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WO2003031645A1 - Procede de dosage de preincubation utilisant un oligomere d'acide nucleique monocatenaire - Google Patents

Procede de dosage de preincubation utilisant un oligomere d'acide nucleique monocatenaire Download PDF

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Publication number
WO2003031645A1
WO2003031645A1 PCT/JP2002/010029 JP0210029W WO03031645A1 WO 2003031645 A1 WO2003031645 A1 WO 2003031645A1 JP 0210029 W JP0210029 W JP 0210029W WO 03031645 A1 WO03031645 A1 WO 03031645A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
synthase
acid synthase
substrate
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2002/010029
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kenji Abe
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi and Co Ltd filed Critical Shionogi and Co Ltd
Priority to JP2003534615A priority Critical patent/JP4199115B2/ja
Publication of WO2003031645A1 publication Critical patent/WO2003031645A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Definitions

  • the present invention relates to an Assay method for an activator or an inhibitor of a nucleic acid synthase, and more particularly, to an Assay method for an activator or an inhibitor of a nucleic acid synthase using a single-stranded nucleic acid oligomer.
  • Nucleic acid synthetase activators or inhibitors may be used to determine the appropriate conditions (eg, buffer conditions, reaction temperature, etc.) for the enzymatic reaction to proceed.
  • a necessary substance for example, metal ion
  • the enzyme reaction is allowed to proceed, and after the reaction is completed, the enzyme activity measured or calculated by some means is measured. It is achieved by comparing with
  • a nucleic acid synthetase, a labeled substrate, a template, a primer, a metal ion, and a test substance are simultaneously or sequentially mixed to progress the nucleic acid synthase reaction.
  • the labeled substrate is incorporated into the reaction product (Incorporation).
  • the amount of the labeled substrate incorporated into the reaction product is measured, and the calculated enzyme activity is compared with the enzyme activity in the absence of the test substance.
  • the test substance may be based on the structure or properties of the test substance.
  • Atsushi acts or binds non-specifically to nucleic acid synthases, giving false positives. Therefore, if the result of Atsushi shows that the result is positive, it is necessary to confirm that it is a true nucleic acid synthetase activator or inhibitor by another Atsetsu method. Atsey method requires complicated processes In some cases, however, it is not suitable for primary attestation.
  • HTS high-throughput screening
  • Patent Document 1 describes the possibility of the Atsey method of HCV without adding a primer, but does not disclose preincubation.
  • Non-Patent Document 1 discloses that the pre-incubation of HCV RNA-dependent RNA synthetase in the presence of a template and a primer increases the enzyme activity.
  • the above-mentioned documents merely disclose the properties of the enzyme, and do not disclose at all the activator or inhibitor of the enzyme or the case using a single-stranded nucleic acid oligomer.
  • RNA-dependent RNA synthase when a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ end can serve as its own primer is used as a template, the enzyme reaction proceeds in the absence of a primer. It is disclosed in reference 2. However, no pre-incubation is disclosed.
  • Patent Document 1 WO 96/37619
  • Non-Patent Document 1 Journal of General Virology (2000), 81, 759-767
  • Non-patent document 2 Journal of virology, 2000, 9134-9143 Disclosure of the invention
  • the present inventors have proposed a preincubation assay, that is, in the absence of a test substance and a substrate for a nucleic acid synthase, a nucleic acid synthase, a single strand in which the 3 ′ terminal portion can function as its own primer.
  • Solution containing the nucleic acid oligomer and metal ions Incubation followed by the selection of an activator or inhibitor of nucleic acid synthase was found to reduce noise from the data obtained from the results of the assay. ⁇ 5
  • the viral nucleic acid synthase is a viral RNA-dependent RNA synthase.
  • the viral RNA-dependent RNA synthase is an HCV RNA-dependent RNA synthase.
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, an activator or an inhibitor of nucleic acid synthase obtained by the Atsey method according to any one of (1) to (11).
  • the present invention relates to a technique relating to an activator or an activator of a nucleic acid synthase.
  • the assay of the activator or inhibitor of nucleic acid synthase is an assay for evaluating a test substance that is not known to be an activator or inhibitor of nucleic acid synthase, ie, a primary assay.
  • Atsey and atssie to evaluate test substances already known to be activators or inhibitors of nucleic acid synthase, that is, reassessments.
  • the atsee of the present invention can be used for all of these atsees. For example, it can be used to identify substances that activate or inhibit nucleic acid synthase.
  • nucleic acid synthase can be used to identify substances that inhibit nucleic acid synthase. For example, identification of substances that inhibit viral nucleic acid synthase, identification of substances that inhibit RNA-dependent RNA synthase, HCV RNA-dependent RNA It can be used to identify substances that inhibit synthase.
  • the present invention relates to an activator or an inhibitor of a nucleic acid synthase.
  • Atssay is characterized by incubating before starting the enzyme reaction. That is, a solution containing a nucleic acid synthase, a single-stranded nucleic acid oligomer capable of functioning as its own primer and a metal ion in the absence of a test substance and a substrate for the nucleic acid synthase is used. It is characterized by incubating. In this specification, the incubation is also referred to as preincubation.
  • the nucleic acid synthase at the temperature at which the pre-incubation effect appears in the absence of the test substance and the substrate for the nucleic acid synthase, the time at which the pre-incubation effect appears, the nucleic acid synthase, and the 3 'end become their own primers. This means incubating the resulting solution containing single-stranded nucleic acid oligomer and metal ions.
  • the temperature of the incubation is specifically about 15 ° C to about 50 ° C, particularly 20 ° C to 40 ° C, Is preferably incubated at 20 to 30 ° C.
  • the incubation time is preferably about 15 minutes or more, particularly preferably 0.5 hours or more, more preferably 1 hour or more, and is preferably about 15 minutes to 12 hours, 0 hour or more. It is preferable to incubate for 5 to 3 hours, especially for 1 to 2 hours.
  • a solution containing the nucleic acid synthase, a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ terminal portion can function as its own primer, and a metal ion is included. By the basing, the enzyme reaction is likely to proceed.
  • “In the absence of a test substance and a substrate for a nucleic acid synthase” means that incubation is performed under conditions that do not include a test substance and a substrate for a nucleic acid synthase.
  • what is essential for an enzymatic reaction other than the substrate of the nucleic acid synthase eg, metal ion
  • Solution containing nucleic acid synthase, single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 'end can function as its own primer and metal ion means Nucleic acid synthase, 3' end functions as its own primer
  • it may contain high molecular compounds, low molecular compounds, metal ions, halogen ions, amino acids, polypeptides, nucleic acids, polynucleotides, and the like.
  • the present invention relates to a nucleic acid synthase activator activator or an inhibitor, and relates to a nucleic acid elongation synthesis reaction using a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3′-terminal part can function as its own primer. Atsushi.
  • Single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ end can function as its own primer means a single-stranded template DNA or RNA whose 3 ′ end can function as its own primer. I do. In other words, it means a single-stranded nucleic acid oligomer whose 3 ′ terminal portion hybridizes with its own complementary portion and can form a loop structure. Note that if the 3'-terminal part is a single-stranded nucleic acid oligomer that functions as its own primer in the enzymatic reaction, it forms a loop even if it is present as a single strand without forming a loop in solution. May be.
  • the complementary bond in the hybridizing part is a hydrogen bond between G and C.
  • a hydrogen bond between A and U and a hydrogen bond between dA and dT are more preferable than a hydrogen bond between dG and dC.
  • those having an AU repeating sequence at the 3 ′ terminal are preferable.
  • Examples of the single-stranded nucleic acid oligomer include the following.
  • poly (dA), poly (dT), poly (dG) ⁇ poly (dC) ⁇ poly (A), poly (U), poly (G) ⁇ poly (C) self-complementary nucleic acid sequence at the 3 ′ end A single-stranded nucleic acid oligomer having
  • Poly (A), poly (U), poly (G), poly (C) and other homopolymers have oligo (U), oligo (A), oligo (C), and oligo ( G) and other single-stranded RNA oligos (eg, in the case of RNA-dependent RNA synthase),
  • Poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC) and other homopolymers have oligo (U), oligo (A), Single-stranded nucleic acid oligomers with oligo (C), oligo (G), etc. (eg, for DNA-dependent RNA synthase),
  • oligo (dT), oligo (dA), oligo (dC), and oligo (dG) are added to the 3 'end of homopolymers such as poly (A), poly (U), poly (G), and pol C), respectively.
  • homopolymers such as poly (A), poly (U), poly (G), and pol C), respectively.
  • other single-stranded nucleic acid oligomers for example, in the case of RNA-dependent DNA synthase
  • a single-stranded DNA oligomer for example, DNA
  • a dAdT or dCdG repeating sequence is added to the 3 'end of a homopolymer such as poly (dA), poly (dT), poly (dG), or poly (dC).
  • a homopolymer such as poly (dA), poly (dT), poly (dG), or poly (dC).
  • a single-stranded RNA oligomer (such as ly (A), poly (U), poly (G), or poly (C)) with a repeat sequence of AU or CG added to the 3 'end of a homopolymer such as poly (C) ,
  • RNA-dependent RNA synthase Poly (dA), poly (dT) s Poly (dG), poly (dC), etc.
  • Single-stranded nucleic acid oligomer eg, DNA Dependent RNA synthase
  • a single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3′-terminal portion of a heteropolymer for example, a naturally occurring nucleic acid polymer, a synthesized nucleic acid polymer, etc. in which various bases are mixed,
  • a repeating sequence of dAdT, dCdG, AU, or CG is added to the 3 'end of a heteropolymer (for example, a naturally occurring nucleic acid polymer or a synthesized nucleic acid polymer) in which various bases are mixed.
  • a heteropolymer for example, a naturally occurring nucleic acid polymer or a synthesized nucleic acid polymer
  • the nucleic acid oligomer of the strand for example, a naturally occurring nucleic acid polymer or a synthesized nucleic acid polymer
  • the self-complementary nucleic acid sequence means a sequence that forms a loop structure (for example, a hairpin loop) at the 3′-terminal portion and can hybridize with a self-complementary portion.
  • nucleic acid may be added to the 5 ′ terminal portion of the homopolymer.
  • a single-stranded nucleic acid oligomer having an AU repeating sequence at the 3 ′ terminal is preferable.
