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WO2003018819A1 - Procede d'obtention de plants de maïs transformes a caracteristiques de digestibilite ameliorees, plants de maïs obtenus par le procede et utilisations - Google Patents

Procede d'obtention de plants de maïs transformes a caracteristiques de digestibilite ameliorees, plants de maïs obtenus par le procede et utilisations Download PDF

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WO2003018819A1
WO2003018819A1 PCT/FR2002/002982 FR0202982W WO03018819A1 WO 2003018819 A1 WO2003018819 A1 WO 2003018819A1 FR 0202982 W FR0202982 W FR 0202982W WO 03018819 A1 WO03018819 A1 WO 03018819A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
corn
polynucleotide
comt
methyltransferase
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/002982
Other languages
English (en)
Inventor
Magalie Pichon
Michel Beckert
Isabelle Nadaud
Deborah Goffner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genoplante Valor SAS
Original Assignee
Genoplante Valor SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genoplante Valor SAS filed Critical Genoplante Valor SAS
Priority to CA002459076A priority Critical patent/CA2459076A1/fr
Priority to EP02774893A priority patent/EP1425401A1/fr
Publication of WO2003018819A1 publication Critical patent/WO2003018819A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Definitions

  • the present invention relates to the field of improving the digestibility characteristics of corn, by modifying the composition and content of lignins.
  • Corn silage is an interesting food from several points of view.
  • the yield in the field of corn is relatively high, harvesting and storage are easy.
  • the nutritional qualities of ensiled corn are stable and can easily be supplemented with proteins by other forage silage or by soybean meal. These nutritional qualities allow the persistence of milk production.
  • a mixture of corn silage and fodder silage makes it possible to enhance the use of fodder proteins whose solubility (50%) is very high and very fast at the level of the cow's rumen (Léonard, 1996) .
  • corn silage makes it possible to dilute the important content of these elements in forage silage, in particular those of legume silage and to obtain an almost perfect balance between energy and protein from start to finish of lactation.
  • Silage is often an element that helps the breeder to control energy-protein synchronism.
  • the cultivation of this type of fodder is widespread and covers more than 3 million hectares in the European Union.
  • Optimizing the qualities of corn silage consists in increasing the net energy provided by this type of food by improving its digestibility.
  • lignins An important factor in reducing the digestibility of fodder corn is linked to the presence in the walls of plant cells of phenolic compounds, in particular lignins. Lignins establish different types of link with the other parietal constituents to form a tight mesh which hinders the accessibility of carbohydrates with digestive enzymes, the main source of energy for herbivores. Depending on their stage of maturity, plants would not have the same type of lignins deposited on their cell walls. The increase in lignification during the maturation of the plant causes a decrease in the digestibility of this plant (Bentley, 1959 and Grabber et al., 1992).
  • Brown midrib corn in particular bm3 corn, has a greatly increased digestibility compared to conventional corn and significantly improves milk production.
  • These bm3 maize differ from “normal” maize in a greatly reduced lignin content (up to 40%) and modified S (sinapyl alcohol) / G units (coniferyl alcohol) unit ratios.
  • modified S sinapyl alcohol
  • G units coniferyl alcohol
  • the drawbacks of bm3 maize such as a reduced field yield, an increased susceptibility to lodging, a lack of growth and vigor at the start of vegetation and a delay in flowering prevent their exploitation (Barrière and Argillier ( 1993)).
  • Lignin is a major compound in the cell wall of sclerenchyma and the xylem of vascular plants. It plays an important role in the conductive functions of xylem by reducing the water permeability of cell walls. In lignified tissues, it acts as an intercellular liaison officer. It is responsible for the rigidity of cell walls and the upright growth of plants and participates in the resistance of plants to mechanical attack (wind, injury, etc.) or infection by pathogens, tolerance to thermal and water stress.
  • lignin is an insoluble polymer of 3 monomers of alcohols or monolignols: p-coumaryl alcohol (units H), coniferyl alcohol (units G) and sinapylic alcohol (units S) .
  • p-coumaryl alcohol units H
  • coniferyl alcohol units G
  • sinapylic alcohol units S
  • Each type of precursor can form a variety of bonds with other precursors and thus constitute lignin.
  • Other links can also be established with other wall compounds (polysaccharides and proteins) to form a complex three-dimensional network.
  • the content and composition of lignins vary between the major groups of higher plants and between species.
  • the two major classes are gymnosperm lignins which mainly contain G units and a small proportion of H units, and angiosperm lignins which contain both S, G units and only a small proportion of H units (Whetten and al., 1998).
  • Monocotyledon lignins, and more particularly cereals, are the most complex. They consist of the 3 units H, G, S to which are added in a significant proportion of hydroxycinnamic acids (ferulic and coumaric acid) linked by ethers or esters bonds. This structural heterogeneity is also found within the same plant, depending on the organ considered but also according to the stage of development and the location in the wall (Lewis and Yamamoto, 1990)).
  • the lignin biosynthesis pathway is shown in Figure 1. Although the lignin biosynthesis pathway is much studied, many steps are still not understood, especially those involved in methoxylation.
  • the current hypothesis of the monolignol biosynthetic pathway considers that the metabolic network leading to the formation of the S and G units involves successive reactions of hydroxylation and O-methylation.
  • the phenylpropanoides biosynthesis pathway begins with the conversion of phenylalanine to cinnamic acid under the action Phenylalanine-Ammonia-Lyase (PAL).
  • PAL Phenylalanine-Ammonia-Lyase
  • the product of PAL activity on phenylalanine is trans-cinnamic acid which is a substrate for cinnamate-4-hydroxylase (C4H), a P450-hydroxylase.
  • C4H hydroxylates the 4 position of cinnamate to produce p-coumaric acid.
  • p-coumaric acid results from the action of Tyrosine-Ammonia-Lyase (TAL) on tyrosine.
  • TAL Tyrosine-Ammonia-Lyase
  • COAMT Caféoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase
  • 4CL hydroxycinnamate coenzyme A ligases
  • F5H hydroxycinnamate coenzyme A ligases
  • C3H p-coumarate hydroxylase
  • CCR Cinnamoyl Co A reductase
  • Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD).
  • the final stage of polymerization of the monolignols probably involves parietal enzymes, peroxidases and / or laccases.
  • the enzymes catalyzing the methylation steps are O-methyltransferases.
  • O-methyltransferases (S-adenoxyl-L-methionine O-methyltransferases, EC 2.1.1.6) play an important role in the biosynthesis of monolignols. It is currently accepted that COMT would preferentially intervene in the synthesis of S units and CCoAOMT in the synthesis of G units.
  • COMT would allow the methylation of the free forms of hydroxycinnamic acids: caffeic acid and 5-hydroxyferulic acid by introducing one or two methoxy groups respectively into the lignin monomers (Davin and Lewis, 1992). Recently, it has been shown in poplar that COMT is in fact a 5-hydroxyconiferyl aldehyde O-methyltransferase (AldOMT). In fact, 5-hydroxyconiferaldehyde is the preferred substrate for AldOMT. Thus, for Li et al.
  • COMT The involvement of COMT in the biosynthesis of lignin S units is supported by strong reduction in lignin in S units but not of G units in transgenic plants under-expressing COMT such as tobacco (Atanassova et al., 1995), alfalfa (Guo et al., 2001) and poplar (Van Doorselaere and al., 1995).
  • the S and G units are therefore important components of lignins and therefore play a role in the digestibility of the wall of plant cells.
  • the impact on digestibility of the increase or decrease in S and / or G units varies according to the studies.
  • studies on the mutant bm3 have shown that the increased digestibility of the walls is associated with a strong alteration in the structure of lignins: low S / G ratio with substantial incorporation of 5-hydroxyguaiacyl (5-OH G) units (Lapierre et al., 1988) and a lower lignin content. If the correlation results between the digestibility and the lignin content of the plant are always negative, the correlation results between the S / G ratio and the lignin content and the digestibility are not always identical.
  • Wild corn is understood to mean a corn having digestible characteristics, a ratio between the S units and the G units of the lignin, as well as a content of lignin in the plant similar, or even identical, to those of the line.
  • WT corn designated "WT” in the examples, which is a line available from the National Institute for Agronomic Research (INRA) under the name I 2 .
  • the improved digestibility characteristics of corn, or of these derivative products are obtained by the modulation of the synthesis of methyltransferase COMT, which modulation of synthesis induces:
  • the modulation of the synthesis of methyltransferase COMT can be supplemented by the simultaneous modulation of the synthesis of a second enzyme involved in the lignin biosynthesis pathway, preferably a second enzyme involved in the pathway biosynthesis of lignin in corn as described in the prior art and in particular illustrated in the diagram of the
  • the decrease in the synthesis of methyltransferase COMT can be obtained by the transformation of maize plants, in particular wild maize plants, by an antisense polynucleotide inhibiting the translation of the corresponding messenger RNA. This reduction can also be obtained by a co-suppression phenomenon, as described for example by Napoli et al. (1990) or Carvalho Niebel et al. (1995).
  • the increase in the synthesis of methyltransferase COMT can be obtained by transformation of corn plants, in particular wild corn plants, with a polynucleotide encoding this enzyme.
  • Whichever polynucleotide is used, it preferably comprises at least one regulatory sequence allowing its expression in a corn cell.
  • a reduction in the ratio S units / G units is obtained at least by specific inhibition of the COMT activity. It can be supplemented by increasing or reducing the synthesis of other enzymes involved in the biosyrithesis of S units and G units of corn lignin, increase or reduction of activity obtained mainly by overexpression or on the contrary inhibition of expression of genes encoding these other enzymes.
  • An inhibition of the COMT activity of maize is mainly obtained according to the invention by the use of oligonucleotides which specifically inhibit the transcription or the translation of the gene coding for this enzyme.
  • the nucleic acid encoding the COMT of maize is referenced as the sequence SEQ ID No. 1 of the sequence listing.
  • the subject of the invention is the use of a polynucleotide modulating the synthesis of corn COMT methyltransferase encoded by the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, in a process for obtaining corn plants with improved digestibility characteristics having a ratio between the units S and G of the modified lignin and / or having a modified lignin content remaining compatible with the normal development of the plant. It also relates to a process for obtaining maize plants having improved digestibility characteristics, having a ratio between the units S and G of the modified lignin and / or whose lignin content is modified and compatible with normal development.
