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WO2004058998A1 - Verfahren zur erstellung einer sammlung von biologischem probenmaterial und probensammlung - Google Patents

Verfahren zur erstellung einer sammlung von biologischem probenmaterial und probensammlung Download PDF

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WO2004058998A1
WO2004058998A1 PCT/DE2003/004217 DE0304217W WO2004058998A1 WO 2004058998 A1 WO2004058998 A1 WO 2004058998A1 DE 0304217 W DE0304217 W DE 0304217W WO 2004058998 A1 WO2004058998 A1 WO 2004058998A1
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WO
WIPO (PCT)
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sample material
biological sample
isolated
tissue
defined period
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/DE2003/004217
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French (fr)
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WO2004058998A8 (de
Inventor
Hartmut Juhl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Indivumed GmbH
Original Assignee
Indivumed GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Indivumed GmbH filed Critical Indivumed GmbH
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Priority to AU2003300497A priority patent/AU2003300497A1/en
Priority to US10/539,338 priority patent/US20070048729A1/en
Priority to EP03813863A priority patent/EP1560934A1/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Definitions

  • the invention relates to a method for creating a collection of biological sample material and a sample collection from isolated biological sample material.
  • a disadvantage of these known methods is that the biological tissue samples are not isolated, processed, preserved and stored under standardized conditions. Due to the lack of standardization, experimental results obtained from experiments with different isolated biological samples cannot be compared with one another sufficiently.
  • the time that elapses between isolating biological sample material from its natural environment and preserving or freezing the biological sample material has a significant influence on the biochemical state or the quality of the isolated biological sample material.
  • the biological sample material taken from a human changes due to the lack of nutrients the bloodstream.
  • nucleic acids in particular ribonucleic acids, and proteins are degraded.
  • the isolated biological sample material no longer reflects the biochemical or physiological state before it was removed from the natural environment.
  • Such an isolated biological sample material would, for example, be a valuable test material in drug and drug development in the field of cancer or metabolic diseases.
  • the object on which the invention is based is achieved by a method for producing a collection of isolated biological sample material, wherein isolated biological sample material is preserved and subsequently stored within a defined period after isolation of the sample material from its natural environment, and the defined period between isolation and preservation of different sample materials has a defined maximum deviation.
  • the object is further achieved by a sample collection which contains isolated and prepared biological sample material according to the method according to one of claims 1 to 15.
  • the removal or isolation of the biological sample material from its natural environment, for example by surgical intervention in humans, is not the subject of the invention.
  • the method according to the invention for creating a sample collection from isolated biological sample material immediately follows the removal and can be carried out by laboratory personnel without medical supervision.
  • the nature of the biological sample material is recorded and documented after isolation from its natural environment and before preservation.
  • the condition of the isolated biological sample material can be recorded, for example, by photographic documentation. Furthermore, one medical or scientific assessment and assessment of the condition of the isolated biological sample material and documentation of the assessment. Detecting the nature of the biological sample material immediately after isolation from its natural environment allows a more comprehensive assessment and evaluation of examinations and / or experiments carried out with the isolated biological sample material at a later time.
  • the biological sample material preferably has a defined volume.
  • a volume of about 0.5 cm 3 to about 1 cm 3 has proven to be very suitable. It is preferred to obtain several biological sample materials which have approximately the same volume, for example approximately 0.5 cm 3 and / or approximately 1 cm 3 .
  • the biological sample material can also take up smaller volumes, for example 1 mm 3 or 3 mm 3 , or larger volumes, for example 2 cm 3 or 4 cm 3 .
  • the biological sample material can be cut to the desired sample volume with a scalpel immediately after isolation from its natural environment and detection of the condition, for example by digital photo documentation. Subsequently, the sample volumes can be adjusted into
  • Sample tubes for example cryotubes
  • the cryotubes can subsequently be stored in liquid nitrogen.
  • the isolated biological sample materials can also be embedded in paraffin. Before paraffin embedding, drainage can be carried out under standardized conditions. For example, tissue sections can be made from the embedded sample materials for microscopic examination.
  • the defined maximum deviation of the defined period is not more than about 10%, preferably not more than about 5%, based on the defined period.
  • the collected biological sample materials are very easy to compare.
  • the differences can be attributed to the particular disease or degeneracy.
  • the differences that may be ascertained between different biological sample materials are not due to the respective processing method or a different duration of the processing, but rather an indication of the molecular causes of the respective disease or degeneracy.
  • the defined period of time is less than about 25 minutes, preferably less than about 15 minutes. It is further preferred that the defined period is approximately 12 minutes. The defined period of time is more preferably about 10 minutes. Of course, the defined period can also be shorter, for example 5 or 8 minutes.
  • the isolation of human biological sample material has to take place in an operating room and the processing of the isolated biological sample material takes place regularly outside the operating room, there is a reduction in the period of time measured from the isolation of the biological one.
  • Sample material up to the preservation of the isolated biological sample material practically not feasible for less than five minutes. A defined period of about 10 minutes has proven to be very suitable.
  • the isolated biological sample material is preserved by cryopreservation or by chemical preservation.
  • preservation is understood to mean that the biochemical or physiological state of the isolated biological sample material is fixed.
  • the cryopreservation is preferably carried out by immersing the isolated biological sample material in a cooling medium and freezing the biological sample material in a period of preferably a few seconds. Liquid nitrogen is preferably used as the cooling medium. With this procedure, the preservation and storage of the isolated biological sample material coincide.