  • poly (A) having a repeating sequence of AU at the 3 ′ terminal portion is preferable.
  • the length of the single-stranded nucleic acid oligomer is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of the nucleic acid synthase. For example, using a single-stranded nucleic acid oligomer of about 8 bases to about 1000 bases, about 50 bases to about 800 bases, about 100 bases to about 500 bases in length. Can be done.
  • the number of base pairs that hybridize with a self-complementary portion is 2 or more, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5.
  • the metal ion include Mg2 + , Mn2 + , Na +, K +.
  • Many nucleic acid synthetases generally require Mg 2 + .
  • the test substance refers to a substance used in Atsushi, and includes not only low molecular weight compounds but also proteins such as polypeptides.
  • the enzymatic reaction is initiated by adding a nucleic acid synthase substrate to the solution containing the nucleic acid synthase after the preincubation.
  • the pre-incubation assay differs from the conventional method in that the nucleic acid synthetase reaction can be performed at about 10 ° C to about 40 ° C. In particular, it can be performed at about 20 ° C to about 40 ° C. Therefore, in an assay using a nucleic acid synthase present in a human or a nucleic acid synthase of a virus that infects a human, it can be performed at the same temperature as the human body temperature (particularly, 37 ° C). Very useful. In addition, by performing the treatment at such a temperature, the enzyme activity increases, and as a result, the detection sensitivity of Atssey increases.
  • the effect of the test substance on the enzyme reaction of the nucleic acid synthase may be compared by measuring the incorporation of the substrate of the nucleic acid synthase into the reaction product. That is, 1) a solution containing a nucleic acid synthase, a single-stranded nucleic acid oligomer capable of functioning as its own primer, and a metal ion in the absence of a test substance and a substrate for the nucleic acid synthase. 2) Mix the incubated solution with the test substance and the substrate for the nucleic acid synthase, contact the nucleic acid synthase with the substrate for the test substance and the nucleic acid synthase, and react the nucleic acid synthase substrate.
  • mixing a substrate for a nucleic acid synthase and in the absence of a test substance means that the test substance is not mixed. It may include something outside. For example, it may contain a reaction solution for dissolving or suspending the substrate of the nucleic acid synthase. That is, any data may be used as long as it is used to create data to be compared with data in the presence of the test substance.
  • a solution containing a nucleic acid synthase that has not been pre-incubated and a substrate for the nucleic acid synthase are mixed, and the nucleic acid synthase when the nucleic acid synthase and the nucleic acid synthase substrate are contacted in the absence of the test substance Incorporation of the substrate into the reaction product can also be used as a comparison.
  • the pre-incubated solution is mixed with the substrate of the nucleic acid synthase, and the substrate of the nucleic acid synthase is brought into contact with the nucleic acid synthase in the absence of the test substance. It is preferable that the incorporation into the reaction product is used as a comparison target.
  • the data used for these comparisons may be performed at the same time as the assay using the test substance, or may be performed separately.
  • the incorporation of the nucleic acid synthase substrate into the reaction product can be measured by using a labeled nucleic acid synthase substrate.
  • the amount of the labeled nucleic acid synthase substrate incorporated into the reaction product may be measured.
  • a radiolabeled nucleic acid synthase substrate or the like may be used, and in that case, the radioactivity may be measured by a scintillation counter or the like.
  • the labeled substrate of the nucleic acid synthase may be separated from the reaction solution using a commercially available filter (eg, a filter having a acetylaminoethyl group introduced therein).
  • SPA Scintillation proximity assay
  • the low-molecular compound means an organic compound having a molecular weight of 15 to 1000, and its constituent atoms are hydrogen, lithium, boron, carbon, nitrogen, oxygen, fluorine, sodium, magnesium, manganese, Examples include aluminum, sulfur, chlorine, potassium, calcium, iron, barium, bromine, and iodine.
  • Polypeptides include not only naturally-occurring peptides but also structurally modified peptides (for example, peptide isosteres).
  • the substrate for the nucleic acid synthase examples include dATP, dTTP, dGTP, dCTP, ATP, UTP, GTP, and CTP.
  • a substrate for labeled nucleic acid synthesis enzymes for example, 3 H- dATP, 3 H- dTTP, 3 H-dGTP, 3 H- dCTP, 3 H-ATP, 3 H- UTP, 3 H-GTP, 3 H- CTP, 32 P-dATP ⁇ 32 P- dTTP ⁇ 32 P-dGTP ⁇ 32 P- dCTP, 32 P- ATP, 32 P- UTP, 32 P-GTP, 32 P- CTP and the like.
  • These substrates may be selected according to the single-stranded nucleic acid oligomer used for the assay.
  • poly (dA), poly (dT), poly (dG), poly (dC), poly (A) ⁇ poly (U) ⁇ poly (G ) And poly (C), dTTP, dATP, dCTP, dGTP, UTP, ATP, CTP, and GTP may be used as substrates.
  • a single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 'end of a heteropolymer for example, a naturally occurring nucleic acid polymer or a synthesized nucleic acid polymer
  • a heteropolymer for example, a naturally occurring nucleic acid polymer or a synthesized nucleic acid polymer
  • a strand nucleic acid oligomer a mixture of dTTP, dATP, dCTP and dGTP, or a mixture of UTP, ATP, CTP and GTP may be used as a substrate. In this case, all the substrates may be labeled, or any of them may be labeled.
  • ⁇ -UTP or 32 P-UTP may be used as the substrate. it can. '
  • nucleic acid synthase means a polynucleotide chain synthase, for example, a DNA synthase (eg, a DNA-dependent DNA synthase, an RNA-dependent DNA synthase), an RNA synthase (eg, a DNA-dependent RNA) Synthase, RNA-dependent RNA synthase, etc.).
  • a DNA synthase eg, a DNA-dependent DNA synthase, an RNA-dependent DNA synthase
  • RNA synthase eg, a DNA-dependent RNA Synthase
  • RNA-dependent RNA synthase eg. RNA-dependent RNA synthase, etc.
  • not only full-length nucleic acid synthases but also deletions, substitutions and additions of nucleic acid synthases having enzyme activity can be used.
  • a recombinant nucleic acid synthase can be used.
  • viral RNA-dependent RNA synthase is preferable, and HCV RNA-dependent RNA synthase is more preferable.
  • the virus is not particularly limited. Examples include HIV (human immunodeficiency virus), HCV (hepatitis C virus), HBV (hepatitis B virus), HTLV (human T-cell leukemia virus), and influenza virus. No. In particular, viruses belonging to the genus Flavivirus are preferred, and HCV is more preferred.
  • viral enzymes include HIV reverse transcriptase (RNA-dependent DNA synthase, including those having RNaseH activity), HCV RNA-dependent RNA synthase, HBV DNA synthase (DNA-dependent DNA Those having a synthase activity, an RNA-dependent DNA synthase activity, and RNaseH activity), HTLV reverse transcriptase, and influenza virus RNA-dependent RNA synthase.
  • HIV reverse transcriptase RNA-dependent DNA synthase, including those having RNaseH activity
  • HCV RNA-dependent RNA synthase HBV DNA synthase (DNA-dependent DNA Those having a synthase activity, an RNA-dependent DNA synthase activity, and RNaseH activity)
  • HTLV reverse transcriptase HTLV reverse transcriptase
  • influenza virus RNA-dependent RNA synthase influenza virus RNA-dependent RNA synthase.
  • RNA-dependent RNA synthase for example, viral RNA-dependent RNA synthase
  • RNA-dependent RNA synthase of a virus belonging to the Flaviviridae family is particularly preferable.
  • HCV RNA-dependent RNA synthase is preferred.
  • Viruses having an RNA-dependent RNA synthase include the following: Viruses of the virus family, such as Lamyxoviridae (Paramyxoviridae), Orthomyxoviridae (Orthomyxoviridae), Rhabdoviridae (Rabdoviridae), Arenaviridae (Arenaviridae), and Bunyaviridae Is mentioned.
  • viruses of the Flaviviridae family are preferred, and HCV is more preferred.
  • Hepatitis C virus Hepatitis C virus
  • yellow fever virus fellow fever virus tengu iles
  • JJengue virus the flavivirus family
  • Japanese encepnalitis virus West Nile virus
  • St. Louis encephalitis virus St. Louis encephalitis virus
  • Rocio ⁇ inoles Rocio virus
  • Murray Valley fl These viruses have an RNA-dependent RNA synthase. These viruses are also associated with diseases of mammals including humans, and it is useful to find inhibitors of RNA-dependent RNA synthase of these viruses.
  • the nucleic acid synthase includes not only a nucleic acid synthase having a single enzyme activity but also a nucleic acid synthase having a plurality of enzyme activities.
  • examples of the nucleic acid synthetase having a plurality of enzyme activities include HBV DNA synthase (having DNA-dependent DNA synthase activity, RNA-dependent DNA synthase activity, and / or RNaseH activity).
  • HIV reverse transcriptase having RNA-dependent DNA synthase inhibitory activity and RNaseH activity
  • HIV reverse transcriptase having RNA-dependent DNA synthase inhibitory activity and RNaseH activity
  • a moiety having an enzymatic activity may be used in the present invention.
  • HCV enzymes having any of these genotypes can be used.
  • genotypes include genotype la, genotvpe ID, genotvpe lc, genotype 2a, genotype 2b, genotype 2c, genotype 3a, genotype 3b, genotype 4, genotype 5, genotype 6, and the like.
  • HCV RNA-dependent RNA synthase is encoded in the NS5B (Nonstructural Protein 5B) region of HCV.
  • any enzyme having RNA-dependent RNA synthase activity can be used in the present invention.
  • HCV having the above genotype eg, genotype la, genotvt> e lb, genotype lc, genotype 2a, genotype 2D, genotype 2c, genotype 3a, genotype 3b, genotype 4, genotype 5, genotype 6)
  • Nucleic acid synthase having RNA-dependent RNA synthase activity encoded in the NS5B region can be used.
  • Activator means a substance that activates an enzymatic reaction.
  • Nucleic acid synthase activity The agent can be used for treating a disease caused by a decrease in the expression level or function of a nucleic acid synthase, and is useful.
  • nucleic acid elongation is performed using a nucleic acid synthase, it can be used as a reagent for efficiently performing an enzymatic reaction.
