WO2004054594A1 - 細胞死抑制剤 - Google Patents

Abstract

核酸およびプロタミンを主成分とする魚類白子抽出物を含有することを特徴とする細胞死抑制剤。該細胞死抑制剤は、好ましくは鮭、鱒、鰊および鱈からなる群より選択される魚類より製造され、特に虚血により引き起こされる遅発性神経細胞死の抑制のために好適に使用することができる。

Description

明 細 書 細胞死抑制剤 技術分野

本発明は、 特に虚血により引き起こされる遅発性の神経細胞死に対して抑制効 果のある物質に関する。 背景技術

デォキシリボ核酸 （D N A) およびリボ核酸 （R N A) はあらゆる生物細胞中 に存在し、 生物の遺伝情報を保存している高分子化合物である。 これらの核酸の 構成成分であるヌクレオチドは、 生物のエネルギー源である A T P、 代謝調整物 質である c AM Pおよび c GM P、 並びに捕酵素である N A Dおよび F A Dの構 成成分でもあり、生命活動において重要な役割を果たしている。にもかかわらず、 核酸の栄養学的価値は最近まで殆ど注目されていなかった。 しかし、 近年になつ て、 核酸またはヌクレオチドの摂取が、 細胞発達、 免疫機能、 脳機能、 脂質代謝 等に影響を及ぼすことが報告されている （例えば、 Chandra, R. K. & Kumar i, S. (1994) Symposum ： Dietary Nucreotides ： A Recently Demonstrated Requiment for Cellar Development and Immune Function. J. Nutr. 124 ： 1433S - 1435S、 またま Sato, Ν·， Murakami, Y. , Nakano, Τ.， Suga ara, M.， Kawakarai, H. , Idota, T. & Nakajima, I. , (1995) Effects of Dietary Nucleotides on Lipid Metabolism and Learning Ability of Rats. Biosci. Biothec. Biochem 59 ： 1267 - 1271 参 照丄

ところで、 魚類の白子は核酸とタンパク質の複合体である核タンパク質を多量 に含んでおり、 非常に栄養価の高い食材であることが知られている。 しかしなが ら魚類の白子はごく一部が鮮食用として利用されているのみで、 加工の困難さ、 保存性等の理由により大部分は廃棄処分されており、 その利用分野は限られてい た。

魚類の白子が有する高い栄養学的価値に着目した利用方法の一例として、 白子 の磨砕物および分画物を配合してなる乳幼児用栄養組成物が知られている。 該栄 養組成物は、 それを摂取することによって、 便性改善、 窒素利用効率の改善、 消 化吸収能の向上、 アレルギー発症の抑制、 腸管成熟促進等の効果が期待できると 報告されている （例えば、 特開平 8— 2 3 8 0 7 2号公報、 第 2頁参照。）。

一方、 脳は神経突起を介して互いに結合した神経細胞より構成される。 そして 神経細胞同士の結合が破壊された場合、 時間はかかるけれども神経突起が再生 · 再結合して脳機能を取り戻すことができるが、 神経細胞自体が障害を受けて死ん でしまうと、 神経細胞は他の細胞と異なり分裂增殖しないので脳機能が回復する ことはない。 また脳の神経細胞は虚血に対して非常に弱いことが知られている。 例えば、 手足等の体細胞は数時間血液が流れずとも再灌流後に最終的には元通り 回復するが、 脳の虚血はたった 5分でも神経細胞死を引き起こし、 深刻な後遺症 を引き起こす場合がある。

上記のように、魚類の白子抽出物が有する優れた食効は認識されているものの、 その効果の詳細は未だ解明されておらず、 特に細胞死の抑制効果に関して何ら検 討されていなかった。 白子抽出物の効果は、 その主成分である核酸おょぴ核タン パク質の一種であるプロタミンに由来すると推測されるが、 もし脳神経学的効果 の詳細を解明することができれば、 処方の対象、 .時期、 量等を最適化でき、 しか も他の薬剤との相乗効果をも期待でき、 白子抽出物の有効性を格段に拡張できる と考えられる。

本発明は、 上記の課題に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 第一に、 核 酸およびプロタミンを主成分とする白子抽出物の脳神経学的効果の詳細を明らか にし、 より有効な用途を見出すことにある。 他の目的は、 本明細書の記載より把 握される細胞死抑制剤並びにそれを含む食品の提供にある。 発明の開示

