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WO2004046709A1 - Analyseverfahren für moleküle, zur sequenzierung von molekülen und spektrometer hierfür - Google Patents

Analyseverfahren für moleküle, zur sequenzierung von molekülen und spektrometer hierfür Download PDF

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Publication number
WO2004046709A1
WO2004046709A1 PCT/DE2002/004275 DE0204275W WO2004046709A1 WO 2004046709 A1 WO2004046709 A1 WO 2004046709A1 DE 0204275 W DE0204275 W DE 0204275W WO 2004046709 A1 WO2004046709 A1 WO 2004046709A1
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WO
WIPO (PCT)
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sample
molecular
excited
response signal
special
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/DE2002/004275
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Richard Fritz Sauter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to PCT/DE2002/004275 priority Critical patent/WO2004046709A1/de
Priority to DE10297995T priority patent/DE10297995D2/de
Priority to AU2002363822A priority patent/AU2002363822A1/en
Publication of WO2004046709A1 publication Critical patent/WO2004046709A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the present invention relates to a physico-chemical analysis method with associated spectrometer for molecules and sequence analysis of molecular samples.
  • Nucleic acid sequencing was the central problem in genetic biochemistry.
  • the previously established chemical-analytical processes process a maximum of around 20 bases per second and still require around six years for a human genome.
  • the DNA molecule of the longest human chromosome with about 3 * 10 base pairs is around 10 cm long. Other species sometimes have longer chromosomes.
  • the diploid genome of a human body cell, as a single strand, is about 4 meters long and (' around 2 nanometers wide.
  • the primary identity period, which, if at all, is only about 1.5% larger than that of the crystallographic c-axis of natural graphite with 0.3348 nm is 0.34 nm and the secondary is 3.4 nm.
  • each nucleotide connected to it is the information-carrying part of a nucleic acid, and in contrast to the rest of the molecule, such bases can be determined optically as chromophores by spectral analysis.
  • the two base genera of puric acids can be removed from nucleic acids in a highly selective manner by means of an acid-catalytic polymer-analogous chemical reaction at p H 3. This is also possible enzymatically, for example with the help of a nucleosidase. What remains is adenine- and guanine-free apuric acid.
  • the sequence analysis of the primary and complementary strand, each with the remaining two base genera cytosine and thymine and uracil, complements Chargaff again for complete genetic information.
  • the excitation of individual atomic elements with the tip of a scanning tunneling microscope to emit luminescence has already been achieved / EP 0 801 310 /.
  • Biradical one of which is particularly reactive. Furthermore, a change in the polarization between the excitation beam and the emission suggests that energy transfer has taken place. This means, above all at higher temperatures, that the glow mostly comes from a position other than the one just excited.
  • Pentium 4 microprocessor is now operated at an operating frequency of 2.66 GHz, which is currently a monthly increase of +130 MHz.
  • the present invention solves the technical problem of specifying a method which allows an exact, reliable and economical sequence and molecular analysis to be carried out in a very short time.
  • a key area of application is the key technology of genome analysis, for example for the purpose of molecular diagnostics.
  • a second relates to the reading of miniaturized stored data or pits, for example in the field of extremely compact molecular storage density, and a third relates to the field of molecular trace analysis, for example for the detection of hidden explosives and intoxicants.
  • this invention is useful in polymer analysis, for example for the exact determination of the tacticity of macromolecules and the block length in copolymers and also for high-precision, also macroscopic, length measurements with an atomic-molecular step size.
  • the content of DE 101 23 443 is also part of this invention.
  • a thin light beam is generated in one of several ways, of which at least one dimension corresponds to the diameter of a molecule. That is the "molecular spotlight”.
  • This can be a convergent beam with a small focal spot, a thin parallel beam and a preferably linearly polarized beam through a "picospalt". That is, a gap which is about 1 to 10 mm long and about as wide as the position distance of the sample. For nucleic acids it is 340 picometers.
  • the electric field vector oscillates in particular in the longer direction of the "picospalt", so that no diffraction phenomena occur.
  • It can be manufactured e.g. by drilling and milling with an electron beam, if necessary, place several thin platelets with a gap on top of each other, as well as from plane-parallel separated and polluted corrosion-resistant metal pieces, which are provided with a molecularly thin spacer around the gap.
  • inventive method for sequence and molecular analysis is accordingly characterized by the features of independent claims 1), 7), 23), 24), 25), 27), 32) and 38).
  • Advantageous refinements and developments are the subject of the claims which are directly or indirectly dependent thereon.
  • the spectrometer according to the invention is given by claims 38) and 39).
  • the inventive method for sequence analysis is characterized in that
  • step B) the individual sequentially consecutive positions within the sample, e.g. in the location determined in step A), are exposed to an electromagnetic excitation signal with the aid of a “molecular spotlight”, the one dimension corresponding to the position distance of the sample, in order to generate a response signal which is designed in particular as a characteristic light intensity such as transmission or luminescence,
  • the respective response signal is detected, evaluated and stored, a detector device being used whose detection sensitivity is e.g. is in the range of a photon or electron,
  • the detection, the data processing and the advance to the next position are carried out within a relatively short time, in particular under one microsecond to under one nanosecond per position of the sample, and
  • steps B) to E) can be repeated at further positions within the sequence of the sample, preferably at their information-carrying parts.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the tips of tunnel or atomic microscopes are used to fix the sample.
  • steps A) and B) can be carried out simultaneously, i.e. the measuring beam designed as a “molecular spotlight” serves on the one hand to determine the location and the size of a position and on the other hand it also causes characteristic absorption and Rayleigh scattering and the photoluminescence of the sample.
  • the two steps A) and B) are temporal and carried out locally one after the other
  • step B) can be carried out in a further pass.
  • the spontaneous luminescence is preferably suppressed. This happens both with the stimulated emission and with a quencher, i.e. a substance that accelerates the quenching of the luminescence.
  • Typical radical scavengers such as carbon tetrachloride, CCI 4 , polyphenols such as hydroquinone and gases such as methane, CH 4 are suitable for this.
  • Electromagnetic radiation is suitable for excitation, i.e.: radio waves, microwaves, infrared (FR), visible radiation, ultraviolet (UV), X-rays and ⁇ radiation, but also material radiation, such as electron beams, also in the form of alternating current and electrical fields.
  • a system excitation and a system response in the area of optical radiation, that is from UV to FIR, are preferred.
  • the ionizing electromagnetic radiation types are applied so elastically, in particular by flat angles and radiation near the edge, that only an energy component required for characteristic transitions is transmitted to the sample, which is below the total energy 5 of the exciting photon.
  • the optical excitation signal is designed so as to be characteristic of intensity, wavelength, spectral resolution, coherence length, polarization, phase and the duration of pulse and pause so that it is maximally absorbed by the part of the molecule to be excited. In particular, this takes place in a characteristic wavelength range and with a characteristic polarization, which is typical for the chromophore of the position of a sample just examined.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that a stimulated emission is carried out in step B). This can also be done with an atomic molecular spatial resolution and in an internal environment, e.g. in the absence of oxygen,
  • cooling is carried out. This is done by flowing with a fluid, also supercritical, coolant, such as water, in particular at high speed.
  • coolant such as water
  • cooling can be achieved by contact with a cooling finger, which can also be designed as a wire.
  • the material used for this is preferably characterized by a relatively high
  • Thermal conductivity and surface cleanliness This is, for example, copper, silver and gold with an ion beam cleaned surface.
  • cooling can also be carried out alone or in combination with a special laser beam with high spectral resolution. This is all the more effective if such radiation is carried out simultaneously from several different directions.
  • a scanning microscope can also be used for process steps A) or B).
  • the sample is water-free, undergoes rotation about its longitudinal axis, and deflection and collection optics increase the quantum yield of the detection.
  • the working time for the system excitation, for the detection, the advance to the subsequent position and for the associated data processing preferably takes less than a nanosecond.
  • a particularly preferred embodiment which is used in particular for the case of simultaneous excitation of a plurality of, in particular adjacent, positions, is distinguished in that the emission is evaluated via the appropriate use of difference spectra. This is also possible with the aid of "optical spreading".
  • the position to be analyzed 5 is located directly in the focal point of a parabolic mirror. Adjacent sequences are outside of it. According to the rules of geometric beam optics, their luniinescence is not reflected parallel to the optical axis. A relative Long light path over several kilometers, for example with rolled-up fiber optic cables or plane-parallel special mirrors, enables spreading and thus also a lateral separation from the focal rays.
  • a further preferred embodiment uses several detector devices for the evaluation of the luminescence. This consists of the detector and upstream analysis units to refine the detection.
  • the detector can be a photomultiplier, pulse height or multi-channel analyzer, a CCD camera, also pelet-cooled, or other fast and highly detection-sensitive photodetectors based on semiconductors, such as an avalanche
  • an extra folying device which acts on the excitation signals that are emitted. This consists of electric or magnetic field lenses as well as the "molecular spotlight” with an adjusted light intensity.
  • the space quantum yield is much better with the aid of a deflection and collection optics.
  • This is, for example, a parabolic mirror, a part of it can also suffice, in the focal point of which the luminous position of the sample is preferably arranged.
  • these 5 reflectors can also already contain the grating lines required for spectral decomposition, preferably of the echelet type, that is to say optimized in terms of efficiency, in particular on the focus of the wavelength of the radiation to be analyzed. If only the light intensity is measured, a sphere with a radius of 20 cm, for example, is sufficient, the inner surface of which is lined with relatively small detectors such as photodiodes.