  • an inhibitor means a substance that inhibits an enzymatic reaction.
  • inhibitors of viral nucleic acid synthase can be used for treating diseases caused by viruses and are useful.
  • Inhibitors, e.g., IC 5 Q value is 1 0 0 M or less, in particular, 1 0 M or less, more, 1 / M the following materials are preferred.
  • the present invention relates to a pre-incubation assay, and is particularly useful in an assay of an enormous number of compounds, particularly in high-throughput screening (HTS).
  • HTS high-throughput screening
  • the nucleic acid synthase can be activated or inhibited by contacting the nucleic acid synthase with the substance obtained by the Atsey method of the present invention.
  • virus replication can be activated or inhibited by contacting the virus with a substance obtained by the Atsey method of the present invention.
  • Fig. 1 is a graph showing the relationship between the preincubation time and the enzyme activity of HCV RNA-dependent RNA synthetase when the enzyme reaction was performed for 3 minutes.
  • * indicates the case where an oligo RNA that forms a hairpin loop at the 3 ′ end was used as a template.
  • Figure 2 Diagram showing the relationship between the presence or absence of preincubation and the enzyme reaction temperature.
  • ⁇ indicates enzymatic reaction at 37 ° C after pre-incubation
  • ⁇ indicates enzymatic reaction at 25 ° C after pre-incubation
  • ⁇ indicates enzymatic reaction at 37 ° C without pre-incubation If the reaction was performed
  • o is the UM in the HCV RNA-dependent RNA synthase reaction when the enzyme reaction was performed at 25 ° C without pre-incubation.
  • the relationship between the incorporation of P into the reaction product and the enzyme reaction time is shown.
  • Fig. 3 shows the results of random screening performed by the conventional method (using a template and primers).
  • Figure 4 Random screening performed by the pre-incubation method (using template and primers).
  • the “preincubation assay method using a single-stranded nucleic acid oligomer” of the present invention will be described below while comparing with a conventional method.
  • the nucleic acid synthase will be described using HCV RNA-dependent RNA synthase, but is not particularly limited to this enzyme.
  • the present invention can be carried out irrespective of the type of nucleic acid synthase. Particularly preferred are RNA synthase, furthermore, RNA-dependent RNA synthase, and HCV RNA-dependent RNA synthase.
  • oligo RNA means a single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 'end
  • RNA triphosphate as a substrate
  • Simultaneously mix Mg ion (Mg 2+ ), Mn ion (Mn 2+ ) and the test substance start the enzyme reaction, and measure the incorporation of the substrate into the reaction product.
  • Mg ion Mg 2+
  • Mn ion Mn 2+
  • oligo RNA means a single-stranded nucleic acid oligomer having a self-complementary nucleic acid sequence at the 3 'end
  • Mg ion Mg 2+
  • Mn 2+ Pre-incubation of Mn ions at about 25 ° C for about 1 to 2 hours, then adding RNA triphosphate as a substrate and a test substance to start the enzyme reaction,
  • This is a method for measuring the incorporation of a substrate into a reaction product. As in the above conventional method, the percentage of inhibition was calculated by comparing with the value in the absence of the test substance. And select inhibitors.
  • the specific procedure may be referred to Example 1 described later.
  • the “preincubation assay using a single-stranded nucleic acid oligomer” of the present invention is superior to the conventional method in the following points.
  • the preincubation time was compared with the enzyme activity.
  • the specific procedure is described in Test Example 1.
  • the enzyme activity was determined by measuring the uptake of peridine monophosphate (UMP) into the reaction product. The results are shown in Figure 1. It can be seen that the enzyme activity gradually increases until the pre-incubation time reaches about 90 minutes, and the difference in enzyme activity from the conventional method gradually increases. In addition, it can be seen that about 90 minutes of preincubation shows about eight times the enzymatic activity as compared to the conventional method. This facilitates detection of the measurement results, reduces errors in the inhibition rate, and is useful in screening inhibitors. In addition, when the preincubation time was further increased, it was found that the enzyme activity was almost the same as when preincubation was performed for about 90 minutes.
  • Pre-incubation access method reduces noise in the access results Can be made. This is described below using Tables 1 and 2.
  • Tables 1 and 2 use 3'-deoxyperidine triphosphate (3'-dUTP) as a competitive inhibitor.
  • 3'-dUTP is a compound capable of inhibiting the enzymatic reaction of HCV RNA-dependent RNA synthase by competing with the substrate in the nucleic acid synthesis reaction and being incorporated into the reaction product to stop elongation of the RNA chain.
  • Compounds A and B are compounds determined to be positive by the conventional method. That is, these compounds inhibit HCV RNA-dependent RNA synthase by about 60% to 80% at a concentration of 20 ⁇ Zm 1 in the conventional method without precipitation. However, their inhibition rates fall to about 20% to 30% according to the preincubation assay method.
  • Compound C (0.032 g / ml) and 3'-dUTP (0.08 / M) do not show a decrease in the inhibitory effect in the pre-cubation assay.
  • the structures of Compound A, Compound B and Compound C are shown below.
  • HCV RNA-dependent RNA synthase cDNA clone was prepared from HCV-infected plasma, and HCV RNA-dependent RNA synthase was expressed using insect cells or Escherichia coli based on this cDNA clone.
  • HCV RNA-dependent RNA synthase in cell extracts can be analyzed by anion exchange chromatography, heparin affinity chromatography, poly U affinity chromatography, cation exchange chromatography, gel filtration chromatography. Purification was carried out using mouth chromatography.
  • HCV RNA-dependent RNA synthase solution (10.5 ⁇ 1) was added, and preincubation was performed at 25 ° C for 60 minutes.
  • AAAUAU A single-stranded oligonucleotide composed of AUAUAU-3 '. Used as template. The GG at the 5 'end is added to the sequence to stop the nucleic acid synthesis reaction. C Note 3) Perysine triphosphate. Used as substrate.
  • the inhibition rate of HCV RNA-dependent RNA synthase when compound A, compound B, compound C, and 3'-dUTP are used as test substances is shown below.
  • the concentrations of the test substances used are as follows.
  • the ice-cold mixed solution (2) (50 1) was added to a 96-well mic-mouthed Thai plate, into which a test substance (5.26 ⁇ ⁇ 1 per well) dissolved in dimethyl sulfoxide or water was dispensed. .
  • Tris-hydrochloric acid 100 mM, pH 7.5
  • magnesium chloride 25 mM
  • manganese chloride 2.5 mM
  • dithiothreitol 5 mM
  • chloride chloride l25 mM
  • AAA UAU A single-stranded oligonucleotide composed of AUA UAU-3 '. Used as template. The GG at the 5 'end was added to the sequence to stop the nucleic acid synthesis reaction. Note 3) Perysine triphosphate. Used as substrate.
  • the inhibition rates of HCV RNA-dependent RNA synthase when compound A, compound B, compound (1-1), and 3′-dUTP are used as test substances are shown below.
  • the concentrations of the test substances used are as follows.
  • the RdRp enzyme or HCV RdRp enzyme means HCV RNA-dependent RNA synthase.
  • the enzymatic reaction temperature was set at 25 ° C and 37 ° C, and the time course of the enzyme activity of HCV RdRp was measured with and without preincubation (Fig. 2).
  • the enzyme reaction rate at 37 ° C is stopped after 120 minutes.
  • the preincubation method although the enzyme reaction rate tends to decrease at 37 ° C after 60 minutes of enzyme reaction, the amount of enzyme reaction increases, and the amount of enzyme reaction increases from 25 minutes to 30 minutes to 180 minutes. The value was 2.6 to 3.0 times higher than that of the enzyme reaction in C.
  • a major difference between the method of the present invention and the conventional method in screening for an HCV RNA-dependent RNA synthase inhibitor is the difference in inhibitory activity.
  • Compound A and Compound B showed a significant decrease in inhibitory activity by pre-incubation treatment, but Compound C and 3'-dUTP did not show a decrease in inhibitory activity even after pre-incubation treatment. (Table 1, Table 2).
  • the preincubation atsay method can (1) increase enzyme activity, (2) increase thermal stability, and (3) reduce noise.

