[go: up one dir, main page]

WO2003038124A1 - Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees - Google Patents

Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees Download PDF

Info

Publication number
WO2003038124A1
WO2003038124A1 PCT/FR2002/003762 FR0203762W WO03038124A1 WO 2003038124 A1 WO2003038124 A1 WO 2003038124A1 FR 0203762 W FR0203762 W FR 0203762W WO 03038124 A1 WO03038124 A1 WO 03038124A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cbg
seq
transition
hypercortisolemia
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/003762
Other languages
English (en)
Inventor
Marie-Pierre Moisan
Pierre Mormede
Denis Milan
Jean-Pierre Bidanel
Olga Ousova
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0114156A external-priority patent/FR2831556B1/fr
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority to EP02785578A priority Critical patent/EP1440164A1/fr
Priority to JP2003540389A priority patent/JP2005507262A/ja
Priority to CA002465320A priority patent/CA2465320A1/fr
Publication of WO2003038124A1 publication Critical patent/WO2003038124A1/fr
Priority to US10/833,970 priority patent/US20040248179A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/890,368 priority patent/US20080115236A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention has for application 1) the selection of farm animals having a lower probability of developing hypercortisolemia 2) the genetic diagnosis of patients likely to develop hypercortisolemia. 3) the treatment of pathologies linked to constitutive hypercortisolemia. Described are the methods of identifying genetic markers of transcortin and the methods of genetic screening to determine individuals susceptible to developing hypercortisolemia.
  • glucocorticoids The hormones glucocorticoids, cortisol in humans and pigs, corticosterone in rodents, are involved in many biological processes such as neoglucogenesis, lipid and protein metabolism, anti-inflammatory action and growth. Glucocorticoids are also a major component of stress responses. After exposure to stress, cortisol is quickly released from the adrenal glands to provide the energy necessary for behavioral response. By negative feedback, the cortisol level returns to baseline when this stimulus is controlled by the individual. Otherwise, as in situations of chronic stress, high and constant cortisol levels are highly harmful to the body.
  • cortisol and the corticotropic axis in general are involved in various pathologies including obesity (Rosmond et al., 1998), constitutive sensitivity to inflammatory and autoimmune reactions (Sternberg and Gold, 1997), aging (Lupien et al., 1998) or awareness of drugs of abuse (Piazza and Le Moal, 1998).
  • corticotropic axis Significant variability in the functioning of the corticotropic axis is observed between individuals, which influences individual vulnerability to the pathologies mentioned above. This variability is partly of genetic origin as evidenced by several twin studies on the reactivity of the corticotropic axis to stress and its circadian activity (Meikle et al., 1988; Kirschbaum et al., 1992; Linkowski et al. , 1993). Likewise, functional differences in the corticotropic axis have been highlighted between various inbred lines of mice or rats (Armario et al., 1995; (Marissal-Arvy et al., 1999) or between pig breeds (Désautés et al., 1999).
  • the inventors are precisely interested in identifying these genes according to (i) approaches which do not pose a starting hypothesis and which use genetic mapping of quantitative trait loci or QTLs.
  • Transcortin or CBG corticosteroid-binding globulin
  • CBG corticosteroid-binding globulin
  • the inventors have now demonstrated the role of transcortin on the production of cortisol and its implication in the variability of cortisolemia in pigs.
  • porcine Cbg gene is effectively found in the QTL region (demonstrated by FISH and by mapping on irradiated hybrids),
  • the Meishan pig therefore represents an excellent model for the study of the genetic variability of the corticotropic axis and its physiopathological consequences, for obesity in particular. It should also be remembered that in mice, a genomic locus associated with obesity was highlighted in 1995 by Warden (Warden et al., 1995). With current data on the mouse genome, it is possible to see that CBG is at the peak of the confidence interval for this QTL and again constitutes in this model a good candidate for position.
  • transcortin in humans have been described in the literature (Van Baelen et al., 1982) (Smith et al., 1992) and in two studies patients with a mutation in the transcortin gene are obese (Emptoz-Bonneton et al., 2000; Torpy et al, 2001)
  • the invention therefore firstly relates to a method of identifying polymorphic markers associated with the hypercortisolemia phenotype comprising the comparison of nucleic acid sequences, of several individuals, comprising all or part of the Cbg gene and the identification mutations in the Cbg gene or the sequences adjacent to it.
  • said nucleic acid sequences are genomic DNA sequences comprising a part of the Cbg gene or a distant adjacent 3 'or 5' sequence preferably at most 100 kb.
  • the cDNA sequence of the pig Cbg gene and an adjacent 5 'sequence of this gene can be used to search for markers of hypercortisolemia.
  • markers can be obtained from genomic clones comprising a part of the Cbg gene or flanking sequences, themselves obtained from a DNA library screening with a probe specific for the Cbg gene as described in part 4) from the Materials and Methods section.
  • polymorphic markers can be by example of microsatellites, insertion / deletion polymorphisms, restriction fragment length polymorphisms (RFLP) or single nucleotide polymorphisms (SNP).
  • RFLP restriction fragment length polymorphisms
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • the invention therefore also relates to a polymorphic marker associated with the ypercortisolemia phenotype consisting of all or part of a nucleic acid sequence comprising the Cbg gene or the adjacent 3 'or 5' sequences preferably preferably at most 100 kb apart.
  • the invention also relates to nucleotide primers flanking the above marker. Such primers comprise from 5 to 50 preferably from 10 to 30 successive nucleotides of the sequence of the Cbg gene or adjacent 3 'or 5' sequences preferably preferably at most 100 kb apart, flanking a marker defined above.
  • the invention also relates to a genetic screening method for identifying individuals susceptible to developing hypercortisolemia and the associated pathologies using polymorphic markers.
  • Such a method comprises: i) purification of an individual's genomic DNA from blood, tissue or sperm, in general, the DNA is purified from the leukocytes obtained from a blood sample according to conventional techniques , then ii) amplification of the locus containing the polymorphic marker by the polymerase chain reaction (or PCR) from said DNA, using the primers defined above, and iii) the detection of the allele (s) of said polymorphic marker in said amplified DNA.
  • the alleles present in the amplified DNA of the different individuals are detected by conventional electrophoresis techniques, advantageously preceded by an enzymatic digestion for the RFLPs.
  • SNP polymorphisms For point mutations, SNP polymorphisms, the techniques used include for example SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (Orita et al, 1989 PNAS 86: 2766-2770), allelepecific PCR (Gibbs 1987, Nucl Acid Res 17, 2427-2448) or direct sequencing of the amplified DNA.
  • SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
  • allelepecific PCR Gabbs 1987, Nucl Acid Res 17, 2427-2448
  • direct sequencing of the amplified DNA For point mutations, SNP polymorphisms, the techniques used include for example SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (Orita et al, 1989 PNAS 86: 2766-2770), allelepecific PCR (Gibbs 1987, Nucl Acid Res 17, 2427-2448) or direct sequencing of the amplified DNA.
  • Detection of marker alleles in an individual helps predict whether the marker is more likely to develop hypercortisolemia.
  • An example of such a point mutation in the Cbg gene is described in Figure 4 in the appendix.
  • the present invention also relates to the use of a genetic screening method to identify individuals capable of developing hypercortisolemia and the associated pathologies using polymorphic markers for the selection or counter-selection of farm animals, especially pigs, with a high probability of developing hypercortisolemia and a high fattening rate.
  • the work of the Applicant has allowed the detection, from the sequence of exons of the Cbg gene in pigs FI and F0, the following polymorphisms: transition G ⁇ T corresponding to position 133 of SEQ ID NO.l, transition C ⁇ T corresponding to position 134 of SEQ ID NO.l, - transition T ⁇ C corresponding to position 539 of SEQ ID NO.
  • transition A ⁇ G corresponding to position 620 of SEQ ID NO.l transition G ⁇ A corresponding to position 626 of SEQ ID NO.l, transition C ⁇ T corresponding to position 859 of SEQ ID NO .l, transition C ⁇ T corresponding to position 866 of SEQ ID NO.l, - transition A ⁇ G corresponding to position 882 of SEQ ID NO.l, transition G ⁇ C corresponding to position 890 of SEQ ID NO.l, transition C ⁇ T corresponding to position 960 of SEQ ID NO.l, transition G ⁇ A corresponding to position 1008 of SEQ ID NO.l, transition T ⁇ C corresponding to position 42 of SEQ ID NO.6, - transition C ⁇ T corresponding to position 49 of SEQ ID NO.6, transition C ⁇ T corresponding to position 75 of SEQ ID NO.7.