  • the preservation is carried out using chemical crosslinking agents.
  • the preferred crosslinking agents have reactive groups.
  • reactive groups include chemical
  • the reactive groups of the crosslinking agent can react with reactive groups on the isolated biological sample material.
  • the crosslinking agent used in the invention preferably contains aldehyde and / or epoxy groups as reactive groups, which preferably react with amino groups on the isolated biological sample material.
  • the crosslinking agents are preferably selected from the group consisting of formaldehyde, polyaldehydes, preferably dialdehydes, polyepoxide compounds, preferably di- and / or triepoxide compounds, and / or mixtures thereof.
  • Glutardialdehyde is preferably used as the dialdehyde. Instead of formaldehyde, it is of course also possible to use paraformaldehyde.
  • the diepoxide compounds which can be used are, for example, polyalkylene glycol diglycidyl ether, preferably polyethylene glycol diglycidyl ether, or alkane diol glycidyl ether, for example 1,6-hexanediol glycidyl ether and / or 1,4-butanediol glycol cidyl ether.
  • polyglycidyl compounds that can be used are polyalcohol polyglycidyl ethers, for example sorbitol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, pentaerythrol polyglycidyl ether, saccharide polyglycidyl ether and mixtures thereof.
  • polyalcohol polyglycidyl ethers for example sorbitol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, pentaerythrol polyglycidyl ether, saccharide polyglycidyl ether and mixtures thereof.
  • the isolated biological sample material can only be preserved by cryogenic treatment or only by chemical preservation.
  • the isolated biological sample material can first be treated with a chemical crosslinking agent or preservative and then subjected to a cryogenic treatment. But it is also possible to use the isolated biological
  • sample material first under cryogenic treatment and storage under liquid nitrogen or in a freezer, for example at -80 ° C., and at a later stage subject it to chemical preservation by treatment with chemical crosslinking agent or preservative.
  • the isolated biological sample material is preferably human tissue.
  • the biological sample material used in the method according to the invention can in principle be any biological material with which a collection with isolated biological sample material is to be created.
  • Tumor-free tissue, tumor tissue and / or adipose tissue are particularly suitable in the method according to the invention. It is further preferred that the tumor tissue is central or peripheral tumor tissue. Tissue from colon carcinoma, rectal carcinoma, pancreatic carcinoma, breast carcinoma, prostate carcinoma, bronchial carcinoma, gastric carcinoma or cervical carcinoma can be used as tumor tissue.
  • Processed isolated biological sample materials can show the molecular differences, for example of gene activities, expression patterns, expression profiles, activated proteins, in particular cellular tumor factors, enzymes, etc., in experimental investigations.
  • the different DNA, RNA and / or protein activities in the isolated biological protein materials can be examined, for example, in microarray analyzes, for example on so-called biochips (DNA arrays or protein arrays).
  • data sets are assigned to the isolated biological sample material.
  • the data sets contain in particular information about the isolated sample materials.
  • the isolated biological sample material is divided several times before or after preservation and stored separately from one another. Part of the sample material can then be analyzed using molecular biological methods, for example at the protein level and / or mRNA level. These data allow a statement about the activation or inactivation state of genes, mRNAs and / or proteins. Using this data, a kind of activation profile or expression profile of the isolated biological sample material can be created.
  • the data records can be assigned to the isolated biological sample materials, for example, using identification numbers of the respective isolated biological sample material in a computer-supported database.
  • the data records preferably also include information on the patient's medical history, medication, anesthesia, the course of the operation, clinical parameters and / or follow-up data.
  • the data records preferably contain additional information about clinical-chemical diagnoses of blood, stool, urine, sputum, cerebrospinal fluid samples, etc., which were obtained from the patient before and / or after isolation of the respective biological sample material.
  • the data records can thus contain information about blood group, blood count, coagulation values, tumor markers, liver values, kidney values, serum electrolyte values, etc.
  • the data records can contain information about medications administered to the patient before and / or after the isolation of biological sample material.
  • the data records can also contain information regarding the anamnesis, for example eating and lifestyle habits such as appetite, aversions, allergies, pre-existing diseases, childhood diseases, infectious diseases, tropical diseases, previous cancers, sleeping habits, excretion habits of stool and urine, alcohol, nicotine and / or drug consumption , Complaints and
  • Conditions, symptoms, drug doses and intolerance of drugs.et ⁇ include.
  • the data records can include information about the time course of the removal of the biological sample material from its natural environment.
  • the separation or removal of the tissue from humans is preferably used as the start of the chronological sequence.
  • the time at which the proximal and distal ends of the biological sample material are separated is the starting point for the time measurement.
  • isolated biological sample material can be documented, for example information on the size of the isolated tissue material, for example the tumor size.
  • the isolated biological sample materials can then, as explained above, be preserved by cryotreatment, for example in liquid nitrogen, and stored under liquid nitrogen or in a freezer, for example at approximately -80 ° C.
  • the isolated biological sample materials can also be chemically preserved or fixed first and, if desired, subsequently subjected to a cryogenic treatment, for example by treatment with liquid nitrogen, and finally until further use, for example under liquid nitrogen or in a freezer, for example at approximately -80 ° C.
  • the method according to the invention allows the creation of a collection of isolated biological sample material that has been processed under standardized conditions, wherein a large number of clinically relevant data can be assigned to each isolated biological sample material.
