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WO2004052092A1 - Mamíferos no humanos mutantes deficientes en receptores sigma y sus aplicaciones - Google Patents

Mamíferos no humanos mutantes deficientes en receptores sigma y sus aplicaciones Download PDF

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WO2004052092A1
WO2004052092A1 PCT/ES2003/000624 ES0300624W WO2004052092A1 WO 2004052092 A1 WO2004052092 A1 WO 2004052092A1 ES 0300624 W ES0300624 W ES 0300624W WO 2004052092 A1 WO2004052092 A1 WO 2004052092A1
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WO
WIPO (PCT)
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sigma
receptor
gene
mutant
human mammal
Prior art date
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Application number
PCT/ES2003/000624
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English (en)
French (fr)
Inventor
Daniel Zamanillo Castanedo
Lluis Montoliu Jose
Francina Langa Vives
Alfonso Javier Lavado Judez
Victoria Eugenia Tovar Herrador
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Esteve Pharmaceuticals SA
Original Assignee
Laboratorios del Dr Esteve SA
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Publication date
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Priority to EP03778357A priority patent/EP1584232B1/en
Priority to HK06104406.4A priority patent/HK1083987B/en
Priority to DK03778357T priority patent/DK1584232T3/da
Priority to JP2004558125A priority patent/JP4515915B2/ja
Priority to CA002508697A priority patent/CA2508697A1/en
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    • A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy

Definitions

  • the invention relates to mutant non-human mammals deficient in endogenous Sigma receptors, cells derived from said mutant animals, and their applications.
  • the invention also relates to a homologous recombination vector with positive-negative selection useful for the generation of said mutant non-human mammals deficient in endogenous Sigma receptors.
  • Sigma receptors are binding sites with affinity for different ligands, some of which are drugs with different activity. Initially, interest in Sigma receptors was due to their potential role in the actions of anti-psychotic drugs because they showed high affinity for typical neuroleptic agents, such as haloperidol or other compounds that cause psychomimetic activity, for example, ⁇ / -alilnormetazocine (SKF-10047). Subsequently, it has been found that said Sigma receptors may be involved in other physiological mechanisms.
  • Sigma type 1 receptor Two subclasses of Sigma receptors have been identified, called Sigma type 1 receptor and Sigma type 2 receptor, differentiable by their pharmacological profile, function and molecular size. Both types show high to moderate affinity for typical neuroleptic agents, in particular, haloperidol. However, Sigma type 1 receptors exhibit high affinity for (+) - pentazocine, (+) - SKF10047 and others (+) - benzo-morphanes, while Sigma type 2 receptors show low affinity for such compounds. Sigma type 1 receptors have a typical molecular weight of 25 kDa, while the molecular weight of Sigma type 2 receptors is 18-21 kDa (determined in both cases by photoaffinity marking).
  • the Sigma type 1 receptor hereinafter the Sigma-1 receptor, is a non-opioid type receptor, which is expressed in a multitude of adult mammalian tissues (central nervous system, ovary, testis, placenta, adrenal gland, spleen, liver, kidney, gastrointestinal tract, etc.) and also throughout embryonic development from its earliest stages and which, apparently, is involved in a high number of physiological functions.
  • the Sigma type 2 receptor hereinafter the Sigma-2 receptor, is a receptor that is expressed in a multitude of adult mammalian tissues (nervous, immune, endocrine, liver, kidney, etc.).
  • Sigma-2 receptors may be the components of a new apoptosis pathway that could play an important role in the regulation of cell proliferation or in cell development.
  • This route appears to be constituted by Sigma-2 receptors attached to intracellular membranes, located in organelles that store calcium, for example, an endoplasmic reticulum and mitochondria, which also have the ability to release calcium from these organelles.
  • the calcium signals can be used in the signaling path of normal cells and / or in the induction of apoptosis.
  • Sigma-2 receptor agonists induce changes in cell morphology, apoptosis in various types of cell lines and regulate mRNA expression of p-glycoprotein, so they are potentially useful as agents antineoplastic in the treatment of cancer.
  • Sigma-2 receptor agonists induce apoptosis in breast cancer cell lines resistant to common antineoplastic agents that damage DNA.
  • Sigma-2 receptor agonists enhance the cytotoxic effects of said antineoplastic compounds at concentrations where said agonist is not cytotoxic. Therefore, Sigma-2 receptor agonists can be used as antineoplastic agents at doses that induce apoptosis or at sub-toxic doses, in combination with other antineoplastic drugs, to reverse drug resistance thereby allowing dose use.
  • Sigma-2 receptor agonists can also be used in cancer imaging as agents for non-invasive visualization of tumors and their metastases using diagnostic imaging techniques, for example, SPECT or PET. Therefore, Sigma-2 receptors are very interesting targets for tools to fight cancer.
  • Sigma-2 receptor antagonists can prevent irreversible motor side effects caused by typical neuroleptic agents. In fact, it has been proven that Sigma-2 receptor antagonists may be useful as agents to improve the debilitating effects of late dyskinesia that appears in patients as a result of chronic treatment of psychosis with typical antipsychotic drugs, for example, haloperidol. . Sigma-2 receptors also appear to be involved in certain degenerative disorders where blockage of such receptors may be useful. For more information on Sigma-2 receptors see the article by WD Bowen [3]. _ Sigma-2 receptors appear to be involved in numerous physiological functions; However, as with the Sigma-1 receptors, the real role played by the Sigma-2 receptors is not fully known, so there is a need to deepen their knowledge.
  • the genetic manipulation of mammals allows to obtain transgenic animals that express a certain gene or that, on the contrary, have a gene inactivated by means of a specific mutation (knockout or mutant animals). In both cases, the potential it represents for the design of experimental models in laboratory animals that serve to analyze the function, in vivo, of a particular gene is evident.
  • Non-expression of a gene can confer a new phenotype on a mutant animal. Depending on the gene not expressed by said animal, it can be made more or less susceptible to a certain pathological alteration. Such mutant animals are valuable models for the in vivo study of the role that the gene plays as well as for the study of compounds that could potentially be useful in the treatment or prevention of pathologies related to the null or ineffective expression of the product of said gene.
  • Sigma receptors show affinity for om pjJB £ t ⁇ s_cOj3 jlisJMaa real role played by these receptors, so there is a need to generate animal models to study in vivo the role played by endogenous Sigma receptors.
  • a mutant animal, deficient in endogenous Sigma receptors, would help to define the role that these receptors play in vivo and would allow the design and evaluation of potentially interesting compounds for the treatment of processes related to the null or ineffective expression of said receptors.
  • Sigma receptors The invention provides a solution to said existing need.
  • the invention relates to a mutant non-human mammal that has somatic and germ cells in which, at least one allele and, preferably, both alleles, of a gene of an endogenous Sigma receptor contain an exogenous DNA that has been inserted into said gene. so that said mutant non-human mammal does not express the product of the endogenous Sigma receptor gene.
  • Said Sigma receptor may be any Sigma receptor, for example, the Sigma-1 receptor or the Sigma-2 receptor.
  • the exogenous DNA inserted into the endogenous Sigma gene allele comprises a positive selection marker.
  • the invention relates to a viable, non-human mammal, whose genome possesses the gene of a mutated endogenous Sigma receptor and lacks detectable levels of messenger RNA or proteins for said endogenous Sigma receptor.
  • said mutant non-human mammal is a non-human animal belonging to the mammalian class, for example, a mutant mouse, deficient in the endogenous Sigma-1 receptor.
  • Mice deficient in the Sigma-1 receptor are viable, fertile and do not manifest, under laboratory conditions, any symptoms that differentiate them from genetically similar mice but lacking such mutation. Under conditions of controlled housing the mutant mice in the Sigma-1 receptor are indistinguishable from their wild bait brothers.
  • the function (or dysfunction) of the Sigma-1 receptor has been postulated jque_p.uede_estar_asojciada_ajias ⁇ anxiety, depression, schizophrenia or psychosis.
  • the Sigma-1 receptor seems to have anti-amnesic and neuroprotective activity and has also been related to the perception and transduction of analgesia, addiction or stress.
  • the mouse deficient in the Sigma-1 receptor could be useful both for the study of them and for the validation and / or development of drugs designed to regulate or alleviate the effects of the alterations and pathological conditions in which said Sigma-1 receptors are involved.
  • said mutant non-human mammal is a non-human animal belonging to the mammalian class, for example, a mutant mouse, deficient in the endogenous Sigma-2 receptor.
  • Sigma-2 receptors appear to be very interesting targets for the design of tools, both diagnostic and therapeutic, to combat cancer and / or compounds capable of preventing, reducing or alleviating the motor side effects caused in patients undergoing continuous treatment with neuroleptic agents. .
  • mice deficient in Sigma-2 receptors could be useful in the validation and / or development of drugs designed for the diagnosis or treatment of cancer, in the validation and / or development of drugs designed for the prevention and / or treatment of degenerative processes, as well as in the validation and / or development of drugs to prevent, reduce or alleviate the side effects associated with the continued administration of neuroleptic agents to a patient, in particular, the motor side effects.
  • the mutation in the endogenous Sigma receptor gene present in the genome of a cell can be introduced by homologous recombination into said cell between an allele of the endogenous Sigma receptor gene and a homologous recombination vector with positive-negative selection comprising regions of homology with two nucleotide sequences present in said endogenous Sigma receptor gene, and selection of the recombinant homologues by means of the positive-negative selection technique, which are introduced into embryos that are subsequently implanted in recipient females for proper gestation and left that are developed at term.
  • said mutant non-human mammal, deficient in an endogenous Sigma receptor is a heterozygous mutant for said mutation, while in another particular embodiment, said mutant non-human mammal, is a homozygous mutant for said mutation.
  • the offspring of the mutant non-human mammal deficient in an endogenous Sigma receptor constitutes a further aspect of the present invention.
  • the invention relates to cells isolated from said mutant non-human mammal deficient in an endogenous Sigma receptor, which can be propagated and, optionally, immortalized.
  • Such cells may be heterozygous, that is, they contain a mutant allele and a wild-type allele of the endogenous Sigma receptor gene or homozygous, that is, they contain the two mutant alleles of the endogenous Sigma receptor gene.
  • the invention relates to a homologous recombination vector with positive-negative selection, useful for introducing a functional disruption into a gene of a Sigma receptor, comprising: a) a first region of homology, located at the end 5 'of a nucleotide sequence encoding a positive selection marker, wherein said first homology region has a nucleotide sequence that is substantially identical to a first sequence of a Sigma receptor gene; b) a nucleotide sequence encoding a positive selection marker; c) a second homology region, located at the 3 'end of said nucleotide sequence encoding a positive selection marker, wherein said second homology region has a nucleotide sequence that is substantially identical to a second sequence of said Sigma receptor gene, said second _sec epcia_deJ-gene_deJLJ receiver in a 3 'position with respect to said first sequence of the Sigma receptor gene in a wild-type endogenous Sigma gene; and d)
  • the invention relates to a host cell in which said homologous recombination vector with positive-negative selection has been introduced by homologous recombination between said vector and the corresponding endogenous Sigma receptor gene of said host cell, resulting in a functional disruption in said endogenous Sigma receptor gene.
  • said host cell is a differentiated cell that normally expresses the product of the Sigma receptor gene or an undifferentiated and immortal pluripotent cell, such as an embryonic stem cell (embryonic stem celi), established from the internal mass cell of the embryo in the preimplantation phase called blastocyst.
  • said ES embryonic cells are mouse cells.
  • the mutant non-human mammal of the invention can be used as an animal model to study in vivo the role played by endogenous Sigma receptors as well as in the design and evaluation of chemical compounds that could be potentially interesting for the treatment of pathological alterations related to zero or ineffective expression of the products of said genes, or in which such genes were involved. Also, said mutant non-human mammal of the invention could be used as a source of cells for cell cultures.
  • Figure 1 schematically shows the first cDNA ( Figure 1A) and genomic ( Figure 1B) clones obtained from RT-PCR or PCR methods, respectively.
  • Figure 1A depicts the plasmid pmcS1 / N, which corresponds to the 1020 base pair cDNA fragment, obtained from the MS2 / MS4 oligonucleotides [see Table I].
  • Mouse Sigma-1 receptor obtained from the overlapping of the maps corresponding to the four bacteriophage clones ( ⁇ Sgl, ⁇ Sg2, ⁇ Sg5, ⁇ Sg ⁇ ) isolated with 5 'and 3' sequences, surrounding the published sequence of the gene. Abbreviations of restriction enzymes are described in Figure 3. Black boxes correspond to the four exons of the mouse Sigma-1 receptor gene.
  • Figure 3 schematically shows the different original plasmids obtained with genomic DNA inserts corresponding to sequences located in the 5 'and 3' region of the mouse Sigma-1 receptor gene, identified for later use in the construction of the homologous recombination vector. Abbreviations of restriction enzymes are included. The black boxes correspond to the four exons of the mouse Sigma-1 receptor gene.
  • Figure 4 schematically shows the sequence of the mouse Sigma-1 receptor gene to be removed using homologous recombination procedures in mouse ES cells, using the sequence AF030199 as a reference.
  • the black boxes represent the coding areas while the striped boxes represent the 5 'and 3' sequences transcribed but not translated.
  • Figure 5 schematically shows the 5 'and 3' homology sequences of 6.8 and 3.1 kb in size respectively, selected for inclusion in the homologous recombination vector pHR53TK in order to inactivate the Sigma-1 receptor gene mouse
  • restriction enzymes are described in Figure 3.
  • Figure 6 illustrates the verification of the DNA sequence in the transcriptional fusion between the 5 'homology region of the mouse Sigma-1 receptor gene and the first nucleotides of the lacZ indicator gene, present in the pHM2 vector.
  • Figure 7 shows the homologous recombination vector map for inactivation of the mouse Sigma-1 receptor gene in ES embryonic cells.
  • the unique restriction site Salt I is indicated, which identifies the linearization point of the vector for transfection into ES cells.
  • Figure 8 illustrates the experimental design used to distinguish the mutant allele from the wild allele of the mouse Sigma-1 receptor gene in analysis by p.oJimorfJsjnQS_asD.ciadQS_a_the restriction enzyme digestion in Southern blot analysis.
  • Figure 9 shows the result of Southern blot analysis of the genomic DNA corresponding to the 12 positive clones of recombinant ES cells showing the expected polymorphisms, both with the 5 'probe and with the 3' probe. Lanes C and M represent DNA from control ES cells and a molecular weight marker.
  • Figure 10 shows the scheme of the analytical tests by PCR used to establish the genotype of mice carrying mutant and wild alleles of the Sigma-1 receptor gene.
  • Figure 11 shows the results of Southern blot analyzes of wild homozygous (+ / +), heterozygous (+/-) and mutant homozygous (- / -) mice by genomic DNA digestion with the Hiná III and EcoR I e enzymes Consecutive hybridization with the 5 'and 3' probes, respectively.
  • the sizes of the DNA fragments correspond to those expected according to the experimental design ( Figure 8).
