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WO2004056985A2 - オキアミ粗酵素液の製法、その粗酵素液とその凍結品、およびそれらを用いた飼料 - Google Patents

オキアミ粗酵素液の製法、その粗酵素液とその凍結品、およびそれらを用いた飼料 Download PDF

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WO2004056985A2
WO2004056985A2 PCT/JP2003/016167 JP0316167W WO2004056985A2 WO 2004056985 A2 WO2004056985 A2 WO 2004056985A2 JP 0316167 W JP0316167 W JP 0316167W WO 2004056985 A2 WO2004056985 A2 WO 2004056985A2
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WO
WIPO (PCT)
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krill
crude
enzyme solution
enzyme
activity
Prior art date
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PCT/JP2003/016167
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WO2004056985A3 (ja
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Tetsu Mori
Kazuhiro Yoshikawa
Yoshio Matsuda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nissui Corp
Original Assignee
Nippon Suisan Kaisha Ltd
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Publication date
Application filed by Nippon Suisan Kaisha Ltd filed Critical Nippon Suisan Kaisha Ltd
Publication of WO2004056985A2 publication Critical patent/WO2004056985A2/ja
Publication of WO2004056985A3 publication Critical patent/WO2004056985A3/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a crude krill enzyme solution, a crude enzyme solution produced by the method, and a feed utilizing the crude enzyme solution. More specifically, a crude krill enzyme solution containing an active enzyme of krill, which can be used as an enzyme preparation for pharmaceuticals and foods, a modifier for food, a fish attractant for leisure, a feeding promoter for cultured fish, etc. And a feed containing the crude enzyme solution.
  • Krill is caught and used around the world, but the largest catch is Antarctic krill. There is a high demand for fresh products of Antarctic krill as fishing baits. There are also processed food products such as peeled meat, but their production is not high, and the main processing method is meal production, and most of them are for feed.
  • Patent Document 2 describes that an enzyme preparation prepared from the order Krillida is used for a pharmaceutical composition that promotes digestion of food.
  • Patent Document 3 describes a plaque removing agent containing an enzyme isolated from Antarctic krill. All of these conventional krill enzymes utilize frozen koki after fishing. The first step was to thaw, hydrolyze and homogenize the amy, and then purified the enzyme by various methods.
  • Patent Document 4 discloses that as a method for purifying a krill enzyme, pressed krill and the like are autolyzed to facilitate separation and extraction. However, it is a problem that squeezed and self-digested by this method has a high moisture content and lacks preservability.
  • enzymatically active ingredients must be of high purity in order to maximize their effectiveness.
  • proteins and their hydrolysates such as water-soluble low-molecular-weight and muscle proteins other than the enzyme active ingredient are unnecessary. Rather, some of them act as enzyme inhibitors, but removal of them is usually very large. Requires great effort.
  • the purity of the starting material is low.
  • the low value has been a problem in terms of potency and preparation cost for the use of Okinawa enzymes.
  • the process of preparing the homogenate requires water, so that the homogenate generally becomes bulky and causes an increase in transportation cost and storage cost.
  • the main raw material for fish farming feed is fish meal, but under the circumstances where the supply of fish meal is decreasing and prices are rising, vegetable protein, especially defatted soybean meal, etc. is used as an alternative protein to fish meal. Attempts have been made to use them.
  • the amino acids required for fish and shellfish are different from the constituent amino acids of plant proteins, digestive enzyme inhibitory active factors are contained in addition to plant proteins, and indigestible carbohydrates of plants inhibit digestion and absorption. For some reasons, there were limits to their use (see Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 JP-A-5-2626665
  • Patent Literature 2 Japanese Translation of International Publication No. 6 1-50
  • Patent Document 3 JP-A-2000-3 5 1 734
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 2-5504446
  • Non Patent Literature 1 V i y a k a r n e t a ⁇ . N i p p o n S u i s a n Ga kk a i s h i ⁇ 5 8, 1 9 9 1-2000 (1 9 9 2)
  • the present inventors have found that by partially decomposing indigestible carbohydrates contained in a plant used as a raw material of a fish farm feed with an enzyme in advance, the feed efficiency of a feed made from plant protein is improved.
  • Application has been filed (Japanese Patent Application No. 200 2—2 3 2 501, not disclosed).
  • krill enzymes have been found to be suitable as this enzyme, they required a source of krill enzymes that satisfy the degree of purification and price suitable for use as feed material.
  • Impurities that inhibit enzyme activity are eliminated as much as possible, organic impurities that cause spoilage are eliminated as much as possible, and production and distribution costs are suppressed, and krill preparations that maintain the desired enzyme activity are obtained. Accordingly, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, have found a method for producing a krill body fluid that has a small amount of impurities such as muscle proteins and hydrolysates thereof, has a low risk of spoilage, and maintains a desirable enzyme activity. Developed and completed the present invention.
  • fresh krill is squeezed to obtain krill body fluid, and further concentrated at low temperature
  • a method for producing a crude krill enzyme solution and a crude krill enzyme solution produced by this method are summarized.
  • the low-temperature concentration is preferably carried out at a temperature lower than the temperature at which the target enzyme is deactivated, and a solid content of 30% or more is preferable.
  • the present invention provides a frozen krill crude enzyme solution obtained by squeezing fresh krill and concentrating at a low temperature. After pressing, it is preferable to concentrate at a low temperature below the temperature at which the enzyme is deactivated, and it is preferable that the solid content is 30% or more. Further, the present invention provides an animal feed containing a raw material treated with a krill crude enzyme solution obtained by squeezing fresh krill and concentrating at a low temperature.
  • the gist is an animal feed containing plant protein raw material treated with a crude krill enzyme solution obtained by squeezing fresh krill and concentrating at low temperature.
  • the gist of the present invention is an animal feed containing a krill crude enzyme solution obtained by squeezing fresh krill and concentrating at a low temperature to partially decompose the indigestible saccharide of a vegetable protein material.