本発明者等は、 鋭意研究を行った結果、 核酸おょぴプロタミンに富んだ魚類白 子抽出物が細胞死、 特に神経細胞死を顕著に抑制し得ることを見出した。

従って、 本願は、

第 1観点において、 核酸およびプロタミンを主成分とする魚類白子抽出物の有効 量を含有することを特徴とする細胞死抑制剤、

第 2観点において、 前記魚類は、 鮭、 鱒、 鰊おょぴ鳕からなる群より選択される ことを特徴とする第 1観点に記載の細胞死抑制剤、

第 3観点において、 遅発性神経細胞死の抑制のために使用されることを特徴とす る第 1観点に記載の細胞死抑制剤、

第 4観点において、 虚血により引き起こされる遅発性神経細胞死の抑制のために 使用されることを特徴とする、 第 3観点に記載の細胞死抑制剤、 そして

第 5観点において、 第 1観点ないし第 4観点に記載の細胞死抑制剤の有効量を含 有することを特徴とする食品

に関する。 図面の簡単な説明

図 1は、 試験例 1に従い、 2 5分間虚血 7日後までの生存率を N F群おょぴ N P群について図示するグラフである。

図 2は、 試験例 2に従い、 未損傷細胞をトルイジンブルー染色した海馬を光学 顕微鏡により拡大した状態で示す図であり、 図 2 Aおよび図 2 Cが N F群、 また 図 2 Bおよび図 2 Dが N P群を示す。

図 3は、 試験例 2に従い、 アポトーシスの様に損傷を受けた細胞を T U N E L 染色した海馬を光学顕微鏡により拡大した状態で示す図であり、 図 3 Aおよび図 3 Cが N F群、 また図 3 Bおよぴ図 3 Dが N P群を示す。

図 4は、 試験例 2において、 細胞数の計測を行った領域を図示する海馬の断面 模式図である。 発明を実施するための最良の形態

本発明の細胞抑制剤は有効量の魚類白子抽出物を含む。 そして本発明の魚類白 子抽出物は核酸と核タンパク質中のタンパク質であるプロタミンとを主成分とし て含有する。

核酸にはデォキシリボ核酸 （D N A) とリボ核酸 （R N A) があり、 生物の遺 伝情報を保存している。そして魚類の白子は、なかでもアデニン（A)、チミン（T)、 グァニン （G) およびシトシン （C ) の四種のヌクレオチドを構成要素としてな る D N Aを多量に含む。 D N Aを包含する核酸の摂取が生物の健康状態の増進に 役立つという報告が近年為されているが、 本発明以前には、 具体的にどのような 効果を生物に奏するかは不明であった。

またプロタミンは、 魚類の白子中に多く含まれる塩基性タンパク質であって、 核酸と結合してヌクレオプロタミンを形成する。 またアルギニン含量が高く、 ァ ルギニン由来の窒素が全窒素含量の 2 5〜9 0 %に相当する。

本発明の魚類白子抽出物は、 例えば、 魚類の白子から皮、 筋、 血管等を除去し た後、 精製することにより製造される。 また、魚類としては、 好ましくは鮭、鱒、 鰊および鳕を挙げることができる。 鮭、 鱒、 鰊および鳕のような魚類の白子は、 従来はその一部が食用に使用されるのみで、 大部分は利用されることなく廃棄さ れていたため、 これらの白子より細胞死抑制剤を製造することにより、 製造コス トを低減することができる。 さらにプロテアーゼおよぴヌクレアーゼでの処理を 行うことにより、 水溶性化することもできる。

本発明の細胞死抑制剤は様々な剤型とすることが可能である。 定法により加工 することにより、 粉末、 顆粒、 錠剤またはカプセル剤等の剤型をとることができ る。 また、 水溶性化されたものは溶液等とすることもできる。

本発明の細胞抑制剤は、 様々な要因により引き起こされる細胞死を有効に抑制 することができる。 特に、 細胞に血液が流れなくなる現象である虚血により様々 な部位の細胞で生じる細胞死を、 本発明の細胞抑制剤は有効に抑制することがで きる。 該部位としては、 例えば心臓、 指先等の末端部位、 腎臓、 陰茎等を挙げる ことができ、 本発明の細胞死抑制剤は、 これらの部位の細胞中の血流 増加させ ることで、 虚血による細胞死を抑制する。 なかんずく、 脳卒中等における虚血 · 再灌流後に脳で生じる遅発性の神経細胞死、 心筋梗塞等における虚血により心臓 で生じる細胞死に対して、 本発明の細胞死抑制剤は有効である。 実際の投薬時に は、 1日当り位 0 . 1〜1 0 g、 好ましくは 0 . 2〜 5 gの量で細胞死抑制剤を 投与することが好ましく、 1日 1〜3回に分けて投与されるが、 年齢、 体重、 症 状等により投与量が増減する。