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Description

明細書 一本鎖の核酸ォリゴマーを使用したプレインキュベーションアツセィ法 技術分野
本発明は、 核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィ法、 詳しくは、 一 本鎖の核酸ォリゴマーを使用した核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセ ィ法に関する。 背景技術
核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィは、 酵素反応が進行する適当 な条件 （例えば、 バッファー条件、 反応温度等） を定めて、 核酸合成酵素、 核酸 合成酵素の基質、 その他酵素反応に必要なもの （例えば、 金属イオン等） と被検 物質を混和し、 酵素反応を進行させ、 反応終了後、 何らかの手段により測定また は算出される酵素活性を、 被検物質非存在時の酵素活性と比較することにより達 成される。
例えば、 核酸合成酵素、 標識等された基質、 テンプレート、 プライマー、 金属 イオン、 被検物質を同時にまたは順次混合し、 核酸合成酵素反応を進行させる。 標識された基質は、 反応産物に取り込まれる （インコーポレーション） 。 反応終 了後、 反応産物に取り込まれた標識された基質の量を測定し、 それにより計算さ れる酵素活性を、被検物質非存在時の酵素活性と比較することにより達成される。 しかし、 このようなアツセィの結果、 被験物質が核酸合成酵素の活性化作用ま たは阻害作用を有しているということがわかっても、 その被験物質がその被験物 質の構造や特性に基づいて、 核酸合成酵素に対し非特異的に作用または結合し、 擬陽性を示している場合もある。 そのため、 アツセィの結果デ一夕が陽性である ことを示す場合は、 更に別のアツセィ法で真の核酸合成酵素の活性化剤または阻 害剤であることを確認する必要があるが、 別のアツセィ法が複雑な工程を必要と し、 一次アツセィには不適当な場合もある。
近年、 ハイスループッ トスクリーニング （以下、 HTS という。 ） は、 医薬品開 発の初期段階において、 重要な位置を占めている。 HTS によって、 一度に数百〜 数万の化合物のアツセィを行うことができるが、 いかにして莫大なデータを解析 するかが大きな問題となっている。
特許文献 1にはプライマーを加えない HCVのアツセィ法の可能性についての記 載はあるが、 プレインキュベーションについては、 開示されていない。
一方、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素に関して、 テンプレートとプライマーの 存在下でプレインキュベーシヨンすると、 酵素活性が上昇することが非特許文献 1に開示されている。 しかし、 上記文献は単に酵素の性質を開示しているに過ぎ ず、 酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィ、 一本鎖の核酸オリゴマーを使用し たァヅセィについては、 全く開示されていない。
また、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素に関して、 3 '末端が自らのプライマーと なり得る一本鎖の核酸ォリゴマーをテンプレートとして使用した場合、 プライマ 一の非存在下で酵素反応が進行することが非特許文献 2に開示されている。 しか し、 プレインキュベーションについては、 全く開示されていない。
特許文献 1 ： 国際公開第 96/37619号
非特許文献 1 ： Journal of General Virology Γ2000), 81, 759-767
非特許文献 2 ： Journal of virology, 2000, 9134-9143 発明の開示
HTS の結果得られるデ一夕から、 いかに有用な情報を得るか、 即ち、 いかにノ ィズ （擬陽性） をなくすかが重要であり、 核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤 のノイズが少ないアツセィ法の開発が求められている。
本発明者は、 プレインキュベーションアツセィ法、 即ち、 被検物質および核酸 合成酵素の基質の非存在下で、 核酸合成酵素、 3'末端部分が自らのプライマーとし て機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーおよび金属イオンを含む溶液を インキュベーションし、 その後、 核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセ ィをすることにより、 ァヅセィの結果得られるデータからノィズが減少すること を見出した <5
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、 核酸合成酵素、 3'末端 部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーお よび金属イオンを含む溶液をィンキュベーションする工程を含むことを特徴とす る核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィ法、
に関する。
さらに詳しくは以下 （2 ) 〜 （ 1 7 ) に関する。
(2 ) 以下の工程；
(a) 被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、 核酸合成酵素、 3'末端部 分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーおよ び金属イオンを含む溶液をィンキュベーションする工程、
(b)該ィンキュベーシヨンした溶液と、被検物質および該核酸合成酵素の基質を 混合し、 該核酸合成酵素と被験物質および該核酸合成酵素の基質を接触させ、 該核酸 合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
( c ) 該インキュベーションした溶液と、 該核酸合成酵素の基質を混合し、 被 検物質の非存在下で、 該核酸合成酵素と該核酸合成酵素の基質を接触させ、 該核 酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
(d) (b) 及び （C) の工程で測定された該核酸合成酵素の基質の反応産 物への各取り込みを比較する工程.、
を含むことを特徴とする上記 （ 1 ) 記載のアツセィ法、
( 3 ) ウィルス核酸合成酵素の阻害剤のアツセィ法である上記（ 1 ) または （2 ) 記載のアツセィ法、
(4) 該ウィルス核酸合成酵素が、 ウィルス RNA依存型 RNA合成酵素である上 記 （ 3 ) 記載のアツセィ法、 ( 5 ) 該ウィルス RNA依存型 RNA合成酵素が、 HCVRNA依存型 RNA合成酵素 である上記 （ 3 ) 記載のァヅセィ法、
( 6 ) 該一本鎖の核酸オリゴマーが、 3'末端部分に自己相補的核酸配列を有する ものである上記 （4) または （ 5 ) 記載のァヅセィ法、
( 7 ) 該一本鎖の核酸オリゴマーが、 poly (A)の 3'末端部分に自己相補的核酸配 列を有するものである上記 （ 6 ) 記載のアツセィ法、
( 8 ) 該基質が、 ¾-UTPまたは 32P-UTPである上記 （ 7 ) 記載のアツセィ法、
( 9 ) 該金属イオンが Mg2+または Mn2+である上記 （ 1 ) 〜 （ 8 ) のいずれかに 記載のアツセィ法、
( 1 0) 該インキュベーションを 0. 5時間以上行うことを特徴とする上記 （ 1 ) ~ ( 9) のいずれかに記載のァヅセィ法、
( 1 1 ) 該ィンキュベーシヨンを 2 0 °C~ 4 0 °Cで行うことを特徴とする上記 ( 1 ) ~ ( 1 0 ) のいずれかに記載のアツセィ法、
( 1 2 ) 上記 （ 3 ) 記載のアツセィ法により得られる物質とウィルス核酸合成酵 素を接触させることによる、 ウィルス核酸合成酵素の阻害方法、
( 1 3 ) 上記 （ 3 ) 記載のアツセィ法により得られる物質とウィルスを接触させ ることによる、 ウィルスの複製の阻害方法、
( 1 4) 該ウィルスがフラビウィルス科に属するウィルスである上記 ( 1 2 ) ま たは （ 1 3 ) 記載の方法、
( 1 5 ) 該ウィルスが HCVである上記 （ 1 2 ) または （ 1 3 ) 記載の方法、
( 1 6 ) 上記 （ 1 ) ~ ( 1 1 ) のいずれかに記載のアツセィ法により得られる核 酸合成酵素の活性化剤または阻害剤、
( 1 7 ) 上記 （ 1 ) ~ ( 1 1 ) のいずれかに記載のアツセィ法により得られる核 酸合成酵素の活性化剤または阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物、 に関する。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、 核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィに関する技術であ る。 本明細書中、 核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィは、 核酸合成 酵素の活性化剤または阻害剤であることが知られていない被検物質を評価するァ ッセィ、 すなわち第 1次アツセィ、 及び、 既に核酸合成酵素の活性化剤または阻 害剤であることが知られている被検物質を評価するアツセィ、 すなわち再評価ァ ヅセィを包含する。 本発明のアツセィは、 これらのすべてのアツセィに使用する ことができる。 例えば、 核酸合成酵素を活性化または阻害する物質の同定に使用 することができる。 特に、 核酸合成酵素を阻害する物質の同定に使用することが でき、 例えば、 ウィルスの核酸合成酵素を阻害する物質の同定、 RNA依存型 RNA 合成酵素を阻害する物質の同定、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素を阻害する物質 の同定等に使用することができる。
本発明は、 核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤の。アツセィにおいて、 酵素反 応を開始させる前にインキュベーションすることを特徴とする。 すなわち、 被検 物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、 3'末端部分が自らの プライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーおよび金属ィォ ンを含む溶液をインキュベーションすることを特徴とする。 本明細書中、 該イン キュベ一シヨンをプレインキュベーションとも表現する。 詳しくは、 被検物質お よび核酸合成酵素の基質の非存在下で、 プレインキュベーションの効果が現れる 温度で、 プレインキュベーションの効果の現れる時間、 核酸合成酵素、 3'末端が自 らのプライマ一となり得る一本鎖の核酸ォリゴマーおよび金属イオンを含む溶液 をインキュベーションすることを意味する。
該インキュベーションの温度、 すなわちプレイ ンキュベーションの効果が現れ る温度としては、 具体的には、 約 1 5 °C〜約 5 0 °C、 特には、 2 0 °C〜 4 0 °C、 さらには、 2 0〜 3 0 °Cでインキュベーションするのが好ましい。