  • the present invention relates to a method for producing and utilizing a krill crude enzyme solution in which the content of an extra enzyme inhibitory factor is small and the depletion or deterioration of the enzyme activity due to oxidation and freezing is suppressed, that is, a krill body fluid and a concentrate thereof.
  • the present invention squeezes fresh krill and separates it into a body fluid rich in enzymes and a solid content rich in nutrients such as proteins. Concentrate below. In this step, a volume reduction effect due to concentration can also be expected, which facilitates distribution of the krill pressed liquid concentrate of the present invention.
  • the solid content generated in the pressing step of the present invention can be used as a meal raw material as in the past.
  • lipids are extracted from the pressed solids by centrifugation or other methods.
  • active ingredients such as polyunsaturated fatty acids, antioxidant dyes, and phospholipids, etc., and commercialize them as chemical products and health foods.
  • the raw krill used in the present invention is preferably fresh.
  • a known method used for solid-liquid separation can be used for squeezing to obtain the krill body fluid of the present invention. Specifically, it can be selected from sandwiching with a mesh from two directions, pushing into a mesh from one direction such as a screw press, filling a filter cloth, and the like. Since krill has no skeleton and its outer shell is very soft, the force required for squeezing is small. Although the results differ depending on the timing of the raw krill and the method of pressing, usually about 1 to 50% of the weight of the raw krill is obtained as a pressed liquid.
  • the solids produced here can be prepared almost in the same manner as normal meal by treating it with the usual method for producing meal from caught krill.
  • the enzyme is deactivated during the ripening step, and then a substantial portion of the water-soluble components are removed during the solid-liquid separation step. This is because all and a significant portion of the water-soluble components usually do not naturally remain in meal products.
  • Known methods can be used for the concentration of the krill body fluid of the present invention, but concentration at a low temperature is effective for suppressing the inactivation of the enzyme and the oxidation and denaturation of the active ingredient.
  • the temperature is preferably 55 ° C or less when protease is considered as the enzyme, and 40 ° C or less when carbohydrate degrading enzyme is considered. Concentrations in this temperature range can be selected according to the purpose, such as concentration under reduced pressure, membrane concentration, drying with cold air, and removal of water by an adsorbent.
  • the pH is hardly changed from that before the concentration, the salt concentration is about 2.5 to 5.0, and the enzyme activity immediately after the compression is maintained even after the concentration.
  • the krill body fluid concentrate of the present invention retains its enzymatic activity due to its production method and can be used as an enzyme preparation for medicine and food, a modifier for food, feed and the like.
  • additional effects can be expected because they contain pigments such as astaxanthin and food attractants in addition to enzymes.
  • any vegetable protein raw material used as a substitute for animal protein raw material for animal feed raw material can be used.
  • the main examples include soybean, defatted soybean meal, corn gluten meal, raw bran, processed bran, wheat, rapeseed oil cake, cottonseed oil cake, potato protein and the like.
  • the animal feed material of the present invention is preferably prepared by adding the krill crude enzyme solution of the present invention or the concentrated krill crude enzyme solution to a plant protein material containing an indigestible saccharide at 20 to 60 ° C. Is aged at 30 to 50 ° C for 1 to 48 hours, preferably 2 to 6 hours, and then heated at 80 ° C or more, preferably at 85 ° C for 10 minutes or more. It is obtained by sterilizing and drying. During ripening, stirring treatment is performed, but it is also possible to add fresh water so that stirring is difficult and ripening is not insufficient.
  • the indigestible carbohydrate-degrading activity of the krill squeezed liquid was determined by thin layer mouth chromatography. Its activity can be easily confirmed.
  • the degradation activity of the indigestible saccharide is measured as described below. That is, the solid content of the krill crude enzyme solution is separated and removed, and oligosaccharides such as bituminose or maltohexaose are added to a final concentration of 1%, and the mixture is stirred at 40 ° C for 2 hours. Thereafter, the supernatant obtained by centrifuging at 300 rpm, 10 minutes at 4 ° C. was spotted on a silica gel thin layer plate, butanol: propanol: water (1: 3: 2).
  • Nankoku krill which has abundant resources and high enzymatic activity is preferable, but other krills having the same activity can be used.
  • the animal feed material in the present invention is a feed material used for livestock, poultry farming, and fish farming, and is a feed material used as a protein supplement source.
  • the feed of the present invention is particularly suitable for fish farming and crustacean farming.
  • fish culture and crustaceans include fish to be cultured, such as red sea bream, salmon, hamachi, trevally, trout, flounder, eel and shrimp.
  • the animal feed of the present invention can be produced by processing and shaping the animal feed raw material of the present invention and other feed raw materials together.
  • the animal feed material of the present invention can be provided in powdered form by heating and drying after okiami treatment, and can be easily used as a feed material of various types, particularly as a substitute for animal protein. Can be. In the case of fish farming, it can be used as a substitute for fishmeal.
  • Example 1 Production of krill body fluid and its properties
  • Nankiyotakiami was caught by a trawler (February 2002) and transported on a net conveyor to remove excess seawater attached to the fish.
  • an umbrella-type press (Asahi Press F-50-S-3 type)
  • the fish was sandwiched between both sides of the fish body with a wire mesh, and the liquid was discharged as a krill body fluid to the outside of the wire mesh and collected (yield from 2 kg of krill). 389 g) 0
  • Table 1 shows the component data of the obtained krill body fluid.
  • Example 2 Krill body fluid concentration test and physicochemical analysis
  • Protease activity of each concentrated solution obtained in Example 2 was estimated using azocasein degradation as an index.
  • the data in Table 3 was obtained from the absorbance at 44 Onm. This table shows the increase in absorbance at 44 nm when the concentrated solution was reacted with azocasein at a final concentration of 1% at 37 ° C for 60 minutes.