  • Figure 12 shows the results of Northern blot analysis of the Sigma-1 receptor (mSR1) gene expression in total RNA from liver, kidney, brain and heart isolated from wild homozygous (+/ +), heterozygous (+) mice / -) and homozygous mutants (- / -).
  • the photograph of ribosomal RNAs used as load control is included in the lower zone.
  • Figure 13 shows the results of Western blot analyzes of wild homozygous (+/-), heterozygous (+/-) and mutant homozygous (- / -) mice illustrative of Sigma-1 receptor gene expression in brain of mouse using a specific polyclonal antibody against the mouse Sigma-1 receptor.
  • Figure 14 illustrates the activity (function) of the mouse Sigma-1 receptor by a ligand-specific [ 3 H] -pentazocine binding assay.
  • Figure 14A is a graph depicting the specific binding (ordered) of said ligand to Sigma-1 receptors of wild homozygous, heterozygous and homozygous mutant mice as a function of ligand concentration (abscissa).
  • Figure 14B is a graph depicting the "bound ligand / free ligand" (B / F) (ordinate) versus bound ligand concentration (abscissa) as a function
  • the invention provides a mutant non-human mammal, deficient in an endogenous Sigma receptor, hereinafter mutant non-human mammal of the invention, whose genome contains a mutation comprising a disruption in a gene of an endogenous Sigma receptor.
  • non-human mammal includes any non-human animal belonging to the class of mammals, for example, mice.
  • mutant non-human mammal of the invention refers to a non-human mammal that has been manipulated to be deficient in an endogenous Sigma receptor, that is, it has a mutation that prevents expression normal product of the Sigma receptor gene and therefore lacks detectable levels of messenger RNA or protein for the endogenous Sigma receptor.
  • Said expression "mutant non-human mammal of the invention” includes both heterozygous mutants (ie, containing a mutant allele and a wild type allele of the endogenous Sigma receptor gene) as homozygous.
  • the mutant non-human mammal of the invention is a homozygous mutant, that is, it contains the two mutant alleles of the endogenous Sigma receptor gene resulting in an undetectable expression of the gene product.
  • Sigma receptor refers to the Sigma type 1 receptor (Sigma-1) and the Sigma type 2 receptor (Sigma-2).
  • the mutation present in the genome of the non-human mammal of the invention may be present in both the somatic cells and the germ cells of the mutant non-human mammal of the invention.
  • said mutation is present in the germ cells of the mutant non-human mammal of the invention, thereby conferring on it the ability to transfer said mutation to its offspring. Therefore, in a particular embodiment of this invention, the mutant non-human mammal of the invention is fertile and can transmit the mutation that possesses its offspring.
  • the mutation present in the mutant non-human mammal of the invention comprises an insertion, a deletion or a point mutation that causes a functional disruption in a gene of an endogenous Sigma receptor, resulting in a mutant non-human mammal deficient in said endogenous Sigma receptor.
  • the genome of the mutant non-human mammal of the invention comprises a transgene within the mutation introduced into the receptor gene. Endogenous sigma.
  • said transgene comprises a gene that codes for a positive selection marker, for example, the neomycin phosphotransferase (neo) gene that codes for neomycin resistance or any other of the positive selection markers mentioned below in relationship with the homologous recombination vector with positive-negative selection provided by this invention.
  • a positive selection marker for example, the neomycin phosphotransferase (neo) gene that codes for neomycin resistance or any other of the positive selection markers mentioned below in relationship with the homologous recombination vector with positive-negative selection provided by this invention.
  • a mutant mouse is provided, deficient in the endogenous Sigma-1 receptor, homozygous for the endogenous, fertile Sigma-1 receptor gene, whose genome contains a disruption in said gene comprising the neo gene.
  • the mutant non-human mammal of the invention can be obtained by a method comprising the introduction of a functional disruption into a gene of an endogenous Sigma receptor present in the genome of a cell.
  • said functional disruption is introduced by homologous recombination in a gene of an endogenous Sigma receptor, for example, in the Sigma-1 receptor gene or in the Sigma-2 receptor gene, present in the genome of a cell appropriate, such as, for example, a differentiated cell that normally expresses said Sigma receptor gene, or a pluripotent ES embryonic cell, by the introduction of a homologous recombination vector with positive-negative selection in said cell, and homologous selection recombinants by the positive-negative selection technique, which can be used for the generation of the mutant non-human mammals of the invention as described below.
  • the mutant non-human mammal of the invention can be obtained by classical cross-linking techniques, or fertilization. in w " fr ⁇ , _between. non-human mammals. mutants of the invention acting as
  • the invention provides recombinant clones of heterozygous pluripotent ES embryonic cells, that is, they possess one of the gene alleles of a mutated Sigma receptor. From these cells, chimeras and, from these, mutant non-human mammals deficient in a Sigma receptor can be obtained.
  • said embryonic cells ES Heterozygous pluripotent are mouse cells from which chimeras and, from these, mutant mice deficient in a Sigma receptor can be obtained.
  • the invention provides a homologous recombination vector with positive-negative selection, hereinafter vector of the invention, comprising: a) a first homology region, located at the 5 'end of a nucleotide sequence encoding for a positive selection marker, wherein said first homology region has a nucleotide sequence that is substantially identical to a first sequence of a Sigma receptor gene; b) a nucleotide sequence encoding a positive selection marker; c) a second homology region, located at the 3 'end of said nucleotide sequence encoding a positive selection marker, wherein said second homology region has a nucleotide sequence that is substantially identical to a second sequence of said Sigma receptor gene, said second sequence of the Sigma receptor gene being in a 3 'position relative to said first sequence of the Sigma receptor gene in an endogenous wild type Sigma gene; and d) a nucleotide sequence encoding a negative selection marker.
  • the Sigma receiver can be any Sigma receiver, for example, a _ 3igma ⁇ LojLi receiver or, ceceptj Sjgma-2.
  • the vector of the invention can be used to introduce a functional disruption in an endogenous Sigma receptor gene, for example, in the Sigma-1 receptor gene or in the Sigma-2 receptor gene, contained in the genome of a cell. by the homologous recombination technique and positive-negative selection of homologous recombinants, which can be used to obtain mutant non-human mammals deficient in an endogenous Sigma receptor.
  • the nucleotide sequence encoding the positive selection marker is flanked at its 5 'and 3' positions by nucleotide sequences substantially identical to sequences of said Sigma receptor gene corresponding to said first and second homology regions, respectively. .
  • a nucleotide sequence is "substantially identical" to a sequence of a Sigma receptor gene when said nucleotide sequence has sufficient homology with the sequence of said Sigma receptor gene to allow recombination. homologous between said nucleotide sequence and an endogenous Sigma gene sequence in a host cell. Typically, the nucleotide sequences of said first and second homology regions are at least 90%, preferably at least 95%, and even more preferably, 100% identical to the nucleotide sequences of the Sigma receptor gene. endogenous to those aimed at homologous recombination.
  • said first and second homology regions are isogenic with respect to the endogenous allele to which they are directed (i.e., the DNA of said homology regions is isolated from cells of the same genetic background as that of the cell in which it is will introduce the vector of the invention).
  • Such regions of homology must be of sufficient length for homologous recombination to take place between the vector of the invention and the endogenous Sigma receptor gene in a host cell when the vector of the invention is introduced into said cell.
  • the total length of said homology regions is at least 5 kilobases (kb), preferably at least 10 kb.
  • said first and second regions of homology .. s_e ____. choose_d_e .___ man.era _, __que_sus _-_ secu.e_nci.as_ de__j ⁇ ucIe ⁇ tidos_sean administratsubstantially identical to each nucleotide sequence of the endogenous Sigma receptor gene flanking a region of said gene destined to be eliminated by homologous recombination and replaced by the nucleotide sequence encoding a positive selection marker.
  • Said first and second homology regions will be chosen based on the sequence of the endogenous Sigma receptor gene in which it is desired to introduce a disruption that results in the absence of detectable levels of endogenous Sigma receptor in the recombinant homologue and, consequently, depending on the mutant animal, deficient in the endogenous Sigma receptor, which it is desired to obtain.
  • the cDNA sequence encoding the Sigma-1 receptor in guinea pigs, the cDNA sequence and the Sigma-1 receptor gene in humans, the cDNA sequence and the Sigma-1 receptor gene in mice have been described. and the cDNA sequence encoding the Sigma-1 receptor in rats [4] - [8].
  • Genomic or cDNA clones encoding endogenous Sigma-1 receptors of animals for which their nucleotide sequence is not yet known can be obtained by conventional methods from cell libraries of said species in view of the sequences of receptor genes Sigma-1 known due to the high homology observed among them.
  • information on the genomic DNA or cDNA sequence of the Sigma-2 receptor gene can be obtained from publications or databases of nucleic acid or protein sequences, or genomic or cDNA clones encoding Endogenous Sigma-2 receptors through the use of conventional methods, with appropriate modifications, from libraries of cells that express them by a strategy similar to that described in Examples 1 and 2 of this description or by similar approaches, with due modifications, to those followed by other authors to obtain the coding sequence of the Sigma-1 receptor gene [4].
  • Said first and second regions of homology can be obtained by conventional methods in view of the nucleotide sequence of the Sigma receptor gene in which it is desired to introduce a disruption, for example, by using the polymerase chain (PCR).
  • PCR polymerase chain
  • _o__RT / PCR transcription, reverse / polymerase chain reaction
  • Example 1.1 describes the isolation of the mouse Sigma-1 receptor gene.
  • the vector of the invention comprises a first homology region whose nucleotide sequence is substantially identical to a first 6.8 kb nucleotide sequence of the receptor gene Mouse Sigma-1 and a second homology region whose nucleotide sequence is substantially identical to a second 3.1 kb nucleotide sequence of said mouse Sigma-1 receptor gene, delimiting a 1.9 kb sequence of said gene [see Figure 5] that is removed by homologous recombination with the vector of the invention.
  • the nucleotide sequence encoding the positive selection marker confers a positive selection characteristic on the cells that contain it, that is, it allows the selection of the cells that contain and express said positive selection marker against the cells that do not contain it.
  • the nucleotide sequence encoding the positive selection marker can be operatively linked to regulatory elements that independently control the expression of said marker, constituting a positive selection expression cassette, or the vector of the invention can be constructed of so that the expression of said marker takes place under the control of the regulatory elements of the endogenous Sigma receptor gene.
  • Virtually any positive selection marker can be used in the construction of the vector of the invention. Illustrative examples of positive selection markers can be found, for example, in the description of US Pat. No. 5,464,764.
  • the vector of the invention contains a nucleotide sequence comprising the neo gene that confers resistance to cellular mortality associated with the treatment with the antibiotic against neomycin or some of its analogues, such as G418 sulfate.
  • the nucleotide sequence coding for the negative selection marker is located in a distal position, 5 'or 3', with respect to said first and second_Legions ___. Of .... homology. .y .._ is operatively linked to the regulatory elements that control the expression of said negative selection marker constituting a negative selection expression cassette.
  • said nucleotide sequence encoding the negative marker is substantially "not identical" to any sequence of the Sigma receptor gene, that is, the nucleotide sequence encoding the negative selection marker does not have sufficient homology with any sequence.
  • the degree of identity between the nucleotides of said nucleotide sequence encoding the negative selection marker and the sequence of the Sigma receptor gene must be less than 45%, preferably less than 30% in order to avoid unwanted recombinations.
  • this nucleotide sequence advantageously, is not identical to any other non-human mammalian genome sequence.
  • the negative selection marker confers a negative selection characteristic on the cells that contain it, that is, it allows to select the cells that do not contain said negative selection marker against the cells that contain it and express since the latter will die by action of the negative selection agent while those that do not contain it will survive.
  • the vector of the invention contains a nucleotide sequence comprising the thymidine kinase (tk) gene of herpes simplex virus (HSV). DNA synthesis can be interrupted in cells that contain and express said tk gene. These cells can be removed using ganciclovir or any other functionally equivalent nucleotide analogue as a negative selection agent. . . _
  • the vector of the invention is a homologous recombination vector with positive-negative selection comprising first and second regions of homology substantially identical to first and second sequences, respectively, of the mouse Sigma-1 gene, a nucleotide sequence comprising the neo gene and a nucleotide sequence comprising the tk gene, such as the vector called pHR53TK [see Figure 7], which can be used to transform mouse cells, for example, mouse ES embryonic cells, which contain the endogenous Sigma-1 receptor gene, by homologous recombination and obtain mouse cells, first with one of the mutated alleles of the gene of the endogenous Sigma-1 receptor, and, secondly, by a second homologous recombination event in the remaining wild allele of the genome, which lack detectable levels of messenger RNA or protein for the endogenous Sigma-1 receptor.
  • Example 1.2 describes the construction of the pHR53TK vector in detail.
  • the vector of the invention allows the use of the "positive-negative" selection technique to select homologous recombinants, that is, it allows to select the cells in which said vector has been introduced since they contain and express the positive selection marker but they have lost the negative selection marker as a result of homologous recombination between the vector and the endogenous Sigma receptor gene.
  • the vector of the invention can be used to introduce a functional disruption in the gene of an endogenous Sigma receptor, for example, in the Sigma-1 receptor gene or in the Sigma-2 receptor gene, present in the genome of a cell. of non-human mammals, and create recombinant homologs (recombinant host cells) which, in turn, can be used to generate mutant non-human mammals, deficient in an endogenous Sigma receptor.
  • recombinant homologs recombinant host cells
  • any conventional_method_ suitable for the introduction of an exogenous DNA into a cell for example, precipitation with calcium phosphate, transfection, microinjection, lipofection, etc., preferably by electroporation.
  • the vector of the invention After the introduction of the vector of the invention into the host cell, it is cultured for an appropriate period of time under conditions that allow homologous recombination between the vector of the invention and the endogenous Sigma receptor gene.
  • Recombinants homologues are selected by the positive-negative selection process and the existence of homologous recombination in the locus of the endogenous Sigma receptor gene is analyzed by conventional techniques, for example, by a Southern blot analysis using a probe that allows to differentiate between the endogenous allele normal (wild type) and the homologous recombinant allele.
  • Example 2.1 describes the inactivation of the mouse Sigma-1 receptor gene by homologous recombination in mouse ES embryonic cells and the obtaining of chimeric mice (chimeras) with a mutation in the mouse Sigma-1 receptor gene by technique of aggregation of morulas, evaluating the germline transmission of said mutation by crossing the respective chimeras with females of a recipient strain, such as a female of the non-consanguineous strain CD-1, whose albino coat is clearly distinguishable from pigmented fur characteristic of Fi hybrid mice generated from crosses between strains 129X1 / SvJ and 129S1 / Sv from which the ES R1 cells used in the homologous recombination process are derived.
  • Homologous recombinants which contain an allele of the mutated Sigma receptor gene, can be used to generate the mutant non-human mammals of the invention.
  • said recombinant host cells that contain a disruption in the endogenous Sigma receptor gene are introduced into embryos by conventional methods, for example, by aggregation of recombinant cells with 8-cell phase embryos (morulas), which are subsequently implanted in female pseudogestant recipient mammals and embryos are allowed to develop at term.