該インキュベーションの時間、 すなわちプレインキュベーションの効果の現れ る時間としては、 約 1 5分以上、 特には、 0 . 5時間以上、 さらには 1時間以上 が好ましく、 約 1 5分〜 1 2時間、 0 . 5〜 3時間、 特に 1 ~ 2時間インキュべ ーシヨンするのが好ましい。 被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、核酸合成酵素、 3 '末端部分が 自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーおよび金 属イオンを含む溶液をィンキュベーシヨンすることによって、 酵素反応が進行し やすい.状態が形成されると考えられる。
「被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下」 とは、 被検物質および核酸 合成酵素の基質を含まない条件でィンキュベ一ションすることを意味する。 例え ば、 核酸合成酵素の基質以外の酵素反応に必須なもの （例えば、 金属イオン等） を酵素と共にインキュベーショ ンすればいい。
「核酸合成酵素、 3 '末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一 本鎖の核酸オリゴマーおよび金属イオンを含む溶液」 とは、 核酸合成酵素、 3 '末端 部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーお よび金属イオンを少なく とも含み、 それら以外に被検物質および核酸合成酵素の 基質以外のものを含んでいてもよい溶液等が挙げられる。 例えば、 高分子化合物、 低分子化合物、 金属イオン、 ハロゲンイオン、 アミノ酸、 ポリペプチド、 核酸、 ポリヌクレオチド等を含んでいてもよい。
本発明のアツセィは、 核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィであり、 3 '末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴ マーを使用する核酸伸長合成反応に関するアツセィである。
「3 '末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォ リゴマー」 とは、 3 '末端部分が自らのプライマーとして機能することができる一本 鎖のテンプレート DNA または RNA を意味する。 すなわち、 3'末端部分が、 自己 の相補的な部分とハイブリダィズし、 ループ構造を形成することができる一本鎖 の核酸オリゴマーを意味する。 'なお、 酵素反応に際し 3 '末端部分が自らのプライ マーとして機能する一本鎖の核酸ォリゴマーであれば、 溶液中ではループを形成 せず一本鎖として存在していても、 ループを形成していてもよい。 好ましくは、 溶液中ではループを形成せず一本鎖として存在している一本鎖の核酸ォリゴマー である。 例えば、 ハイブリダィズする部分の相補的な結合が、 G と Cの水素結合 や dGと dCの水素結合によるものよりも、 Aと Uの水素結合、 dAと dTの氷素結 合によるものが好ましい。 例えば、 3 '末端部分に AUの繰り返し配列を有するもの などが好ましい。
一本鎖の核酸オリゴマーとしては、 例えば、 以下のものを挙げることができる。 3 '末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマー、
poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dG)ヽ poly(dC)ヽ poly(A)、 poly(U)、 poly(G)ヽ poly(C)の 3 '末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸ォリゴマー、
poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dG), poly(dC)などのホモポリマー（例えば、 合成され た核酸ポリマー） の 3'末端部分に、 それそれ oligo(dT)、 oligo(dA)、 oligo(dC), oligo(dG)などが付加された一本鎖の DNAォリゴマー （例えば、 DNA依存型 DNA 合成酵素の場合） 、
poly(A)、 poly(U)、 poly(G), poly(C)などのホモポリマーの 3'末端部分に、 それぞ れ oligo(U)、 oligo(A)、 oligo(C)、 oligo(G)などが付加された一本鎖の RNAォリゴマ 一 （例えば、 RNA依存型 RNA合成酵素の場合） 、
poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dG)、 poly(dC)などのホモポリマー（例えば、 合成され た核酸ポリマー） の 3 '末端部分に、 それぞれ oligo(U)、 oligo(A)、 oligo(C), oligo(G) などが付加された一本鎖の核酸オリゴマー （例えば、 DNA依存型 RNA合成酵素 の場合） 、
poly(A)、 poly(U)、 poly(G)、 pol C)などのホモポリマーの 3'末端部分に、 それぞ れ oligo(dT)、 oligo(dA), oligo(dC)、 oligo(dG)などが付加された一本鎖の核酸オリ ゴマー （例えば、 RNA依存型 DNA合成酵素の場合） 、
poly(dA), poly(dT)、 poly(dG), poly(dC)などのホモポリマーの 3 '末端部分に、 dAdT または dCdGの繰り返し配列が付加された一本鎖の DNAォリゴマー（例えば、 DNA 依存型 DNA合成酵素の場合） 、
P。ly(A)、 poly(U)、 poly(G)、 poly(C)などのホモポリマーの 3'末端部分に、 AUま たは CGの繰り返し配列が付加された一本鎖の RNAオリゴマー （例えば、 RNA依 存型 RNA合成酵素の場合） 、 poly(dA), poly(dT)s poly(dG), poly(dC)などのホモポリマーの 3'末端部分に、 AUまたは CGの繰り返し配列が付加された一本鎖の核酸オリゴマー（例えば、 DNA 依存型 RNA合成酵素の場合） 、
poly(A)、 poly(U)、 poly(G)、 poly(C)などのホモポリマーの 3 '末端部分に、 dAdT または dCdGの繰り返し配列が付加された一本鎖の核酸ォリゴマー（例えば、 RNA 依存型 DNA合成酵素の場合） 、
各種の塩基が混在したヘテロポリマー （例えば、 天然に存在する核酸ポリマー、 合成された核酸ポリマー等） の 3'末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖 の核酸ォリゴマー、
各種の塩基が混在したヘテロポリマー （例えば、 天然に存在する核酸ポリマー、 合成された核酸ポリマー等） の 3'末端部分に、 dAdT、 dCdG、 AUまたは CGの繰 り返し配列が付加された一本鎖の核酸ォリゴマー。
ここで、 自己相補的核酸配列とは、 3'末端部分がループ構造 （例えば、 ヘアピン ループ） を形成し、 自己の相補的な部分とハイブリダィズすることができる配列 を意味する。
なお、 ホモポリマーの 5'末端部分は、 他の核酸が付加されていてもよい。 例 えば、 ウィルス RNA依存型 RNA合成酵素を使用する場合、 一本鎖の核酸オリゴ マーとしては、 3 '末端部分に AUの繰り返し配列を有するものなどが好ましい。 特 に、 poly (A)の 3 '末端部分に AUの繰り返し配列を有するものが好ましい。
一本鎖の核酸オリゴマーの長さは、 特に制限がなく、核酸合成酵素の種類によって 適宜選択すればよい。例えば、 約 8塩基〜約 1 0 0 0塩基、 約 5 0塩基〜約 8 0 0塩 基、約 1 0 0塩基〜約 5 0 0塩基の長さの一本鎖の核酸オリゴマーを使用することが できる。
一本鎖の核酸ォリゴマーにおいて、 自己の相補的な部分とハイプリダイズする 塩基対の数は、 2以上、 好ましくは 2〜 1 0、 さらに好ましくは 2〜 5である。 金属イオンとしては、 例えば、 M g 2 +、 M n 2 +、 N a +、 K +等が挙げられる。 核酸合成酵素においては、 一般的には、 M g 2 +が必須のものが多い。 被検物質とは、 アツセィに使用される物質を意味し、 低分子化合物のみならず、 ポリペプチドのようなタンパク質も含まれる。
酵素反応は、 プレインキュベーション後、 核酸合成酵素を含む溶液に、 核酸合 成酵素の基質を加えることによって開始される。
従来法（The EMBO Journal vol.15, no.l, ppl2-22, 1996)では、酵素反応を約 2 2 °C で行なう必要があり、 それ以上の温度で行なうと核酸合成酵素が失活し、 それ以 下の温度で行なうと核酸合成酵素の働きが鈍くなる。
プレインキュベーションアツセィ法は、 従来法と異なり、 核酸合成酵素反応を 約 1 0 °C〜約 4 0 °Cで行うことができる。 特に、 約 2 0 °C〜約 4 0 °Cで行なうこ とができる。 そのため、 ヒ トに存在する核酸合成酵素やヒ トに感染するウィルス の核酸合成酵素等を使用したァヅセィにおいては、 ヒ トの体温 （特に 3 7 °C ) と 同一の温度で行うことができ、 非常に有用である。 また、 このような温度で行な うことにより、 酵素活性が上昇し、 その結果としてアツセィの検出感度が上昇す る。
核酸合成酵素の酵素反応に対する被検物質の効果は、 核酸合成酵素の基質の反 応産物への取り込みを測定し、 比較すればよい。 すなわち、 1 ) 被検物質および 核酸合成酵素の基質の非存在下で、 核酸合成酵素、 3'末端部分が自らのプライマー として機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーおよび金属イオンを含む溶 液をインキュベーションし、 2 ) インキュベーションした溶液と、 被検物質およ び核酸合成酵素の基質を混合し、 核酸合成酵素と被検物質および核酸合成酵素の 基質を接触させ、 核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定し、 3 ) ィ ンキュベーシヨンした溶液と、 核酸合成酵素の基質を混合し、 被検物資の非存在 下で、 核酸合成酵素と核酸合成酵素の基質を接触させ、 核酸合成酵素の基質の反 応産物への取り込みを測定し、 4 ) 2 ) および 3 ) の工程で得られた核酸合成酵 素の基質の反応産物への各取り込みを比較することによって確認することができ る。 なお、 インキュベーションした溶液に （被検物質および） 核酸合成酵素の基 質を加えても、 （被検物質および） 核酸合成酵素の基質に、 インキュベーション した溶液を加えてもよい。 すなわち、 核酸合成酵素の基質と核酸合成酵素が接触 すればよい。
また、 「核酸合成酵素の基質を混合し、 被検物質の非存在下で」 とは、 被検物 質を混合しないことを意味し、 被検物質を含まない限り、 核酸合成酵素の基質以 外のものを含んでいてもよい。 例えば、 核酸合成酵素の基質を溶解又は懸濁させ るための反応液を含んでいてもよい。 すなわち、 被検物質存在下のデータの比較 対象とするデータを作成するためのものであればよい。 プレインキュベーション していない核酸合成酵素を含む溶液と、 核酸合成酵素の基質を混合し、 被検物質 の非存在下で、 核酸合成酵素と核酸合成酵素の基質を接触させた場合の核酸合成 酵素の基質の反応産物への取り込みを比較対象として使用することもできる。 な お、 プレインキュベーションした溶液と、 核酸合成酵素の基質を混合し、 被検物 質の非存在下で、 核酸合成酵素と核酸合成酵素の基質を接触させた場合の核酸合 成酵素の基質の反応産物への取り込みを比較対象とするのが好ましい。 これらの 比較対象として使用するデータは、 被検物質を使用するアツセィと同時に行って もよく、 別途、 行ってもよい。