  • the combination of standardized sample material and clinically relevant data is extremely valuable for drug or drug research.
  • the sample collection according to the invention preferably comprises more than 100, preferably more than 500, more preferably more than 1000 isolated biological sample materials.
  • Example 1 Creation of a collection of isolated colon tissue
  • the method according to the invention for creating a collection of isolated biological sample material is illustrated below using isolated colon tumor tissue.
  • the method according to the invention is not limited to colon tumor tissue or colon tissue and can of course also be carried out with other body tissues, for example bronchial tissue, breast tissue, etc.
  • sample material obtained under standardized conditions is provided for the creation of a sample collection.
  • a large number of clinically relevant information about the patient from whom the sample material was taken and about the extraction of the sample material itself as well as analysis data of the isolated sample material in the form of data records are preferably assigned and stored to the isolated biological sample material.
  • Samples include, for example, healthy tissue, adipose tissue, peripheral tumor tissue and central tumor tissue.
  • the healthy tissue is removed from the resectate at least 5 cm from the tumor.
  • the samples are divided so that the volume is preferably about 0.5 cm 3 .
  • the divided samples are transferred to sample tubes + 10 min preservation of the sample materials in the tubes:
  • the biological sample material is preferably left to stand at room temperature (for example 25 ° C.) for a defined period of time, for example ten or 24 hours.
  • the preservation solution ie formaldehyde solution, glutaraldehyde solution or liquid nitrogen
  • the process according to the invention is completed in terms of time.
  • Example 2 Detection of the change in biological sample material over time Isolation from the natural environment
  • the protein composition of intestinal tissue samples was examined at defined time intervals after removal from the patient by means of SELDI-MS (surface-enhanced laser desorption ionization mass spectrometry).
  • FIG. 1 shows the result of SELDI-MS analyzes of colon tissue samples.
  • the sample material was frozen in liquid nitrogen for 3 minutes, 5 minutes, 8 minutes, 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes and 30 minutes after removal from the patient.
  • the samples were subsequently processed in accordance with the manufacturer's instructions (CIPHERGEN, Göttingen, Germany) and analyzed using SELDI-MS.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von isoliertem biologischen Probenmaterial, wobei isoliertes biologisches Probenmaterial innerhalb eines definierten Zeitraums nach Isolation des Probenmaterials aus seiner natürlichen Umgebung konserviert und nachfolgend gelagert wird und wobei der definierte Zeitraum zwischen Isolation und Konservierung verschiedener Probenmaterialien eine definierte maximale Abweichung aufweistDes weiteren betrifft die Erfindung eine Sammlung von biologischem Probenmaterial.

Description

Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von biologischem Probenmaterial und Probensammlung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von biologischem Probenmaterial sowie eine Probensammlung aus isoliertem biologischen Probenmaterial.
Aus zahlreichen Veröffentlichungen, beispielsweise Alon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA Bd. 96 (1999) 6745-6750; Zou et al., Oncogene 21 (2002) 4855-4862; Nottermann et al., Cancer Research 61 (2001 ) 3124-3130, Sorlie et al., PNAS 98 (2001 ) 10869-10874, ist bekannt, daß isolierte biologische Gewebeproben in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei etwa -170°C oder -80°C gelagert werden können.
Bei diesen bekannten Verfahren ist nachteilig, daß die biologischen Gewebeproben nicht unter standardisierten Bedingungen isoliert, aufbereitet, konserviert und gelagert werden. Aufgrund der fehlenden Standardisierung sind experimentelle Ergebnisse, die bei Experimenten mit verschiedenen isolierten biologischen Proben erhalten werden, untereinander nicht ausreichend vergleichbar.
Die zwischen Isolation von biologischem Probenmaterial aus seiner natürlichen Umgebung und Konservierung oder Einfrieren des biologischen Probenmaterials verstreichende Zeit hat einen wesentlichen Einfluß auf den biochemischen Zustand bzw. die Qualität des isolierten biologischen Probenmaterials. Das einem Menschen entnommene biologische Probenmaterial, beispielsweise Tumormaterial, verändert sich aufgrund der fehlenden Nährstoffversorgung durch den Blutkreislauf. Beispielsweise kommt es zu einem Abbau von Nukleinsäuren, insbesondere Ribonukleinsäuren, sowie von Proteinen. Auch kann es zu einer Modifizierung, beispielsweise zu Phosphorylierung und/oder Dephosphorylierung von zellulären Bestandteilen, insbesondere von Proteinen, kommen.
Das heißt, mit zunehmender Zeitdauer nach Isolation des biologischen Probenmaterials gibt das isolierte biologische Probenmaterial nicht mehr den biochemischen oder physiologischen Zustand vor der Entnahme aus der natürlichen Umgebung wieder.
Um bei experimentellen in vitro-Untersuchungen mit isoliertem biologischen Probenmaterial zu Ergebnissen zu kommen, die eine Aussage über die biochemischen, physiologischen und/oder molekularbiologischen in vivo-Verhältnisse zu lassen, ist wesentlich, daß das isolierte biologische Probenmaterial auch die in vivo-Verhältnisse wiedergibt.
Ein solches isoliertes biologisches Probematerial wäre beispielsweise ein wertvolles Untersuchungsmaterial bei der Wirkstoff- und Arzneimittelentwicklung auf dem Gebiet von Krebs- oder Stoffwechselerkrankungen.