  • a sphere with a radius of, for example, 5 cm is used with the light source in the center.
  • the spherical surface are exactly vertical, that is to say radial, the one ends of optical fibers which collimate the emission of the detector device from the other ends located at a common point
  • optical fibers of different lengths are then preferably made thin and flexible, so their diameter is in the micrometer range.
  • Their cross section is preferably planar and perpendicular to the length and is oriented towards full use of the spherical surface. That means, like a soccer ball, pentagons and hexagons alternate. Fewer optical fibers are required if the inner surface of the sphere that remains free is reflective
  • ⁇ is trained, e.g. as an aluminum mum ball.
  • the radiation collected in this way is directed onto a detector device, in particular after a cross-sectional reduction with convergence, better with a pair of parabolic mirrors to maintain collimation.
  • Optical fibers can also serve as sample carriers, e.g. as a tube or hollow fiber filled with the sample, as a full fiber with the sample in a preferably central gap and with a sample fixed in casting resin 5.
  • Light sources are e.g. thermal, colorful and coherent emitters. One is required
  • Dye lasers are suitable for wide spectral ranges. Their spectral resolution can be improved) e.g. through tuning according to Fabry-Perot or Etalon as well as mode selection and mode coupling with electronic readjustment to a sharp spectral line.
  • For pulsed excitation of the sample e.g. electronic breakers, flash lamps and choppers are used.
  • Reflectors can also be partially transparent, e.g. for preferably one-sided light passage, e.g. 1%.
  • a chopper separates temporally separate processes such as reflection and scattered light, stimulated emission, spontaneous fluorescence and phosphorescence, also to improve the signal / noise ratio.
  • the electron spin reversal stimulated by a characteristic microwave radiation is separated from their
  • Characteristic J-R absorptions or Raman scatterings can also be measured, especially the stretching and bending vibrations of the base residues on the oxygen of the first carbon atom from the sugar.
  • the chemical improvement of the fluorescence intensity can also be achieved by photochemical derivatization with an organic reagent for the duration of the excited state.
  • Hydroquinone for example, is suitable for this.
  • the contact between the sample and the support can also be achieved using an adhesive, e.g. a household adhesive. It is also possible to extend the sample at one end. This happens with another polymer molecule that is chemically bound to it, for example via a condensation reaction.
  • Non-polar solvents such as ether or hexane, a glassy alcohol-ether matrix according to Spolsky at low temperature or high vacuum are also suitable as the chemical environment of the sample, with the advantage that the glass bulb of the detector tube, which may interfere with its reflection, can be omitted.
  • Data storage is more compact if only one valid signal is saved at several measurements in the same position.
  • Disturbing length fluctuations are achieved through a relatively high constancy of the working temperature through thermostatting, shading against external heat sources and use of materials with a particularly low expansion coefficient as well as a correspondingly low-vibration mounting of the spectrometer. This happens, for example, as with the tower microscope with a special suspension or how for a seismograph with a particularly heavy mass.
  • "Low-leveP 'measuring station typical) precautions are the steel shielding to the outside, for example by the usual several cm thick lead walls, and within the spectrometer through the use of low-radioisotope materials.
  • the gain selectivity e.g. is operated in the lowest temperature range at temperatures around -196 ° C 3 to below 1 K (-272 ° C),
  • the measuring beam is also matched to a maximum and selective absorption as possible according to the respective characteristic intensity, wavelength, spectral resolution, coherence length, polarization, phase and the duration of the pulse and pause, and
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that a gas measuring cell, optionally with a heatable wall, is used in step I).
  • the light path in the gas measuring cell covers the entire Irmen cross-sectional area. The multiple total reflection of the measuring beam, even with several measuring beams, makes this possible, for example.
  • the non-irradiated partial areas should not be significantly larger than one
  • measuring beam Either its surface moves through the measuring volume or the gas flows through it. Instead of round e.g. also be square. This happens before the optical downsizing, if necessary after the measuring beam has been expanded, e.g. to 5 cm, with the help of an appropriately shaped panel.
  • the measuring cell itself can also be square and reflective.
  • this gas must be replaced by a gas, such as noble gas, for example argon, which has a weaker absorption therein.
  • a gas such as noble gas, for example argon, which has a weaker absorption therein.
  • Interfering particles such as aerosols etc. are separated beforehand, eg electrostatically or by filtration.
  • a molecule can also be examined optically in a capillary tube. Enrichment of the substance or group of substances sought is also advantageous.
  • the characteristic strong absorption bands of organic nitro compounds in the IR spectrum at 1650, 1290 and 850 cm " and medium intensities are suitable for detecting explosives
  • a significantly longer measuring time is available for determining a molecule. This can be less than a second, for example, but can also take up to an hour.
  • a copy of the sample likewise a synthetic sample for molecular data storage, can be synthesized with more intense and faster-emitting, but preferably fluorescent, luminophores and then advantageously sequenced.
  • all components should be ideally transparent, absorbent and reflective, that is, each with a high degree of efficiency.
  • a “picospalt” is also suitable for determining the position of the position under investigation within the sequence of a sample, which is also arranged in the beam path after the sample and is provided with an aperture to protect against radiation from adjacent positions.
  • the transmission of the excitation beam also works in this sense.
  • the photons specific for sequence positions are directed to a preferably pelet-cooled CCD camera after spectral decomposition in order to achieve the shortest possible measurement times, under one microsecond per sequence position.
  • a fast electronic buffer with time-delayed data output that is to say a transient memory, is used.
  • the parallel operation of several microprocessors is also possible.
  • Characteristic features of the invention in this method are that locally selective optical excitation of a sequence position of the sample using the “molecular Spotlights "takes place and for transmission and fluorescence measurements a detection of the resulting response signal is carried out in the range of highest possible detection sensitivity and shortest measuring time specific to the location and genus.
  • the variant of the exciter spectroscopy technique can also be used for this.
  • the invention also relates to a spectrometer for performing the above-mentioned methods.
  • a spectrometer for performing the above-mentioned methods.
  • devices or units which enable the method steps mentioned above to be carried out in a corresponding manner.
  • luminescence can also be excited with the aid of both types of radiation. This is preferably done optically, but also with electrons. In principle, electric fields are also suitable for this alone, in particular in the form of alternating fields, and a sufficiently high temperature, which is, however, above the decomposition point of most organic substances.
  • Double-stranded molecules are preferred, in particular thermally, melted into single-stranded molecules and then individually examined. There is a possibility that the molecules to be sequenced e.g. be measured in a capillary with a light collecting effect.
  • Fabry-Perot plates can be used to bring even higher spectral resolution.
  • the photons which are characteristic of a position of the sample and which, as is known, can originate from various excited species are made as short as possible to achieve this
  • a relatively short detection time e.g. below one microsecond to nanosecond
  • Figure 1 is a schematic representation of a spectrometer for absorption and fluorescence measurements for conducting a molecular and sequence analysis with a "molecular spotlight”. It consists of: a light source (76), an attachment lens (96), e.g. a condenser, one
  • FIG. 2 shows a freely movable arrangement of the sample carrier (22) consisting of two tunnel microscope tips (24 + 28) with the sample (12/40) hanging between them. The position just measured is then marked with "X”.
  • the excitation beam (97), the transmission (98) and the associated detel device (14) also follow.
  • the radiation for the stimulated emission (34), the response from luminescence (30) also follows Rayleigh scattering and stimulated emission (36) and the associated detector device (14.)
  • the x coordinate runs in the longitudinal direction of the sample, the y coordinate runs perpendicular to it and the z coordinate runs perpendicular to both.
  • the position coordinates of the sample are determined and stored, or the excitation to emit a luminescence (30) takes place. Furthermore, both a separate second fine pass can be carried out and an excitation signal (20) can be emitted via a second “molecular spotlight” that follows immediately after it.
  • FIGS. 1 and 2 there is a spectrometer that generates a “molecular spotlight” and can direct it onto the fixed sample. It has a detector device (14), a deeply cooled electronic amplifier (86) and a control and evaluation unit. and storage means (18) followed by an output unit for the data.
  • the diameter and thus the relatively high lateral resolution of the excitation beam (20/97) in the order of magnitude of typical positional distances within the sample is therefore 0.34 nm.
  • the sample is taken from a swab of the cheek mucosa from a person's oral cavity. This is followed by enzymatic digestion with lysis of the cell wall and nucleus, followed by isolation, separation and purification in one operation by accelerated gel permeation chromatography with a particularly short column, with negative pressure on the removal side and with centrifugal force. Duration about 1 A to 1 hour, also automated. If the spectral purity of the sample is insufficient, this is followed by repeated cleaning if necessary, i.e. phenol extraction and precipitation from aqueous solution using isopropanol or ethanol. The double strands are then thermally separated into two complementary single strands by heating to over 65 to 90 ° C. in water. Possibly. add some glycerin or a mixture of sodium chloride and citrate.
  • PH 3 is adjusted at room temperature by adding phthalate-hydrochloric acid buffer. Possibly. ) reheat. Subject the mixture to gel permeation chromatography again or pour it into a dish, let it dry, rinse with pure water, let it dry again. Electrostatically, if necessary with biotin, fix the sample at two tips and place it in the holding device. Pull the tips apart without tearing the sample and place them in the measuring beam.
  • the transmission, fluorescence and possibly the scattered light must be measured. To do this, start with one photon per second and then increase the intensity to saturation. With an emission stimulated with any lateral resolution, the saturation intensity is several orders of magnitude higher. The determinations become more precise when the photons that are superfluous for a measurement burden the detection. This can be achieved by the selective selection of a characteristic polarization; a correspondingly high spectral resolution of the excitation radiation is also advantageous.