  • said method comprising a step of transforming a corn host cell with a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) an antisense polynucleotide specifically inhibiting the expression of the gene encoding COMT methyltransferase corn; b) a polynucleotide encoding COMT methyltransferase from corn.
  • the antisense polynucleotide is the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2.
  • the polynucleotide encoding corn COMT methyltransferase is the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1.
  • the antisense polynucleotide or the polynucleotide encoding corn methyltransferase COMT are preferably inserted into an expression cassette allowing their functional expression in corn.
  • Such an expression cassette is advantageously introduced into an expression vector suitable for transforming corn cells. According to the method of the invention, it is possible to use a second polynucleotide modulating the activity of an enzyme involved in the pathway for biosynthesis of the S and G units of lignin, other than the methyltransferase COMT.
  • the invention also relates to a corn plant transformed according to the above process, which has improved digestibility characteristics, as well as to any part of the transformed corn plant, in particular root, seed, leaf, flower and stem.
  • the "metabolic network” described in the diagram includes the results of recent studies suggesting unexpected substrate specificities of the enzymes F5H and COMT (Humphreys et al. 1999; Osakabe et al. 1999; Li et al. 2000).
  • the framed pathway represents the main reactions leading to lignins G.
  • the framed pathway represents the preferred biosynthetic pathway for lignins S, 4CL, 4-coumarate coenzyme A ligase; CAD, cinnamyl alcohol dehydrogenase; CCR, cinnamyl coenzyme A reductase.
  • Figure 2 Principle of the method used to assess the impact of the transformation targeting COMT activity on the structure of lignins.
  • silylation BSTFA
  • CPG-SM electroactive impact
  • FIG. 3 Chromatographic profiles in CPG-SM of the control lines and under-expressing the COMT: profiles reconstructed on the specific ions of each type of monomer.
  • FIG. 4 HPLC analysis of products from mild alkaline hydrolysis (1 M NaOH, 2.5h, 40 ° C) of extracted corn samples (stems + leaves).
  • P-coumaric acid E and Z peaks 1 and 2.
  • Ferulic acid E and Z peaks 3 and 4.
  • Standard (ethylvanillin) peak 5.
  • Figure 5 Schematic representation of the constructions of the plasmids described in Example 1.
  • Figure 6A shows a Northern blot analysis of the 20-day C-OMT 225 corn line.
  • Figure 6B shows a comparative Southern blot analysis between the antisense line 225 and the line, using four separate restriction enzymes, respectively: AcoRV, Kpnl, EcoRI and SacI.
  • Figure 7 Screening of a population of transgenic maize plants, transformed respectively with the plasmids pProsper + pBar, pProsper-Bar, pJim + pBar2 and pALIX + pBar2.
  • the ordinate axis represents the COMT activity found in the corn plants analyzed, expressed in cpm / mg of protein.
  • the histogram bars each represent a tested transgenic plant.
  • Figure 8 cribro-vascular bundles of adult control corn leaves (I 2 ) and C-OMT antisense (225) stained according to Ma ⁇ le's method. We see that the coloration is less intense in the sclerenchyma and in the xylem of 225; this observation suggests a decrease in S units in the lignins of line 225.
  • the induction of the modulation of the synthesis of an enzyme involved in the biosynthesis pathway of corn lignin, methyltransferase COMT, also designated COMT causes a modification of the S units / G units ratio in the composition of lignin and / or of the lignin content, compared to that found in wild corn, and that the modification of the S units / G units ratio and / or of the content Lignin gave the corn plant, as well as its transformation products, improved digestibility characteristics.
  • improved digestibility characteristics of a corn plant according to the invention, it is meant that, compared with a variety of wild corn plant, for example the aforementioned variety of corn I 2 , the corn plant obtained according to the invention has a higher digestibility index value "dndf" than the digestibility index value calculated from a corn plant of the wild variety.
  • the material used for the establishment of the ndf is a lyophilized powder of whole plants harvested at the flowering stage.
  • a corn plant obtained according to the invention has improved digestibility characteristics if the value of the “dndf” index is at least 80.
  • a corn plant according to the invention has a Klason lignin content, measured from the stems and leaves, which is less than 8.5, preferably less than 8, 7.5, to, 7.0 , at 6.9 or 6.8, and preferably less than 6.7.
  • a preferred corn plant according to the invention has a Klason lignin content of between 6.1 and 6.6.
  • Example 9 To measure the Klason lignin content, a person skilled in the art can advantageously refer to the technique described in Example 9. It is shown for the first time according to the invention, surprisingly: a) that the inhibition of COMT methyltransferase corn enzyme allowed (i) to reduce the ratio S units / G units of lignin in this plant and (ii) to reduce the lignin content in this plant; and b) that the reduction of the S units / G units ratio of lignin and / or of the lignin content in maize made it possible to obtain maize plants having improved digestibility characteristics, compared to wild maize.
  • the applicant has developed a process for transforming corn plants in which the transformed corn plants have a ratio S units / G units of lignin and / or a modified lignin content, relative to that found in wild corn plants.
  • the S units / G units ratio is lower than the S units / G units ratio found in a wild corn plant.
  • transformed corn plants having improved digestibility characteristics can be obtained using an antisense polynucleotide.
  • the subject of the invention is the use of a polynucleotide modulating the synthesis of corn COMT methyltransferase encoded by the nucleotide sequence SEQ ID No. 1, in a process for obtaining corn plants with improved digestibility characteristics having a ratio between the units S and G of the modified lignin and / or having a modified lignin content remaining compatible with the normal development of the plant.
  • said polynucleotide inhibits the synthesis of COMT methyltransferase from corn in the plant, when it is introduced by transformation into the cells of said plant.
  • Said antisense polynucleotide consists of a polynucleotide coding for an antisense RNA hybridizing with the messenger RNA constituting the transcript of the gene coding for methyltransferase COMT in maize.
  • a person skilled in the art can synthesize any antisense polynucleotide inhibiting the synthesis of methyltransferase COMT using his general technical knowledge, from a nucleotide sequence coding for COMT, for example the sequence SEQ ID No. 1.
  • a sense polynucleotide or of an antisense polynucleotide which specifically inhibits the transcription or translation of a gene coding for an enzyme involved in the biosynthesis of lignins in plants, in particular the COMT of certain plant species
  • those skilled in the art can advantageously refer to the articles by Baucher et al. (1999), de Zhong et al. (2000), de Pinboc et al. (2001a), de Blee et al. (2001), de Pinboc et al. (2001 b) or Lapierre et al. (1999).
  • the antisense polynucleotide can also consist of the cDNA obtained from the mRNA constituting the transcription product of the gene coding for methyltransferase COMT.
  • the antisense polynucleotide comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 2.
  • the antisense polynucleotide consists of the antisense polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2.
  • said polynucleotide increases the synthesis of methyltransferase COMT in the plant, when it is introduced by transformation into the cells of said plant.
  • a polynucleotide encoding COMT methyltransferase from corn is used, which causes a higher production of this enzyme, when it is introduced by transformation into the plant.
  • methyltransferase COMT can be obtained: - (i) either by transforming corn cells with a polynucleotide encoding methyltransferase COMT placed under the control of a functional regulatory sequence in corn, said regulatory sequence being able to include a strong constitutive promoter and, where appropriate, also transcription activator sequences (functional “enhancer” sequences in corn), allowing a high level of expression of the methyltransferase COMT;
  • the polynucleotide coding for methyltransferase COMT comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • the polynucleotide coding for methyltransferase COMT consists of the nucleotide sequence SEQ ID No. 1.
  • a subject of the invention is also a process for obtaining maize plants having improved digestibility characteristics, having a ratio between the units S and G of the modified lignin and / or the lignin content of which is modified and compatible with the normal development of the plant, said method comprising a step of transforming a corn host cell with a polynucleotide chosen from the following polynucleotides: a) an antisense polynucleotide specifically inhibiting the expression of the gene encoding COMT methyltransferase corn; b) a polynucleotide encoding COMT methyltransferase from corn.
  • the modification of the lignin composition of the transformed corn plants capable of being obtained by the above process consists in reducing the content of S units relative to the content of G units in corn lignins, so as to obtain a lower S / G ratio than that of wild corn plants.
  • the S / G ratio is less than 40/60.
  • said method is characterized in that it comprises the following steps: a) transforming a corn host cell with a polynucleotide encoding corn COMT methyltransferase COMT; b) regenerating an entire plant from the recombinant host cell obtained in step a); Preferably, the polynucleotide encoding methyltransferase
  • COMT of maize comprises the nucleotide sequence SEQ ID N ° 1.
  • the process for obtaining transformed corn plants according to the invention is characterized in that it comprises the following additional step: c) selecting the corn plants having integrated into their genome at least one copy of the antisense polynucleotide or at least one copy of the polynucleotide encoding COMT methyltransferase from maize.
  • Expression cassettes comprising an antisense polynucleotide or a polynucleotide encoding COMT methyltransferase from maize
  • the antisense polynucleotide or the polynucleotide encoding COMT methyltransferase from corn is integrated into an expression cassette also comprising a nucleotide sequence regulating the expression of said polynucleotide in corn cells.
  • the antisense polynucleotide or the polynucleotide coding for methyltransferase COMT is integrated into an expression cassette also comprising a nucleotide sequence with a transcription terminator function.
  • the expression cassette defined generally above may also be designated “DNA construct” or “DNA construct” in the present description.
  • the antisense polynucleotide or the polynucleotide coding for methyltransferase COMT where also the expression cassette in which is inserted respectively one or the other of these polynucleotides, is artificially inserted into a host cell of Agrobacterium tumefaciens.
  • the DNA constructs also include a gene promoter sequence and a terminator sequence operably linked to the DNA sequence to be transcribed.
  • the gene promoter is generally located at the 5 'end to allow initiation of transcription of the DNA sequence.
  • the promoter sequences are located in the 5 'non-coding regions of the genes but also sometimes in the introns (Luehrsen K ,. 1991) or in the coding regions such as, for example, the promoter of the PAL gene in tomatoes (Bloksberg, 1991).
