[go: up one dir, main page]

WO2004050869A1 - Akt2に結合する蛋白質 - Google Patents

Akt2に結合する蛋白質 Download PDF

Info

Publication number
WO2004050869A1
WO2004050869A1 PCT/JP2003/015546 JP0315546W WO2004050869A1 WO 2004050869 A1 WO2004050869 A1 WO 2004050869A1 JP 0315546 W JP0315546 W JP 0315546W WO 2004050869 A1 WO2004050869 A1 WO 2004050869A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
akt2
polypeptide
seq
present
akbp2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/015546
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2004050869A8 (ja
Inventor
Yuki Endo
Hideki Endoh
Yoshitaka Ueda
Miyuki Kato
Kazunori Inabe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority to JP2004570732A priority Critical patent/JP4438951B2/ja
Priority to DE60327361T priority patent/DE60327361D1/de
Priority to AU2003289186A priority patent/AU2003289186A1/en
Priority to CA002508232A priority patent/CA2508232A1/en
Priority to US10/537,767 priority patent/US7452983B2/en
Priority to AT03777257T priority patent/ATE429493T1/de
Priority to EP03777257A priority patent/EP1568768B1/en
Publication of WO2004050869A1 publication Critical patent/WO2004050869A1/ja
Publication of WO2004050869A8 publication Critical patent/WO2004050869A8/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide that binds to Akt2, a novel polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide, a transformed cell containing the vector, and the polypeptide and Akt2. And a method for screening a binding inhibitor.
  • Background technology ''
  • Insulin is secreted by S-cells (from Langerhans islets) and acts mainly on muscles, liver and fat to lower blood glucose levels by taking blood sugar into cells for storage and consumption. . Diabetes is caused by this lack of action of insulin.
  • S-cells from Langerhans islets
  • Type 2 that makes it difficult for insulin to promote glucose metabolism.
  • blood glucose levels are higher than in healthy individuals, but type 1 absolutely lacks blood insulin, whereas type 2 causes uptake or consumption of blood glucose by cells despite the presence of insulin. Unpromoted insulin resistance occurs.
  • Type 2 diabetes is a so-called lifestyle-related disease caused by overeating, lack of exercise, and stress in addition to genetic predisposition.
  • hypoglycemic drugs prescribed for patients with type 2 include sulfonylurea hypoglycemic drugs (SU drugs), which act on the ⁇ cells of the kidney to promote insulin secretion, in addition to insulin injection products, and anaerobic drugs.
  • SU drugs sulfonylurea hypoglycemic drugs
  • anaerobic drugs In addition to the biguanide hypoglycemic agent, which has the effect of increasing sugar utilization and suppressing gluconeogenesis and inhibiting intestinal absorption of sugar by the action of sugar, it also delays digestion and absorption of carbohydrates.
  • Lucosidase inhibitors are known. Although these indirectly improve insulin resistance, thiazolidine derivatives have recently been used as agents that directly improve insulin resistance. Its effects are the uptake of glucose into cells and the promotion of glucose utilization in cells. This thiazolidine derivative is a peroxisome proliferator-activated receptor gamma (perox i some pro li ferator act i vated
  • Non-Patent Document 1 thiazolidine derivatives are known not only to improve insulin resistance but also to cause edema (see Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3). Since the occurrence of edema is a serious side effect that causes cardiac hypertrophy, there is a need for a drug target molecule that is more useful than PPAR ⁇ in order to improve insulin resistance.
  • Insulin action signals are transmitted into cells via insulin receptors on the cell membrane. There are two pathways for insulin action, the first and second.
  • Akt1 ( ⁇ ) or Akt2 from activated insulin receptor via IRS-KIRS-2, PI3 kinase, and PDK1
  • Akt2 is present in the above-mentioned first pathway of the insulin signal, and is phosphorylated and activated via PDK1 upon stimulation of insulin. Activated Akt2 transmits a signal by phosphorylating a protein serving as a substrate as a kinase. It has been reported that homozygous knockout mice in which the gene encoding the Akt2 protein has been artificially deleted have reduced insulin sensitivity mainly in muscle and liver and exhibit a type 2 diabetes-like phenotype. Based on these facts, Akt2 takes up glucose into cells in response to insulin signal. It is a signal mediator that acts on recruitment, and its function inhibition is thought to cause insulin resistance by partially blocking insulin signaling (see Non-Patent Document 7).
  • Non-Patent Document 3 (Non-Patent Document 3)
  • Non-Patent Document 4 (Non-Patent Document 4)
  • Non-Patent Document 5 (Non-Patent Document 5)
  • Non-Patent Document 6 (Non-Patent Document 6)
  • Non-Patent Document 7 (Non-Patent Document 7)
  • Akt2 Akt2 is a kinase, and it is difficult to regulate its enzymatic activity in a way that enhances it with drugs. Therefore Proteins that bind to Akt2 were identified by the yeast two-hybrid system.
  • Akt2 Binding Protein 2 Akt2 Binding Protein 2
  • AKBP2 Akt2 Binding Protein 2
  • the expression level of the protein was significantly increased in muscle and fat of a mouse model of diabetes mellitus compared to normal individuals, it was found that the protein is a causative factor of diabetes mellitus.
  • AKBP2 blocks the insulin signal and induces insulin resistance, thus inhibiting the binding of AKBP2 to Akt2 Improved insulin resistance. Therefore, a screening system for an insulin resistance improving drug and / or a glucose metabolism improving drug utilizing the interaction between AKBP2 and Akt2 was constructed.
  • the present invention provides a method for screening a cell, an insulin sensitizer and / or a glucose metabolism ameliorating agent, and a method for producing a pharmaceutical composition for improving insulin resistance and / or glucose metabolism, thereby completing the present invention. That is, the present invention
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, and / or inserted.
  • [5] A cell transformed with the expression vector according to [4], [6] (1) An amino acid sequence having 90% or more homology with the polypeptide according to [1] or [2], or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 And (2) contacting a polypeptide that binds to Akt2 or a cell that expresses the polypeptide with a test substance,
  • a method for screening a substance that inhibits binding between the polypeptide and Akt2, comprising:
  • the step of measuring the binding between the polypeptide that binds to Akt2 and (2) Akt2 is the step of measuring the change in Akt2 due to the change in the binding [6] or
  • a method for producing a pharmaceutical composition for improving insulin resistance and / or improving glucose metabolism characterized by comprising:
  • sequences having homology to the polynucleotide of the present invention were listed as sequence numbers AX714043, BC042155, and BG049110 in the sequence database GenBank, but the sequences were disclosed only, The use is not described. Further, in the sequence database GenPept, 68 amino acids were deleted as the accession number AK056090 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, which is one of the polypeptides of the present invention.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence; and accession number AK019105 In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one of the peptides, a polypeptide comprising an amino acid sequence in which 228 amino acids have been deleted and 13 amino acids have been substituted is listed. . However, there is no specific information on how these polypeptides can be obtained, not to mention that these polypeptides have actually been obtained. In addition, it does not describe the specific use of the polypeptide.
  • the present inventors have found for the first time the polypeptides and polynucleotides of the present invention, and have clarified for the first time that increased expression of the protein and increased binding to Akt2 are responsible for the pathology of diabetes. Further, the screening method of the present invention utilizing the binding between the polypeptide of the present invention and Akt2 is a method first provided by the present inventors.
  • FIG. 1 shows the expression of AKBP2 in cultured cells. Lanes 1 and 3 show molecular weight markers, lane 2 shows empty vector, and lane 3 shows the case where PGDNA-AKBP2 was introduced.
  • (1) in FIG. 2 is a diagram showing a comparison of AKBP2 expression levels in fat in normal mice C57BL / 6J loaded with a normal diet or a high fat diet.
  • the vertical axis in the figure shows the relative expression level in mouse fat.
  • the white bar indicates the normal diet, and the black bar indicates the high fat diet.
  • (2) is a diagram showing a comparison of AKBP2 expression levels in muscle in normal mice G57BL / 6J loaded with a normal diet or a high fat diet.
  • the vertical axis in the figure shows the relative expression level in mouse muscle.
  • the white bar indicates the normal diet, and the black bar indicates the high fat diet.
  • (4) is a diagram showing a comparison of the AKBP2 expression level in muscle between normal mouse G57BL / 6J and diabetes model mouse KKA y / Ta.
  • the vertical axis in the figure is relative emission in mouse muscle. Indicates the current quantity.
  • the white bars indicate the results of the normal mouse G57BL / 6J, and the bars with the lines indicate the results of the diabetes model mouse KKA y / Ta.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of AKBP2 overexpression on Akt2 enzyme activity in NIH3T3 L1 adipocytes.
  • the vertical axis of the figure indicates the relative activity, in which the value of the enzyme activity in the control virus-infected cells in the no insulin stimulation state is indicated as 1.
  • the numbers on the horizontal axis of the figure indicate the insulin stimulation time (minutes).
  • polypeptide of the present invention binds to Akt2 and reduces the kinase activity of Akt2.
  • polypeptide of the present invention is not limited to polypeptides derived from humans and mice as long as it falls under any of the above (1) to (2), and may be derived from other vertebrates (e.g. (Including horses, higgins, dogs, monkeys, cats, bears, pigs, and chickens).
  • vertebrates e.g. (Including horses, higgins, dogs, monkeys, cats, bears, pigs, and chickens).
  • Akt2 preferably human Akt2, more preferably a polypeptide encoded by GenBank accession number M95936), The following method can be used to confirm whether or not it is J.
  • the cells are preferably cells that respond to insulin, and more specifically, adipocytes, hepatocytes, or skeletal muscle-derived cells.
  • the Akt2 protein and the protein binding thereto can be concentrated from the cells by immunoprecipitation using an anti-Akt2 antibody.
  • the obtained concentrated solution of Akt2 and its binding protein was separated by polyacrylamide gel electrophoresis according to a known method, and then subjected to Western blotting using an antibody.
  • an antibody against the polypeptide to be examined prepared based on the polypeptide to be examined or a partial sequence thereof, or an antibody recognizing the above tag can be used.
  • Example 6 In vitro pull-down using an extract of cells expressing the polypeptide of interest or a protein mixture prepared by transcription and translation in vitro, and Akt2 protein purified with a tag such as GST Combination of the method (Experimental Engineering, Vo M3, No. 6, p. 528, 1994, Matsuchigozo et al., 1994) with Western blotting as described above can also detect the binding between Akt2 and the polypeptide to be examined.
  • a plasmid for expressing the protein to be examined for example, Example 1
  • an in vitro translation kit eg, TNT kit (Promega)
  • the method described in Example 6 can be used to detect the binding between the polypeptide of interest and Akt2.
  • “Reducing the kinase activity of Akt2” means reducing the kinase activity of Akt2 by binding the polypeptide under study to Akt2.
  • Whether or not to “decrease kinase activity” can be confirmed by the following method. It is known that Akt2 phosphorylates serine 473 (Ser473) or threonine 308 (Thr308) in the molecule and enhances kinase activity (Biochem.
  • the phosphorylation state of Akt2 Ser473 or Thr308 can be detected by Western blotting using an antibody (eg, anti-phosphoSer antibody) that specifically reacts with these phosphorylated residues, and the presence or absence of Akt2 activity can be determined. Can be detected.
  • an antibody eg, anti-phosphoSer antibody
  • cells expressing a part or the full-length region of the polypeptide to be examined are preferable, and more specifically, cells derived from adipocytes, hepatocytes, or skeletal muscle-derived cells) Lysate, and use this as a sample to detect the phosphorylation of Akt2, that is, the presence or absence of Akt2 activity by using Western blotting or spot western blotting using an anti-phosphoSer antibody. Can be done. Preferably, it can be detected by the method of Example 7. In this detection system, the phosphorylation of Akt2 using a sample obtained from cells expressing the polypeptide of interest was compared with a sample obtained from cells not expressing the polypeptide of interest. If the decrease in Akt2 activation is observed, the polypeptide under consideration can be determined to be “reduces the Akt2 kinase activity”.
  • the Akt2 kinase was also determined by the in vitro kinase atsay method, which measures the amount of radioactive phosphate incorporated into the substrate when histone H2B or GSK-3 fusion protein is reacted with the immunoprecipitate of Akt2 as an Akt2 substrate. It is possible to confirm whether the activity is reduced. Specifically, cells expressing a part or full-length region of the polypeptide to be studied (preferably cells that respond to insulin, more specifically, fat cells, hepatocytes, or skeletal muscle-derived cells) Extract from pile
  • Akt2 protein zero can be concentrated by immunoprecipitation using an Akt2 antibody.
  • Akt2 substrate for example, GST-crosstide (GST fusion protein of GSK3-beta sequence, which is a physiological substrate of Akt) and concentrated Akt2 protein
  • GST-crosstide GST fusion protein of GSK3-beta sequence, which is a physiological substrate of Akt
  • the phosphorylation of Akt2 Kinase activity can be measured and quantified.
  • it can be measured by the method described in Example 7.
  • a decrease in substrate phosphorylation was observed when using a sample obtained from cells expressing the polypeptide of interest as compared to a sample obtained from cells not expressing the polypeptide of interest. If so, the polypeptide under consideration can be determined to "reduce the kinase activity of Akt2.”
  • the polynucleotide of the present invention may be any polynucleotide as long as it encodes the polypeptide of the present invention, that is, the polypeptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or a functionally equivalent variant thereof. May be derived from the species of Preferably, it is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, more preferably, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • polynucleotide j includes both DNA and RNA.
  • the polynucleotide of the present invention can include any mutant as long as it encodes the polypeptide of the present invention. More specifically, naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having deletions, substitutions, additions and insertions can be included.
  • the above-mentioned mutation may be caused, for example, by mutation in nature, but may also be artificially modified and produced.
  • the present invention includes all mutant genes encoding the polypeptide of the present invention, regardless of the cause and means of the mutation of the polynucleotide.
  • Examples of artificial means for producing the above-mentioned mutant include, for example, genetic engineering techniques such as base-specific substitution method (Methods in Enzymo Iogy, (1987) 154, 350, 367-382), and phosphotriesters. And a chemical synthesis method such as the phosphoramidite method (Science 150, 178J968). By combining these, it is possible to obtain a DMA with a desired base substitution. Alternatively, substitution of non-specific bases in DNA molecules can be performed by repeating the PGR method or by using manganese ions in the reaction mixture.
  • polynucleotide and the polypeptide of the present invention can be easily produced and obtained by general genetic engineering techniques based on the sequence information disclosed by the present invention.
  • Polynucleotides encoding the polypeptide of the present invention can be obtained, for example, as follows, but are not limited to this method and include known procedures, such as Holleculin Cloning, Sambrook, J et al., And Cold Spr. English Harbor Laboratory Press, 1989 ".
  • a method using PGR (2) a conventional genetic engineering method (ie, (a method of selecting a transformant containing a desired amino acid from a transformant transformed with the cDNA library), or (3) a chemical synthesis method.
  • Each manufacturing method can be carried out in the same manner as described in W001 / 34785.
  • the polynucleotide described in the present specification can be obtained by the procedure described in the above-mentioned patent document, ⁇ Embodiment of the invention '' 1)
  • the method for producing a protein gene a)
  • the first production method can be manufactured.
  • “human cells or tissues capable of producing the protein of the present invention” include, for example, fat cells. Extract mRNA from human or mouse adipocytes. Next, the mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of a random primer or an oligo dT primer to synthesize a first-strand cDNA.
  • the polynucleotide of the present invention or a part thereof can be obtained. It can. More specifically, the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the methods described in Examples 1 and 4.
  • the polypeptide of the present invention can be obtained by the procedure described in the above-mentioned Patent Document “Embodiment of the Invention” 1)
  • the method for producing a protein gene b)
  • the second production method Can be produced.
  • the method using the chemical synthesis method for example, the method described in the above-mentioned Patent Document “Embodiment of the Invention” 1)
  • the method for producing a protein gene c)
  • the third production method, and d) The method described in the fourth production method
  • a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be produced.
  • the expression level of the polynucleotide of the present invention in an individual or various tissues can be specifically detected.
  • Examples of such a detection method include a method such as RT-PCR (Reverse transcribed -Polymerase cha in react ion), Northern blotting analysis, and insitu hybridization.
  • RT-PCR Reverse transcribed -Polymerase cha in react ion
  • Northern blotting analysis and insitu hybridization.
  • the present invention also includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the transformed cell of the present invention.
  • polypeptides of the present invention obtained as described above are described in Riiflo l ecu l ar C l on ng Sambrook, J et al., Go I d Spr ng Harbor Laboratory Press, 1989 J
  • the polypeptide of the present invention can be used for expression in a test tube or in a test cell by linking to a downstream of an appropriate promoter by a known method described in US Pat.
  • a gene in a cell-free system using The polypeptide of the present invention can be expressed by transcription and translation.
  • the polypeptide of the present invention can be expressed in the cell.
  • cells having such a configuration incorporated into chromosome DNA may be obtained and used.
  • the fragment containing the isolated polynucleotide can be transformed into eukaryotic and prokaryotic host cells by reintegration into an appropriate vector plasmid.
  • the polypeptide of the present invention can be expressed in each host cell by introducing an appropriate promoter and a sequence involved in expression into these vectors.
  • the host cell is not particularly limited as long as it can detect the expression level of the polypeptide of the present invention at the messenger RNA level or at the protein level. It is more preferable to use a fat-derived cell or a muscle-derived cell rich in endogenous Akt2 as a host cell.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains a desired polynucleotide.
  • a desired polynucleotide is added to a known expression vector appropriately selected according to the host cell to be used.
  • An expression vector obtained by insertion can be mentioned.
  • the cell of the present invention can be obtained, for example, by transfection of a desired host cell with the expression vector.
  • an expression vector for a desired protein can be obtained.
  • the transformed cell of the present invention can be produced by incorporating the expression vector into 293 cells using the calcium phosphate method.
  • the desired transformed cells obtained above can be cultured according to a conventional method, and the desired protein is produced by the culture.
  • the medium used for the culture various types commonly used depending on the host cells used can be appropriately selected.
  • a medium obtained by adding G418 to a medium such as Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM) to which serum components such as fetal bovine serum (FBS) are added can be used.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • a cell expressing the polypeptide of the present invention is preferable. By culturing the cells of the present invention, the polypeptide of the present invention produced in the cells can be detected, quantified, and further purified.
  • the polypeptide of the present invention can be detected and purified by a Western blot method using an antibody that binds to the polypeptide of the present invention or an immunoprecipitation method.
  • an appropriate tag protein such as daltathione-S-transferase (GST), protein ⁇ , ⁇ -lactosidase, maltose binding protein ( ⁇ )
  • GST daltathione-S-transferase
  • ⁇ ⁇ -lactosidase
  • ⁇ maltose binding protein
  • the polypeptide of the present invention can be detected by Western blotting or immunoprecipitation using an antibody specific to the tag protein, and purified using the tag protein. More specifically, it can be purified using a tag protein as follows.
  • the polypeptide of the present invention (for example, the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4) is obtained by converting the polynucleotide of the present invention (for example, the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 or 3) to a His tag, for example.
  • a His tag for example.
  • pcDNA3.1 / V5- Both mouse and human ⁇ 2 expression plasmids prepared using His-TOPO are designed so that V5 and His tags are added to the G-terminal of ⁇ 2.
  • the AKBP2 protein can be purified from the cultured cells expressing AKBP2 shown in Example 2 or Example 5 using those His tags.
  • the AKBP2 protein fused with His tag was extracted from the lysed cell extract using the Ni 2+ -NTA- It can be bound to Agarose (Funakoshi) and isolated by centrifugation.
  • the polypeptide-expressing cells of the present invention cultured in a culture flask are removed by adding an appropriate amount of a buffer solution (for example, 1 ml), and thereafter, are removed at 15,000 per minute. Separate the supernatant by centrifugation at 5 min with rotation, add the appropriate volume (eg 50j «M) of Ni 2+ -NTA-Agarose replaced with an appropriate buffer, and mix thoroughly (eg, Rotator And stir for more than 10 minutes).
  • a culture flask for example, a petri dish having a diameter of 10 cm
  • a buffer solution for example, 1 ml
  • the supernatant is separated and removed by centrifugation (for example, at 2,000 rpm for 2 minutes), and an appropriate amount (for example, 0.5 ml) of a buffer solution having a pH of 6.8 is added thereto, followed by re-centrifugation for washing. I do. After repeating this three times, an appropriate amount (for example, 50 JLH) of 100 mM EDTA is added, and the mixture is left for 10 minutes.
  • the released polypeptide of the present invention can be purified.
  • the buffer for example buffer B may be used (8 Urea, 0.1M Na 2 HP0 4, 0.1 NaH 2 P0 4, 0.01M Tris-HCI pH8.0) a.
  • the His tag in the purified protein molecule can be removed from the molecule by using the TAGZyme System (Qiagen), for example, by designing the N-terminal to fuse the His tag.
  • the protein can be purified by a method not using a tag protein, for example, by various separation procedures utilizing the physical and chemical properties of a protein comprising the polypeptide of the present invention. Specific examples include the use of ultrafiltration, centrifugation, gel filtration, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and high-performance liquid chromatography.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method according to the amino acid sequence information shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Specifically, a peptide synthesis method by a liquid phase and a solid phase method is included. In the synthesis, the amino acids may be linked sequentially one by one, or may be linked after synthesizing a peptide fragment consisting of several amino acids.
  • the polypeptide of the present invention obtained by these means can be purified according to the various methods described above.
  • the expression level of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be examined, and the expression level (preferably in adipose tissue) can be determined. Diagnosis can be diagnosed using the increase in the expression level as an index.
  • stringent conditions means conditions under which non-specific binding does not occur, and specifically contains 0.1% sodium lauryl sulfate (SDS).
  • SSC Seline-sodumumcitrate buffer
  • the probe a DNA having at least a part or the entire sequence of the polynucleotide of the present invention (or its complementary sequence) and a chain length of at least 15 bp is used.
  • the above-mentioned probe is brought into contact with a test sample, and a conjugate of a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention (for example, mRNA or cDNA derived therefrom) and the probe is subjected to a known analysis method.
  • a conjugate of a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention for example, mRNA or cDNA derived therefrom
  • a known analysis method for example, Northern blotting
  • the above-described probe can be applied to a DNA chip to analyze the expression level. If the amount of the conjugate, that is, the amount of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention is increased as compared to a healthy person, it can be determined that the patient has diabetes.
  • a method of measuring the expression level of the polynucleotide of the present invention a method of measuring the expression level by detecting the polypeptide of the present invention is possible.
  • Such a test method includes, for example, Western blotting using an antibody that binds a test sample to the polypeptide of the present invention, preferably an antibody that specifically binds to the polypeptide of the present invention, The sedimentation method and the ELISA method can be used.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a standard amount.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide of the present invention. Useful for generating antibodies that bind to libeptide. If the amount of the polypeptide of the present invention is higher than that of a healthy person, it can be determined that the patient has diabetes.
  • a polypeptide of the present invention (2) an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and which binds to Akt2 A polypeptide (hereinafter, referred to as a homologous polypeptide), or (3) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • a polypeptide that binds to Akt2 hereinafter, referred to as a hybridizing polypeptide
  • uses the polypeptide ie, the polypeptide of the present invention, a homologous polypeptide.
  • a screening method for a substance having the following can be constructed.
  • the polypeptide of the present invention, the homologous polypeptide and the hybridized polypeptide are collectively referred to as the screening polypeptide of the present invention.
  • the homologous polypeptide in the present specification is an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and is a polypeptide that binds to Akt2
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 is preferably at least 95%, more preferably at least 98 ⁇ 1 ⁇ 2, from an amino acid sequence having homology. Are preferred.
  • the polynucleotide encoding the hybridizing polypeptide of the present invention hybridizes with the polynucleotide having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, ⁇ Stringent conditions '' for peptides include ⁇ 5xSSPE, 5 ⁇ Denhard's solution, 0.5% SDS, 40% formamide, 200 g / ml salmon sperm DNA, 37 ° C for hybridization. More severe conditions are 5xSSPE, 5xDenhard's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 / g / ml salmon sperm DNA, and 42 ° C overnight J.
  • the conditions for cleaning are ⁇ 5xSSG, 1% SDS, 42 ° C '' as loose conditions, and ⁇ 0.5xSSG, 0.1% SDS, 42 ° C '' in general. xSSG, 0.1% SDS, 65 ° C '' You.
  • the screening method of the present invention includes a step of contacting a test substance with a polypeptide for screening of the present invention or a cell expressing the polypeptide of the present invention, the binding between the polypeptide and Akt2. And a method of screening for a substance that inhibits the binding between the polypeptide and Akt2, the method including a step of measuring the following: and a step of selecting a substance that inhibits the binding.
  • Cells expressing the screening polypeptide of the present invention include cells transformed with an expression vector containing a polynucleotide encoding the screening polypeptide of the present invention, and a naturally occurring polypeptide of the present invention. Any cells expressing the peptide may be used, but transformed cells are preferable.
  • Akt2 Akt2 activity is reduced in adipocytes overexpressing mouse AKBP2. Therefore, it was found that the polypeptide of the present invention negatively controls insulin signal through binding to Akt2. Therefore, a screening agent for a rinsulin resistance improving agent or a glucose metabolism improving agent can be screened by the above-described screening method.
  • Akt2 is expressed by the screening polypeptide of the present invention or a cell expressing the screening polypeptide of the present invention.
  • the step of measuring the binding can be carried out by directly detecting the binding between the screening polypeptide of the present invention and Akt2, or by measuring the change in Akt2 due to the change in the binding.
  • test substance used in the screening method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include commercially available compounds (including peptides) and various known compounds (peptides) registered in a chemical file. , Combinatorial '' Chemistry I Technology (NK Terrett, M. Gardner, DW Gordon, RJ Koby leck i,
  • the screening method is not limited, but specific examples include the following screening methods.
  • Akt2 phosphorylates serine 473 (Ser473) or threonine 308 (Thr308) in the molecule and enhances kinase activity (BioGhem.
  • the phosphorylation state of Akt2 Ser473 or Thr308 can be detected by Western blot using an antibody that specifically reacts to these phosphorylated residues (for example, anti-phosphoSer antibody, etc.) to determine the presence or absence of Akt2 activity. Can be detected.
  • test substance expressing a part or full-length region of the screening polypeptide of the present invention is untreated or treated.
  • the test cells are preferably cells that respond to insulin, and more specifically, adipocytes, hepatocytes, or skeletal muscle-derived cells.
  • Akt2 phosphorylation that is, the presence or absence of Akt2 activity by lysing cells that have not been treated or treated with a test substance and using this as a sample by Western blotting or spot western blotting using an anti-phosphoSer antibody Can be detected.
  • it can be detected by the method of Example 7.
  • a substance treated in a sample in which the phosphorylation of Akt2 i.e., activation of Akt2
  • a substance having an ED50 of Akt2 enhancing phosphorylation in the screening method of not more than 1, preferably not more than 1, more preferably not more than 0.1 juM is preferably selected. ,.
  • Akt2 activity can also be measured by the in vitro kinase assay to measure the amount of radioactive phosphate incorporated into the substrate. Can be detected.