  • the phase also influences the success of the absorption of a light quantum. This can be moved cheaply by triggering the flash lamp or chopper. A matching extension of the light path is also beneficial. Heat dissipation contacts and the mostly multiple use of laser cooling dissipate disruptive heat.
  • Piezoelectric also precision mechanical or thermohydraulic, actuators move the sample holder relative to the spectrometer position by position to the last position after each successful measurement. After the limited maximum deflection of the actuator has been reached, the moving front part is fixed there, the rear starting part is set back to a minimum deflection, is then tracked, fixed and the fixing of the front part is released again.
  • the actuators move a reflector that directs the measuring beam from the first to the last sequence position of the semicircular sample.
  • a second reflector which is also moved, to a fixed detector. When measuring fluorescence, the sample is moved.
  • the complementary strand is sequenced in the same way and then the appropriate complementary direction and the complete sequence are determined with the aid of EDP.
  • the result is then output as a complete sequence protocol or only in the form of special deviations as well as molecular genetic diagnosis and prognosis with therapy suggestions saved on a data carrier. This happens, for example, on a magnetic tape, a memory chip or a burned CD-ROM.
  • Characteristic features of the invention in this analysis method are that local excitation takes place in the atomic-molecular order of magnitude and at the same time a detection of the resulting specific response signal of the sequence position in the range of the highest possible detection sensitivity is carried out selectively from the location of the excitation.
  • This enables simple, automatable, fast, inexpensive, direct and sequence-accurate analyzes of (macro) molecules and their parts as well as trace molecules.
  • a human genome can be sequenced within a very short time, from less than a month to a quarter of an hour, at a cost that is compatible with health insurance.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung ist ein physikalisch-chemisches Verfahren und dient der Analyse und Sequenzierung von Molekülen in einer Probe. Das geschieht in einem Spektrometer mit Hilfe eines molekulardünnen Lichtstrahls, dem "molekularen Spotlight". Dabei können Transmission, Streuung und Emission gemessen werden. Zur Kürzung der Meßzeit und zur örtlichen Bestimmung der gerade emittierenden Sequenzposition erfolgt eine stimulierte Emission. Das erfordert eine intensive Kühleinrichtung mit mehreren Laserstrahlen sowie mit festen Wärmeableitkontakten und mit schnell anströmenden Fluiden. Die Quantenausbeute der Detektion wird mit einer besonderen Umlenk- und Sammeloptik erhöht. Eine Tiefstkühlung der Verstärkungselektronik verbessert das Signal/Rausch-Verhältnis. Hauptanwendungsgebiete sollen die Schlüsseltechnologie der molekularen Diagnostik, das Ablesen höchstkompakt gespeicherter Daten und die molekulare Spurenanalytik werden. Ferner auch die Polymeranalytik zur exakten Bestimmung der Taktizität sowie der Blocklänge bei Copolymeren und die Längenmessung, auch über makroskopische Distanzen, mit atomar-molekularer Schrittweite.

Description

Beschreibung
Analyseverfahren für Moleküle, zur Sequenzierung von Molekülen und
Spektrometer hierfür
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein physikalisch-chemisches Analyseverfahren mit zugehörigem Spektrometer für Moleküle und Sequenzanalysen molekularer Proben.
Stand der Technik
Die Nukleinsäuresequenzierung war das Zentralproblem der genetischen Biochemie. Die bisher etablierten chemisch-analytischen Verfahren bearbeiten maximal rund 20 Basen pro Sekunde und benötigen für ein Humangenom immer noch etwa sechs Jahre.
Das DNA-Molekül des längsten menschlichen Chromosoms mit etwa 3*10 Basenpaaren ist rund 10 cm lang. Andere Arten haben zum Teil noch längere Chromosomen. Das diploide Genom einer menschlichen Körperzelle ist als hintereinander angeordnete Einzelstränge etwa 4 Meter lang und (' rund 2 Nanometer breit. Die primäre Identitätsperiode, die, wenn überhaupt, nur etwa 1,5 % größer ist als jene der kristallographischen c- Achse von Naturgraphit mit 0,3348 nm, beträgt 0,34 nm und die sekundäre 3,4 nm. Alle 0,34 nm folgt somit eine um 36 ° verdrehte weitere Position, hier als eines von in der Regel vier Nukleotiden, innerhalb der Sequenz einer Probe. Der informationstragende Teil einer Nukleinsäure ist die Base von jedem mit ihr verbundenen Nukleotid. Im Gegensatz zum Molekülrest sind solche Basen optisch gut als Chromophore spektralanalytisch bestimmbar.
Durch eine säurekatalytische polymeranaloge chemische Reaktionen bei pH 3 können die zwei Basengattungen der Purinsäuren hoch selektiv aus Nukleinsäuren entfernt werden. Ebenso ist das enzymatisch möglich, etwa mit Hilfe einer Nukleosidase. Zurück bleibt die adenin- und guanin- freie Apurinsäure. Die Sequenzanalyse von Primär- und Komplementärstrang, jeweils mit den noch verbleibenden beiden Basengattungen Cytosin und Thymin bzw. Uracil, ergänzt sich nach Chargaff wieder zur vollständigen genetischen Information. Die Anregung einzelner atomarer Elemente mit der Spitze eines Rastertunnelmikroskops zur Emission einer Lumineszenz ist bereits gelungen / EP 0 801 310 /. In diesem Zusammenhang wird sie als Oberbegriff für alle Erscheinungen der Fluoreszenz und der Phosphoreszenz verstanden, da beide meist nur über die Lebensdauer und die Energie ihrer Emission unterscheidbar sind. Ihre zeitliche Abfolge liegt je nach Art der Moleküle bei der spontanen Fluoreszenz in der Größenordnung um 10" Sekunden, bei der Phosphoreszenz typischerweise im Sekundenbereich. Die Meßzeit kann mit Hilfe einer stimulierten Emission nach dem Laseφrinzip, oder mit charakteristischer Mikrowelleneinstrahlung zur Stimulierung der Spinumkehr bei der
—14 Phosphoreszenz, auf 10 Sekunden erheblich verkürzt werden / DE 101 23 443 /.
Dies ist mit einem sehr hohen bis maximal technisch erzielbaren Raum-Zeit-Umsatz an Energie verbunden. Bei Leistungslasern wird daher zusätzlich mit Wasser gekühlt, um eine thermische
—12
Materialzersetzung zu vermeiden. Ein gepulster Betrieb ist dabei üblich. Innerhalb von 10 Sekunden finden noch keine chemischen Reaktionen statt, ebensowenig eine Energieübertragung an benachbarte Positionen durch einen molekularen Stoß, bei dem auch die Atomkerne merklich mitbewegt werden. Lediglich teilweise erfolgt diese durch die starke Nolumenausdehnung der mit einem angeregten Elektron als stehender Materiewelle besetzten Orbitale. Nach den Bohr' sehen Postulaten, berechnet für die 2. Schale des Wasserstoffatoms, geschieht das analog mit einer Geschwindigkeit im Größenordnungsbereich von 1/300 der Vakuumlichtgeschwindigkeit und dauert rund 10" Sekunden, mit einer üblichen Längenausdehnung um +100 %. So entsteht ein
Biradikal, wovon eines besonders reaktiv ist. Ferner läßt eine Änderung der Polarisation zwischen dem Anregungsstrahl und der Emission auf eine stattgefundene Energieübertragung schließen. Das bedeuted somit vor allem bei höheren Temperaturen, daß das Leuchten meist von einer anderen als der gerade angeregten Position stammt.
Die Bewältigung von Störungen des Meßstrahls durch die Bildung von Schlieren und Gasblasen ist seit Jahren Stand der Technik. Der Mikroprozessor Pentium 4 wird inzwischen mit einer Arbeitsfrequenz von 2,66 GHz betrieben, das ist derzeit eine monatliche Zunahme um +130 MHz.
Für zahlreiche molekulare Mikromanipulationen der Probe eignen sich ,,Lichtpinzetten" und die Spitzen von Tunnel- und Kraftmikroskopen. Eine Dokumentation der Sequenzen z.B. mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung, -Speicherung und -Ausgabe ist üblich. Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst das technische Problem, ein Verfahren anzugeben, das eine exakte, zuverlässige und wirtschaftliche Sequenz- und Molekülanalyse innerhalb kürzester Zeit durchzuführen erlaubt. Ein Hauptanwendungsgebiet soll die Schlüsseltechnologie der Genom- analyse werden, beispielsweise zum Zwecke der molekularen Diagnostik. Ein Zweites betrifft das Ablesen von miniaturisiert gespeicherten Daten oder Pits, beispielsweise im Bereich höchstkompakter molekularer Speicherdichte, und ein Drittes den Bereich der molekularen Spurenanalytik, beispielsweise zum Aufspüren verborgener Spreng- und Rauschmittel. Ferner ist diese Erfindung in der Polymeranalytik nützlich, beispielsweise zur exakten Bestimmung der Taktizitat von Makromolekülen sowie der Blocklänge bei Copolymeren und außerdem für hochpräzise, auch makroskopische, Längenmessungen mit atomar-molekularer Schrittweite. Der Inhalt von DE 101 23 443 ist auch Bestandteil dieser Erfindung.
Erfindungsgemäß wird zur Lösung des analytischen Problems ein dünner Lichtstrahl auf eine von mehreren Arten erzeugt, von dem mindestens eine Dimension dem Durchmesser eines Moleküls entspricht. Das ist das „molekulare Spotlight".