また本発明では、 魚類白子抽出物からなる細胞死抑制剤を食品に添加すること により、 虚血等の原因で生じる神経細胞死等を抑制するに有効な食品を提供する こともできる。 以下の例により本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらの例に限定される ものではない。 実施例 1 ：

鮭の白子より白子抽出物を以下のように精製した。

1 . 鮭白子の前処理

鮭白子 1 0 0 0 gをとり、 血抜きおよび水洗を行った。 水切りした後 3 0 0 m Lの水を加え、 磨砕、 攪拌して懸濁液を得た。

2 . 粉化処理

次ぎに、 この懸濁液を濾過し白子の皮等の固形分を取り除いた後、 スプレード ライヤ一で噴霧乾燥し、 粉状の物質を得た。

3 . 洗浄、 回収

この粉状の物質をエタノール洗浄して、 エタノール可溶物と水分を除き、 減圧 乾燥し、 粉末状物として、 白子抽出物 1 8 0 _gを得た。

力べして得られた白子抽出物は淡黄色の粉末であって、 その化学的、 物理的性 質を以下に示す。

核酸含有量： 2 5〜 5 0 %

タンパク質含有量： 2 5〜6 0 %

灰分含有量： 5〜： 1 5 %

ニンヒドリン反応： 陽性 実施例 2 ：

水溶性の白子抽出物を以下のように製造した。

1 . プロテアーゼ処理

実施例 1の 1 . で得た懸濁液を 5 0 °Cに昇温した後、 白子の 0 . 1 %であるプ 口テアーゼ [ノボノルディスクバイオインダストリ一株式会社製、 P Y N 3 . 0 S、 主成分：ブタ睥臓からのトリプシン、微量のキモトリブ ンを含む。] 1 _gを 添加し、 攪拌しながら 4時間反応させた。 反応の間、反応液の pHを 6. 0〜6. 3に保持した。反応の間には加熱を行わず、 4時間経過後の反応液の温度は 44. 7°Cに低下した。 反応終了後、 反応液の温度を 70°Cに昇温してプロテアーゼを 失活させた。

2. ヌクレアーゼ処理

70°Cの温度の反応液に、 白子の 0. 1%であるヌクレアーゼ [天野製薬株式 会社製、 ヌクレアーゼ 「ァマノ」、 Penicilliumcitrinum菌より単離。] 1 gを添 加し、 攪拌しながら 4時間反応させた。 反応の間、 反応液の pHを 5. 0〜5. 5に保持した。 反応終了後、 反^液の温度を 85 °Cに昇温してヌクレア一ゼを失 活させた。

3. 酵素処理品からの回収

反応液を 35°Cに冷却し、 pHを 7. 0に調節した。 反応液を連続的にデカン ターに送液してその上澄液を分離し、 分離した上澄液をスプレードライヤーにて 噴霧して乾燥し、 粉末状の白子抽出物 130 gを得た。 以下の実験により、 白子抽出物を投与しない群 （NF群） と比較して、 実施例 1の白子抽出物を投与した群 （NP群） の神経細胞死抑制効果を評価した。 この 効果は、 実施例 1の白子抽出物に限定されるものではなく、 プロテアーゼおよび ヌクレアーゼの酵素処理をすることにより水溶性化された実施例 2の白子抽出物 についても当てはまる。

各群に与えた飼料の組成を表 1に示す。

表 1 実験飼料の組成

% (w/w)

NF ΝΡ

カゼイン 24.5 24.5

コーンスターチ 45.5 44.3

グラニュー糖 10.0 10.0

コーン油 6.0 6.0

結晶性セルロース 3.0 3.0

セルロース粉末 2.0 2.0

α—デンプン 1.0 1.0

ビタミン混合物 1.0 1.0

ミネラル混合物 7.0 7.0

白子抽出物 1.2 該実験には 7週齢の C 57 BL/ 6マウスを用いた。 該マウスを先ず 12時間 明喑サイクル、 23 ± 2°C、 40 ± 15 %の相対湿度で通常の飼料を与えて飼育 し、 次いで各実験群に対応した上記の飼料を与えて 7日間飼育し、 その後に実験 を行つた。

対象とした神経細胞死は、 脳の虚血 ·再灌流後に発症する海馬の遅発性神経細 胞死であり、 マウスの両総頸動脈を一定時間閉塞し、 その後再灌流させて発生さ せた。 試験例 1