Des weiteren wäre ein solches hochwertiges biologisches Probenmaterial auch sehr gut geeignet, um die molekularbiologischen und/oder pathobiochemischen Vorgänge in pathologischem biologischen Probenmaterial im Vergleich zu nichtpathologischem biologischen Probenmaterial zu untersuchen, um Erkenntnisse über die molekularen Ursachen von Erkrankungen, beispielsweise von Krebs- oder Stoffwechselerkrankungen, zu gewinnen.
Um die Relevanz von erhaltenen experimentellen Ergebnissen beurteilen zu können, müssen diese statistisch abgesichert sein. Insofern muß eine entsprechende Anzahl von experimentellen Untersuchungen mit isolierten biologischen Probenmaterialien verschiedenen Ursprungs durchgeführt werden. Hierbei ist Voraussetzung, daß die verschiedenen isolierten biologischen Probenmaterialien nach der Isolation unter standardisierten Bedingungen aufbereitet, konserviert und gelagert werden. Es besteht mithin ein Bedarf an einem Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von biologischem Probenmaterial.
Des weiteren besteht ein Bedarf an einer Sammlung von biologischem Probenmaterial, das den biochemischen Zustand in seiner natürlichen Umgebung zuverlässiger wiedergibt.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von isoliertem biologischen Probenmaterial, wobei isoliertes biologisches Probenmaterial innerhalb eines definierten Zeitraums nach Isolation des Probenmaterials aus seiner natürlichen Umgebung konserviert und nachfolgend gelagert wird und wobei der definierte Zeitraum zwischen Isolation und Konservierung verschiedener Probenmaterialien eine definierte maximale Abweichung aufweist, gelöst.
Bevorzugte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 15 angegeben.
Die Aufgabe wird weiterhin durch eine Probensammlung, die isoliertes und gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 aufbereitetes biologisches Probenmaterial enthält, gelöst.
Die Entnahme bzw. Isolation des biologischen Probenmaterials aus seiner natürlichen Umgebung, beispielsweise durch chirurgischen Eingriff beim Menschen, ist nicht Gegenstand der Erfindung. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erstellung einer Probensammlung aus isoliertem biologischen Probenmaterial folgt unmittelbar auf die Entnahme und kann von Laborpersonal ohne ärztliche Beaufsichtigung durchgeführt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Beschaffenheit des biologischen Probenmaterials nach der Isolation aus seiner natürlichen Umgebung und vor der Konservierung erfaßt und dokumentiert.
Die Erfassung der Beschaffenheit des isolierten biologischen Probenmaterials kann beispielsweise durch fotografische Dokumentation erfolgen. Des weiteren kann eine medizinische oder wissenschaftliche Begutachtung und Bewertung des Zustands des isolierten biologischen Probenmaterials und Dokumentation der Bewertung erfolgen. Eine Erfassung der Beschaffenheit des biologischen Probenmaterials unmittelbar nach der Isolation aus seiner natürlichen Umgebung erlaubt eine umfassendere Beurteilung und Bewertung von zu einem späteren Zeitpunkt mit dem isolierten biologischen Probenmaterial durchgeführten Untersuchungen und/oder Experimenten.
Vorzugsweise weist das biologische Probenmaterial ein definiertes Volumen auf. Hierbei hat sich ein Volumen von etwa 0,5 cm3 bis etwa 1 cm3 als sehr geeignet erwiesen. Dabei ist es bevorzugt, mehrere biologische Probenmaterialien zu gewinnen, die in etwa das gleiche Volumen, beispielsweise etwa 0,5 cm3 und/oder etwa 1 cm3 aufweisen. Selbstverständlich kann das biologische Probenmaterial auch kleinere Volumina, beispielsweise 1 mm3 oder 3 mm3, oder auch größere Volumina, beispielsweise 2 cm 3 oder 4 cm3, einnehmen.
Das biologische Probenmaterial kann unmittelbar nach der Isolation aus seiner natürlichen Umgebung und Erfassung der Beschaffenheit, beispielsweise durch digitale Photodokumentation, auf das gewünschte Probenvolumen mit einem Skalpell zugeschnitten werden. Nachfolgend können die Probenvolumina in geeignete
Probenröhrchen, beispielsweise Kryoröhrchen, überführt werden. Die Kryoröhrchen können nachfolgend in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
Die isolierten biologischen Probenmaterialien können auch in Paraffin eingebettet werden. Vor der Paraffineinbettung kann gegebenenfalls eine Entwässerung unter standardisierten Bedingungen erfolgen. Aus den eingebetteten Probenmaterialien können beispielsweise Gewebeschnitte für eine mikroskopische Untersuchung angefertigt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung beträgt die definierte maximale Abweichung des definierten Zeitraums nicht mehr als etwa 10 %, vorzugsweise nicht mehr als etwa 5 %, bezogen auf den definierten Zeitraum.
Es hat sich gezeigt, daß die Einhaltung eines definierten Zeitraumes, gemessen von der Entnahme des biologischen Probenmaterials bis zur Konservierung und/oder Lagerung des isolierten biologischen Probenmaterials, die Vergleichbarkeit der Qualität des isolierten biologischen Probenmaterials stark verbessert.
