プロ テアーゼ阻害剤を含む薬剤を静脈内投与、 経口投与又は経皮適用するこ とで上記目的を解決しうることを見出し、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、
1 . 少なくとも 1のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、 静 脈内投与、 経口投与又は経皮適用されることを特徴とする脊椎動物被検 体内の組織表面の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤、
2 . 該プロテアーゼ阻害剤が、 セリンプロテアーゼ阻害剤である、 前項 1に記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤、
3 . 該セリンプロテアーゼの阻害剤が、 キモトリブシン様セリンプロテ ァーゼ阻害剤である前項 2に記載の癒着形成防止、 抑制又は治镌剤、
4 . 該キモトリブシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、 キマーゼ阻害剤 である前項 3に記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤、
5 . 該キマーゼ阻害剤が、 a -ァミノアルキルホスホン酸のァリールジ エステルのぺプチド誘導体である前項 4に記載の癒着形成の防止、 抑制 又は治療用薬剤、
6 . 該キマーゼ阻害剤が、 Suc-Val-Pro-Phep(OPli)2である、 前項 4のに 記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤、
7 . 該キマーゼ阻害剤が、 Suc-Val-Pro-PheP(OPh)2 の鏡像異性体 Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2の濃縮製剤である前項 4に記載の癒着形成 防止、 抑制又は治療剤、
8 . 該鏡像異性体濃縮製剤において、 Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2 が Suc-Val-Pro-PheP(OPh)2の総重量の 9 5 %以上を含有する前項 7に記 載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤、
9 . 該プロテアーゼ阻害剤が、 当該部位において当該プロテアーゼ阻害 剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、 そして、 当該伝達体は、 ヒアルロン酸、 ヒ ドロゲル、 カルポキシメチルセルロー ス、 デキストラン、 シクロデキストラン、 そしてその化合物からなる集 合体より選択された高分子量担体をなす、 前項 1〜 8のいずれか 1に記 載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤、
1 0 . 前項 1〜9のいずれか 1に記載のプロテアーゼ阻害剤と、 薬学的 に許容できる希釈液又は賦形剤からなる、 癒着形成の防止、 抑制又は治 療用薬剤、
1 1 . 外科手術前、 外科手術中若しくは外科手術後、 又は炎症性の内臓 癒着が危惧される場合に脊椎動物被検体に対し、 前項 1〜8のいずれか
1に記載の治癒形成の防止、抑制又は治療剤を投与する治癒形成の防止、 抑制又は治療方法、 よりなる。 図面の簡単な説明
図 1は、 偽薬または Suc-Val-Pro-L-PlieP(OPh)2を内服したときの平 均癒着スコア一を示した図である。 （実験例） 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 プロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤を、 静脈内投与、 経 口投与又は経皮適用することを特徴とする脊椎動物披検体内の組織表面 の癒着形成防止、 抑制又は治療剤に関するものである。 当該プロテア一 ゼ阻害剤は、 例えば外科的処理の前 · 中 ·後に当該被検体に投与するこ とができる。 また、 外科的手術を施さない場合でも、 例えば外傷や炎症 性の内臓癒着が危惧される塲合等においても投与することができる。 本発明の薬剤は、 温血の哺乳類の腹膜内の癒着形成を防止、 抑制又は 治療する為の薬剤であり、 当該哺乳類に少なくとも 1の効果的な量のセ リ ンプロテアーゼ阻害剤を、 静脈内投与、'経口投与又は経皮適用により 組織修復に十分量一定期間投与することからなる。 好ましい実施例は、 少なくとも 1のキモトリプシン様セリンプロテアーゼであるセリンプロ テアーゼ阻害剤を使用し、術後癒着形成を防止、抑制する方法に関する。 本発明の薬剤は当該温血哺乳類としてヒ トに適用することができる。
(プロテアーゼ阻害剤）
本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤は公知物質であり、 医 薬として使用できる程度に精製されたものであれば、 種々の方法で調製 されたものを使用することができる。