  • “enzyme activity of the concentrated solution” indicates the enzyme activity of the concentrated solution itself
  • “concentration correction value” is a correction value obtained by converting the enzyme activity to the solid content in the concentrated solution.
  • the carbohydrate-degrading activity was estimated using the degradation of p-ditophenyl phenyldarcoside as an index. This is to estimate the intensity of the enzyme activity by quantifying p-nitrophenone anion generated when the enzyme in the concentrated solution acts on the substrate to release glucose, from the absorbance. 420 nm when a decomposition reaction was performed for 5 minutes at 37 and H 6.0 using 5 mM substrate
  • Table 4 shows the increase in absorbance at.
  • “absorbance” represents the increase in absorbance for each concentrated solution
  • concentration correction value is a correction value obtained by converting the value of “absorbance” to the solid content in the concentrated solution.
  • ⁇ concentration correction value '' in Table 4 is considered to indicate the relative value of the specific activity of the enzyme, but this does not change much during the enrichment process, and changes in salt concentration do not affect carbohydrate degradation activity It is shown that.
  • Example 5 Conservation of enzyme activity of krill body fluid
  • Example 24.7 kg (82% water content) of the krill body fluid obtained in Example 1 was placed in a 100 L vacuum vessel and concentrated under reduced pressure while stirring at a liquid temperature of 25 ° C to obtain a concentrate having a solid content of 37%.
  • Got. This was dispensed into plastic containers by 80 to 10 Om1 and sealed, and stored at 20 ° C, 5 ° C, 25 ° C, and 40 ° C for 1 to 5 months.
  • Tables 5 to 7 show the protease activity, saccharolytic enzyme activity, and general viable cell count per sample lg of each stock solution, respectively.
  • the notation of the enzyme activity value is the same as the enzyme activity of the concentrated solution shown in Example 3 for the protease activity and the absorbance shown in Example 4 for the carbohydrate degrading enzyme activity.
  • the protease activity and glycolytic enzyme activity before storage of this sample were 3.5 and 17.4, respectively.
  • the krill body fluid concentrate can be stored at a solid content of about 37% for 1 month at a temperature of 120 to 40 ° C, and for 5 months at a glycolytic enzyme activity of 5 It can be seen that the general viable cell count does not increase for 4 months below 5 ° C.
  • Example 6 Production of feed from raw material treated with krill crude enzyme solution Squeezing krill with indigestible carbohydrate-decomposing activity to produce krill raw material
  • a 10% by weight squeezed liquid was prepared.
  • 30 kg of defatted soybean meal was added to 25 kg of the squeezed liquid, heated and stirred at 40 ° C for 2 hours, maintained at 85 ° C for 10 minutes, and then cooled and freeze-dried.
  • Decomposed defatted soybean meal was prepared.
  • the obtained decomposed defatted soybean oil cake is mixed in advance with a mixer together with a mixture of fishmeal, rice bran, vitamins and minerals, and water and oils are added using a twin-screw truss extruder. Molded into. Table 8 shows the composition.
  • Example 7 Breeding test using krill-treated soybean supplemented feed
  • Example 8 Comparison of storability between squeezed liquid not autolyzed and autolyzed juice.
  • the crude enzyme solution having a solid content of 37% obtained in Example 5 is referred to as a body fluid concentrate.
  • the krill harvested in February was crushed and kept at 50 ° C for 1 hour to promote autolysis, and further concentrated at 23 ° C under reduced pressure to reduce the solid content.
  • a crude enzyme solution of 29% was obtained (referred to as autolysate).
  • the body fluid concentrate and the autolysate were subjected to a storage test at 120 ° C for 25 weeks at 25 ° C.
  • the protease activity and saccharolytic enzyme activity of each storage solution were examined, and the values before storage were set to 100% and shown in Tables 10 to 11.
  • Table 12 shows the number of general viable bacteria per 1 g of the sample.
  • the notation of the value of the enzyme activity is the same as the enzyme activity of the concentrated solution shown in Example 3 for the protease activity and the absorbance shown in Example 4 for the carbohydrate degrading enzyme activity.
  • Protease inhibitor cocktail (Sigma, product number P 2714: 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonylfluoride, aprotune, bestatin, EDTA, trans-epoxysuccinyl-L-leucylamide (4-Guanidino) butane and leptin) was added in an amount sufficient to stop the activity of krill protease, and the mixture was kept at 40 ° C for a certain period of time, and the centrifuged supernatant was collected.
  • Example 11 Effect of Protease Inhibitor on Krill Body Fluid
  • krill used as a raw material was collected in February and May 2002. According to the method shown in Example 1, about 400 g of krill body fluid was produced from each of these 2 kg. Egg white, soy milk, kinako, SBM (defatted soybean meal), or CGM (corn gluten meal) were used as protease inhibitors.
  • the magnitude of the kakiamipu oralase activity varies according to the fishing season, and is high in summer in Antarctica, and is expected to decrease significantly after autumn.
  • the protease activity was lower in May (winter) than in February (antarctic summer), when the protease activity was high. It can be seen that thease inhibitors function more effectively.
  • a krill crude enzyme solution in which oxidization, denaturation, and alteration are suppressed and storage stability is improved can be produced.
  • This is a simple and inexpensive production method as compared with known methods for preparing krill-derived enzymes. It is possible to provide a high-quality crude krill enzyme solution with less contamination of muscle proteins and hydrolysates thereof.
  • This crude enzyme solution can be used effectively as a feed material other than the enzyme when it is used as a feed material, while the enzyme is concentrated when a highly pure enzyme is produced. Thus, a preferred intermediate material can be provided.