  • the present invention relates to the use of a genetic screening method to identify individuals, likely to develop hypercortisolemia and associated pathologies using polymorphic markers, in which the alleles of the polymorphic marker as defined above exhibit one of the mutations described above.
  • the invention also aims to offer a kit for implementing the above method for testing the genetic markers of hypercortisolemia from a DNA sample.
  • a kit comprises a pair of nucleotide primers as defined above which will be used with commercially available PCR amplification reagents.
  • the kit can also include negative and positive reaction and marker controls.
  • the invention also relates to a method for identifying substances capable of modulating the expression of the Cbg gene and / or its synthesis with the therapeutic aim of reducing hypercortisolemia.
  • the CBG protein, wild type or mutant can be used for in vitro screening of compounds capable of modifying the binding of CBG to cortisol and / or corticosterone. Consequently, the subject of the invention is a method of identifying substances capable of modulating the function of CBG consisting in measuring by any appropriate technique the binding of the compound to CBG
  • the binding activity between CBG and an active compound can for example be determined by a radio-binding test in which the binding capacity and the affinity of the compounds to be tested are estimated by their ability to move radioactive cortisol.
  • the source of CBG is obtained for example by transfection of a vector containing the cDNA of the Cbg gene into cells in culture.
  • the protein being secreted, the radio-binding test can be carried out on the culture medium. Compounds that effectively compete with cortisol will be selected.
  • the invention also relates to the use of animals overexpressing the Cbg gene or expressing a mutant of this gene as a study model for understanding the mechanisms of action of CBG on the corticotropic axis and / or for screening compounds capable of modulating the expression of CBG. Furthermore, the invention relates to transgenic animals in which the transgene contains a nucleic acid sequence contained in the CJbg gene or the adjacent adjoining 3 'and 5' sequences preferably at most 100 kb apart. Preferably, the sequences chosen encode a polypeptide identical or homologous to the CBG protein.
  • these transgenic animals are obtained by micro-injection into embryos of the animal (for example mouse, rat, pig) of a nucleic acid containing the coding sequence of the Cbg gene (for example SEQ ID no. l) as well as regulatory sequences allowing its over-expression in the target tissue (in this case the liver) as is conventionally used for this technology.
  • the animal for example mouse, rat, pig
  • a nucleic acid containing the coding sequence of the Cbg gene for example SEQ ID no. l
  • regulatory sequences allowing its over-expression in the target tissue (in this case the liver) as is conventionally used for this technology.
  • These animals can be used as a technical model to understand the mechanisms of action of CBG on the corticotropic axis and the pathologies associated with obesity, inflammatory and autoimmune responses, aging in particular cognitive, drug addiction. These animals can be used to screen for compounds capable of modulating the function of CBG.
  • the screening of compounds can be carried out by administration to the animal of the test compound followed by the measurement of the alterations in said animal of the corticotropic function by conventional methods.
  • the present invention also relates to a method of screening for a compound capable of modulating the expression of the Cbg gene and / or its synthesis and / or its binding to cortisol with the therapeutic aim of reducing hypercortisolemia and consequently of treating pathologies linked to this hypercortisolemia such as obesity, the constitutive sensitivity to inflammatory and autoimmune reactions or the pathologies of aging or awareness of drug abuse.
  • This method includes producing the CBG protein from cultured cells, for example, HepG2 cells and testing said compound for production of said protein.
  • this screening is a large-scale screening.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound capable of modulating the expression of the Cbg gene and / or its synthesis and / or its binding to cortisol, characterized in that it comprises screening in vivo on a transgenic animal such as described above, of a compound identified in vi tro according to the screening method above.
  • the identification of the genetic markers according to the invention makes it possible to have new tools for carrying out genetic tests for the CBG in order to assess the constitutive hypercortisolemia and consequently the vulnerability to the indicated pathologies. previously and in particular obesity. Such a test is also useful for the counter-selection of farm animals showing constitutive hypercortisolemia.
  • such a method comprises the PCR amplification of a region of the DNA of the sample comprising all or part of the Cbg gene and then the analysis of this region to identify the presence of at least one mutation responsible for hypercortisolemia and likely to have been identified by the method described above.
  • the invention therefore also relates to the use of the above method for the diagnosis of hypercortisolemia or of a predisposition to hypercortisolemia in a subject, in particular human, making it possible to identify a dysfunction of the corticotropic axis and therefore a disease or a predisposition to a disease linked to this axis such as obesity, the constitutive sensitivity to inflammatory and autoimmune reactions, or the pathologies of aging (in particular cognitive) or awareness of drugs of abuse.
  • the invention finally relates to the identification of a compound agonist or antagonist of CBG and therefore capable of acting directly on the level of CBG or on its affinity for cortisol, which indirectly will reduce the level of corticosteroids.
  • FIG. 2 shows the location of the pig Cbg gene at 7q26 by FISH.
  • FIG. 3 shows the genetic linkage analysis of plasma CBG concentrations in 81 F2 pigs.
  • FIG. 4 shows the detection of mutation in the genomic sequence of Cbg.
  • the arrows indicate the nucleotide for which the pig Fl # 9110045 and its mother Meishan are heterozygous (T / G) while the father LW is homozygous (G / G).
  • Significance thresholds along the chromosomes were determined empirically by simulating the data assuming an infinitesimal model and a normal distribution of performance. A total of 50,000 simulations were performed for each character.
  • BAC clones were isolated by three-dimensional PCR screening of a porcine bank of BAC clones as described previously (Rogel-Gaillard et al., 1999).
  • Clone BAC 383F4 containing the pig CBG sequence was cloned using a primer pair established from the sequence of exon 2 of human CBG: FW: ACACCTGTCTTCTCTGGCTG (SEQ ID NO: 4)
  • REV ACAGGCTGAAGGCAAAGTC (SEQ ID NO: 5)
  • the PCRs were performed on 35 cycles of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 56 ° C, 30 seconds at 72 ° C, in a reaction volume of 20 ⁇ l containing 0 , 2 mM of each dNTP, 1.5 mM of MgCl 2 ; 8 ⁇ M of each primer, 2U of Taq DNA polymerase and reaction buffer (Perkin-Elmer, Roche).
  • sequence reactions were carried out with the “Prism AmpliTaq FS diChloroRhodamine Dye Terminators” kit (Perkin Elmer) on an PE 970 automatic sequencer.
  • the binding capacity of CBG and its affinity for cortisol were measured at 4 ° C. by a solid phase binding test using a Concavalin A-Sepharose column (Pugeat et al., 1984).
  • the equilibrium association constant (Ka) and the capacity of CBG for cortisol were calculated by a Scatchard analysis using “bound” as the amount of cortisol specifically fixed to the glycoproteins adsorbed on the gel and “free” as the concentration of cortisol in the aqueous phase.
  • FISH fluorescent in situ hybridization
  • the clone BAC 383F4 made it possible to identify the genomic organization and the sequence of the Cbg gene which had never been cloned before.
  • the pig Cbg gene contains 5 exons with an AUG codon in exon 2.
  • the inventors found 66% and 80% homology between the pig CBG protein and respectively those of humans and sheep.
  • Sense primer 5 '-CCCTGTATGCCTGTCTCCTC-3'
  • Antisense primer 5 '-CCTGCTCCAAGAACAAGTCC-3' PCR conditions: lx PCR buffer (Promega), 1.5mM MgC12, 100 uM dNTP, 10 pmol of each primer, 0.4 U Taq polymerase (Promega ).
  • IMpRH server an RH mapping server available on the Web [In Process Citation].
  • a major quantitative trait locus influences hyperactivity in the WKHA rat. Nat Genet 14: 471-473.
  • Transcortin Leuven a variant of human corticosteroid-binding globulin with decreased cortisol- binding affinity. J Biol Chem 257: 3397-3400.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phénotype d'hypercortisolémie caractérisée en ce qu'elle comprend la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus, comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes. L'invention a également pour objet un marqueur polymorphe associé au phénotype d'hypercortisolémie constitué d'une séquence d'acide nucléique comprenant tout ou partie du gène Cbg ou des séquences 3' ou 5' adjacentes éloignées préférentiellement au plus de 100kb.