本発明の癒着形成防止、 抑制又は治療剤の対象となるプロテアーゼ群 は、 好ましくはセリンプロテアーゼである。 該セリンプロテアーゼは、 ぺプチド中のセリンを開裂結合させるェンドぺプチダーゼのサブクラス である (Barrett, A. J., In: Protease Inhibitors, Ed. Barrett, A. J. et.al, Elsevir, Amsterdam, p.3-22, 1986)。 セリンプロテアーゼ自体は公知で ある。 例えばキモ ト リブシン · スーパーフア ミ リー及び放線菌扉, (Sti'eptomyces)ズプチリシン ' スーパーファミ リ一等の 2種のセリ ンプ 口テアーゼのスーパーファミリ一が報告されている。
セリンプロテアーゼ阻害剤は公知であり、 以下の系統群に分類するこ とができる。 （1 ) ゥシのすい臓来トリプシン阻害剤 （クニッッ） フアミ リーであり、 塩基性プロテアーゼ阻害剤 (Ketcham, L.K. et al, In:Atlas of Protein Sequence and Structure, Ed. Dayhoff, M. O., p.131-143, 1978) (以下 「BPTI」 という） としても知られている、 （2 ) Kazal群、 ( 3 ) 放線菌属 (Streptomyces)ズブリシン阻害剤群 （以下 「SSI」 とい う）、 （4 )セルピンファミ リー、 （5 )大豆ト リプシン阻害剤（クニッッ） ファミ リー、 （6 ) ポテト阻害剤ファ ミ リー、 （ 7 ) ボウマンバークファ ミ リ一（Laskowski,M. et al. Ann. Rev. Biochem., 49:ρ·593'626， 1980) を含む。 BPTI群、 Kazal群、 SSI群、 大豆トリプシン群、 ポテト トリ プシン群のメンバを含む多くの完全な阻害剤と、 Seprin - α - 1 -抗ト リプシンの開裂型のための結晶学的データが利用できる（Read, R.J. et al.)。 多くのセリンプロテアーゼ阻害剤は広い特異性をもち、 血液凝固 セリンプロテアーゼを含むプロテアーゼのキモトリプシン ·スーパーフ アミリーとセリンプロテア一ゼの放線菌属スーパーファミリ一両者を抑 Jす る こ と カ で き る (Laskowski et al, Ann. Rev. Biochem., 49:p.593-626, 1980)。 各阻害剤の特異性は、 セリンプロテアーゼの直接 の開裂部位に対するァミノ末端のァミノ酸の同一性によつて決定すると 考えられている。 P部位残基として知られるこのアミノ酸は、 セリ ンブ 口テアーゼの活性部位において、 セリンとァシル結合を形成すると考え られている (LaskowskiLaskowski et al, Ann. Rev. Biochem., 49: p.593 - 626, 1980)。
本発明の薬剤に含有される好ましいセリンプロテアーゼ阻害剤は、 セ ノレピン (serpinjファ ミ リーとボウマンノ ーク (Bowman'Birk)ファミ リー に属する。 セルピンファミ リ一に対するセリ ンプロテアーゼ阻害剤とし て、 プラスミノゲン活性化因子阻害剤である PAI- 1、 PAI-2、 PAI-3があ り、 C1 エステラーゼ阻害剤、 a -2-抗プラスミン、 コン トラプシン (contrapsin) , 抗ト リプシン、 抗トロンビン III、 プロテア一ゼネク シン I、 ひ- 1-抗キモ トリブシン、 プロテイン C阻害剤、 へパリンコファ クタ一 II及ぴ成長ホルモン調節タンパク質が挙げられる（Carrell et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol" 52： 527-535, 1987)。
キモトリプシン ·スーハ。一ファミリ一のセリンプロテアーゼの例とし ては、 組織型プラスミ ノゲン活性化因子（tissue -type plasminogen activator： t-PA), トリプシン、 トリプシン様プロテアーゼ、 キモトリ プシン、 プラスミン、 エラスターゼ、 ゥロキナーゼ （又は非尿型プラス ミノグン活性化因子 ： u-PA)、 ァクロシンン、 活性化プロティン C、 C1 エステラーゼ、 カプテシン G、 キマーゼ、 そしてカリクレイン、 トロン ビン、 Vila因子、 IXa因子、 Xa因子、 XIa因子、 Xlla因子を含む血液 凝固カスケ一ドのプロテアーゼなどが含まれる（Barrett, A.J" In: Protease Inhibitors, Ed. Barrett, A. J. et.al" Elsevir, Amsterdam, p.3-22， 1986， Strassburger, W.et.al, FEBS Lett., 157:p.219.223，1983)。
キモトリブシン ' スーパーファミ リ一のすべてのセリンプロテアーゼ の触媒ドメインは、配列相同性と構造相同性をもつ。配列相同性は、 （ 1 ) 特異活性部位残基、 例えば、 トリプシンの場合に、 195位のセリン、 57 位のヒスチジン及び 102位のァスパラギン酸が共通する ； （2 ) ォキシ ァニオン孔 (oxyanion hole) (例えば、 トリプシンの場合に、 193位のグ リシン及び 194位のァスパラギン酸）、 ( 3 ) 構造においてジスルフィ ド 架橋を形成するシスティン残基、 の全保存を含む (Hartley, B.S.,Symp. Soc. Gen. MicrbopL, 24:152- 182(1974))。