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Description

明 細 書 ォキアミ粗酵素液の製法、 その粗酵素液とその凍結品、 およびそれらを用い た飼料 技術分野
本発明はォキアミ粗酵素液の製法およびその製法により製造した粗酵素液、 さらに粗酵素液を利用する飼料に関する。 より詳細には、 ォキアミの活性な 酵素を含有し、 医薬用 ·食品用酵素製剤、 食品等の改質剤、 レジャー用魚類 誘引剤、 養殖魚用摂餌促進剤などに利用できるォキアミ粗酵素液およびその 粗酵素液を含有する飼料に関する。 背景技術
ォキアミは世界各地で漁獲され利用されているが、 最も漁獲の多い種類は ナンキヨクオキアミである。 ナンキヨクオキアミの生鮮品は釣り餌としての 需要が高い。 剥き身など食品用途の加工品もあるが、 その生産量は高くなく 、 主要な加工方法はミール製造であり、 大半が飼料用途である。
ォキアミは酵素活性が強くて漁獲直後から黒変や自己消化が急速に進み、 これがォキアミ利用を制限する要因となっている。 一方ではこの強力な酵素 活性の利用も進められ、 例えば、 特許文献 1には生物学的起源の汚染物質又 はかかる汚染物質の分解生成物をクリーニングする （分解及び除去する） た めにォキアミ目から調製される消化酵素を用いることが記載されている。 ま た、 特許文献 2には食物の消化を促進する医薬組成物にォキアミ目から調製 される酵素製剤を使用することが記載されている。 さらに特許文献 3にはナ ンキヨクオキアミから分離された酵素を含む歯垢除去剤について記載されて いる。 これら従来のォキアミ酵素の利用ではいずれも、 漁獲後冷凍したォキ アミを解凍し、 加水してホモジナイズする工程が最初にあり、 その後種々の 方法で酵素を精製していた。
一方、 特許文献 4にはォキアミ酵素を精製する方法として圧搾されたォキ アミなどを自己消化させ、 分離おょぴ抽出を容易にすることが記載されてい る。 しかし、 この方法で圧搾して自己消化させたものはそのままでは水分含 量も高く、 保存性に欠ける点が課題である。
酵素活性成分はその有効性を最大限に発揮するためには純度が高いことが 必要であることは言うまでもない。 すなわち酵素活性成分以外の他の水溶性 低分子および筋肉タンパク質などのタンパク質やその加水分解産物は不必要 であり、 むしろこれらの中には酵素阻害剤として働くものもあるが、 除去に は通常多大な労力を必要とする。
冷凍ォキアミを原料とし、 肉片 ·殻 ·ェマルジヨンを形成している脂質な ど、 ォキアミの全成分が均一に分散したホモジネートから目的のォキアミ酵 素を抽出 ·精製する方法においては、 出発原料の純度が低いことが、 ォキア ミ酵素の利用にとって力価の面、 調製コストの面から問題となっていた。 ま たホモジネートの調製工程では加水が必要なため、 ホモジネートは一般に嵩 高いものとなり、 輸送コスト、 保管コストの増加の原因となるものであった さらに加水により水分含量が高くなるため、 有効成分の力価が十分に得ら れないだけでなく、 不純物として含まれる有機物の p Hが中性に近いことか ら腐敗が生じやすく、 そのため冷凍状態で流通させることが不可欠であり、 このことも輸送コスト、 保管コストの増加の一因であった。 これらのコスト は消費地から遠い南極海で漁獲されるナンキヨクオキアミにおいては特に重 要な問題である。
養魚用飼料の主原料は魚粉であるが、 魚粉の供給の減少、 価格の高騰とい つた環境下、 魚粉代替蛋白質として植物性蛋白質、 特に脱脂大豆粕などを使 用する試みがなされている。 しかし、 魚介類の必要アミノ酸が、 植物性蛋白 質の構成アミノ酸と異なること、 植物性蛋白質の他に消化酵素阻害活性因子 が含まれていること、 植物の難消化性糖質が消化吸収を阻害することなどの 原因により、 その使用には限界があった （非特許文献 1参照）。
特許文献 1 特開平 5— 26 26 6 5号公報
特許文献 2 特表昭 6 1— 50 1 9 1 8号公報
特許文献 3 特開 2000— 3 5 1 7 34号公報
特許文献 4 特表平 2— 5 0446 5号公報
非特許文献 1 V i y a k a r n e t a \ . N i p p o n S u i s a n Ga kk a i s h i^ 5 8, 1 9 9 1 - 2000 (1 9 9 2) 発明の開示
発明者らは養魚用飼料の原料として用いる植物に含まれる難消化性糖質を 酵素により予め部分分解しておくことにより植物性蛋白質を原料とする飼料 の飼料効率が向上することを見出し、 別途出願している （特願 200 2— 2 3 2 5 0 1、未公開）。 この酵素としてォキアミ酵素が適していることを見出 しているが、 飼料原料として用いるのに適した精製度と価格を満たすォキア ミ酵素の供給源を必要としていた。
酵素活性を阻害する不純物ができるだけ排除され、 腐敗の原因となる有機 物不純物などができるだけ排除され、 かつ、 製造 ·流通コストが抑えられ、 しかも目的とする酵素活性は維持しているォキアミ調製物が求められていた そこで本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、 筋肉タンパク質やその加水分 解物などの不純物が少なく、 腐敗の恐れが低下し、 望ましい酵素活性を維持 したォキアミ体液の製造方法を開発し、 本発明を完成するに至った。