Description

UTILISATION DU GENE DE LA CBG COMME MARQUEUR GENETIQUE DE L' HYPERCORTISOLEMIE ET DES PATHOLOGIES ASSOCIEES.
La présente invention concerne l'utilisation du gène codant pour la transcortine (ou CBG=corticosteroid binding globulin) comme marqueur génétique de 1 ' hypercortisolemie constitutive et comme nouvelle cible thérapeutique de pathologies associées à 1 'hypercortisolemie . L'invention a pour application 1) la sélection des animaux d'élevage ayant une plus faible probabilité de développer une hypercortisolemie 2) le diagnostic génétique de patients susceptible de développer une hypercortisolemie. 3) le traitement de pathologies liées à 1 ' hypercortisolemie constitutive. Sont décrites les méthodes d'identification des marqueurs génétiques de la transcortine et les méthodes de criblage génétique pour déterminer les individus susceptibles de développer une hypercortisolemie . Les hormones glucocorticoïdes, cortisol chez l'homme et le porc, corticostérone chez les rongeurs, sont impliquées dans de nombreux processus biologiques comme la néoglucogénèse, le métabolisme lipidique et protéique, l'action anti- inflammatoire et la croissance. Les glucocorticoïdes sont aussi un composant majeur des réponses de stress. Après exposition à un stress, le cortisol est rapidement libéré des glandes surrénales pour fournir l'énergie nécessaire à la réponse comportementale. Par rétrocontrôle négatif, le niveau de cortisol retourne à des valeurs de base lorsque ce stimulus est contrôlé par l'individu. Dans le cas contraire, comme dans les situations de stress chronique, les niveaux élevés et constants de cortisol sont fortement délétères pour l'organisme. Ainsi, le cortisol et l'axe corticotrope en général sont impliqués dans diverses pathologies dont l'obésité (Rosmond et al., 1998) , la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes (Sternberg and Gold, 1997) , le vieillissement (Lupien et al. , 1998) ou la sensibilisation aux drogues d'abus (Piazza and Le Moal, 1998) .
Une importante variabilité du fonctionnement de l'axe corticotrope est observée entre individus, ce qui influence la vulnérabilité individuelle aux pathologies citées ci-dessus. Cette variabilité est en partie d'origine génétique comme en témoignent plusieurs études de jumeaux portant sur la réactivité de l'axe corticotrope au stress et son activité circadienne (Meikle et al . , 1988; Kirschbaum et al., 1992; Linkowski et al., 1993) . De même, des différences fonctionnelles de l'axe corticotrope ont été mises en évidence entre diverses lignées consanguines de souris ou de rats (Armario et al., 1995; (Marissal-Arvy et al., 1999) ou entre races de porcs (Désautés et al., 1999) .
L'identification des gènes supportant cette variabilité du fonctionnement de l'axe corticotrope est donc d'une grande importance pour la santé humaine et animale. Chez l'homme, des études d'association ont été menées entre des gènes régulateurs de l'axe corticotrope et des pathologies liées au dysfonctionnement de cet axe. Par exemple, des polymorphismes du récepteur aux glucocorticoïdes ont été trouvés associés à l'obésité abdominale (Buemann et al., 1997) .
Les Inventeurs se sont précisément intéressés à identifier ces gènes selon (i) des approches ne posant pas d'hypothèse de départ et utilisant la cartographie génétique de locus de traits quantitatifs ou QTL
(Quantitative Trait Loci) sur modèles animaux (Moisan et al., 1996) , et (ii) des approches «gènes candidats» basés sur la connaissance du rôle de ces gènes dans le fonctionnement de l'axe corticotrope (Marissal-Arvy et al . , 2000) .
Ces deux stratégies ont été mises en œuvre sur le gène codant pour la transcortine, et les travaux ayant conduit à la présente Invention ont concerné à la fois une analyse de QTL et de la fonction connue de ce gène. La transcortine ou CBG (corticosteroid-binding globulin) est une protéine de liaison plasmatique des hormones glucocorticoïdes qui a été étudiée pour son rôle de transporteur du cortisol et son influence sur la biodisponibilité de celui-ci.
Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence le rôle de la transcortine sur la production du cortisol et son implication dans la variabilité de la cortisolëmie chez le porc .
Ces résultats ont été obtenus suite aux travaux des Inventeurs sur la recherche des gènes influençant le fonctionnement de l'axe corticotrope chez le porc, et mettant en œuvre la méthode de cartographie génétique de QTL sur un croisement de deux races porcines : Large hite européen et Meishan chinois.
Une forte liaison génétique a été trouvée entre les concentrations plasmatiques de cortisol des porcs et un locus du chromosome 7 porcin (Bidanel et al . , 2000) . Par cartographie comparée avec le génome humain, il s'est avéré maintenant que le gène de la transcortine se trouvait dans l'intervalle défini par l'analyse génétique :
- le gène Cbg porcin se trouve effectivement dans la région du QTL (démontré par FISH et par cartographie sur hybrides irradiés) ,
- l'analyse de liaison génétique faite avec la concentration plasmatique de transcortine (au lieu du cortisol) sur la même population F2 montre également une forte liaison avec le locus du chromosome 7, - la concentration de CBG est différente chez les deux races de porcs parentaux Large White et Meishan,
- une mutation intéressante a été trouvée dans la région codante du gène Cbgr chez le porc Meishan. Le gêne Cbg constitue donc un « candidat de position » pour ce QTL chez le porc.
Ces résultats de l'analyse de liaisons génétiques mettent en évidence, pour la première fois, une relation de cause à effet entre des variants moléculaires de la transcortine et la production de cortisol.
Par ailleurs, le porc Meishan qui est hypercortisolémique est également obèse et montre un retard de croissance par rapport au Large White ce qui pourrait être une conséquence de ses taux élevés de cortisol. En faveur de cette hypothèse, une corrélation positive a été trouvée chez les individus F2 entre les taux de cortisol et l'épaisseur de lard dorsal. Cette relation a été retrouvée dans une population F2 Duroc x Large White entre cortisol urinaire, lard dorsal et proportion de viande maigre dans la carcasse (Mormède P. non publié) . Suite à ces résultats une nouvelle analyse statistique a permis de mettre en évidence une liaison génétique entre l'épaisseur de lard dorsal et le locus du chromosome 7 dans la population de porcs F2 (Meishan x large White) . La figure 5 illustre la liaison génétique entre l'épaisseur de lard dorsal et le QTL d' hypercortisolemie . Le gène cbg se trouve en position 1,35 Morgan du chromosome 7, au pic du second QTL présenté sur cette figure. Cortisolémie et dépôt de gras convergent donc vers ce locus contenant le gène de la transcortine. Le porc Meishan représente donc un excellent modèle pour l'étude de la variabilité génétique de l'axe corticotrope et ses conséquences physiopathologiques, pour l'obésité en particulier. Il convient en outre de rappeler que chez la souris, un locus génomique associé à l'obésité a été mis en évidence en 1995 par Warden (Warden et al., 1995) . Avec les données actuelles sur le génome de la souris, il est possible de voir que la CBG est au pic de l'intervalle de confiance de ce QTL et constitue de nouveau dans ce modèle un bon candidat de position.
Enfin, chez l'homme une relation inverse entre la concentration de CBG et 1 ' hyperinsulinémie a été rapportée au cours de l'obésité, tandis que les diabétiques ont une CBG plus élevée (Fernandez-Real et al., 1999) (Fernandez-Real et al., 2000). Ces relations pourraient s'expliquer par l'effet inhibiteur de l'insuline sur la production hépatique de CBG (Grave et al. , 1995) .
Des variants moléculaires de la transcortine chez l'homme ont été décrits dans la littérature (Van Baelen et al., 1982) (Smith et al., 1992) et dans deux études les patients ayant une mutation dans le gène de la transcortine sont obèses (Emptoz-Bonneton et al., 2000 ; Torpy et al, 2001)
L'ensemble des données recueillies dans diverses espèces animales à partir de différentes approches, permet de considérer les variations de la CBG au cours de l'obésité comme un facteur important de la biodisponibilité du cortisol impliqué dans la physiopathologie de la maladie.
Ces résultats sont remarquables car aucun marqueur de cortisolémie constitutive n'est disponible à ce jour. Un tel marqueur permet de déterminer à partir d'un échantillon de sang, et dès la naissance, la cortisolémie d'un individu. Cette cortisolémie va influencer la vulnérabilité à l'obésité, aux réactions auto-immunes et inflammatoires, la vitesse de croissance, le vieillissement, la toxicomanie. L'invention trouve donc des applications dans le domaine de la sélection d' animaux d' élevage , comme le porc , portant des allèles favorables du gène de la transcortine , ainsi que pour le diagnostic géné t i que che z l ' homme de p réd i spo s i t i on à 1 ' hypercortisolemie constitut ive et ses conséquences pathologiques ci -dessus . Enf in , l ' invention permet de disposer d' un nouvel outil de criblage de substances ut i les pour trai ter ces pathologies l iées à un dysfonctionnement de l ' axe corticotrope .
L'invention a donc tout d'abord pour objet une méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phenotype d' hypercortisolemie comprenant la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus, comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes.
On entend par individus tant des sujets humains que des animaux. Avantageusement, lesdites séquences d'acide nucléique sont des séquences d'ADN génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou une séquence 3' ou 5 ' adjacente éloignée préfèrentiellement au plus de lOOkb.
A titre d'exemple, la séquence de l'ADNc du gène Cbg de porc et une séquence 5' adjacente de ce gène, qui sont représentées dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 3 respectivement, peuvent être utilisées pour rechercher des marqueurs de l' hypercortisolemie. Ces marqueurs peuvent être obtenus à partir de clones génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou des séquences flanquantes, eux-mêmes obtenus à partir d'un criblage de banque d'ADN avec une sonde spécifique du gène Cbg comme décrit dans la partie 4) de la section Matériel et Méthodes. Ces marqueurs polymorphes peuvent être par exemple des microsatellites, des polymorphismes d' insertion/dëlétion, des polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) ou des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP) . Le séquençage d'un segment d'ADN couvrant le locus polymorphe permet de définir des amorces nuclêotidiques permettant l'amplification spécifique dudit segment à partir d'ADN génomique total d'un individu.