構造相同性は （ 1 ) 2つのグリーク · キー構造からなる一般ホールド (common fold)(Richrdoson), ( 2 ) 触媒残基の一般要因、 （3 ) 分子核内 での構造の精密な保存 (Stroud,R.M.， Sci. AM.，231:24-88)を含む。
本発明の薬剤は、 -ァミノアルキルホスホン酸のァリールジエステ ルのペプチド誘導体を含むことができる。 ゥシトロンビン、 ヒ ト因子 XIIa、 ヒ ト因子 Xa、 ヒ ト結晶カリクレイン、 ゥシトリプシン、 ラッ ト 皮膚トリプターゼ、ヒ ト白血球エラスターゼ、ブタすい臓エラスターゼ、 ゥシキモトリプシン、 ヒ ト白血球カテブシン G、 ラットマスト細胞プロ テアーゼ IIを含む幾多のセリンプロテアーゼの阻害剤に関し、これらひ - ァミ ノアルキルホスホン酸塩誘導体が発見されている（米国特許 5543396, 5686419, 5952307, 他)。 これらの誘導体^;、 ヒ ト血凝 ίこ含ま れ、 種々の環境下で非常に安定している。 例えば、 本発明の薬剤に含有 される好適な阻害剤 Suc-Val-Pro-PlieP(OPli)2、 特に好ま しく は Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2は、ヒ ト血漿内で約 20時間の半減期をもつ。 この安定性は重要である。 なぜなら、 腹膜の浸出物は、 大部分のプロテ ァーゼ阻害剤を中和し、 活性を失わせると予測されるからである。 アミ ノアルキルホスホン酸は a -アミノ酸に相似しており、 そして、 一般的 に受容したァミノ酸のための上付き文字の Pへと続く 3文字の略称が命 名された。 例えば、 ァラニンに関するジフエ二ル α _(Ν-ベンジルォキシ カルボ-ノレァミ ノ (N-benzyloxycarbonylamino)ェチルホスホネィ ト (ethylphosphonate)は Cbz-Alap(OPh)2 と略称される。
C-端末のリン酸塩残基を有するぺプチド ValP(OPh)2、それはパリンの 類似体であるが、 これは比較的有効で比較的特異的なエラスターゼ及び エラスターゼ様酵素に特異的な不可逆性阻害剤である。 フエ二ルァラ二 ン、他の芳香族アミノ酸又は長脂肪酸族側鎖と関連性がある C-端末リン 酸塩残基は比較的有効であり、 比較的特効のあるキモトリプシンとキモ トリプシン様酵素の阻害剤である。 オル二チン、 溶解素、 アルギニン又 は、 《 -ァ ミ ノ - a -(4-ア ミ ジノ フエニル）メ タ ンホスホン酸塩 [(4-AmPhGly)p(OPh)2]又は α -アミノ - α -(4'アミジノフエニルメチル）メ タンホスホン酸塩 [(4-AmPhe)p(OPh)2]の C-端末ジフエ二ルエステルに 関連性があるべプチドは、 比較的有効で比較的安定性のあるトリプシン と トリプシン様酵素の阻害剤である。
酵素との反応に対する付加的な特異性及び/又は増加した活性は、 ぺ プチド構造の部位におけるアミノ酸配列の変異により、 阻害分子へ導く ことができる。ぺプチドの P-二トロアニリ ドといった酵素基質の配列と 効果的なぺプチドのリン酸塩阻害剤の配列間には一般的に一致した配列 がある。 比較的高活性の阻害剤は、 一般的に、 特定の酵素のための好都 合なペプチドの P-二トロアユリ ド基質の配列をもつ。 例えば、 キモトリ プシンそしてキモトリプシン様酵素に対して比較的有効な阻害剤である Suc-Val-Pro-Phep(OPh)2 は、 これらの酵素に適当な基質である Suc-Val-Pro-Phe-NA と類似のアミノ酸配列を有する。 ヒ ト白血球エラ スターゼに比較的有効な阻害剤 [Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Valp(OPh)2及ぴ Boc-Val-Pro-ValP(OPh)2]は、 この酵素に対する 2 つの適当な基質 MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-NA及び Boc-Val-Pro'Val'NA と類似のアミ ノ酸配列をもつ。 論文中に報告された、 それらの同じセリンプロテア一 ゼのための比較的有効な可逆的 ·不可逆的な阻害剤中に発見されたぺプ チド配列に基づくセリンプロテアーゼのためのホスホン酸塩阻害剤の設 計も可能である (Powers and Harper, in Protease Inhibitors, Barrett and Salvesen, eds., Elsevier, p55"152, 1986； Trainore, D.A., Trends in Pharm. Sci. 8:303.307, 1987)。