Das kann ein konvergenter Strahl mit kleinem Brennfleck sein, ein dünner paralleler Strahl sowie ein bevorzugt linear polarisierter Strahl durch einen „Picospalt". D.h. einen Spalt, der etwa 1 bis 10 mm lang und etwa so breit wie der Positionsabstand der Probe ist. Bei Nukleinsäuren beträgt er 340 Picometer. Der elektrische Feldvektor schwingt dabei insbesondere in der längeren Richtung des „Picospalts", so daß keine Beugungserscheinungen auftreten.
Herstellbar ist er z.B. durch Bohren und Fräsen mit einem Elektronenstrahl, ggf. mehrere dünne Plättchen mit Spalt übereinander legen, sowie aus planparallel getrennten und pollierten korrossionsfesten Metallstücken, die um den Spalt herum mit einem molekular dünnen Abstandshalter versehen sind. Der besteht z.B. aus Graphenschichten, Glimmerplättchen oder am Rand aufgesputtertem Metall.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenz- und Molekülanalyse zeichnet sich demgemäß durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche 1), 7), 23), 24), 25), 27), 32) und 38) aus. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind Gegenstand der davon direkt oder indirekt abhängigen Ansprüche. Das erfindungsgemäße Spektrometer ist durch die Ansprüche 38) und 39) gegeben. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Sequenzanalyse ist dadurch gekennzeichnet, daß
A) jeweils der Ort und die Größe der molekularen Position innerhalb der Sequenz einer Probe mit Hilfe eines „molekularen Spotlights" festgestellt und festgehalten wird,
B) jeweils die einzelnen sequenziell aufeinander folgenden Positionen innerhalb der Probe, z.B. in dem in Schritt A) festgestellten Ort, einem elektromagnetischen Anregungssignal mit Hilfe eines ,,molekularen Spotlights" ausgesetzt werden, die eine Dimension entspricht dabei dem Positionsabstand der Probe, zur Erzeugung eines Antwortsignals, das insbesondere als charakteristische Lichtintensität wie Transmission oder Lumineszenz ausgebildet ist,
C) jeweils die Position bestimmt wird, von der das Antwortsignal ausgeht,
D) das jeweilige Antwortsignal detektiert, ausgewertet und gespeichert wird, wobei eine Detelrtoreinrichtung eingesetzt wird, deren Nachweisempfindlichkeit z.B. im Bereich eines Photons oder Elektrons liegt,
E) die Detektion, die Datenverarbeitung und der Vorschub zur nächsten Position innerhalb einer relativ kurzen Zeit, insbesondere unter einer Mikrosekunde bis unter eine Nanosekunde pro Position der Probe, durchgeführt werden und
F) die Schritte B) bis E) an weiteren Positionen innerhalb der Sequenz der Probe wiederholt werden können, bevorzugt an deren informationstragendenen Teilen.
Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, daß zur Fixierung der Probe die Spitzen von Tunnel- oder Atomkral ikroskopen eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung können die Schritte A) und B) gleichzeitig durchgeführt werden, d.h. der als „molekulares Spotlight" ausgebildete Meßstrahl dient einerseits zur Feststellung des Ortes sowie der Größe einer Position und andererseits bewirkt er auch eine charakteristische Absorption und Rayleighstreuung sowie die Photolumineszenz der Probe. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung werden die zwei Schritte A) und B) zeitlich und örtlich unmittelbar nacheinander durchgeführt. In einer alternativen Ausgestaltung kann Schritt B) in einem weiteren Durchlauf ausgeführt werden.
Bei einer Messung der Transmission wird bevorzugt die spontane Lumineszenz unterdrückt . Dies geschieht sowohl mit der stimulierten Emission als auch mit einem Quencher, also einer Substanz, welche die Lumineszenzlöschung beschleunigt. Dazu eignen sich typische Radikalfänger, wie beispielsweise Tetrachlorkohlenstoff, CCI4, Polyphenole wie z.B. Hydrochinon und Gase wie Methan, CH4. Zur Anregung eignen sich elektromagnetische Strahlung, also: Radiowellen, Mikrowellen, Infrarot (FR), sichtbare Strahlung, Ultraviolett (UV), Röntgen- und γ-Strahlung, aber auch Materiestrahlung, wie z.B. Elektronenstrahlung, auch in Form von Wechselstrom und elektrischen Feldern. Dabei ) wird eine Systemanregung und eine Systemantwort im Bereich der optischen Strahlung, also vom UV- bis zum FIR, bevorzugt.
Die ionisierenden elektromagnetischen Strahlungsarten werden insbesondere durch flache Winkel und randnahe Einstrahlung so elastisch angewandt, daß nur ein für charakteristische Übergänge erforderlicher Energieanteil auf die Probe übertragen wird, welcher unterhalb der Gesamtenergie 5 des anregenden Photons liegt.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung ist das optische Anregungssignal nach Intensität, Wellenlänge, spektraler Auflösung, Kohärenzlänge, Polarisierung, Phase sowie der Dauer von Puls und Pause jeweils so charakteristisch ausgebildet, daß es vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird. Insbesondere geschieht dies in einem charakteristischen Wellenlängenbereich und mit einer } charakteristischen Polarisierung, welche für den Chromophor der gerade untersuchten Position einer Probe typisch ist.
Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, daß bei Schritt B) eine stimulierte Emission durchgeführt wird. Dies kann ebenso mit einer atomarmolekularen Ortsauflösung und in innerter Umgebung, wie z.B. unter Sauerstoffausschluß,
5 geschehen und es kann auch dabei eine Transmissionsmessung erfolgen. Dazu wird auch eine intensive Kühlung durchgeführt. Dies geschieht durch Anströmung mit einem fluiden, auch überkritischen, Kühlmittel, wie beispielsweise Wasser, insbesondere mit hoher Geschwindigkeit. Zusätzlich kann durch Kontakt mit einem Kühlfinger, der auch als Draht ausgebildet sein kann, gekühlt werden. Das hierzu eingesetzte Material zeichnet sich bevorzugt durch eine relativ hohe
0 Wärmeleitfähigkeit und Oberflächenreinheit aus. Das ist beispielsweise Kupfer, Silber und Gold mit ionenstrahlgereinigter Oberfläche. Ferner kann auch allein oder in Kombination die Kühlung mit einem speziellen Laserstrahl hoher spektraler Auflösung erfolgen. Dies ist um so wirksamer, wenn eine solche Bestrahlung aus mehreren unterschiedlichen Richtungen gleichzeitig erfolgt.
Für die Verfahrensschritte A) oder B) kann auch ein Rastertiumelmikroskop eingesetzt werden. In 5 einer vorteilhaften Ausgestaltung ist die Probe wasserf ei, erfährt eine Rotation um ihre Längsachse und eine Umlenk- und Sammeloptik erhöht die Quantenausbeute der Detektion. Bevorzugt dauert die Arbeitszeit für die Systemanregung, für die Detektion, den Vorschub zur nachfolgenden Position und für die zugehörige Datenverarbeitung unter einer Nanosekunde. Mit den bekannten Kryotechniken ist auch eine wesentliche Verbesserung des Signal Rausch- ) Verhältnises bei der Verstärl gselektronik erzielbar.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung, die insbesondere für den Fall einer gleichzeitigen Anregung mehrerer, vor allem benachbarter, Positionen eingesetzt wird, zeichnet sich dadurch aus, daß die Auswertung der Emission über den sinngemäßen Einsatz von Differenzspektren erfolgt. Ebenso ist das mit Hilfe der „optischen Spreizung" möglich. Dabei befindet sich die zu 5 analysierende Position unmittelbar im Brennpunkt eines Parabolspiegels. Benachbarte Seqenzen liegen außerhalb davon. Ihre Luniineszenz wird nach den Regeln der geometrischen Strahlenoptik nicht parallel zur optischen Achse reflektiert. Ein relativ langer Lichtweg über mehrere Kilometer, z.B. mit aufgerollten Lichtleiterkabeln oder planparallelen Spezialspiegeln, ermöglicht eine Spreizung und damit auch eine laterale Abtrennung von den Brennpunktsstrahlen.
) Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung nutzt für die Auswertung der Lumineszenz mehrere Detektoreinrichtungen. Diese besteht aus dem Detektor und vorgeschalteten Analyseeinheiten zur Verfeinerung der Detektion. Detektor kann dabei ein Photomultiplier, Impulshöhen- bzw. Vielkanalanalysator, eine CCD-Kamera, auch peletiergekühlt, oder andere schnelle und hochnachweisempfindliche Photodetektoren auf Halbleiterbasis, wie beispielsweise eine Avalanche
5 Photodiode (APD) mit einer Quantenausbeute von 50 bis über 90 % sein, auch als Diodenzeile angeordnet. Im Infrarotbereich wird eine MCT-Photodiode, -Kamera und kleine Sensorfläche für eine raschere Signalmeßfolge bevorzugt.
Zur Erhöhung der Genauigkeit bzw. zur Erzielung einer möglichst hohen lateralen Auflösung kann erfindungsgemäß eine extra Folαissiereinrichtung eingesetzt werden, die auf die abgegebenen ) Anregungssignale einwirkt. Diese besteht aus elektrischen oder magnetischen Feldlinsen sowie aus dem ,,molekularen Spotlight" bei angepasster Lichtintensität.