核酸合成酵素の基質の反応産物への取り込みは、 標識された核酸合成酵素の基 質を使用することにより測定することができる。 例えば、 反応産物に取り込まれ た標識された核酸合成酵素の基質の量を測定すればよい。 標識された核酸合成酵 素の基質としては、 放射標識された核酸合成酵素の基質等を使用すればよく、 そ の場合、 シンチレーシヨンカウンタ一等で放射活性を測定すればいい。 なお、 標 識された核酸合成酵素の基質等は、 市販のフィル夕一等 （例えば、 ジェチルアミ ノエチル基を導入したフィル夕一等） を使用して、 反応液から分離すればよい。 また、 SPA (, Scintillation proximity assay) おにも適 j¾、でさる。
低分子化合物とは、 分子量 1 5〜 1 0 0 0の有機化合物を意味し、 構成原子と しては、 水素、 リチウム、 ホウ素、 炭素、 窒素、 酸素、 フッ素、 ナト リウム、 マ グネシゥム、 マンガン、 アルミニウム、 硫黄、 塩素、 カリウム、 カルシウム、 鉄、 バリウム、 臭素、 沃素等が挙げられる。 ポリペプチドには、 天然型ペプチドのみならず、 構造修飾したペプチド （例え ば、 ペプチドァイソスターなど） も含まれる。
核酸合成酵素の酵素の基質としては、 dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP、 ATP, UTP、 GTP, CTP 等が挙げられる。 特に標識されたものが好ましく、 標識された核酸合 成酵素の基質としては、 例えば、 3H- dATP、 3H-dTTP、 3H-dGTP、 3H- dCTP、 3H-ATP、 3H-UTP、 3H-GTP、 3H- CTP、 32P-dATPヽ 32P- dTTPヽ 32P-dGTPヽ 32P- dCTP、 32P- ATP、 32P- UTP、 32P-GTP、 32P- CTP等が挙げられる。 これらの基質は、 アツセィに使用す る一本鎖の核酸ォリゴマーに応じて選択すればよい。
例えば、 一本鎖の核酸オリゴマーとして 3'末端部分が修飾された poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dG)、 poly(dC), poly(A)ヽ poly(U)ヽ poly(G)、 poly(C)を使用する場合 は、 それそれ dTTP、 dATP、 dCTP、 dGTP、 UTP、 ATP、 CTP、 GTP を基質として 使用すればよい。
また、 一本鎖の核酸オリゴマーとして、 各種の塩基が混在したヘテロポリマー (例えば、 天然に存在する核酸ポリマー、 合成された核酸ポリマー等） の 3'末端 部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸ォリゴマーを使用する場合、 dTTP、 dATP、 dCTP及び dGTPを混合したもの、 または UTP、 ATP, CTP及び GTP を混合したものを基質として使用すればよい。 この場合、 すべての基質が標識さ れてもよいし、 いずれかが標識されていてもよい。
例えば、 一本鎖の核酸オリゴマーとして、 poly (A)の 3'末端部分に AUの繰り返 し配列を有するものを使用する場合、該基質として ¾-UTPまたは 32P-UTPを使用 することができる。 '
「核酸合成酵素」 とは、 ポリヌクレオチド鎖合成酵素を意味し、 例えば、 DNA 合成酵素 （例えば、 DNA依存型 DNA合成酵素、 RNA依存型 DNA合成酵素） 、 RNA合成酵素 （例えば、 DNA依存型 RNA合成酵素、 RNA依存型 RNA合成酵素 等） が挙げられる。 なお、 本発明には、 全長の核酸合成酵素のみならず、 酵素活 性を有する核酸合成酵素の欠失体、 置換体、 付加体も使用することができる。 例 えば、 リコンビナントの核酸合成酵素を使用することもできる。 また、 反応液中 で酵素となるような酵素の前駆体を使用してもよい。
核酸合成酵素としては、 ウィルス RNA依存型 RNA合成酵素が好ましく、 さら には HCV RNA依存型 RNA合成酵素が好ましい。
• ウィルスは特に限定されないが、 例えば、 HIV (ヒ ト免疫不全ウィルス） 、 HCV ( C型肝炎ウィルス） 、 HBV ( B型肝炎ウィルス） 、 HTLV (ヒ ト T細胞白血病ゥ ィルス） 、 ィンフルェンザウィルス等が挙げられる。 特に、 フラビウィルス属に 属するウィルスが好ましく、 さらには HCVが好ましい。
ウィルスの酵素としては、 例えば、 HIVの逆転写酵素 （RNA依存型 DNA合成 酵素。 RNaseH活性を有するものを含む。 ） 、 HCVの RNA依存型 RNA合成酵素、 HBVの DNA合成酵素 （DNA依存型 DNA合成酵素活性、 RNA依存型 DNA合成酵 素活性、 およびノまたは RNaseH活性を有するもの） 、 HTLVの逆転写酵素、 イン フルェンザウィルスの RNA依存型 RNA合成酵素などが挙げられる。
本発明はいかなる核酸合成酵素においても使用することができる。 核酸合成酵 素の中では、 RNA依存型 RNA合成酵素 （例えば、 ウィルス RNA依存型 RNA合 成酵素） が好ましく、 特に、 フラビウィルス科に属するウィルスの RNA 依存型 RNA合成酵素が好ましい。 さらには、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素が好ましい。
R N A依存型 R N A合成酵素を有するウィルスとしては、 ピコルナウィルス科 ( Picornaviridae ) 、 力 リ シウィルス科 ( Caliciviridae ) 、 トーガウィルス科 ( Togaviridae)、フラビウィルス科（Flaviviridae)ヽコロナウィルス科（ Coronaviridae)、 パ ラ ミ ク ソ ウ ィ ルス科 ( Paramyxoviridae ) 、 オル ソ ミ ク ソ ウ ィ ルス科 ( Orthomyxoviridae) 、 ラブドウィルス科 ( R abdoviridae ) 、 ァレナウィルス科 (Arenaviridae) 、 ブニァウィルス科（Bunyaviridae) 等のウィルス科のウィルスが 挙げられる。 特に、 フラビウィルス科 ( Flaviviridae) のウィルスが好ましく、 さ らには、 H C Vが好ましい。
フラビウィルス科に属するウィルスとしては、 C型肝炎ウィルス （Hepatitis C virus) 、 黄熱ウイ レス fellow fever virus) 、 テングゥイ レス 、JJengue virus) 、 曰本 fl 炎ウイルス (Japanese encepnalitis virus ) 、 West Nile熱ウィルス ( West Nile fever virus) 、 セン トノレイス月 Si炎ウイ レス ( St. Louis encephalitis virus) 、 Rocio ゥ イノレス ( Rocio virus)、 Murray Valley fl 炎ウイノレス ( Murray Valley encephalitis virus) 等が挙げられる。 これらのウィルスは、 RNA依存型 RNA合成酵素を有している。 また、 これらのウィルスはヒトを含む哺乳動物の疾患とも関連しており、 これら のウィルスの RNA依存型 RNA合成酵素の阻害剤を見出すことは有用である。
- また、 核酸合成酵素には、 単一の酵素活性を有する核酸合成酵素のみならず、 複数の酵素活性を有する核酸合成酵素も含まれる。 例えば、 複数の酵素活性を有 する核酸合成酵素としては、 HBVの DNA合成酵素（DNA依存型 DNA合成酵素活 性、 RNA依存型 DNA合成酵素活性、 および/または RNaseH活性を有するもの） などが挙げられる。
また、 HIVの逆転写酵素（RNA依存型 DNA合成酵素阻害活性および RNaseH活 性を有する） などは、 それそれの酵素活性を有する部分のみを本発明のアツセィ に使用してもよいし、 両方の酵素活性を有する部分を本発明のアツセィに使用し てもよい。
HCVの遺伝子型 （Genotype) は多数存在するが、 本発明においては、 それらの いずれの遺伝子型を有する HCVの酵素についても使用することができる。 遺伝子 型と しては、 genotype la, genotvpe I D, genotvpe lc, genotype 2a, genotype 2b, genotype 2c, genotype 3a, genotype 3b, genotype 4, genotype 5, genotype 6等が挙げら れる。
HCVの RNA依存型 RNA合成酵素は、 HCVの NS5B ( Nonstructural Protein 5B) 領 域にコードされており、 本発明においては、 RNA依存型 RNA合成酵素活性を持つ ている酵素であれば、 いかなるものも使用することができる。 例えば、 上記の遺 子型 (例えは、 genotype la, genotvt>e lb, genotype lc, genotype 2a, genotype 2D, genotype 2c, genotype 3a, genotype 3b, genotype 4, genotype 5, genotype 6) を有する HCVの NS5B領域にコードされている RNA依存型 RNA合成酵素活性を持っている 核酸合成酵素等を使用することができる。
活性化剤とは、 酵素反応を活性化させる物質を意味する。 核酸合成酵素の活性 化剤は、 核酸合成酵素の発現量や機能の低下に起因する疾患の治療に使用するこ とができ、 有用である。 また、 核酸合成酵素を使用して核酸伸長を行う場合に、 酵素反応を効率よく行うための試薬として使用することができる。
また、 阻害剤とは酵素反応を阻害する物質を意味する。 特に、 ウィルス核酸合 成酵素の阻害剤は、 ウィルスに起因する疾患の治療に使用することができ、 有用 である。 阻害剤としては、 例えば、 I C 5 Q値が 1 0 0 M以下、 特に、 1 0 M 以下、 さらには、 1 / M以下の物質が好ましい。
本発明は、 プレインキュベーションアツセィ法に関するものであるが、 特に、 莫大な数の化合物のアツセィ、 特にハイスループヅ トスク リーニング （HTS) に おいて有用である。 本発明を実施すれば、 ノイズ （擬陽性） を減少させることが でき、 効果的にリード化合物を選択することができる。
すなわち、 本発明のアツセィ法により得られる物質と核酸合成酵素を接触させ ることにより、 核酸合成酵素を活性化または阻害することができる。 また、 核酸 合成酵素がウィルスの核酸合成酵素である場合は、 本発明のアツセィ法により得 られる物質とウィルスを接触させることにより、 ウィルスの複製を活性化または 阻害することができる。 図面の簡単な説明
図 1 ： 3 ◦分間酵素反応を行った場合の、 プレインキュベーション時間と HCV RNA依存型 RNA合成酵素の酵素活性との関係を示す図である。 図中、 *はテンプ レートとして 3 '末端でヘアピンループを形成するオリゴ RNA、を使用した場合を 表す。
図 2 ： プレインキュベーションの有無と酵素反応温度の関係を示す図である。 図 中、 ▲はプレインキュベーション後 3 7 °Cで酵素反応を行った場合、 ·はプレイン キュベーシヨン後 2 5 °Cで酵素反応を行った場合、 Δはプレインキュベーションを 行わず 3 7 °Cで酵素反応を行った場合、 oはプレインキュベーションを行わず 2 5 °Cで酵素反応を行った場合の HCV RNA依存型 RNA合成酵素反応における U M Pの反応産物への取り込みと酵素反応時間の関係を示している。
図 3 ：従来法 （テンプレート及びプライマー使用） でランダムスクリーニングを 行った結果を示す図である。