a -ァミノアルキルホスホン酸のジフエ二ルエステルは前記方法によ り合成することができる（米国特許 5543396)。 a -ァミノアルキルホス ホン酸の 2(置換フエニル）エステルは、 トリフエ二ル亜リン酸の代わりに 3(置換フヱニル）リン酸を使用する方法にて調製することができる。パー フルォロアルキルジエステルは、 エステル転移反応に含まれる方法によ つて合成することができる（Szewczyk et al.， Synthesis, p.409-414, 1982)。 代わりに、 前記のようにアミノアルキルホスホン酸のジエステ ルの合成とそれらのペプチドは、 ホスホン酸部分のエステ.ル化により行 うことができる（Bartlett et al" Bioorg. Chem., 14:356-377， 1986)。 本 発明の薬剤に含有される多くの付如的セリンプロテアーゼ阻害剤は、 米 国特許によ り開示される （米国特許 6262069， 5916888, 5900400, 5157019, 4829052, 5723316, 5807829)。
多くの有機化合物は光学活性型が存在する。 光学活性化合物を示す場 合、 識別コード Dそして L又は Rそして Sが、 キラル中心の分子の絶 対配置を示すために使用される。 識別コード (+)と（-)又は dと 1は、 水平 偏光の回転のサインを示すため、 化合物により使用される。 （-)又は 1は 化合物が左旋回していることを意味し、化合物識別コード (+)又は dは化 合物が右旋回していることを示す。 立体異性体とよばれるこれらの化合 物は、 互いに鏡像であることを除けば同一である。 特定の立体異性体は 鏡像異性体として表すことができ、 そのような異性体の混合物は鏡像異 性混合物又は鏡像異性ラセミックと呼ばれることもある。 本発明の薬剤 の製法として、 立体異性純度又は光学純度をより有効性を増加及び/又 は有害作用を減少させる手段を利用することができる。
本明細書において使用される用語 「キラル」 は、 鏡像相手の重合不可 の性質の分子をしめすものである。 しかしながら、 用語 「アキラル」 は 鏡像相手に重合可能な分子を示す。 用語 「立体異性体」 は同一化学構造 をもつ化合物を意味する。 しかし、 空間の原子又は群の配置に関しては 相違する。 特に 「鏡像異性体」 は、 重合不可能な鏡像ともう一つの 2種 の化合物の立体異性体を意味する。
—方、 「ジァステレオマ」は非対称の 2以上の中心を持つ立体異性体を 示し、その分子は相互に鏡像ではない。キラル中心の命名法に関しては、 用語 S と R 配置が IUPAC1974(Reconmiendations for Section E.， Fundamental Stereochemistry, Pure Appl. Chem., 45:13-30, 1976) に より定義される。
本発明の薬剤に含有される化合物に関し、 互換的に使われている用語 「鏡像異性的に濃縮された」 と 「非ラセミ体」 は、 光学的に濃縮された 構成物を示し、その構成物内では鏡像異性体のラセミ混合物と比較して、 一方の鏡像異性体が濃縮されている。 別に明記されていない場合は、 そ れらは、 望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相対的 な割合が 1対 1以上である構成物を示す。 例えば、 鏡像異性的に濃縮さ れた製剤は、 望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相 対的な割合が、重さにして 50%以上であり、望ましくは少なくとも 75%、 さらに望ましくは 80%である。 もちろん濃縮物は、 「十分に鏡像異性的 に濃縮」 された製剤、 「十分に非ラセミ体の」製剤又は 「十分に光学的に 純粋」 な製剤にすることにより 80%以上とすることが可能であり、 それ は少なくとも望ましい鏡像異性体が 85%以上、 望ましくは 90%以上、 さらに望ましくは 95%以上である薬剤を意味する。
鏡像体の分離は、 既に公知の幾つかの方法によって達成することがで きる。 例えば、 2の鏡像異性体のラセミ混合物はクロマトグラフィーに よつて分離することができる（"Chiral Liquid Chromatography", W.J. Lough, Ed. Chapman and Hall, New York, 1989)。 鏡像異性体は、 伝統 的な分離技術によっても分離することができる。 例えば、 ジァステレオ マ塩の構成物と分画結晶化によって鏡像異性体を分離することができる カルボン酸の鏡像異性体の分離については、 ジァステレオマ塩が、 ブル シン、 キニーネ、 エフェドリン、 ストリキニーネ、 その他のような鏡像 異性的に純粋なキラル塩基を添加することにより形成される。代わりに、 ジァステレオマエステルは、 遊離物質を産出するためのジァステレオマ エステルの分離、 加水分離に続いて、 鏡像異性的に濃縮されたカルボン 酸であるメントールのような鏡像異性的に純粋なキラルアルコールを加 えることにより形成される。 ァミノ化合物の光学異性体の分離に関して は、 キラルカルボン又はカンファースルホン酸、 酒石酸、 マンデル酸又 は乳酸といった'スルホン酸の添加によりジァステレオマ塩の形成といつ た結果になる。 上記のような分離技術のほかに、 活性鏡像異性体は、 既 に公知の方法を使用し、 望ましい光学異性体のみを産する立体特異的合 成によっても合成することができる。 キラル合成は高鏡像異性的純度の 生成物を産出することができる。 しかしながら、 幾つかの事例では、 生 成物の鏡像異性的純度は特段高くない。 熟練者たちは、 キラル合成によ つて得られた鏡像異性的濃度をより高めるものとして、 上記分離方法を 高く評価している。 鏡像異性体の光学的濃度は先行技術によって既知の 方法によって決定される。 例えば、 鏡像異性体試料は、 キラルクロマト グラフィーカラム上の高速液体クロマトグラフィ一によつて分析するこ とができる。