Bei Einhaltung standardisierter Bedingungen bei der Aufarbeitung der isolierten biologischen Probenmaterialien, insbesondere der Zeitdauer zwischen Entnahme und Konservierung und/oder Lagerung, weisen die gesammelten biologischen Probenmaterialien eine sehr gute Vergleichbarkeit auf.
Mithin können bei einem Vergleich des biochemischen und/oder physiologischen Zustandes der isolierten biologischen Probenmaterialien von beispielsweise gesunden bzw. nichtpathologischen Gewebeproben mit pathologischen Gewebeproben die Unterschiede auf die jeweilige Erkrankung oder Entartung zurückgeführt werden. Das heißt, bei einer standardisierten Aufarbeitung der isolierten biologischen Probenmaterialien sind die gegebenenfalls zwischen verschiedenen biologischen Probenmaterialien festzustellenden Unterschiede nicht auf das jeweilige Aufarbeitungsverfahren bzw. eine unterschiedliche Zeitdauer der Aufarbeitung zurückzuführen, sondern ein Indiz für die molekularen Ursachen der jeweiligen Erkrankung oder Entartung.
Erfindungsgemäß ist bevorzugt, daß der definierte Zeitraum weniger als etwa 25 Minuten, vorzugsweise weniger als etwa 15 Minuten, beträgt. Weiterhin ist bevorzugt, daß der definierte Zeitraum etwa 12 Minuten beträgt. Noch bevorzugter beträgt der definierte Zeitraum etwa 10 Minuten. Selbstverständlich kann der definierte Zeitraum auch kürzer sein, beispielsweise 5 oder 8 Minuten.
Im Hinblick auf den Umstand, daß die Isolation von humanem biologischen Probenmaterial in einem Operationssaal zu erfolgen hat und die Aufarbeitung des isolierten biologischen Probenmaterials regelmäßig außerhalb des Operationssaals erfolgt, ist eine Verringerung der Zeitdauer, gemessen ab Isolation des biologischen. Probenmaterials bis zur Konservierung des isolierten biologischen Probenmaterials, von weniger als fünf Minuten praktisch nicht durchführbar. Als sehr geeignet hat sich ein definierter Zeitraum von etwa 10 Minuten erwiesen. Gemäß einer weiteren bevorzugten Weiterbildung erfolgt die Konservierung des isolierten biologischen Probenmaterials durch Kryokonservierung oder durch chemische Konservierung.
Unter „Konservierung" wird im Sinne der Erfindung verstanden, daß der biochemische oder physiologische Zustand des isolierten biologischen Probenmaterials fixiert wird.
Die Kryokonservierung erfolgt vorzugsweise durch Eintauchen des isolierten biologischen Probenmaterials in ein Kältemedium und Einfrieren des biologischen Proben materials in einem Zeitraum von vorzugsweise wenigen Sekunden. Als Kältemedium wird vorzugsweise flüssiger Stickstoff verwendet. Bei dieser Vorgehensweise fallen die Konservierung und Lagerung des isolierten biologischen Probenmaterials zusammen.
Gemäß einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Konservierung unter Verwendung von chemischem Vernetzungsmittel. Die bevorzugt verwendeten Vernetzungsmittel besitzen reaktive Gruppen.
Unter „reaktiven Gruppen" werden im Sinne der Erfindung chemische
Funktionalitäten verstanden, die sich mit dem isolierten biologischen Probenmaterial chemisch umsetzen. Dabei können die reaktiven Gruppen des Vernetzungsmittels mit reaktiven Gruppen auf dem isolierten biologischen Probenmaterial reagieren. Vorzugsweise enthält das bei der Erfindung verwendete Vernetzungsmittel als reaktive Gruppen Aldehyd- und/oder Epoxidgruppen, die sich vorzugsweise mit Aminogruppen auf dem isolierten biologischen Probenmaterial umsetzen.
Die Vernetzungsmittel werden dabei vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Formaldehyd, Polyaldehyden, vorzugsweise Dialdehyden, Polyepoxid- Verbindungen, vorzugsweise Di- und/oder Triepoxidverbindungen, und/oder Gemischen davon besteht.
Vorzugsweise wird als Dialdehyd Glutardialdehyd verwendet. Anstelle von Formaldehyd kann selbstverständlich auch Paraformaldehyd verwendet werden. Als Diepoxidverbindungen können beispielsweise Polyalkylenglykoldiglycidylether, vorzugsweise Polyethylenglykoldiglycidylether, oder Alkandiolglycidylether, beispielsweise 1 ,6-Hexandiolglycidylether und/oder 1 ,4-Butandiolgylcidylether, verwendet werden.
Als Polyglycidylverbindungen können beispielsweise Polyalkoholpolyglycidylether, beispielsweise Sorbitolpolyglycidylether, Glycerinpolyglycidylether, Pentaerythrolpolyglycidylether, Saccharidpolyglycidylether und Gemische davon verwendet werden.
Das isolierte biologische Probenmaterial kann nur durch Kryobehandlung oder nur durch chemische Konservierung konserviert werden. Selbstverständlich kann das isolierte biologische Probenmaterial zunächst mit chemischem Vernetzungsmittel oder Konservierungsmittel behandelt und nachfolgend einer Kryobehandlung unterworfen werden. Es ist aber auch möglich, das isolierte biologische
Probenmaterial zunächst einer Kryobehandlung und Lagerung unter flüssigem Stickstoff oder in einem Gefrierschrank, beispielsweise bei -80°C, zu lagern und zu einem späteren Zeitpunkt einer chemischem Konservierung durch Behandlung mit chemischem Vernetzungsmittel oder Konservierungsmittel zu unterwerfen.