  • a test substance expressing a part or full length of the screening polypeptide of the present invention is untreated or treated.
  • the test cells are preferably cells that respond to insulin, and more specifically, adipocytes, hepatocytes, or skeletal muscle-derived cells.
  • the activated Akt2 protein can be concentrated from the cells by immunoprecipitation using an anti-Akt2 antibody.
  • Akt2 substrates for example, GST-crosstide (GST fusion protein of GSK3-beta sequence, where Akt is a physiological substrate) and enriched Akt2 protein are mixed, and Akt2 kinase Activity can be measured and quantified. Preferably, it can be measured by the method described in Example 7. Kinase measurement is based on the total kinase assay (Waga et al.,
  • Methods 190, pp71-77, 1996) can be used as a method for screening a large number of compounds.
  • a substance obtained by treating a test substance in a sample in which an increase in Akt2 kinase activity was observed as compared to an untreated sample and then inhibiting the binding between the screening polypeptide of the present invention and Akt2 was measured.
  • a rinsulin resistance improving agent and a Z or glucose metabolism improving agent that is, a substance having a therapeutic effect on diabetes.
  • Akt2 Akt2 enhancing kinase activity of 10 juM or less, preferably, or less, more preferably 0.1 M or less in the screening method.
  • the screening polypeptide of the present invention negatively controls insulin signal through binding to Akt2, the following screening method using the binding between the screening polypeptide of the present invention and Akt2 as an index Is mentioned.
  • a part or the entire length of the screening polypeptide of the present invention, or a part or the entire length of the screening polypeptide of the present invention in which a tag such as GST, Flag, or His is fused. Is untreated or treated with a test substance.
  • the test cells are preferably cells that respond to insulin, and more specifically, adipocytes, hepatocytes, or cells derived from skeletal muscle.
  • the Akt2 protein and its binding protein can be concentrated from the cells by immunoprecipitation using an anti-Akt2 antibody.
  • IG50 of the action of inhibiting the binding of the polypeptide of the present invention to Akt2 is preferably 10 jwM or less, more preferably 0 or less, more preferably 0 or less.
  • the antibody used here may be an antibody against the screening polypeptide of the present invention (for example, an anti-AKBP2 antibody) prepared based on the screening polypeptide of the present invention or a partial sequence thereof, or an antibody recognizing the above tag. Can be.
  • the test cells can be used without stimulation or with insulin stimulated, but preferably the test cells can be stimulated with insulin.
  • the test substance was added to an extract of cells expressing the polypeptide for screening of the present invention or a protein mixture prepared by transcription and translation at the in vitro opening.
  • In vitro pull-down method using Akt2 protein purified by adding a tag such as GST from the one with or without added (Experimental Engineering, Vol 13, No. 6, Rangen, p. 528, Matsuchizo Matsu, et al.)
  • a test substance that inhibits the binding between Akt2 and the screening polypeptide of the present invention can also be selected by combining Western blotting as described above.
  • a protein for example, an AKBP2 expression plasmid prepared in Example 1 (5)
  • a plasmid for example, the AKBP2 expression plasmid prepared in Example 1 (5)
  • AKBP2 protein is transcribed and translated in vitro using an in vitro translation kit (eg, TNT kit (Promega)), with or without a test substance added to a protein mixture prepared in vitro.
  • an in vitro translation kit eg, TNT kit (Promega)
  • a test substance that inhibits the binding between Akt2 and the screening polypeptide of the present invention can be selected.
  • test substances can be screened by performing well-known spot western blotting without using polyacrylamide electrophoresis.
  • the known ELISA method comprising adding a test substance to a lysate of cells that simultaneously expressed Akt2 and the polypeptide for screening of the present invention expressed by fusing the same tag as described above.
  • screening for selecting a test substance that inhibits the binding between Akt2 and the screening polypeptide of the present invention is possible.
  • using a known mammalian cell two-hybrid system (Clontech)
  • Akt2 fused to the GAL4 DNA binding region on the bait and VP16 transcription promoting region fused on the play side for screening of the present invention. Screening and selecting from the majority population a test substance that inhibits the binding of Akt2 to the screening polypeptide of the present invention by detecting the existing GAT or luciferase activity by locating the polypeptide. Is possible.
  • the present invention comprises a step of screening using the screening method of the present invention, and a step of formulating insulin.
  • a method for producing a pharmaceutical composition for improving resistance is included.
  • Preparations containing a substance obtained by the screening method of the present invention as an active ingredient can be prepared using carriers, excipients, and Z or other additives commonly used in the formulation thereof.
  • administration examples include oral administration such as tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, or oral solutions, or injections such as intravenous injection, intramuscular injection, or joint injection, and suppositories.
  • Parenteral administration such as an agent, a transdermal agent, or a transmucosal agent.
  • parenteral administration such as intravenous injection is preferred for peptides digested in the stomach.
  • one or more active substances and at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, polyvinyl It can be mixed with pyrrolidone or magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition may contain additives other than an inert diluent, for example, a lubricant, a disintegrant, a stabilizer, or a solubilizing or solubilizing agent, according to a conventional method.
  • the tablets or pills can be coated with a sugar coating or a film of a gastric or enteric substance, if necessary.
  • Liquid compositions for oral use can include, for example, emulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs; commonly used inert diluents, such as purified water Or it may include ethanol.
  • the composition can contain additives other than inert diluents, for example, wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
  • Parenteral injections can include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
  • the aqueous solution or suspension may contain, for example, distilled water for injection or physiological saline as a diluent.
  • examples of the diluent of the water-insoluble solution or suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil (eg, olive oil), alcohols (eg, ethanol), and polysorbate 80. be able to.
  • the composition may further contain a wetting agent, an emulsifying agent, a dispersing agent, a stabilizing agent, a solubilizing or solubilizing agent, or a preservative.
  • the composition can be sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation. Also, a sterile solid set The product can be prepared and dissolved in sterile water or other sterile injectable medium before use.
  • the dose can be appropriately determined in consideration of the active ingredient, that is, the strength of the activity of the substance obtained by the screening method of the present invention, the symptoms, the age or sex of the administration subject, and the like.
  • the dosage in the case of oral administration, is usually about 0.1 to 100 mg, preferably 0.1 to 50 mg per day for an adult (assuming a body weight of 60 kg).
  • the dose is 0.01 to 50 mg, preferably 0.01 to 10 mg per day in the form of injection.
  • the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
  • the method can be carried out according to a known method (riyiolcucarrClonngSambrook, J et al., CoIdSpring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • the procedure can be performed according to the instructions for the commercially available product.
  • the sequence of the Akt2 cDNA cloned on the vector was determined using the sequencing nucleotide (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: ⁇ ) as a primer and a sequencing kit (Applied Biosystems) and sequencing.
  • the nucleotide sequence was determined using a sensor (ABI 3700 DMA sequencer Applied Biosystems) and confirmed to be consistent with the reported sequence.
  • human Akt2 GDNA was inserted into the 5 'and 3' ends of the human Akt2 gene sequence, respectively.
  • Primers shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 to which regions homologous to 40 nucleotides before and after the multicloning site of the pDBtrp vector were added were designed.
  • PGR is performed using the human Akt2 plasmid cloned as described above as a type I DNA polymerase (Pyrobest DNA polymerase; Takara Shuzo), 98 ° C (1 minute), 98 ° C (5 seconds), 55 ° C (30 seconds), 72 ° C (5 minutes) cycle was repeated 35 times.
  • the resulting DNA fragment has the entire coding region of the human Akt2 gene.
  • the vector pDBtrp which has been linearized by cutting with the restriction enzymes Sa11 and Ncol, and the PGR fragment containing the GDNA of the human Akt2 obtained above, are simultaneously used for the yeast strain for single hybrid MaV203.
  • pDB-Akt2 Akt2 GDNA was inserted into the pDBtrp multi-cloning site was formed.
  • the yeast cells having the plasmid were selected by culturing them on a minimal solid synthesis medium (DIFC0) (20% agarose) lacking the tryptophan, a selection marker for plasmid, and After treating the cells with Zymolyase (Seikagaku Corporation) at 37 ° C for 30 minutes, the plasmid is isolated and purified by the alkaline method, and the sequencing kit (Applied Biosystems) and the sequencer (ABI 3700 DNA sequencer Applied) The nucleotide sequence was determined using Biosystems, Inc., and those in which the Akt2 GDNA was inserted so that the coding frame of the GAL4 DNA binding region of pDBtrp was inserted in the translation frame were selected.
  • DIFC0 minimal solid synthesis medium
  • Akt2 GDNA was inserted so that the coding frame of the GAL4 DNA binding region of pDBtrp was inserted in the translation frame were selected.
  • RNA was prepared according to the mRNA preparation method described in (1). Perform first-strand synthesis and second-strand synthesis using 5 g of RNA using Stratagene's ZAP-cDNA Synthesis Kit according to the attached protocol, blunt-end the double-stranded GDNA, and attach it to the kit.
  • EcoRI adapter was ligated and cut with restriction enzymes EGORI and Xhol. Resize fractionation was performed using a spin column (CHROMA SPIN-400; Clontech) to remove short fragments. After cutting 100 jug of vector PAGT2 (Clontech) with the restriction enzyme Xhol, treating with alkaline phosphatase (Bacterial Alkaline Phosphatase; Takara Shuzo), cutting with the restriction enzyme EGORI, spin column (CHROMA SPIN-1000; Clontech) ).
  • alkaline phosphatase Bacillus subtilis
  • Vector and GDNA are ligated according to the method for preparing a cDNA library described in Experimental Medicine Separate Volume Biomanual Series 2 Gene Library Preparation Method (Edited by Yodosha Nojima Hiroshi; published on February 20, 1994), and the ligated sample is collected by Millipore. With a filter cup (UFGP3TK50).
  • E. coli for electroporation ElectroMAX TM DH10B TM Cel Is
  • transformation was carried out by the electroporation method, followed by shaking culture in a 1000 ml culture solution overnight. Independent colonies in the culture solution was confirmed to be 10 6 or more, plasmid purification kit; using (Qiagen Plasmid Kit QIAGEN), according to the protocol attached to kits Bok, the plasmid was purified.
  • the yeast strain MaV203 for two-hybrid transformed with pDB-Akt2 described above was suspended in 400 ml of YPD liquid medium (DIFG0), and the suspension was kept at 30 ° C until the absorbance at a wavelength of 590 nm reached 0.1 to 0.4. After shaking culture for about 6 hours, the cells were made into competent cells by the lithium acetic acid method, and the final volume was suspended in 1.0 ml of a 0.1 M lithium-tris buffer solution. The cells were transformed with 20 g each of the mouse adipose tissue-derived GDNA library prepared in (3) above, and the cells were deficient in pDB-Akt2 and tryptophan and leucine, the selection markers for the respective plasmids in the library.
  • DIFG0 YPD liquid medium
  • the cells were selected by culturing on a solid synthesis minimum medium (DIFG0) (20% agarose) to obtain a transformant in which both plasmids were introduced.
  • DIFG0 solid synthesis minimum medium
  • the same transformed cells are also reporter genes that are expressed when the GAL4 DNA binding domain fusion protein artificially expressed in the two-hybrid system is bound to the GAL4 transcription promoting domain fusion protein.
  • ⁇ 3AT 3-AM I NO-1, 2, 4-TR I AZ0LE; Sigma
  • HIS3 histidine is removed from the culture medium to select activated cells
  • ⁇ 3AT 3-AM I NO-1, 2, 4-TR I AZ0LE; Sigma
  • the cells were cultured at 30 ° C for 5 days on a solid minimum medium (20% agarose) supplemented with 20 mM. Under the same conditions, a colony of a 3AT-resistant yeast showing that it expresses a protein that binds to Akt2 was obtained. After growing these yeast cells on YPD solid medium for 24 hours, the expression of a gene, a binding indicator reporter of a two-hybrid system separate from / ⁇ , was examined using 8-galactosidase activity as an index. .
  • -Galactosidase activity was determined by transferring yeast cells from the medium to a Nitrocellulose filter, freezing in liquid nitrogen, thawing at room temperature, and filtering the filter at 0.4% X-GAL (Sigma). ) The solution was placed on filter paper soaked and allowed to stand at 37 ° C for 24 hours, and the blue color change due to yS-galactosidase was measured. By selecting colonies in which the cell content copied on the filter changed from white to blue, yeast cells expressing the protein that binds to Akt2 were identified, and from the cells, the method of Clontech's Yeast Protocols Handbook was used. The plasmid derived from the library 1 was extracted according to the procedure described above.
  • the nucleotide sequence of the gene fragment contained therein was sequenced using the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 (sequence that binds to the GAL4 AD region; derived from GenBank accession number U29899 Cloning vector pACT2) as a primer.
  • SEQ ID NO: 9 sequence that binds to the GAL4 AD region; derived from GenBank accession number U29899 Cloning vector pACT2
  • a library-derived plasmid having a gene fragment containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained. Therefore, in order to determine the start codon of the gene contained in the fragment, it is represented by SEQ ID NO: 10, which corresponds to the complementary strand of the nucleotide sequence from No. 1034 to No. 1011 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. And a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 from the adipose tissue-derived GDNA library described above by PCR using the primer and a primer having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9.
  • the base sequence of the inserted DMA fragment in the obtained plasmid was combined with a primer (TOPO TA Cloning kit; Invitrogen; SEQ ID NO: 11) which binds to the T7 promoter region on the vector, and a sequencing kit (Applied Biosystems). ) And a sequencer (ABI 3700 DNA sequencer; Applied Biosystems).
  • a primer TOPO TA Cloning kit; Invitrogen; SEQ ID NO: 11
  • a sequencing kit Applied Biosystems
  • a sequencer ABSI 3700 DNA sequencer; Applied Biosystems
  • a plasmid derived from a library having a gene fragment containing the length of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained, and the presence of an Akt2 binding factor was demonstrated.
  • the open reading frame was determined in (5) above.
  • the primers shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 were synthesized (Proligo), and the AKBP2 GDNA encoding the net AKBP2 protein was synthesized using the primers described above.
  • the plasmid obtained in (4) was amplified by the PGR method using the plasmid as type I.
  • Each of these two types of DNA primers has a nucleotide sequence homologous to the partial sequence on the 5 ′ side and 3 ′ side of the mouse AKBP2 gene shown in SEQ ID NO: 1.
  • the PGR reaction was carried out using 98 ° C (1 minute), 98 ° C (5 seconds), 55 ° C (30 seconds), 72 ° C (5 minutes) using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo). ) Cycle was repeated 35 times. As a result of separating the PGR product by agarose gel electrophoresis, it was confirmed that a DNA fragment of about 1.7 kbp was amplified.
  • the DMA fragment in the reaction solution was subcloned into an expression vector (pcDNA3.1 / V5-His-T0P0; Invitrogen) using the T0P0 TA Clonin system (Invitrogen).
  • the primer shown in SEQ ID NO: 13 used at this time was cloned 3 'to the vector-derived V5 epitope! ⁇ Ip (derived from the V protein of paramyxovirus SV5, Southern JA, J. Gen. Virol. 72, 1551-1557, 1991) and His6 tag (Lindner PBioTechniques 22, 140-149, 1997) follow in the same frame as the triplet of the mouse AKBP2 gene.
  • AKBP2 was designed to eliminate the stop codon sequence.
  • the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment in the obtained plasmid was combined with a primer (T0P0 TA Cloning kit; Invitrogen; SEQ ID NO: 11) that binds to the T7 promoter region on the vector, a sequencing kit (Applied Biosystems) and It was determined using a sequencer (ABI 3700 DNA sequencer; Applied Biosystems).
  • a primer T0P0 TA Cloning kit; Invitrogen; SEQ ID NO: 11
  • GDNA was inserted into the above-mentioned expression vector PGDNA3.1 / V5-His-TOP0 as DNA excluding the stop codon on the 3 'side of the DNA sequence.
  • this expression plasmid is abbreviated as PGDNA-AKBP2.
  • pcDNA-AKBP2 (3.0j «g / well) transiently. After culturing for 30 hours, the medium is removed, the cells are washed with a phosphate buffer (hereinafter abbreviated as PBS), and then 0.1 ml of a cell lysate (100 mM potassium phosphate (pH 7.8), 0.2 mM) is added. ° /. Triton X-100) was added to lyse the cells.
  • PBS phosphate buffer
  • Triton X-100 Triton X-100
  • AKBP2-V5-His6 fusion protein consisting of 618 amino acids including a C-terminal tag consisting of 45 amino acids and a protein of about 70 kDa, which is shown in Fig. 1, was used for gene transfer of the expression vector PGDNA-AKBP2. It was confirmed that it was detected dependently. This revealed that the mouse AKBP2 gene cloned in the cultured cells certainly expressed the full-length region and could have a stable structure as a protein.
  • mice AKBP2 protein of the present invention binds to Akt2 and is expressed in insulin-responsive tissues such as fat and muscle. Since the Akt2 protein is a factor that acts on the insulin signal first pathway, it was expected that the action of AKBP2 of the present invention would be involved in insulin resistance. Therefore, type 2 diabetes model mouse KKA y / Ta (Iwatsuka et al. Endocrinol. Japon. ⁇ '17, 23-35, 1970, Taketomi et al. Horm. Etab. Res., 7, 242-246, 1975) AKBP2 gene messenger RNA (ITIRNA) expression in muscle and fat of healthy mice G57BL / 6J fed a high-fat diet was measured.
  • ITIRNA AKBP2 gene messenger RNA
  • the gene expression level was corrected by measuring the expression level of the mouse AKBP2 gene of the present invention and simultaneously measuring the expression level of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) gene.
  • G3PDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • PRISM TM 7700 Sequence Detection System and SYBR Green PGR Master Mix (Applied Biosystems) were used.
  • the expression level of the target gene is determined by detecting and quantifying the amount of fluorescence of the SYBR Green I dye, which is contained in the double-stranded DNA amplified by the PGR, in real time. Specifically, the measurement was performed according to the following procedure.
  • a 14-week-old male G57BL / 6J mouse and a 15-week-old male G57BL / 6J mouse and a KKA y / Ta mouse (all of Clea Japan) loaded with a normal diet or a high fat diet were used.
  • the high fat diet load was performed for 9 weeks from 5 to 14 weeks of age.
  • the composition of the high fat diet is as follows: casein 29.8%, sucrose 15.8%, vitamin mix 1.3%, mineral mix 8.8%, cellulose powder 5.0%, methionine 0.5% , Safflower oil 28.9%, water 10%.
  • GE-2 (CLEA Japan) was used for normal diet.
  • RNA extraction reagent Isogen; Nippon Gene
  • Each of the prepared total RNAs was then treated with a deoxyribonuclease (Fujitsu Gene Co., Ltd.), treated with phenolic-mouth-form, ethanol-precipitated, dissolved in sterile water, and stored at -20 ° C.
  • RNA to single-stranded cDNA Reverse transcription from total RNA to single-stranded cDNA was performed using 1 jug of RNA (fat), 1 ⁇ g of RNA (muscle from 14-week-old mouse), 0.25 ig of RNA (fat) prepared in (1). Using a 15-week-old mouse muscle), a 20 I system was performed using a reverse transcription reaction kit (Advantage TM RT-for-PCR Kit; Clontech). After reverse transcription, sterile water (180 I) was added and stored at -20 ° C.
  • SEQ ID NO: 14-SEQ ID NO: 17 Four oligonucleotides (SEQ ID NO: 14-SEQ ID NO: 17) were designed as primers for PGR described in section (4).
  • SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 were used, and for the G3PDH gene, a combination of SEQ ID NO: 1.6 and SEQ ID NO: 17 was used.
  • the PGR using 5 I of a suitably diluted mouse genome DMA (Clontech) of ⁇ I was obtained at 50 ° C for 10 minutes, then at 95 ° C for 10 minutes, and then at 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C.
  • the test was performed by repeating a 45-cycle process consisting of two steps of 60 seconds at ° C.
  • the expression level of the mouse AKBP2 gene in each sample was corrected with the expression level of the G3PDH gene based on the following equation.
  • AKBP2 corrected expression level: l [AKBP2 gene expression level (raw data)] Z [G3PDH gene expression level (raw data)],
  • Fig. 2 shows the relative amounts of C57BL / 6J mice on a normal diet for comparison of the expression levels in fat, and the expression level of G57BL / 6J mice in the comparison of the expression levels in muscle tissue.
  • mouse AKBP2 of the present invention As shown in FIG. 2, it was found that the expression of the mouse AKBP2 gene of the present invention was significantly increased in fat and muscle under a high fat diet load or in fat and muscle of a diabetes model mouse. Therefore, it is considered that the mouse AKBP2 of the present invention induces insulin resistance by increasing the expression level in fat and muscle. From the above, it is concluded that the mouse AKBP2 of the present invention is greatly involved in insulin resistance. In addition, the results of this example revealed that the measurement of the expression level of mouse AKBP2 can diagnose a diabetic condition.
  • Example 4 Cloning of human AKBP2 gene and analysis of expression distribution by tissue Using a human fat-derived GDNA library (Clontech) as type III, a pair of primers shown in SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 were used. Amplification of the full-length GDNA of the AKBP2 human ortholog gene was attempted by the same PGR method as described in Example 1 (5) above. The nucleotide sequence of the obtained DNA fragment of about 1.8 kbp was determined in the same manner as in Example 1, and it was confirmed that the full-length GDNA of the gene shown in SEQ ID NO: 3 was included. .
  • the gene GDNA is a novel gene encoding the polypeptide shown in SEQ ID NO: 4.
  • the gene has 76.8% of the mouse AKBP2 gene shown in SEQ ID NO: 1, and the encoded polypeptide has a homology of 71.3 ⁇ 1 ⁇ 2 with the mouse AKBP2 protein shown in SEQ ID NO: 2, respectively.
  • GDNA fragments were amplified from GDNA derived from various human tissues using PCR, and the presence or absence of AKBP2 expression in various tissues was examined.
  • Various human tissues GDNA library (Clontech) PCR was performed using 2 igs each as a type II DNA polymerase.
  • human AKBP2 has a high homology with mouse AKBP2, and expression is observed in insulin-responsive tissues. It was found to be useful for screening.
  • the expression plasmid pcDNA-human AKBP2 was introduced 5.18 per well in the same manner as in Example 2 (1), and the expression of human AKBP2 protein was detected according to the method of Example 2 (2).
  • a human AKBP2-V5-His6 fusion protein consisting of 638 amino acids including a G-terminal tag consisting of 45 amino acids was approximately 70 kDa. It was confirmed that the protein was detected depending on the gene transfer of the expression vector pcDNA-human AKBP2.
  • the full-length region of the cloned human AKBP2 gene was certainly expressed in cultured cells, and a stable structure as a protein was obtained. It became clear that it could be taken.
  • Example 1 To insert human Akt2 GDNA into the GST fusion expression vector pGEX-3X (Amersham Biosciences), the human Akt2 cDMA obtained in Example 1 (1) was
  • the vector pGEX-3X was cut with restriction enzymes BamHI and EcoRI, respectively, to make it linear.
  • restriction enzymes BamHI and EcoRI restriction enzymes
  • they were each treated at 60 ° C. for 30 minutes as a pretreatment, mixed, and left at room temperature for 2 hours.
  • a mixture of these treated human Akt2 GDNA fragments, vector pGEX-3X and ligation fragments was mixed with DNA and igase solution (DNA ligation kit II; Takara Shuzo Co., Ltd.), and treated at 16 ° C for 3 hours.
  • pGEX-Akt2 A plasmid (hereinafter abbreviated as pGEX-Akt2) in which Akt2 GDNA was inserted into a 3X multicloning site was prepared.
  • pGEX-Akt2 A plasmid in which Akt2 GDNA was inserted into a 3X multicloning site was prepared.
  • the nucleotide sequence was determined using a sequencing kit (Applied Biosystems) and a sequencer (ABI 3700 DNA sequencer Abdio Biosystems). The one in which the GDNA coding region and the GST tag translation frame of the pGEX vector were inserted so as to match was selected.
  • the plasmid pGEX-Akt2 obtained in (1) above was transformed by heat shock method using Escherichia coli BL21, and cultured with shaking overnight in a 2.4 mL culture medium. After shaking culture at 37 ° C for 3 hours, add IPTG (SIGMA) to a final concentration of 2.5 mM, and culture with shaking for another 3 hours to obtain GST-fused Akt2 protein (hereinafter referred to as GST-Akt2). (Abbreviated) was induced. Collect the cells and use a known method
  • GST-Akt2 was purified on Glutathione Sepharose 4B (Glutathione Sepharose 4B; Amersham 'Pharmacia) according to (Experimental Engineering, VoM3, No. 6, page 528, Matsuchigozo, et al., 1994).
  • E. coli transformed with pGEX-3X as control From BL21, a protein containing only the GST portion (hereinafter abbreviated as GST protein) was induced and purified in the same manner as described above.
  • GST-Akt2 protein (abbreviated as GST-Akt2) prepared in (2) above, the presence or absence of direct interaction between the human AKBP2 protein and the Akt2 protein was determined by the GST pull-down method (Experimental Engineering, Vol. No. 6, 1994, p. 528, Shichigo Matsumatsu et al.).
  • the human AKBP2 of the present invention was found to be involved in the induction of insulin resistance through the interaction with the Akt2 protein, similarly to the mouse AKBP2 of the present invention.
  • Example 7 Influence of AKBP2 overexpression on Akt2 kinase activity in NIH3T3 L1 adipocytes
  • GST-crosstide a GST fusion protein (hereinafter abbreviated as GST-crosstide).
  • GST-crosstide a GST fusion protein
  • the cells were recovered and GST-crosstide was purified on Glutathione Sepharose 4B (Alusham's Pharmacia) according to a known method (Experimental Engineering, Vol. 13, No. 6, 1994, page 528, Matsuchigozo, et al., 1994). .
  • Glutathione Sepharose 4B Alusham's Pharmacia
  • SDS polyacrylamide gel electrophoresis according to a known method, and it was confirmed that the GST-crosstide protein was purified by Coomassie brilliant single staining.
  • the gene fragment encoding mouse AKBP2 is excised from the PGDNA-AKBP2 vector using the restriction enzymes BamH and Sacl I, and further, the adenovirus vector is synthesized using the linker oligos SEQ ID NO: 26 and 27 to produce Sacl I and Notl cleavage fragments.
  • AKBP2 / pAdTrack-CMV vector was obtained by inserting it into the multi-cloning site (88111 ⁇ 1 ⁇ 01: 1) of pAdTrack-G V (obtained from Johns Hopkins Cancer Center).
  • the following is a well-known protocol ["A Practical Guide for using the AdEasy System "] (HYPER and I NK" http: // www. GO I oncancer. Org / adeasy. Htm "
  • a high-titer adenovirus solution expressing AKBP2 was prepared.
  • the adenovirus for control was pAdTrack-GMV. Prepared.
  • the virus load was measured by measuring the absorbance at 260 nm (A260) and converting it by the following formula.
  • NIH3T3 L1 adipocytes were modified with Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal calf serum (FGS).
  • FGS Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal calf serum
  • DMEM DMEM
  • a 6-well plate Asahi Techno Glass Co., Ltd. coated with collagen so as to have 8 ⁇ 10 5 holes.
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • the medium was returned to 0.4 ml DWIEM (10% FGS).
  • an adenovirus expressing AKBP2 was added to the medium at a concentration of 8 ⁇ 10 10 pfu per well.
  • an adenovirus expressing only GFP was used.
  • the cells were cultured in serum-free DIEM medium for 16 hours from 36 hours after adenovirus infection, stimulated with 100 nM insulin for a predetermined time (0, 30, 60 minutes), and immediately lysed with a cell lysate (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0.5 mM Na 3 V0 4, 0.1% 2- Melka flop Bok Etano Ichire, 50 mM NaF, 5 mM sodium pyrophosphate ⁇ 10 mM ⁇ -
  • Glycerophosphate 1% Triton-X100, 0.1 mM PSF) dissolved in 500 juI.
  • the supernatant was immunoprecipitated with anti-Akt2 antibody (Upstate) and Protein G-sepharose (Amersham).
  • the immunoprecipitate was twice with the cell lysate, twice with the washing solution (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 0.03% Brij35, 0.1% 2-mercaptoethanol), and the reaction solution (20 mM MOPS pH 7.2, 10 mM MgGI 2 , 25 mM ⁇ -Glycerophosphate, 5 mM EDTA, 1 mM DTT), and donated to the kinase reaction.
  • the immunoprecipitate was suspended in a 20 / I reaction solution.
  • 15jt / M ATP 10
  • the reaction solution was added containing Gi [r 32 P] -ATP 3u g GST- crosst i de, warmed for 20 minutes at 30 ° C.
  • the reaction was stopped by adding 10 I of 4xSDS sample buffer. After separation by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, the radioactivity incorporated in the GST-crosstide was analyzed and quantified using a BAS2000 bioimaging analyzer (Fuji Film Co., Ltd.). As shown in Fig.
  • Akt2 immunoprecipitated after stimulation with insulin described above was purified using anti-phosphorylated serine 473 antibody (New England and Biolab).
  • the unphosphorylated phosphorylation level was lower in cells infected with AKBP2 virus than in control virus-infected cells.
  • stimulation of insulin for 30 minutes resulted in stimulation-dependent enhancement of phosphorylation in both AKBP2 virus-infected cells and control virus-infected cells, but the degree of phosphorylation was increased by AKBP2 virus.
  • mouse AKBP2 of the present invention interacts with Akt2 to induce insulin resistance by reducing insulin-independent enzyme activity in addition to its insulin-independent enzyme activity. it is conceivable that.
  • polypeptide and polynucleotide of the present invention which have the property of binding to Akt2, decrease the kinase activity of Akt2, and increase the expression level in diabetic conditions, are useful for diagnosis of diabetes.
  • the polypeptide, polynucleotide, expression vector and cell of the present invention are substances that inhibit the binding of the polypeptide of the present invention to Akt2 (that is, Akt2). (A substance that enhances the function of).
  • a substance selected by the screening is useful as a candidate substance for an insulin sensitizer or a diabetes improver.
  • each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOS: 5 to 8 and 10 to 27 in the sequence listing is a primer sequence artificially synthesized.
  • the base sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 9 is a sequence composed of bases Nos. 5183 (5 ') to 5162 (3') of cloning vector pAGT2 (GenBank U29899).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)