Bei einer Emission in mehrere Richtungen ist die Raumquantenausbeute mit Hilfe einer Umlenk- und Sammeloptik wesentlich besser. Das ist z.B. ein Parabolspiegel, es kann auch ein Teil davon genügen, in dessen Brennpunkt die leuchtende Position der Probe bevorzugt angeordnet ist. Diese 5 Reflektoren können aber auch bereits die zur spektralen Zerlegung erforderlichen Gitterstriche enthalten, bevorzugt vom Echelettetyp sein, also optimiert im Wirkungsgrad, insbesondere auf den Schweφunkt der Wellenlänge der zu analysierenden Strahlung. Wird nur die Lichtintensität gemessen, so genügt auch eine Kugel mit z.B. 20 cm Radius, deren Innenfläche mit relativ kleinen Detektoren wie Photodioden ausgekleidet ist.
) In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Umlenk- und Sammeloptik zur Verbesserung der Raumquantenausbeute ist eine Kugel mit einem Radius von beispielsweise 5 cm mit der Lichtquelle im Mittelpunkt eingesetzt. In der Kugeloberfläche sind exakt senkrecht, also radial, die einen Enden von Lichtleitfasern eingelassen, welche die Emission so kollimiert der Detektoreinrichtung gebündelt aus den an gemeinsamer Stelle befindlichen anderen Enden
> zuführen. Vorzugsweise sind diese dann unterschiedlich langen Lichtleitfasern dünn und flexibel ausgebildet, ihr Durchmesser ist also im Mikrometerbereich. Bevorzugt ist ihr Querschnitt eben und senkrecht zur Länge sowie auf eine vollständige Nutzung der Kugeloberfläche ausgerichtet. Das bedeutet, einem Fußball gleich, wechseln Fünf- und Sechsecken einander ab. Weniger Lichtleitfasern sind erforderlich, wenn die so freibleibende Kugelinnenfläche reflektierend
} ausgebildet ist, z.B. als AlumMumkugel. Die so gesammelte Strahlung wird, insbesondere nach einer Querschnittsverkleinerung mit einer Konvergenz, besser mit einem Parabolspiegelpaar zur Erhaltung der Kollimation, auf eine Detektoreinrichtung gelenkt.
Auch Lichtleiter können als Probenträger dienen, z.B. als mit der Probe gefülltes Rohr oder Hohlfaser, als volle Faser mit der Probe in einer bevorzugt mittigen Lücke und mit in Gießharz 5 fixierter Probe.
Lichtquellen sind z.B. thermische, bunte und kohärente Strahler. Erforderlich ist dabei eine
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Leistung ab 10 , 10 bis über 10 Photonen pro Sekunde, je nachdem welche optischen Einrichtungen mit welchem Verlust bis zur Probe durchstrahlt werden. Dabei eignen sich Farbstofflaser für weite Spektralbereiche. Ihr spektrales Auflösungsvermögen läßt sich verbessern ) z.B. durch Abstimmung nach Fabry-Perot oder Etalon sowie eine Modenselektion und Modenkopplung mit elektronischer Nachregelung auf eine scharfe Spektrallinie. Für eine gepulste Anregung der Probe kommen z.B. elektronische Unterbrecher, Blitzlampen und Chopper zum Einsatz. Reflektoren können, auch zum bevorzugt einseitigen Lichtdurchtritt, teildurchlässig, z.B. 1%, ausgebildet sein.
5 Ein Chopper trennt, auch zur Verbesserung des Signal/Rausch- Verhältnises, zeitlich getrennte Vorgänge wie Reflexion und Streulicht, stimulierte Emission, spontane Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Statt einer chemischen Abtrennung der Purinbasen wird zur Vereinfachung der Sequenzanalyse die mit einer charakteristischen Mikrowelleneinstrahlung stimulierte Elektronenspinumkehr von deren,
) ggf. auch von den Pyrimidinbasen, angeregten Zuständen in relativ langlebige Tripletts herangezogen. Für rund eine Sekunde fallen diese dann bei der regulären Absorption aus. Auch das zweite nicht mit angeregte Elektron kann mit einer anderen charakteristischen Mikrowelleneinstrahlung zur Spinumkehr stimuliert werden. Geschieht das, so kann ein Sigulettzustand nicht mehr (so schnell) relaxieren und scheidet so lange Zeit bei der regulären
5 Absorption ebenfalls aus. Ebenfalls meßbar sind charakteristische J-R-Absorptionen bzw. Ramanstreuungen speziell auch der Streck- und Biegeschwingungen der Basenreste am Sauerstoff des ersten Kohlenstoffatoms vom Zucker.
Die chemische Verbesserung der Fluoreszenzintensität kann auch durch eine photochemische Derivatisierung mit einem organischen Reagenz während der Dauer des angeregten Zustandes ) erfolgen. Dazu eignet sich beispielsweise Hydrochinon.
Der Kontakt zwischen Probe und Träger kann auch mit Hilfe eines Klebers, z.B. ein haushaltsüblicher Klebstoff, gefestigt werden. Ebenso ist die Verlängerung der Probe an einem Ende möglich. Das geschieht mit einem anderen Polymermolekül, welches chemisch daran gebunden wird, beispielsweise über eine Kondensationsreaktion.
5 Als chemische Umgebung der Probe eignen sich auch unpolare Lösungsmittel wie Ether oder Hexan, eine glasige Alkohol-Ether-Matrix nach Spolsky bei tiefer Temperatur oder Hochvakuum mit dem Vorteil, daß dabei der ggf. wegen seiner Reflexion störende Glaskolben der Detektorröhre entfallen kann.
Wird die Probe mit dem Tunnelstrom angeregt, so ist sie vorteilhafterweise wasserfrei zu messen. 3 Dabei stören dann die starken elektrischen Felder „nackter" Natriumionen, welche daher durch großvolumige organische Kationen mit weiträumig delokalisierter Ladung zu ersetzen sind. Dazu eignet sich beispielsweise ein quarternäres organisches Ammoniu salz.
Die Datenspeicherung ist kompakter, wenn bei mehreren Messungen an derselben Position nur noch ein gültiges Signal abgespeichert wird. Störende Längenschwankungen werden durch eine 5 relativ hohe Konstanz der Arbeitstemperatur durch Thermostatisierung, Abschattierung gegen äußere Wärmequellen und Verwendung von Werkstoffen mit besonders niedrigem Ausdehnimgskoefϊizient sowie entsprechend erschütterungsarme Lagerung des Spektrometers erreicht. Das geschieht z.B. wie beim Turmelmikroskop mit einer besonderen Aufhängung oder wie bei einem Seismographen mit einer besonders schweren Masse. „Low-leveP'-meßplatztypische ) Vorkehrungen sind nach außen die Sttahlenabscbirmung, z.B. durch übliche mehrere cm dicke Bleiwände, und innerhalb des Spektrometers durch die Verwendung radioisotopenarmer Materialien.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Molekülanalyse ist dadurch gekennzeichnet, daß
I) im Prinzip der Meßstrahl eines herkömmlichen Spektrometers für Transmissions- und 5 Fluoreszenzmessungen mit z.B. 2 mm Durchmesser durch das „molekulare Spotlight" als molekular dünnem Meßstrahl ersetzt wird,
II) der Detektor eines herkömmlichen Spektrometers durch einen solchen mit höchstmöglicher Nachweisempfindlichkeit im jeweiligen Meßbereich ersetzt wird,
πi) die Verstärl mgselekttonik z.B. im Tiefsttemperaturbereich bei Temperaturen um -196 °C 3 bis unter 1 K (-272 °C) betrieben wird,
IV) der Meßstrahl auch nach jeweils charakteristischer Intensität, Wellenlänge, spektraler Auflösung, Kohärenzlänge, Polarisierung, Phase sowie der Dauer von Puls und Pause auf eine möglichst maximale und selektive Absorption abgestimmt ist und
V) bei Gasen und in Lösung mit einem viereckigen Meßstrahl gearbeitet wird.
5 Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, daß bei Schritt I) eine Gasmeßzelle, ggf. mit beheizbarer Wand, verwendet wird. In einer besonders bevorzugten Variante erfaßt der Lichtweg in der Gasmeßzelle die gesamte Irmenquerschnittsfläche. Die mehrfache Totalreflexion des Meßstrahls, auch mit mehreren Meßstrahlen, ermöglicht das beispielsweise. Die nicht durchstrahlten Teilflächen sollten dabei nicht wesentlich größer als ein
0 Meßstrahl sein. Entweder bewegt sich dessen Fläche durch das Meßvolumen oder das Gas durchströmt sie. Dieser kann dazu statt rund z.B. auch viereckig ausgebildet sein. Das geschieht vor der optischen Verkleinerung, ggf. nach vorheriger Aufweitung des Meßstrahls z.B. auf 5 cm, mit Hilfe einer entsprechend geformten Blende. Auch die Meßzelle selbst kann viereckig und reflektierend ausgebildet sein.
5 Wird dabei die Absorption duch Komponenten des Trägergases, in der Regel Luft, in einem zur Charakterisierung erforderlichen spektralen Meßbereich zu groß, so muß dieses Gas durch ein insbesondere darin schwächer absorbierendes Gas wie Edelgas, z.B. Argon, ersetzt werden. Störende Partikel wie Aerosole usw. werden zuvor abgetrennt, z.B. elektrostatisch oder durch Filtration.