  • the construct includes an open sense reading phase, it is necessary to use a full length cDNA so that the protein can be translated.
  • the construct comprises an open reading phase in antisense or a non-coding region, it is not essential to use a full length cDNA, a partial sequence may suffice.
  • transcription promoters which can be used, mention may be made in particular of the so-called constitutive promoters, the so-called inductive promoters as well as the specific tissue promoters.
  • a constitutive promoter allows a strong expression of the transcript in all the tissues of the regenerated plant and will be active in most environmental conditions, and in all the stages of cellular transformation and differentiation.
  • the main dual component promoters are:
  • 35S promoter or advantageously the double constitutive promoter 35S (pd35S) of CaMV, described in the article by Kay et al., (1987) - the rice actin promoter followed by the rice actin intron contained in the plasmid pAct1-F4 described by Me Elroy et al. (1991)
  • PAL phenylalanine ammonia lyase
  • HMG HMG-CoA reductase
  • promoters which can advantageously be used to carry out the process which is the subject of the invention groups together specific tissue promoters, in particular they may be promoters of genes for the lignin biosynthesis pathway or for example the promoter of the alcohol dehydrogenase which is expressed specifically in vascular tissue.
  • the terminator sequence used in the constructions which are the subject of the invention is located at the 3 ′ end of the sequence to be transcribed. It can come from the same gene as the promoter sequence or from a different gene.
  • transcription terhninators which can be used, there may be mentioned:
  • polyA NOS terminator which corresponds to the 3 ′ non-coding region of the nopaline synthase gene of the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens nopaline strain.
  • the constructs also include a selection marker for selecting the plant cells transformed by these constructs.
  • selection markers are well known to those skilled in the art, in particular they confer resistance to one or more toxins, for example resistance to the herbicide BASTA®.
  • the transformation of plant cells by the constructions which are the subject of the invention can be controlled by other techniques well known in the art such as Southern and Western Blots.
  • DNA constructs of the present invention can be linked to a vector having at least one replication system, for example with E. Coli, after each manipulation, it is possible to clone and sequence the construct obtained in order to verify the correct handling.
  • the invention relates to the constructions as described above, and comprising at least one sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 or 2 linked operatively upstream to a promoter and downstream to a terminator.
  • the expression cassette comprises the promoter of the alcohol dehydrogenase specific for the vascular system, the cDNA of methyltransferase (COMT or AldOMT) and the terminator of Nopaline synthase, as shown in FIG. 'example 1.
  • the expression cassettes or the DNA constructs as defined above can be included in expression vectors which can be used to transform an Agrobacterium tumefaciens cell or a corn host cell.
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC No. 37 017) or also the vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, United States ).
  • vectors pQE70, pQE60, pQE9 Quiagen
  • psiX174 pBluescript SA
  • pNH8A pMH16A
  • pMH18A pMH46A
  • pWLNEO pSV2CAT
  • pOG44 pOG44
  • pXTI pSG
  • They may also be vectors of the Baculovirus type such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect the cells of the line Sf9 (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda.
  • vectors of the Baculovirus type such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect the cells of the line Sf9 (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda.
  • vectors specially adapted for the expression of sequence of interest in plant cells such as the following vectors: - vector pBIN19 (BEVAN et al.), Marketed by the Company
  • a first very preferred vector is the plasmid pAlix represented in FIG. 5, into which has been inserted the antisense polynucleotide of sequence SEQ ID No. 2 inhibiting the synthesis of methyltransferase COMT from maize.
  • a second very preferred vector is the plasmid pProsper represented in FIG. 5, into which has been inserted the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 coding the methyltransferase COMT of corn. Processing of corn plants
  • An increase in the synthesis of the S and / or G units of lignin and / or of the lignin content in the plant can be obtained by integrating in the open reading phase a DNA construct in sense orientation, in particular the sequence SEQ ID # 1.
  • the transformation of a target plant with such a construction results in an increase in the number of copies of the transcript and therefore in an increase in the quantity of enzyme.
  • an increase in the synthesis of S units can be obtained by integrating into the genome of the target plant the sense sequence of O methyltransferase encoded by SEQ ID No. 1.
  • a reduction in the synthesis of S and / or G units of lignin and / or of the lignin content in the plant can be obtained by introducing into the open reading phase a DNA construct in antisense orientation, in particular any or part of the sequence SEQ ID n ° 2.
  • the transcribed RNA is complementary to the endogenous mRNA sequence, which will have the consequence of reducing the number of copies of the transcript and therefore of reducing the quantity of enzyme.
  • a decrease in the synthesis of S units can be obtained by integrating into the genome of the target plant the antisense sequence of methyltransferase COMT coded by SEQ ID No. 2.
  • the DNA constructs can also comprise a nucleotide sequence comprising a non-coding region of the methyltransferase COMT gene.
  • non-coding regions which can be used in such constructs include introns and 5 'or 3' non-coding sequences. Transformation of target plants with such DNA constructs can lead to a reduction in the synthesis of S and / or G units of lignin and / or the lignin content by the co-suppression process, as has described for example Napoli et al. (1990) or Carvalho Niebel et al. (1995).
  • the regulation of the synthesis of S and / or G units of lignin and / or of the lignin content can also be carried out by inserting said sequences in whole or in part (for example DNA or RNA) in ribozyme constructs (Haseloff and al., 1988).
  • the effect of the antisense polynucleotide or of the polynucleotide encoding the methyltransferase COMT of maize can be completed by the insertion in the genome of the same corn plant of a second polynucleotide derived from the gene encoding an enzyme involved in the lignin biosynthesis pathway, other than the methyltransferase COMT.
  • the above method can also be characterized in that in step a), the corn host cell is also transformed with at least one second polynucleotide, specifically modulating the expression of an enzyme involved in the pathway biosynthesis of lignins, other than corn COMT methyltransferase.
  • said method is characterized in that the second polynucleotide is chosen from: a) an antisense polynucleotide specifically inhibiting the expression of the gene coding for the enzyme involved in the lignin biosynthetic pathway, other than the methyltransferase COMT of But ; b) a polynucleotide encoding the enzyme involved in the lignin biosynthesis pathway, other than corn COMT methyltransferase.
  • the enzyme involved in the lignin biosynthesis pathway is chosen from: (a) the CAD enzyme from corn, the sequence of which is referenced in the GenBank database under the access number Y13733, (b) the corn CCR1 enzyme whose sequence is referenced in the GenBank database under access number X98083 and (c) the F5H enzyme from Arabidopsis thaliana whose sequence is referenced in the base GenBank data under access number U38416.
  • the enzyme involved in the lignin biosynthesis pathway can also be chosen from (d) the CCoAOMTI enzyme from corn, the sequence of which is referenced in the GenBank database under the number d access AJ242980 and (e) the corn CCoAOMT2 enzyme whose sequence is referenced in the GenBank database under the access number AJ242981.
  • the constructs serve to transform plant cells.
  • the transformation of plant cells can be carried out by transferring the above-mentioned vectors into plant protoplasts, in particular after incubation of the latter in a polyethylene glycol solution in the presence of divalent cations (Ca 2+) (Schocher ef al., 1986).
  • the transformation of plant cells can advantageously be carried out by electroporation, in particular according to the method described in the article by Fromm et al. (1985).
  • the transformation of plant cells can also be carried out by using a particle gun allowing the projection, at very high speed, of metallic particles covered with the DNA sequences of interest, thus delivering the sequences inside the cell nucleus. (Fromm et al. 1990, Finer et al., 1992).
  • Another method of transforming plant cells is that of cytoplasmic or nuclear micro-injection (Neuhaus et al., 1987).
  • One of the methods of transformation of plant cells which can be used in the context of the invention is the infection of plant cells by a bacterial cell host comprising the vector containing the sequence of interest.
  • the abovementioned cell host used is Agrobacte um tumefaciens, in particular according to the method described in the article by An et al. (1986), or even Agrobacterium rhizogenes, in particular according to the method described in the article by Guerche et al. (1987).
  • the transformation of plant cells is carried out by the transfer of the T region of the extrachromosomal circular plasmid inducing Ti tumors of Agrobactenum tumefaciens, using a binary system (Watson et al., 1994).
  • a binary system Wang et al., 1994.
  • two vectors are constructed. In one of these vectors, the T-DNA region was deleted, with the exception of the right and left edges, a marker gene being inserted between them to allow selection in plant cells.
  • the other partner of the system binary is a helper Ti plasmid, a modified plasmid which no longer has T-DNA but still contains the vir virulence genes necessary for the transformation of the plant cell.
  • This plasmid is maintained in Agrobacterium.
  • the method described by Ishida et al. (1996) can be applied for the transformation of monocots, in particular maize.
  • the transformation is carried out according to the method described by Finer et al. (1992) using the tungsten or gold particle gun.
  • the process for obtaining transformed corn plants according to the invention is characterized in that it comprises the following additional steps: d) crossing between them of two transformed plants as obtained in step b) or in step c) with a second corn plant; e) selection of the plants homozygous for the transgene or the transgenes.
  • the process for obtaining transformed corn plants according to the invention is characterized in that it comprises the following additional steps: f) crossing of a transformed corn plant obtained in step c) with a second corn plant; g) selection of the corn plants resulting from the crossing of step f) and having conserved the transgene.
  • One of the embodiments of the process which is the subject of the invention relates to obtaining transgenic maize plants from plant cells transformed with a construct comprising at least one sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2 .
  • the subject of the invention is also a corn host cell or an Agrobacterium tumefaciens cell transformed with: a) either an antisense polynucleotide inhibiting the synthesis of methyltransferase COMT in a corn cell; b) or a polynucleotide coding for methyltransferase COMT, said polynucleotide (a) or said polynucleotide (b) being preferably placed under the control of a functional regulatory sequence in a corn cell, for example in an expression cassette or else in an expression vector as defined above.
  • the present invention relates to the cells of transformed plants thus obtained.
  • the corn cells having stably integrated into their genome the constructs comprising all or part of the sequences SEQ ID No. 1 or No. 2.
  • the cells transformed by the constructions which are the subject of the present invention are selected by means of the selection marker, for example resistance to BASTA®.
  • the transgenic cells are then cultivated on an appropriate medium to regenerate whole plants using methods well known to those skilled in the art.