Bevorzugt ist das isolierte biologische Probenmaterial humanes Gewebe. Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete biologische Probenmaterial kann grundsätzlich jedes biologische Material sein, mit dem eine Sammlung mit isoliertem biologischen Probenmaterial erstellt werden soll.
Besonders eignet sich tumorfreies Gewebe, Tumorgewebe und/oder Fettgewebe bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Des weiteren ist bevorzugt, daß das Tumorgewebe zentrales oder peripheres Tumorgewebe ist. Als Tumorgewebe kann beispielsweise Gewebe von Kolonkarzinom, Rektumkarzinom, Pankreaskarzinom, Mammakarzinom, Prostatakarzinom, Bronchialkarzinom, Magenkarzinom oder Cervixkarzinom verwendet werden.
Der Vergleich des biochemischen und/oder physiologischen Zustandes von tumorfreiem Gewebe, zentralem sowie peripherem Tumorgewebe aus der erfindungsgemäßen Probensammlung bzw. nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufbereitete isolierte biologische Probenmaterialien kann die molekularen Unterschiede, beispielsweise von Genaktivitäten, Expressionsmustern, Expressionsprofilen, aktivierten Proteinen, insbesondere zellulären Tumorfaktoren, Enzymen, etc., bei experimentellen Untersuchungen aufzeigen.
Die unterschiedlichen DNA-, RNA- und/oder Protein-Aktivitäten in den isolierten biologischen Proteinmaterialien können beispielsweise in Microarray-Analysen, beispielsweise auf.sogenannten Biochips (DNA-Arrays oder Protein-Arrays), untersucht werden.
Aus diesem Vergleich von unter standardisierten Bedingungen aufbereitetem biologischen Probenmaterial lassen sich mögliche Angriffspunkte für Wirkstoffe und/oder Arzneimittel bei der Behandlung von Krebs oder Stoffwechselerkrankungen ermitteln. Insbesondere ist unter Verwendung einer Vielzahl von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufbereiteten isolierten biologischen
Probenmaterialien eine statistische Validierung der experimentellen Ergebnisse möglich.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung werden dem isolierten biologischen Probenmaterial Datensätze zugeordnet.
Die Datensätze enthalten insbesondere Informationen über die isolierten Probenmaterialien. In der Regel wird das isolierte biologische Probenmaterial vor oder nach der Konservierung mehrfach geteilt und separat voneinander aufbewahrt. Ein Teil des Probenmaterials kann dann unter Verwendung molekularbiologischer Verfahren, beispielsweise auf Proteinebene und/oder mRNA-Ebene, analysiert werden. Diese Daten erlauben eine Aussage über den Aktivierungs- bzw. Inaktivierungszustand von Genen, mRNAs und/oder Proteinen. Unter Verwendung dieser Daten kann mithin eine Art Aktivierungsprofil oder Expressionsprofil des isolierten biologischen Probenmaterials erstellt werden.
Die Zuordnung der Datensätze zu den isolierten biologischen Probenmaterialien kann beispielsweise über Identifikationsnummern des jeweiligen isolierten biologischen Probenmaterials in einer Computer-gestützten Datenbank erfolgen. Vorzugsweise umfassen die Datensätze ferner Informationen über die Anamnese, Medikation, Narkose, den Operationsverlauf, klinische Parameter und/oder Nachsorgedaten.
Die Datensätze enthalten vorzugsweise zusätzlich Informationen über klinischchemische Diagnosen von Blut-, Stuhl-, Urin-, Sputum-, Liquor cerebrospinalis- Proben, etc., die vor und/oder nach Isolation des jeweiligen biologischen Probenmaterials vom Patienten gewonnen wurden. Somit können die Datensätze Informationen über Blutgruppe, Blutbild, Gerinnungswerte, Tumormarker, Leberwerte, Nierenwerte, Serum-Elektrolytwerte, etc. enthalten.
Des weiteren können die Datensätze Informationen über vor und/oder nach der Isolation von biologischem Probenmaterial dem Patienten verabreichte Medikamente enthalten.
Ebenfalls können die Datensätze Informationen bzgl. der Anamnese, beispielsweise Eß- und Lebensgewohnheiten wie Appetit, Aversionen, Allergien, Vorerkrankungen, Kindererkrankungen, Infektionserkrankungen, Tropenerkrankungen, frühere Krebserkrankungen, Schlafgewohnheiten, Ausscheidungsgewohnheiten von Stuhl und Urin, Alkohol-, Nikotin- und/oder Drogenkonsum, Beschwerden und
Befindlichkeiten, Symptome, Medikamentendosen und Unverträglichkeiten von Medikamenten.etα, umfassen.
Des weiteren können die Datensätze Informationen über den zeitlichen Verlauf der Entnahme des biologischen Probenmaterials aus seiner natürlichen Umgebung umfassen. Vorzugsweise wird als Beginn des zeitlichen Ablaufs die Abtrennung bzw. Herauslösung des Gewebes von Menschen verwendet. Bei Isolation von Kolongewebeproben ist der Zeitpunkt der Durchtrennung des proximalen und distalen Endes des biologischen Probenmaterials der Startpunkt der Zeitmessung.