本発明は、 新鮮なォキアミを圧搾してォキアミ体液を得、 さらに低温濃縮 することを特徴とするォキアミ粗酵素液の製法およびこの製法により製造し たォキアミ粗酵素液を要旨とする。 低温濃縮は目的とする酵素の失活する温 度以下で実施することが好ましく、 固形分含有量が 3 0 %以上にしたものが 好ましい。
また、 本発明は、 新鮮なォキアミを圧搾し、 低温濃縮して得たォキアミ粗 酵素液の凍結品を要旨とする。 圧搾後、 酵素の失活する温度以下で低温濃縮 したものが好ましく、 固形分含有量が 3 0 %以上にしたものが好ましい。 また、 本発明は、 新鮮なォキアミを圧搾し、 低温濃縮して得たォキアミ粗 酵素液で処理した原料を含有する動物用飼料を要旨とする。 新鮮なォキアミ を圧搾し、 低温濃縮して得たォキアミ粗酵素液で処理した植物性蛋白質原料 を含有する動物用飼料を要旨とする。 好ましくは、 新鮮なォキアミを圧搾し 、 低温濃縮して得たォキアミ粗酵素液で植物性蛋白質原料の難消化性糖質を 部分分解したものを含有する動物用飼料を要旨とする。
すなわち、 本発明は、 余分な酵素阻害要因の含有量が少なく、 酸化 ·冷凍 による酵素活性の減耗や変質が抑制されたォキアミ粗酵素液、 即ちォキアミ 体液およびその濃縮物の製造方法と利用である。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を具体的に記載する。
本発明は、 新鮮なォキアミを圧搾して、 酵素を豊富に含む体液とタンパク 質など栄養成分を豊富に含む固形分とに分離し、 さらにそのォキアミ体液の 保存性を高めるため、 これを高真空下濃縮する。 この工程では濃縮による減 容効果も期待でき、 これは本発明のォキアミ圧搾液濃縮物の流通を容易にす る。
他方、 本発明の圧搾工程で発生する固形分は従来通りミール原料として使 用可能である。 また圧搾後の固形分から遠心分離などの方法で脂質を抽出し て、 そのなかの有効成分である高度不飽和脂肪酸、 抗酸化性色素、 リン脂質 などを取り出して化成品、 健康食品として製品化することも従来通り可能で ある。
本発明に用いる原料ォキアミは、 新鮮なものが適している。 従来ォキアミ からの酵素の調製などに使用されている冷凍品は、 漁船上での冷凍にある程 度の時間がかかるため多少の自己消化が進行しており、 さらに均一な解凍が 困難なため、 魚体表面など解凍が終了した部分から即座に自己消化が開始さ れ、 ペプチドなど酵素活性阻害物質が生成するからである。 また漁獲後冷凍 させないものであっても、 鮮度が低いものは自己消化産物や自動酸化された 成分が体液に混入するからである。 したがって、 漁獲後速やかに圧搾処理を するのが好ましい。
塩分は余分なのでできる限り公知の方法で除くことが望ましい。 これは原 料をネットコンベアで移送する、 清水で洗浄するなどにより達成できる。 本発明のォキアミ体液を得るための圧搾には、 公知の固液分離に用いられ る方法が利用できる。 具体的には、 二方向からメッシュでの挟み込み、 スク リユープレスなど一方向からメッシュへの押し込み、 濾布への充填などから 選択できる。 ォキアミは骨格を有さず外殻も非常に軟らかいため、 圧搾に必 要な力は少なくてよい。 原料ォキアミの漁獲時期、 圧搾方法などにより結果 は異なるが、 通常原料ォキアミの重量の 1〜 5 0 %程度が圧搾液として得ら れる。
なお、 ここで生じる固形分は、 漁獲されたォキアミからミールを製造する 通常の方法で処理することにより通常ミールとほとんど同じものを調製でき る。 通常のミール製造では煮熟工程で酵素を失活させ、 そのあと固液分離ェ 程で水溶性成分のかなりの部分を除去するので、 本発明の圧搾工程で固形分 から分離される酵素活性の全部と水溶性成分のかなりの部分は通常ミールの 製品中には元来残存しないからである。 本発明のォキアミ体液の濃縮には公知の方法が利用できるが、 酵素の失活 や有効成分の酸化 ·変性を抑制するためには低温での濃縮が有効である。 具 体的には、 酵素としてプロテアーゼを考慮する場合には 5 5 °C以下、 糖質分 解酵素を考慮する場合には 4 0 °C以下などが適当である。 この温度帯での濃 縮には減圧濃縮、 膜濃縮、 冷風乾燥、 吸着剤による水分の除去などの手段が 考えられ、 目的に応じて選択できる。
本発明のォキアミ粗酵素液は、 p Hは濃縮前とほとんど変化がなく、 塩濃 度は 2 . 5〜5 . 0程度であり、 濃縮後も圧搾直後の酵素活性を維持するも のである。
本発明のォキアミ体液の濃縮物はその製造法から酵素活性を保持しており 、 医薬用 ·食品用酵素製剤、 食品，飼料等の改質剤等に使用できる。 特に飼 料に利用する場合には酵素以外にもァスタキサンチン等の色素、 摂餌誘引物 質などを含有するため付加的な効果が期待できる。
本発明において植物性タンパク質原料とは、 動物用飼料原料の動物性タン パク質原料の代替品として用いられている植物性タンパク質原料であれば何 でも使用することができる。 主なものとしては、 大豆、 脱脂大豆粕、 コーン グルテンミール、 生糠、 加工糠、 小麦、 ナタネ油粕、 綿実油粕、 ポテトプロ ティン等が例示される。
本発明の動物用飼料原料は、 難消化性糖質を含有する植物性タンパク質原 料に本発明のォキアミ粗酵素液、 または濃縮したォキアミ粗酵素液を加えて 2 0〜 6 0 °C、 好ましくは 3 0〜 5 0 °Cにて 1〜 4 8時間、 好ましくは 2〜 6時間熟成処理を行い、 次いで 8 0 °C以上、 好ましくは 8 5 °C、 1 0分間以 上維持して加熱殺菌処理を行い、 乾燥処理に付することによって得られる。 熟成の際に、 攪拌処理を行うが、 攪拌が困難で熟成が不充分とならないよう に清水を加えることも可能である。