  • the cell wall can reform under the effect of appropriate osmotic conditions.
  • a medium favorable to the germination or the initiation of calluses is used.
  • the medium used must allow regeneration.
  • the principle of in vitro regeneration of corn plant cells is well known to those skilled in the art.
  • the plants are regenerated from calluses obtained after culturing anther cells, pollen grains, embryos or protoplasts.
  • the cells are cultivated on agar nutritive media adapted to each cell type under sterile conditions in petri dishes or culture tubes in a climatic chamber under favorable environmental conditions (suitable temperature and brightness). After transplanting, the vitroplants are transplanted to the greenhouse.
  • the corn plants offering better digestibility and whose content of S and / or G units is modified, in particular having a S / G ratio lower than that of plants whose ratio n is not modified can be obtained after hybridization with an individual whose activity of methyltransferase COMT is modified by the principles of varietal selection well known to those skilled in the art.
  • a person skilled in the art can also employ the methods of vegetative multiplication from corn plants whose methyltransferase COMT activity is modified, in particular in order to modify the ratio in S units / G units and / or the lignin content. These methods can advantageously include certain steps in vitro. These can be stages of regeneration of cells having a modified COMT methyltransferase activity. It can be methods of tissue culture, micro-cuttings, culture of meristems, culture of embryos, corn plants having a modified methyltransferase COMT activity. These can be methods of regenerating protoplasts from corn plants having a modified COMT methyltransferase activity or from fusion with protoplasts from corn plants having a modified COMT methyltransferase activity.
  • the subject of the invention is also a transformed corn plant, capable of being obtained by the process as defined above, which is characterized by digestibility characteristics. improved.
  • a corn plant transformed in accordance with the invention has improved digestibility characteristics and a value of the index “dndf” of at least 80.
  • a plant of corn according to the invention has a Klason lignin content, measured from the stems and leaves, which is less than 8.5, preferably less than 8, 7.5, to, 7.0, to 6, 9 or 6.8, and preferably less than 6.7.
  • a preferred corn plant according to the invention has a Klason lignin content of between 6.1 and 6.6.
  • a corn plant transformed according to the invention has an S / G ratio of lignin of less than 40/60.
  • the invention also relates to a part of a transformed corn plant as defined above, for example a root, a seed, a leaf, a stem or a flower.
  • the invention also relates to a recombinant expression vector comprising a polynucleotide chosen from: a) an antisense polynucleotide specifically inhibiting the expression of the gene encoding COMT methyltransferase from corn; b) a polynucleotide coding for methyltransferase COMT; said polynucleotide being placed under the control of a functional regulatory sequence in corn.
  • the present invention also relates to a DNA construct comprising a sense polynucleotide or an antisense polynucleotide specifically inhibiting the transcription or translation of the COMT gene of sequence SEQ ID No. 1, placed under the control of a functional promoter in maize .
  • It also relates to a DNA construct comprising a polynucleotide coding for methyltransferase COMT, placed under the control of a functional promoter in corn to increase the expression of said enzyme.
  • the invention also relates to a transformation product obtained from a transformed corn plant or part of a transformed corn plant, as defined above.
  • a transformation product is characterized in particular in that the lignin which it contains has a modified ratio between the S units and the G units.
  • the S / G ratio is less than 40/60.
  • Said transformation product includes animal feed, obtained from corn plants whose contents in S units or in G units are modified and / or whose lignin content is modified.
  • the subject of the invention is also a lignin purified from a transformed corn plant or a part of a corn plant as defined above, characterized in that it has in particular a relationship between the units S and the G units which is modified, compared to the S / G ratio found in lignin from wild corn plants.
  • the lignin purified above is characterized in that the S / G ratio is less than 40/60.
  • PCR amplification is carried out on this plasmid with the oligonucleotides TOM22 (5'-CTGCTGGAGGTGCTGCAGAAG-3 '- SEQ ID N ° 3) and TOM23 (5'-CTCCTTGCCCCCGGGGTTGTG-3 - SEQ ID N ° 4'), allowing respectively to introduce the PstI and Smal sites, 5 ′ and 3 ′ of a 0.85 Kpb fragment between the positions 0.17 and 1.04 Kpb of the cDNA.
  • This fragment is then subcloned into the vector pGemT (Promega), and the plasmid obtained is digested with PstI and SmaI.
  • the released fragment is cloned into pUC18-Nos at the PstI and SmaI sites, thus generating the plasmid pTMO-Nos.
  • the plasmid pBARGUS (Fromm et a /., 1990) contains a CaMV35S-intron Adhl-BAR-Tnos promoter cassette and an AdhI-Intron AdhI-GUS-Tnos promoter cassette. The latter is released by EcoRI and Hindlll digestion. In a second step, partial EcoRI / Pvull digestion of the same fragment makes it possible to release a 1.75 Kpb fragment corresponding to the Adhl promoter coupled to the Adhl intron. This fragment is then subcloned into pTMO-Nos between EcoRI and Smal. The plasmid obtained is pProsper. - pAlix plasmid [ Figure 5]
  • the PMC1 plasmid is digested with HindIII and Xbal to release the full length (1.4 Kbp) cDNA from C-OMT.
  • the plasmid pActine-BAR (Wu, (Cornell University, New York) consists of the plasmid psP72 containing an actin - Intron actin - BAR - Tnos promoter cassette. This plasmid is digested with Hindlll and Xbal to remove the BAR fragment, then the fragment 1.4 Kbp Hindlll-Xbal of C-OMT is subcloned between these two sites, thus giving the plasmid pAlix.
  • the plasmid pBARGUS is digested with HindIII, to release the promoter cassette CaMV35S - Intron Adhl - BAR - Tnos of 2.13 Kpb.
  • the cassette thus released is subcloned into pUC18 at the Hindlll site, to give the plasmid pBar2.
  • the transformation begins with a co-culture phase where the immature embryos of the corn plants are brought into contact for at least 5 minutes with Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 containing the superbinary vectors.
  • the superbinary plasmid is the result of homologous recombination between an intermediate vector carrying the T-DNA containing the gene of interest and / or the selection marker derived from the plasmids described in the previous examples, and the vector pSB1 from Japan.
  • Tobacco which contains: the virB and virG genes of the plasmid pTiBo542 present in the supervirulent strain A281 of Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) and a homologous region found in the intermediate vector allowing this homologous recombination.
  • the embryos are then placed on LSAs medium for 3 days in the dark and at 25 ° C.
  • a first selection is made on the transformed calluses: the embryogenic calluses are transferred to LSD5 medium containing phosphinotricin at 5 mg / l and cefotaxime at 250 mg / l (elimination or limitation of contamination by Agrobacterium tumefaciens). This stage is carried out for 2 weeks in the dark and at 25 ° C.
  • the second selection step is carried out by transfer of the embryos which have developed on LSD5 medium, on LSD10 medium (phosphinotricin at 10 mg / l) in the presence of cefotaxime, for 3 weeks under the same conditions as above.
  • the third selection step consists in excising the type I calluses (fragments of 1 to 2 mm) and transferring them 3 weeks in the dark and at 25 ° C to LSD 10 medium in the presence of cefotaxime.
  • the regeneration of the seedlings is carried out by excising the type I calluses which have proliferated and by transferring them to LSZ medium in the presence of phosphinotricin at 5 mg / l and cefotaxime for 2 weeks at 22 ° C. and under continuous light.
  • the regenerated seedlings are transferred to RM + G2 medium containing 100 mg / l of Augmentin for 2 weeks at 22 ° C and under continuous illumination for the development stage.
  • the plants obtained are then transferred to the phytotron for their acclimatization.
  • Calluses of genotype I 2 , 2 months old, obtained after the cultivation of immature embryos on a callogenesis medium are used for transformation.
  • a plasmolyzing treatment makes it possible to reduce the volume of the vacuole and thus limits the cell bursts during firing (pretreatment of 4 hours and a post-treatment of 16 hours on a Sorbitol 0.2M and Mannitol 0.2M medium).
  • the plant material is distributed evenly across all of the boxes.
  • 15 mg of sterile tungsten microbeads are mixed in 150 ⁇ l of sterile milliQ water.
  • a sterile gauze filter is placed on the petri dish which is placed 19 cm in the barrel enclosure.
  • the vacuum is pushed inside the enclosure at a pressure of 25 mbar
  • the shooting is started.
  • the helium pressure in the barrel is 8 bars.
  • the bombarded plant material is returned to its original petri dish (Mannitol / Sorbitol).
  • the boxes are placed at 26 ° C and in the dark for 16 hours for a post-bombardment plasmolyzing treatment (mannitol / sorbitol).
  • the selection pressure is applied 16 hours after firing and is maintained at the same concentration of the selective agent (bialaphos at 5 mg / L) during all the regeneration steps.
  • the seedlings are then transplanted into potting soil (small pots) for 1 week then transferred to 20-liter pots (peat-pozzolan mixture) in the transgenic greenhouse or in an air-conditioned room (temperature 24 ° C day / 20 ° C night; photoperiod 16h day / 8h night, humidity 80%).
  • the plants are self-fertilized or crossed.
  • RNAs are isolated by the Extract-all solution (Eurobio), according to the supplier's protocol. Additional precipitation with 0.2 M NaCl with 2 volumes of absolute ethanol is carried out. 10 ⁇ g of RNA are separated on formaldehyde gels (Sambrook et a /., 1989). Total genomic DNA is extracted from 1 g of leaves by the method described in Dellaporta et al. (1983). After a phenol-chloroform purification step, 10 ⁇ g of DNA are digested with 40 units of restriction enzyme (Promega), and separated on TAE agarose gel at 1% (m / v).
  • RNAs or DNAs are transferred onto nylon membranes (Hybond-N +, Amersham), and hybridized with DNA probes labeled with 32 P-dCTP by the "prime-a-gene labeling system" kit from Promega.
  • the hybridization signal is determined by contacting the membranes with Kodak Biomax-MS films in an autoradiography cassette.
  • Figure 6A shows a Northern blot analysis of the 20-day C-OMT 225 corn line. RNAs from roots (r), collar (c), and coiled leaves (H) of line 225 and control line I2 were deposited on agarose electrophoresis gel.