L'invention a donc également pour objet un marqueur polymorphe associé au phenotype d' ypercortisolemie constitué de tout ou partie d'une séquence d' acide nucléique comprenant le gène Cbg ou les séquences 3' ou 5' adjacentes éloignées préférentiellement au plus de lOOkb. L' invention concerne également des amorces nuclêotidiques flanquant le marqueur ci -dessus. De telles amorces comprennent de 5 à 50 de préférence de 10 à 30 nuclêotides successifs de la séquence du gène Cbg ou des séquences 3' ou 5' adjacentes éloignées préférentiellement au plus de lOOkb, flanquant un marqueur défini ci-dessus.
L' invention se rapporte aussi à une méthode de criblage génétique pour identifier les individus, susceptibles de développer une hypercortisolemie et les pathologies associées à l'aide de marqueurs polymorphes.
Une telle méthode comprend : i) la purification d'ADN génomique d'un individu à partir de sang, de tissu ou de sperme, en général, l'ADN est purifié à partir des leucocytes obtenus d'un prélèvement sanguin selon les techniques classiques, puis ii) l'amplification du locus contenant le marqueur polymorphe par la réaction de polymérase en chaîne (ou PCR) à partir dudit ADN, à l'aide des amorces définies ci-dessus, et iii) la détection du ou des allèles dudit marqueur polymorphe dans ledit ADN amplifié.
Selon le type de polymorphisme du marqueur, différentes techniques peuvent être utilisées : - Pour les polymorphismes de longueur
(microsatellites, insertion/délétion, RFLP) les allèles présents dans les ADN amplifiés des différents individus sont détectés par les techniques classiques d' électrophorèse , avantageusement précédées d'une digestion enzymatique pour les RFLP.
Pour les mutations ponctuelles, polymorphismes de type SNP, les techniques utilisées incluent par exemple la SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (Orita et al, 1989 PNAS 86 : 2766-2770) , la PCR allèle- pécifique (Gibbs 1987, Nucl Acid Res 17, 2427- 2448) ou le séquençage direct de l'ADN amplifié.
La détection des allèles du marqueur chez un individu permet de prédire si celui-ci est plus susceptible de développer une hypercortisolemie. Un exemple d'une telle mutation ponctuelle dans le gène Cbg est décrit dans la figure 4 en annexe.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une méthode de criblage génétique pour identifier les individus, susceptibles de développer une hypercortisolemie et les pathologies associées à l'aide de marqueurs polymorphes pour la sélection ou contre- sélection d'animaux d'élevage, notamment de porcs, ayant une forte probabilité de développer une hypercortisolemie et un taux d'engraissement élevé.
Les travaux de la Demanderesse ont permis la détection, à partir de la séquence des exons du gène Cbg chez les porcs FI et F0, les polymorphismes suivants : transition G → T correspondant à la position 133 de la SEQ ID NO.l, transition C → T correspondant à la position 134 de la SEQ ID NO.l, - transition T → C correspondant à la position 539 de la SEQ ID NO.l, transition A → G correspondant à la position 620 de la SEQ ID NO.l, transition G → A correspondant à la position 626 de la SEQ ID NO.l, transition C → T correspondant à la position 859 de la SEQ ID NO.l, transition C → T correspondant à la position 866 de la SEQ ID NO.l, - transition A → G correspondant à la position 882 de la SEQ ID NO.l, transition G → C correspondant à la position 890 de la SEQ ID NO.l, transition C → T correspondant à la position 960 de la SEQ ID NO.l, transition G → A correspondant à la position 1008 de la SEQ ID NO.l, transition T → C correspondant à la position 42 de la SEQ ID NO.6, - transition C → T correspondant à la position 49 de la SEQ ID NO.6, transition C → T correspondant à la position 75 de la SEQ ID NO.7.
Les séquences SEQ ID NO . 6 et 7 dans la liste de séquences en annexe correspondant respectivement à la partie 5' et à la partie 3' de l'intron C du gène Cbg de porc. Par conséquent, la présente invention concerne l'utilisation d'une méthode de criblage génétique pour identifier les individus, susceptibles de développer une hypercortisolemie et les pathologies associées à l'aide de marqueurs polymorphes, dans laquelle les allèles du marqueur polymorphe tel que défini précédemment présente une des mutations décrites ci-dessus.
L' invention vise également à offrir un kit pour la mise en œuvre de la méthode ci -dessus permettant de tester les marqueurs génétiques de l' hypercortisolemie à partir d'un échantillon d'ADN. Un tel kit comprend une paire d'amorces nuclêotidiques comme définies précédemment qui seront utilisées avec des réactifs d'amplification par PCR disponibles commercialement. Le kit peut aussi inclure des contrôles négatifs et positifs des réactions et des marqueurs .
L'invention se rapporte aussi à une méthode pour identifier des substances capables de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse dans le but thérapeutique de réduire une hypercortisolemie. En effet, la protéine CBG, de type sauvage ou mutante, peut être utilisée pour un criblage in vitro de composés capables de modifier la liaison de la CBG au cortisol et/ou à la corticostérone . En conséquence, l'invention a pour objet une méthode d' identification de substances capables de moduler la fonction de la CBG consistant à mesurer par toute technique appropriée la liaison du composé à la CBG
(sauvage ou mutante) . Il peut s'agir d'une technique utilisant les méthodes de criblage à grande échelle décrites dans la littérature comme par exemple dans l'ouvrage « High throughput screening : The discovery of Bioactive Substances », JP Delvin (Ed) , Marcel Dekker Inc. New York (1997) .
L'activité de liaison entre la CBG et un composé actif peut par exemple être déterminée par un test de radio-liaison dans lequel la capacité de liaison et l'affinité des composés à tester sont estimés par leur capacité de déplacement de cortisol radioactif . La source de CBG est obtenue par exemple par transfection d' un vecteur contenant l ' ADNc du gène Cbg dans des cellules en culture . La protéine étant sécrétée , le test de radio- liaison peut-être réalisé sur le milieu de culture . Les composés entrant ef f icacement en compétition avec le cortisol seront sélectionnés .
L ' invention concerne également l ' util isation d' animaux surexprimant le gène Cbg ou exprimant un mutant de ce gène comme modèle d ' étude pour comprendre les mécanismes d' action de la CBG sur l ' axe corticotrope et/ou pour cribler des composés capables de moduler l ' expression de la CBG . De plus , l ' invention concerne des animaux transgéniques dont le transgène contient une séquence d' acide nucléique contenu dans le gène CJbg ou les séquences 3 ' et 5 ' adj acentes éloignées préférentiellement au plus de 100 kb . De préférence, les séquences choisies codent pour un polypeptide identique ou homologue à la protéine CBG .
A titre d'exemple, ces animaux transgéniques sont obtenus par micro-injection dans des embryons de l'animal (par exemple souris, rat, porc) d'un acide nucléique contenant la séquence codante du gène Cbg (par exemple SEQ ID n°l) ainsi que des séquences régulatrices permettant sa sur-expression dans le tissu cible (dans ce cas le foie) comme il est classiquement d'usage pour cette technologie.
Ces animaux peuvent être utilisés comme modèle technique pour comprendre les mécanismes d'action de la CBG sur l'axe corticotrope et les pathologies associées à l'obésité, les réponses inflammatoires et auto-immunes, le vieillissement en particulier cognitif, les toxicomanies. Ces animaux peuvent être utilisés pour cribler des composés capables de moduler la fonction de la CBG.
Le criblage de composés peut être réalisés par l'administration à l'animal du composé à tester suivie de la mesure des altérations dans ledit animal de la fonction corticotrope par les méthodes classiques.
La présente invention concerne également une méthode de criblage d'un composés capable de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse et/ou sa liaison au cortisol dans le but thérapeutique de réduire une hypercortisolemie et par voie de conséquence de soigner les pathologies liées à cette hypercortisolemie comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes ou encore les pathologies du vieillissement ou la sensibilisation à l'abus de drogues. Cette méthode comprend la production de la protéine CBG à partir de cellules en culture, par exemple, les cellules HepG2 et le test dudit composé vis-à-vis de la production de ladite protéine. Avantageusement, ce criblage est un criblage à grande échelle.
La présente invention concerne également une méthode de criblage d'un composé capable de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse et/ou sa liaison au cortisol caractérisée en ce qu'elle comprend le criblage in vivo sur un animal transgénique tel que décrit précédemment, d'un composé identifié in vi tro selon la méthode de criblage ci-dessus.
L'identification des marqueurs génétiques selon l'invention permet de disposer de nouveaux outils pour la réalisation de tests génétiques pour la CBG afin d'évaluer l' hypercortisolemie constitutive et par voie de conséquence la vulnérabilité aux pathologies indiquées précédemment et notamment l'obésité. Un tel test est également utile pour la contre-sélection d'animaux d'élevage montrant une hypercortisolemie constitutive.
A titre d'exemple, une telle méthode comprend l'amplification par PCR d'une région de 1 ' ADN de l'échantillon comprenant tout ou partie du gène Cbg puis l'analyse de cette région pour identifier la présence d'au moins une mutation responsable d'une hypercortisolemie et susceptible d'avoir été identifiée par la méthode décrite précédemment.
L'invention se rapporte donc aussi à l'utilisation de la méthode ci-dessus pour le diagnostic d'une hypercortisolemie ou d'une prédisposition à une hypercortisolemie chez un sujet, notamment humain, permettant d'identifier un dysfonctionnement de l'axe corticotrope et donc une maladie ou une prédisposition à une maladie liée à cet axe comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes, ou encore les pathologies du vieillissement (en particulier cognitives) ou la sensibilisation aux drogues d'abus.