Description

明 細 書
Akt2に結合する蛋白質 技術分野
本発明は、 Akt2に結合する新規なポリペプチド、 及び該ポリペプチドをコード する新規なポリヌクレオチド、 該ポリヌクレオチドを含有するベクター、 該べク ターを含有する形質転換細胞及び前記ポリペプチドと Akt2との結合阻害物質をス クリーニングする方法に関する。 背景技術 '
インスリンは滕臓ランゲルハンス島の) S細胞より分泌され、 主に筋肉、 肝臓、 脂肪に作用して血中の糖を細胞に取リ込ませて貯蔵、消費させることによリ血糖 値を降下させる。 糖尿病は、 このインスリンの作用不足から引き起こされるが、 患者にはインスリンの生産又は分泌に障害をもつ 1型と、 インスリンによる糖代 謝促進が起こリにくくなる 2型の 2つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖 値が健常人よリ高くなるが、 1型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対し て、 2型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の細胞における取り込み又は 消費が促進されないィンスリン抵抗性が生じている。 2型糖尿病は遺伝的素因に 加えて過食や運動不足、 ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣 病である。 今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの 2型糖尿病患者が急 激に增加しており、 日本では糖尿病患者の 95%を占めている。 そのため糖尿病の 治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、 インスリン抵抗性の改善によリ糖代謝 を促進する 2型糖尿病の治療を対象とした研究の必睪性が高まっている。
現在 1型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。 一方、 2 型患者に処方される血糖降下剤としては、 ィンスリン注射製剤に加えて塍臓の^ 細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤 （SU剤） や、 嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、 及び糖の腸管吸収を抑制す る作用を持つビグアナィド系血糖降下剤の他、 糖質の消化吸収を遅らせる ーグ ルコシダーゼ阻害剤が知られている。 これらは間接的にインスリン抵抗性を改善 するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン 誘導体が使われるようになつた。その作用は細胞内へのブドウ糖の取リ込みと細 胞内におけるブドウ糖利用の促進である。 このチアゾリジン誘導体はペルォキシ ソーム増殖剤応答性受容体ガンマ（perox i some pro l i ferator act i vated
receptor : PPAR ) のァゴニストとして作用することが示されている（非特許文献 1 参照）。 しかしチアゾリジン誘導体はィンスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮 腫を惹起する副作用が知られている（非特許文献 2、 非特許女献 3参照)。この浮腫 の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用なので、 インスリン抵抗性改善のために、 PPAR γにかわるよリ有用な創薬標的分子が求められている。
インスリン作用のシグナルは細胞膜上にあるインスリン受容体を介して細胞内 へ伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の 2経路が存在する。
(非特許文献 4参照） 。 第一経路においては、 活性化されたインスリン受容体か ら I RS-K I RS-2、 P I 3キナーゼ、及び PDK1 を介して Akt1 (ΡΚΒ α)若しくは Akt2
(Ρ Β β ) 、 または ΡΚΟ λ若しくは PKG へ順次シグナルが伝達され、その結果と して細胞内に存在するグルコーストランスポーター GLUT4 を細胞膜上へ移行させ ることにより、 細胞外からの糖の取り込みを促進する（非特許文献 5参照)。一方、 第二経路ではインスリン受容体から c - Cb l 及び GAPを介して GrK Iし G3G、 並び に TG10へ順次シグナルが伝達され、結果 GLUT4 による糖の取り込みを促進する (非特許文献 6参照）。 しかし、 これらインスリンシグナル伝達経路の詳細につい てはいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構 を経てグルコース卜ランスポーターを介した細胞の糖取リ込みを促進するのか明 らかではない。
Akt2は前述のィンスリンシグナル第一経路に存在し、ィンスリンの刺激によリ PDK1を介してリン酸化され活性化する。活性化した Akt2はキナーゼとして基質と なる蛋白質をリン酸化することによりシグナルを伝達する。 Akt2蛋白質をコード する遺伝子を人為的に欠失させたホモノックァゥ卜マウスは主に筋肉、 肝臓にお いてィンスリンの感受性が低下し 2型糖尿病様の表現型を示すことが報告されて いる。 これらの事実から、 Akt2はインスリンシグナルに応答した細胞内への糖取 リ込みに働くシグナル仲介因子であり、その機能阻害はインスリンシグナル伝達 の部分的な遮断によりィンスリン抵抗性を惹起すると考えられている（非特許文 献 7参照)。
(非特許文献"
「ザ■ジャーナル .ォブ 'バイオロジカル 'ケミス卜リー（The Journal of Biological Chem i str y) J、 (米国)、 1995年、第 270巻、 p. 12953-12956
(非特許文献 2)
「ダイアビーテイーズ フロンティア（Diabetes Front ier)」 、 （米国）、 1999年、 第 10巻、 p.811- 818
(非特許文献 3)
「ダイアビーテイーズ フロンティア（Diabetes Front ier)j 、 （米国）、 1999年、 第 10巻、 p.819-824
(非特許文献 4)
「ザ■ジャーナル 'ォブ 'クリニカル'インべスティゲ一シヨン（The Journal of CI inical I nvest i at i on) J (米国）、 2000年、第 106巻、第 2号、 p. 165-169
(非特許文献 5)
「ザ■ ジャーナル■ォブ .バイオロジカル 'ケミストリ一 (The Journal of Biological Ghemistry)」、（米国）、 1999年、第 274巻、第 4号、 p. 1865-1868
(非特許文献 6)
Γネィチヤ一 (Nature) J、 (英国)、 2001年、第 410巻、第 6831号、 p.944-948
(非特許文献 7)
「サイェンス（Sc i ence) J (米国）、 2002年、第 292巻、第 2号、 ρ· 1728-1731 発明の開示
本発明者らは、 上述の知見から Akt2の働きを増強させることができれば、 イン スリン抵抗性を改善できると考えた。そしてこの目的は、 Akt2自身の活性を増大 させるか、 Akt2に結合してその作用を制御している細胞内因子を同定し、 その作 用を調節することにより達成できると考えた。しかし Akt2はキナーゼであり、 そ の酵素活性を薬剤によって増強する方向に調節することは困難である。 そこで Akt2に結合する蛋白質を、 酵母ツーハイブリッドシステムにより同定した。 その 結果、 Akt2に結合する蛋白質 AKBP2 (Akt2 Binding Protein 2) をコードする新 規な塩基配列のマウス由来 cDNAのクローニングに成功した。 さらに同蛋白質は糖 尿病モデルマウスの筋肉および脂肪において正常個体より発現量が顕著に増加し ていることから同蛋白質が糖尿病態の原因因子であることを見出した。 加えて、 ヒトオルソログであるヒト AKBP2遺伝子のクローニングに成功し、 該遺伝子がィ ンスリン応答組織である脂肪細胞に発現していること、 マウス AKBP2と同様ヒ卜 AKBP2も Akt2に結合することを見出した。 加えて、 マウス AKBP2過剰発現により Akt2のキナーゼ活性が低下することを検出し、 AKBP2によリィンスリンシグナル が遮断されインスリン抵抗性が惹起されること、 従って、 AKBP2と Akt2との結合 を阻害することによりインスリン抵抗性が改善されることがわかった。 そこで、 AKBP2と Akt2との相互作用を利用したィンスリン抵抗性改善薬及び 又は糖代謝 改善薬のスクリーニング系を構築した。
これらの結果、 インスリン抵抗性改善薬及ぴ 又は糖代謝改善薬の探索に有用 な新規なポリペプチド、 前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 前記 ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、 前記発現ベクターで形質転換された細胞、 ィンスリン抵抗性改善薬及び 又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、 並 びに、 ィンスリン抵抗性改善用及びノ又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を 提供し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は、
[1 ] 配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列、 あるいは、 配列番号 2 又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個のアミノ酸が欠失、 置 換、 及び 若しくは挿入されたアミノ酸配列
を含み、 しかも Akt2と結合するポリペプチド、
[2] 配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド、
[3] [1 ] 又は [2] に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
[4] [3] に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクタ一、
[5] [4] に記載の発現ベクターで形質転換された細胞、 [6] (1) [1 ] 若しくは [2] に記載のポリペプチド、 または配列番号 2若し くは配列番号 4で表されるァミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配 列からなり、 しかも Akt2と結合するポリペプチド、 あるいは前記ポリペプチドを 発現している細胞と （2) 試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドと Akt2との結合を測定する工程、 及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリべプチドと Akt2との結合阻害物質をスクリー二 ングする方法、
[ 7 ] 結合阻害物質がィンスリン抵抗性改善薬及ぴ 又は糖代謝改善薬である [6] に記載のスクリーニングする方法。
[8] (1) [1 ] 又は [2] に記載のポリペプチド、 あるいは配列番号 2若しく は配列番号 4で表されるアミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配列 からなリ、 しかも、 Akt2と結合するポリペプチドと （2) Akt2との結合を測定す る工程が、 前記結合の変化による Akt2の変化を測定する工程である [6] 又は
[7] に記載のスクリーニングする方法。
[9] [6] 乃至 [8] に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリ一ニン グする工程、 及び
製剤化する工程
を含むことを特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善用及び 又は糖代謝改善用医薬 組成物の製造方法
に関する。
配列番号！〜 4に記載の本発明のポリべプチド及びポリヌクレ才チドと同一の配 列は知られていない。 本願優先日後に、 配列データベース GenBankにおいてァク セッション番号 AX714043、 BC042155, 及び BG049110として本発明のポリヌクレオ チドと相同性を有する配列が収載されたが、 配列が開示されたにすぎず、 その具 体的用途については記載されていない。 また、 配列データべ一ス GenPeptには、 ァクセッション番号 AK056090として、 本発明のポリべプチドの一つである配列番 号 4で表されるアミノ酸配列において、 68個のァミノ酸が欠失したァミノ酸配列 からなるポリペプチド、 及びァクセッション番号 AK019105として、 本発明のポリ ぺプチドの一つである配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 228個のアミ ノ酸が欠失し、 13個のアミノ酸が置換されたァミノ酸配列からなるポリぺプチド が収載されている。 しかしながら、 実際にこれらポリペプチドを取得したとの情 報はおろか、 どのように取得できるかの具体的情報もない。 また、 当該ポリぺプ チドの具体的用途についても記載されていない。 本発明者らは本発明のポリぺプ チド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、 その蛋白質の発現亢進及び Akt2との 結合の増加が糖尿病病態の原因であることを初めて明らかにした。 また、 本発明 のポリべプチドと Akt2との結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明 者らによって初めて提供された方法である。
図面の簡単な説明
図 1は、 培養細胞における AKBP2の発現を示す図である。 レーン 1及びレーン 3は 分子量マーカーを、 レーン 2は空べクタ一を、 レーン 3は PGDNA-AKBP2を導入した 場合を示している。
図 2の （1 ) は、 通常食又は高脂肪食負荷した正常マウス C57BL/6Jにおける脂 肪での AKBP2発現量の比較を示す図である。 図の縦軸はマウス脂肪における相対 発現量を示す。 白塗りのバーは通常食、 黒塗りのバーは高脂肪食負荷した場合を 示している。
(2) は、 通常食又は高脂肪食負荷した正常マウス G57BL/6Jにおける筋肉での AKBP2発現量の比較を示す図である。 図の縦軸はマウス筋肉における相対発現量 を示す。 白塗りのバーは通常食、 黒塗りのバーは高脂肪食負荷した場合を示して いる。
(3) は、 正常マウス C57BL/6J及び糖尿病モデルマウス KKAy/Taにおける脂肪 での AKBP2発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス脂肪における相対発 現量を示す。 白塗りのバーは正常マウス G57BL/6J、 線入りのバーは糖尿病モデル マウス KKAy/Taの結果を示している。
(4) は、 正常マウス G57BL/6J及び糖尿病モデルマウス KKAy/Taにおける筋肉 での AKBP2発現量の比較を示す図である。図の縦軸はマウス筋肉における相対発 現量を示す。 白塗りのバーは正常マウス G57BL/6J、 線入りのバーは糖尿病モデル マウス KKAy/Taの結果を示している。
(1 ) 、 (2) の比較においては通常食の G57BL/6Jの発現量を、 （3) 、 （4) の比 較においては G57BL/6Jの発現量を、それぞれ 1として表示している。
図 3は、 N I H3T3 L1脂肪細胞におけるマウス AKBP2過剰発現による Akt2酵素活 性への影響を示す図である。 図の縦軸は相対活性を示しており、 インスリン無刺 激状態におけるコントロールウィルス感染細胞における酵素活性の値を 1 として 表示している。 図の横軸の数値は、 インスリンの刺激時間 （分） を示している。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
<本発明のポリぺプチド >
本発明のポリぺプチドには、
( 1 ) 配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド； 及び
( 2 ) i)配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも Akt2に 結合するポリペプチド、 あるいは、 i i )配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミ ノ酸配列において、 1〜10個（好ましくは 1〜7個、よリ好ましくは 〜 5個、更に好ま しくは 1 ~3個）のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 若しくは挿入されたアミノ酸配 列を含み、 しかも Akt2に結合するポリペプチド （以下、 機能的等価改変体と称す る）
が含まれる。
本発明のポリペプチドは、 Akt2と結合し、 Akt2のキナーゼ活性を低下させるも のが特に好ましい。
また、 本発明のポリペプチドは、 前述の （1 ) ~ (2) のいずれかに該当する 限りヒト及びマウス由来のポリべプチドに限定されず、 他の脊椎動物 （例えぱラ ッにゥサギ、 ゥマ、 ヒッジ、ィヌ、 サル、 ネコ、クマ、 ブタ、 ニヮトリなど） 由 来のものも包含する。 また、 前述の （1 ) ~ (2) のいずれかに該当する限り、 天 然のポリべプチドに限定されず人工的に製造した変異体も含まれる。 「Akt2に結合する」 とは、 Akt2 (好ましくはヒト Akt2、 更に好ましくは GenBankのァクセッション番号 M95936によリコードされるポリべプチド） にポリ ペプチドが結合することを意味しており、 「結合する J か否かは以下の方法によ リ確認することができる。
結合するか否かの検討対象ポリべプチドの一部若しくは全長域、 または GSTや F l ag, H i sなどのタグを融合させた検討対象ポリべプチドの一部若しくは全長域 を細胞に発現させる。 前記細胞としてはィンスリンに応答する細胞が好ましく、 より具体的には脂肪細胞、 肝細胞、 あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。 前記細 胞から抗 Akt2抗体を用いた免疫沈降により Akt2蛋白質とそこに結合する蛋白質を 濃縮することができる。 得られた Akt2およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方 法によリポリアクリルァミドゲル電気泳動法によリ分離し、抗体を用いたウェス タンブロティングによリ検討対象のポリべプチドが Akt2に結合するか否かを確認 することができる。 ここで用いる抗体は、 検討対象のポリペプチド若しくはその 部分配列をもとに作製した検討対象のポリぺプチドに対する抗体、または上記タ グを認識する抗体を利用することができる。
また検討対象のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液、 または、 インビトロ で転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液と、 GSTなどのタグをつけて精製した Akt2蛋白質とを用いた i n v i troのプルダウン法 （実験工学、 Vo M 3、 No. 6、 1994 年 528頁 松七五三ら） と上述と同様のウェスタンブロッテイングを組み合わせる によっても Akt2と検討対象のポリペプチドの結合を検出することができる。 好ま しくは、 実施例 6に示すように検討対象蛋白質発現用プラスミド （例えば実施例 1
(5) で作製した AKBP2蛋白質発現用プラスミド） から直接検討対象蛋白質をイン ビトロトランスレーシヨンキット （例えば TNTキット （プロメガ社） ） を用いて i n v i troで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液を用いて結合を検出できる。 よリ好ましくは、 実施例 6に記載の方法により検討対象のポリぺプチドと Akt2と の結合を検出することができる。 「Akt2のキナーゼ活性を低下させる」 とは、 検 討対象のポリベプチドが Akt2に結合することによリ Akt2の有するキナーゼ活性を 低下させることを意味する。 「キナーゼ活性を低下」 させるか否かは、 以下の方 法によリ確認することができる。 Akt2は分子内のセリン 473番 （Ser473) あるいはスレオニン 308番 （Thr308) が リン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている （B i ochem.
J. ，1998 335 (1-13) ) 。 これを利用し、 Akt2の Ser473又は Thr308のリン酸化状態 をこれらリン酸化残基に特異的に反応する抗体 （例えば抗 phosphoSer抗体等） を 用いたウェスタンプロットにより検出することで Akt2の活性の有無が検出できる。 よリ具体的には、 検討対象のポリべプチドの一部若しくは全長域を発現させた細 胞 （インスリンに応答する細胞が好ましく、 より具体的には脂肪細胞、 肝細胞、 または骨格筋由来細胞が好ましい） を溶解し、 これを試料として抗 phosphoSer抗 体を用いるウェスタンブロット法、 スポットウエスタンブロット法などを利用す ることによリ Akt2のリン酸化、 すなわち Akt2の活性の有無.を検出することができ る。 好ましくは実施例 7の方法で検出することができる。 この検出系において、 検討対象のポリべプチドを発現させない細胞から得た試料に比較して検討対象の ポリべプチドを発現させた細胞から得た試料を用いたときの Akt2のリン酸化 （す なわち Akt2の活性化） の低下が観察された場合、 検討対象のポリペプチドは 「Akt2のキナーゼ活性を低下させる」 と判断することができる。
また、 ヒストン H2Bや GSK - 3融合タンパク質などを Akt2の基質として Akt2の免疫 沈降物と反応させたときの、 基質に対する放射性リン酸の取り込み量を測定する インビトロキナーゼアツセィ法によっても 「Akt2のキナーゼ活性を低下」 させる か否か確認することができる。 具体的には、 検討対象のポリペプチドの一部また は全長域を発現させた細胞 （インスリンに応答する細胞が好ましく、 より具体的 には脂肪細胞、 肝細胞、 あるいは骨格筋由来細胞が好ましい） の抽出液から杭
Akt2抗体を用いた免疫沈降により Akt2蛋白零を濃縮することができる。 Akt2の基 質、 例えば、 GST- crosst i de (Aktの生理的基質である GSK3-beta配列の GST融合蛋 白質） と濃縮 Akt2蛋白質とを混合することにより、 基質のリン酸化を指標として Akt2のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。 好ましくは実施例 7に記載の方法 で測定することができる。 この測定系において、 検討対象のポリペプチドを発現 させない細胞から得た試料に比較して検討対象のポリぺプチドを発現させた細胞 から得た試料を用いたときの基質のリン酸化の低下が観察された場合、 検討対象 のポリペプチドは 「Akt2のキナーゼ活性を低下させる」 と判断することができる。 く本発明のポリヌクレオチド>
本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリべプチド、 すなわち、 配列番号 2 又は配列番号 4に記載のアミノ酸配列で表されるポリべプチド、 またはその機能 的等価改変体をコードする塩基配列ならいずれの種由来のものであってもよい。 好ましくは、 配列番号 2又は配列番号 4に記載のァミノ酸配列をコードする塩基 配列からなるポリヌクレオチドであり、 さらに好ましくは、 配列番号 1又は配列 番号 3に記載の塩基配列である。 なお、 本明細書における 「ポリヌクレオチド j には、 DNA及び RNAの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、 本発明のポリペプチドをコードする限り、 あ らゆる変異体を含むことが出来る。 より具体的には天然に存在するアレル変異体、 天然に存在しない変異体、 欠失、 置換、 付加及び挿入を有する変異体を含むこと が出来る。 前記の変異は、 例えば天然において突然変異によって生じることもあ るが、 人為的に改変し作製することも出来る。本発明は、 上記ポリヌクレオチド の変異の原因及び手段を問わず、 上記本発明のポリべプチドをコ一ドする全ての 変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、 例えば 塩基特異的置換法 (Methods i n Enzymo I ogy、 (1987) 154、 350, 367-382)等の遺伝子 工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸ァミダイド法などの化学合成手 段 (Sc i ence 150、 178J 968)を挙げることができる。 それらの組み合わせによつ て所望の塩基置換を伴う DMAを得ることが可能である。あるいは PGR法の繰リ返 し作業や、 その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることにより DNA分子 中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリべプチドは、 本発明によリ開示された配列 情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造■取得することが出来 る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 例えば次のように得 ることができるが、 この方法に限らず公知の操作 Ho l ecu l ar C l on i ng Sambrook, Jら、 Co l d Spr i ng Harbor Laboratory Press, 1989年」 等でも得ることができる。 例えば、 （1 ) PGR を用いた方法、 （2 ) 常法の遺伝子工学的手法 （すなわち cDNAラィブラリ一で形質転換した形質転換株から所望のァミノ酸を含む形質転換 株を選択する方法） を用いる方法、 又は （3 ) 化学合成法などを挙げることがで きる。 各製造方法については、 W001 /34785に記載されているのと同様に実施でき る。