Als Feststoff läßt sich ein Molekül auch in einem Kapillarrohr optisch untersuchen. Vorteilhaft ist auch eine Anreicherung der gesuchten Substanz oder deren Stoffgruppe. Für das Aufspüren von Sprengstoffen eignen sich die dafür charakteristischen starken Absorptionsbanden organischer Nitoverbindungen im lR-Spektrum bei 1650, 1290 und 850 cm" sowie mittlere Intensitäten bei
760 und 700 cm . Im Gegensatz zur Sequenzanalyse steht hier zur Bestimmung eines Moleküls eine wesentlich längere Meßzeit zur Verfügung. Diese kann beispielsweise unter einer Sekunde liegen, aber auch bis zu einer Stunde dauern.
Um aus einem parallelen Lichtstrahl mit den üblichen 2 mm Durchmesser einen solchen mit 200 p ohne störende Beugungserscheinungen als ,,molekulares Spotlight" zu erzeugen, ist beispielsweise ein Parabolspiegelpaar mit fl = 10 km und £2 = 1 mm, 3 gleiche Paare mit fl = 1 m und £2 = 4,6 mm oder 7 gleiche Paare mit fl = 1 m und £2 = 10 cm erforderlich. Wird der Lichtstrahl dabei um mehr als 7 Größenordnungen verkleinert, so kann damit, bevorzugt bei fixierter Lage der Probe, statt des ganzen Chromophors auch nur ein einzelnes Orbital räumlich selektiv angeregt werden.
Um die spektrale Auflösung zu erhöhen, kann eine Kopie der Probe, desgleichen eine synthetische Probe zur molekularen Datenspeicherung, mit intensiver und schneller emittierenden, jedoch bevorzugt fluoreszierenden, Luminophoren synthetisiert und danach vorteilhafter sequenziert werden.
Um möglichst jedes emittierte Photon auf den Detektor zu lenken, sollten möglichst alle Komponenten ideal transparent, absorbierend und reflektierend sein, also jeweils von hohem Wirkungsgrad.
Zur Ortsbestimmung der gerade untersuchten Position innerhalb der Sequenz einer Probe eignet sich außer der „optischen Spreizung" auch ein „Picospalt", welcher im Strahlengang auch nach der Probe angeordnet und mit einer Blende gegen Strahlung benachbarter Positionen versehen ist. In diesem Sinne wirkt auch die Transmission des Anregungsstrahls. Desgleichen die stimulierte Emission, sowohl bei der Stimulierung mit einem „molekularen Spotlight" als auch bei der resultierenden doppelten Emission. Erfindungsgemäß werden die für Sequenzpositionen spezifischen Photonen zur Erzielung möglichst kurzer Meßzeiten, unter einer Mikrosekunde pro Sequenzposition, nach der spektralen Zerlegung auf eine bevorzugt peletiergekühlte CCD-Kamera gelenkt. Bei Meßzeiten weit unter 0 einer Nanosekunde wird ein schneller elektronischer Zwischenspeicher mit zeitverzögerter Datenausgabe, also ein Transientenspeicher, eingesetzt. Ebenso ist der Parallelbetrieb mehrerer Mikroprozessoren möglich.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung zur Sequenzanalyse weist zehn wesentliche Merkmale auf:
5 1) Eine elektromagnetische Anregung einer Sequenzposition mit einer lateralen Auflösung im Größenordnungsbereich vom Abstand benachbarter Positionen der Probe mit dem „molekularen Spotlight",
2) eine stimulierte Emission an derselben Sequenzposition der Probe,
3) eine, z.B. piezoelektronisch, bewegte Reflelrtoreinrichtung zur Lenkung des „molekularen 0 Spotlights" auf die jeweilige Sequenzposition der Probe,
4) eine ähnliche Reflektoreinrichtung zur Lenkung der Emission auf die Detektoreinrichtung,
5) eine hochwirksame Kühlung der Probe mit mehrfachem Laserstrahl und Wärmeableitkontakten,
6) eine relativ hohe Nachweisempfindlichkeit des Detektors im Größenordnungsbereich von 5 einem Photon,
7) eine relativ kurze Detektions- und Datenverarbeitungszeit unter einer Nanosekunde,
8) eine störfrequenzfreie Stromversorgung und abgeschirmte Messungen z.B. in einem Farady- Käfig,
9) eine Kühlung der Verstärkungselektronik z.B. im Tiefsttemperaturbereich und
!0 10) einen Bildausschnitt in der Größe der längsten Probe.
Als erfindungswesentliche Merkmale sind bei diesem Verfahren anzusehen, daß örtlich eine selektive optische Anregung einer Sequenzposition der Probe mit Hilfe des „molekularen Spotlights" erfolgt und für Transmissions- und Fluoreszenzmessungen eine Detektion des resultierenden Antwortsignals im Bereich höchstmöglicher Nachweisempfindlichkeit und kürzester Meßzeit orts- und gattungsspezifisch durchgeführt wird. Es kann dazu auch die Variante der Erregerspekftoskopietechnik genutzt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Spektrometer zur Durchfuhrung der oben genannten Verfahren. Dabei sind Vorrichtungen bzw. Einheiten vorhanden, welche die Durchführung der oben genannten Verfahrensschritte sinngemäß ermöglichen.
Das Prinzip der Erfindung wird im folgenden anhand der Anregung einer Probe zur Aussendung einer Lumineszenz erläutert.
Wie jede Emission von elektromagnetischer Strahlung und von Materiestrahlung, läßt sich auch die Lumineszenz mit Hilfe von beiden Strahlungsarten anregen. Bevorzugt geschieht das optisch, aber auch mit Elektronen. Prinzipiell eignen sich dazu auch elektrische Felder allein, insbesondere als Wechselfelder ausgebildet, sowie eine ausreichend hohe Temperatur, welche jedoch über dem Zersetzungspunkt der meisten organischen Substanzen liegt.
Doppelstrangmoleküle werden bevorzugt, insbesondere thermisch, in Einzelstrangmoleküle aufgeschmolzen und danach einzeln untersucht. Es besteht die Möglichkeit, daß die zu sequenzierenden Moleküle z.B. in einer Kapillare mit Lichtsammeieffekt gemessen werden.
Die helikale Slxuktur der DNA-Makromoleküle mit m = 10 = primäre- / sekundäre Identitätsperiode bleibt auch bei der Einzelstrangversion erhalten. Das bedeutet, die Kernbasen folgen einander um jeweils 36 ° verdreht. Um sie alle aus der selben Richtung messen zu können, ist eine Rotation um die Längsachse erforderlich.
Die Verfeinerung der spektralen Zerlegung mit einer Monochromatoreinrichtung, z.B. mit Hilfe eines holographisch erzeugten Gitters mit bauartbedingt optimierter Helligkeit, kann insbesondere mit Fabry-Perot-Platten zu noch höherer spektraler Auflösung gebracht werden.
Erfindungsgemäß werden die für eine Position der Probe charakteristischen Photonen, die bekanntlich von diversen angeregten Spezies stammen können, zur Erzielung möglichst kurzer
Meßzeiten auf jeweils einen gemeinsamen Detektor pro positionsspezifischer Gattung gelenkt. Das kann ein Photomultiplier sein, ebenso eine peletiergekühlte CCD-Kamera. Zur Erzielung eines gültigen Antwortsignals muß mit dem Wirkungsgrad dieser Erfindung eine Position etwa zwei bis eintausendmal angeregt werden. Sechs Detektoren genügen zur einfachen, raschen und automatischen Feststellung, ob DNA oder RNA vorhegt, des Anteils an seltenen Sondernukleotiden sowie des genauen Polymerisationsgrads.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung weist fünf wesentliche Merkmale auf:
1) Eine relativ hohe laterale Auflösung im Bereich des minimalen Positionsabstands der Probe, bei Nukleinsäuren = 0,34 nm,
2) eine relativ hohe Nachweisempfϊndlichkeit des Detektors im Größenordnungsbereich von einem Photon,
3) eine relativ hohe Quantenausbeute von der Anregung bis zur Detektion,
4) eine relativ kurze Detektionszeit, z.B. unterhalb einer Mikro- bis Nanosekunde,
5) eine ebenso kurze Zeit für einen anschließenden Datenverarbeitungsschritt und
6) eine tiefstgekühlte Verstärkungselektronik.
Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 ist die schematische Darstellung eines Spektrometers für Absorptions- und Fluoreszenzmessungen zur Diircl fuhrung einer Molekül- und Sequenzanalyse mit einem „molekularen Spotlight". Es besteht aus: Einer Lichtquelle (76), einer Vorsatzoptik (96), z.B. einem Kondensor, einer
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Regeleinrichtung für die optische Intensität (81), z.B. von 0 bis 10 Photonen pro Sekunde, einer Monochromatoreinrichtung (78), einem Polarisator (80), einem Chopper (82), einem parallelen Lichtstrahl mit etwa 2 mm Durchmesser, einem ersten Parabolspiegel (52,1) mit Brennweite f 1 und Brennpunkt F 1, einem zweiten Parabolspiegel (52,2), beliebig vielen weiteren Parabolspiegelpaaren (52,3 + 52,4 usw.), einem Strahlteiler (92) zur Abzweigung des Referenzstrahls (99) vom Meßstrahl (97), der Probe (12) mit gerade gemessener Position an der Stelle „X" in einer durch den gestrichelten Kreis symbolisierten Meßzelle bzw. Umlenk- und Sammeloptik, einem Chopper (82) zur Einkoppelung der senkrechten Emission, einem Polarisator (80), einem Chopper (82) zur Einkoppelung des Referenzstrahls, einer Monocliromatoreinrichtung (78), einem Polarisator (80), einer Regeleinrichtung für die optische Intensität (81), einem ersten Detektor (14 / Dl), einer Einrichtung zur Signalverstärkung (86), einer elektrischen Leitung (32), einer Steuer-, Auswert- und Speichereinrichtung (18) und einer Datenausgabeeinheit (88). Der Referenzstrahl (99) wird zwischen Abzweigung und Einkoppelung entweder auf einen dritten Detektor (D3) oder auf eine Umlenkvorrichtung (62) gerichtet. Desgleichen die senkrechte Emission auf einen zweiten Detektor (D2) oder auf eine Umlenkvorrichtung (62).