L'invention se rapporte enfin à l'identification de composé agoniste ou antagoniste de la CBG et donc capable d'agir directement sur le taux de CBG ou sur son affinité pour le cortisol ce qui indirectement réduira le taux de corticostéroïdes .
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant l'identification de mutations dans le gène Cbg chez le porc et l'analyse de liaisons génétiques mettant en une relation de cause à effet entre des variants moléculaires de la CBG et la production de cortisol. Il sera fait référence aux figures en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente la localisation du gène Cbg de porc par cartographie sur hybrides irradiés . En A: Evolution du taux maximal de vraisemblance le long de Sscr 7 (en cM) pour les concentrations de cortisol plasmatique. En B: profil de cartographie par hybrides irradiés du chromosome 7 de porc. Les distances sont en
- la figure 2 représente la localisation du gène Cbg de porc à 7q26 par FISH. - La figure 3 représente l'analyse de liaison génétique des concentrations de CBG plasmatique sur 81 porcs F2.
- La figure 4 représente la détection de mutation dans la séquence génomique de Cbg . Les flèches indiquent le nucléotide pour lequel le porc Fl#9110045 et sa mère Meishan sont hétérozygotes (T/G) alors que le père LW est homozygote (G/G) .
I - Matériel et Méthodes . 1) Cartographie sur hybrides irradiés.
Les réactions ont été réalisées indépendamment en double sur un panel ImpRH (Yerle et al., 1998) . Les produits de PCR ont été analysés sur des gels d'agarose 2% en tampon IX TBE après coloration au bromure d'éthidium. Une troisième amplification a été effectuée sur les clones pour lesquels des résultats discordants avaient été obtenus. Les vecteurs des résultats d'amplification ont été soumis à la banque ImpRH (Milan et al. 2000) . 2) Cartographie FISH. Les chromosomes en métaphase ont été obtenus à partir de cultures de lymphocytes de sang périphérique. Pour identifier les chromosomes, les métaphases ont été marquées en bandes G en utilisant une technique G-T-G avant hybridation, et les images des meilleures métaphases ont été prises avec une imprimante vidéo comme décrit antérieurement (Yerle et al . , 1992) .
Les expériences d'hybridation in situ ont été réalisées conformément à Yerle et al. (Yerle et al. , 1992) . Avec quelques modifications (Sun et al., 1999) .
3) Analyse de liaisons génétiques. La distribution des données selon une loi normale a d'abord été vérifiée. Les quatre caractères présentaient des distributions logarithmiques normales et les données ont été transformées en scores logarithmiques avant analyse. La cartographie QTL a été effectuée en utilisant des techniques de vraisemblance maximum multipoints. Un test statistique défini comme le rapport des vraisemblances sous les hypothèses de un (Hl) contre pas (HO) de QTL lié au jeu de marqueurs considéré a été calculé en chaque position (chaque cM) le long du chromosome. La carte de marqueur du chromosome 7 utilisée a été calculée à partir des génotypes de plus de 1100 porcs par Bidanel et al. (2000). Selon l'hypothèse Hl, un QTL avec un effet de substitution de gène pour chaque père et mère a été adapté aux données. D'autres détails sur les procédures de calcul de probabilités peuvent être trouvés dans Bidanel et al. (2000). Les estimations des effets moyens de substitution ont été calculées à chaque position avec le plus fort rapport de probabilité.
Les seuils de signification le long des chromosomes ont été déterminés empiriquement en simulant les données en supposant un modèle infinitésimal et une distribution normale des performances. Un total de 50 000 simulations ont été réalisés pour chaque caractère. Le niveau de signification du test chromosomique Pc correspondant à un test de probabilité du génome entier Pg a été obtenu en utilisant la correction de Bonferroni, i.e. en tant que solution de : Pg = 1 - (1 - Pc) 19, qui donne Pc = 0,0027 et 0,000054, respectivement, pour des niveaux significatifs (Pg = 0,05) et très significatif (Knott et al. , 1998) .
4) Criblage de la banque d'ADN de BAC.
Les clones BAC ont été isolés par criblage PCR trois dimensions d'une banque porcine de clones BAC comme décrit précédemment (Rogel-Gaillard et al., 1999). Le clone BAC 383F4 contenant la séquence CBG de porc a été clone en utilisant une paire d'amorces établie à partir de la séquence de l'exon 2 de CBG humaine : FW : ACACCTGTCTTCTCTGGCTG (SEQ ID NO :4)
REV : ACAGGCTGAAGGCAAAGTC (SEQ ID NO :5) Les PCR ont été réalisés sur 35 cycles de 30 secondes à 94°C, 30 secondes à 56°C, 30 secondes à 72°C, dans un volume de réaction de 20 μl contenant 0,2 mM de chaque dNTP, 1,5 mM de MgCl2 ; 8pM de chaque amorce, 2U de Taq DNA polymérase et de tampon de réaction (Perkin-Elmer, Roche) .
5) Séquençage .
Les réactions de séquences ont été réalisées avec le kit « Prism AmpliTaq FS diChloroRhodamine Dye Terminators » (Perkin Elmer) sur un séquenceur automatique PE 970.
La capacité de liaison de CBG et son affinité pour le cortisol ont été mesurées à 4°C par un test de fixation en phase solide utilisant une colonne Concavalin A-Sepharose (Pugeat et al., 1984) . La constante d'équilibre d'association (Ka) et la capacité de CBG pour le cortisol ont été calculées par une analyse de Scatchard utilisant « bound » comme la quantité de cortisol spécifiquement fixée aux glycoprotéines adsorbées sur le gel et « free » comme la concentration de cortisol dans la phase aqueuse .
7) Statistiques. Les matrices de corrélation et le test Student t ont été effectués en utilisant la version 5 du logiciel Statistica .
II - Résultat.
1) La cartographie comparative permet de proposer le gène Cbg comme candidat au QTL d'hypercortisolemie .
Goureau et al. (2000) ont décrit les correspondances des segments de chromosomes humains et porcins en utilisant une analyse de peinture chromosomique bi-directionnelle . Le QTL cortisol flanqué par les marqueurs S0101 et Sw764 a été localisé sur la région porcine 7q2.4-7q2.6. Parmi les gènes localisés sur la région hortologue humaine (Hsapl4q) , le gène codant pour la CBG localisé en Hsapl4q32.1 (Billingsley et al., 1993) a retenu l'attention. En effet 90% du cortisol plasmatique est fixé à la CBG qui est une glycoprotêine synthétisée par le foie. Puisque seulement le cortisol libre est actif, la CBG a un rôle majeur dans le bio-disponibilité du cortisol. Ainsi, le gène Cbg constitue un bon candidat fonctionnel pour ce QTL associé à des niveaux de cortisol.
Puisque le gène Cbg avait été clone chez l'homme, le singe, le mouton et la souris (Hammond et a l., 1987 ; Hammond et al., 1994 ; Berdusco et al., 1993 ; Orava et al., 1994), il a été possible d'aligner les différentes séquences disponibles en utilisant le programme Mul talin (Corpet, 1988) et de préparer des amorces oligonucléotidiques consensus à partir de l'exon 2 pour obtenir un fragment PCR de Cbg de porc. Après vérification de la forte homologie de la séquence du fragment PCR avec le gène Cbg d'autres espèces, les amorces ont été utilisées pour cartographier le gène Cbg de porc en utilisant un panel d'hybrides irradiés (Yerle et al., 1988). Comme montré sur la figure 1, il a alors été trouvé que le gène Cbg de porc se trouve entre les marqueurs S0101 et SW764 comme le QTL cortisol.
Cette localisation chromosomique a été confirmée par hybridation in situ fluorescente (FISH) . Tout d'abord une banque BAC génomique de porc a été criblée par PCR avec des amorces amplifiant l'exon 2 du gène Cbg de porc. Un clone de 150 kb, dénommé BAC 383F4, contenant la totalité de la séquence génomique du gène Cbg de porc a été obtenu. Ce clone BAC a été utilisé comme sonde pour cartographier le gêne CJbg de porc par FISH sur un étalement de chromosomes en métaphase et, comme montré à la figure 2, il a été confirmé que le gène Cbg de porc se trouve en 7q26 du chromosome.
2) La capacité de liaison de la CBG est génétiquement liée aux marqueurs flanquant le QTL d' hypercortisolemie .
La capacité de liaison de la CBG au cortisol a été mesurée dans le plasma de 81 porcs F2 à partir du croisement d'origine, tous descendants du porc FI #911045. Comme attendu, une forte corrélation a été trouvée entre cette mesure et le niveau de cortisol (r = 0,57). La liaison génétique entre cette nouvelle mesure phénotypique et les marqueurs Ssc7 a été évaluée. La figure 3 montre qu'une forte liaison génétique est détectée exactement dans la même région que pour le QTL cortisol . La probabilité maximale est même supérieure avec les valeurs CBG
(p<5.1θ"4) ce qui renforce l'implication du gène Cbgr dans ce QTL. 3) La capacité de liaison de la CBG est différente entre les porcs LW et MS .
Au niveau des protéines, la capacité de liaison au cortisol et la constante d'affinité de CBG ont été comparées entre les porcs LW et Meishan par des études de radio-liaison. Aucune différence d'affinité n'a été trouvée entre les 2 races de porc. Toutefois, comme le montre le tableau 1 ci-dessous, la capacité maximale de liaison était en moyenne 1.6 fois supérieure chez les porcs Meishan par rapport aux porcs LW (p<0,001).
Tableau 1
Figure imgf000020_0001
4) Identification d'une mutation dans le gène
Cbg.
Le clone BAC 383F4 a permis d'identifier l'organisation génomique et la séquence du gène Cbg qui n'avait jamais été clonée auparavant. Comme dans les autres espèces, le gène Cbg de porc contient 5 exons avec un codon AUG dans l'exon 2. Au niveau des acides aminés, les Inventeurs ont trouvé 66% et 80% d'homologie entre la protéine CBG de porc et respectivement celles de l'humain et de mouton.
Afin de rechercher des mutations, les exons et 900pb de la région du promoteur d'un animal FI, de son père LW et de sa mère Meishan ont été séquences. Il a été considéré que ce porc FI (#911045) devait être hétérozygote au QTL puisqu'il y avait une différence significative dans les niveaux moyens de cortisol entre la progéniture qui avait reçu l'un ou l'autre allèle du marqueur S0101 flanquant le QTL. En conséquence, la mère Meishan devrait avoir au moins un allèle différent du père LW au niveau de la mutation en cause. Une mutation de ce type a été identifiée dans l'exon 2 du porc FI #9110045. En position +15 à partir du codon de départ ATG, cet animal est hétérozygote avec une mutation ponctuelle G — T sur un allèle (figure 4) . Cette substitution G —> T correspondant au codon 15, change une serine en une isoleucine dans le peptide signal de la protéine CBG. Le test d'amplification par PCR a été optimisé avec les paramètres suivants :
Amorce sens : 5' -CCCTGTATGCCTGTCTCCTC-3' Amorce antisens : 5' -CCTGCTCCAAGAACAAGTCC-3 ' Conditions PCR : lx tampon PCR (Promega) , 1.5mM MgC12, 100 uM dNTP, 10 pmol de chaque amorce, 0.4 U Taq polymerase (Promega) .