PCR を用いた方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態」 1 ) 蛋 白質遺伝子の製造方法 a)第 1製造法に記載された手順により、 本明細書記載のポ リヌクレオチドを製造することができる。 該記載において、 「本発明の蛋白質を 産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」 とは、 例えば、 脂肪細胞を挙げる ことができる。 ヒ ト又はマウス脂肪細胞から mRNA を抽出する。 次いで、 この mRNA をランダムプライマ一またはオリゴ dT プライマーの存在下で、 逆転写酵素 反応を行い、 第一鎖 cDNAを合成することが出来る。 得られた第一鎖 cDNAを用い、 目的遺伝子の一部の領域をはさんだ 2種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連 鎖反応 （PGR) に供し、 本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることが できる。 より具体的には、 例えば実施例 1 及び実施例 4に記載の方法により本発 明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の 実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 b)第 2製造法に記載された手順により、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。 化学合成法を用いた方法では、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態」 1 ) 蛋白質遺伝子の製造方法 c)第 3製造法、 d)第 4製造法に記載された方法によつ て、 本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを製造することができ る。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配 列を利用することによリ、 個体もしくは各種組織における本発明のポリヌクレオ チドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法としては、 RT-PCR (Reverse transcr i bed - Po l ymerase cha i n react i on) 、 ノーザンブロッテイング解析、 i n s i tu ハイブリダィゼーシヨンな どの方法を挙げることが出来る。 <本発明の発現ベクター、 細胞、 及びポリペプチドの製造法 >
本発明には、 本発明の形質転換された細胞を培養することを特徴とする本発明 のポリべプチドの製造方法も包含される。
上述のように得られた本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドは、 riiflo l ecu l ar C l on i ng Sambrook, Jら、 Go I d Spr i ng Harbor Laboratory Press, 1989年 J 等に記載の公知の方法により、 適当なプロモーターの下流に連結するこ とで本発明のポリべプチドを試験管内、 あるいは試験細胞内で発現させることに 利用できる。
具体的には上述のように得られた本発明のポリぺプチドの開始コドン上流に特 定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、 これを錶 型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、 翻訳による本発明のポリべプチドの 発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを適当な ベクタープラスミドに組み込み、 プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内 で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。 あるいは、 このような構成が染色 体 DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。 より具体的には、 単 離されたポリヌクレオチドを含む断片は、 適当なベクタープラスミドに再び組込 むことによリ、 真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。 さらに、 これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を 導入することにより、 それぞれの宿主細胞において本発明のポリべプチドを発現 させることが可能である。 宿主細胞は、 特に限定されるわけではなく、 本発明の ポリぺプチドの発現量をメッセンジャー RNAレベルで、 あるいは蛋白質レベルで 検出できるものであればよい。 内在性の Akt2が豊富に存在する脂肪由来細胞、 あ るいは筋肉由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、 例えば、 前記特許文献の 「発明の実施の形態」 2 ) 本発明のベクター、 本発明の宿主細胞、 本発明の組換 え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。 発現ベクターは、 所望の ポリヌクレオチドを含む限り、 特に限定されるものではない。 例えば、 用いる宿 主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、 所望のポリヌクレオチドを 挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。 本発明の細胞 は、 例えば、 前記発現ベクターにより所望 0宿主細胞をトランスフエクシヨンす ることにより得ることができる。 より具体的には、 例えば、 実施例 2に記載のよ うに所望のポリヌクレオチドを哺乳類動物細胞用の発現ベクター pcDNA3. 1に組み 込むことにより、 所望の蛋白質の発現べクタ一を得ることができ、 該発現べクタ 一をリン酸カルシウム法を用いて 293細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞 を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、 常法に従い培養することができ、 該培 養により所望の蛋白質が生産される。 該培養に用いられる培地としては、 採用し た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択できる。 例えば上記 293細 胞であれば牛胎児血清 (FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最 小必須培地 (DMEM)等の培地に G418を加えたものを使用できる。 本発明の形質転 換された細胞としては、 本発明のポリべプチドを発現している細胞が好ましい。 本発明の細胞を培養することにより、 細胞中で産生した本発明のポリぺプチド を検出、定量、 さらには精製することが出来る。 例えば、 本発明のポリペプチド と結合する抗体を用いたウェスタンブロッ卜法、 あるいは免疫沈降法により本発 明のポリペプチドを検出、 精製することが可能である。 あるいは、 本発明のポリ ペプチドを、 ダルタチオン- S-トランスフェラーゼ (GST)、 プロテイン Α、 β— ラクトシダ一ゼ、 マルトースバインディングプロテイン (ΜΒΡ)など適当なタグ蛋 白質との融合蛋白質として発現させることにより、 これらタグ蛋白質に特異的な 抗体を用いてウェスタンブロット法、 あるいは免疫沈降法により本発明のポリべ プチドを検出、 タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。 より具体的には以 下のようにしてタグ蛋白質を利用して精製することができる。
本発明のポリペプチド （例えば、 配列番号 2又は配列番号 4で表されるポリぺプ チド） は、 本発明のポリヌクレオチド （例えば、 配列番号 1及び 3で示されるポリ ヌクレオチド） を例えば Hi sタグが融合されるベクター、 より具体的には例えば 実施例 1に記載の PGDNA3. 1/V5- Hi s- T0P0 (インビトロジェン社） 等に組み込むこ とで培養細胞に発現させ、 H i sタグを用いて精製した後でタグ部分を除去すること によリ得ることができる。 例えば実施例 1あるいは実施例 5において pcDNA3. 1/V5- His - TOPOを用いて作製したマウスあるいはヒ卜の ΑΚΒΡ2発現プラスミドは、 いず れも ΑΚΒΡ2の G-末端に V5および Hisタグが付加されるように設計されている。 これ により、 それらの Hisタグを利用して、 実施例 2あるいは実施例 5に示した AKBP2を 発現させた培養細胞から AKBP2蛋白質を精製することができる。 具体的には公知 の方法 （実験医学別冊 タンパク質の分子間相互作用実験法、 1996年 32頁 中原 ら） に従って、 破砕した細胞の抽出液より Hisタグと融合した AKBP2蛋白質を Ni2+- NTA - Agarose (フナコシ） に結合させて遠心分離により単離することができる。 より具体的には培養フラスコ （例えば 10cm径のシャーレ） に培養させた本発明の ポリペプチド発現細胞を適当な量の緩衝液 （例えば、 1 ml) を加えて搔き取った 後、 毎分 15000回転で 5分間の遠心分離によって上清を分離し、適当な緩衝液で置 換した適量 （例えば 50j«M) の Ni2+- NTA-Agaroseを加えて十分に混合する （例えば、 ローテ一ターで 10分以上攪拌する） ことができる。 続いて遠心分離 (例えば毎分 2000回転で 2分間）によリ上清を分離して除去し、 pHを 6.8にした緩衝液を適量 (例 えば 0.5 ml)加えて再度遠心分離することにより洗浄する。 これを 3回繰り返した 後適量 （例えば 50JLH) の 100mM EDTAを加えて 10分置き、上清を回収することに よリ遊離した本発明のポリぺプチドを精製することができる。 上記緩衝液として は、 例えば緩衝液 B (8 Urea, 0.1M Na2HP04, 0.1 NaH2P04, 0.01M Tris-HCI pH8.0) を用いることができる。 精製した蛋白質分子中の Hisタグは、 例えば N末 端がわに Hisタグを融合させる様設計することにより TAGZyme System (キアゲン 社） を用いることで分子中から除去することができる。
あるいは所望により、タグ蛋白質を利用しない方法、 例えば、 本発明のポリべ プチドからなる蛋白質の物理的性質、 化学的性質を利用した各種の分離操作によ つても精製できる。具体的には限外濾過、 遠心分離、 ゲル濾過、吸着クロマトグラ フィ一、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 高 速液体クロマトグラフィ一の利用を例示することが出来る。
本発明のポリぺプチドは、 配列番号 2又は配列番号 4に示すアミノ酸配列情報 に従って、 一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、 及び固相法によるべプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を 1個ずつ逐次結 合させても、 数アミノ酸からなるぺプチド断片を合成した後に結合させてもよい。 これらの手段により得られる本発明ポリべプチドは前記した各種の方法に従って 精製を行うことが出来る。
<糖尿病の検査方法 >
本発明のポリヌクレオチドにストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする プローブを用いることにより、 本発明のポリべプチドをコードするポリヌクレオ チドの発現量を調べることができ、 その発現量 （好ましくは脂肪組織における発 現量） の増加を指標として糖尿病の診断をすることができる。 糖尿病の検査方法 において、 「ストリンジェン卜な条件」 とは、 非特異的な結合が起こらない条件 を意味し、 具体的には、 0. 1 %ラウリル硫酸ナトリウム (SDS)を含有する
0. 1 SSC (Sa l i ne-sod i um c i trate buffer)溶液を使用し、 温度が 65°Cである条件 を意味する。 プローブとしては、 本発明のポリヌクレオチドの少なくとも一部若 しくは全部の配列 （またはその相補配列) を有し、 少なくとも 15bpの鎖長の DNA が用いられる。
糖尿病の検出方法では、 上述のプローブと試験試料とを接触させ、 本発明のポ リペプチドをコードするポリヌクレオチド （例えば、 mRNA又はそれ由来の cDNA) と前記プローブとの結合体を、 公知の分析方法 （例えば、 ノザンブロッテイング ) で分析することにより、 糖尿病であるか否かを検出することができる。 また、 上述のプローブを DNAチップに適用し、 発現量を分析することもできる。 前記結 合体の量、 すなわち、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの量 が、 健常人に比べて増加している場合には、 糖尿病であると判定することができ る。
本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する方法として、 発現レベルを 本発明のポリべプチドの検出によって測定する方法が可能である。 このような検 査方法としては、 例えば、 試験試料を本発明のポリペプチドに結合する抗体、 好 ましくは、 本発明のポリべプチドに特異的に結合する抗体を利用したウェスタン ブロッテイング、 免疫沈降法、 EL I SA法などを利用することが出来る。 試験試料 中に含まれる本発明のポリぺプチドの量を定量する際、 本発明のポリべプチドを 標準量として利用することができる。 また、 本発明のポリペプチドは本発明のポ リベプチドに結合する抗体を作製するために有用である。 本発明のポリべプチド の量が健常人に比べて増加している場合には、 糖尿病であると判定することがで きる。
<本発明のスクリーニングする方法 >
( 1 ) 本発明のポリべプチド、 （2) 配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミ ノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 Akt2と結 合するポリペプチド （以下、 相同ポリペプチドと称する） 、 あるいは （3) 配列 番号 1又は配列番号 3で表される塩基配列であるポリヌクレオチドとストリンジェ ン卜な条件でハイブリダィズするポリヌクレオチドによリコ一ドされるポリぺプ チドであって、 しかも、 Akt2に結合する蛋白質であるポリペプチド （以下、 ハイ ブリダィズポリペプチドと称する） を使用し、 前記ポリペプチド （即ち本発明の ポリペプチド、 相同ポリペプチド又はハイブリダィズポリペプチド） と Akt2キナ ーゼとの相互作用を利用してィンスリン抵抗性改善作用を有する物質及び 又は 糖代謝改善作用を有する物質 （即ち糖尿病改善薬） のスクリーニング方法を構築 できる。本発明のポリべプチド、 前記相同ポリべプチド及ぴ前記ハイブリダィズ ポリべプチドを総称して本発明のスクリーニング用ポリべプチドと称する。 本明細書における相同ポリべプチドは、 配列番号 2又は配列番号 4で表されるァ ミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 Akt2に 結合するポリペプチドである限り、 特に限定されるものではないが、 配列番号 2 又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列に関して、 好ましくは 95%以上、 更に好 ましくは 98<½以上め相同性を有するァミノ酸配列からなるポリぺプチドが好まし い。
なお、 本明細書における前記 「相同性」 とは、 Glustal program (Higgins and Sharp, Gene 73, 237-244, 1998； Thompson et al. Nucl. Acids Res. 22， 4673-4680, 1994)検索によりデフオル卜で用意されているパラメータを用いて得 られた値 （Identities) を意味する。 前記のパラメータは以下のとおりである。
Multiple Alignment Parametersとして、 Gap Penalty 15.00、 Gap Length Penalty 6.66、 Delay Divergent Seqs (%) 30、 DNA Transition Wei ht 0.50、 Pairwise Alignment Parametersとして、 Slow-Accurateで、 Gap Penalty 15.00、 Gap Length Penalty 6.66。
本明細書のハイブリダィズポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、 配 列番号 1又は配列番号 3で表される塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダ ィズする、 本明細書のハイブリダィズポリペプチド用の 「ストリンジェントな条 件」 としては、 ハイブリダィゼーシヨンのための条件として、 「5xSSPE、 5χ Denhard's液、 0.5% SDS、 40% ホルムアミド、 200 g/ml 鮭精子 DNA、 37°Cォ一 バーナイ 卜」 の条件であり、 より厳しい条件としては 「5xSSPE、 5xDenhard's液、 0.5% SDS、 50% ホルムアミド、 200/ g/ml 鮭精子 DNA、 42°Cオーバ一ナイト J の 条件である。 また洗浄のための条件として、 緩い条件としては 「5xSSG、 1% SDS、 42°C」 、 通常 「0.5xSSG、 0.1% SDS、 42°C」 の条件であり、 より厳しい条件とし ては 「0.2xSSG、 0.1% SDS、 65°C」 の条件である。
本発明のスクリーニングする方法には、 本発明のスクリーニング用ポリべプチ ドまたは本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現している細胞と試験物質 とを接触させる工程、 該ポリペプチドと Akt2との結合を測定する工程、 及び前記 結合を阻害する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリぺプチドと Akt2との結合阻害物質をスクリーニングする方法が含まれる。 本発明のスクリー ニング用ポリべプチドを発現している細胞は、 本発明のスクリーニング用ポリべ プチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換した細胞、 天然に存在する本発明のポリべプチドを発現している細胞何れでも良いが、 形質 転換した細胞が好ましい。
本発明のスクリーニンゲ用ポリべプチドの一つである AKBP2は Akt2と結合する こと、 糖尿病モデルマウスで発現が低下していること、 及びマウス AKBP2を過剰 発現させた脂肪細胞で Akt2活性が低下していることから、 本発明のポリぺプチド は Akt2との結合を介してインスリンシグナルを負に制御していることがわかつた。 従って、 上述のスクリ一二ングする方法によリィンスリン抵抗性改善薬及び 又 は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。
上述のスクリーニングする方法における本発明のスクリーニング用ポリぺプチ ドまたは本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現している細胞と Akt2との 結合を測定する工程は、 本発明のスクリーニング用ポリべプチドと Akt2との結合 を直接検出することによって実施でき、 また、 前記結合の変化による Akt2の変化 を測定することによつても実施できる。
本発明のスクリーニングする方法で使用す'る試験物質としては、 特に限定され るものではないが、 例えば、 市販の化合物 （ペプチドを含む） 、 ケミカルフアイ ルに登録されている種々の公知化合物 （ペプチドを含む） 、 コンビナトリアル ' ケミストリ一技術 (N. K. Terrett, M. Gardner, D. W. Gordon, R. J. Koby l eck i ,
J. Stee I e, Tetrahedron, 51 , 8135-73 (1995) )によって得られた化合物群、 微生物の 培養上清、 植物や海洋生物由来の天然成分、 動物組織抽出物、 あるいは、 本発明 のスクリーニング法により選択された化合物 （ペプチドを含む） を化学的又は生 物学的に修飾した化合物 （ペプチドを含む） を挙げるごとができる。
上記スクリーニングする方法として限定はされないが具体的には以下のスクリ 一二ング方法が挙げられる。
1 ) Akt2のリン酸化を利用したスクリーニング方法
Akt2は分子内のセリン 473番 (Ser473) あるいはスレオニン 308番 (Thr308) が リン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている （B i oGhem.
J. , 1998 335 (1-13) ) 。 これを利用し、 Akt2の Ser473又は Thr308のリン酸化状態 をこれらリン酸化残基に特異的に反応する抗体 （例えば抗 phosphoSer抗体等） を 用いたウェスタンブロットにより検出することで Akt2の活性の有無が検出できる。
本発明のスクリーニング用ポリぺプチドの一部あるいは全長域を発現してい る試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。 試験用細胞としてはィンスリン に応答する細胞が好ましく、 より具体的には脂肪細胞、 肝細胞、 あるいは骨格筋 由来細胞が好ましい。 試験物質を未処理又は処理した細胞を溶解し、 これを試料 として抗 phosphoSer抗体を用いるウェスタンブロッ卜法、 スポットウエスタンブ ロッ卜法などを利用することにより Akt2のリン酸化、 すなわち Akt2の活性の有無 を検出することができる。 好ましくは実施例 7の方法で検出することができる。 この検出系において、 試験物質 未処理の試料に比較して Akt2のリン酸化 （すな わち Akt2の活性化） の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のスクリー ニング用ポリべプチドと Akt2との結合を阻害する物質として選択することができ、 これによリィンスリン抵抗性改善薬及び Z又は糖代謝改善薬、 即ち糖尿病治療効 果を有する物質をスクリーニングすることができる。 このような物質としては、 該スクリーニング法における Akt2のリン酸化亢進作用の ED50が、 以下、 、好 ましくは 1 以下、 更に好ましくは 0. 1 ju M以下のものを選択することが好ましし、。
2 ) インビトロキナーゼ法を利用したスクリ一二ング法
ヒストン H2Bや GSK-3融合タンパク質などを Akt2の基質として Akt2の免疫沈降物 と反応させたときの、 基質に対する放射性リン酸の取リ込み量を測定するインビ トロキナーゼアツセィ法によっても Akt2活性を検出することができる。 具体的に は、 本発明のスクリーニング用ポリべプチドの一部あるいは全長域を発現してい る試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。 試験用細胞としてはィンスリン に応答する細胞が好ましく、 より具体的には脂肪細胞、 肝細胞、 あるいは骨格筋 由来細胞が好ましい。 前記細胞から抗 Akt2抗体を用いた免疫沈降により活性化し た Akt2蛋白質を濃縮することができる。 Akt2の基質、 例えば、 GST-crosst i de (Aktが生理的基質としている GSK3-beta配列の GST融合タンパク） と濃縮 Akt2蛋 白質とを混合することにより、 基質のリン酸化を指標として Akt2のキナーゼ活性 を測定及び定量化できる。 好ましくは実施例 7に記載の方法で測定することがで きる。 キナーゼ測定は、 トータルキナーゼアツセィ法 （Wagaら、
I國 uno l . Methods 190, pp71-77, 1996) を利用することにより大規模な数の化 合物のスクリーニング方法として使用が可能である。 この測定系において、 試験 物質を未処理の試料に比較して Akt2のキナーゼ活性の亢進が観察された試料に処 理した物質を本発明のスクリーニング用ポリぺプチドと Akt2との結合を阻害する 物質として選択することができ、 これによリィンスリン抵抗性改善薬及び Z又は 糖代謝改善薬、 即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることがで きる。 このような物質としては、 該スクリーニング法における Akt2のキナーゼ活 性亢進作用の ED50が、 10ju M以下、 、好ましくは 以下、 更に好ましくは 0. 1 M 以下のものを選択することが好ましい。 3 ) 本発明のスクリーニング用ポリペプチドと Akt2 との結合を利用したスクリ 一二ング方法