  • rRNA ribosomal RNAs
  • Figure 6B shows a comparative Southern blot analysis between the antisense line 225 and the line I2, using four distinct restriction enzymes, respectively: EcoRV, Kpnl, EcoRI and Sac1.
  • the probe used is a 1.2 Kb fragment located in the 3 ′ region of the corn C-OMT cDNA.
  • the bands revealed on the line I 2 are due to the endogenous gene C-OMT.
  • the supernumerary bands present for the line 225 correspond to the transgenic sequences: the enzymes EcoRV, Kpnl and Sacl do not cut in the transgene.
  • An EcoRI site is present in the 5 'part of the transgenic construct.
  • 3 supernumerary bands (EcoRI, EcoRV) or 2 bands (Kpnl, Sacl) appear for the line 225.
  • reaction mixture (Caffeic acid 3 mM, 3 H-SAM 0.1 ⁇ Ci, SAM 50 ⁇ M, DTT 10 mM, Na 2 HP0 4 buffer / NaH 2 P0 4 0.1 M pH 7.5 qs 960 ⁇ L) and the whole is incubated for 1 hour at 37 ° C.
  • the reaction is stopped with 100 ⁇ L of 9N sulfuric acid and 5 ml of organic scintillant (OCS, Amersham) are added to the mixture.
  • OCS organic scintillant
  • the whole is homogenized to pass the tritiated ferulic acid, product of the reaction, through the organic scintillant.
  • the radioactivity of ferulic acid is quantified with a Beckman scintillation counter.
  • the proteins are assayed according to the method of Bradford (1976) with the reagent of Biorad.
  • the plants were harvested at a young stage (20 days old after sowing), which implies a short time between sowing and analysis, and which makes it possible to cultivate a large number of plants simultaneously.
  • the stem and the coiled young leaves were used as a mixture for this work.
  • the ligulate leaves have been eliminated.
  • the mutant corn line bm3 was used for the comparison. It was interesting to validate the protocol for measuring C-OMT activity, used for the first time on corn, using the mutant bm3, which exhibits zero C-OMT activity. Three bm3 plants were analyzed, and we observe a very low activity level corresponding to the background noise. The crude protein extracts from bm3 plants therefore constitute excellent negative controls in this work.
  • Ma ⁇ le staining The sections are incubated in a 1% (m / v) KMn ⁇ 4 solution for 5 minutes, rinsed in distilled water, discolored with a 15N HCl solution for 3 minutes, rinsed in distilled water, and incubated in a solution of NaHCO 3 to 5% (m / v).
  • Phloroglucinol staining The sections are immersed in a solution of phloroglucinol in hydrochloric solution (Prolabo). The photographs are taken with a camera. B. Results
  • FIG. 8 represents photon microscopy pictures of cribovascular bundles of adult leaves of corn, respectively of the line I 2 of control corn and of the line of corn 225, which was transformed with a antigen polynucleotide inhibiting methyltransferase COMT.
  • This method makes it possible to estimate a potential digestibility by the activity of cellulolytic enzymes on the plant wall.
  • the samples are placed in sealed bags and immersed in the enzyme solutions.
  • the reactions take place in a DAIZY incubator which can contain four 2-liter bottles, shaken by rotation, maintained at 40 ° C and which can contain from 20 to 80 sachets.
  • the lyophilized powder samples are incubated overnight at 70 ° C in a crystallizer. Then, 0.5 g of powder (initial mass) is placed in a sachet (F57, Ankom) which is closed by welding, incubated for 24 h at 70 ° C and then weighed after cooling (P1).
  • the sachet is then incubated in a pepsin solution (Merck) at 20 g / L of 0.1 N HCL, at 40 ° C for 24 h, then at 80 ° C for Vz hour. The whole is then rinsed with water at 35 ° C and wrung. This step is repeated once.
  • a pepsin solution Merk
  • the sachet is then incubated in a cellulase solution (Onozuka R10 Yakult, Biochemical Co, Ltd.) At 1 g / L with amyloglucosidase (Merck) at 0.1 g / L in a sodium acetate / acetic acid buffer (2.95 mL of 96% acetic acid and 6.8 g of sodium acetate in 1L of demineralized water), at 40 ° C for 24 h, then rinsed and wrung twice, before being dried at the oven at 70 ° C for 24 hours. The bag is weighed (P2). The solubility (in% of the dry mass) is equal to (P1-P2) / (initial mass x 100).
  • index ndf represents the percentage of non-digestible fraction measured from lyophilized powder of whole plants harvested at the flowering stage.
  • the dndf index represents the digestibility index calculated from the value of ndf (neutral detergent fiber) and dms (enzymatic solubility Aufrère) according to the formula of Struik (1985).
  • Table 1 show the higher digestibility of the two transgenic corn lines 225 (1) and 225 (2) which were transformed with an antisense construct according to the invention, compared to the control “WT” corn variety, the corn line I 2 .
  • the fairly high extractable content is due to the presence of the leaves.
  • the Klason lignin assay was carried out on the extracted samples. It is expressed as a percentage by weight of these samples (Table 3).
  • Table 3 Klason lignin content of the corn samples (stems + leaves) extracted. Results expressed in% by weight of the walls extracted
  • the lignin contents are lower than in the case of stems harvested at maturity: the samples extracted come from (leaves + stems) harvested at the flowering stage.
  • the two lines transgenic have a lower lignin content (25 to 30% less) than the control line.
  • the p-hydroxycinnamic esters bound to the walls were released by alkaline hydrolysis (1 M NaOH, 2.5 h, 40 ° C, 20 mg of sample extracted treated with 2 ml of sodium hydroxide, in the presence of 0.2 mg internal standard ethylvanillin, with stirring magnetic and under N 2 ).
  • the hydrolyzate was acidified with 2 M HCl (1.5 ml), ultrafiltered through Millex H25 NS (Millipore).
  • the phenolic compounds were extracted by solid phase extraction on Sep-Pak C1.8 (Classic, Waters Millipore), according to a protocol adapted from Beveridge et al. (2000, Food Res. Internat., 33, 775-783).
  • the Sep-pak cartridge was packaged with 2 * 5 ml MeOH, 2 * 5 ml water (milliQ), 2 * 5 ml formate buffer pH 3, before passage of the acidified hydrolyzate, followed by washing with 3 ml formate buffer.
  • the elution of the phenolic compounds retained in full on the cartridge (we have verified it) was carried out with 1 ml CH 3 CN.
  • the collected sample was diluted v / v with the HPLC solvent before being ultrafiltered again and analyzed by reverse phase HPLC (20 ⁇ l injected).
  • Ferulic esters are associated with polysaccharides and can be linked to lignins by ether linkages (Jacquet et al., 1995).
  • the lower lignin content of transgenic maize limits this stowage and probably accounts for the fact that more ferulic acid is released by alkaline hydrolysis of the transgenic lines, compared to the control.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide modulant la synthèse de la méthyltransférase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N DEG 1, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante. Application à l'amélioration de la digestibilité du maïs

Description

Procédé d'obtention de plants de maïs transformés à caractéristiques de digestibilité améliorées, plants de maïs obtenus par le procédé et utilisations
La présente invention se rapporte au domaine de l'amélioration des caractéristiques de digestibilité du maïs, en modifiant la composition et la teneur des lignines.
ART ANTERIEUR Le maïs ensilé est un aliment intéressant à plusieurs points de vue. Pour l'agriculteur, le rendement au champ du maïs est relativement élevé, la récolte et le stockage sont aisés. Pour les animaux, en particulier pour les vaches laitières, les qualités nutritionnelles du maïs ensilé sont stables et peuvent aisément être complémentées en protéines par d'autres ensilages de fourrage ou par des tourteaux de soja. Ces qualités nutritionnelles permettent la persistance de la production laitière. Ainsi, un mélange d'ensilage de maïs et d'ensilage de fourrage permet de valoriser l'utilisation des protéines du fourrage dont la solubilité (50%) est très élevée et très rapide au niveau du rumen de la vache (Léonard, 1996). Le faible contenu en calcium et en potassium de l'ensilage de maïs permet de diluer l'importante teneur de ces éléments dans l'ensilage de fourrage, notamment ceux de l'ensilage de légumineuses et d'obtenir un équilibre quasi parfait entre l'énergie et les protéines du début à la fin de la lactation. L'ensilage est souvent un élément qui aide l'éleveur à maîtriser le synchronisme énergie-protéine. Etant donné les qualités nutritionnelles du maïs d'ensilage, la culture de ce type de fourrage est très répandue et couvre plus de 3 millions d'hectares dans l'Union Européenne. L'optimisation des qualités de l'ensilage de maïs consiste à augmenter l'énergie nette fournie par ce type d'alimentation en améliorant sa digestibilité.
Un facteur important de diminution de digestibilité du maïs fourrage est lié à la présence dans les parois des cellules végétales de composés phénoliques, en particulier des lignines. Les lignines établissent différents type de liaison avec les autres constituants pariétaux pour former un maillage serré qui gène l'accessibilité des glucides aux enzymes digestives, principale source d'énergie pour les herbivores. Selon leur stade de maturité, les plantes ne posséderaient pas le même type de lignines déposées sur leurs parois cellulaires. L'augmentation de la lignification au cours de la maturation de la plante provoque une diminution de la digestibilité de cette plante (Bentley, 1959 et Grabber et al., 1992). Il est difficile de corréler la réduction de la digestibilité des plantes au cours de leur maturation avec le contenu en lignines, la composition en lignines, la structure des lignines, ou avec tout autre composant pariétal étant donné les changements dans les constituants chimiques et la structure physique associés à la maturation de la plante.
Par conséquent, une des voies privilégiées d'amélioration des qualités du maïs d'ensilage concerne la modification de la composition et de la teneur en lignine des plantes fourragères. En effet, une faible diminution de la teneur en lignine conduit à une forte amélioration de la digestibilité. Une expérimentation menée par Emile (1995) démontre qu'une variété plus digeste permet d'augmenter le niveau de production de lait de plus d'un kilogramme et la prise de poids des vaches de 22 kg par rapport à une variété moins digeste. Ainsi, plus la variété est digeste plus la production laitière est élevée et moins la perte d'état de chair est importante.