本発明の薬剤に含有されるセリンプロテアーゼ阻害剤としてのキマー ゼ阻害剤は、 温血の哺乳類の腹膜内の癒着形成を防止、 抑制又は治療方 法に使用され、 当該哺乳類に少なくとも 1の効果的な量のキマーゼ阻害 剤を組織修復に十分量一定期間存在するように、 静脈内投与、 経口投与 又は'経皮適用することができる。
好適には、 例えば Suc-Val-Pro-PheP(OPh)2 といったひ一ァミノアル キルホスホン酸のァリ一ルジェステルのぺプチド誘導体であるキマーゼ 阻害剤を使用することができる。 より好適には、 鏡像異性的に濃縮した ひ一アミノアルキルホスホン酸のァリ―ルジエステルのぺプチド誘導体、 例えば Suc-Val-Pro-L-PheP(OPli)2の製剤を使用することができる。 こ の Suc-Val-Pro-L_PheP(OPh)2は、 全 SucVal-Pro-PheP (OPh)2重量の 50%、 80%好ましくは 95%以上に濃縮したものが好適である。 当該温 血哺乳類はヒ トであることが望ましい。 濃縮する方法は、 例えばァセト ンーエーテルを用いて結晶化させ、 再度同様に結晶化させることにより 得ることができる。 (製剤）
本発明の薬剤は、 前記プロテアーゼ阻害剤を単独で、 あるいは適当な 製剤用添加物と共に製剤形態の医薬組成物として調製し、 投与すること ができる。 このような医薬組成物の投与形態としては、 経口的投与に使 用されるもの、 又は非経口的に投与されるものであれば特に限定されな いが、 例えば、 錠剤、 シロップ、 注射用アンプル剤、 注射用凍結乾燥粉 末剤や軟膏剤、 シップ剤等を用いることができる。 各種製剤型への調製 は、 当業者が利用可能な周知の製剤添加物、 例えば、 希釈剤や添加剤な どを用いて慣用の手法に従って行うことができる。
例えば、 注射用凍結乾燥粉末剤は、 精製されだ前記プロテアーゼ阻害 剤の有効量を注射用蒸留水、 生理食塩水、 ブドウ糖水溶液等の希釈液に 溶解し、 必要に応じてカルボキシメチルセファロース、 アルギン酸ナト リゥム等の賦形剤、 ポリエチレングリコール、 デキストラン硫酸ナトリ ゥム、 アミノ酸、 ヒ ト血清アルブミン等の安定化剤、 ベンジルアルコー ル、 塩化ベンザルコニゥム、 フエノール等の保存剤、 ブドウ糖、 ダルコ ン酸カルシウム、塩酸プロ力イン等の無痛化剤、塩酸、酢酸、 クェン酸、 水酸化ナトリゥム等の p H調節剤等を加え、 常法により製造することが できる。 また、 注射用アンプル剤は、 前記プロテアーゼ阻害剤の有効量 を注射用蒸留水、 生理食塩水、 リンゲル液などの希釈剤に溶解し、 必要 に応じてサリチル酸ナトリウム、 マ二トール等の溶解補助剤、 クェン酸 ナトリウム、 グリセリン等の緩衝剤、 プドウ糖、 添加糠等の等張化剤、 前述の安定化剤、保存剤、無痛化剤、 p H調節剤等の添加剤を加えた後、 通常の加熱滅菌、 無菌ろ過等により無菌化して調製することができる。 なお、 有効成分の種類によつては加熱滅菌工程で失活する場合があるの で、 滅菌方法は適宜選択すべきである。
本発明の薬剤は、 医薬上許容される担体等を用いて、 錠剤、 顆粒、 力 プセル剤、 散剤等の固型状、 あるいは液剤、 懸濁剤、 シロップ、 乳剤、 レモナーデ剤等の液状の態様や軟膏剤、 シップ剤の態様で、 経口投与、 非経口投与に適した剤型に製剤化し、 医薬製剤として用いることもでき る。 必要ならば、 上記製剤に補助剤、 安定化剤、 湿潤剤、 その他の常用 添加剤、 例えば乳糖、. クェン酸、 酒石酸、 ステアリン酸、 ステアリン酸 マグネシウム、 白土、 庶糖、 トウモロコシ澱粉、 タルク、 ゼラチン、 寒 天、 ぺクチン、 落花生油、 ォリーブ油、 カカオ油、 エチレングリコール 等を配合してもよい。
(投与量）
本発明の薬剤は、少なくとも 1種のプロテアーゼ阻害剤を有効量含み、 該プロテアーゼ阻害剤が癒着形成の部位において効果的な濃度で実質的 に上皮化に足る十分な時間滞留するように投与することができる。
本発明において、 投与可能なプロテアーゼ阻害剤の量と濃度は、 効果 を得るに十分な濃度すなわち「有効量」 を最低濃度とし、 「薬学的に許容 できる」 濃度を最高濃度とした範囲で決定することができる。 所望の癒 着形成を防止、 抑制又は治療したい部位 （腹部、 胸部、 眼、 心臓、 婦人 科的組織等） で効果が得られるように、 プロテアーゼ阻害剤混合物は適 した剤型や媒体 （生理食塩水） で、 静脈内投与、 経口投与又は経皮適用 することができる。 本発明において、 経皮適用とは、 軟膏剤や、 シップ 剤の製剤に調製したものを患部に塗る、 若しくは貼ること等をいい、 被 検体の組織表面のある部位に塗布するのとは区別される。