本発明のスクリーニング用ポリべプチドは Akt2との結合を介してインスリンシ グナルを負に制御していることから、 本発明のスクリーニング用ポリべプチドと Akt2との結合を指標とした以下のスクリーニング方法が挙げられる。 具体的には、 本発明のスクリーニング用ポリべプチドの一部あるいは全長域、 あるいは GSTや F l ag, H i sなどのタグを融合させた本発明のスクリーニング用ポリべプチドの一 部あるいは全長域を発現している試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。 試験用細胞としてはィンスリンに応答する細胞が好ましく、 よリ具体的には脂肪 細胞、 肝細胞、 あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。 前記細胞から抗 Akt2抗体を 用いた免疫沈降により Akt2蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができ る。 この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させ ておくことが望ましい。 得られた Akt2およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方 法によリポリアクリルァミドゲル電気泳動法によリ分離し、抗体を用いたウェス タンプロティングにより本発明のスクリーニング用ポリべプチドの量を測定する ことにより、 本発明のスクリーニング用ポリべプチドと Akt2の結合を阻害する試 験物質を選択することができる。 このような物質としては、 上記のスクリーニン グ方法において、 本発明のポリべプチドと Akt2との結合を阻害する作用の I G50が、 好ましくは 10 jw M以下、 好ましくは 以下、 更に好ましくは 0. 1 j« M以下のもの を選択することが好ましい。 ここで用いる抗体は、 本発明のスクリーニング用ポ リベプチド或いはその部分配列をもとに作製した本発明のスクリーニング用ポリ ペプチドに対する抗体 （例えば抗 AKBP2抗体） 、あるいは上記タグを認識する抗体 を利用することができる。
以上 1 ) 〜3 ) のスクリーニング方法においては、 試験用細胞にインスリンを 未刺激又は刺激して用いることができるが、 好ましくは試験用細胞にィンスリン 刺激して用いることができる。 また上述と同様に本発明のスクリーニング用ポリべプチドを発現している細胞 の抽出液またはインビ卜口で転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質 を添加あるいは未添加したものから、 GSTなどのタグをつけて精製した Akt2蛋白 質を用いた i n v i troのプルダウン法 （実験工学、 Vo l 13、 No. 6、 蘭年 528頁 松 七五三ら） と上述と同様のウェスタンブロッテイングを組み合わせるによっても Akt2と本発明のスクリーニング用ポリべプチドの結合を阻害する試験物質を選択 することができる。 好ましくは、 実施例 6に示すように本発明のスクリーニング 用ポリペプチドを発現するプラスミド （例えば、 実施例 1 (5) で作製した AKBP2 発現プラスミド） から直接本発明のポリペプチドからなる蛋白質 （例えば、 AKBP2蛋白質） をインビトロトランスレーシヨンキット （例えば TNTキット （プロ メガ社） ） を用いて i n v i troで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物 質を添加あるいは未添加したものを用いても同様に Akt2と本発明のスクリーニン グ用ポリべプチドの結合を阻害する試験物質を選択することができる。 これらの 方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウェ スタンブロッティングを行うことによリ多数の試験物質をスクリ一ニングするこ とが可能である。 また上述と同様のタグを融合させて発現させた本発明のスクリ 一二ング用ポリべプチドおよび Akt2を同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質 を添加することからなる公知の ELI SA法に従っても Akt2と本発明のスクリーニン グ用ポリべプチドの結合を阻害する試験物質を選択するスクリーニングが可能で ある。 また公知の哺乳類細胞におけるツーハイブリッドシステム （クロンテック 社） を利用して、ベイ トに GAL4の DNA結合領域と融合させた Akt2を、 プレイ側に VP16の転写促進領域を融合させた本発明のスクリーニング用ポリべプチドを配置 することにより、既存の GATあるいはルシフェラーゼ活性の検出により Akt2と本発 明のスクリーニング用ポリべプチドとの結合を阻害する試験物質を大多数の母集 団からスクリーニングし選択することが可能である。
<インスリン抵抗性改善用及び 又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法 > 本発明には、 本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、 及び製剤化する工程を含むことを特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善用医薬組成 物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、 前 記有効成分のタイプに応じて、 それらの製剤化に通常用いられる担体、 賦形剤、 及び Z又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 又 は経口用液剤などによる経口投与、 あるいは、 静注、 筋注、 若しくは関節注など の注射剤、 坐剤、 経皮投与剤、 又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げる ことができる。 特に胃で消化されるペプチドにあっては、 静注等の非経口投与が 好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、 少な くとも一つの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 微結晶 セルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 デンプン、 ポリビニルピロリ ドン、 又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。 前記組成 物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加剤、 例えば、 滑沢剤、 崩壊剤、 安定化剤、 又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。 錠剤又は 丸剤は、 必要によリ糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆す ることができる。
経口のための液体組成物は、 例えば、 乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 又はエリキシル剤を含むことができ、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例え ば、 精製水又はエタノールを含むことができる。 前記組成物は、 不活性な希釈剤 以外の添加剤、 例えば、 湿潤剤、 懸濁剤、 甘味剤、 芳香剤、 又は防腐剤を含有す ることができる。
非経口のための注射剤としては、 無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、 懸濁剤、 又は乳濁剤を含むことができる。 水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、 希釈剤として、 例えば、 注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。 非水溶性の溶 液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、 例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール、 植物油 （例えば、 ォリーブ油） 、 アルコール類 （例えば、 ェタノ ール） 、 又はポリソルベー卜 80等を含むことができる。 前記組成物は、 更に湿潤 剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶解若しくは溶解補助剤、 又は防腐剤などを含 むことができる。 前記組成物は、 例えば、 バクテリア保留フィルターを通す濾過、 殺菌剤の配合、 又は照射によって無菌化することができる。 また、 無菌の固体組 成物を製造し、 使用の際に、 無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、 使 用することもできる。
投与量は、 有効成分、 すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物 質の活性の強さ、 症状、 投与対象の年齢、 又は性別等を考慮して、 適宜決定する ことができる。
例えば、 経口投与の場合、 その投与量は、 通常、 成人 （体重 60kgとして） にお いて、 1日につき約 0. 1〜100mg、 チましくは 0. 1〜50mgである。 非経口投与の場 合、 注射剤の形では、 1日につき 0. 01〜50mg、 好ましくは 0. 01〜10mgである。
実施例
以下、 実施例によって本発明を詳述するが、 本発明は該実施例によって限定さ れるものではない。 なお、 特に断りがない場合は、 公知の方法（ riyio l ecu l ar C l on i ng Sambrook, Jら、 Co I d Spr i ng Harbor Laboratory Press、1989年」 、等）に 従って実施可能である。 また、 市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指 示書に従つて実施可能である。
<実施例 1 >マウス AKBP2遺伝子のクローニングと発現ベクターの構築
(1 ) Akt2遺伝子のクローニング
遺伝子データベース GenBankのァクセッション番号 M95936に記載されたヒト Akt2の全長領域をコ一ドする GDNA配列を参照して設計した配列番号 5及び配列番 号 6で示されるオリゴヌクレオチドをプライマ一とし、 ヒ卜骨格筋
cDNA (Marathon-Ready™ cDNA；クロンテック社）を錶型として、 DNAポリメラーゼ
(Pyrobest DNA Po l ymerase (宝酒造社） ） を用いて、 95°C3分間の熱変性反応の 後、 98°C 10秒間、 60°C 30秒間、 74°C 1分 30秒からなるサイクルを 40回、さらに 74°C 7分間の条件で、 PGRを行なった。これにより生成した約 1 . 5 kbpの DNA断片を、 ブラ スミド pZErO™-2. 1 (インビトロジェン社） の EGORV認識部位に挿入することによ リ、 ヒト Akt2 cDNAをクローニングした。 ベクタ一上にクローニングした Akt2 cDNAの配列は前述の配列番号 5及び配列番号 ρに示すォリゴヌクレオチドをプライ マーとして、 シ一ケンシングキット (アプライドバイオシステム社) 及びシーケ ンサー （ABI 3700 DMA sequencer アプライドバイオシステムズ社） を用いて塩 基配列を決定し、 報告された配列と一致することを確認した。
(2)酵母ツーハイブリツド用発現プラスミ ドの作製
ヒト Akt2の GDNAを酵母ツーハイブリッド用発現べクタ一 pDBt卬 （インビトロジ ェン社）に挿入するため、 ヒ卜 Akt2遺伝子配列のそれぞれ 5' 側及び 3' 側に
pDBtrpベクターのマルチクローニングサイ卜の前後 40ヌクレオチドと相同な領域 を付加した配列番号 7及び配列番号 8に示すプライマーを設計した。 PGRは上述でク ローニングしたヒ卜 Akt2プラスミドを錶型として、 DNAポリメラーゼ （Pyrobest DNA polymerase；宝酒造社) を用い、 98°C(1分）の後、 98°C(5秒）、 55°C(30秒）、 72°C(5分）のサイクルを 35回、 繰り返した。 その結果得られた DNA断片はヒト Akt2 遺伝子の全コード領域を有している。
制限酵素 Sa 11及び Ncolで切断して直鎖状にしたべクタ一 pDBtrp及び上記で得ら れたヒ卜 Akt2の GDNAを含む PGR断片を同時にッ一ハイプリッド用酵母株 MaV203
(インビトロジェン社） へ添加し、 リチウム酢酸法により形質転換した（Guthrie G. and Fink R. , Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic, San Diego, 1991年）。その結果同酵母細胞内で相同組換えが生じ、 pDBtrpのマル チクロ一ニングサイ卜に Akt2 GDNAが挿入されたプラスミド （以下 pDB- Akt2と略 称する） が形成された。 同プラスミドを有する酵母細胞を、 プラスミ ドの選択マ —カーであるトリプ卜ファンを欠乏させた固形合成最小培地 （DIFC0社） （20%ァ ガロース） 上にて培養することにより選択し、 同酵母細胞をザィモリエース （生 化学工業社） で 37°Cにて 30分処理した後、 アルカリ法でプラスミドを単離精製し、 シーケンシングキッ卜 (アプライドバイォシステム社) 及びシーケンサー (ABI 3700 DNA sequencer アプライドバイオシステムズ社） を用いて塩基配列の決定 を行い、 Akt2の GDNAが、 pDBtrpの GAL4 DNA結合領域のコード領域と翻訳フレーム がー致して挿入されているものを選択した。
(3)マウス脂肪組織由来 cDNAライブラリ一の作製
12週令ォスの C57BL/6Jマウス、 及び 13週令ォスの C57BL/Ks J- +m/+mマウスを 日本クレアより購入し、 副睾丸脂肪から実験医学別冊 バイオマニュアルシリ一 ズ 2 遺伝子ライブラリ一作製法 （羊土社 野島博 編集； 1994 年 2 月 20 曰発 行） に記載の mRNA調製法に従い、 Poly(A)+RNAを調製した。 ストラタジーン社の ZAP-cDNA Synthesis Kit を用いて、 添付のプロトコールに従い、 5 g の RNA を 用いて第 1ストランド合成、 第 2ストランド合成を行い、 2本鎖 GDNAを平滑末端 化し、 キッ卜に添付の EcoRIアダプターを連結し、 制限酵素 EGORI、 及び Xholで 切断した。 スピンカラム （CHROMA SPIN- 400； クロンテック社） によリサイズ分 画を行い、 短い断片を除いた。 ベクター PAGT2 (クロンテック社） 100 jug を制限 酵素 Xhol で切断し、 アルカ リ フォスファターゼ （Bacterial Alkal ine Phosphatase； 宝酒造社） で処理した後、 制限酵素 EGORI で切断し、 スピンカラ ム （CHROMA SPIN-1000； クロンテック社） にかけた。 実験医学別冊 バイオマ二 ュアルシリーズ 2 遺伝子ライブラリ一作製法 （羊土社 野島博 編集； 1994年 2 月 20 日発行） の cDNAライブラリ一作製法に従い、 ベクターと GDNAを連結し、 連結後のサンプルをミリポア社のフィルターカップ （UFGP3TK50) で処理した。 ギブコ BRL社のエレクトロポレーシヨン用大腸菌 （ElectroMAX™ DH10B™Cel Is) を用いて、 エレクトロボレ一シヨン法による形質転換を行い、 1000ml の培養液で 一晩振盪培養した。 培養液中に独立コロニーが 106個以上であることを確認し、 プラスミ ド精製キット （Qiagen Plasmid Kit；キアゲン社） を用いて、 キッ卜に 添付のプロトコールに従い、 プラスミドを精製した。
(4)酵母ツーハイプリッドスクリーニング
上述の pDB- Akt2によリ形質転換したツーハイプリッド用酵母株 MaV203を 400mlの YPD液体培地 (DIFG0社）に懸濁し、波長 590ナノメ一トルの吸光度が 0.1から 0.4にな るまで 30°Cで約 6時間振とう培養した後、 リチウム酢酸法でコンビテントセルと し、 最終量を 1.0mlの 0.1M リチウム-トリス緩衝液に懸濁した。同細胞を前述 (3) で作製したマウス脂肪組織由来 GDNAライブラリ一各 20 gで形質転換し、 同細胞 を pDB-Akt2及びライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプ トフアン、 ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地 （DIFG0社） （20%ァガロー ス） 上にて培養することにより選別し、 両プラスミドが導入された形質転換株を 得た。 同時に同じ形質転換細胞をトリブトファン、 ロイシンのほかに、 ツーハイ プリッドシステムにおいて人工的に発現させた GAL4 DNA結合領域の融合蛋白質 に、 GAL4 転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝 子 //^作動した細胞を選択するため、 ヒスチジンを培地から除き、 さらに HIS3 がコードする酵素の阻害剤である 3AT (3-AM I NO - 1 , 2, 4-TR I AZ0LE； シグマ社) 20mM を添加した固形最小培地 （20%ァガロース） 上で 30°Cにて 5日間培養した。 同条 件下で Akt2に結合する蛋白質を発現していることを示す 3AT耐性の酵母のコロニ 一を取得した。 これらの酵母細胞を 24時間 YPD固形培地上で成長させた後、/〃 と は別のツーハイプリッド システムの結合指示レポ一ターである 遺伝子の発 現を) 8 -ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。 ）3 -ガラクトシダーゼ活性は 培地上の酵母細胞を二トロセルロースフィルタ一に移し取リ、液体窒素中で凍結 させた後、 室温で解凍し、 フィルタ一を 0. 4%の X-GAL (シグマ社)溶液を浸した濾 紙上にのせて 37°Cで 24時間静置し、 yS -ガラクトシダ一ゼによる青色変化を測定 した。フィルタ一上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニー を選択することにより、 Akt2に結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、 同細胞からクロンテック社 Yeast Protoco l s Handbookの方法に従ってライブラリ 一由来のプラスミドを抽出した。 そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、 配列 番号 9で表される塩基配列 （GAL4 AD領域に結合する配列； GenBankァクセッショ ン番号 U29899 C l on i ng vector pACT2 由来） をプライマーとし、 シ一ケンシン グキット （アプライドバイオシステム社） 及びシーケンサー （AB I 3700 DNA sequencer アプライドバイオシステムズ社） を用いて決定した結果、 配列番号 1 に示す塩基配列が含まれていることを確認した。
(5)マウス AKBP2遺伝子の開始コドンの決定
前述 (4)の結果、 配列番号 1で表される塩基配列を含む遺伝子断片を持ったライ ブラリー由来のプラスミドが得られた。 そこで該断片に含まれる遺伝子の開始コ ドンを決定するために、 配列番号 1で示された塩基配列の第 1034番から第 101 1番 の塩基配列の相補鎖に相当する配列番号 10で表される塩基配列のプライマーを合 成 （プロリゴ社） し、該プライマーと前述配列番号 9で表される塩基配列のプライ マ一を用いて前述の脂肪組織由来 GDNAライブラリー中から PCR法によリ該遺伝子 の発現産物由来の全長 GDNAの増幅を試みた。 PGR反応は DMAポリメラーゼ （TAKARA LA Taq ;宝酒造社) を用い、 94°C (3分)の後、 94°C (30秒） ' 58°C (1 . 5分） ■ 72°C (4分） のサイクルを 35回繰リ返した。 反応液中の同 DMA断片を発現べクタ一 (pcDNA3.1/V5- His- TOPO;インビトロジ: Lン社） に TOPO TA Clonin システム (インビトロジェン社） を用いてクロ一ニングした。 得られたプラスミド中の揷 入 DMA断片の塩基配列を、 ベクター上の T7プロモーター領域に結合するプライマ 一 (TOPO TA Cloning kit；インビトロジェン社；配列番号 11) とシ一ゲンシン グキッ卜 （アプライドバイオシステム社） 及びシーケンサ一 (ABI 3700 DNA sequencer；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。 その結果、 該遺 伝子の配列を有する様々な長さの cDNAを含むプラスミドが得られたが、 最長の GDNAはいずれも前述 (4)で得られた転写産物由来の GDNAとほぼ同等の鎖長であつ た。数度の試行でも同じ結果であったことから、該遺伝子の転写産物の鎖長および 配列は (4)で得られた GDNAとほぼ一致することがわかつた。 これによリ配列番号 1 に示す塩基配列の初めにある ATGが該遺伝子の開始コドンであるとわかり、 配列 番号 1に示す該遺伝子のオープンリ一ディングフレームを確定した。この遺伝子を マウス AKBP2遺伝子と名付けた。
(6)マウス AKBP2発現ベクターの作製
前述 (4)の結果、 配列番号 1で表される塩基配列の 長を含む遺伝子断片を持つ たライブラリー由来のプラスミドが得られ、 Akt2に結合する因子の存在が示され た。 また前述 (5)においてそのオープンリーディングフレームが確定した。 そこ で配列番号 1に示す塩基配列情報に従い、 配列番号 12及び配列番号 13に示すブラ イマ一を合成 （プロリゴ社） し、 該プライマーを用いて、正味 AKBP2蛋白質をコー ドする AKBP2 GDNAを前述の (4)で得られたプラスミドを錶型として PGR法により増 幅した。これら 2種類の DNAプライマーはそれぞれ配列番号 1が示すマウス AKBP2遺 伝子の 5' 側、 3' 側の部分配列と相同な塩基配列を有する。 PGR反応は DNAポリメラ ーゼ (Pyrobest DNA Polymerase；宝酒造社） を用い、 98°C(1分）の後、 98°C(5秒）、 55°C(30秒）、 72°C (5分）のサイクルを 35回繰り返した。 PGR産物をァガロースゲル 電気泳動によって分離した結果、 約 1.7kbpの DNA断片が増幅されたことを確認し た。 そこで反応液中の同 DMA断片を発現ベクター （pcDNA3.1/V5-His- T0P0;インビ 卜ロジェン社） に T0P0 TA Clonin システム （インビトロジェン社） を用いてサ ブクローニングした。 このとき用いた配列番号 13に示すプライマーはクローニン グ後 3' 側にベクター由来の V5ェピ！ ^一プ （paramyxovirus SV5の V protein由来、 Southern J A, J. Gen. Virol.72, 1551-1557,1991) 及び Hi s6タグ (Lindner P B i oTechn i ques22, 140-149， 1997)がマゥス AKBP2遺伝子のトリプレットと同じフレ —ムで続くように、 AKBP2のストップコドン配列が除かれるよう設計した。得られ たプラスミド中の挿入 DNA断片の塩基配列を、 ベクタ一上の T7プロモーター領域 に結合するプライマー （T0P0 TA Cloning kit；インビトロジェン社；配列番号 11) とシーケンシングキッ卜 (アプライドバイオシステム社) 及びシーケンサー (ABI 3700 DNA sequencer；アプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。 その結果、 配列番号 1に示す正味 AKBP2蛋白質をコードする 1719塩基対の 1(8?2
GDNAが DNA配列の 3' 側のストップコドンを除いた DNAとして前述の発現ベクター PGDNA3.1/V5-His - T0P0に挿入されていることを確認した。 以下この発現プラスミ ドを PGDNA-AKBP2と略記する。
<実施例 2> AKBP2蛋白質を発現する培養細胞の作製
( AKBP2発現細胞の作製
上述の実施例 1 (5)で作製した発現プラスミ ド PGDMA-AKBP2又は空べクタ一
(pcDNA3.1/V5-His-T0PO) を 293細胞（セルバンク社）に導入した。 293細胞は 6ゥェ ル培養プレート （ゥヱル直径 35画） の培養皿に各ゥヱル 2mlの 10%牛胎児血清 （シ グマ社） を含む最少必須培地 DMEM (ギブコ社） を加えて 70%コンフルェントの状 態になるまで培養した。 この細胞にリン酸カルシウム法（Graham et al.,
Virology, 52,456， 1973、新井直子、遺伝子導入と発現/解析法 13- 15頁 1994年）によ リ pcDNA - AKBP2(3.0j«g/ゥェル）を一過性に導入した。 30時間培養した後、 培地を 除去し、 細胞をリン酸緩衝液 （以下 PBSと略称する） で洗浄した後にゥエルあた リ 0.1 mlの細胞溶解液（100mM リン酸カリウム (pH7.8)、 0.2° /。トリ トン X - 100)を添 加して細胞を溶解した。
(2)AKBP2蛋白質の検出