Figur 2 zeigt eine behebig frei bewegliche Anordnung des Probenträgers (22) bestehend aus zwei Tunnelmikroskopspitzen (24 + 28) mit der daran hängenden Probe (12 / 40) dazwischen. Daraufist die gerade gemessene Position mit „X" gekennzeichnet. Weiter folgt der Anregungsstrahl (97), die Transmission (98) und die zugehörige Detelstoreinrichtung (14). Ferner die Einstrahlung zur stimulierten Emission (34), die Antwort aus Lumineszenz (30) mit Rayleighstreuung und stimulierter Emission (36) sowie die zugehörige Detektoreinrichtung (14). Die x-Koordinate verläuft in Längsrichtung der Probe, die y-Koordinate verläuft dazu senkrecht und wiederum zu beiden senkrecht verläuft die z-Koordinate.
Wege zum Ausführen der Erfindung
Das folgende spezielle Ausfuhrungsbeispiel wird anhand der Sequenzanalyse von DNA-Molekülen beschrieben. Liegen sie als Doppelhelix vor, so werden sie bevorzugt über die thermische Methode aufgeschmolzen. Jeweils einer der Einzelstränge (40) der Probe (12) wird zwischen zwei Spitzen (24) und (28) eines Tunnelmikroskops gut handhabbar fixiert und dabei in Längsrichtung (x) ausgebreitet (siehe Figur 2). Beide Spitzen sind über eine Halterung miteinander verbunden und in allen Richtungen nach Bedarf frei beweglich.
Mit einem „molekularen Spotlight" wird die Probe zu einer ersten Bestimmung der Lage (Topographie) grob untersucht. Gemessen wird dabei die Absorption, Emission oder Streuung. Die Lichtintensität liegt dabei unterhalb der Sättigung des Chromophors und die Wellenlänge im Bereich von ER. bis 230 nm. Eine merkliche Absorption beginnt bei λ = 310 nm. Die so erhaltenen Koordinaten (x, y und z) werden abgespeichert, wobei vorteilhafterweise y und z = 0 gesetzt werden (Oberkannte der Sequenzpositionen) und die erste Position bei x = 0 beginnt.
Bei einem weiteren feinen Durchlauf erfolgt die Bestimmung der Positionskoordinaten der Probe und deren Speicherung oder auch gleich die Anregung zur Emission einer Lumineszenz (30) Ferner kann sowohl ein separater zweiter Feindurchlauf durchgeführt werden, als auch ein Anregungssignal (20) über ein unmittelbar dahinter folgendes zweites „molekulares Spotlight" abgegeben werden.
Nach den Figuren 1 und 2 ist ein Spektrometer vorhanden, das ein ,,molekulares Spotlight" erzeugt und auf die fixierte Probe lenken kann. Es weist eine Detel toreinrichtung (14), einen tiefstgekühlten elektronischen Verstärker (86) und eine Steuer-, Auswert- und Speichereinrichtung (18) auf, gefolgt von einer Ausgabeeinheit für die Daten.
Die exakte Positionierung der Probe im Spektrometer hinsichtlich des Ortes ihrer Sequenzposition (X) ist in den Figuren 1 und 2 schematisch durch die Koordinatenpfeile x, y und z dargestellt.
Es wird zunächst die Ortskoordinate x (läßgsX Y (quer) und z (hoch) der jeweiligen Sequenzposition (X) fest bestimmt. Bei den nachfolgenden Positionen genügt in der Regel die Bestimmung der x-Koordinate, da y und z meist konstant bleiben, bevorzugt beim Wert 0. In einem weiteren Durchlauf wird dann an dieser Stelle (X) = n der Chromophor mit dem Anregungssignal (20) beaufschlagt, woraufhin der so entstandene Luminophor die Lumineszenz (30) abgibt, welche von einer Detektoreiririchtung (14) aufgenommen und anschließend von der Steuer-, Auswert- und Speichereinrichtung (18) ausgewertet, gespeichert und von der Datenausgabe (88) ausgegeben wird.
Bevorzugt ist der Durchmesser und damit die relativ hohe laterale Auflösung des Anregungsstrahls (20/97) in der Größenordnung typischer Positionsabstände innerhalb der Probe also von 0,34 nm.
Das folgende spezielle Ausfuhrungsbeispiel zur Sequenzanalyse wird anhand doppelsträngiger DNA-Moleküle beschrieben. Die Probe wird einem Abstrich von der Wangenschleimhaut aus der Mundhöhle eines Menschen entnommen. Es folgen der enzymatische Aufschluß mit einer Lyse von Zellwand und Zellkern, gefolgt von der Isolienmg, Abtrennung und Reinigung in einem Arbeitsgang durch eine beschleunigte Gelpermeationschromatographie mit einer besonders kurzen Säule, mit Unterdruck an der Entnahmeseite und mit Zentrifugalkraft. Dauer etwa lA bis 1 Stunde, auch automatisiert. Bei unzureichender spektraler Reinheit der Probe gefolgt von der ggf. wiederholten Nachreinigung, also Phenolextraktion und Präzipitationen aus wässriger Lösung durch Isopropanol oder Ethanol. Sodann erfolgt die thermische Trennung der Doppelstränge in zwei komplementäre Einzelstränge durch Erwärmung auf über 65 bis 90 °C in Wasser. Ggf. mit etwas Glycerin oder einem Gemisch aus Natriumchlorid und -citrat, versetzen.
Durch Zugabe von Phthalat-Salzsäure-Puffer wird bei Raumtemperatur pH 3 eingestellt. Ggf. ) wieder erwärmen. Gemisch erneut einer Gelpermeationschromatographie unterziehen oder in eine Schale gießen, eintrocknen lassen, mit reinem Wasser nachspülen, wieder eintrocknen lassen. Elektrostatisch, ggf. mit Biotin, die Probe an zwei Spitzen fixieren und in die Haltevorrichtung verbringen. Spitzen ohne Abriß der Probe auseinanderziehen und in den Meßstrahl bringen.
Zur Kontrolle von Lage und Größe ist die Transmission, Fluoreszenz ggf. auch das Streulicht zu > messen. Dazu mit einem Photon pro Sekunde beginnen und dann die Intensität bis zur Sättigung hochfahren. Bei einer mit beliebiger lateraler Auflösung stimulierten Emission liegt die Sättigungsintensität um einige Größenordnungen höher. Die Bestimmungen werden genauer, wenn möglichst wenig für eine Messung überzählige Photonen die Detektion belasten. Das läßt sich durch die selektive Auswahl einer charakteristischen Polarisation erreichen, günstig ist auch eine ) entsprechend hohe spektrale Auflösung der Anregungsstrahlung. Ebenso beeinflußt auch die Phase den Erfolg der Absorption eines Lichtquants. Diese läßt sich durch Triggerung der Blitzlampe oder des Choppers günstig verschieben. Auch eine darauf abgestimmte Verlängerung des Lichtwegs ist günstig. Wärmeableitkontakte und die meist mehrfache Nutzung der Laserkühlung führen störende Wärme ab.
ϊ Position 1 der Probe in den Meßstrahl bringen und die Transmission bei λ = 260 nm messen, desgleichen bei λ = 230 nm. Der jeweils kaum geschwächte Meßstrahl zeigt die abwesenden Basen Adenosin (A) und Guanosin (G) an. Der bei λ = 230 nm kaum und bei λ = 260 nm signifikannt geschwächte Meßstrahl zeigt Thymin (T) an. Erfolgt beidemal eine annähernd gleiche und deutliche Abschwächung des Meßstrahls, so liegt Cytosin (C) vor. Das Ergebnis wird elektronisch
» abgespeichert.
Mit piezoelektrischen, auch feinmechanischen oder thermohydraulischen, Aktoren wird die Probenhalterung relativ zum Spektrometer positionsweise bis zur letzten Position nach jeder erfolgreichen Messung weiterbewegt. Nach erreichen der begrenzten maximalen Auslenkung des Aktors wird der bewegte vordere Teil dort fixiert, der hintere Anfangsteil auf minimale i Auslenkung zurückgestellt, dabei nachgeführt, fixiert und die Fixierung des vorderen Teils wieder aufgehoben. Alternativ bewegen die Aktoren einen Reflektor, der den Meßstrahl von der ersten bis zur letzten Sequenzposition der halbkreisartig angeordneten Probe lenkt. Bei Messungen der Transmission lenkt ein zweiter ebenso bewegter Reflektor den Strahl auf einen ortsfesten Detektor. Bei Messungen der Fluoreszenz wird die Probe bewegt.
Der komplementäre Strang wird genauso sequenziert und dann mit Hilfe der EDV die sinngemäße komplementäre Richtung und die komplette Sequenz bestimmt. Das Ergebnis wird abschließend als komplettes Sequenzprotokoll oder nur in Form besonderer Abweichungen sowie molekulargenetischer Diagnose und Prognose mit Therapievorschlägen auf einem Datenträger gespeichert ausgegeben. Das geschieht beispielsweise auf einem Magnetband, einem Speicherchip oder einer gebrannten CD-ROM.