本発明において 「有効量」 という用語は、 上記の癒着形成の防止、 抑 制又は治療において、 微毒又は無毒で、 所望する反応を得る為の薬剤の 十分な量を意味する。 求められる正確な量は被検体によってまちまちで あり、 被検体の種、 年齢、 体重、 一般的体調、 投与の形態などによって 変わってくる。 適切な 「有効量」 は、 ここに提供された事と慣例的な方 法を使用した普遍的な先行技術により決定することもできる。
「薬学的に許容できる」 とは、 効果と危険性の比率的と比例して、 過 度の毒性、 炎症、 アレルギー反応又はその他の問題点又は合併症を伴わ ない、 ヒ ト又は動物の組織との接触に適当な、 信頼できる医療判断の範 囲内での、 物質、 化合物、 混合物又は投与形式を意味する。
該プロテアーゼ阻害化合物は一般的に作用する間隔で投与することが でき、 例えば手術前、 手術中、 手術完了後の期間にも投与することがで きる。術後少なく とも 1〜72時間、 好ましくは 1〜48時間の間に投与を 開始することができる。 例えば静脈内投与の場合は、 術後少なく とも 1 ~24時間、 好ましくは 1〜12 時間の間に投与を開始することができ、 経口投与の場合は、 同様に 1〜72時間、 好ましくは 12〜48時間、 より 好ましくは 12〜24時間の間に投与を開始することができる。 さらに、 軟膏剤等を経皮適用する場合は、 術後少なくとも 1〜72時間、 好ましく は 1〜48時間の間に投与を開始することができる。 一般的に術後癒着を 形成しうる期間は、 術後 24時間〜 14日であるから、 静脈内投与、 経口 投与及び経皮適用の場合にはいずれもこの期間内に本発明の薬剤を継続 的に投与することができる。
本発明の薬剤は、 少なくとも 1種のプロテアーゼ阻害剤が癒着形成の 部位において効果的な濃度で実質的に上皮化に足る投与量で投与するこ とができる。 例えば、 本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤の 具体例であるキマーゼ阻害剤（Suc-Val-Pi'o-L-PheP(OPh)2)を手術中に 10 / M使用したとき、 該生体内のキマーゼ活性は、 血管組織において 4 週間にわたり顕著に抑制された。 キマーゼ阻害剤（Suc-Val-Pro-L-PheP (ΟΡ1ι)2)の効果的な投与量は、成人体重 1 k g、 1 日あたり 0.0001〜100 mgの間で選択することができる。 例えば静脈内投与の場合には 0.0001 〜： L00mg、 好ましくは 0.01〜： Lmgの間で、 また経口投与の場合には 0.1 〜： lOOmg、好ましくは 0.1〜： LOmgの間で投与量を選択することができる。 さらに、 経皮適用の場合には、 0.0001〜： L000mg、 好ましくは 0. 1- 100 mgの間で適用することができる。
他のプロテアーゼ阻害剤の効果的な量、 経路は、 公知の手段により決 定することができる。 実施例
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれら に限定されるものではない。 実施例 1
(ァミノアルキルホスホン酸誘導体の調製）
ァミノアルキルホスホン酸のァリ一ルジェステルのぺプチド誘導体か らなる薬剤は先行技術の 1 つによって証明され、 実行される (Biochemistry, 30, p.485-493, 1991)。
キマーゼ活性と癒着形成との関係を説明するのに、 典型的なセリンプ 口テアーゼ阻害剤、 キマーゼ阻害剤、 Suc-Val-Pro-Phep(OPli)2の効果を 調べた。 この化合物は公知の方法を使用し合成した（Biochemistry, 30, p.485-493, 1991)。 さらに詳しくは、 Cbz-Val'OH(0.25g， 1 mmol), DCC (0.2g, 1 mmol)と水素和物 Cbz-Val-Pro-PheP(OPh)2(0.584g, 1 mmol)は、 30mlの酢酸ェチルに溶解し、 オイルを加える。 この溶液に対し、 0.1g(l mmol)のコハク無水物と O.lgの 5%Pd/Cが加えられ、 混合物は、 薄層 クロマトグラフィ一が新しい斑点を示すまで、水素気圧下で攪拌される。 触媒はろ過により取り除かれ、 有機層は数回水で洗浄され、 乾燥後有機 溶媒は提供の為に除去させる。 有機物として例えば、 ハイ ドロスコープ 固体としての 0.45g(65%)の生成物が得られた（mp.50-53°C .;one apot on TLC, Rf=0.4; sip NMR 19.75， 19.23ppm, ratio 1:1， Anal. Calcd. for C34H40O3N3P.2H2O: 59.56； H,6.42. Founds, 59.59； H, 6.42)。 実施例 2