  • the resulting animals are chimeras on which the transmissibility of the mutation is analyzed. by girl-germinal. The chimeras capable.de.
  • Example 2.2 describes obtaining mutant mice (heterozygous and homozygous) for the gene of Endogenous Sigma-1 receptor verifying that they were deficient in said gene as described in Example 2.3 by the corresponding structural, expression and function analyzes in homozygous mutant mice.
  • the offspring of a mutant non-human mammal of the invention which constitutes a further aspect of this invention, can be obtained by conventional methods, for example, by classical cross-breeding techniques between mutant non-human mammals of the invention (parents) or alternatively , by in vitro fertilization of eggs and / or sperm of the mutant non-human mammals of the invention or by cloning, by nuclear transfer and subsequent reconstruction of enucleated ovules with nuclei of mutant or carrier cells of the embryonic or somatic mutation type.
  • the term "offspring” and "offspring of a mutant non-human mammal of the invention” refers to each and every descendant of each generation subsequent to that of the originally transformed non-human mammals.
  • the mutant non-human mammals of the invention can be used as control animals for performing in vivo assays (see below).
  • the mutant non-human mammals of the invention can be used as a source of somatic, fetal or embryonic cells, which, once isolated and cultured, can be used in in vitro assays.
  • immortalized cell lines can be prepared from said cells by using conventional techniques [18-21]. Therefore, in another aspect, the invention provides an isolated cell line derived from the mutant non-human mammal of the invention.
  • said cell line provided by this invention is a murine cell line, for example, a mouse ES embryonic cell line comprising a mutation in the mouse Sigma-1 receptor gene where said cell line lacks of detectable levels of Sigma-1 receptor.
  • the mutant non-human mammals of the invention can also be used as model animals to study the role played in vivo by endogenous Sigma receptors, in particular, Sigma-1 or Sigma-2 receptors, and as control animals for performing in vivo tests.
  • the Sigma-1 receptor appears to be involved in disorders of the central nervous system, such as anxiety, depression or schizophrenia, in memory disorders, for example, amnesia, and in conditions of stress and drug addiction. Likewise, said Sigma-1 receptor seems to be involved in analgesia and neuroprotection processes. Therefore, a mutant non-human mammal, deficient in the Sigma-1 receptor, provided by this invention, can be useful both for the study of such situations as well as for the validation and / or development of drugs designed to regulate or alleviate the effects of the alterations and pathological conditions in which said Sigma-1 receptors are involved.
  • the invention relates to the use of a mutant non-human mammal of the invention, or a cell line provided by this invention, deficient in the Sigma-1 receptor, to evaluate potentially useful compounds intended to prevent and / or treat disorders of the central nervous system, for example, anxiety, schizophrenia or depression; prevent and / or treat memory disorders, for example, amnesia; prevent and / or treat stress conditions; prevent and / or treat drug addiction conditions; produce analgesia; or produce neuroprotection.
  • disorders of the central nervous system for example, anxiety, schizophrenia or depression
  • prevent and / or treat memory disorders for example, amnesia
  • prevent and / or treat stress conditions prevent and / or treat drug addiction conditions
  • produce analgesia or produce neuroprotection.
  • Sigma-2 receptors appear to be targets for the design of tools, both diagnostic and therapeutic, to combat cancer and / or degenerative processes and / or for the design of compounds capable of preventing, reducing or alleviating secondary pathology associated with administration.
  • neuroleptic agents for example, secondary motor alterations caused in patients undergoing continuous treatment with neuroleptic agents, such as haloperidol.
  • a non-human mammal deficient in the Sigma-2 receptor may be useful in the validation and / or development of drugs designed for the diagnosis or treatment of cancer, as well as in the validation and / or development of drugs for the prevention and / or the treatment of degenerative processes, or in the validation and / or development of drugs designed to prevent, reduce or alleviate the side effects associated with the continued administration to a patient of neuroleptic agents, in particular, motor side effects.
  • the invention relates to the use of a mutant non-human mammal of the invention, or a cell line provided by this invention, deficient in the Sigma-2 receptor, for the validation and / or development of drugs designed for the diagnosis or treatment of cancer; the prevention and / or treatment of degenerative processes, or to prevent, reduce or alleviate the side effects associated with the administration of neuroleptic agents.
  • the invention in another aspect, relates to a method for determining the effect of a compound to be tested on a non-human mammal deficient in an endogenous Sigma receptor, such as a Sigma-1 or Sigma-2 receptor, which comprises contacting a mutant non-human mammal of the invention with said compound to be tested and detect the presence or absence of a physiological change in said mutant non-human mammal in response to contact with said compound; or, administering a test compound to said mutant non-human mammal of the invention, administering said test compound to a control non-human mammal expressing the corresponding functional endogenous Sigma receptor, for example, the Sigma-1 receptor or the Sigma receptor -2, and observe if said compound produces an effect on the phenotype in said mutant non-human mammal when compared to the control non-human mammal. Any observable effect on the phenotype could be related, in principle, to the function (or dysfunction) of the Sigma receptor considered.
  • the invention relates to a method for determining the effect of a compound on cells expressing a Sigma receptor, for example, the Sigma-1 receptor or the Sigma-2 receptor, and on cells that do not express said Sigma receptor. , which comprises introducing a compound to be tested in a population of cells, or in a homogenate thereof, wherein said cells are cells isolated or established from a non-human mammal.
  • mutant of the invention administering said compound to be tested to a population of non-human control mammalian cells, or to a homogenate thereof, which expresses the corresponding functional Sigma receptor, and observing or analyzing whether said compound to be tested produces an effect on the expression of said Sigma receptor in the cells of said mutant non-human mammal of the invention when compared to control non-human mammalian cells.
  • any observable effect on the phenotype could be related to the function (or dysfunction) of the Sigma receptor considered.
  • Example 1 describes the isolation and cloning of the mouse Sigma-1 receptor gene and the construction of a homologous recombination vector with positive-negative selection, while in Example 2 the transfection of mouse ES cells and the generation of mutant mice deficient in the murine Sigma-1 receptor.
  • oligonucleotides specific DNA fragments of the expected size were obtained from genomic DNA and total mouse RNA from NMRI and BALB / C strains, using standard PCR and RT / PCR protocols [9].
  • the cDNA corresponding to the 1020 bp fragment was cloned from the pair of oligonucleotides MS2 / MS4 by RT-PCR.
  • the DNA fragments obtained were subcloned into the plasmid vector Bluescript KS + (Stratagene), using usual methods [9].
  • the plasmids obtained with cDNA and gene sequences are described in Figure 1.
  • the plasmid pmcS1 / N is described, which corresponds to the 1020 bp cDNA fragment, obtained from the MS2 / MS4 oligonucleotides, which was subsequently used to obtain genomic clones of the mouse Sigma-1 receptor gene.
  • Figure 5 shows the relative position of the 5 'and 3' homology sequences, 6.8 and 3.1 kb in size and present in the pHR53 vector, with respect to the 30 kb overlap previously described. These 5 'and 3' homology sequences in turn delimit the area of the Sigma-1 receptor gene to be removed, of a size of 1.9 kb.
  • the expression cassette with the HSV-TK gene was cloned into the site of restriction Not I of plasmid pHR53 through an intermediate construction in which the HSV-TK gene was obtained in the pSX vector [12], finally generating on the latter plasmid the vector pHR53TK of 20.8 kb in size, whose map is shown in Figure 7.
  • the plasmid pHR53TK has been deposited in the CECT on October 4, 2002 and has been assigned the access number CECT 5737.
  • a total of 272 recombinant mouse ES cell clones were analyzed by the Southern blot method, described in the literature [9].
  • two probes were designed, a 5 'probe and another 3' probe, away from the homology zones of the mouse Sigma-1 receptor gene included in the pHR53TK vector in order to identify two polymorphisms in the fragment size of restriction.
  • the wild allele (10.7 kb) could be distinguished from the mutant allele (19 kb) of the mouse Sigma-1 receptor gene.
  • Figure 9 shows the results of Southern blot analysis of the genomic DNA corresponding to these 12 clones of ES cells.
  • the eleven surviving chimeras obtained corresponded to two independent ES cell clones, clone # 8 and clone # 175, following the recommendations included in the usual chimera generation protocols, which require obtaining the mutation at least from two independent clones to avoid problems inherent to a certain clone that could generate a phenotype anomalous mutant mouse [10].
  • the germline transmission of the mutation was evaluated by crossing the respective chimeras with females of the CD-1 receptor strain, whose albino coat is clearly distinguishable from the pigmented coat characteristic of the 129Sv strains from which the ES R1 cells used are derived in the homologous recombination process [11].
  • Table III describes the results of the transmission analyzes of the pigmented phenotype (associated with the genotype present in the ES cells) performed on the 11 identified chimeras.
  • Transmissibility analyzes showed that four independent chimeras (1 derived from clone # 175 and 3 derived from clone # 8) were able to effectively transmit (100%) the genotype of ES cells to their offspring, through the germ line . These F1 animals were used to analyze the presence of the mutant allele and, by successive crosses, generate the corresponding mutant mouse.
  • PCR-Sigma uses oligonucleotides MS1 and MS3 [Table I] that can only amplify a specific DNA fragment of 1.16 kb when either of the two alleles of the Sigma-1 receptor gene is intact.
  • PCR-Neo employs two specific and internal oligonucleotides to the gene that confers resistance to neomycin (neo gene) [Neo 1 (SEQ. ID. NO: 5) and Neo 2 (SEQ. ID. NO: 6) ], which amplify a specific 0.7 kb DNA fragment only if either of the two alleles carries the mutation initially detected in ES cells.
  • Table V details the identification of heterozygous individuals among the individuals obtained in F1 resulting from crossings between transmitting chimeras and female CD-1. Only pigmented individuals were analyzed by PCR-Neo. The detection of the 0.7 kb analytical band indicates that this individual is a carrier of the mutation in one of the alleles of the Sigma-1 receptor gene. Approximately half of the pigmented individuals, in each of the two clones, correspond to chinchilla mice. The other half are agouti mice, the wild fur. Similarly, slightly less than half of the pigmented F1 individuals were, in each of the two clones analyzed, heterozygous and therefore carriers of the mutation.
  • the genotype of the F2 animals generated was based on the two analytical tests by PCR (PCR-Sigma and PCR-Neo) described above (see Table IV). The result of these crosses and the total numbers of each of the three genotypes obtained in the second generation individuals are detailed in Table VI.
  • mice are being analyzed in detail to assess the effect of the mutation in the Sigma-1 receptor gene through paradigms aimed at elucidating their participation in analgesia, addiction, depression, psychosis and schizophrenia processes using standard methods in this area of knowledge [16].
  • the mutation has been obtained and analyzed in two different mixed genetic backgrounds (129Sv x CD-1 and 129Sv x C57BL / 6J).
  • mutant mice were generated for the mouse Sigma-1 receptor gene, the absence of the gene (DNA), its expression (messenger RNA), protein and activity (function) was verified to verify that, in effect, the mutant mice were deficient in the Sigma-1 receptor gene.
  • the expression of the Sigma-1 receptor gene was evaluated in different organs of mutant, heterozygous and wild mice in which the gene is usually present [5].
  • the Northern blot technique was used for these expression analyzes, following protocols described in the area [9].
  • Figure 12 the absence of signal is observed in those lanes of the gel that correspond to total RNAs of mutant homozygous animals, and therefore lacking the Sigma-1 receptor gene.
  • the Sigma-1 receptor gene not present, but it is also impossible to find messenger RNAs (transcripts) to document its expression. In effect, the mutant mouse does not express the Sigma-1 receptor gene.
  • the activity (function) of the mouse Sigma-1 receptor was evaluated by a ligand-specific [ 3 H] -pentazocine binding assay. Briefly, brains of mutant (- / -), heterozygous (+/-) and wild (+ / +) mice were homogenized and the homogenates were centrifuged several times in different velocity conditions to obtain the membrane fraction. Subsequently, the samples of the membrane fraction obtained with the radioligand [ 3 H] -pentazocine were incubated under optimal binding conditions for this receptor (37 ° C, for 130-170 minutes), filtration of the samples, washing of samples and reading of the radioactivity count present in the filtrate [22]. The results obtained are shown in Figure 14 and show the absence of activity (function) in homozygous mutant mice.
  • a culture of Escherichia coli Top10F ', called pHR53TK containing the plasmid vector pHR53TK has been deposited in the Spanish Type Culture Collection, CECT, Burjasot, Valencia (Spain), on October 4, 2002, corresponding to the access number CECT 5737.
  • Mammalian cell lines can be established in vitro upon expression of the SV40 large T antigen driven by a promoter sequence derived from the human vimentin gene. Biol. Cell. 73 (1): 7-14.

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Abstract

El genoma del mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, contiene una mutación que comprende una disrupción en un gen de un receptor Sigma endógeno, en donde dicha disrupción génica da lugar a un mutante que carece de niveles detectables de receptor Sigma endógeno. El mutante puede ser utilizado como animal control para ensayos in vivo así como fuente de células que pueden ser utilizadas en ensayos in vitro. Los mutantes deficientes en el receptor Sigma-1 pueden utilizarse como modelos para estudiar in vivo desórdenes del sistema nervioso central, alteraciones de la memoria, condiciones de estrés y adicción a drogas, procesos de analgesia y neuroprotección. Los mutantes deficientes en el receptor Sigma-2 pueden utilizarse para estudiar herramientas, diagnósticas o terapéuticas, para combatir el cáncer y/o procesos degenerativos y/o para el diseño de compuestos capaces de prevenir, reducir o aliviar la patología secundaria asociada a la administración de agentes neurolépticos.

Description

MAMÍFEROS NO HUMANOS MUTANTES DEFICIENTES EN RECEPTORES SIGMA Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a mamíferos no humanos mutantes deficientes en receptores Sigma endógenos, a células derivadas de dichos animales mutantes, y a sus aplicaciones. La invención también se refiere a un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa útil para la generación de dichos mamíferos no humanos mutantes deficientes en receptores Sigma endógenos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los receptores Sigma son unos sitios de unión con afinidad por distintos ligandos, algunos de los cuales son fármacos con distinta actividad. Inicialmente, el interés por los receptores Sigma fue debido a su potencial papel en las acciones de los fármacos anti-psicóticos debido a que mostraban elevada afinidad por agentes neurolépticos típicos, tales como el haloperidol u otros compuestos que causan actividad psicomimética, por ejemplo, Λ/-alilnormetazocina (SKF-10047). Posteriormente, se ha encontrado que dichos receptores Sigma pueden estar implicados en otros mecanismos fisiológicos.
Se han identificado dos subclases de receptores Sigma, denominadas receptor Sigma de tipo 1 y receptor Sigma de tipo 2, diferenciables por su perfil farmacológico, función y tamaño molecular. Ambos tipos muestran de alta a moderada afinidad por agentes neurolépticos típicos, en particular, haloperidol. Sin embargo, los receptores Sigma de tipo 1 exhiben una elevada afinidad por (+)- pentazocina, (+)-SKF10047 y otros (+)-benzo-morfanos, mientras que los receptores Sigma de tipo 2 muestran baja afinidad por dichos compuestos. Los receptores Sigma de tipo 1 tienen un peso molecular típico de 25 kDa, mientras que el peso molecular de los receptores Sigma de tipo 2 es de 18-21 kDa (determinado en ambos casos por mareaje de fotoafinidad).