ォキアミ圧搾液の難消化性糖質分解活性は薄層ク口マトグラフィ一にて容 易にその活性が確認できる。 難消化性糖質の分解活性の測定は以下に述べる ようにして行う。 すなわち、 ォキアミ粗酵素液の固形分を分別除去し、 これ に終濃度 1 %となるようにセ口ビオースまたはマルトへキサオースなどの少 糖類を加えて 4 0 °C、 2時間攪拌処理を行う。 その後、 3 0 0 0 r p m、 1 0分間、 4 °Cにて遠心分離を行って得られる上清 をシリカゲル薄層プレ 一ト上にスポットし、 ブタノール：プロパノール：水 （1 ： 3 ： 2 ) にて展 開し、 オルシノール硫酸溶液を用いて発色させる。 この際に、 セロビオース 、 マルトへキサオースなどの少糖類のスポットが完全に消滅し、 /3—ダルコ ース、 α—グルコースなどと考えられる単糖のスポットのみが出現する活性 を有するものに限定される。
本発明において使用するォキアミは、 資源量が豊富で、 酵素活性が高いナ ンキヨクオキアミが好ましいが、 同様の活性のあるォキアミであれば他のォ キアミも使用できる。
本発明における動物用飼料原料とは、 畜産、 養鶏、 養魚用に使用される飼 料原料であって、 タンパク質補給源として用いる飼料原料である。 本発明の 飼料は特に養魚用、 甲殻類の養殖用に適している。 養魚、 甲殻類としてはマ ダイ、 サケ、 ハマチ、 シマアジ、 マス、 ヒラメ、 ゥナギ、 ェビ等の養殖対象 魚が例示される。
本発明の動物用飼料は本発明の動物用飼料原料及びその他の飼料原料を一 緒に加工成形して製造することができる。 本発明の動物用飼料原料はォキア ミ処理後、 加熱乾燥して粉末状の形態で提供できるもので、 種々のタイプの 飼料用原料として、 特に動物性タンパク質の代替品として容易に使用するこ とができる。 養魚用の場合でいえば、 魚粉の代替品として使用することがで さる。 実施例
以下に本発明の実施例を記載するが、 本発明はこれらに何ら限定されるも のではない。
実施例 1 ：ォキアミ体液の製造およびその性状
ナンキヨタォキアミをトロール船で漁獲し（2002年 2月）、ネットコン ベアで移送することにより魚体に付着した余分な海水を除去した。 これを傘 型プレス （旭プレス製 F— 50— S— 3型） を用い、 魚体の両側から金網で 挟み込むことで液分をォキアミ体液として金網外側へ流出させ回収した （2 k gのォキアミから収量 389 g)0
得られたォキアミ体液の成分データを表 1に示す。
Figure imgf000009_0001
実施例 2 ：ォキアミ体液の濃縮試験と理化学性分析
実施例 1により得られたォキアミ体液 389 g (水分含量 81. 8%) を 2 L容のなす型フラスコにいれ、 ロータリーエバポレータで減圧濃縮した。 このときフラスコは 30°Cに保った水浴で加温し、 減圧は氷冷した水流ポン プを用いた。 濃縮の各段階で適宜サンプリングして、 水分含量の異なる濃縮 液を得た。 これらについての理化学分析のデータを表 2に示す。
表 2
水分 塩濃度
H
(%) (%)
濃縮前 82 6. 7 2. 1
濃縮液 1 81 6. 7 2. 2
濃縮液 2 77 6. 7 2. 5
濃縮液 3 72 6. 7 3. 1
濃縮液 4 63 6. 7 4. 0
濃縮液 5 56 6. 6 4. 6 実施例 3 ：ォキアミ体液のプロテアーゼ活性
実施例 2で得た各濃縮液についてプロテアーゼ活性をァゾカゼイン分解を 指標に推定した。 4 4 O n mにおける吸光度より、 表 3のデータを得た。 本 表では濃縮液と終濃度 1 %ァゾカゼインとを 3 7 °Cで 6 0分反応させたとき の 4 4 0 n mにおける吸光度の上昇値を示した。 なお、 本表の 「濃縮液の酵 素活性」は濃縮液そのものの酵素活性を表し、 「濃度補正値」は酵素活性を濃 縮液中の固形分当たりに換算した補正値である。
表 3
Figure imgf000010_0001
表 2から、 濃縮により濃縮液の塩濃度が変化しているが、 本実施例の濃縮 条件では; p Hはあまり変化しないことが分かる。 また、 表 3の 「濃度補正値 J は酵素の比活性の相対値を表すと考えられるが、 これは濃縮の過程であま り変化せず、 塩濃度が変わってもプロテアーゼの活性には影響しないことを 示している。 実施例 4 ：ォキアミ体液の糖質分解酵素活性
実施例 2で得た各濃縮液について糖質分解活性を p—二ト口フエニルダル コシドの分解を指標に推定した。 これは濃縮液中の酵素が該基質に作用して グルコースを遊離させるときに発生する p—二トロフエノレ一トァニオンを その吸光度から定量し、 酵素活性の強弱を推定するものである。 5 mM基質 を用い、 3 7 、 H 6 . 0で 5分間分解反応を行わせた場合の 4 2 0 n m における吸光度の上昇値を表 4に示す。 なお、 本表の 「吸光度」 は各濃縮液 についての吸光度上昇値を表し、 「濃度補正値」 は「吸光度」 の数値を濃縮液 中の固形分当たりに換算した補正値である。
表 4
Figure imgf000011_0001
表 4の 「濃度補正値」 は酵素の比活性の相対値を表すと考えられるが、 こ れは濃縮の過程であまり変化せず、 塩濃度が変わっても糖質分解活性には影 響しないことを示している。 実施例 5 ：ォキアミ体液の酵素活性の保存性