(Suc-Val-Pro-PheP(OPh)2キマーゼ阻害剤の濃縮鏡像異性体の調製） 以下に使用されているように、 以下の略語が適用される。 Zはべンジ /レオキシカルボニル、 Boc は tert-ブチルォキシカルボニル、 WSCD は 力ノレボンィ ド、 HOBtは Oleksyszyn と Powers (Methods Enzymol, 244：423-441, 1994)及びべンジルォキシカルボニルは水素臭化物酸溶液 により取り除かれた。 生成物を WSCD-HOBt反応により Boc-Pro と力 ップリングさせ、 その後ラセミ混合物を得た。 その後、 再沈殿により分 離した。 まず、 溶液中の非活性鏡像異性体を結晶化させて、 溶液から除 去した。 HC1を加えた Bocの溶液中の活性鏡像異性体からブロックを除 いた後、試料を WSCD-HOBt反応により Boc-Valとカップリングさせ、 再度ブロックを除いて分離された。 この生成物に対し、 コハク無水物と トリエタノアミンを加え、 Suc-Val-Pro-PheP(OPh)2を得た。 そして、 生 成物を逆相 HPLCによって濃縮した。
(Z-DL-PheP(OPh)2)
フエ二ルァセトアルデヒ ド (28.3mL,0.242mol)を 45mLの酢酸で溶解 した。 力ルバミル酸べンジルエステル（24.4g, 0.161mol)と トリフエニル 亜リン酸塩 (50.0 g, 0.161 mol)をこの溶液に加え、 1.5時間 85。Cで攪拌 した。 有機溶剤を蒸発させた後、 残りの溶液を室温まで冷まし、 400niL のメタノールをこの溶液に加え、 -20°Cで結晶化で.きるようにした。該生 成物をろ過により集め、 冷メタノールにより洗浄し、 32.9g(42%)の Z-D-PheP(OPli)2と Z-L-PheP(OPli)2の化合物を産出するため真空内で乾 燥した。 (DL-PheP(OPh)2 · HBr)
Z-PheP(OPh)2と Z-L-PheP(OPh)2(14.3g, 29.3 mmol)の混合物を 30mL の 25%水素臭化物 Z酢酸溶液中に溶解し、 室温で 1時間攪拌した。 両方 を加えた後、 分離された固体試料をろ過によって集めた。 この試料をェ 一テルで洗浄し、 12g(94%)の Dと L-PheP(OPh)2 · HBrの混合物を得る 為に真空乾燥した。
(Boc-Pro-DL-Phep(OPh)2)
Dと L-Phep(OPh)2'HBr(11.5g, 26 mmol), Boc-Pro(5.53g, 25.7mmol) と HOBt(3.58g, 26.5rnmol)の混合物を 70mLの DMFに溶解し、 WSCD (4.70niL, 26.5nmiol)を点滴によりで氷で冷却しながら加えた。 室温で 3.5時間攪拌した後、溶液を真空で濃縮し、ェチルアセテートを加えた。 結果により得られた溶液を逐次、 酢酸とアル力リ性溶液で洗浄し、 MgS04で乾燥し、真空乾燥濃縮した。 アセトンーェテ 'ールにより結晶化 させ、同様に再結晶化させて不活性鏡像異性体 (D体)を除去し、 Boc-Pro- L-PheP(OPh)2を得た。 残存溶液を真空で濃縮し、 5.10gの鏡像異性体を 産出するための溶解剤としてトルエンーェチルーァセテ一ト（5:1)を加 え、 中圧シリカゲルで精製した。
(Boc-Pro-L-Phep(OPh)2)
Boc-Pro-L-Phep(OPh)2(4.98g, 9.05 mmol)を 37mLの冷 HC1/ジォキ サン (4.9N)に溶解し、 室温で 1時間攪拌した。 概溶液は真空で蒸発、 乾 燥させた。 残物を 40niLの DMFで溶解し、 Boc-Val(2.06g， 9.50 mmol) と HOBt(1.35g， 9.96 mmol)をこの溶液に加えた。 WSCD(1.77mL， 9.96 mmol)を点滴又は氷で冷やしながらこの溶液に加え、 室温でー晚攪拌し た。 酢酸ェチルをこの反応溶液に加え、 引き続いて、 酸性とアルカリ性 の溶液で洗浄した。 MgS04で乾燥させ、 ろ過した後、 無色オイルとして 6.26g(94%)の生成物を産出し、 真空で濃縮した。 (Suc-Pro-L-Phep(OPh)2)
Boc-Pro-L-Phep(OPh)2(5.86g, 8.47 mmol)を 35mLの冷 HClZジォキ サン (4.9 N)に加え溶解し、室温で 1時間攪拌した。概溶液を真空で蒸発、 乾燥した。 残物を 35mL の DMF を加え溶解し、 コハク無水物（1.02g， 10.2minol)を加えた。 トリェチルァミン（2.36mL, 16.9mmol)を点滴によ りこの溶液に加え、 室温で 2時間攪拌した。 氷冷しながら HC1溶液によ り溶液の pHが pHl.O となるように調整し、酢酸ェチルを加えて試料を 抽出した。 抽出物を飽和塩水溶液で洗浄し、 MgS04で乾燥させ、 黄色ォ ィルとして生成物を産出し、真空でろ過、濃縮した。オイルを逆相 HPLC (分離管： YMC ODS SH-363-5, 30 X 250mm, 移動相： 0.1TFA, 勾配 40 -70% MeCN)により濃縮し、 ホワイ トパウダーとして、 2.30g(42%)の生 成物を産出し冷却乾燥した。
(分析結果）
試料： Suc-Val-Pro-L-Phep(OPli)2
Lot.： 520217
Volume： 2.0gX l
概観： 白粉
HPLCによる純度：主ピーク 98.8%
HPLCコンディシヨン：
カラム ： YMC Pack, ODS-A 4.6mm I.D. X 150mm.