Receptor Siqma de tipo 1 El receptor Sigma de tipo 1, en adelante receptor Sigma-1 , es un receptor de tipo no opiáceo, que se expresa en multitud de tejidos adultos de mamíferos (sistema nervioso central, ovario, testículo, placenta, glándula adrenal, bazo, hígado, riñon, tracto gastrointestinal, etc.) y también a lo largo del desarrollo embrionario desde sus fases más tempranas y que, aparentemente, está implicado en un elevado número de funciones fisiológicas. Se ha descrito su elevada afinidad por distintos fármacos, tales como SKF-10047, (+)-pentazocina, haloperidol y rimcazole, entre otros, ligandos conocidos con actividad analgésica, ansiolítica, antidepresiva, antiamnésica, antipsicótica, y neuroprotectora, por lo que el estudio del receptor Sigma-1 es de gran interés en farmacología debido a su posible papel fisiológico en procesos relacionados con la analgesia, ansiedad, adicción, amnesia, depresión, esquizofrenia, estrés, neuroprotección y psicosis [1], [2] y [3]. Sin embargo, el papel real que desempeña el receptor Sigma-1 sigue siendo todavía desconocido y enigmático. De hecho, se desconoce su ligando endógeno concreto, aunque se cree que interactúa con hormonas esferoides endógenas, tales como la progesterona y la testosterona.
Se ha descrito la secuencia de cDNA que codifica para el receptor Sigma-1 en conejillos de indias, la secuencia de cDNA y el gen del receptor Sigma-1 en humanos, la secuencia de cDNA y el gen del receptor Sigma-1 en ratones, y la secuencia de cDNA que codifica para el receptor Sigma-1 en ratas.
El primer trabajo que consiguió obtener una secuencia genética codificante para un receptor Sigma-1 se debe a Hanner y colaboradores [4]. En ese trabajo, utilizando las características específicas de unión de este receptor a determinados compuestos marcados radiactivamente, por ejemplo, (+)[3H]Pentazocina, se obtuvo primero una proteína y, pqsterjoEmente.jjn. clon de cDNA que codificaba para la misma. El clon se aisló de una genoteca de cDNA preparada a partir de mRNAs de hígado de conejillo de indias (C. porcellus) [cDNA de 1857 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: Z66537]. Seguidamente, basándose en dicha secuencia de cDNA, diferentes grupos de trabajo procedieron a clonar mediante homología de secuencias, sucesivamente, el cDNA en humanos [5] (cDNA de 1653 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: HSU75283), el cDNA y el gen de ratón [6] (cDNA de 1567 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF030198; gen de 6973 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF030199), el cDNA de rata [7] (cDNA de 1582 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF004218) y el gen en humanos [8] (gen descrito en tres fragmentos de DNA que contienen, respectivamente, el promotor (3589 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF001975), el exon 1, 2 y 3 (757 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF001976) y el exon 4 (1630 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF001977)).
El análisis de la homología existente entre dichas secuencias, tanto a nivel de nucleótidos como de aminoácidos, ha puesto de manifiesto el elevado grado de homología existente entre ellas. El conocimiento de dichas secuencias puede ser utilizado en el desarrollo de modelos animales destinados a estudiar la fisiología y patología asociada con alteraciones en receptores Sigma y el efecto de fármacos potencialmente útiles para ei tratamiento o prevención de patologías asociadas con alteraciones en dichos receptores o en las que están implicadas dichos receptores.
Receptor Si ma de tipo 2
El receptor Sigma de tipo 2, en adelante receptor Sigma-2, es un receptor que se expresa en multitud de tejidos adultos de mamíferos (sistema nervioso, inmune, endocrino, hígado, riñon, etc.). Los receptores Sigma-2 pueden ser los componentes de una nueva ruta de apoptosis que podría jugar un importante papel en la regulación de la proliferación celular o en el desarrollo celular. Esta ruta parece estar constituida por receptores Sigma-2 unidos a membranas intracelulares, localizadas en orgánulos que almacenan calcio, por ejemplo, retículo _endoplásmico_ y mitocondrias, que poseen, además, la capacidad de liberar calcio a partir de dichos orgánulos. Las señales de calcio pueden ser utilizadas en la ruta de señalización de las células normales y/o en la inducción de apoptosis.
Los agonistas de los receptores Sigma-2 inducen cambios en la morfología celular, apoptosis en diversos tipos de líneas celulares y regulan la expresión de mRNA de la p-glicoproteína, por lo que son potencialmente útiles como agentes antineoplásicos en el tratamiento del cáncer. De hecho, se ha observado que agonistas de receptores Sigma-2 inducen apoptosis en líneas celulares de tumores de mama resistentes a agentes antineoplásicos comunes que dañan al DNA. Además, agonistas de receptores Sigma-2 potencian los efectos citotóxicos de dichos compuestos antineoplásicos a concentraciones en las que dicho agonista no es citotóxico. Por tanto, los agonistas de los receptores Sigma-2 pueden ser utilizados como agentes antineoplásicos a dosis que inducen apoptosis o bien a dosis sub-tóxicas, en combinación con otros antineoplásicos, para revertir la resistencia al fármaco permitiendo de este modo el empleo de dosis más bajas del agente antineoplásico y reduciendo consecuentemente sus efectos adversos. Los agonistas de los receptores Sigma-2 pueden utilizarse, además, en el diagnóstico por imagen del cáncer como agentes para la visualización no invasiva de tumores y sus metástasis utilizando técnicas de diagnóstico por imagen, por ejemplo, SPECT o PET. Por tanto, los receptores Sigma-2 constituyen unas dianas muy interesantes para herramientas con las que combatir el cáncer.
Los antagonistas de los receptores Sigma-2 pueden prevenir los efectos secundarios motores irreversibles causados por los agentes neurolépticos típicos. De hecho, se ha comprobado que antagonistas de los receptores Sigma-2 pueden ser útiles como agentes para mejorar los efectos debilitantes de la disquinesia tardía que aparece en los pacientes como consecuencia del tratamiento crónico de la psicosis con fármacos antipsicóticos típicos, por ejemplo, haloperidol. Los receptores Sigma-2 también parecen estar implicados en ciertos desórdenes degenerativos en donde el bloqueo de dichos receptores podría ser útil. Para más información sobre los receptores Sigma-2 véase el artículo de W.D. Bowen [3]. _ Los receptores Sigma-2 parecen estar implicados en numerosas funciones fisiológicas; no obstante, al igual que ocurre con los receptores Sigma-1 , el papel real que desempeñan los receptores Sigma-2 no es totalmente conocido, por lo que existe la necesidad de profundizar en el conocimiento de los mismos. Una alternativa para contribuir al conocimiento de las funciones fisiológicas en las que están implicados dichos receptores Sigma-2 consiste en el desarrollo de modelos animales destinados a estudiar la fisiología y patología en la que pueden estar implicados dichos receptores y el efecto de fármacos potencialmente útiles para el tratamiento y prevención de patologías en las que están implicados dichos receptores.
Tecnología "knockout"
La manipulación genética de mamíferos permite obtener animales transgénicos que expresen un determinado gen o que, por el contrario, tengan un gen inactivado mediante una mutación específica (animales "knockout" o mutantes). En ambos casos es evidente el potencial que representa para el diseño de modelos experimentales en animales de laboratorio que sirvan para analizar la función, in vivo, de un determinado gen.
La tecnología "knockout" para la generación de animales mutantes está bien establecida y ha sido objeto de numerosas publicaciones. A modo ilustrativo, pueden citarse las patentes norteamericanas US 5.464.764, US 5.487.992, US 5.627.059, US 5.631.153, US 6.194.633, US 6.207.876, US 6.239.326, US 6.245.963, US 6.245.965 y US 6.252.132, entre otras.
La no expresión de un gen puede conferir un nuevo fenotipo a un animal mutante. Dependiendo del gen no expresado por dicho animal, éste puede hacerse más o menos susceptible a una alteración patológica determinada. Tales animales mutantes son modelos valiosos para el estudio in vivo del papel que desempeña el gen así como para el estudio de compuestos que potencialmente podrían ser útiles en el tratamiento o prevención de patologías relacionadas con la expresión nula o ineficaz del producto de dicho gen.
Aunque se ha descrito que los receptores Sigma muestran afinidad por om pjJB£tαs_cOj3 jlisJMaa papel real que desempeñan dichos receptores, por lo que existe la necesidad de generar modelos animales para estudiar in vivo el papel desempeñado por los receptores Sigma endógenos. Un animal mutante, deficiente en receptores Sigma endógenos, ayudaría a definir el papel que desempeñan in vivo dichos receptores y permitiría el diseño y evaluación de compuestos potencialmente interesantes para el tratamiento de procesos relacionados con la expresión nula o ineficaz de dichos receptores Sigma. La invención proporciona una solución a dicha necesidad existente.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con un mamífero no humano mutante que tiene células somáticas y germinales en las que, al menos un alelo y, preferentemente, ambos alelos, de un gen de un receptor Sigma endógeno contienen un DNA exógeno que ha sido insertado en dicho gen de manera que dicho mamífero no humano mutante no expresa el producto del gen del receptor Sigma endógeno. Dicho receptor Sigma puede ser cualquier receptor Sigma, por ejemplo, el receptor Sigma-1 o el receptor Sigma-2. En una realización particular, el DNA exógeno insertado en el alelo del gen Sigma endógeno comprende un marcador de selección positiva.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un mamífero no humano, viable, cuyo genoma posee el gen de un receptor Sigma endógeno mutado y carece de niveles detectables de RNA mensajero o proteínas para dicho receptor Sigma endógeno. En una realización particular, dicho mamífero no humano mutante es un animal no humano perteneciente a la clase de los mamíferos, por ejemplo, un ratón mutante, deficiente en el receptor Sigma-1 endógeno. Los ratones deficientes en el receptor Sigma-1 son viables, fértiles y no manifiestan, en condiciones de laboratorio, ningún síntoma que los diferencie de ratones genéticamente similares pero carentes de dicha mutación. En condiciones de estabulación controlada los ratones mutantes en el receptor Sigma-1 son indistinguibles de sus hermanos de carnada salvajes. La función (o disfunción) del receptor Sigma-1 se ha postulado jque_p.uede_estar_asojciada_ajias^ ansiedad, depresión, esquizofrenia o psicosis. El receptor Sigma-1 parece tener actividad anti-amnésica y neuroprotectora y se le ha relacionado, además, con la percepción y transducción de la analgesia, adicción o estrés. Para estas situaciones, que en humanos pueden derivar en condiciones patológicas, el ratón deficiente en el receptor Sigma-1 podría resultar útil tanto para el estudio de las mismas como para la validación y/o el desarrollo de fármacos diseñados para regular o paliar los efectos de las alteraciones y condiciones patológicas en las que están implicados dichos receptores Sigma-1.
En otra realización particular, dicho mamífero no humano mutante es un animal no humano perteneciente a la clase de los mamíferos, por ejemplo, un ratón mutante, deficiente en el receptor Sigma-2 endógeno. Los receptores Sigma-2 parecen ser dianas muy interesantes para el diseño de herramientas, tanto diagnósticas como terapéuticas, para combatir el cáncer y/o compuestos capaces de prevenir, reducir o aliviar los efectos secundarios motores provocados en pacientes sometidos a tratamiento continuado con agentes neurolépticos. Por tanto, los ratones deficientes en receptores Sigma-2 podrían resultar útiles en la validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para el diagnóstico o tratamiento del cáncer, en la validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para la prevención y/o tratamiento de procesos degenerativos, así como en la validación y/o desarrollo de fármacos para prevenir, reducir o aliviar los efectos secundarios asociados con la administración continuada de agentes neurolépticos a un paciente, en particular, los efectos secundarios motores.
La mutación en el gen del receptor Sigma endógeno presente en el genoma de una célula puede ser introducida por recombinación homologa en dicha célula entre un alelo del gen del receptor Sigma endógeno y un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa que comprende unas regiones de homología con sendas secuencias de nucleótidos presentes en dicho gen del receptor Sigma endógeno, y selección de los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección positiva-negativa, los cuales se introducen en embriones que posteriormente son implantados en hembras receptoras para su adecuada gestación y se deja que se desarrollen a término. Las quimeras capaces de transmitir eficazmente el genotipo de los homólogos recombinantes a su descendencia a través de la línea germinal se cruzan con mamíferos no humanos tipo salvaje para obtener mutantes heterocigotos para la disrupción del gen del receptor Sigma endógeno y, posteriormente, los mutantes heterocigotos se cruzan entre sí para obtener mutantes homocigotos, siguiendo una clásica segregación alélica de tipo mendeliano. En una realización particular, dicho mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, es un mutante heterocigoto para dicha mutación, mientras que en otra realización particular, dicho mamífero no humano mutante, es un mutante homocigoto para dicha mutación.
La descendencia del mamífero no humano mutante deficiente en un receptor Sigma endógeno constituye un aspecto adicional de la presente invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con células aisladas a partir de dicho mamífero no humano mutante deficiente en un receptor Sigma endógeno, las cuales pueden ser propagadas y, opcionalmente, inmortalizadas. Dichas células pueden ser heterocigotas, es decir, que contienen un alelo mutante y un alelo tipo salvaje del gen del receptor Sigma endógeno o bien homocigotas, es decir, que contienen los dos alelos mutantes del gen del receptor Sigma endógeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa, útil para introducir una disrupción funcional en un gen de un receptor Sigma, que comprende: a) una primera región de homología, situada en el extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha primera región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una primera secuencia de un gen de un receptor Sigma; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva; c) una segunda región de homología, situada en el extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha segunda región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una segunda secuencia de dicho gen del receptor Sigma, estando dicha segunda _sec epcia_deJ-gen_deJLreceptor Sigma en una posición 3' respecto a dicha primera secuencia del gen del receptor Sigma en un gen Sigma endógeno tipo salvaje; y d) una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección negativa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora en la que dicho vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa ha sido introducido por recombinación homologa entre dicho vector y el correspondiente gen del receptor Sigma endógeno de dicha célula hospedadora, dando como resultado una disrupción funcional en dicho gen del receptor Sigma endógeno. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula diferenciada que normalmente expresa el producto del gen de un receptor Sigma o una célula pluripotente indiferenciada e inmortal, tal como una célula embrional ES (embryonic stem celí), establecida a partir de la masa interna celular del embrión en la fase preimplantatoria denominada blastocisto. En una realización concreta, dichas células embrionales ES son células de ratón.