Les maïs de type Brown midrib, en particulier les maïs bm3, possèdent une digestibilité fortement augmentée par rapport aux maïs conventionnels et améliorent significativement la production laitière. Ces maïs bm3 diffèrent des maïs « normaux » par une teneur fortement réduite en lignine (jusqu'à 40%) et des rapports unités S (alcool sinapylique)/unités G (alcool coniférylique) modifiés. Cependant, les inconvénients des maïs bm3 tels qu'un rendement en champ moindre, une susceptibilité à la verse accrue, un manque de croissance et de vigueur en début de végétation et un retard à la floraison en empêchent l'exploitation (Barrière et Argillier (1993)).
La lignine est un composé majeur de la paroi des cellules du sclérenchyme et du xylème des plantes vasculaires. Elle joue un rôle important dans les fonctions conductrices du xylème en réduisant la perméabilité hydrique des parois cellulaires. Dans les tissus lignifiés, elle intervient comme agent de liaison intercelluiaire. Elle est responsable de la rigidité des parois cellulaires et du port dressé des végétaux et participe à la résistance des plantes aux agressions mécaniques (vent, blessure...) ou infection par des pathogènes, tolérance aux stress thermique et hydrique.
En général, il est considéré que la lignine est un polymère insoluble de 3 monomères d'alcools ou monolignols : l'alcool p- coumarylique (unités H), l'alcool coniférylique (unités G) et l'alcool sinapylique (unités S). Chaque type de précurseurs peut former une variété de liaisons avec d'autres précurseurs et ainsi constituer la lignine. D'autres liaisons peuvent également s'établir avec d'autres composés pariétaux (polysaccharides et protéines) pour former un réseau complexe tridimensionnel. Le contenu et la composition des lignines varient entre les grands groupes de végétaux supérieurs et entre espèces. Les deux classes majeures sont les lignines de gymnospermes qui contiennent principalement des unités G et une petite proportion d'unités H, et les lignines d'angiospermes qui contiennent à la fois des unités S, G et en faible proportion des unités H (Whetten et al., 1998). Les lignines de monocotylédones, et, plus particulièrement des céréales sont les plus complexes. Elles sont constituées des 3 unités H, G, S auxquelles se rajoutent en proportion importante des acides hydroxycinnamiques (acide férulique et coumarique) liés par des liaisons éthers ou esters. Cette hétérogénéité structurale se rencontre également au sein d'un même végétal, en fonction de l'organe considéré mais également en fonction du stade de développement et de la localisation dans la paroi (Lewis et Yamamoto, 1990)).
La voie dé biosynthèse des lignines est représentée sur la Figure 1. Bien que la voie de biosynthèse des lignines soit beaucoup étudiée, de nombreuses étapes sont encore incomprises notamment celles impliquées dans la méthoxylation.
L'hypothèse actuelle de la voie de biosynthèse des monolignols considère que le réseau métabolique aboutissant à la formation des unités S et G fait intervenir des réactions successives d'hydroxylation et de O-méthylation. La voie de biosynthèse des phénylpropanoides débute par la conversion de la phénylalanine en acide cinnamique sous l'action de la Phénylalanine-Ammonia-Lyase (PAL). Le produit de l'activité PAL sur la phénylalanine est l'acide trans-cinnamique qui est un substrat de la cinnamate-4-hydroxylase (C4H), une P450-hydroxylase. La C4H hydroxyle la position 4 du cinnamate pour produire l'acide p-coumarique. Chez les monocotylédones, l'acide p-coumarique résulte de l'action de la Tyrosine-Ammonia-Lyase (TAL) sur la tyrosine.
L'ensemble des enzymes intervenant ultérieurement dans le réseau métabolique ont fait l'objet de revues (Boudet et al., 1995; Dixon ét al., 2001 ; Whetten et al., 1998, Li et al., 2000), elles incluent : - des O-méthyltransférases ayant des désignations distinctes selon les espèces : l'acide caféique 3-O-méthyltransférase (COMT) également désignée acide caféique O-méthyltransférase (COMT), O-méthyltransférase COMT ou encore de manière préférentielle dans le texte methyltransferase COMT ou la 5- hydroxyconiféryl aldéhyde O-méthyltransférase (AldOMT) et la
Caféoyl coenzyme A 3-O-méthyltransférase (CCOAMT), des hydroxycinnamate coenzyme A ligases (4CL), une férulate 5-hydroxylase (F5H) à cytochrome P450, la p-coumarate-hydroxylase (C3H), - et plusieurs isoformes de Cinnamoyl Co A réductase (CCR) et de
Cinnamyl alcool déhydrogénase (CAD). L'étape terminale de polymérisation des monolignols fait vraisemblablement intervenir des enzymes pariétales, peroxydases et/ou laccases. Les enzymes catalysant les étapes de méthylation sont les O- méthyltransférases. Les O-méthyltransférases (S-adénoxyl-L-méthionine O-méthyltransférases, EC 2.1.1.6) jouent un rôle important dans la biosynthèse des monolignols. Il est actuellement admis que la COMT interviendrait préférentiellement dans la synthèse des unités S et la CCoAOMT dans la synthèse des unités G.
La COMT permettrait la méthylation des formes libres d'acides hydroxycinnamiques : l'acide caféique et l'acide 5-hydroxyférulique en introduisant respectivement un ou deux groupes méthoxy dans les monomères de lignines (Davin and Lewis, 1992). Récemment, il a été montré chez le peuplier que la COMT est en fait une 5-hydroxyconiféryl aldéhyde O-méthyltransférase (AldOMT). En effet, le 5- hydroxyconiféraldéhyde est le substrat préférentiel de l'AldOMT. Ainsi, pour Li et al. (2000), il existe chez les angiospermes ligneux, deux voies distinctes d'hydroxylation/méthylation conduisant respectivement aux unités S et G : la CCoA3H (Coumaroyl CoA 3-hydroxylase)/CCoAOMT, avec la 4CL, la CCR et la CAD sont associés à la synthèse des unités G, et la CAIdδH (Coniféraldéhyde 5-hydroxylase)/AldOMT se connecte à partir du conyféryl aldéhyde pour la biosynthèse des unités S. L'implication des COMT dans la biosynthèse des unités S de lignine est supportée par une forte réduction en unité S de la lignine mais pas des unités G dans les plantes transgéniques sous-exprimant la COMT comme le tabac (Atanassova et al., 1995), la luzerne (Guo et al., 2001) et le peuplier (Van Doorselaere et al., 1995).
Les unités S et G sont donc des composants importants des lignines et par conséquent interviennent dans la digestibilité de la paroi des cellules végétales. Cependant l'impact sur la digestibilité de l'augmentation ou de la diminution des unités S et/ou G varie selon les études. Ainsi, les études sur le mutant bm3 ont montré que la digestibilité accrue des parois est associée à une altération forte de la structure des lignines : rapport S/G faible avec incorporation substantielle d'unités 5- hydroxyguaiacyl (5-OH G) (Lapierre et al., 1988) et une teneur en lignine plus faible. Si les résultats de corrélation entre la digestibilité et la teneur en lignine de la plante sont toujours négatifs, les résultats de corrélations entre le rapport S/G et la teneur en lignine et la digestibilité ne sont pas toujours identiques. Ainsi, pour Zhong et al. (1998) et Méchin et al. (2000), le rapport S/G est corrélé positivement avec la digestibilité. Autrement dit, les résultats respectifs de ces auteurs sur le tabac et le maïs montrent que plus le rapport S/G augmente, plus la digestibilité est importante. Ainsi, suivant l'espèce et les études, il apparaît qu'une variation du rapport S/G, associée ou non à une teneur en lignine réduite peut être accompagnée d'une stabilité, d'une réduction ou d'une augmentation de la digestibilité.
Ces résultats contradictoires démontrent qu'il n'est pas évident de prévoir les conséquences de la modification de l'activité des O- méthyltransférases (COMT, AldOMT) sur le rapport S/G et la teneur en lignine et par conséquent sur la digestibilité de la plante. L'invention décrite dans ce brevet permet d'obtenir des plants de maïs offrant une meilleure digestibilité en modifiant les activités O-méthyltransférases.
En particulier, l'homme du métier n'est pas en mesure de transposer les résultats expérimentaux hautement contradictoires décrits dans l'état de la technique relatifs aux conséquences de la surexpression ou au contraire de la sous-expression d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse de la lignine dans une espèce végétale donnée, y compris le maïs, sur la teneur et la composition de la lignine, en particulier sur le rapport entre les unités S et les unités G.
De plus, l'homme du métier, à la lumière des résultats expérimentaux décrits dans l'état de lé technique, ne pouvait prévoir, dans le cas spécifique du maïs, si une augmentation ou une réduction du rapport unités S/unités G de la lignine et/ou la teneur en lignine influeraient positivement ou négativement sur les caractéristiques de digestibilité de cette espèce végétale ou des produits de transformation correspondants, par exemple le fourrage produit à partir du maïs.
SOMMAIRE DE L'INVENTION II a été montré selon l'invention que, de manière surprenante, l'induction de la modulation de la synthèse d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine du maïs, l'acide caféique 3-0 Methyltransferase, aussi désignée COMT, appelée dans la suite du présent texte methyltransferase COMT, provoquait une modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine et/ou de la teneur en lignine, par rapport à ce qui est retrouvé dans le maïs sauvage, et que la modification du rapport unités S/unités G et/ou de la teneur en lignine conférait au plant de maïs, ainsi qu'à ses produits de transformation, des caractéristiques améliorées de digestibilité. Par « modulation » de la synthèse d'une enzyme, on entend selon l'invention une diminution, ou au contraire une augmentation de la synthèse de ladite enzyme.
Par « modification » du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine, on entend une diminution ou une augmentation de ce rapport. On entend par « maïs sauvage », un maïs possédant des caractéristiques de digestibilité, un rapport entre les unités S et les unités G de la lignine, ainsi qu'une teneur en lignine dans la plante similaires, voire identiques, à celles de la lignée de maïs désignée « WT » dans les exemples, qui est une lignée disponible auprès de l'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA) sous la dénomination I2.