上述実施例 2 (1)の AKBP2発現細胞の溶解液 10 Iに 10ju Iの 2倍濃度 SDSサンプル バッファー（125mM 卜リス塩酸 (pH6.8)、3%ラウリル硫酸ナトリウム、 20% グリセ リン、 0.14M )8-メルカプトエタノール、 0.02%ブロムフエノールブルー）を添加 し、 100°Cで 2分間処理した後、 10%の SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行し、、 試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッテイング装置 （バ ィォラッド社） を用いてポリアクリルアミドゲル中の蛋白質をニトロセルロース 膜に転写した後、常法に従いウェスタンブロッテイング法にょリ該ニトロセル口 ース上の AKBP2蛋白質の検出を行った。一次抗体には AKBP2の C末端に融合させた V5 ェピトープを認識するモノクローナル抗体 （インビトロジェン社） を用い、二次 抗体にはマウス IgG-HRP融合抗体 （バイオラッド社） を用いた。その結果、図 1に 示す通リ、 45ァミノ酸からなる C末端側のタグを含む 618ァミノ酸からなる AKBP2- V5-His6融合蛋白質を示す約 70kDaの蛋白質が発現ベクター PGDNA-AKBP2の遺伝子 導入に依存して検出されることを確認した。これにより、 培養細胞中でクロー二 . ングした前述のマウス AKBP2遺伝子は全長領域が確かに発現し、 蛋白質として安 定な構造をとりうることが明らかになった。
<実施例 3 >正常マウス、 高脂肪食負荷正常マウス、 および糖尿病モデルマウ スにおける AKBP2発現量の測定
上述の知見により本発明のマウス AKBP2蛋白質は Akt2と結合し、 脂肪、 筋肉な どのィンスリン応答組織で発現していることが判明した。 Akt2蛋白質はィンスリ ンシグナル第一経路に作用する因子であることから、 本発明の AKBP2の作用がィ ンスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで 2型糖尿病モデルマウス KKAy /Ta (Iwatsuka et al. Endocrinol. Japon. ■' 17, 23-35, 1970、 Taketomi et al. Horm. etab. Res., 7, 242 - 246， 1975)および通常食もしくは高脂肪食を与えた 健常マウス G57BL/6Jの筋肉および脂肪における AKBP2遺伝子のメッセンジャー RNA (ITIRNA)発現量を測定した。
遺伝子発現量は、 本発明のマウス AKBP2遺伝子の発現量を測定し、同時に測定し たグリセルアルデヒド 3-リン酸脱水素酵素 （Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH)) 遺伝子の発現量により補正した。測定系としては PRISM ™ 7700 Sequence Detection Systemと SYBR Green PGR Master Mix (アプライド バイオシステムズ社） を用いた。 本測定系においては PGRで増幅された 2本鎖 DNAがとリこむ SYBR Green I色素の蛍光量をリアルタイムに検出■定量すること により、 目的とする遺伝子の発現量が決定される。 具体的には、 以下の手順により測定した。
(1 ) 全 RNA (tota l RNA)の調製
通常食又は高脂肪食負荷した 14週齢のォスの G57BL/6Jマウス、 並びに 15週齢 のォスの G57BL/6Jマウス及び KKAy /Taマウス （いずれも日本クレア社） を使用 した。 高脂肪食負荷は 5週齢から 14週齢までの 9週間行った。 高脂肪食の組成 は次の通りである； カゼイン 29. 8%、 スクロース 15. 8%、 ビタミンミックス 1. 3%、 ミネラルミックス 8. 8%、 セルロースパウダー 5· 0%、 メチォニン 0. 5%、 サフラワーオイル 28. 9%、 水 10%。 一方、 正常食は GE-2 (日本クレア社） を用 いた。 前記各マウスの筋肉および脂肪を摘出し、 RNA抽出用試薬 （I sogen ;ニッ ボンジーン社） を用いて、 説明書に従い全 RNA を調製した。 調製した各々の全 RNA はその後デォキシリボヌクレアーゼ （二ツボンジーン社） を用いて処理し、 フエノ一ル ク口口ホルム処理、 ェタノール沈殿して滅菌水に溶解し- 20°Cで保 存した。
(2) 1本鎖 cDNAの合成
全 RNAから 1本鎖 cDNAへの逆転写は、 （1 ) で調製した 1 ju gの RNA (脂肪） 、 1〃gの RNA (14週齢のマウスの筋肉） 、 0. 25 i gの RNA (15週齢のマウスの筋 肉） をそれぞれ用い、 逆転写反応用キッ卜 （Advantage™ RT-for-PCR Ki t；クロ ンテック社） を用いて 20 Iの系で行った。 逆転写後、 滅菌水 180 I を加えて - 20°Cで保存した。
(3) PCRプライマーの作製
4つのオリゴヌクレオチド (配列番号 14-配列番号 17) を （4 ) の項で述べる PGRのプライマーとして設計した。 マウス AKBP2遺伝子に対しては配列番号 14と 配列番号 15の組合せ、 G3PDH遺伝子に対しては配列番号 1.6と配列番号 17の組み 合わせで使用した。
(4) 遺伝子発現量の測定
PRI SM™ 7700 Sequence Detect i on Systemによる PCR増幅のリアルタイム測定 は 25 / I の系で説明書に従って行った。 各系において 1本鎖 cDNA は 5 し 2xSYBR Green試薬を 12. 5 し 各プライマーは 7. 5pmo l使用した。 ここで 1本鎖 cDNAは (2)で保存したものを G3PDHに関しては 30倍希釈、 マウス AKBP2に関して は 1 0倍希釈して使用した。 なお検量線作成には、 1 本鎖 GDNAに代えて 0.
μ I のマウスゲノム DMA (クロンテック社）を適当に希釈したものを 5 I 用いた PGRは、 50°Cで 10分に続いて 95°Cで 10分の後、 95°Cで 15秒、 60°Cで 60秒の 2 ステップからなる工程を 45サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウス AKBP2遺伝子の発現量は、 下記式に基づいて G3PDH遺伝 子の発現量で補正した。
[AKBP2補正発現量： l=[AKBP2遺伝子の発現量 （生データ） ] Z [G3PDH遺伝子の発 現量 （生データ） ] ,
脂肪における発現量の比較においては通常食の C57BL/6Jマウスの発現量を、筋 肉組織における発現量の比較においては G57BL/6Jマウスの発現量を、それぞれ 1 とした相対量を図 2に示した b
図 2に示す通り、 高脂肪食負荷時の脂肪および筋肉、 または糖尿病モデルマウ スの脂肪および筋肉において、 本発明のマウス AKBP2遺伝子の発現は顕著に増加 していることが判明した。従って本発明のマウス AKBP2 は脂肪および筋肉におけ る発現量亢進によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことから ィンスリン抵抗性に本発明のマウス AKBP2の関与が大きいと結論づけられる。 また本実施例の結果より、 マウス AKBP2発現量の測定により糖尿病病態の診断 が出来ることが明らかとなった。
<実施例 4 > ヒト AKBP2遺伝子のクローニング、 および組織別発現分布解析 ヒト脂肪由来 GDNAライブラリー （クロンテック社） を錶型とし、 配列番号 1 8及 び配列番号 1 9に示す一対のプライマーを用いて、 前述の実施例 1 (5)に示したもの と同様の PGR法により、 AKBP2ヒトオルソログ遺伝子全長 GDNAの増幅を試みた。そ の結果得られた約 1. 8kbpの DNA断片を、 実施例 1に示したものと同様の方法に従い 塩基配列を決定したところ、 配列番号 3に示す遺伝子の全長 GDNAが含まれること を確認した。該遺伝子 GDNAは配列番号 4に示すポリべプチドをコ一ドする新規の遺 伝子である。 該遺伝子は配列番号 1に示すマウス AKBP2遺伝子と 76. 8%、 コードす るポリべプチドは配列番号 2に示すマウス AKBP2蛋白質と 71. 3<½の相同性をそれぞ れ有している AKBP2のヒトオルソログ遺伝子である。 そこで次に該ヒト AKBP2遺伝子の配列をもとに、 配列番号 20に示すプライマ一を 設計し、 これと前述配列番号 19に示すプライマーを用いて、 ヒト AKBP2遺伝子の 3' 末端側約 800塩基の GDNA断片を、 ヒト各種組織由来 GDNAから PCR反応を用いて 増幅を試み、各種組織における AKBP2の発現の有無を調べた。ヒ卜の各種組織 GDNA ライブラリ一 （クロンテック社） 各 2 i gを錶型として PCR反応は DNAポリメラーゼ
(Pyrobest DNA Po l ymerase；宝酒造社） を用い、 98°C (1分）の後、 98°C (5秒）、 55°C (30秒）、 72°C (5分）のサイクルを 35回繰り返した。 得られた PGR産物をァガロ ースゲル電気泳動によって分離した結果、 骨格筋、 肝臓、 脂肪由来の各 cDNAライ ブラリーから所望するヒト AKBP2遺伝子の 3' 末端側部分配列を含むと思われる約 800塩基対の DNA断片が増幅された。 これらの DMA断片を各々ァガ口一スゲル中か ら分離した後、 上述の実施例 1 (4)に記した方法に従い配列番号 20に示すプライ マーを用いて該 DNA断片の塩基配列をそれぞれ決定した結果、配列番号 3に示すヒ 卜 AKBP2遺伝子の 3' 末端側の部分配列であることを確認した。このことから、ヒト AKBP2遺伝子の発現は、 インスリンシグナルに応答する脂肪、 筋肉、 肝臓などの 限定された臓器で特異的に制御されていることが判明した。
本実施例の結果、 ヒト AKBP2はマウス AKBP2と相同性が高く、 さらにインスリン 応答性組織で発現が観察されることから、 マウスと同様の機能を有しており、糖 尿病診断、糖尿病改善薬のスクリーニングに有用であることが明らかになった。
<実施例 5 > ヒト AKBP2蛋白質を発現する培養細胞の作製
前述の実施例 4で得られたヒト AKBP2遺伝子の全長 cDNAを前述の実施例 1 (6) に示したものと同様の方法でサブクローニングした。 そして配列番号 3に示す正 味ヒト AKBP2蛋白質をコードする 1782塩基対のヒト AKBP2 cDNAが DNA配列の 3' 側のストップコドンを除いた DNA として前述の発現ベクター PGDNA3. 1/V5- H i s-TOPO に挿入されていることを確認した。 以下この発現プラスミドを pcDNA- human AKBP2 と略記する。この発現プラスミド pcDNA-human AKBP2 を実施例 2 (1 ) と同様の方法でゥエルあたり 5. 1 8導入し、 ヒト AKBP2 タンパク質の発現を実 施例 2 (2)の方法に従って検出した。 その結果、 45アミノ酸からなる G末端側のタ グを含む 638アミノ酸からなるヒト AKBP2-V5 - H i s6融合蛋白質を示す約 70kDaの 蛋白質が発現ベクター pcDNA- human AKBP2の遺伝子導入に依存して検出されるこ とを確認し、 クローニングした前述のヒト AKBP2遺伝子は培養細胞中で全長領域 が確かに発現し、 蛋白質として安定な構造をとりうることが明らかになった。
<実施例 6>ヒ卜 AKBP2と Akt2の相互作用の検証
(1)GST融合 Akt2発現プラスミドの作製
ヒト Akt2の GDNAを GST融合発現べクタ一 pGEX- 3X (アマシャムバイオサイエンス 社）に挿入するため、 実施例 1 (1 ) で得られたヒト Akt2の cDMAを制限酵素
Hindi 11及び EGOR Iで、 ベクター pGEX- 3Xを制限酵素 BamH I及び EcoR Iでそれぞれ 切断し、 直鎖状にした。 また配列番号 21及び配列番号 22に示す断片をこれらの連 結用断片として用いるために、 前処理として各々 60°Cで 30分間処理した後混合し、 室温で 2時間放置した。 これら処理済みのヒト Akt2 GDNA断片、 ベクター pGEX-3X 及び連結用断片を混合したものを DNA に igase液 （DNA ligation kit II； 宝酒造 社） と混合して 16°Cで 3時間処理し、 pGEX-3Xのマルチクローニングサイ 卜に Akt2 GDNAが挿入されたプラスミド （以下 pGEX-Akt2と略称する） を作製した。 配列番 号 23に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 シ一ケンシングキット （ァ プライドバイオシステム社） 及びシーケンサー （ABI 3700 DNA sequencer アブ ライドバイォシステムズ社) を用いて塩基配列の決定を行い、 Akt2の GDNAのコー ド領域と pGEXベクターの GSTタグ翻訳フレームが一致して挿入されているものを 選択した。
(2)GST融合 Akt2タンパク質の精製
上述の （1) で得られたプラスミド pGEX- Akt2を大腸菌 BL21を用いて、 heat shock法による形質転換を行い、 2.4 mLの培養液で一晩振盪培養した後、 その全 量を 400 mL培養液に移し変え、 37°Cで 3時間振盪培養した後、最終濃度が 2.5 mM となるように IPTG (SIGMA) を添加し、 更に 3時間振盪培養して GST融合 Akt2蛋白 質 （以下 GST- Akt2と略記する） の発現を誘導した。 菌体を回収し、 公知の方法
(実験工学、 VoM3、 No.6、 1994年 528頁 松七五三ら） に従って GST- Akt2をダル タチオンセファロ一スビーズ （Glutathione Sepharose 4B；アマシャム 'フアル マシア社） 上に精製した。 コントロールとして pGEX - 3Xで形質転換した大腸菌 BL21から GST部分のみの蛋白質 （以下 GST蛋白質と略記する） を上述と同様に発現 誘導して精製した。 公知の方法に従って SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法 による分離及びクーマジープリリアントブルー染色を行い、 期待される分子量の 蛋白質 （GST - Akt2； 79kDa、GST蛋白質； 26kDa) が精製されていることを確認し た。
(3)Akt2蛋白質とヒト AKBP2蛋白質との生化学的結合の確認
上述 （2) で作製した GST融合 Akt2蛋白質 （以下 GST-Akt2と略記する） を用いて、 ヒト AKBP2蛋白質と Akt2蛋白質の直接の相互作用の有無を GST- pul l down法 （実験 工学、 Vol 13、 No.6、 1994年 528頁 松七五三ら） によって確認した。 まず上述実 施例 5で作製した pcDNA - human AKBP2の 0, 5 gを錶型として TNT kit (TNTRQuick Coupled Transcription/Translation System;プロメガ社） 40〃 Iおよびラジオァ イソトープ （redivue Pro-mix L-[35S] ；アマシャム） 1.3 MBqを用いて添付のプ 口トコールに従い in Vは roでの転写 '翻訳によリラジオアイソ I ^一プラベルされ たヒ卜 AKBP2蛋白質を調製した。 このヒト AKBP2蛋白質調製液各 15 Iと上述 （2) でグルタチオンビーズ上に精製した GST蛋白質あるいは GST - Akt2各 1 jugを混合し、 0.3 mlの Buffer A (50mMトリス塩酸 (pH7.5) 、 10%グリセロール、 120mM NaGし 1mM EDTA、 0.1n EGTA、 0.5mM PMSF、 0.5%NP-40) を添加して 4°Cで 1時間振盪し た。 その後遠心分離によりビーズ上の GST蛋白質あるいは GST-Akt2に結合する蛋 白質を共沈殿させた。 これを上述の Buffer Aの NaGI濃度を 100mM【こ置換した緩衝 液 0.5 mlでけん濁し、 再度遠心分離により共沈殿させた。 この操作を 4回繰り返 したのち、 沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従って SDSポリアクリルアミ ドゲル 電気泳動法により分離し、 オートラジオグラフィによリヒト AKBP2蛋白質を検出 した。 その結果、 GST蛋白質を混合した場合には検出されないバンドが GST-Akt2 を混合した場合に検出された。 これにより、本発明のポリべプチドの一つである ヒ卜 AKBP2は、 本発明のマウス AKBP2と同様に Akt2蛋白質と相互作用することが明 らかになリ、これらヒ卜、 マウスの AKBP2は両動物種で互いに同一の機能を担う力 ゥンターパートであることが裏付けられた。 従って本発明のヒト AKBP2は、 本発 明のマウス AKBP2と同様に Akt2蛋白質との相互作用を介してインスリン抵抗性の 惹起に関与することがわかった。 く実施例 7>NIH3T3 L1脂肪細胞におけるマウス AKBP2過剰発現による Akt2キナ ーゼ活性への影響
上述の酵母ツーハイブリッ ド及び生化学的結合の解析の結果から、 Akt2 と AKBP2 が相互作用することが示された。 そこで、 AKBP2 が Akt2 の酵素 （キナー ゼ） 活性にどのような影響を及ぼすか、 培養細胞 NIH3T3 L1 を用いたインビトロ キナーゼァッセィで調査した。
(1 ) インビトロキナーゼアツセィ用基質 GST— crosstideの調製
Akt2の生理的基質である GSK3)8のリン酸化部位をコードする配列番号 24およ び配列番号 25に示した合成ォリゴ DNAを混合し、 pGEX- 6P-1 ベクターの EGORし Xhol サイ卜に組み換えた。 これを pGST— crosstide とした。 プラスミド pGST— crosstide を大腸菌 BL21 を用いて、 heat shock 法による形質転換を行い、 2.4 mLの培養液で一晚振盪培養した後、 その全量を 400 mL培養液に移し変え、 37°C で 3時間振盪培養した後、最終濃度が 2.5 ir となるように IPTG (SIGMA社） を添 加し、 更に 3時間振盪培養して GST融合蛋白質 （以下 GST— crosstide と略記す る） の発現を誘導した。 菌体を回収し、 公知の方法 （実験工学、 Vol13、 No.6、 1994年 528頁 松七五三ら） に従って GST— crosstideをグルタチオンセフアロー スビーズ （Glutathione Sepharose 4B； アマシャム'フアルマシア社） 上に精製 した。 精製したこれらの蛋白質は、 公知の方法に従って SDSポリアクリルアミド ゲル電気泳動法による分離と、クーマジープリリアントブル一染色により GST- crosstide蛋白質が精製されていることを確認した。
(2) アデノウイルスベクターを利用した AKBP2高発現ウィルスの作製
マウス AKBP2をコードする遺伝子断片を、 PGDNA-AKBP2ベクターよリ制限酵素 BamHし Sacl Iを用いて切り出し、 さらに Sacl Iおよび Notl切断断片をつくるリン カーオリゴ配列番号 26および配列番号 27を用いてアデノウイルスベクター
pAdTrack-G V (ジョンズホプキンス癌センターよ 入手） のマルチクロ一ニング サイト (88111ぉょび1^01:1) に挿入し、 AKBP2/pAdTrack - CMVベクタ一を得た。 以下、 公知のプロ卜コール [ "A Practical Guide for using the AdEasy System" ] (HYPERし I NK "http： //www. GO I oncancer. org/adeasy. htm"
"http://www. coloncanGer.org/adeasy/protocol2.htm，， ) ] に従 Ι 、 AKBP2を発 現する高力価アデノウイルス液の調製を行った。 コントロール用アデノウイルス は、 pAdTrack-GMVより調製した。
なおウィルス量は 260 nmにおける吸光度 (A260)を測定し、 下記の計算式で換算し た。
[式] 1 A260 = 1.1 X 1012ウィルス粒子 = 3.3 X 1011 pfu/ml
(3) NIH3T3 L1脂肪細胞におけるマウス AKBP2過剰発現および Akt2の免疫沈降 NIH3T3 L1細胞を 10% ゥシ胎児血清（FGS)を含むダルベッコ変法イーグル培地
(DMEM)に懸濁し、 8x 105個ノ穴になるようにコラーゲンコートした 6穴プレート (旭テクノグラス社) にまいた。 翌日、 10jug/ml インスリン、 250 nMデキサメ サゾン、 0.5 mM 3-イソブチル -1-メチルキサンチン （IBMX) を加えた (10% FGS)に培地を交換して 3T3 - L1細胞の分化を誘導した。 その 2日後、 培地を 0.4 ml の DWIEM (10% FGS)に戻した。 その 4日後、 AKBP2を発現させるアデノウイルスを 1 穴あたり 8 X 1010 pfuの濃度で培地に添加した。 コントロールとしては GFPのみを 発現させるアデノウィルスを用いた。
アデノウイルス感染 36時間後より 16時間、 無血清 DIEM培地で培養し、 100 nMィ ンスリンにより所定の時間 （0、 30、 60分間） 刺激し、 ただちに細胞溶解液 （50 mM Tris-HCI pH 7.5、 1 mM EDTA、 5 mM EGTA、 0.5 mM Na3V04、 0.1 % 2-メルカ プ卜ェタノ一レ、 50 mM NaF、 5 mM sodium pyrophosphate^ 10 mM β―
Glycerophosphate. 1 % Triton - X 100、 0.1 mM P SF) 500 ju I中に溶解した。
15000 rpm、 20分間の遠心後、 上清に抗 Akt2抗体 （Upstate社） および Protein G -sepharose (Amersham社） により免疫沈降した。 免疫沈降物は細胞溶解液で 2回、 洗浄液 (50 mM Tris-HCI pH 7.5、 0.03 % Brij35、 0.1% 2-メルカプトエタノー ル） で 2回、 反応液 （20 mM MOPS pH 7.2、 10 mM MgGI2、 25 mM β - Glycerophosphate, 5 mM EDTA、 1 mM DTT) で 2回洗浄し、 キナーゼ反応に供与し た。
(4) インビトロキナーゼアツセィ
上記免疫沈降物を 20 / Iの反応液にけん濁した。 さらに、 15jt/M ATP、 10 Gi [ r32P] -ATP 3u g GST— crosst i deを含む反応液を加え、 30°Cで 20分間加温し た。 反応は、 10 Iの 4xSDSサンプルバッファ一を加えて停止した。 SDSポリアク リルアミドゲル電気泳動により分離後、 GST- crosst i deに取り込まれた放射活性 を BAS2000バイオイメージングアナライザー （富士フィルム社） により解析し、 定量した。 図 3に示すように、 インスリン無刺激状態におけるコントロールウイ ルス （GFP) および AKBP2を感染させた NI H3T3 L1.細胞を比較した場合、 Akt2のキ ナーゼ活性は AKBP2過剰発現によリコントロールよリ 0. 82倍に低下した。 同様に 100 nMインスリン刺激による Akt2の活性上昇を観察したところ、 GFP感染細胞で は、 無刺激状態に比べ 1 . 39倍 （30分） 、 1. 5倍 （60分） の酵素活性の上昇を示し たのに対し、 AKBP2ウィルスを感染させた細胞では、 刺激依存的な活性上昇は 1. 30倍 （30分） および 1. 22倍 （60分） しか示さなかった。 また、 Akt2の活性化に セリン 473香のリン酸化が重要であることから、 上述のィンスリン刺激後に免疫 沈降した Akt2を抗リン酸化セリン 473抗体 (New Eng l and B i o l ab社) を用いてゥ エスタンプロット解析したところ、 無刺激時のリン酸化状態は、 AKBP2ウィルス を感染させた細胞においてコントロールウィルス感染細胞より低下していた。 ま た、 30分間のインスリン刺激により、 AKBP2ウィルスを感染させた細胞とコント ロールウィルス感染細胞において共に刺激依存的なリン酸化の亢進が認められた が、 そのリン酸化亢進の程度は、 AKBP2ウィルスを感染させた細胞においてはコ ントロールウィルス感染細胞より弱められており、 インビトロキナーゼアツセィ の結果を支持した。 以上の結果より、 本発明のマウス AKBP2は、 Akt2と相互作用 し、 そのインスリン非依存的な酵素活性に加え、 インスリン依存的な酵素活性上 昇を低下させることによりインスリン抵抗性を惹起していると考えられる。
産業上の利用可能性
Akt2に結合する性質を有し、 Akt2のキナーゼ活性を低下させ、 糖尿病態において 発現量が増加する本発明のポリべプチド及ぴポリヌクレオチドは、 糖尿病の診断 に有用である。 また、 本発明のポリペプチド、 ポリヌクレオチド、 発現べクタ一 及び細胞は本発明のポリべプチドと Akt2との結合を阻害する物質 （すなわち Akt2 の働きを増強させる物質） のスクリーニングに有用である。 該スクリーニングに よリ選択される物質はィンスリン抵抗性改善薬並びに糖尿病改善薬の候補物質と して有用である。
配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出しく 2 2 3 >には、 rArt i f i c i a l Sequence」の説明を 記載する。 具体的には、 配列表の配列番号 5〜8、 10〜27の配列で表される各塩 基配列は、 人工的に合成したプライマ一配列である。 配列番号 9の配列で表され る塩基配列は、 クローニングベクター pAGT2 (GenBank U29899) の第 5183番 (5' ) 〜第 5162番 （3' ) の塩基からなる配列である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