El mamífero no humano mutante de la invención puede ser utilizado como modelo animal para estudiar in vivo el papel desempeñado por los receptores Sigma endógenos así como en el diseño y evaluación de compuestos químicos que podrían ser potencialmente interesantes para el tratamiento de alteraciones patológicas relacionadas con la expresión nula o ineficaz de los productos de dichos genes, o en las que estuvieran involucrados tales genes. Asimismo, dicho mamífero no humano mutante de la invención podría ser utilizado como fuente de células para cultivos celulares.
Aspectos adicionales de la presente invención resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la descripción y reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra esquemáticamente los primeros clones de cDNA (Figura 1A) y genómicos (Figura 1B) obtenidos a partir de métodos de RT-PCR o PCR, respectivamente. En la Figura 1A se representa el plásmido pmcS1/N, que corresponde al fragmento cDNA de 1020 pares de bases, obtenido a partir de los oligonucleótidos MS2/MS4 [véase la Tabla I].
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receptor Sigma-1 de ratón obtenido a partir del solapamiento de los mapas correspondientes a los cuatro clones de bacteriófagos (λSgl, λSg2, λSg5, λSgδ) aislados con secuencias 5' y 3', circundantes a la secuencia publicada del gen. Las abreviaturas de los enzimas de restricción se describen en la Figura 3. Las cajas negras corresponden a los cuatro exones del gen del receptor Sigma-1 de ratón.
La Figura 3 muestra esquemáticamente los diferentes plásmidos originales obtenidos con insertos de DNA genómico correspondientes a secuencias situadas en la región 5' y 3' del gen del receptor Sigma-1 de ratón, identificados para su posterior utilización en la construcción del vector de recombinación homologa. Se incluyen las abreviaturas de los enzimas de restricción. Las cajas negras corresponden a los cuatro exones del gen del receptor Sigma-1 de ratón.
La Figura 4 muestra esquemáticamente la secuencia del gen del receptor Sigma-1 de ratón a eliminar utilizando procedimientos de recombinación homologa en células ES de ratón, usando la secuencia AF030199 como referencia. Las cajas negras representan las zonas codificantes mientras que las cajas a rayas representan las secuencias 5' y 3' transcritas pero no traducidas.
La Figura 5 muestra esquemáticamente las secuencias de homología 5' y 3', de 6,8 y 3,1 kb de tamaño respectivamente, seleccionadas para su inclusión en el vector de recombinación homologa pHR53TK con objeto de inactivar el gen del receptor Sigma-1 de ratón. Las abreviaturas de los enzimas de restricción se describen en la Figura 3.
La Figura 6 ilustra la verificación de la secuencia de DNA en la fusión transcripcional entre la región 5' de homología del gen del receptor Sigma-1 de ratón y los primeros nucleótidos del gen indicador lacZ, presente en el vector pHM2.
La Figura 7 muestra el mapa del vector de recombinación homologa para la inactivación del gen del receptor Sigma-1 de ratón en células embrionales ES. Se indica el sitio de restricción único Sal I, que identifica el punto de linearización del vector para su transfección en células ES.
La Figura 8 ilustra el diseño experimental utilizado para distinguir el alelo mutante del alelo salvaje del gen del receptor Sigma-1 de ratón en análisis mediante p.oJimorfJsjnQS_asD.ciadQS_a_la digestión por enzimas de restricción en análisis por Southern blot.
La Figura 9 muestra el resultado de los análisis mediante Southern blot del DNA genómico correspondiente a los 12 clones positivos de células ES recombinantes en donde se muestran los polimorfismos esperados, tanto con la sonda 5' como con la sonda 3'. Los carriles C y M representan DNA de células ES control y un marcador de peso molecular. La Figura 10 muestra el esquema de los tests analíticos mediante PCR usado para establecer el genotipo de los ratones portadores de alelos mutantes y salvajes del gen del receptor Sigma-1.
La Figura 11 muestra los resultados de los análisis mediante Southern blot de ratones homocigotos salvajes (+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-) mediante digestión de DNA genómico con los enzimas Hiná III y EcoR I e hibridación consecutiva con las sondas 5' y 3', respectivamente. Los tamaños de los fragmentos de DNA corresponden a los esperados según el diseño experimental (Figura 8).
La Figura 12 muestra los resultados de los análisis mediante Northern blot de la expresión del gen del receptor Sigma-1 (mSR1) en RNA total de hígado, riñon, cerebro y corazón aislado de ratones homocigotos salvajes (+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-). Se incluye, en la zona inferior, la fotografía de los RNA ribosomales utilizada como control de carga.
La Figura 13 muestra los resultados de los análisis mediante Western blot de ratones homocigotos salvajes (+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-) ilustrativos de la expresión del gen del receptor Sigma-1 en cerebro de ratón usando un anticuerpo policlonal específico frente al receptor Sigma-1 de ratón.
La Figura 14 ilustra la actividad (función) del receptor Sigma-1 de ratón mediante un ensayo de unión específica al ligando [3H]-pentazocina. La Figura 14A es una gráfica en la que se representa la unión específica (ordenadas) de dicho ligando a receptores Sigma-1 de ratones homocigotos salvajes, heterocigotos y homocigotos mutantes en función de la concentración de ligando (abscisas). La Figura 14B es una gráfica que representa la relación "ligando unido/ligando libre" (B/F) (ordenadas) frente a la concentración de ligando unido (abscisas) en función
_del origen de dichos receptores__Sigma Δ _ (ratones homocigotos salvajes, heterocigotos y homocigotos mutantes).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención proporciona un mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, en adelante mamífero no humano mutante de la invención, cuyo genoma contiene una mutación que comprende una disrupción en un gen de un receptor Sigma endógeno.
El término "mamífero no humano", tal como se utiliza en esta descripción, incluye a cualquier animal no humano perteneciente a la clase de los mamíferos, por ejemplo, ratones. El término "mamífero no humano mutante de la invención", tal como aquí se utiliza, se refiere a un mamífero no humano que ha sido manipulado para que sea deficiente en un receptor Sigma endógeno, es decir, que tiene una mutación que impide la expresión normal del producto del gen de un receptor Sigma y, por tanto, carece de niveles detectables de RNA mensajero o proteína para el receptor Sigma endógeno. Dicha expresión "mamífero no humano mutante de la invención" incluye tanto mutantes heterocigotos (es decir, que contienen un alelo mutante y un alelo tipo salvaje del gen del receptor Sigma endógeno) como homocigotos. En una realización particular y preferida de esta invención, el mamífero no humano mutante de la invención es un mutante homocigoto, es decir, contiene los dos alelos mutantes del gen del receptor Sigma endógeno dando como resultado una expresión no detectable del producto génico.
El término "receptor Sigma", tal como aquí se utiliza, se refiere al receptor Sigma de tipo 1 (Sigma-1) y al receptor Sigma de tipo 2 (Sigma-2).
La mutación presente en el genoma del mamífero no humano de la invención puede estar presente tanto en las células somáticas como en las células germinales del mamífero no humano mutante de la invención. Ventajosamente, dicha mutación está presente en las células germinales del mamífero no humano mutante de la invención, confiriéndole de ese modo la capacidad de transferir dicha mutación a su descendencia. Por tanto, en una realización particular de esta invención, el mamífero no humano mutante de la invención es fértil y puede transmitir la mutación que posee a.su descendencia. _
La mutación presente en el mamífero no humano mutante de la invención comprende una inserción, una deleción o una mutación puntual que causa una disrupción funcional en un gen de un receptor Sigma endógeno, dando lugar a un mamífero no humano mutante deficiente en dicho receptor Sigma endógeno. En una realización particular, el genoma del mamífero no humano mutante de la invención comprende un transgén dentro de la mutación introducida en el gen del receptor Sigma endógeno. A modo ilustrativo, dicho transgén comprende un gen que codifica para un marcador de selección positiva, por ejemplo, el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) que codifica para la resistencia a neomicina o cualquier otro de los marcadores de selección positiva mencionados más adelante en relación con el vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa proporcionado por esta invención.
En una realización concreta de esta invención, se proporciona un ratón mutante, deficiente en el receptor Sigma-1 endógeno, homocigoto para el gen del receptor Sigma-1 endógeno, fértil, cuyo genoma contiene una disrupción en dicho gen que comprende el gen neo.
El mamífero no humano mutante de la invención puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende la introducción de una disrupción funcional en un gen de un receptor Sigma endógeno presente en el genoma de una célula. En una realización particular, dicha disrupción funcional se introduce mediante recombinación homologa en un gen de un receptor Sigma endógeno, por ejemplo, en el gen del receptor Sigma-1 o en el gen del receptor Sigma-2, presente en el genoma de una célula apropiada, tal como, por ejemplo, una célula diferenciada que normalmente expresa dicho gen del receptor Sigma, o una célula embrional ES pluripotente, mediante la introducción de un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa en dicha célula, y selección de los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección positiva-negativa, los cuales pueden utilizarse para la generación de los mamíferos no humanos mutantes de la invención tal como se describe más adelante. Alternativamente, el mamífero no humano mutante de la invención puede obtenerse mediante técnicas de cruzamiento clásico, o_fertilización. in w"frα,_entre. mamíferos no. humanos. mutantes de la invención que actúen como progenitores.
En otro aspecto, la invención proporciona clones recombinantes de células embrionales ES pluripotentes heterocigotas, es decir, que poseen uno de los alelos génicos de un receptor Sigma mutado. A partir de dichas células se pueden obtener quimeras y, a partir de éstas, mamíferos no humanos mutantes deficientes en un receptor Sigma. En una realización particular, dichas células embrionales ES pluripotentes heterocigotas son células de ratón a partir de las cuales se pueden obtener quimeras y, a partir de éstas, ratones mutantes deficientes en un receptor Sigma.
En otro aspecto, la invención proporciona un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa, en adelante vector de la invención, que comprende: a) una primera región de homología, situada en el extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha primera región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una primera secuencia de un gen de un receptor Sigma; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva; c) una segunda región de homología, situada en el extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha segunda región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una segunda secuencia de dicho gen del receptor Sigma, estando dicha segunda secuencia del gen del receptor Sigma en una posición 3' respecto a dicha primera secuencia del gen del receptor Sigma en un gen Sigma endógeno tipo salvaje; y d) una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección negativa.
El receptor Sigma puede ser cualquier receptor Sigma, por ejemplo, un _ recepíor 3igma¿LojLi o,ceceptoj Sjgma-2.
El vector de la invención puede ser utilizado para introducir una disrupción funcional en un gen de un receptor Sigma endógeno, por ejemplo, en el gen del receptor Sigma-1 o en el gen del receptor Sigma-2, contenido en el genoma de una célula mediante la técnica de recombinación homologa y selección positiva-negativa de los recombinantes homólogos, los cuales pueden ser utilizados en la obtención de mamíferos no humanos mutantes deficientes en un receptor Sigma endógeno. La secuencia de nucleótidos que codifica para el marcador de selección positiva está flanqueada en sus posiciones 5' y 3' por unas secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a unas secuencias de dicho gen del receptor Sigma que corresponden a dichas primera y segunda regiones de homología, respectivamente. Tal como se utiliza en esta descripción, una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente idéntica" a una secuencia de un gen de un receptor Sigma cuando dicha secuencia de nucleótidos tiene la suficiente homología con la secuencia de dicho gen del receptor Sigma como para permitir la recombinación homologa entre dicha secuencia de nucleótidos y una secuencia del gen Sigma endógeno en una célula hospedadora. Típicamente, las secuencias de nucleótidos de dichas primera y segunda regiones de homología son, al menos, un 90%, preferentemente, al menos, un 95% y aun más preferentemente, un 100% idénticas a las secuencias de nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno a las que van dirigidas para la recombinación homologa. Ventajosamente, dichas primera y segunda regiones de homología son isogénicas con respecto al alelo endógeno al que van dirigidas (es decir, el DNA de dichas regiones de homología se aisla a partir de células del mismo fondo genético que el de la célula en el que se va a introducir el vector de la invención). Dichas regiones de homología deben tener una longitud suficiente como para que tenga lugar la recombinación homologa entre el vector de la invención y el gen del receptor Sigma endógeno en una célula hospedadora cuando el vector de la invención se introduce en dicha célula. Típicamente, la longitud total de dichas regiones de homología es de, al menos, 5 kilobases (kb), preferentemente de, al menos, 10 kb.
En una realización particular, dichas primera y segunda regiones de homología.. s_e____.eligen_d_e.___man.era _, __que_sus_-_secu.e_nci.as_ de__jιucIeΛtidos_sean„ sustancialmente idénticas a sendas secuencias de nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno que flanqueen una región de dicho gen destinada a ser eliminada mediante recombinación homologa y reemplazada por la secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva.
Dichas primera y segunda regiones de homología se elegirán en función de la secuencia del gen del receptor Sigma endógeno en el que se desea introducir una disrupción que da lugar a la ausencia de niveles detectables de receptor Sigma endógeno en el homólogo recombinante y, consecuentemente, en función del animal mutante, deficiente en el receptor Sigma endógeno, que se desea obtener. Se han descrito la secuencia de cDNA que codifica para el receptor Sigma-1 en conejillos de indias, la secuencia de cDNA y el gen del receptor Sigma-1 en humanos, la secuencia de cDNA y el gen del receptor Sigma-1 en ratones, y la secuencia de cDNA que codifica para el receptor Sigma-1 en ratas [4]-[8]. Clones genómicos o de cDNA codificantes de receptores Sigma-1 endógenos de animales para los que todavía no se conoce su secuencia de nucleótidos pueden obtenerse por métodos convencionales a partir de genotecas de células de dichas especies a la vista de las secuencias de los genes de receptores Sigma-1 conocidas debido a la elevada homología observada entre las mismas. Asimismo, información sobre la secuencia de DNA genómico o de cDNA del gen del receptor Sigma-2 puede obtenerse a partir de publicaciones o bases de datos de secuencias de ácidos nucleicos o de proteínas, o bien se pueden obtener clones genómicos o de cDNA codificantes de receptores Sigma-2 endógenos mediante el empleo de métodos convencionales, con las debidas modificaciones, a partir de genotecas de células que los expresan mediante una estrategia similar a la descrita en los Ejemplos 1 y 2 de esta descripción o bien mediante aproximaciones similares, con las debidas modificaciones, a las seguidas por otros autores para la obtención de la secuencia codificante del gen del receptor Sigma-1 [4].
Dichas primera y segunda regiones de homología pueden obtenerse por métodos convencionales a la vista de la secuencia de nucleótidos del gen del receptor Sigma en el que se desea introducir una disrupción, por ejemplo, mediante -eLempleo_.deJa_xeacción_e_n-cadena-deJa polimerasa (PCR)_o__RT/PCR. [transcripción, inversa/reacción en cadena de la polimerasa] utilizando los oligonucleótidos iniciadores apropiados. En el Ejemplo 1.1 se describe el aislamiento del gen del receptor Sigma-1 de ratón.