移動相 0.1%TFA, 勾配 30-80% MeCN (25niin)
流率 ： 1.0mL/min
検出 ： フォトメ一ターにより紫外線吸光度 (波長： 220nm) アミノ酸分析： モル率 回収率
Val(l) 1.00 90.5%
Pro(l) 1.03 Phep(OH)2 0.98
加水分解状況： 6mol HC1, phenol, 110°C, 22時間
基本分析 ： Calcd C34H40N3O8S: 0,62.86； H,6.2l; N,6.47%
Calcd C34H40N3O8S · 8H2O · 0.5TFA:
C,58.30; H,5.88; N,5.83%
Hound: 0,58.34； H，5.94; N,5.51%
マススぺク トロメ トリー ： 650.3
Figure imgf000024_0001
ESI-MS)) (実験例 Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2の内服による癒着予防効果） シリアンハムスター (SLC社)、年齢 6週間 (体重 85〜90グラム）を開胸 し、心臓を擦過後、心筋癒着モデルを作製し、 Suc'Val-Pro-L-PheP (OPh)2 (I0mg/kg)(8例）又は偽薬 (8例）をモデル作製前 3日よりモデル作成後 14 日まで 1 日 1回、 ゾンデで強制経口投与し、 モデル作製後 14 日の癒着 程度を比較検討した。 尚、 癒着スコア一は下記のとおりである。 なお、 癒着スコア一により、 Student-t testを用いて有意差検定を行った。 癒着度 0 ；心臓が容易に取り出せ、 通常の心臓と同様に周囲から独立 して存在している。
癒着度 1 ；心臓の一部と周囲組織との薄膜性の癒着が認められるが、 簡易癒着部位が剥離でき、 心臓を露出できる。
癒着度 2 ；心臓の数箇所と周囲組織との癒着が認められるが牽引する ことにより、 癒着部が剥離でき、 心臓を露出できる。
癒着度 3 ；心臓が確認できるが、 周囲の組織数箇所と強固に癒着し、 強く牽引しなければ心臓の露出が行いにくい。
癒着度 4 ；心臓を中心とした極度の細胞増殖、 線維化が起こり周囲の 組織との癒合が認められる。 心臓が周辺組織と癒着しているため、 牽引 しても剥離不可能で、 心臓の露出が非常に困難である。
偽薬群では、 癒着度 4が 3例 (37.5%)、 癒着度 3が 2例 (25%)、 癒着 度 1が 1 例 (12.5%)、 そして残りが癒着度 0 (25%)であったのに対し、 Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2投与群では、 癒着度 4が 1例（12.5%)、 癒着 度 2が 1例 (12.5%)、そして残りが癒着度 0 (75%)であり、有意に癒着度 が軽減されていた。 産業上の利用の可能性
以上説明したように、 本発明の癒着形成防止、 抑制又は治療剤は、 静 脈内投与や経口投与又は経皮適用することにより癒着予防に有用であり、 整形外科的あるいは形成外科的な手術後の癒着のみならず炎症性の内臓 癒着にも有用である。

Claims

ま 求 の 範 囲
1 . 少なくとも 1のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、
' 静脈内投与、 経口投与又は経皮適用されることを特徴とする脊椎動物被 検体内の組織表面の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤。
2 . 該プロテアーゼ阻害剤が、 セリ ンプロテアーゼ阻害剤である、 請 求の範囲第 1項に記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤。
3 . 該セリンプロテアーゼの阻害剤が、 キモトリブシン様セリンプロ テアーゼ阻害剤である請求の範囲第 2項に記載の癒着形成の防止、 抑制 又は治療用薬剤。
4 . 該キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、 キマーゼ阻害 剤である請求の範囲第 3項に記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬 剤。
5 · 該キマーゼ阻害剤が、 ひ - アミノアルキルホスホン酸のァリール ジエステルのぺプチド誘導体である請求の範囲第 4項に記載の癒着形成 の防止、 抑制又は治療用薬剤。
6 . 該キマーゼ阻害剤が、 Suc-Val-Pro-Phep(OPli)2である、 請求の範 囲第 4項に記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤。
7 . 該キマーゼ阻害剤が、 Suc-Val-Pi'o-PheP(OPh)2の鏡像異性体 Suc_ Val-Pro-L-PheP(OPh)2の濃縮製剤である請求の範囲第 4項に記載の癒 着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤。
8 . 該鏡像異性体濃縮製剤において、 Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2が Suc-Val-Pro-Phep(OPh)2の総重量の 9 5 %以上を含有する請求の範囲 第 7項に記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤。
9 . 該プロテアーゼ阻害剤が、 当該部位において当該プロテアーゼ阻 害剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、そして、 当該伝達体は、 ヒアルロン酸、 ヒ ドロゲル、 カルボキシメチルセルロー ス、 デキストラン、 シクロデキストラン、 そしてその化合物からなる集 合体より選択された高分子量担体をなす、 請求の範囲第 1項〜第 8項の いずれか 1に記載の癒着形成の防止、 抑制又は治療用薬剤。
1 0 . 請求の範囲第 1項〜第 9項のいずれか 1に記載のプロテアーゼ 阻害剤と、 薬学的に許容できる希釈液又は賦形剤からなる、 癒着形成の 防止、 抑制又は治療用薬剤。
1 1 . 外科手術前、 外科手術中若しくは外科手術後、 又は炎症性の内 臓癒着が危惧される場合に脊椎動物被検体に対し、 請求の範囲第 1項〜 第 8項のいずれか 1に記載の癒着形成防止、 癒着形成抑制又は癒着形成 治療用薬剤を投与する治癒形成の防止、 抑制又は治療方法。
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