Selon l'invention, les caractéristiques améliorées de digestibilité du maïs, ou de ces produits dérivés, sont obtenues par la modulation de la synthèse de la methyltransferase COMT, laquelle modulation de synthèse induit :
(i) la modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine ; et/ou
(ii) la modification de la teneur en lignine dans le plant de maïs, et les produits qui en sont dérivés. Conformément à l'invention, la modulation de la synthèse de la methyltransferase COMT peut être complétée par la modulation simultanée de la synthèse d'une seconde enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine, de préférence une seconde enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine chez le maïs telle que décrite dans l'art antérieur et notamment illustrée dans le schéma de la
Figure 1.
La diminution de la synthèse de la methyltransferase COMT peut être obtenue par la transformation de plants de maïs, notamment de plants de maïs sauvages, par un polynucleotide antisens inhibant la traduction de l'ARN messager correspondant. Cette diminution peut également être obtenue par un phénomène de co-suppression, comme décrit par exemple par Napoli et al. (1990) ou Carvalho Niebel et al. (1995).
Inversement, l'augmentation de la synthèse de la methyltransferase COMT peut être obtenue par transformation de plants de maïs, notamment de plants de maïs sauvages, par un polynucleotide codant cette enzyme.
Quel que soit le polynucleotide utilisé, il comprend de préférence au moins une séquence de régulation permettant son expression dans une cellule de maïs. Selon l'invention, une réduction du rapport unités S/unités G est obtenue au moins par inhibition spécifique de l'activité COMT. Elle peut être complétée par l'augmentation ou la réduction de la synthèse d'autres enzymes impliquées dans la biosyrithèse des unités S et des unités G de la lignine du maïs, augmentation ou réduction d'activité obtenue principalement par surexpression ou au contraire inhibition de l'expression des gènes codant ces autres enzymes.
Une inhibition de l'activité de la COMT du maïs est principalement obtenue selon l'invention par l'utilisation d'oligonucléotides inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du gène codant cette enzyme.
L'acide nucléique codant la COMT du maïs est référencé comme la séquence SEQ ID N° 1 du listage de séquences.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un polynucleotide modulant la synthèse de la methyltransferase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante. Elle est également relative à un procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucleotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs. De préférence, le polynucleotide antisens est le polynucleotide de séquence SEQ ID N°2.
Préférentiellement, la polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs est le polynucleotide de séquence SEQ ID N°1.
Le polynucleotide antisens ou le polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs sont préférentiellement insérés dans une cassette d'expression permettant leur expression fonctionnelle chez le maïs. Une telle cassette d'expression est avantageusement introduite dans un vecteur d'expression adapté pour transformer des cellules de maïs. Selon le procédé de l'invention, on peut utiliser un second polynucleotide modulant l'activité d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des unités S et des unités G de la lignine, autre que la methyltransferase COMT.
L'invention est également relative à un plant de maïs transformé selon le procédé ci-dessus, qui possède des caractéristiques de digestibilité améliorées, ainsi qu'à toute partie du plant de maïs transformé, notamment racine, graine, feuille, fleur et tige.
Elle concerne aussi les produits de transformation obtenus à partir des plants de maïs transformés définis ci-dessus, notamment le fourrage et la lignine purifiée.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Voie de biosynthèse des monomères de lignines (Guo et al.,
2001). Le "réseau métabolique" décrit dans le schéma comprend les résultats de récentes études suggérant les spécificités inattendues de substrat des enzymes F5H et COMT (Humphreys et al. 1999 ; Osakabe et al. 1999 ; Li et al. 2000). La voie encadrée (guaiacyl [G] unit) représente les réactions principales aboutissant aux lignines G. La voie encadrée (syringyl [S] unit) représente la voie de biosynthèse préférée pour les lignines S, 4CL, 4-coumarate coenzyme A ligase; CAD, cinnamyl alcool déhydrogénase; CCR, cinnamyl coenzyme A réductase.
Figure 2 : Principe de la méthode employée pour évaluer l'impact de la transformation visant l'activité COMT sur la structure des lignines. Les unités H (R1=R2=H), G (Rt≈OCHs, R2=H), S (Ri≈Rz≈OCHs) et 5-OH G (R-ι= OCH3, R2=OH) engagées dans des liaisons -0-4 génèrent des monomères thioéthylés spécifiques. Après silylation (BSTFA), ces monomères sont analysés en CPG-SM (impact électronique). Les chromatogrammes reconstruits sur les ions benzyliques propres à chacun d'eux permettent d'évaluer de manière univoque et sans interférence des autres constituants la fréquence relative des unités ayant généré ces monomères.
Figure 3 : Profils chromatographiques en CPG-SM des lignées témoin et sous-exprimant la COMT : profils reconstruits sur les ions spécifiques de chaque type de monomères.
Figure 4 : Analyse HPLC des produits issus de l'hydrolyse alcaline douce (NaOH 1 M, 2.5h, 40°C) d'échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits. Acide p-coumarique E et Z : pics 1 et 2. Acide férulique E et Z: pics 3 et 4. Etalon (éthylvanilline): pic 5. Ces profils illustrent que les teneurs en PC (acide p-coumarique) diminuent dans les deux lignées transgéniques ASCOMT1.2 et ASCOMT3.2 par rapport au témoin WT.
Figure 5 : Représentation schématique des constructions des plasmides décrits à l'exemple 1.
Figure 6 : La Figure 6A représente une analyse Northern blot de la lignée de maïs C-OMT 225 au stade 20 jours.
La Figure 6B représente une analyse Southern blot comparative entre la lignée antisens 225 et la lignée , en utilisant quatre enzymes de restriction distinctes, respectivement : AcoRV, Kpnl, EcoRI et Sacl.
Figure 7 : Criblage d'une population de plants de maïs transgéniques, transformés respectivement avec les plasmides pProsper+pBar, pProsper-Bar, pJim+pBar2 et pALIX+pBar2.
L'axe des ordonnées représente l'activité COMT retrouvée dans les plants de maïs analysés, exprimée en cpm/mg de protéine.
Les barres d'histogramme représentent chacune un plant transgénique testé.
Figure 8 : faisceaux cribro-vasculaires de feuilles adultes de maïs témoins (I2) et antisens C-OMT (225) colorés selon la méthode de Maϋle. On voit que la coloration est moins intense dans le sclérenchyme et dans le xylème de 225 ; cette observation suggère une diminution des unités S dans les lignines de la lignée 225.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il a été montré selon l'invention que, de manière surprenante, l'induction de la modulation de la synthèse d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine du maïs, la methyltransferase COMT, aussi désignée COMT, provoquait une modification du rapport unités S/unités G dans la composition de la lignine et/ou de la teneur en lignine, par rapport à celui retrouvé dans le maïs sauvage, et que la modification du rapport unités S/unités G et/ou de la teneur en lignine conférait au plant de maïs, ainsi qu'à ses produits de transformation, des caractéristiques améliorées de digestibilité. Par « caractéristiques améliorées de digestibilité », d'un plant de maïs selon l'invention, on entend que, par rapport à une variété de plant de maïs sauvage, par exemple la variété de maïs I2 précitée, le plant de maïs obtenu selon l'invention possède une valeur d'indice de digestibilité « dndf » plus élevée que la valeur d'indice de digestibilité calculée à partir d'un plant de maïs de la variété sauvage.
Selon l'invention, la valeur de l'indice de digestibilité « dndf » est calculée à partir de « ndf (neutral détergent fiber) » dont la méthode d'obtention est décrite par Van Soest (1967) et du « dms (solubilité enzymatique Aufrère) » dont la méthode d'obtention est décrite par Aufrère (1983), selon la formule dmdf = 100*[dms - (100 - ndf)]/ndf donnée par Struik (1985). Le matériel utilisé pour l'établissement du ndf est une poudre lyophilisée de plantes entières récoltées au stade floraison.
Préférentiellement, un plant de maïs obtenu selon l'invention possède des caractéristiques de digestibilité améliorées si la valeur de l'indice « dndf » est d'au moins 80.
Préférentiellement, un plant de maïs selon l'invention possède une teneur en lignine Klason, mesurée à partir des tiges et des feuilles, qui est inférieure à 8,5, de préférence inférieure à 8, à 7,5, à ,7,0, à 6,9 ou à 6,8, et de préférence inférieure à 6,7. Un plant de maïs préféré selon l'invention possède une teneur en lignine Klason comprise entre 6,1 et 6,6.
Pour mesurer la teneur en lignine Klason, l'homme du métier peut avantageusement se référer à la technique décrite a l'exemple 9. II est montré pour la première fois selon l'invention, de manière surprenante : a) que l'inhibition de l'enzyme methyltransferase COMT de maïs permettait (i) de réduire le rapport unités S/ unités G de la lignine chez cette plante et (ii) de réduire la teneur en lignine chez cette plante ; et b) que la réduction du rapport unités S/unités G de la lignine et/ou de la teneur en lignine chez le maïs permettait l'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, par rapport au maïs sauvage.
Tirant parti de ces résultats inattendus, la demanderesse a mis au point un procédé de transformation de plants de maïs dans lequel les plants de maïs transformés ont un rapport unités S/unités G de la lignine et/ou une teneur en lignine modifiés, par rapport à celui retrouvé dans les plants de maïs sauvages.
Préférentiellement, le rapport unités S /unités G est inférieur au rapport unités S/unités G retrouvés dans un plant de maïs sauvage.
Plus spécifiquement, il est montré selon l'invention que des plants de maïs transformés ayant des caractéristiques de digestibilité améliorées peuvent être obtenus en utilisant un polynucleotide antisens. L'invention a pour objet l'utilisation d'un polynucleotide modulant la synthèse de la methyltransferase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°1 , dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.
Inhibition de la synthèse de la methyltransferase COMT
Selon un premier mode de réalisation, ledit polynucleotide inhibe la synthèse de la methyltransferase COMT de maïs dans la plante, lorsqu'il est introduit par transformation dans les cellules de ladite plante. Ledit polynucleotide antisens consiste en un polynucleotide codant un ARN antisens s'hybridant avec l'ARN messager constituant le produit de transcription du gène codant la methyltransferase COMT du maïs.