Insbesondere können weitere Informationen bzgl. des isolierten biologischen Probenmaterials dokumentiert werden, beispielsweise Angaben zu Größe des isolierten Gewebematerials, beispielsweise die Tumorgröße. Die isolierten biologischen Probenmaterialien können dann, wie oben erläutert, durch Kryobehandlung beispielsweise in flüssigem Stickstoff konserviert und unter flüssigem Stickstoff oder in einem Gefrierschrank, beispielsweise bei etwa -80°C, aufbewahrt werden.
Die isolierten biologischen Probenmaterialien können aber auch zunächst chemisch konserviert oder fixiert und, falls erwünscht, nachfolgend einer Kryobehandlung, beispielsweise durch Behandlung mit flüssigem Stickstoff, unterworfen werden und schließlich bis zur weiteren Verwendung beispielsweise unter flüssigem Stickstoff oder in einem Gefrierschrank , beispielsweise bei etwa -80°C, aufbewahrt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Erstellung einer Sammlung von isoliertem biologischen Probenmaterial, das unter standardisierten Bedingungen aufgearbeitet wurde, wobei jedem isolierten biologischen Probenmaterial eine Vielzahl von klinisch relevanten Daten zugeordnet werden kann. Die Kombination von standardisiertem Probenmaterial und klinisch relevanten Daten ist äußerst wertvoll für die Wirkstoff- oder Arzneimittelforschung.
Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Probensammlung mehr als 100, vorzugsweise mehr als 500, noch bevorzugter mehr als 1000 isolierte biologische Probenmaterialien.
Beispiel 1 : Erstellung einer Sammlung von isoliertem Colongewebe
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von isoliertem biologischen Probenmaterial anhand von isoliertem Colontumor- gewebe veranschaulicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf Colontumorgewebe bzw. Colongewebe beschränkt und kann selbstverständlich auch mit anderem Körpergewebe, beispielsweise Bronchialgewebe, Mammagewebe, etc.,, durchgeführt werden.
Zur Erstellung von dem isolierten biologischen Probenmaterial zugeordneten Datensätzen wurden neben den Anamnesedaten sowie weiteren klinischchemischen Parametern des Patienten, beispielsweise Blut-, Urin-, Liquor-, Sputumanalysen, etc., auch der zeitliche Ablauf bis zur und einschließlich der Entnahme des biologischen Probenmaterials dokumentiert. Mithin wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren unter standardisierten Bedingungen gewonnenes Probenmaterial zur Erstellung einer Probensammlung bereitgestellt. Darüber hinaus wird vorzugsweise eine Vielzahl klinisch relevanter Informationen über den Patienten, dem das Probenmaterial entnommen wurde, sowie über die Gewinnung des Probenmaterials selbst als auch Analysedaten des isolierten Probenmaterials in Form von Datensätzen dem isolierten biologischen Probenmaterial zugeordnet und gespeichert.
Mithin stehen beispielsweise der Wirkstoff- bzw. Arzneimittelforschung zum einem eine Vielzahl von innerhalb einer äußerst kurzen Zeit, beispielsweise 10 Minuten, und unter standardisierten Bedingungen gewonnene biologische Probenmaterialien sowie zum anderen mit dem jeweiligen Probenmaterial verknüpfte spezifische Informationen zur Verfügung.
Die bei der Wirkstofforschung mit verschiedenen isolierten Gewebeproben, beispielsweise Colongewebeproben, erhaltenen gegebenenfalls unterschiedlichen Ergebnisse können eventuell vor dem Hintergrund der weiter vorliegenden Informationen verstanden, erklärt und/oder gedeutet werden. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstellte erfindungsgemäße Proben- und
Datensammlung ist insbesondere für die Wirkstofforschung der Pharmaindustrie ein äußerst wertvolles Werkzeug.
Den Zeitpunkten vor der Isolation des Probenmaterials ist in der untenstehenden Tabelle 1 ein Minuszeichen vorangestellt. Die Entnahme selbst ist nicht Teil des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vielmehr beginnt das erfindungsgemäße Verfahren unmittelbar nach der erfolgten Isolation des biologischen Probenmaterials. Den Zeitpunkt nach der erfolgten Isolation ist in der Tabelle 1 ein Pluszeichen vorangestellt. Tabellel : Zeitveriauf von der Entnahme bis zur Konservierung von Colongewebe
Zeitpunkt Handlung
-77 min Beginn der Narkose des Patienten -61 min " Blutabnahme
-45 min Beginn der Operation
-38 min Urinabnahme -14 min Abbindung der Mesenterica inferior
- 7 min Abbindung der unteren Arkade
- 5 min Abbindung der oberen Arkade
- 3 min Durchtrennung des distalen Endes des Resektats (Colongewebe) 0 min nach Durchtrennung des proximalen Endes des Resektats + 1 min Resektat wird entlang des Darmverlaufs mit einer Schere aufgeschnitten, wobei der Tumor vorzugsweise nicht durchschnitten wird. +1 bis 5 min Das Resektat sowie der Tumor werden vorzugsweise mit einer digitalen Kamera photographiert. Von dem Tumor wird eine Großaufnahme angefertigt.