実施例 1により得られたォキアミ体液 24. 7 k g (水分含量 82%) を 100 L容の減圧釜にいれ、 液温 25 °Cで攪拌しながら減圧濃縮し、 固形分 含量 37%の濃縮物を得た。 これを 80〜10 Om 1ずつプラスチック製容 器に分注して密封し、 一 20°C、 5°C、 25°C、 40°Cで 1〜5ヶ月間保存 した。 各保存液のプロテアーゼ活性、 糖質分解酵素活性、 および試料 l gあ たりの一般生菌数を調べたものをそれぞれ表 5〜 7に示した。 ここで酵素活 性の値の表記法はプロテアーゼ活性については実施例 3に示す濃縮液の酵素 活性、 糖質分解酵素活性については実施例 4に示す吸光度と同じである。 な お、 本試料の保存前のプロテアーゼ活性と糖質分解酵素活性はそれぞれ 3. 5と 17. 4であった。 表 5
ォキアミ体液濃縮物のプロテアーゼ活性
Figure imgf000012_0001
表 6
ォキアミ体液濃縮物の糖質分解酵素活性
Figure imgf000012_0002
表 7
ォキアミ体液濃縮物の一般生菌数
Figure imgf000012_0003
これらの表よりォキアミ体液濃縮物は、 固形分含量 3 7 %程度の場合、 プロ テアーゼ活性は一 2 0〜 4 0 °Cで 1ヶ月、 糖質分解酵素活性は 5でで 5ヶ月 間保存可能であること、 および 5 °C以下では一般生菌数が 4ヶ月間上昇しな いことが分かる。 実施例 6 ：ォキアミ粗酵素液処理した原料を用いた飼料の製造 難消化性糖質分解活性を有するォキアミを圧搾処理して、 ォキアミ原料の
1 0 %重量の圧搾液を作製した。 この圧搾液 2 5 k gに脱脂大豆粕 3 0 kgを 加えて 4 0 °C、 2時間加熱攪拌処理した後 8 5 °C達温 1 0分間維持し、 その 後冷却、 凍結乾燥を実施して分解脱脂大豆粕を作製した。
得られた分解脱脂大豆油粕を魚粉および糟糠類，ビタミンおよびミネラル混 合物とともにあらかじめミキサーで混合し， 2 軸エタス トルーダーで水およ び油脂類を加えて混合 ·混練 ·加熱■加圧してペレツトに成型した。 配合組 成を表 8に示した。
表 8
Figure imgf000013_0001
実施例 7 ：ォキアミ処理大豆添加飼料を用いた飼育試験
平均体重 1 7 . 9 gのマダイを用いて 8週間の飼育試験を実施した。 いず れの試験区も問題なく成育し、 斃死は認められず、 また魚病も発生せず寄生 虫の寄生もなかった。 4週目 （中間） と 8週目 （試験終了時） の体測結果を 表 9に示した。 表 9
Figure imgf000014_0001
この結果から分かるように、 ォキアミ処理大豆区では体重増加 （成長性） が他の 2区よりも優れていた。 さらに、飼料効率も対照区より上回っており、 ォキアミ処理大豆を添加した飼料の優位性が示唆された。 実施例 8 ： 自己消化しない圧搾液と自己消化液との保存性の比較。
本実施例では、 実施例 5で得られた固形分含量 3 7 %の粗酵素液を体液濃 縮液と呼ぶ。 一方、 2月の漁獲のォキアミを粉砕し、 これを 5 0 °Cで 1時間 保持することにより自己消化を進行させ、 さらにこれを品温 2 3 °Cで減圧濃 縮して固形分含量を 2 9 %とした粗酵素液を得た（自己消化液と呼ぶ)。体液 濃縮液および自己消化液について一 2 0でおょぴ 2 5 °Cにて 4週間の保存試 験を実施した。 各保存液のプロテアーゼ活性、 糖質分解酵素活性を調べ、 保 存前を 1 0 0 %として表 1 0〜1 1に示した。 また、 試料 1 gあたりの一般 生菌数を表 1 2に示した。 ここで酵素活性の値の表記法はプロテアーゼ活性 については実施例 3に示す濃縮液の酵素活性、 糖質分解酵素活性については 実施例 4に示す吸光度と同じである。 表 1 0
保存液のタンパク質分解酵素活性 （％)
Figure imgf000015_0001
保存液の糖質分解酵素活性 （％)
Figure imgf000015_0002
表 1 0より、 自己消化液は保存期間中にタンパク質分解酵素活性が大きく 減少しているのに対し、 体液濃縮液は活性が減少していないことがわかる。 次に表 1 1より糖質分解酵素活性については両者とも活性の保存中の減少が 観察されるが、その減少の程度は自己消化液の方が顕著であることがわかる。 最後に表 1 2より、 両保存液とも 2 5 °C保存中に一般生菌数は増加している 1 特に自己消化液では初期の菌数が高いことがわかる。 実施例 9 ：ォキアミ粗酵素液処理の遊離タンパク質增加効果
脱脂大豆粕とォキアミ体液 （2 0 0 2年 2月に漁獲したォキアミより得ら れたもの） とを固形分比で 5 ： 1となるように混合した。 これに対しプロテ ァーゼインヒビターカクテル（シグマ社製、製品番号 P 2714 : 4- (2 一アミノエチル） ベンゼンスルホニルフルォリ ド、 ァプロチュン、 ベスタチ ン、 EDTA、 trans-エポキシスクシニル一 L—ロイシルアミ ド （4—グァニ ジノ） ブタン、 ロイぺプチンの混合物） をォキアミのタンパク質分解酵素活 性を停止させるに十分な量添加して、 40°Cで一定時間保持したものの遠心 分離上清を採取した。 タンパク質分解酵素活性がプロテアーゼインヒビター により有効に抑制されていることは、 上清を SD S— PAGE分析して、 泳 動パターンが 40°C保持処理前後で変化していないことから確認した。 ブラ ッドフォード法により測定した上清 1 m Lあたりの可溶性タンパク質を表 1 3に示す。
表 13 ォキアミ処理の進行と可溶性タンパク質量 (g/mL)
Figure imgf000016_0001