25分間閉塞により神経細胞死を生じさせたマウスの NF群および NP群につ いて、 閉塞 7日後までの生存率を比較した。 結果を図 1に図示する。

図 1から明らかなように、双方の群共に虚血 20分後から死亡数が増加し始め、 25分間の虚血による生存率はそれぞれ NF群が 60%そして NP群が 77. 8%であり、 NF群の生存率は NP群より低かった。 双方の群における生存率の 差異は虚血 1日後にはより顕著となり、 NF群が 20%、 群が55. 6%と なった。 試験例 2

1 5分間閉塞により遅発性神経細胞死を生じさせたマウスの N F群および N P 群について、 神経細胞死の抑制効果を比較した。

虚血 2日後にマウスを安楽死させてその海馬の断面を、 トルイジンブルー染色 した試料および T U N E L染色した試料について光学顕微鏡により観察した。 ト ルイジンブルー染色は、 大きな円形で透明の核を有する未損傷の細胞を染色する ものであり、 一方、 TUNE L染色はアポトーシスのように損傷を受けた細胞を 染色するものである。 図 2は、 トルイジンブルー染色した状態を示す図であり、 図 2 Aおよぴ図 2 Cが NF群、 また図 2 Bおよぴ図 2Dが NP群を示す。 スケー ルバ一は、 図 2 Aおよび図 2 Bが 400 μηι、 また図 2 Cおよび 2 Dが 100 μ mである。 また図 3は、 TUNE L染色した状態を示す図であり、 図 3 Aおよび 図 3 Cが NF群、 また図 3 Bおよび図 3Dが NP群を示す。 スケールバーは図 2 と同様である。

図 2から明らかなように、 NF群のマウスの海馬では、 細胞核が収縮して異常 な形状となり、 核小体は明瞭に観察できなかった。 それに対して、 NP群では虚 血 2日後であっても多くの細胞が損傷を受けないままであった。 図 3に図示され る結果は、 図 2のものと一致しており、 NF群では多数の細胞が損傷しており、 一方、 NP群では僅かな細胞の損傷しか生じなかった。

次いで、 未損傷のトルイジン染色された細胞の数と損傷を受け TUNE L染色 された細胞の数とを双方の群について比較した。 細胞数の計測は双方の半球体に ついて二つづつである合計四つの海馬 C A 1領域について行い、 各領域の寸法は それぞれ 260 ^mX 180 μπιであった （図 4参照）。

計測の結果、 N F群のトルィジンブルー染色された細胞数は平均 1 8. 4個で あり、 また TUNE L染色された細胞数は平均 29. 2個であった。 一方、 NP 群では、 トルイジンブルー染色された細胞数は平均 35. 7個であり、 また TU NEL染色された細胞数は平均 9. 3個であった。 この結果は、 実施例 1の白子 抽出物が有する神経細胞死抑制効果を裏付けるものである。

また NF群と NP群について、虚血の間での大脳血流の変化を観察したところ、 NP群では NF群と比較して血流量が顕著に多かった。 これは、 実施例 1の白子 抽出物が細胞中の血流を促進する効果を有することを示す。 産業上の利用可能性

本発明では、 今までその効果が一切知られていなかった魚類白子抽出物が細胞 死の抑制に有用であることを見出したことにより、 魚類白子抽出物の一つの効果 が明らかとなり、 該効果に基づいて処方の対象、 時期、 量等の最適化、 および他 の薬剤との併用が可能となり、 白子抽出物の有効性が格段に増大する。

また、本発明の白子抽出物は、細胞の血流を促進する効果をも有することから、 脳の神経細胞のみならず、 心臓、 指先、 腎臓、 陰茎等における血流の増大にも役 立つ。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 核酸およびプロタミンを主成分とする魚類白子抽出物の有効量を含有する ことを特徴とする細胞死抑制剤。

2 . 前記魚類は、 鮭、 鱒、 鰊おょぴ鳕からなる群より選択されることを特徴と する、 請求項 1記載の細胞死抑制剤。

3 . 遅発性神経細胞死の抑制のために使用されることを特徴とする、 請求項 1 記載の細胞死抑制剤。

4 . 虚血により引き起こされる遅発性神経細胞死の抑制のために使用されるこ とを特徴とする、 請求項 3記載の細胞死抑制剤。

5 . 請求項 1ないし 4に記載の細胞死抑制剤の有効量を含有することを特徴と する食品。