1.配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列、 あるいは、 配列番号 2又は 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1〜10個のアミノ酸が欠失、 置換、 及ぴ 若しくは挿入されたァミノ酸配列
を含み、 しかも、 Akt2と結合するポリペプチド。
2. 配列番号 2又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド。
ェ
3. 請求の範囲 1又は請求の範囲 2に記載のポリべプチドをコードするポリヌクレ ォチド。
の
4. 請求の範囲 3に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
5. 請求の範囲 4に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
囲
6. (1 ) 請求の範囲 1若しくは請求の範囲 2に記載のポリペプチド、 または配列番 号 2若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミ ノ酸配列からなり、 しかも Akt2と結合するポリペプチド、 あるいは前記ポリぺプ チドを発現している細胞と （2) 試験物質とを接触させる工程、
該ポリべプチドと Akt2との結合を測定する工程、 及び
前記結合を阻害する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドと Akt2との結合阻害物質をスクリー二 ングする方法。
7. 結合阻害物質がィンスリン抵抗性改善薬及び Z又ば糖代謝改善薬である請求 の範囲 6に記載のスクリーニングする方法。
8. (1 ) 請求の範囲 1又は請求の範囲 2に記載のポリペプチド、 あるいは配列番号 2 若しくは配列番号 4で表されるアミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ 酸配列からなり、 しかも Akt2と結合するポリペプチドと （2) Akt2との結合を測 定する工程が、 前記結合の変化による Akt2の変化を測定する工程である請求の範 囲 6又は請求の範囲 7に記載のスクリーニングする方法。
9.請求の範囲 6乃至請求の範囲 8に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリ 一二ングする工程、 及び
製剤化する工程 を含むこと.を特徴とする、 ィンスリン抵抗性改善用及びノ又は糖代謝改善用医薬 組成物の製造方法。
PCT/JP2003/015546 2002-12-05 2003-12-04 Akt2に結合する蛋白質 Ceased WO2004050869A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004570732A JP4438951B2 (ja) 2002-12-05 2003-12-04 Ａｋｔ２に結合する蛋白質
DE60327361T DE60327361D1 (de) 2002-12-05 2003-12-04 An akt2 bindendesprotein
AU2003289186A AU2003289186A1 (en) 2002-12-05 2003-12-04 PROTEIN BINDING TO Akt2
CA002508232A CA2508232A1 (en) 2002-12-05 2003-12-04 Protein binding to akt2
US10/537,767 US7452983B2 (en) 2002-12-05 2003-12-04 Protein which binds to Akt2
AT03777257T ATE429493T1 (de) 2002-12-05 2003-12-04 An akt2 bindendesprotein
EP03777257A EP1568768B1 (en) 2002-12-05 2003-12-04 PROTEIN BINDING TO Akt2