図 4 ： プレインキュベーション法 （テンプレート及びプライマー使用） でランダ ムスクリーニングを行った結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明である 「一本鎖の核酸ォリゴマーを使用したプレインキュベーションァ ッセィ法」 について、 従来法との比較をしながら、 以下に説明する。 なお、 核酸 合成酵素としては、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素を使用して説明するが、 特に 本酵素に限定する意味ではない。 本発明は、 核.酸合成酵素であれば、 種類を問わ ず実施することができる。 特に好ましいのは、 RNA合成酵素、 さらには RNA依 存型 RNA合成酵素、 さらには HCV RNA依存型 RNA合成酵素である。
従来法
HCV RNA依存型 RNA合成酵素、 テンプレートとしてのオリゴ RNA (オリゴ RNA は、 3 '末端部分に自己相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマーを意 味する） 、 基質としての RNA三リン酸、 M gイオン （Mg2+)、 M nイオン （Mn2+)、 被検物質を一斉混和し、 酵素反応を開始させ、 基質の反応産物への取り込みを測 定する。 被検物質非存在下での値と比較することにより、 被検物質が HCV RNA 依存型 RNA合成酵素を活性化しているか、 阻害しているかを知ることができる。 プレインキュベーションアツセィ法
HCV RNA依存型 RNA合成酵素、 テンプレートとしてのオリゴ RNA (オリゴ RNA は、 3'末端部分に自 3相補的核酸配列を有する一本鎖の核酸オリゴマーを意 味する） 、 M gイオン （Mg2+) 、 M nイオン （Mn2+) を約 2 5 °Cで約 1時間から 2 時間プレインキュベーションした後、 基質としての RNA三リン酸、 被検物質を添 加し、 酵素反応を開始させ、 基質の反応産物への取り込みを測定する方法である。 なお、 上記従来法と同様に、 被検物質非存在下での値と比較し、 阻害百分率を算 出し、 阻害剤を選定することができる。 具体的な手順は、 後述の実施例 1 を参考 にすればよい。
本発明の 「一本鎖の核酸ォリゴマーを使用したプレインキュベーションァヅセ ィ法」 は、 従来法に比較して、 以下の点で優れている。
①酵素活性の上昇
プレインキュベーション時間と酵素活性の比較をおこなった。具体的な手順は、 試験例 1に記載されている。なお、酵素活性は、 ゥリジンモノホスフェート （UMP ) の反応産物への取込みを測定することにより決定した。 結果を図 1に示す。 プレ インキュベーション時間が約 9 0分までは、 徐々に酵素活性が上昇し、 従来法と の酵素活性の差が徐々に大きくなつていくのがわかる。 また、 約 9 0分のプレイ ンキュベーシヨンにより、 従来法にく らべて、 約 8倍の酵素活性を示すことがわ かる。 このことにより、 測定結果の検出が容易になり、 阻害率の誤差も減少し、 阻害剤のスク リーニングにおいて有用であると言える。 なお、 さらにプレインキ ュベーシヨン時間を長く した場合、 約 9 0分プレインキュベーションした場合と ほぼ同等の酵素活性を示すことがわかる。
②熱安定性の上昇
プレインキュベーションの有無と酵素反応温度の関係を調べ、 結果を図 2に示 した。 図 2に示すように、 従来法では、 酵素反応を約 3 7 °Cでおこなうと、 反応 時間が 2 時間以上になると酵素が失活し、 正確な酵素活性値を測定することがで きない。 それに対し、 プレインキュベーション法では、 約 3 7 °Cでも酵素反応が 良好に進行し、 より生体内温度に近い条件でァヅセィをおこなうことができる。 また、 酵素反応を約 2 5 °Cでおこなうより も、 約 3 7 °Cでおこなう方が、 さらに 酵素活性が高くなることがわかる。 従って、 プレインキュベーションアツセィ法 においては、 約 3 7 °Cという生体温度に近い温度でアツセィすることも可能であ る o
③擬陽性 （ノイズ） の減少
プレインキュベーションァヅセィ法によって、 ァヅセィ結果のノイズを軽減さ せることができる。 以下に、 表 1、 表 2を使用して説明する。
表 1、 表 2では、 競合的阻害剤として、 3'-デォキシゥリジント リホスフェート ( 3'-dUTP) を使用している。 3 '- dUTP は、 核酸合成反応において基質と競合して 反応産物へ取り込まれ、 RNA鎖の伸長を止めることにより、 HCV RNA依存型 RNA 合成酵素の酵素反応を阻害することができる化合物である。 化合物 A、 Bは、 従 来法でポジティブと判定された化合物である。 すなわち、 これらの化合物は、 プ レインキュベ一ションしない従来法では、 20〃Zm 1の濃度で、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素を約 6 0 %〜 8 0 %阻害する。 しかしながら、 プレインキュベーシ ヨンアツセィ法によると、 それらの阻害率は約 2 0 %〜3 0 %に低下する。 一方 で、 化合物 C ( 0.032 g/ml)、 3 '-dUTP (0.08 / M) は、 プレインキュベーショ ン アツセィ法における阻害効果の低下は認められない。 以下に、 化合物 A、 化合物 B、 化合物 Cの構造を示す。
Figure imgf000018_0001
化合物 C
実施例
HCV RNA依存型 RNA合成酵素の調製法
HCV感染者血漿から HCV RNA依存型 RNA合成酵素の c DNAクローンを作製 し、 これを基に HCV RNA依存型 RNA合成酵素を昆虫細胞または大腸菌を使用し て発現させた。 細胞抽出液中の HCV RNA依存型 RNA合成酵素は、 ァニオン交換 クロマトグラフィ一、 へパリ ンァフィニティークロマ トグラフィー、 poly Uァフ ィニティ一クロマトグラフィー、 カチオン交換クロマ トグラフィー、 ゲル濾過ク 口マトグラフィ一などを使用して精製した。精製は約 4°Cの低温条件で実施し、 酵 素溶解液としてはエチレンジァミン四酢酸 （ I mM) 、 ジチオスレィ トール （ 1 0 mM) 、 グリセロール （2 0 %) を含むト リス緩衝液 （PH7. 5) を使用した。 精製酵素は、 アツセィに使用するまで 4°Cまたは— 20°Cにて保存した。
実施例 1
HCVRNA依存型 RNA合成酵素 プレインキュベーションァヅセィ法
① トリス塩酸 （100mM、 pH 7.5) 及び塩化マグネシウム （25mM) 、 塩化マン ガン (2.5mM) 、 ジチオスレィ トール (5mM) 、 塩化カリウム (l25mM) を含 有する緩衝液 I注 1〕 （10.5 1 ) をポリプロピレン製容器に入れ、 ここへオリゴ RNA注 2 )氷溶液 （100〃 g/m l、 10.5〃 1 ) と水 （18.5〃 1 ) を添加し、 緩やかに 混和した。
② 次に、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素液 （10.5〃 1 ) を追加し、 2 5 °Cで 6 0分間のプレインキュベーションを行った。
③ ジメチルスルホキシドまたは水で溶解した被験物質 （ 1穴当り 5.26〃 1 ) を 分注しておいた 9 6穴マイクロタイ夕一プレートに、 ②のプレインキュベーショ ン済みの溶液 （50 1 ) を加えた。
④ 更に、 ト リス塩酸 （100mM、 pH 7.5) 及び塩化マグネシウム （25mM) 、 塩 化マンガン (2.5mM) 、 ジチォスレイ トール （5mM) 、 塩化カリゥム (l25mM)、 UTP a 3) (ΐΛίΜ, 含 4.9〃Ci3H-UTP)を含有する緩衝液 II (10.6 1 ) と水 （39·4 Ζ 1 ) の混合液 （50〃 1) を添加混和し、 2 5 °Cで 6 0分間 酵素反応を行った。
⑤ 酵素反応が 6 0分経過した時、 エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム水溶液 (50mM、 50 Λί 1 ) を添加混合し、 酵素反応を停止した。
⑥ 次にセルハーべスターを使用して、 ジェチルアミノエチル基を導入したフィ ルター （以下、 DEAE-フィルターマッ トと略す） 上に⑤のサンプル全量を移した 後、 リン酸ナト リウム緩衝液 （0.25Μ、 ρΗ7.0) で 1 0秒間のすすぎ洗いを 2回と 脱イオン水で 1 0秒間のすすぎ洗いを 1回行った。
⑦ すすぎ終えた DEAE-フィルターマッ トを 9 5 °Cで 1 5分間乾燥し、 液体シン チレ一夕 (10m 1 ) と共にサンプルバッグに入れ密封した。
⑧ シンチレーションカウンターで放射活性を計測した。
⑨ 放射活性計測値 （単位； cpm) を以下の計算式に代入して阻害率を求めた。 阻害率 = 1 0 0— （被験物質存在下の計測値一酵素非存在下の計測値）
/ (被験物質非存在下の計測値 -酵素非存在下の計測値） X 1 0 0 注 1 ) ①〜⑤の実験材料に使用している氷は全てジェチルピロカーボネートで RNA分解酵素の失活処理をしている。 ジェチルピロカーボネートによる処理は、 ジェチルピロカーボネート （O.lg) を脱イオン水 （100m 1 ) に溶解後 3 7°Cで 2 4時間放置し、 その後 1 2 0 °Cで 3 0分間オートクレーブにかけて行った。
AAAUAU AUAUAU-3'で構成された単鎖のォリゴヌクレオチド。 テンプレートと して使用した。 5'末端の GGは、 核酸合成反応を停止させるために配列に付加した c 注 3 ) ゥリジン三リン酸。 基質として使用した。
以下に、 被検物質として、 化合物 A、 化合物 B、 化合物 C、 3'-dUTPを使用した 場合の、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素の阻害率を示す。 なお、 使用した被検物 質の濃度は、 以下の通りである。
化合物 A ： 20 g/ml 化合物 B ： 20 g/ml
ィ匕合物 C ： 0.032 g/ml 3'-dUTP： 0.08 M
表 1
化合物 N o . (濃度） 阻害率
化合物 A ： 20 ig/ml 3 2 %
化合物 B ： 20 g/ml 2 2 %
化合物 C ： 0.032 g/ml 3 6 %
3'-dUTP： 0.08〃 M 7 5 %
参考例 1
HCVRNA依存型 RNA合成酵素アツセィ 従来法
① トリス塩酸 （100mM、 PH 7.5) 及び塩化マグネシウム （25mM) 、 塩化マン ガン (2.5mM) 、 ジチオスレィ トール (5m M) 、 塩化カリウム （125mM) を含 有する緩衝液注 u (10.5 1 ) をポリプロピレン製容器に入れ、 ここへオリゴ RNA 注 2 )水溶液 （100〃 g/m l、 10.5〃 1 ) と水 （18.5 1 ) を添加し、 緩やかに混和 後、 氷冷した。
② 次に、 氷冷した HCV RNA依存型 RNA合成酵素液 （10.5〃 1 ) を添加、 混合 した。
③ ジメチルスルホキシドまたは水で溶解した被験物質 （ 1穴当り 5.26〃 1 ) を 分注しておいた 9 6穴マイク口タイ夕一プレートに、 ②の氷冷混合液 （50〃 1 ) を加えた。
④ 次に、 ト リス塩酸 （100mM、 pH7.5) 及び塩化マグネシウム （25mM) 、 塩 化マンガン (2.5mM) 、 ジチオスレィ トール （5mM) 、 塩化力リゥム (l25mM)、
UTP注 3) (4.9 /M、 含 l Ci3H- UTP)を含有する緩衝液（10.6〃 1 ) と水 （39.4〃 1 ) の混合液 （50〃 1 ) を添加混和し、 2 5 Cで 6 0分間 酵素反応を行った。