Das folgende spezielle Ausführungsbeispiel zur molekularen Datenspeicherung wird anhand nach dem Stand der Technik synthetisierter DNA-Moleküle beschrieben. Buchstaben und Ziffern werden nach dem Morsealphabet, Punkt und Strich analog, auf die Basenfolge C und T der Nukleinsäuren als molekularem Datenspeicher übertragen. Abgelesen werden diese Informationseinheiten wie unter Sequenzanalyse bereits beschrieben, jedoch ohne Abtrennung der Purinbasen.
Ein weiteres Beispiel zum Ablesen gespeicherter Daten ersetzt in herkömmlichen Ablesegeräten den Lesestrahl für die Informationseinheiten, auch Pits genannt, durch das ,,molekulare Spotlight", beispielsweise in Form des dünnen konvergenten oder parallelen Lichtstrahls. So können diese Pits immer kleiner gemacht werden.
Das folgende spezielle Ausführungsbeispiel zur Molekülanalyse wird anhand von Lysergsäurediethylamid beschrieben. In herkömmlichen Spektrometern zur Spurengasanalyse wird der zu dicke Meßstrahl durch das „molekulare Spotlight" in Form des dünnen, parallelen und viereckigen Lichtstrahls ersetzt. Der Einstrahlungswinkel auf die Reflektoren der Meßzelle mit einem Volumen von 1 mm3 bis 1 cm3 ist dabei noch flacher. Statt einem Volumen wird nur noch eine Fläche ausgeleuchtet, auch mehrfach von allen Seiten, die entweder durch das Volumen bewegt wird oder durch welche hindurch das Meßgas strömt. Die charakteristische und maximale IR- Absorption erscheint hierbei um 1620 cm" .
Als erfindungswesentliche Merkmale sind bei diesem Analyseverfahren anzusehen, daß örtlich eine selektive Anregung im atomar-molekularen Größenordnungsbereich erfolgt und gleichzeitig eine Detektion des resultierenden spezifischen Antwortsignals der Sequenzposition im Bereich höchstmöglicher Nachweisempfindlichkeit selektiv vom Ort der Anregung durchgeführt wird. So können einfache, automatisierbare, schnelle, preiswerte, direkte und sequenztreue Analysen von (Makro-)Molekülen und ihren Teilen sowie von Spurenmolekülen erfolgen. Insbesondere kann damit ein Humangenom innerhalb kürzester Zeit, unter einem Monat bis zu einer Viertelstunde, sequenziert werden und das zu einem krankenkassenfahigen Kostensatz.
Sowohl die Herstellung solcher Spektrometer, auch vollautomatisch, als auch deren Anwendung zu analytischen Dienstleistungen ist möglich, insbesondere für die Gen-, Polymer- und Spurenanalytik.

Claims

Patentansprüche
1) Analyseverfahren für Moleküle und zur Sequenzierung molekularer Proben, dadurch gekennzeichnet, daß
+A) die Probe mit Hilfe einer Teilchenstrahlung zur Emission eines analytischen Antwortsignals angeregt wird, +B) die Probe eine Rotation erfährt und
+C) die Probe wasserfrei gemessen wird.
2) Verfahren nach Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, daß eine Phasenanalyse des Teilchenstroms als analytischem Antwortsignal durchgeführt wird.
3) Verfahren nach Anspruch 1), dadurch gekennzeichnet, daß die Natriumionen der Probe durch besondere Kationen ersetzt werden.
4) Verfahren nach Anspruch 3), dadurch gekennzeichnet, daß die besonderen Kationen relativ groß sind und eine weiträumig delokalisierte Ladung aufweisen.
5) Verfahren nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß die besonderen Kationen eine quarternäre organische Ammoniumverbindung sind.
6) Verfahren nach Anspruch 4), dadurch gekennzeichnet, daß die besonderen Kationen eine organische Kronenetherverbindung sind.
7) Analyseverfahren für Moleküle und zur Sequenzierung molekularer Proben, dadurch gekennzeichnet, daß
+A) die Probe mit Hilfe einer elektromagnetischen Strahlung zur Emission eines analytischen Antwortsignals angeregt wird,
+B) dazu ein „molekulares Spotlight" verwendet wird und
+C) die Probe mit einer besonderen charakteristischen Qualität angeregt wird.
8) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die elektromagnetische Strahlung im Bereich des ultravioletten, sichtbaren und infraroten Lichts liegt. 9) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die elektromagnetische Strahlung im Bereich charakteristischer Wellenlängen der Probe liegt.
10) Verfahren nach Anspruch 9), dadurch gekennzeichnet, daß die charakteristischen Wellenlängen einer Nukleinsäureprobe bei 260 nm und 230 nm hegen.
11) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die besondere charakteristische Qualität als Intensität so charakteristisch ausgebildet ist, daß sie vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird.
12) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die besondere charakteristische Qualität als Wellenlänge so charakteristisch ausgebildet ist, daß sie vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird.
13) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die besondere charakteristische Qualität als spektrale Auflösung so charakteristisch ausgebildet ist, daß sie vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird.
14) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die besondere charakteristische Qualität als Kohärenzlänge so charakteristisch ausgebildet ist, daß sie vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird.
15) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die besondere charakteristische Qualität als Polarisierung so charakteristisch ausgebildet ist, daß sie vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird.
16) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die besondere charakteristische Qualität als Phase so charakteristisch ausgebildet ist, daß sie vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird.
17) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß die besondere charakteristische Qualität als Dauer von Puls und Pause so charakteristisch ausgebildet ist, daß sie vom anzuregenden Molekülteil maximal absorbiert wird.
18) Verfahren nach Anspruch 7), dadurch gekennzeichnet, daß das analytische Antwortsignal eine Transmission ist. 19) Verfahren nach Anspruch 1) und 7), dadurch gekennzeichnet, daß das analytische Antwortsignal eine Lumineszenz ist.
20) Verfahren nach Anspruch 19), dadurch gekennzeichnet, daß die Lumineszenz eine Fluoreszenz ist.
21) Verfahren nach Anspruch 18) bis 20), dadurch gekennzeichnet, daß das analytische Antwortsignal eine stimulierte Emission ist.
22) Verfahren nach Anspruch 1) und 7), dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzemissionsposition des analytischen Antwortsignals bestimmt wird.
23) Verfahren zur Erzeugung eines konvergenten ,,molekularen Spotlights", dadurch gekennzeichnet, daß ein paralleler Lichtstrahl und ein nicht aberrierter Parabolspiegel verwendet werden.
24) Verfahren zur Erzeugung eines parallelen „molekularen Spotlights", dadurch gekennzeichnet, daß ein paralleler Lichtstrahl und mehrere nicht aberrierte Parabolspiegel verwendet werden.
25) Verfahren zur Erzeugung eines polarisierten „molekularen Spotlights", dadurch gekennzeichnet, daß ein polarisierter Lichtstrahl und ein „Picospalt" verwendet werden.
26) Verfahren nach Anspruch 25), dadurch gekennzeichnet, daß linear polarisiertes Licht verwendet wird.
27) Analyseverfahren für Moleküle und zur Sequenzierung molekularer Proben, dadurch gekennzeichnet, daß
+A) das resultierende Antwortsignal eine elektromagnetische Strahlung ist,
+B) diese Emission mit einer extra Umlenk- und Sammeloptik in hoher Quantenausbeute der Detektion zugeführt wird und
+C) eine Bestimmung der Sequenzposition erfolgt, von der das analytische Antwortsignal ausgeht.
28) Verfahren nach Anspruch 27), dadurch gekennzeichnet, daß die elektromagnetische Strahlung direkt einem Detektor zugeführt wird. 29) Verfahren nach Anspruch 27), dadurch gekennzeichnet, daß die elektromagnetische Strahlung nach einer spektralen Filterung einem Detektor zugeführt wird.
30) Verfahren nach Anspruch 27), dadurch gekennzeichnet, daß die elektromagnetische Strahlung nach einer spektralen Zerlegung einem Detektor zugeführt wird.
31) Verfahren nach Anspruch 27), dadurch gekennzeichnet, daß die Umlenk- und Sammeloptik ein Paraboloid ist.
32) Umlenk- und Sammeloptik, dadurch gekennzeichnet, daß in der Oberfläche einer Kugel senkrecht Lichtleiterfaserbündel eingelassen sind.
33) Verfahren nach Anspruch 27), dadurch gekennzeichnet, daß die Umlenk- und Sammeloptik eine Kugel ist, deren Innenfläche mit Detektorelementen ausgekleidet ist.
34) Verfahren nach Anspruch 27), dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der Sequenzposition, von der das analytische Antwortsignal ausgeht, mit Hilfe der „optischen Spreizung" erfolgt.
35) Verfahren nach Anspruch 34), dadurch gekennzeichnet, daß zur „optischen Spreizung" ein relativ langer kompakt angeordneter Lichtleiter verwendet wird.
36) Verfahren nach Anspruch 34), dadurch gekennzeichnet, daß zur „optischen Spreizung" planparallele Spezialspiegel verwendet werden.
37) Verfahren nach Anspruch 27), dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der Sequenzposition, von der das analytische Antwortsignal ausgeht, mit Hilfe des „Picospalts" mit einer Blende erfolgt, der nach der Probe angeordnet ist.
38) Spektrometer zur Durchführung des Verfahrens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1) bis 37).
39) Spektrometer nach Anspruch 38), dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Detektoren und Mikroprozessoren mit über 2,65 Gigahertz besonders schnell sind.
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