両成分を単独で保持した場合には時間経過により可溶性タンパク質量はほ とんど変化していない。 これらの和に比べ、 混合した場合に観察されるタン パク質量は大きく増加した。 また、 経時的に可溶性タンパク質の増量が観察 されることから、 ォキアミ成分の作用により、 大豆粕の不溶性タンパク質の 可溶化が進むことが示唆された。 このことは、 ォキアミ体液処理した大豆粕 の、 飼料としての利用性が高まることを意味すると考えられる。 参考例 1 ：市販糖質分解酵素による大豆可溶性タンパク質の増加効果
脱脂大豆粕 5 gを 45mLの 5 OmMクェン酸緩衝液 （pH4. 5) に懸 濁し、 プロテアーゼインヒビターカクテル （シグマ社製、 製品番号 P 271 4 )をォキアミのタンパク質分解酵素活性を停止させるに十分な量添加した。 これに対し、セルラーゼ Y— NC (ヤクルト薬品工業製）、マセロチーム A (ャ クルト薬品工業製） の 5% (w/v) 溶液、 あるいはピスコザィム L (ノポ ザィム製） を lmL添加して 30分および 3時間反応したものの遠心上清の タンパク質濃度をピウレツト法にて測定した結果を表 14に示す。
表 14 糖質分解酵素処理と大豆可溶性タンパク質量 （mgZmL)
Figure imgf000017_0001
本表より、 糖質分解酵素には大豆粕の可溶性タンパク質を増加させる効果が あることがわかる。 実施例 10 ：ォキアミ粗酵素処理の糖還元末端増加効果
脱脂大豆粕 2 gを用い、 これとォキアミ体液とを固形分比で 5 ： 1となる ように混合した。 これを 40°Cにて 0、 1および 1 6時間保持したのち、 2 0 %硫酸ナトリウムを含む 2. 4 %塩酸を 5倍量加えることで酸性として酵 素反応を停止させた。 このものの濾液をもちいて、 溶液中の糖の還元末端を フェリサイアナイド試薬を用いて定量した。 標準試料としてグルコースを用 いた。 測定された還元末端を脱脂大豆粕 1 gあたりに換算し、 表 1 5に示す 結果を得た。
表 1 5 脱脂大豆粕のォキアミ処理と還元末端量 （％Zg大豆粕）
Figure imgf000017_0002
この結果より、 脱脂大豆粕のォキアミ処理により、 糖還元末端の増加が確認 され、 糖質分解の進行が示唆された。 実施例 1 1 ：ォキアミ体液に対するプロテアーゼ阻害剤の効果 本実施例では原料ォキアミとして、 2 0 0 2年 2月および 5月に漁獲され たものを使用した。 実施例 1に示す方法に従いこれら 2 k gからォキアミ体 液約 4 0 0 gずつを製造した。 プロテアーゼ阻害剤として卵白、 豆乳、 きな 粉、 S B M (脱脂大豆粕）、 または C GM (コーングルテンミール） を使用し た。 各ォキアミ体液に対し、 各プロテアーゼ阻害剤を固形分比で 0 . 4 %添 加して、 実施例 3および 4に記載した方法でプロテアーゼ活性、 グリコシダ ーゼ活性を測定した。 阻害剤無添加の場合の活性を 1としたときの各阻害剤 添加時の各残存活性を表 1 6およぴ表 1 7に示す。 表 1 6 プロテアーゼ阻害剤のォキアミプロテアーゼ活性に対する効果
Figure imgf000018_0001
本表から明らかなように、 卵白および大豆製品のうち豆乳 （生大豆） やき な粉 （焙焼大豆） はォキアミプロテアーゼを阻害した。 一方 S B Mや C G M にはプロテアーゼ阻害活性は認められなかった。 また、 これら試験した阻害 剤はォキアミダルコシダーゼ活性を全く阻害しなかった。 一般にォキアミプ 口テアーゼ活性の大きさは漁獲時期により異なり南極の夏時期は高く、 秋以 降は大幅に低下するとされている。 本実施例の結果では、 プロテアーゼ活性 の高い 2月 （南極の夏季） よりも、 活性の低い 5月 （冬季） のほうが、 プロ テアーゼ阻害剤がより効果的に機能していることがわかる。
産業上の利用可能性
本発明により酸化 ·変性 ·変質が抑制され、 保存性も向上したォキアミ粗 酵素液を製造することができる。 これはォキアミ由来酵素を調製する公知の 方法と比較して、 簡便で安価な製造方法である。 筋肉タンパク質やその加水 分解物の混入が少なく、 良質なォキアミ粗酵素液を提供することができる。 本粗酵素液は飼料原料として用いる場合には酵素以外の飼料原料として好ま しい成分をそのまま有効に活用することができるものであり、 また、 純度の 高い酵素を製造する場合には、 酵素が濃縮された好ましい中間原料を提供す ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 新鮮なォキアミを圧搾してォキアミ体液を得、 これを濃縮することを 特徴とするォキアミ粗酵素液の製法。
2. 請求項 1の製法により製造したォキアミ粗酵素液。
3. 圧搾後、 目的とする酵素の失活温度以下で低温濃縮したものである請 求項 2のォキアミ粗酵素液。
4. 固形分含有量が 30%以上である請求項 2または 3のォキアミ粗酵素 液。
5. 請求項 2、 3または 4いずれかのォキアミ粗酵素液の凍結品。
6. 請求項 2、 3または 4いずれかのォキアミ粗酵素液で処理した原料を 含有する動物用飼料。
7. ォキアミ粗酵素液で処理する原料が植物性蛋白質原料である請求項 6 の動物用飼料。
8. ォキアミ粗酵素液による処理がォキアミ粗酵素液により原料の難消化 性糖質を部分分解したものである請求項 6または 7いずれかの動物用飼料。
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