Programme du thermocycleur :
1) 96°C : 5 min
2) 92°C : 30 S 3) 60°C : 1 min 4) 72°C : 30s
5) étape 2) 3) et 4) 34 fois
6) 72°C 2 min
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
- Armario, A., Gavalda, A., and Marti, J. (1995) . Comparison of the behavioural and endocrine response to forced swimming stress in five inbred strains of rats. Psychoneuroendocrinology 20:879-890.
- Berdusco, E. T., Hammond, G. L., Jacobs, R. A., Grolla, A., Akagi, K. , Langlois, D., and Challis, J. R. (1993) . Glucocorticoid-induced increase in plasma corticosteroid-binding globulin levels in fetal sheep is associated with increased biosynthesis and altérations in glycosylation. Endocrinology 132:2001-2008.
- Bidanel, J. P., Milan, D., Chevalet, C, Woloszyn, N. , Bourgeois, F., Caritez, J. C, Gruand, J. , Le Roy, P., Bonneau, M., Lefaucheur, L., Mourot, J.,
Prunier, M., Désautés, C, Mormède, P., Renard, C,
Vaiman, M., Robic, A., Gellin, J., and Ollivier, L.
(1998) . Détection de locus à effets quantitatifs dans le croisement entre les races porcines Large White et meishan. Dispositif expérimental et premiers résultats. Journées Rech Porcine en France 30:117-125.
- Bidanel, J. P., Milan, D. , Iannuccelli, N., Amigues, Y., Bosher, M. -Y., Bourgeois, F., Caritez, J.-C, Gruand, J. , Le Roy, P., Lagand, H. B. M., Lefaucheur, L., Mourot, J. , Prunier, A., Désautés, C, Mormède, P., Renard, C, Vaiman, M., Robic, A., Gellin, J. , Ollivier, L., and Chevalet, C. (2000) . Détection de locus à effets quantitatifs dans le croisement entre les races porcines Large White et Meishan: Résultats et Perspectives. Journées Rech Porcine en France 32:369-383.
- Billingsley, G. D., Walter, M. A., Hammond, G. L., and Cox, D. W. (1993) . Physical mapping of four serpin gènes : alpha 1 - ant i t rypsin , alpha 1- antichymotrypsin, corticosteroid-binding globulin, and protein C inhibitor, within a 280-kb région on chromosome I4q32.1. Am J Hum Genêt 52:343-353.
- Buemann, B., Vohl , M. C, Chagnon, M., Chagnon, Y. C, Gagnon, J., Perusse, L., Dionne, F., Despres, J. P., Tremblay, A., Nadeau, A., and Bouchard, C. (1997) . Abdominal viscéral fat is associated with a Bell restriction fragment length polymorphism at the glucocorticoid receptor gène locus. Obes Res 5:186-192.
Corpet, F. (1988) . Multiple séquence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res 16:10881-10890.
- Grave, J. C, Lejeune, H., Brebant, C, Baret, C, and Pugeat, M. (1995). Differential effects of insulin and insulin-like growth factor I on the production of plasma steroid-binding globulins by human hepatoblastoma- derived (Hep G2) cells. J Clin Endocrinol Metab 80:1283-1289.
- Désautés, C, Bidanel, J. P., and Mormède, P. (1997) . Genetic study of behavioral and pituitary- adrenocortical reactivity in response to an environmental challenge in pigs. Physiol Behav 62:337-345.
- Désautés, C, Sarrieau, A., Caritez, J. C, and Mormède, P. (1999) . Behavior and pituitary-adrenal function in Large White and Meishan pigs. Domestic animal endocrinology 16:193-205.
- Emptoz-Bonneton, A., Cousin, P., Seguchi , K. , Avvakumov, G. V., Bully, C, Hammond, G. L., and Pugeat, M. (2000). Novel human corticosteroid-binding globulin variant with low cortisol- binding affinity. J" Clin Endocrinol Metab 85:361-367.
Fernandez-Real, J. M., Grasa, M., Casamitjana, R. , Pugeat, M., Barret, C, and Ricart, W. (1999) . Plasma total and glycosylated corticosteroid- binding globulin levels are associated with insulin sécrétion. J" Clin Endocrinol Metab 84:3192-3196. Fernandez-Real, J. M., Grasa, M., Casamitjana, R., and Ricart, W. (2000) . The insulin résistance syndrome and the binding capacity of cortisol binding globulin (CBG) in men and women. Clin Endocrinol (Oxf) 52:93-99.
- Goureau, A., Vignoles, M., Pinton, P., Gellin, J., and Yerle, M. (2000). Improvement of comparative map between porcine chromosomes 1 and 7 and human chromosomes 6, 14, and 15 by using human YACs. Mamm Génome 11:796-799.
- Hammond, G. L. (1995) . Potential functions of plasma steroid-binding proteins. Trends in Endocrinology and Metabolism 6:298-304.
- Hammond, G. L., Smith, C. L., Goping, I. S., Underhill, D. A., Harley, M. J., Reventos, J., Musto, N.
A., Gunsalus, G. L., and Bardin, C. W. (1987). Primary structure of human corticosteroid binding globulin, deduced from hepatic and pulmonary cDNAs , exhibits homology with serine protease inhibitors . Proc Natl Acad Sci U S A 84:5153-5157.
- Hammond, G. L., Smith, C. L., Lahteenmaki, P., Grolla, A., Warmels-Rodenhiser, S., Hodgert, H., Murai, J. T., and Siiteri, P. K. (1994). Squirrel monkey corticosteroid-binding globulin: primary structure and comparison with the human protein. Endocrinology 134:891- 898.
- Hammond, G. L., Smith, C. L., Paterson, N. A., and Sibbald, W. J. (1990). A rôle for corticosteroid- binding globulin in delivery of cortisol to activated neutrophils. J" Clin Endocrinol Metab 71:34-39.
- Kirschbaum, C. , Wust, S., Faig, H. G., and Hellhammer, D. H. (1992). Heritability of cortisol responses to human corticotropin-releasing hormone, ergometry, and psychological stress in humans . J" Clin Endocrinol Metab 75:1526-1530. - Knott, S. A., Marklund, L., Haley, C. S., Andersson, K. , Davies, W., Ellegren, H., Fredholm, M., Hansson, I., Hoyheim, B., Lundstrom, K. , Moller, M., and Andersson, L. (1998) . Multiple marker mapping of quantitative trait loci in a cross between outbred wild boar and large white pigs. Genetics 149:1069-1080.
Linkowski, P., Van Onderbergen, A.,
Kerkhofs, M., Bosson, D., Mendlewicz, J. , and Van Cauter,
E. (1993). Twin study of the 24-h cortisol profile: évidence for genêtic control of the human circadian clock.
Am J Physiol 264 :E173-Ξ181.
- Lupien, S. J. , de Léon, M., de Santi, S., Convit, A., Tarshish, C, Nair, N. P., Thakur, M., McEwen, B. S., Hauger, R. L., and Meaney, M. J. (1998). Cortisol levels during human aging predict hippocampal atrophy and memory déficits [see comments] [published erratum appears in Nat Neurosci 1998 Aug; 1 (4) : 329] . Nat Neurosci 1:69-73.
Marissal-Arvy, N., Mormède, P., and Sarrieau, A. (1999) . Strain différences in corticosteroid receptor efficiencies and régulation in Brown Norway and Fischer 344 rats. J Neuroendocrinol 11:267-273.
- Marissal-Arvy, N. , Ribot, E., Sarrieau, A., and Mormède, P. (2000). Is the mineralocorticoid receptor in Brown Norway rats constitut ively active? J Neuroendocrinol 12:576-588.
- Meikle, A. W. , Stringham, J. D., Woodward, M. G., and Bishop, D. T. (1988). Heritability of variation of plasma cortisol levels. Metabolism 37:514-517.
- Milan, D., Hawken, R. , Cabau, C, Leroux, S., Genêt, C, Lahbib, Y., Tosser, G., Robic, A., Hatey,
F., Alexander, L., Beattie, C, Schook, L., Yerle, M., and Gellin, J. (2000) . IMpRH server: an RH mapping server available on the Web [In Process Citation] . Bioinformatics 16:558-559. - Moisan, M. P., Courvoisier, H., Bihoreau, M. T., Gauguier, D. , Hendley, E. D., Lathrop, M., James, M. R., and Mormède, P. (1996). A major quantitative trait locus influences hyperactivity in the WKHA rat. Nat Genêt 14:471-473.
- Mormède, P., Dantzer, R. , Bluthe, R.-M., and Caritez, J.-C. (1984). Différences in adaptive abilities of three breeds of chinese pigs. Genêt Sel Evol 16:85- 102. - Orava, M., Zhao, X. F., Leiter, E., and
Hammond, G. L. (1994) . Structure and chromosomal location of the gène encoding mouse corticosteroid-binding globulin: strain différences in coding séquence and steroid-binding activity. Gène 144:259-264. - Piazza, P. V. and Le Moal, M. (1998) . The rôle of stress in drug self-administration . Trends Pharmacol Sci 19:67-74.
- Pugeat, M. M., Chrousos, G. P., Νisula, B. C, Loriaux, D. L., Brandon, D., and Lipsett, M. B. (1984) . Plasma cortisol transport and primate évolution. Endocrinology 115:357-361.
- Rogel-Gaillard, C, Bourgeaux, Ν. , Billault, A., Vaiman, M., and Chardon, P. (1999). Construction of a swine BAC library: application to the characterization and mapping of porcine type C endoviral éléments. Cytogenet Cell Genêt 85:205-211.
- Rosmond, R. , Dallman, M. F., and Bjorntorp, P. (1998) . Stress-related cortisol sécrétion in men: relationships with abdominal obesity and endocrine, metabolie and hemodynamic abnormalities [see comments] . J Clin Endocrinol Metab 83:1853-1859.
- Sambrook,J. Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989 Mol ecular cl oning . - A laboratory manual , 2n édition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. - Smith, C. L. and Hammond, G. L. (1991) . An amino acid substitution in biobreeding rat corticosteroid binding globulin results in reduced steroid binding affinity. J Biol Chem 266 : 18555-18559. - Smith, C. L. , Power, S. G., and Hammond, G.
L. (1992) . A Leu His substitution at residue 93 in human corticosteroid binding globulin results in reduced affinity for cortisol. J Steroid Biochem Mol Biol 42:671- 676. - Sternberg, E. and Gold, P. (1997) . Emotions and disease. From balance of humors to balance of molécule. Nature Medicine 3:264-267.
- Sun, H. F., Ernst, C. W. , Yerle, M., Pinton, P., Rothschild, M. F., Chardon, P., Rogel-Gaillard, C, and Tuggle, C. K. (1999). Human chromosome 3 and pig chromosome 13 show complète synteny conservation but extensive gene-order différences. Cytogenet Cell Genêt 85:273-278.
- Torpy, D.J., Bachmann, A. W. , Grice, J.E., Fitzgerald, S. P., Phillips, P. J. , Whitworth, J. . , Jackson,
R.V. (2001) in press J Clin Endocrinol Metab 86 (6)
- Van Baelen, H., Brepoels, R. , and De Moor, P. (1982) . Transcortin Leuven : a variant of human corticosteroid-binding globulin with decreased cortisol- binding affinity. J Biol Chem 257:3397-3400.
- Warden, C. H., Fisler, J. S., Shoemaker, S. M., Wen, P. Z., Svenson, K. L. , Pace, M. J., and Lusis, A. J. (1995) . Identification of four chromosomal loci determining obesity in a multif actorial mouse model. J Clin Invest 95:1545-1552.
- Yerle, M., Galman, 0., Lahbib-Mansais, Y., and Gellin, J. (1992) . Localization of the pig luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor gène (LHCGR) by radioactive and nonradioactive in situ hybridization . Cytogenet Cell Genêt 59:48-51. - Yerle, M., Pinton, P., Robic, A., Alfonso, A., Palvadeau, Y., Delcros, C, Hawken, R. , Alexander, L., Beattie, C, Schook, L. , Milan, D. , and Gellin, J. (1998). Construction of a whole-genome radiation hybrid panel for high- resolution gène mapping in pigs. Cytogenet Cell Genêt 82:182-188.