En una realización particular, el vector de la invención comprende una primera región de homología cuya secuencia de nucleótidos es sustancialmente idéntica a una primera secuencia de nucleótidos de 6,8 kb del gen del receptor Sigma-1 de ratón y una segunda región de homología cuya secuencia de nucleótidos es sustancialmente idéntica a una segunda secuencia de nucleótidos de 3,1 kb de dicho gen del receptor Sigma-1 de ratón, que delimitan una secuencia de 1,9 kb de dicho gen [véase la Figura 5] que se elimina mediante recombinación homologa con el vector de la invención.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el marcador de selección positiva confiere una característica de selección positiva en las células que lo contienen, es decir, permite seleccionar las células que contienen y expresan dicho marcador de selección positiva frente a las células que no lo contienen. La secuencia de nucleótidos que codifica para el marcador de selección positiva puede estar operativamente unida a unos elementos reguladores que controlan de forma independiente la expresión de dicho marcador, constituyendo un cassette de expresión de selección positiva, o bien el vector de la invención puede construirse de manera que la expresión de dicho marcador tenga lugar bajo el control de los elementos reguladores del gen del receptor Sigma endógeno. Prácticamente cualquier marcador de selección positiva puede ser utilizado en la construcción del vector de la invención. Ejemplos ilustrativos de marcadores de selección positiva pueden encontrarse, por ejemplo, en la descripción de la patente norteamericana US 5.464.764. En una realización particular, el vector de la invención contiene una secuencia de nucleótidos que comprende el gen neo que confiere resistencia a la mortalidad celular asociada al tratamiento con el antibiótico frente a la neomicina o alguno de sus análogos, tales como el sulfato de G418.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el marcador de selección negativa está situada en una posición distal, 5' ó 3', respecto a dichas primera y _segunda_negionesL___.de.... homología. .y.._está operativamente unida a los elementos reguladores que controlan la expresión de dicho marcador de selección negativa constituyendo un cassette de expresión de selección negativa. Ventajosamente, dicha secuencia de nucleótidos que codifica para el marcador negativo es sustancialmente "no idéntica" a ninguna secuencia del gen del receptor Sigma, es decir, la secuencia de nucleótidos que codifica para el marcador de selección negativa no tiene la suficiente homología con ninguna secuencia del gen del receptor Sigma como para permitir la recombinación homologa entre dichas secuencias, es decir, el grado de identidad entre los nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para el marcador de selección negativa y la secuencia del gen del receptor Sigma debe ser inferior al 45%, preferentemente inferior al 30% con el fin de evitar recombinaciones indeseadas. Además, esta secuencia de nucleótidos, ventajosamente, no es idéntica a ninguna otra secuencia del genoma del mamífero no humano. El marcador de selección negativa confiere una característica de selección negativa en las células que lo contienen, es decir, permite seleccionar las células que no contienen dicho marcador de selección negativa frente a las células que lo contienen y expresan ya que estas últimas morirán por acción del agente de selección negativa mientras que las que no lo contienen sobrevivirán. Aunque prácticamente cualquier marcador de selección negativa puede ser utilizado en la construcción del vector de la invención, preferentemente se elegirán aquellos que cumplan la condición de que la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho marcador de selección negativa no sea sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno ni a ninguna otra secuencia del genoma del mamífero no humano. Ejemplos ilustrativos de marcadores de selección negativa pueden encontrarse, por ejemplo, en la patente norteamericana US 5.464.764. En una realización particular de esta invención, el vector de la invención contiene una secuencia de nucleótidos que comprende el gen de la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simplex (HSV). La síntesis de DNA puede interrumpirse en las células que contienen y expresan dicho gen tk. Estas células pueden eliminarse utilizando como agente de selección negativa el ganciclovir o cualquier otro análogo nucleotídico funcionalmente -equivalente.-^ . . . _
En una realización particular, el vector de la invención es un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa que comprende unas primera y segunda regiones de homología sustancialmente idénticas a unas primera y segunda secuencias, respectivamente, del gen Sigma-1 de ratón, una secuencia de nucleótidos que comprende el gen neo y una secuencia de nucleótidos que comprende el gen tk, tal como el vector denominado pHR53TK [véase la Figura 7], que puede ser utilizado para transformar células de ratón, por ejemplo, células embrionales ES de ratón, que contienen el gen del receptor Sigma-1 endógeno, mediante recombinación homologa y obtener células de ratón, en primer lugar con uno de los alelos mutados del gen del receptor Sigma-1 endógeno, y, en segundo lugar, mediante un segundo evento de recombinación homologa en el alelo salvaje restante del genoma, que carecen de niveles detectables de RNA mensajero o proteína para el receptor Sigma-1 endógeno. En el Ejemplo 1.2 se describe de forma detallada la construcción del vector pHR53TK.
Para la construcción del vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa proporcionado por esta invención se pueden utilizar métodos convencionales de digestión con enzimas de restricción y unión, y similares, tales como los descritos por Sambrook et al. [17].
El vector de la invención permite el empleo de la técnica de selección "positiva-negativa" para seleccionar los recombinantes homólogos, es decir, permite seleccionar las células en las que se ha introducido dicho vector ya que éstas contienen y expresan el marcador de selección positiva pero han perdido el marcador de selección negativa como resultado de la recombinación homologa entre el vector y el gen del receptor Sigma endógeno.
El vector de la invención puede ser utilizado para introducir una disrupción funcional en el gen de un receptor Sigma endógeno, por ejemplo, en el gen del receptor Sigma-1 o en el gen del receptor Sigma-2, presente en el genoma de una célula de mamífero no humano, y crear homólogos recombinantes (células hospedadoras recombinantes) que, a su vez, pueden ser utilizados para generar mamíferos no humanos mutantes, deficientes en un receptor Sigma endógeno. Para -ello,-el-Nector_de- la_ invención-.se_introduce_en_dicha-célula- por_cualquier_mé.todo_ convencional adecuado para la introducción de un DNA exógeno en una célula, por ejemplo, precipitación con fosfato calcico, transfección, microinyección, lipofección, etc., preferentemente mediante electroporación. Tras la introducción del vector de la invención en la célula hospedadora, ésta se cultiva durante un periodo de tiempo apropiado bajo condiciones que permitan la recombinación homologa entre el vector de la invención y el gen del receptor Sigma endógeno. Los recombinantes homólogos se seleccionan mediante el proceso de selección positiva-negativa y se analiza la existencia de recombinación homologa en el locus del gen del receptor Sigma endógeno por técnicas convencionales, por ejemplo, mediante un análisis Southern blot utilizando una sonda que permite diferenciar entre el alelo endógeno normal (tipo salvaje) y el alelo del recombinante homólogo. En el Ejemplo 2.1 se describe la inactivación del gen del receptor Sigma-1 de ratón mediante recombinación homologa en células embrionales ES de ratón y la obtención de ratones quiméricos (quimeras) con una mutación en el gen del receptor Sigma-1 de ratón mediante la técnica de agregación de mórulas, evaluándose la transmisión por línea germinal de dicha mutación mediante cruces de las quimeras respectivas con hembras de una cepa receptora, tal como una hembra de la cepa no consanguínea CD-1 , cuyo pelaje albino es netamente distinguible del pelaje pigmentado característico de los ratones híbridos Fi generados a partir de cruces entre las cepas 129X1/SvJ y 129S1/Sv del cual derivan las células ES R1 utilizadas en el proceso de recombinación homologa.
Los recombinantes homólogos (células hospedadoras recombinantes), que contienen un alelo del gen del receptor Sigma mutado, pueden utilizarse para generar los mamíferos no humanos mutantes de la invención. Para ello, dichas células hospedadoras recombinantes que contienen una disrupción en el gen del receptor Sigma endógeno se introducen en embriones por métodos convencionales, por ejemplo, mediante agregación de las células recombinantes con embriones en fase de 8 células (mórulas), los cuales son posteriormente implantados en mamíferos hembras receptoras pseudogestantes y se deja que los embriones se desarrollen a término. Los animales resultantes son unas quimeras sobre las que se -analiza la transmisibilidad.de la-mutación. porNia-germinal. Las quimeras capaces.de. transmitir eficazmente el genotipo de las células hospedadoras a su descendencia a través de la línea germinal se cruzan con mamíferos no humanos tipo salvaje para obtener mutantes heterocigotos para la disrupción del gen Sigma endógeno en células somáticas y germinales. Posteriormente, los mutantes heterocigotos se cruzan entre sí para obtener mutantes homocigotos. El Ejemplo 2.2 describe la obtención de ratones mutantes (heterocigotos y homcigotos) para el gen del receptor Sigma-1 endógeno verificándose que eran deficientes en dicho gen tal como se describe en el Ejemplo 2.3 mediante los correspondientes análisis estructurales, de expresión y función, en los ratones mutantes homocigotos.
La descendencia de un mamífero no humano mutante de la invención, que constituye un aspecto adicional de esta invención, puede obtenerse mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de cruzamiento clásico entre mamíferos no humanos mutantes de la invención (progenitores) o bien, alternativamente, mediante fertilización in vitro de huevos y/o esperma de los mamíferos no humanos mutantes de la invención o mediante clonación, por transferencia nuclear y reconstrucción posterior de óvulos enucleados con núcleos de células mutantes o portadoras de la mutación de tipo embrional o somático. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "descendencia" y "descendencia de un mamífero no humano mutante de la invención" se refiere a todos y cada uno de los descendientes de cada generación posterior a la de los mamíferos no humanos originalmente transformados.
Los mamíferos no humanos mutantes de la invención pueden ser utilizados como animales control para la realización de ensayos in vivo (véase más adelante). Asimismo, los mamíferos no humanos mutantes de la invención pueden ser utilizados como fuente de células somáticas, fetales o embrionales, las cuales, una vez aisladas y cultivadas pueden ser utilizadas en ensayos in vitro. Además, si se desea, se pueden preparar líneas celulares inmortalizadas a partir de dichas células mediante el empleo de técnicas convencionales [18-21]. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una línea celular aislada derivada del mamífero no humano mutante de la invención. En una realización particular, dicha línea celular proporcionada por.esta nvención es una línea celular murina, por ejemplo, una línea de células embrionales ES de ratón que comprende una mutación en el gen del receptor Sigma-1 de ratón en donde dicha línea celular carece de niveles detectables de receptor Sigma-1.
Los mamíferos no humanos mutantes de la invención pueden ser utilizados, además, como animales modelo para estudiar el papel desempeñado in vivo por los receptores Sigma endógenos, en particular, los receptores Sigma-1 o Sigma-2, y como animales control para la realización de ensayos in vivo.
El receptor Sigma-1 parece estar implicado en desórdenes del sistema nervioso central, tales como la ansiedad, depresión o esquizofrenia, en alteraciones de la memoria, por ejemplo, amnesia, y en condiciones de estrés y adicción a drogas. Asimismo, dicho receptor Sigma-1 parece estar implicado en procesos de analgesia y neuroprotección. Por tanto, un mamífero no humano mutante, deficiente en el receptor Sigma-1 , proporcionado por esta invención, puede resultar útil tanto para el estudio de tales situaciones así como para la validación y/o el desarrollo de fármacos diseñados para regular o paliar los efectos de las alteraciones y condiciones patológicas en las que estén implicados dichos receptores Sigma-1.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un mamífero no humano mutante de la invención, o de una línea celular proporcionada por esta invención, deficiente en el receptor Sigma-1 , para evaluar compuestos potencialmente útiles destinados a prevenir y/o tratar desórdenes del sistema nervioso central, por ejemplo, ansiedad, esquizofrenia o depresión; prevenir y/o tratar alteraciones de la memoria, por ejemplo, amnesia; prevenir y/o tratar condiciones de estrés; prevenir y/o tratar condiciones de adicción a drogas; producir analgesia; o producir neuroprotección.
Los receptores Sigma-2 parecen ser dianas para el diseño de herramientas, tanto diagnósticas como terapéuticas, para combatir el cáncer y/o procesos degenerativos y/o para el diseño de compuestos capaces de prevenir, reducir o aliviar la patología secundaria asociada a la administración de agentes neurolépticos, por ejemplo, alteraciones secundarias motoras provocadas en pacientes sometidos a tratamiento continuado con agentes neurolépticos, tales como haloperidol. Por tanto, un mamífero no humano deficiente en el receptor Sigma-2 puede resultar útil en la validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para el diagnóstico o tratamiento del cáncer, así como en la validación y/o desarrollo de fármacos para la prevención y/o el tratamiento de procesos degenerativos, o en la validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para prevenir, reducir o aliviar los efectos secundarios asociados con la administración continuada a un paciente de agentes neurolépticos, en particular, los efectos secundarios motores.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un mamífero no humano mutante de la invención, o de una línea celular proporcionada por esta invención, deficiente en el receptor Sigma-2, para la validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para el diagnóstico o tratamiento del cáncer; la prevención y/o el tratamiento de procesos degenerativos, o para prevenir, reducir o aliviar los efectos secundarios asociados con la administración de agentes neurolépticos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar el efecto de un compuesto a ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en un receptor Sigma endógeno, tal como un receptor Sigma-1 o Sigma-2, que comprende poner en contacto un mamífero no humano mutante de la invención con dicho compuesto a ensayar y detectar la presencia o ausencia de un cambio fisiológico en dicho mamífero no humano mutante en respuesta al contacto con dicho compuesto; o bien, administrar un compuesto a ensayar a dicho mamífero no humano mutante de la invención, administrar dicho compuesto a ensayar a un mamífero no humano control que expresa el receptor Sigma endógeno funcional correspondiente, por ejemplo, el receptor Sigma-1 o el receptor Sigma-2, y observar si dicho compuesto produce un efecto sobre el fenotipo en dicho mamífero no humano mutante cuando se compara con el mamífero no humano control. Cualquier efecto observable sobre el fenotipo podría estar relacionado, en principio, con la función (o disfunción) del receptor Sigma considerado.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar el efecto de un compuesto sobre células que expresan un receptor Sigma, por ejemplo, el receptor Sigma-1 o el receptor Sigma-2, y sobre células que no expresan dicho receptor Sigma, que comprende introducir un compuesto a ensayar en una población de células, o en un homogeneizado de las mismas, en donde dichas células son células aisladas o establecidas a partir de un mamífero no humano mutante de la invención, administrar dicho compuesto a ensayar a una población de células de mamífero no humano control, o a un homogeneizado de las mismas, que expresa el correspondiente receptor Sigma funcional, y observar o analizar si dicho compuesto a ensayar produce un efecto sobre la expresión de dicho receptor Sigma en las células de dicho mamífero no humano mutante de la invención cuando se compara con células de mamífero no humano control. En principio, cualquier efecto observable sobre el fenotipo podría estar relacionado con la función (o disfunción) del receptor Sigma considerado.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma. La combinación de los Ejemplos 1 y 2 describe de forma detallada un procedimiento para la generación de ratones mutantes en el gen del receptor Sigma-1 endógeno que carecen de niveles detectables del receptor Sigma-1 de ratón. En el Ejemplo 1 se describe el aislamiento y clonaje del gen del receptor Sigma-1 de ratón y la construcción de un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa, mientras que en el Ejemplo 2 se describe la transfección de células ES de ratón y la generación de ratones mutantes deficientes en el receptor Sigma-1 murino.