⑤ 酵素反応が 6 0分経過した時、 エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム水溶液 (50mM、 50 / 1 ) を添加混合し、 酵素反応を停止した。
⑥ 次にセルハーべスターを使用して、 ジェチルアミノエチル基を導入したフィ ルター （以下、 DEAE-フィルターマッ トと略す） 上に⑤のサンプル全量を移した 後、 リン酸ナト リゥム緩衝液 （0.25 M、 pH7.0) で 1 0秒間のすすぎ洗いを 2回と 脱イオン水で 1 0秒間のすすぎ洗いを 1回行った。
⑦ すすぎ終えた DEAE-フィル夕一マッ トを 9 5 °Cで 1 5分間乾燥し、 液体シン チレ一夕 (10m 1 ) と共にサンプルバッグに入れ密封した。
⑧ シンチレーシヨンカウンターで放射活性を計測した。
⑨ 放射活性計測値 （単位； cpm) を以下の計算式に代入して阻害率を求めた。 阻害率 = 1 0 0」 （被験物質存在下の計測値—酵素非存在下の計測値）
/ (被験物質非存在下の計測値一酵素非存在下の計測値） X I 0 0 注 1 ) ①〜⑤の実験材料に使用している水は全てジ'ェチルピロカーボネートで RNA分解酵素の失活処理をしている。 ジェチルピロカーボネートによる処理は、 ジェチルピロカーボネート （O.lg) を脱イオン水 （100m 1 ) に溶解後 3 7°Cで 2 4時間放置し、 その後 1 2 0 °Cで 3 0分間オートクレーブにかけて行った。
AAA UAU AUA UAU-3'で構成された単鎖のオリゴヌクレオチド。 テンプレートと して使用した。 5'末端の GGは、核酸合成反応を停止させるために配列に付加した 注 3 ) ゥリジン三リン酸。 基質として使用した。
以下に、 被検物質として、 化合物 A、 化合物 B、 化合物 (1-1)、 3'-dUTPを使用し た場合の、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素の阻害率を示す。 なお、 使用した被検 物質の濃度は、 以下の通りである。
化合物 A ： 20 ^ g/ml 化合物 B ： 20 / g/ml
化合物 C ： 0.032 g/ml 3 '-dUTP： 0.08 M
表 2
化合物 N o . (濃度） 阻害率
化合物 A ： 20 Z g/ml 7 8 %
化合物 B ： 20 g/ml 7 1 %
化合物 C ： 0.032 Z g/ml 3 6 %
3'-dUTP： 0.08〃 M 6 1 %
試験例 1
本発明ァヅセィ法の操作上の大きな特徴であるプレインキュベーションが酵素 活性に及ぼす影響を調べた。 なお、 文中、 RdRp酵素または HCV RdRp 酵素は、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素を意味する。
緩衝液 I、 オリゴ RNA、 リコンピナント RdRp酵素の混合液を 25°Cでプレイン キュベーシヨンする時間を 0分、 15分、 30分、 45分、 60分、 90分、 120分に設 定し、 酵素反応条件は一律 25°C、 30分で実施した （図 1 ) 。 また、 被験物質の代 わりには溶媒の DMSOを使用した。
この時の基質の反応産物への取り込み量を酵素活性とし比較したところ、 プレ ィンキュベーション時間が長いほど酵素活性は上昇を示し、 プレインキュベ一シ ヨン 90分以上では酵素活性はほぼ頭打ち状態となった。 酵素活性の上昇は、 プレ インキュベーションなし （ 0分） と比較して最高で 8.5倍高い酵素活性を示した。 以上の結果から、 酵素反応前に緩衝液 I、 オリゴ RNA、 リコンビナント RdRp 酵素をプレインキュベーションすることは、 酵素活性の上昇を誘導することが判 明した。
試験例 2
次にプレインキュベーションが酵素の熱安定性に及ぼす影響を調べた。
酵素反応温度を 25°Cと 37°Cに設定し、 プレインキュベーションの有無で HCV RdRpの酵素活性の経時的変化を測定した （図 2 ) 。 従来法 （プレインキュベーシ ヨンなし） では、 酵素反応 120分以降で 37°Cでの酵素反応速度が停止している。 一方、 プレインキュベーション法では、 酵素反応 60分以降で 37°Cでの酵素反応速 度の低下傾向は示すものの酵素反応量の増加を認め、 且つ酵素反応 30分から 180 分において酵素反応量は 25°Cでの酵素反応と比較して 2.6倍から 3.0倍の高値を 示した。
以上の結果から、 緩衝液 I、 オリゴ RNA、 リコンビナント RdRp酵素のプレィ ンキュベーション処理は、酵素反応における RdRpの熱安定性を高めることが判明 した。 生体内での HCVの増殖を考える時、 37°C前後での RdRp酵素の安定性は必 須である。 このことから、 プレインキュベーション処理後の RdRpの形態は、 生体 内の HCV RdRpの形態に近い可能性がある。
試験例 3
HCV RNA依存型 RNA合成酵素阻害剤のスクリーニングにおいて本発明ァヅセ ィ法が従来法と大きく異なる点として、 阻害活性の乖離が挙げられる。 プレイ ン キュベーシヨン処理を行うことにより、 化合物 A、 化合物 B は阻害活性の大幅な 低下を示したが、 化合物 C、 3'- dUTPはプレインキュベーション処理を行っても阻 害活性の低下は認められなかった （表 1、 表 2 ) 。
以上の結果から、 緩衝液 I、 poly(A)、 oligo(U), リコンビナント RdRp酵素のプ レインキュベーション処理は、化合物の種類によって RdRp阻害活性に大きな変動 をもたらすことが判明した。
参考試験例 従来法とプレインキュベーション ァヅセィ法の比較を行うために、 3 '末端部分 が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸オリゴマーの代り に、 テンプレートとして poly(A)、 プライマーとして oligo(U)12を使用し、 化学構 造の異なる数万個の化合物を被検物質として、 ランダムスクリーニングを行った。 まず、化合物を 1 0検体ずつ混合し、混合物である被検物質の濃度を 0.83 Z g/ml として、 従来法 （但し、 テンプレートとして poly(A)、 プライマーとして oligo(U)12 を使用） に準じて、 酵素阻害率を求めた。 結果を図 3に示す。
一方、 数万個の化合物を被検物質として、 化合物を 5検体ずつ混合し、 混合物 である被検物質の濃度を
Figure imgf000024_0001
として、 上記実施例 1に記載されている本発明 であるプレインキュベーション アツセィ法 （但し、 テンプレートとして poly(A)、 プライマーとして oligo(U)12を使用） に準じて、 酵素阻害率を求めた。 結果を図 4 に示す。 産業上の利用可能性
プレインキュベーションアツセィ法により、 ①酵素活性の上昇、 ②熱安定性の 上昇、 ③ノィズの軽減を図ることができることを見出した。

Claims

請求の範囲
1 . 被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、 核酸合成酵素、 3 '末端部分 が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーおよび 金属イオンを含む溶液をィンキュベーションする工程を含むことを特徴とする核 酸合成酵素の活性化剤または阻害剤のアツセィ法。
2 . 以下の工程；
( a ) 被検物質および核酸合成酵素の基質の非存在下で、 核酸合成酵素、 3 '末端部 分が自らのプライマーとして機能することができる一本鎖の核酸ォリゴマーおよ び金属イオンを含む溶液をィンキュベーションする工程、
( b )該ィンキュベーシヨンした溶液と、被検物質および該核酸合成酵素の基質を混 合し、 該核酸合成酵素と被験物質および該核酸合成酵素の基質を接触させ、 該核酸合 成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
( c ) 該インキュベーションした溶液と、 該核酸合成酵素の基質を混合し、 被検 物質の非存在下で、 該核酸合成酵素と該核酸合成酵素の基質を接触させ、 該核酸 合成酵素の基質の反応産物への取り込みを測定する工程、
( d ) ( b ) 及び （ c ) の工程で測定された該核酸合成酵素の基質の反応産物 への各取り込みを比較する工程、
を含むことを特徴とする請求の範囲第 1項記載のアツセィ法。
3 . ウィルス核酸合成酵素の阻害剤のアツセィ法である請求の範囲第 1項または 第 2項記載のアツセィ法。
4 . 該ウィルス核酸合成酵素が、 ウィルス RNA依存型 RNA合成酵素である請求 の範囲第 3項記載のアツセィ法。
5 . 該ウィルス RNA依存型 RNA合成酵素が、 HCV RNA依存型 RNA合成酵素で ある請求の範囲第 3項記載のアツセィ法。
6 . 該一本鎖の核酸ォリゴマーが、 3'末端部分に自己相補的核酸配列を有するもの である請求の範囲第 4項または第 5項記載のァッセィ法。
7 . 該一本鎖の核酸オリゴマーが、 poly (A)の 3'末端部分に自己相補的核酸配列を 有するものである請求の範囲第 6項記載のアツセィ法。
8 . 該基質が、 3H-UTPまたは 32 P- UTPである請求の範囲第 7項記載のアツセィ法 ( 9 .該金属イオンが Mg2+または Mn2+である請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれか に記載のアツセィ法。
1 0 .該インキュベーションを 0 . 5時間以上行うことを特徴とする請求の範囲第 1 項〜第 9項のいずれかに記載のアツセィ法。
1 1 . 該インキュベーションを 2 0 °C ~ 4 0 °Cで行うことを特徴とする請求の範 囲第 1項〜第 1 0項のいずれかに記載のアツセィ法。
1 2 . 請求の範囲第 3項記載のアツセィ法により得られる物質とウィルス核酸合 成酵素を接触させることによる、 ウィルス核酸合成酵素の阻害方法。
1 3 . 請求の範囲第 3項記載のアツセィ法により得られる物質とウィルスを接触 させることによる、 ウィルスの複製の阻害方法。
1 4 . 該ウィルスがフラビウィルス科に属するウィルスである請求の範囲第 1 2 項または第 1 3項記載の方法。
1 5 . 該ウィルスが HCVである請求の範囲第 1 2項または第 1 3項記載の方法。
1 6 . 請求の範囲第 1項〜第 1 1項のいずれかに記載のアツセィ法により得られ る核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤。
1 7 . 請求の範囲第 1項〜第 1 1項のいずれかに記載のアツセィ法により得られ る核酸合成酵素の活性化剤または阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物。
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ZHONG W. ET AL.: "Template/primer requirements and single nucleotide incorporation by hepatitis C virus nonstructural protein 5B polymerase", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 74, no. 19, October 2000 (2000-10-01), pages 9134 - 9143, XP002957697 *

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