Claims

REVENDICATIONS
1) Méthode d'identification de marqueurs polymorphes associés au phenotype d' hypercortisolemie caractérisée en ce qu'elle comprend la comparaison de séquences d'acide nucléique, de plusieurs individus, comprenant tout ou partie du gène Cbg et l'identification de mutations dans le gène Cbg ou les séquences qui lui sont adjacentes.
2) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide nucléique sont des séquences d'ADN génomiques comprenant une partie du gène Cbg ou une séquence 3' ou 5' adjacente éloignée préférentiellement au plus de lOOkb.
3) Un marqueur polymorphe responsable du phenotype d' hypercortisolemie constitué de tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique contenu dans le gène Cbg ou les séquences 3' ou 5' adjacentes éloignées préférentiellement au plus de lOOkb.
4) Un marqueur selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe comprenant des microsatellites, des polymorphismes d' insertion/délétion, des polymorphismes de longueur de fragment de restriction (RFLP) ou des polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP) .
5) Une amorce nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend de 5 à 50 de préférence de 10 à 30 nucléotides successifs de la séquence du gène Cbg ou des séquences 3' ou 5' adjacentes éloignées préférentiellement au plus de lOOkb, flanquant un marqueur selon l'une des revendications 3 ou 4. 6) Méthode de criblage génétique pour identifier les individus susceptibles de développer une hypercortisolemie et les pathologies associées, à l'aide de marqueurs polymorphes, caractérisée en ce qu'elle comprend : i) la purification d'ADN génomique d'un individu, puis ii) l'amplification du locus contenant un marqueur polymorphe selon l'une des revendications 3 ou 4 par PCR à partir dudit ADN, et iii) la détection du ou des allèles dudit marqueur polymorphe dans ledit ADN amplifié.
7) Un kit pour la mise en œuvre de la méthode selon la revendication 6, permettant de tester les marqueurs génétiques de l' hypercortisolemie à partir d'un échantillon d'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend une paire d'amorces nuclêotidiques selon la revendication 5, des réactifs de PCR, et éventuellement des contrôles négatifs et positifs des réactions et des marqueurs.
8) Utilisation de la méthode selon la revendication 6 pour le diagnostic d'une hypercortisolemie ou d'une prédisposition à une hypercortisolemie chez un sujet, notamment humain, permettant d'identifier un dysfonctionnement de l'axe corticotrope et donc une maladie ou une prédisposition à une maladie liée à cet axe comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes, ou encore les pathologies du vieillissement (en particulier cognitives) ou la sensibilisation aux drogues d'abus.
9) Utilisation de la méthode selon la revendication 6 pour la sélection ou contre-sélection d'animaux d'élevage, plus particulièrement de porcs, ayant une forte probabilité de développer une hypercortisolemie et un taux d'engraissement élevé.
10) Utilisation de la méthode selon la revendication 6, dans laquelle les allèles du marqueur polymorphe selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4 présentent une mutation choisie dans le groupe de mutations constitué par : - transition G → T correspondant à la position 133 de la SEQ ID NO.l, transition C → T correspondant à la position 134 de la SEQ ID NO.l, transition T → C correspondant à la position 539 de la SEQ ID NO.l, transition A → G correspondant à. la position 620 de la SEQ ID NO.l, transition G → A correspondant à la position 626 de la SEQ ID NO.l, - transition C → T correspondant à la position 859 de la SEQ ID NO.l, transition C → T correspondant à la position 866 de la SEQ ID NO.l, transition A → G correspondant à la position 882 de la SEQ ID NO.l, transition G → C correspondant à la position 890 de la SEQ ID NO.l, transition C → T correspondant à la position 960 de la SEQ ID NO.l, - transition G → A correspondant à la position 1008 de la SEQ ID NO.l, transition T → C correspondant à la position 42 de la SEQ ID NO.6, transition C → T correspondant à la position 49 de la SEQ ID NO.6, transition C → T correspondant à la position 75 de la SEQ ID NO.7.
11) Animal transgénique dont le transgène contient une des séquences nucléiques de la revendication
3.
12) Animal transgénique surexprimant une des séquences parmi celles de la revendication 3 codant pour un polypeptide identique ou homologue à la protéine CBG.
13) Utilisation d'un animal transgénique selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, comme modèle technique pour comprendre les mécanismes d'action de la CBG sur l'axe corticotrope et les pathologies associées à l'obésité, les réponses inflammatoires et auto-immunes, le vieillissement en particulier cognitif, les toxicomanies.
14) Utilisation d'un animal transgénique selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, pour cribler des composés capables de moduler la fonction de la CBG.
15) Méthode de criblage d'un composés capable de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse et/ou sa liaison au cortisol caractérisée en ce qu'elle comprend la production de la protéine CBG à partir de cellules en culture, par exemple, les cellules HepG2 et en ce que l'on teste ledit composé vis-à-vis de la production de ladite protéine.
16) Méthode de criblage selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit criblage est un criblage à grande échelle. 17) Méthode de criblage d'un composé capable de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse et/ou sa liaison au cortisol caractérisée en ce qu'elle comprend le criblage in vivo sur un animal transgénique selon la revendication 12, d'un composé identifié in vitro selon une méthode de criblage selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16.
PCT/FR2002/003762 2001-10-31 2002-10-31 Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees Ceased WO2003038124A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02785578A EP1440164A1 (fr) 2001-10-31 2002-10-31 Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees
JP2003540389A JP2005507262A (ja) 2001-10-31 2002-10-31 高コルチゾール血症及びそれに関連する病変の遺伝子マーカーとしてのｃｂｇ遺伝子の用法
CA002465320A CA2465320A1 (fr) 2001-10-31 2002-10-31 Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees
US10/833,970 US20040248179A1 (en) 2001-10-31 2004-04-28 Cbg gene as a genetic marker of hypercortisolism and associated pathologies
US11/890,368 US20080115236A1 (en) 2001-10-31 2007-08-06 CBG gene as a genetic marker of hypercortisolism and associated pathologies