+ 5 min Aus dem Resektat und dem Tumor werden Proben entnommen. Die
Proben umfassen beispielsweise gesundes Gewebe, Fettgewebe, peripheres Tumorgewebe und zentrales Tumorgewebe. Das gesunde Gewebe wird mindestens 5 cm von dem Tumor entfernt aus dem Resektat entnommen. Die Proben werden zerteilt, so daß das Volumen vorzugsweise etwa 0,5 cm3 beträgt. Die zerteilten Proben werden in Probenröhrchen überführt + 10 min Konservierung der Probenmaterialien in den Röhrchen:
- durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder - durch Zugabe von 10 ml 3,5 % Formaldehydlösung oder
- durch Zugabe von 10 ml 5,5 Gew.-% Glutaraldehydlösung
Von den durch Zerteilung der isolierten Probenmaterialien erhaltenen Proben wird vorzugsweise jeweils ein Drittel nach jedem der vorstehenden Konservierungsverfahren konserviert und nachfolgend gelagert. Bei Konservierung mittels Formaldehyd oder Glutaraldehyd wird das biologische Probenmaterial vorzugsweise über einen definierten Zeitraum, beispielsweise zehn oder 24 Stunden, bei Zimmertemperatur (z.B. 25°C) stehen gelassen. Mit Zugabe der Konservierungslösung, d.h. Formaldehydlösung, Glutaraldehydlösung oder flüssigem Stickstoff, ist das erfindungsgemäße Verfahren in zeitlicher Hinsicht abgeschlossen.
Beispiel 2: Nachweis der Veränderung von biologischem Probenmaterial über die Zeit Isolation aus der natürlichen Umgebung
Als Nachweis für die Bedeutung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde die Proteinzusammensetzung von Darmgewebeproben in definierten zeitlichen Abständen nach Entnahme aus dem Patienten mittels SELDI-MS (Surface-enhanced Laser Desorption lonisation-Massenspektrometrie) untersucht.
In Fig.1 ist das Ergebnis von SELDI-MS-Analysen von Dickdarmgewebeproben gezeigt. Das Probenmaterial wurde dabei 3 min, 5 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min sowie 30 min nach Entnahme aus dem Patienten in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden nachfolgend gemäß Herstellerangaben (Firma CIPHERGEN, Göttingen, Deutschland) aufgearbeitet und mittels SELDI-MS analysiert.
In Fig. 1 ist das jeweils erhaltene Massenspektrum gezeigt. Von dem in der rechten Eingrenzung gezeigten Teil des Massenspektrums ist eine vergrößerte Überlagerung der Massenspektren zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Entnahme rechts von den Massenspektren dargestellt. In der Überlagerung des Ausschnitts der erhaltenen Massenspektren sind die jeweiligen Zeitpunkte des Einfrierens des Probenmaterials in flüssigem Stickstoff angegeben.
Es ist deutlich zu erkennen, dass es zu einer zeitlichen Veränderung bei der Proteinzusammensetzung bei den isolierten Resektaten, den isolierten Colongewebeproben, zwischen Resektion und Einfrieren innerhalb von Minuten kommt. Die zeitliche Veränderung kann beispielsweise auf eine Hoch- und/oder Runterregulierung von Proteinen, beispielsweise infolge eine Unterversorgung mit Sauerstoff (Hypoxie) zurückzuführen sein. Diese Ergebnisse belegen die große Bedeutung des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich der Standardisierung der Aufarbeitung der isolierten biologischen Probenmaterialien, bei der Erstellung einer Sammlung von biologischem Probenmaterial.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erstellung einer Sammlung von isoliertem biologischem
Probenmaterial, wobei isoliertes biologisches Probenmaterial innerhalb eines definierten Zeitraums nach Isolation des Probenmaterials aus seiner natürlichen Umgebung konserviert und nachfolgend gelagert wird und wobei der definierte Zeitraum zwischen Isolation und Konservierung verschiedener Probenmaterialien eine definierte maximale Abweichung aufweist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Beschaffenheit des biologischen Probenmaterials nach der
Isolation aus seiner natürlichen Umgebung und vor der Konservierung erfaßt und dokumentiert wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Probenmaterial ein definiertes Volumen aufweist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die definierte maximale Abweichung des definierten Zeitraums nicht mehr als etwa 10 %, vorzugsweise nicht mehr als etwa 5 %, bezogen auf den definierten Zeitraum, beträgt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der definierte Zeitraum weniger als etwa 25 Minuten, vorzugsweise weniger als etwa 15 Minuten, beträgt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der definierte Zeitraum etwa 12 Minuten beträgt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der definierte Zeitraum etwa 10 Minuten beträgt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konservierung durch Kryokonservierung oder durch chemische Konservierung erfolgt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei der chemischen Konservierung Vemetzungsmittel mit reaktiven Gruppen verwendet werden.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzungsmittel aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Formaldehyd, Polyaldehyden, vorzugsweise Dialdehyden,
Polyepoxidverbindungen, vorzugsweise Di- und/oder Triepoxidverbindungen, und/oder Gemischen davon besteht.
1 1 . Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das isolierte biologische Probenmaterial humanes Gewebe ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das humane Gewebe tumorfreies Gewebe, Tumorgewebe und/oder Fettgewebe ist.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Tumorgewebe zentrales oder peripheres Tumorgewebe ist.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß dem Probenmaterial Datensätze zugeordnet werden.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Datensätze Informationen über die Anamnese, Medikation, Narkose, Operationsverlauf, klinische Parameter und/oder
Nachsorgedaten umfassen.
16. Biologische Probenmaterial-Sammlung, die isoliertes und gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 aufbereitetes biologisches Probenmaterial enthält.
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