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002354155 2002-12-05
JP2002-354155 2002-12-05
JP2003206952 2003-08-08
JP2003-206952 2003-08-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004050869A1 true WO2004050869A1 (ja) 2004-06-17
WO2004050869A8 WO2004050869A8 (ja) 2004-08-05

Family

ID=32473704

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/015546 Ceased WO2004050869A1 (ja) 2002-12-05 2003-12-04 Akt2に結合する蛋白質

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7452983B2 (ja)
EP (1) EP1568768B1 (ja)
JP (1) JP4438951B2 (ja)
AT (1) ATE429493T1 (ja)
AU (1) AU2003289186A1 (ja)
CA (1) CA2508232A1 (ja)
DE (1) DE60327361D1 (ja)
ES (1) ES2324779T3 (ja)
WO (1) WO2004050869A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USD629025S1 (en) * 2008-03-27 2010-12-14 Greenleaf Richard J Shedder pin
TWD137060S1 (zh) * 2009-07-06 2010-09-21 Ｓｍｃ股份有限公司 空氣壓機器用消音器
CN111718898B (zh) * 2020-07-06 2021-01-15 北京智能宝生物科技有限公司 提高滑膜间充质干细胞逆境耐受性的方法及其试剂

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003088388A (ja) * 2001-09-14 2003-03-25 Herikkusu Kenkyusho:Kk 新規な全長ｃＤＮＡ
US20030181366A1 (en) * 2002-03-21 2003-09-25 Yan Luo Peptide inhibitors of Akt and uses thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1293569A3 (en) 2001-09-14 2004-03-31 Research Association for Biotechnology Full-length cDNAs

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003088388A (ja) * 2001-09-14 2003-03-25 Herikkusu Kenkyusho:Kk 新規な全長ｃＤＮＡ
US20030181366A1 (en) * 2002-03-21 2003-09-25 Yan Luo Peptide inhibitors of Akt and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MITSUUCHI Y. ET AL.: "Identification of a chromosome 3p14.3-21.1 gene, APPL, encoding an adaptor molecule that interacts with the oncoprotein-serine/threonine kinase AKT2", ONCOGENE, vol. 18, no. 35, 1999, pages 4891 - 4898, XP002965023 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2004050869A1 (ja) 2006-03-30
DE60327361D1 (de) 2009-06-04
US7452983B2 (en) 2008-11-18
ATE429493T1 (de) 2009-05-15
EP1568768A4 (en) 2006-06-07
EP1568768B1 (en) 2009-04-22
JP4438951B2 (ja) 2010-03-24
CA2508232A1 (en) 2004-06-17
US20060211041A1 (en) 2006-09-21
ES2324779T3 (es) 2009-08-14
WO2004050869A8 (ja) 2004-08-05
AU2003289186A1 (en) 2004-06-23
EP1568768A1 (en) 2005-08-31
AU2003289186A8 (en) 2004-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022200673B2 (en) Compositions and methods for degradation of misfolded proteins
KR100529270B1 (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
ES2625316T3 (es) Neuquinasa, una proteína corriente abajo de neuregulina
US12473334B2 (en) SWI/SNF family chromatin remodeling complexes and uses thereof
JPH11313686A (ja) サイクリン依存性キナ―ゼの阻害剤の結合パ―トナ―、並びにそれらの阻害剤検索および疾病の診断または治療のための使用
CA2471307A1 (en) Protein complexes and methods for their use
KR20040088077A (ko) 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제
CA2496891A1 (en) Novel actin-related cytoskeletal protein lacs
US5905146A (en) DNA binding protein S1-3
JP4438951B2 (ja) Ａｋｔ２に結合する蛋白質
JP4419077B2 (ja) Ｃａｐ結合蛋白質
JPWO2000029571A1 (ja) 新規膜貫通蛋白質をコードする遺伝子
JP4264904B2 (ja) 糖尿病改善薬のスクリーニングに利用できる新規蛋白質
KR100811926B1 (ko) 파킨 유전자 활성의 조절에 유용한 조성물
CA2359145A1 (en) Exocytosis pathway proteins and methods of use
WO2004015103A1 (ja) Ａkt２結合蛋白質
CN1952165A (zh) pp3774基因在抑制细胞生长中的应用
WO2005071098A1 (ja) 脂質代謝改善物質のスクリーニング方法
CA2491417A1 (en) Method for screening an agent for improving insulin resistance
JPWO2005093068A1 (ja) 新規タンパク質及びプロモーター
JP2007524346A (ja) ホスホキナーゼ及びその使用
WO2004037858A2 (en) Nipa, a nuclear interacting partner of anaplastic lymphoma kinase, polypeptides and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
D17 Declaration under article 17(2)a
WR Later publication of a revised version of an international search report
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004570732

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003777257

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2508232

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10537767

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003777257

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10537767

Country of ref document: US