EJEMPLO 1
Aislamiento y clonaje del gen del receptor Sigma-1 de ratón y construcción de un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa
1.1 Aislamiento del gen del receptor Sigma-1 de ratón
A partir de las secuencias publicadas del cDNA y del gen del receptor Sigma- 1 de ratón [8] se diseñaron cuatro oligonucleótidos con el objetivo de aislar y clonar dicho gen. Las características de dichos oligonucleótidos, denominados MS1 , MS2, MS3 y MS4, se detallan en la Tabla I. Las posiciones relativas de estos oligonucleótidos, respecto a las secuencias publicadas del cDNA y del gen de ratón, se representan esquematizadas en la Figura 1. Tabla I Oligonucleótidos utilizados para clonar el gen del receptor Sigma-1 de ratón
Figure imgf000026_0001
Con dichos oligonucleótidos se obtuvieron fragmentos específicos de DNA del tamaño esperado a partir de DNA genómico y RNA total de ratón de las cepas NMRI y BALB/C, utilizando protocolos de PCR y RT/PCR habituales [9]. Se utilizaron inicialmente las parejas de oligonucleótidos MS1/MS3 y MS2/MS4 que produjeron, mediante PCR sobre DNA genómico, fragmentos de 1160 y 2246 pares de bases (pb), respectivamente. Además, a partir de RNA total, mediante RT-PCR se clonó el cDNA correspondiente al fragmento de 1020 pb a partir del par de oligonucleótidos MS2/MS4. Los fragmentos de DNA obtenidos fueron subclonados en el vector plasmídico Bluescript KS+ (Stratagene), usando métodos habituales [9]. En la Figura 1 se describen los plásmidos obtenidos con secuencias del cDNA y del gen. En particular se describe el plásmido pmcS1/N, que corresponde al fragmento cDNA de 1020 pb, obtenido a partir de los oligonucleótidos MS2/MS4, que posteriormente fue usado para la obtención de clones genómicos del gen del receptor Sigma-1 de ratón.
La clonación, por PCR y por RT/PCR, de los diferentes fragmentos genómicos y de cDNA correspondientes al gen del receptor Sigma-1 de ratón proporcionó sondas genéticas específicas para ser utilizadas en el aislamiento de clones genómicos intactos de una genoteca de ratón. Dado que el objetivo último reside en la obtención de un ratón mutante para este gen se debe procurar obtener clones secuencias isogénicas (esto es, de la misma cepa de ratón) con objeto de optimizar el proceso de recombinación homologa en las células embrionales pluripotentes ES [10]. Las células ES de ratón que se utilizaron, células ES R1 [11], provienen de un híbrido F1 de dos sub-cepas de ratón 129/Sv [129X1/SvJ x 129S1/SvJ]. Por ello, se decidió abordar el aislamiento de clones genómicos a partir de una genoteca comercial preparada a partir de DNA de ratones 129/Sv (Stratagene, Cat. Nr. #946313). Se analizaron 1 x 106 clones recombinantes de la genoteca distribuidos en 6 placas grandes (Nunc, 243 mm x 243 mm, 530 cm2) a razón de 170.000 fagos por placa, aproximadamente. Se procedió a obtener dos réplicas consecutivas de cada placa en membrana de Nylon (Hybond-N, Amersham). Estas membranas fueron hibridadas con la sonda específica correspondiente al inserto del plásmido pmcS1/N, siguiendo protocolos habituales
[9].
Inicialmente se identificaron nueve señales específicas (en ambos duplicados de las réplicas) y se procedió a purificar los bacteriófagos presentes en las placas que habían dado señal positiva, siguiendo protocolos habituales [9]. La utilización de los oligonucleótidos mencionados (MS1 , MS2, MS3 y MS4) y el análisis mediante Southern blot permitió comprobar que cuatro de estos clones seleccionados (λSgl , λSg2, λSgδ, λSgδ) contenían la totalidad del gen del receptor Sigma-1 de ratón. En la Figura 2 se presenta el mapa de las secuencias colindantes al gen del receptor Sigma-1 de ratón obtenido a partir del solapamiento de los mapas de los cuatro clones de bacteriófagos mencionados. Se constató la obtención novedosa del mapa estructural de unas 30 kilobases (kb) circundantes al gen, lo cual excedía de la información publicada y depositada en las bases de datos (inferior a 7 kb, centradas alrededor del gen) [6]. Estas secuencias se subclonaron en plásmidos para poder ser utilizadas en la construcción del vector de la recombinación homologa con selección positiva-negativa. En la Figura 3 se representan los diferentes clones originales obtenidos con secuencias genómicas correspondientes a secuencias situadas en la región 5' y 3' del gen.
1.2 Construcción del vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa (pHR53TK) para la inactivación por mutación del gen del receptor Sigma-1 en células ES de ratón Para la construcción del vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa denominado pHR53TK se utilizó, como plásmido de soporte e inicio de los sucesivos clonajes, el vector pHM2 [12] (8451 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: X76682), el cual ya había sido utilizado con éxito en la preparación de vectores de recombinación homologa que habían conducido a la inactivación efectiva de otros genes del ratón, véase, por ejemplo [13].
A partir del plásmido pmgS1 Eag6.7 (véase la Figura 3) se obtuvo, mediante digestión con el enzima de restricción Bgl II, un fragmento de 3,1 kb portador de la secuencia de homología 3' del gen del receptor Sigma-1 de ratón. Este fragmento Bgl II de 3,1 kb se insertó en el plásmido pHM2, previamente digerido con el mismo enzima, cuyo único sitio de corte para Bgl II se sitúa en la posición 8171 , generándose el plásmido intermedio pHR3A, con un tamaño de 11 ,6 kb. Seguidamente, sobre el plásmido pHR3A se insertó, en el sitio único de corte para el enzima de restricción Pml I (posición 2259 relativa al plásmido pHM2), la secuencia de homología 5' del gen del receptor Sigma-1 de ratón, obtenida como un fragmento de 6,8 kb mediante digestión con los enzimas Sal I y Sac II a partir del DNA del bacteriófago λSgδ (Figura 2). La posterior fusión, previa conversión a extremos romos de las secuencias de DNA, del sitio Sac II (de la secuencia del gen del receptor Sigma-1 de ratón, posición 3356 de la secuencia AF030199) y Pml I (del vector pHR3A) permitió obtener la fusión transcripcional entre los primeros cuatro aminoácidos del gen del receptor Sigma-1 con el resto de aminoácidos del gen indicador lacZ, presente en el vector original pHM2 [12]. La adición de la secuencia de homología 5' del gen del receptor Sigma-1 permitió obtener el plásmido intermedio pHR53, el cual delimitaba exactamente los nucleótidos a suprimir (deleccionar) del gen entre las posiciones 3356 (Sac II) y 5263 (Bgl II), relativas a la secuencia original del gen depositada en GenBank AF030199. En efecto, esto producía la eliminación de 1907 nucleótidos, los cuales incluyen la práctica totalidad de secuencias codificantes para el gen del receptor Sigma-1 de ratón, con la excepción de los primeros cuatro aminoácidos. En la Figura 4 se representan gráficamente los límites precisos de la secuencia cuya eliminación estaba prevista realizar a través de recombinación homologa en células ES de ratón (Ejemplo 1.3). En la Figura 5 se puede observar la posición relativa de las secuencias de homología 5' y 3', de 6,8 y 3,1 kb de tamaño y presentes en el vector pHR53, respecto al solapamiento de 30 kb previamente descrito. Estas secuencias de homología 5' y 3' a su vez delimitan la zona del gen del receptor Sigma-1 a eliminar, de un tamaño de 1 ,9 kb.
Con objeto de verificar la presencia y fusión exacta de los fragmentos de DNA utilizados para la construcción del vector pHR53 se procedió a secuenciar los extremos de los mismos. En particular, se verificó la fusión transcripcional entre los primeros nucleótidos codificantes del gen del receptor Sigma-1 de ratón con la secuencia codificante para el gen indicador lacZ, tal y como se presenta en la Figura 6.
Finalmente, con objeto de obtener un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa sobre el que poder aplicar los procedimientos de selección positiva (gen de resistencia a neomicina, presente en el plásmido pHM2) combinados con los de selección negativa [14] (gen de resistencia a ganciclovir, timidina quinasa del virus del herpes simplex, HSV-TK, ausente en el plásmido pHM2 pero presente en el plásmido pPNT [15]) se procedió a clonar el cassette de expresión con el gen HSV-TK en el sitio de restricción Not I del plásmido pHR53 a través de una construcción intermedia en la que se obtuvo el gen HSV-TK en el vector pSX [12], generándose finalmente sobre éste último plásmido el vector pHR53TK de 20,8 kb de tamaño, cuyo mapa se muestra en la Figura 7. El plásmido pHR53TK ha sido depositado en la CECT con fecha 4 de octubre de 2002 y le ha correspondido el número de acceso CECT 5737.
EJEMPLO 2 Generación de ratones mutantes deficientes en el gen del receptor Sigma-1 endógeno
2.1 Inactivación del gen del receptor Sigma-1 mediante recombinación homologa en células ES de ratón y obtención de ratones quiméricos con dicha mutación Una vez construido el vector pHR53TK se linearizó mediante digestión con el enzima de restricción Sal I (Figura 7). A continuación, 20 μg del vector pHR53TK linearizado se utilizaron para transfectar 9,6 x 106 células ES R1 [11] mediante electroporación (condiciones de electroporación: 500 μF, 250 V). A las 24 horas se inició el proceso de selección positiva mediante la adición de 300 μg/ml del antibiótico G418. A las 48 horas se adicionó la droga ganciclovir, para el proceso de selección negativa, hasta alcanzar una concentración final de 2 μM. Ocho días más tarde se procedió a identificar clones recombinantes independientes (resistentes a G418 y ganciclovir) que fueron subcultivados por separado. Todo el proceso se realizó en presencia de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) resistentes a G418 y del factor de crecimiento L.I.F. (leucemia inhibitory factor o factor de inhibición de la leucemia) para inhibir la diferenciación espontánea de las células ES pluripotentes. En todo momento se siguieron protocolos descritos en la literatura para el cultivo, transfección y manipulación de células ES de ratón [10] (información relativa al proceso de selección positiva-negativa se puede obtenerse, por ejemplo, en las patentes norteamericanas US 5.464.764, US 5.487.992, US 5.627.059 y US 5.631.153).
Se analizaron un total de 272 clones recombinantes de células ES de ratón mediante el procedimiento de Southern blot, descrito en la literatura [9]. Para ello se diseñaron dos sondas, una sonda 5' y otra sonda 3', alejadas de las zonas de homología del gen del receptor Sigma-1 de ratón incluidas en el vector pHR53TK con el objetivo de identificar dos polimorfismos en el tamaño de fragmentos de restricción. Así pues, mediante digestión con el enzima de restricción Hinά III y utilizando la sonda 5' se podía distinguir el alelo salvaje (10,7 kb) del alelo mutante (19 kb) del gen del receptor Sigma-1 de ratón. De igual manera, mediante digestión con el enzima de restricción EcoR I y utilizando la sonda 3' se podía distinguir el alelo salvaje (13,7 kb) del alelo mutante (11 ,9 kb) del gen del receptor Sigma-1 de ratón. En la Figura 8 se indica el diseño experimental utilizado para diferenciar el alelo mutante del alelo salvaje del gen del receptor Sigma-1 de ratón.
De los 272 clones de células ES independientes analizados 12 (es decir, un 4,4%) presentaron los polimorfismos esperados utilizando la sonda 5' y la sonda 3' (Figura 8). En la Figura 9 se muestra el resultado de los análisis mediante Southern blot del DNA genómico correspondiente a estos 12 clones de células ES.
Seguidamente se seleccionaron 4 clones recombinantes positivos de células ES independientes con el objeto de proceder a la generación de los ratones quiméricos (quimeras) correspondientes, mediante la técnica de agregación de mórulas, utilizando procedimientos descritos en la literatura [10], [11]. Las condiciones experimentales para la agregación de las células ES recombinantes (en número promedio de 10) con embriones en fase de 8-células (mórulas) de la cepa de ratón CD-1 comprendían el empleo de un 4% de medio condicionado de células ES en el proceso de agregación.
Usando estas condiciones se identificaron 11 quimeras supervivientes, obtenidas a partir de 19 quimeras inicialmente identificadas a término entre los 40 fetos que lograron progresar en su gestación a partir de 382 embriones agregados y transferidos. En la Tabla II aparece, de forma resumida el proceso de agregación utilizado.
Tabla II
Agregación de mórulas (embriones de ratón de 8 células de la cepa CD-1) con los clones de células ES recombinantes positivos
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Las once quimeras supervivientes obtenidas correspondían a dos clones de células ES independientes, el clon #8 y el clon #175, siguiendo las recomendaciones incluidas en los protocolos habituales de generación de quimeras, que exigen la obtención de la mutación por lo menos a partir de dos clones independientes para evitar problemas inherentes a un determinado clon que pudieran generar un fenotipo anómalo del ratón mutante [10].
Seguidamente se evaluó la transmisión por línea germinal de la mutación mediante cruces de las quimeras respectivas con hembras de la cepa receptora CD- 1 , cuyo pelaje albino es netamente distinguible del pelaje pigmentado característico de las cepas 129Sv de las que derivan las células ES R1 utilizadas en el proceso de recombinación homologa [11].
En la Tabla III se describen los resultados de los análisis de transmisión del fenotipo pigmentado (asociado al genotipo presente en las células ES) realizados sobre las 11 quimeras identificadas.
Tabla III
Quimeras obtenidas para la mutación en el gen del receptor Sigma-1. Análisis de la transmisión por vía germinal del genotipo presente en las células ES mediante cruces con hembras de ratón albinas CD-1
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(*) Sin tapones vaginales (estéril)
(**) Tapones vaginales no productivos (estéril)
Los análisis de transmisibilidad demostraron que cuatro quimeras independientes (1 derivada del clon #175 y 3 derivadas del clon #8) fueron capaces de transmitir eficazmente (al 100 %) el genotipo de las células ES a su descendencia, a través de la línea germinal. Estos animales F1 fueron utilizados para analizar la presencia del alelo mutante y, mediante cruces sucesivos, generar el correspondiente ratón mutante.
2.2 Obtención de ratones mutantes para el gen del receptor Sigma-1
Una vez verificada la transmisión a línea germinal en cuatro de las once quimeras obtenidas (con individuos representantes de los dos clones ES recombinantes utilizados) por la presencia de pigmentación en las crías F1 obtenidas a partir de los cruces con ratones albinos CD-1 se verificó la presencia de alelos mutados del gen del receptor Sigma-1. La detección de pigmentación no garantiza la presencia del alelo mutado puesto que solamente un 50% heredará el alelo portador de la mutación, el 50% restante heredará el alelo salvaje, intacto, de las células ES originales. Por ello, y para la posterior identificación de individuos homocigotos mutantes y salvajes, se diseñaron dos tests analíticos mediante la técnica de PCR (PCR-Sigma y PCR-Neo, Figura 10), usando métodos habituales [9] que permitían identificar inequívocamente los tres genotipos, concretamente: homocigotos salvajes, heterocigotos (portadores de la mutación) y homocigotos mutantes (Véase la Tabla IV).