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0114156A FR2831556B1 (fr) 2001-10-31 2001-10-31 Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees
FR01/14156 2001-10-31
FR02/09551 2002-07-26
FR0209551A FR2831890B1 (fr) 2001-10-31 2002-07-26 Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/833,970 Continuation US20040248179A1 (en) 2001-10-31 2004-04-28 Cbg gene as a genetic marker of hypercortisolism and associated pathologies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003038124A1 true WO2003038124A1 (fr) 2003-05-08

Family

ID=26213239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2002/003762 Ceased WO2003038124A1 (fr) 2001-10-31 2002-10-31 Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l'hypercortisolemie et des pathologies associees

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20040248179A1 (fr)
EP (1) EP1440164A1 (fr)
JP (1) JP2005507262A (fr)
CA (1) CA2465320A1 (fr)
FR (1) FR2831890B1 (fr)
WO (1) WO2003038124A1 (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8541770B2 (en) 2008-11-19 2013-09-24 Micron Technology, Inc. Select devices including an open volume, memory devices and systems including same, and methods for forming same

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595969A (en) * 1992-12-16 1997-01-21 Allelix Biopharmaceutical Inc. Variants of human corticosteroid binding globulin
WO1997035602A1 (fr) * 1996-03-22 1997-10-02 Smithkline Beecham Plc Utilisation de l'antagoniste du recepteur de la vasopressine pour reguler la liberation de l'acth
WO1998056903A1 (fr) * 1997-06-13 1998-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methodes et utilisations de ciblage de genes sur la base de transposon
WO2000066787A2 (fr) * 1999-05-05 2000-11-09 Ohio University Genes et proteines hepatiques pouvant etre regules par l'hormone de croissance, utilisations associees

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPQ828300A0 (en) * 2000-06-21 2000-07-13 University Of Queensland, The Polynucleotides and polypeptides linked to blood pressure regulation and/or fatigue
US20030092019A1 (en) * 2001-01-09 2003-05-15 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating neuropsychiatric disorders such as schizophrenia

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595969A (en) * 1992-12-16 1997-01-21 Allelix Biopharmaceutical Inc. Variants of human corticosteroid binding globulin
WO1997035602A1 (fr) * 1996-03-22 1997-10-02 Smithkline Beecham Plc Utilisation de l'antagoniste du recepteur de la vasopressine pour reguler la liberation de l'acth
WO1998056903A1 (fr) * 1997-06-13 1998-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methodes et utilisations de ciblage de genes sur la base de transposon
WO2000066787A2 (fr) * 1999-05-05 2000-11-09 Ohio University Genes et proteines hepatiques pouvant etre regules par l'hormone de croissance, utilisations associees

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARISSAL-ARVY N ET AL: "Strain differences in corticosteroid receptor efficiencies and regulation in Brown Norway and Fischer rats", JOURNAL OF NEUROENDOCRINOLOGY, vol. 11, 1999, pages 267 - 73, XP002204421 *
ROLLINI P ET AL: "Long-range chromatin reorganization of the human serpin gene cluster at 14q32.1 accompanies gene activation and extinction in microcell hybrids", GENOMICS, vol. 56, no. 1, February 1999 (1999-02-01), pages 22 - 30, XP002204420 *
See also references of EP1440164A1 *
UNDERHILL D A ET AL: "cis-Regulatory elements within the proximal promoter of the rat gene encoding corticosteroid-binding globulin", GENE, ELSEVIER BIOMEDICAL PRESS. AMSTERDAM, NL, vol. 162, no. 2, 11 September 1995 (1995-09-11), pages 205 - 211, XP004042017, ISSN: 0378-1119 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8541770B2 (en) 2008-11-19 2013-09-24 Micron Technology, Inc. Select devices including an open volume, memory devices and systems including same, and methods for forming same
US8957403B2 (en) 2008-11-19 2015-02-17 Micron Technology, Inc. Select devices including an open volume, and related methods, memory devices, and electronic systems

Also Published As

Publication number Publication date
FR2831890B1 (fr) 2006-06-23
CA2465320A1 (fr) 2003-05-08
US20040248179A1 (en) 2004-12-09
EP1440164A1 (fr) 2004-07-28
FR2831890A1 (fr) 2003-05-09
US20080115236A1 (en) 2008-05-15
JP2005507262A (ja) 2005-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ousova et al. Corticosteroid binding globulin: a new target for cortisol-driven obesity
Tryon et al. Homozygosity mapping approach identifies a missense mutation in equine cyclophilin B (PPIB) associated with HERDA in the American Quarter Horse
Tsaih et al. Identification of a novel gene for diabetic traits in rats, mice, and humans
Saadi et al. Molecular genetics of cystinuria: mutation analysis of SLC3A1 and evidence for another gene in the type I (silent) phenotype
US20120009592A1 (en) Enpp1 (pc-1) gene haplotype associated with the risk of obesity and type 2 diabetes and their applications
Lee et al. Molybdenum cofactor-deficient mice resemble the phenotype of human patients
Isaacs et al. Identification of two new Pmp22 mouse mutants using large-scale mutagenesis and a novel rapid mapping strategy
Fife et al. Multipoint linkage analysis of a candidate gene locus in rheumatoid arthritis demonstrates significant evidence of linkage and association with the corticotropin‐releasing hormone genomic region
Meerabux et al. Association of an orexin 1 receptor 408Val variant with polydipsia–hyponatremia in schizophrenic subjects
Keßler et al. Diabetes insipidus and, partially, low anxiety‐related behaviour are linked to a SNP‐associated vasopressin deficit in LAB mice
Xiao et al. Caytaxin deficiency causes generalized dystonia in rats
JP5686335B2 (ja) 筋萎縮性側索硬化症の診断マーカー、及び、方法、並びに、筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル動物、及び、モデル細胞
Gorwood et al. Reappraisal of the serotonin 5-HT1B receptor gene in alcoholism: of mice and men
Peters et al. Alopecia in a novel mouse model RCO3 is caused by mK6irs1 deficiency
Qiu et al. Npy deletion in an alcohol non-preferring rat model elicits differential effects on alcohol consumption and body weight
Bjerre et al. Porcine parkin: molecular cloning of PARK2 cDNA, expression analysis, and identification of a splicing variant
Collin et al. Genetic modifiers interact with Cpe fat to affect body weight, adiposity, and hyperglycemia
AU752138B2 (en) A DNA molecule encoding a mutant prepro-neuropeptide Y, a mutant signal peptide, and uses thereof
WO2003038124A1 (fr) Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l&#39;hypercortisolemie et des pathologies associees
Jiang et al. A missense mutation in the follicle stimulating hormone receptor (FSHR) gene shows different allele effects on litter size in Chinese Erhualian and German Landrace pigs
FR2831556A1 (fr) Utilisation du gene de la cbg comme marqueur genetique de l&#39;hypercortisolemie et des pathologies associees
Vaingankar et al. Long human CHGA flanking chromosome 14 sequence required for optimal BAC transgenic “rescue” of disease phenotypes in the mouse Chga knockout
Morrison et al. A functional variant of IRS1 is associated with type 1 diabetes in families from the US and UK
Zhang et al. Screening of polymorphic loci in candidate genes for colobomus eyelid and their application in phenotypic purification of geese
Villafuerte Molecular genetics of affective disorders: positional cloning and gene-based association approaches

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2465320

Country of ref document: CA

Ref document number: 2003540389

Country of ref document: JP

Ref document number: 10833970

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002785578

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002785578

Country of ref document: EP

WWR Wipo information: refused in national office

Ref document number: 2002785578

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2002785578

Country of ref document: EP