Tabla IV Obtención de genotipo mediante PCR
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La PCR-Sigma utiliza los oligonucleótidos MS1 y MS3 [Tabla I] que solamente pueden amplificar un fragmento de DNA específico de 1 ,16 kb cuando alguno de los dos alelos del gen del receptor Sigma-1 está intacto. De forma similar, la PCR-Neo emplea dos oligonucleótidos específicos e internos al gen que confiere resistencia a la neomicina (gen neo) [Neo 1 (SEQ. ID. NO: 5) y Neo 2 (SEQ. ID. NO: 6)], que amplifican una fragmento de DNA específico de 0,7 kb solamente si alguno de los dos alelos transporta la mutación inicialmente detectada en las células ES.
En la Tabla V se detalla la identificación de individuos heterocigotos entre los individuos obtenidos en la F1 resultante de cruces entre quimeras transmisoras y hembras CD-1. Solamente los individuos pigmentados fueron analizados mediante la PCR-Neo. La detección de la banda analítica de 0,7 kb indica que ese individuo es portador de la mutación en uno de los alelos del gen del receptor Sigma-1. Aproximadamente la mitad de los individuos pigmentados, en cada uno de los dos clones, corresponden a ratones chinchilla. La otra mitad son ratones agouti, el pelaje salvaje. De igual manera, un poco menos de la mitad de los individuos F1 pigmentados resultaron ser, en cada uno de los dos clones analizados, heterocigotos y por lo tanto portadores de la mutación.
Tabla V Detección de individuos heterocigotos en los cruces entre quimeras y hembras CD-1
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Una vez identificados suficientes individuos heterocigotos (de los dos sexos) de cada uno de los dos clones ES utilizados, se establecieron cruces entre estos individuos heterocigotos con el objetivo, según las leyes de la Genética Clásica (Mendel), de lograr detectar individuos mutantes (homocigotos para el alelo mutante) en la segunda generación (F2) resultante.
La obtención del genotipo de los animales F2 generados se basó en los dos tests analíticos por PCR (PCR-Sigma y PCR-Neo) anteriormente descritos (véase la Tabla IV). El resultado de estos cruces y los números totales de cada uno de los tres genotipos obtenidos en los individuos de la segunda generación se detallan en la Tabla VI.
Tabla VI Detección de individuos homocigotos en los cruces entre animales F1
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Según las leyes de Mendel el resultado del cruce entre dos individuos heterocigotos, con dos alelos distintos para un mismo locus, se distribuye como sigue: 25% de individuos salvajes (+/+), 50% de individuos heterocigotos (+/-) y 25% de homocigotos mutantes (-/-). En la Tabla Vil se comparan los resultados obtenidos en la F2 (Tabla VI) frente a los esperados, según las leyes de Mendel.
Tabla Vil Comparación entre resultados obtenidos y esperados en los individuos F2
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El análisis estadístico de estos datos da como resultado, en ambos casos, un valor χ2 calculado inferior al tabulado para p=0,05 y (3-1 = 2) 2 grados de libertad (χ2 = 5,991) [Clon ES #175 χ2 = 3,785; Clon ES #8 χ2 = 0,125] por lo que se puede concluir, que la distribución de genotipos se ajusta a la prevista según Mendel (p=0,05). No es pues estadísticamente significativa la ligera disminución de mutantes identificados respecto a los valores teóricamente esperados.
Como conclusión adicional a este primer análisis se puede añadir que se obtienen, por igual, machos y hembras homocigotos mutantes. La distribución por sexos entre los homocigotos mutantes identificados se ajusta a lo esperable (50% de cada sexo), no observándose, por el momento desviaciones estadísticamente significativas. En el caso del clon ES #175 de los 28 mutantes detectados 13 son machos, mientras que en el caso del clon ES #8 de los 11 mutantes detectados 4 son machos. Ambos valores se acercan a la normalidad y siguen la distribución esperada (p=0,05, grados de libertad=1 , χ2 calculado=3,841) [Clon ES #175 χ2 = 0,143; Clon ES #8 χ2= 0,818].
Adicionalmente se ha observado que tanto las hembras como los machos homocigotos mutantes son fértiles, por lo que han podido obtenerse colonias de esta mutación estables. No se ha detectado manifestación externa ni obervable que, aparentemente, distinga a los ratones mutantes de los ratones salvajes. No obstante, los ratones están siendo analizados pormenorizadamente para evaluar el efecto de la mutación en el gen del receptor Sigma-1 mediante paradigmas encaminados a dilucidar su participación en procesos de analgesia, adicción, depresión, psicosis y esquizofrenia usando métodos habituales en esta área de conocimiento [16].
La mutación se ha obtenido y analizado en dos fondos genéticos mixtos distintos (129Sv x CD-1 y 129Sv x C57BL/6J).
2.3 Análisis estructurales, de expresión y función, en ratones mutantes para el gen del receptor Sigma-1
Una vez generados los ratones mutantes para el gen del receptor Sigma-1 de ratón se verificó la ausencia del gen (DNA), de expresión del mismo (RNA mensajero), de proteina y de actividad (función) para verificar que, en efecto, los ratones mutantes eran deficientes en el gen del receptor Sigma-1.
En primer lugar se analizó la presencia de los polimorfismos asociados a las sondas 5' y 3' que permiten detectar los alelos mutantes y salvajes de forma inequívoca. Para ello se analizó DNA genómico de ratones salvajes, heterocigotos y mutantes para el gen del receptor Sigma-1. El resultado del análisis por Southern blot se incluye en la Figura 11. Los resultados obtenidos permiten concluir, inequívocamente, la presencia del alelo mutante según el diseño experimental previsto.
En segundo lugar se evaluó la expresión del gen del receptor Sigma-1 en diferentes órganos de ratones mutantes, heterocigotos y salvajes en los cuales el gen habitualmente está presente [5]. Para estos análisis de expresión se utilizó la técnica de Northern blot, siguiendo protocolos descritos en el área [9]. A continuación, en la Figura 12, se observa la ausencia de señal en aquellos carriles del gel que corresponden a RNA totales de animales homocigotos mutantes, y por lo tanto carentes del gen del receptor Sigma-1. En conclusión, no solamente no está el gen del receptor Sigma-1 sino que además es imposible encontrar RNA mensajeros (transcritos) que permitan documentar su expresión. En efecto, el ratón mutante no expresa el gen del receptor Sigma-1.
En tercer lugar se evaluó la expresión del gen del receptor Sigma-1 en cerebro de ratones mutantes, heterocigotos y salvajes mediante la localización de la proteína correspondiente en extractos proteicos por un anticuerpo policlonal específico. Para ello, se utilizó la técnica de ltVesíe blot. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 13, donde no se observan niveles detectables de proteína (receptor Sigma-1 ) en los extractos proteicos de cerebro procedentes de ratones mutantes homocigotos para el gen Sigma-1.
En cuarto lugar se evaluó la actividad (función) del receptor Sigma-1 de ratón mediante un ensayo de unión específica al ligando [3H]-pentazocina. Brevemente, cerebros de ratones mutantes (-/-), heterocigotos (+/-) y salvajes (+/+) fueron homogeneizados y los homogeneizados se centrifugaron varias veces en distintas condiciones de velocidad para obtener la fracción membranaria. Posteriormente, se procedió a la incubación de muestras de la fracción membranaria obtenidas con el radioligando [3H]-pentazocina en condiciones de unión óptima para este receptor (37°C, durante 130-170 minutos), filtración de las muestras, lavado de las muestras y lectura del contaje de radiactividad presente en el filtrado [22]. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 14 y ponen de manifiesto la ausencia de actividad (función) en los ratones mutantes homocigotos.
En quinto lugar se evaluó la función del receptor Sigma-1 frente a paradigmas y protocolos de conducta y comportamiento conocidos. En este sentido no se han detectado diferencias estadísticamente significativas en el comportamiento de los ratones mutantes frente a los salvajes en la siguiente lista de tests o paradigmas analizados. Solamente se han observado diferencias estadísticamente significativas frente a ratones salvajes en la respuesta de hiperactividad (hipermotilidad) inducida por el ligando SKF-10047 (datos no mostrados).
DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Un cultivo de Escherichia coli Top10F', denominado pHR53TK conteniendo el vector plasmídico pHR53TK ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo, CECT, Burjasot, Valencia (España), el 4 de octubre de 2002, correspondiéndole el número de acceso CECT 5737.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, cuyo genoma contiene una mutación que comprende una disrupción en un gen de un receptor Sigma endógeno, en donde dicha disrupción génica da lugar a un mamífero no humano mutante que carece de niveles detectables de receptor Sigma endógeno.
2. Mamífero no humano mutante según la reivindicación 1 , en el que dicho mamífero no humano mutante es un mutante heterocigoto para dicha mutación.
3. Mamífero no humano mutante según la reivindicación 1 , en el que dicho mamífero no humano mutante es un mutante homocigoto para dicha mutación.
4. Mamífero no humano mutante según la reivindicación 1 , en el que dicho mamífero no humano es un ratón.
5. Mamífero no humano mutante según la reivindicación 1 , en el que el genoma del mamífero no humano mutante comprende un transgén dentro de la mutación introducida en el gen del receptor Sigma-1 endógeno que comprende un gen que codifica para un marcador de selección positiva.
6. Mamífero no humano mutante según la reivindicación 5, en el que dicho transgén comprende el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo).
7. Mamífero no humano mutante según la reivindicación 1 , en el que dicho receptor Sigma se selecciona entre un receptor Sigma de tipo 1 (Sigma-1) y un receptor Sigma de tipo 2 (Sigma-2)
8. Mamífero no humano mutante según la reivindicación 1 , en el que dicho mamífero no humano mutante es un ratón mutante, deficiente en el receptor Sigma- 1 endógeno, homocigoto para el gen del receptor Sigma-1 de ratón, fértil, cuyo genoma contiene una disrupción en dicho gen que comprende el gen neo.
9. Un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa, que comprende:
a) una primera región de homología, situada en el extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha primera región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una primera secuencia de un gen de un receptor Sigma;
b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva;
c) una segunda región de homología, situada en el extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha segunda región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una segunda secuencia de dicho gen del receptor Sigma, estando dicha segunda secuencia del gen del receptor Sigma en una posición 3' respecto a dicha primera secuencia del gen del receptor Sigma en un gen Sigma endógeno tipo salvaje; y
d) una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección negativa.
10. Vector según la reivindicación 9, en el que dicho gen del receptor Sigma se selecciona entre el gen del receptor Sigma de tipo 1 (Sigma-1) y el gen del receptor Sigma de tipo 2 (Sigma-2).
11. Vector según la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva comprende el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo).
12. Vector según la reivindicación 9, en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección negativa comprende el gen de la timidina quinasa (tk) del herpes simples (HSV).
13. Vector según la reivindicación 9, identificado como pHR53TK, depositado en la CECT con el número de acceso n° CECT 5737.
14. Una célula hospedadora cuyo genoma contiene un gen de un receptor Sigma endógeno transfectada con un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, deficiente en un receptor Sigma endógeno.
15. Célula según la reivindicación 14, en la que dicha célula hospedadora cuyo genoma contiene un gen de un receptor Sigma endógeno se selecciona entre una célula diferenciada que normalmente expresa el producto del gen del receptor Sigma y una célula embrional pluripotente.
16. Célula según la reivindicación 14, que comprende un alelo del gen del receptor Sigma-1 mutado.
17. Una célula aislada a partir de un mamífero no humano muíante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o de su descendencia.
18. Célula según la reivindicación 17, que comprende uno o los dos alelos del gen del receptor Sigma mutados.
19. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, propagada y, opcionalmente, inmortalizada.
20. La descendencia de un mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
21. Un procedimiento para la obtención de un mamífero no humano mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la introducción de una disrupción funcional en un gen de un receptor Sigma endógeno presente en el genoma de una célula, por recombinación homologa en dicha célula entre un alelo de un gen de un receptor Sigma endógeno y un vector de recombinación homologa con selección positiva-negativa según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, la selección de los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección positiva-negativa, la introducción de dichos homólogos recombinantes en embriones, su implantación en mamíferos hembra receptoras pseudogestantes y su desarrollo a término, la selección de las quimeras capaces de transmitir eficazmente el genotipo de los homólogos recombinantes a su descendencia a través de la línea germinal; el cruzamiento de dichas quimeras con mamíferos no humanos tipo salvaje para obtener mutantes heterocigotos para la disrupción del gen del receptor Sigma endógeno y, si se desea, el cruzamiento de dichos mutantes heterocigotos entre sí para obtener mutantes homocigotos.
22. Empleo de un mamífero no humano mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, como animales control para la realización de ensayos in vivo.
23. Empleo de un mamífero no humano deficiente en el receptor Sigma-1 , o de una línea celular deficiente en el receptor Sigma-1 , para evaluar compuestos potencialmente útiles destinados a prevenir y/o tratar desórdenes del sistema nervioso central; prevenir y/o tratar alteraciones de la memoria; prevenir y/o tratar condiciones de estrés; prevenir y/o tratar condiciones de adicción a drogas; producir analgesia; o producir neuroprotección.
24. Empleo de un mamífero no humano deficiente en el receptor Sigma-2, o de una línea celular deficiente en el receptor Sigma-2, para la validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para el diagnóstico o tratamiento del cáncer; la prevención y/o el tratamiento de procesos degenerativos, o para prevenir, reducir o aliviar los efectos secundarios asociados con la administración de agentes neurolépticos.
25. Un método para determinar el efecto de un compuesto a ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en un receptor Sigma endógeno, que comprende poner en contacto un mamífero no humano mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con dicho compuesto a ensayar y detectar la presencia o ausencia de un cambio fisiológico en dicho mamífero no humano mutante en respuesta al contacto con dicho compuesto.
26. Un método para determinar el efecto de un compuesto a ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en un receptor Sigma endógeno, que comprende administrar dicho compuesto a ensayar a un mamífero no humano mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; administrar dicho compuesto a ensayar a un mamífero no humano control que expresa un receptor Sigma endógeno funcional; y observar si dicho compuesto produce un efecto sobre el fenotipo en dicho mamífero no humano mutante cuando se compara con el mamífero no humano control.
27. Un método para determinar el efecto de un compuesto sobre células que expresan un receptor Sigma y sobre células que no expresan dicho receptor Sigma, que comprende introducir un compuesto a ensayar en una población de células, o en un homogeneizado de las mismas, en donde dichas células son células aisladas o establecidas a partir de un mamífero no humano mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, administrar dicho compuesto a ensayar a una población de células de mamífero no humano control, o a un homogeneizado de las mismas, que expresa un receptor Sigma funcional, y observar o analizar si dicho compuesto a ensayar produce un efecto sobre la expresión de dicho receptor Sigma en las células de dicho mamífero no humano mutante cuando se compara con células de mamífero no humano control.
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