L'inhibition de la synthèse de la methyltransferase COMT peut être obtenue :
- (i) soit en transformant les cellules de maïs avec un polynucleotide antisens, tel que défini ci-dessus, placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs, ladite séquence de régulation pouvant comprendre un promoteur constitutif fort et, le cas échéant, aussi des séquences activatrices de la transcription
(séquences « enhancer » fonctionnelles chez le maïs), permettant un haut niveau d'expression du nombre de copies de l'ARNm de l'antisens methyltransferase COMT ;
- (ii) soit en introduisant de manière stable dans les cellules de maïs une pluralité de copies du polynucleotide antisens tel que défini ci- dessus;
- (iii) soit par une combinaison de (i) et de (ii), comme cela est décrit dans les exemples.
L'homme du métier peut synthétiser tout polynucleotide antisens inhibant la synthèse de la methyltransferase COMT à l'aide de ses connaissances générales techniques, à partir d'une séquence nucléotidique codant la COMT, par exemple la séquence SEQ ID N°1.
Pour la synthèse d'un polynucleotide sens ou d'un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction d'un gène chez une plante, l'homme du métier se référera avantageusement à l'article de revue de Matzke et al. (2001 ) ainsi qu'au contenu des articles référencés dans cet article de revue.
Encore plus spécifiquement, pour la construction ou la synthèse d'un polynucleotide sens ou d'un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction d'un gène codant une enzyme impliquée dans la biosynthèse des lignines chez les plantes, notamment la COMT de certaines espèces végétales, l'homme du métier peut se référer avantageusement aux articles de Baucher et al. (1999), de Zhong et al. (2000), de Pinçon ét al. (2001a), de Blee et al. (2001), de Pinçon et al. (2001 b) ou de Lapierre et al. (1999). Le polynucleotide antisens peut aussi consister en l'ADNc obtenu à partir de l'ARNm constituant le produit de transcription du gène codant la methyltransferase COMT.
Il peut aussi consister en un fragment nucléotidique de cet ADNc, de préférence un fragment nucléotidique d'au moins 100 bases consécutives de cet ADNc, cette longueur du fragment nucléotidique étant suffisante pour permettre son hybridation spécifique avec l'ARNm de la methyltransferase COMT du maïs et ainsi empêcher sa traduction en protéine. Selon un premier aspect préféré, le polynucleotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°2.
Selon un second aspect préféré, le polynucleotide antisens consiste en le polynucleotide antisens de séquence SEQ ID N°2.
Augmentation (surproduction) de la methyltransferase COMT
Selon un second mode de réalisation, ledit polynucleotide augmente la synthèse de la methyltransferase COMT dans la plante, lorsqu'il est introduit par transformation dans les cellules de ladite plante. Selon ce second mode de réalisation, on utilise un polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs, qui provoque une production plus élevée de cette enzyme, lorsqu'il est introduit par transformation dans la plante.
La synthèse ou l'isolement d'un polynucleotide codant la methyltransferase COMT du maïs peut être effectué par l'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales en biologie moléculaire, notamment grâce à sa connaissance de la séquence nucléotidique SEQ
ID N°1.
La production plus élevée de la methyltransferase COMT peut être obtenue : - (i) soit en transformant les cellules de maïs avec un polynucleotide codant la methyltransferase COMT placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs, ladite séquence de régulation pouvant comprendre un promoteur constitutif fort et, le cas échéant, aussi des séquences activatrices de la transcription (séquences « enhancer » fonctionnelles chez le maïs), permettant un haut niveau d'expression de la methyltransferase COMT ;
- (ii) soit en introduisant de manière stable dans les cellules de maïs une pluralité de copies du polynucleotide codant la methyltransferase COMT ;
- (iii) soit par une combinaison de (i) et de (ii).
Selon un premier aspect préféré, le polynucleotide codant la methyltransferase COMT comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°1. Selon un second aspect préféré, le polynucleotide codant la methyltransferase COMT consiste en la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
PROCEDES D'OBTENTION DE PLANTS DE MAÏS A CARACTERISTIQUES DE DIGESTIBILITE AMELIOREES.
L'invention a aussi pour objet un procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucleotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs.
Selon un premier mode de réalisation du procédé ci-dessus peut être caractérisé en qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du gène codant pour la methyltransferase COMT de maïs.; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
Selon un premier aspect, la modification de la composition de la lignine des plants de maïs transformés susceptibles d'être obtenus par le procédé ci-dessus consiste à réduire la teneur en unités S par rapport à la teneur en unités G des lignines de maïs, de façon à obtenir un rapport S/G inférieur à celui des plants de maïs sauvages.
Préférentiellement, le rapport S/G est inférieur à 40/60.
Selon un second mode de réalisation du procédé ci-dessus, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ; Préférentiellement, le polynucleotide codant la methyltransferase
COMT de maïs comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé d'obtention de plants de maïs transformés selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) sélectionner les plants de maïs ayant intégré dans leur génome au moins une copie du polynucleotide antisens ou au moins une copie du polynucleotide codant la methyltransferase COMT du maïs.
Cassettes d'expression comprenant un polynucleotide antisens ou un polynucleotide codant la methyltransferase COMT du mais
Avantageusement, le polynucleotide antisens ou le polynucleotide codant la methyltransferase COMT du maïs est intégré dans une cassette d'expression comprenant aussi une séquence nucléotidique régulant l'expression dudit polynucleotide dans les cellules de maïs. Avantageusement, le polynucleotide antisens ou le polynucleotide codant la methyltransferase COMT est intégré dans une cassette d'expression comprenant aussi une séquence nucléotidique à fonction de terminateur de la transcription.
La cassette d'expression définie de manière générale ci-dessus peut aussi être désignée « construction d'ADN » ou « construit d'ADN »dans la présente description.
Selon encore un autre aspect, le polynucleotide antisens ou le polynucleotide codant la methyltransferase COMT, où encore la cassette d'expression dans laquelle est inséré respectivement l'un ou l'autre de ces polynucléotides, est artificiellement inséré dans une cellule hôte de Agrobacterium tumefaciens.
Les constructions d'ADN comprennent également une séquence promotrice de gène et une séquence terminatrice liées de façon opérationnelle à la séquence d'ADN devant être transcrite. Le promoteur du gène est généralement situé à l'extrémité 5' pour permettre l'initiation de la transcription de la séquence d'ADN. Les séquences promotrices sont situées dans les régions 5' non codantes des gènes mais aussi parfois dans les introns (Luehrsen K,. 1991 ) ou dans les régions codantes comme par exemple le promoteur du gène PAL de la tomate (Bloksberg, 1991 ). Lorsque le construit inclut une phase ouverte de lecture en orientation sens, il est nécessaire d'utiliser un ADNc pleine longueur de façon à ce que la protéine puisse être traduite. Lorsque le construit comprend une phase ouverte de lecture en antisens ou une région non codante, il n'est pas indispensable d'utiliser un ADNc pleine longueur, une séquence partielle peut suffire.
Promoteurs
Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment les promoteurs dits constitutifs, les promoteurs dits inductifs ainsi que les promoteurs tissus spécifiques.
Un promoteur constitutif permet une expression forte du transcrit dans l'ensemble des tissus de la plante régénérée et sera actif dans la plupart des conditions environnementales, et dans l'ensemble des étapes de transformations et de différentiations cellulaires. Par exemple, les principaux promoteurs doubles constitutifs sont :
- le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur double constitutif 35S (pd35S) du CaMV, décrit dans l'article de Kay et al., (1987) - le promoteur de l'actine du riz suivi de l'intron actine de riz contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Me Elroy et al. (1991 )
- le promoteur ubiquitine 1 de maïs (Christensen et al., 1996) et d'autres régions initiatrices de la transcription de gènes de plantes variables connues de l'homme du métier. Alternativement, il peut être intéressant d'utiliser une séquence promotrice de transcription inductible capable d'être contrôlée par les conditions environnementales ou le stade de développement comme par exemple les promoteurs phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG- CoA reductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de protéinase (PI), de gènes de la famille PR1 , de la nopaline synthase (nos) ou du gène vspB (US-5.670.349), tous ces promoteurs étant rappelés avec les références des publications correspondantes par le Tableau 3 du brevet US~5.670.349. Une autre catégorie de promoteurs pouvant avantageusement être utilisée pour réaliser le procédé objet de l'invention regroupe les promoteurs tissus spécifiques, en particulier il peut s'agir des promoteurs des gènes de la voie de biosynthèse des lignines ou par exemple le promoteur de l'alcool déshydrogénase qui s'exprime spécifiquement dans les tissus vasculaires.
On peut également citer des promoteurs spécifiques des graines (Datla, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP- 0.255.378), de la glutenine, de l'héliantinine (WO-92/17580), de l'albumine (WO-98/45460), de l'oléosine (WO-98/45461), de IΑTS1 ou de IΑTS3 (WO-99/20775).
Séquences terminatrices
La séquence terminatrice employée dans les constructions objets de l'invention est située à l'extrémité 3' de la séquence à transcrire. Elle peut provenir du même gène que la séquence promotrice ou d'un gène différent.
Parmi les terhninateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer :
-le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit dans l'article de Franck et al., (1980), ou
-le terminateur polyA NOS, qui correspond à la région en 3' non- codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline. Marqueur de sélection
Les constructions comportent également un marqueur de sélection permettant de sélectionner les cellules végétales transformées par ces constructions. Ces marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier, particulièrement ils confèrent une résistance à une ou plusieurs toxines, par exemple une résistance à l'herbicide BASTA®. Par ailleurs, la transformation des cellules végétales par les constructions, objet de l'invention peut être contrôlée par d'autres techniques bien connues de l'art telles que les Southern et Western Blots.
Fabrication d'une cassette d'expression
Les techniques pour lier de manière opérationnelle tous les composants de ces constructions sont bien connues de l'homme de l'art et incluent l'utilisation de sites de clonage synthétiques comprenant un ou plusieurs sites de restrictions endonucléasiques comme décrits par exemple par Maniatis et al. (1989). Les constructions d'ADN de la présente invention peuvent être liées à un vecteur possédant au moins un système de réplication, par exemple avec E. Coli, après chaque manipulation, il est possible de cloner et de séquencer la construction obtenue afin de vérifier l'exactitude de la manipulation.
L'invention concerne les constructions telles que décrites ci- dessus, et comportant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n°1 ou 2 liée de manière fonctionnelle en amont à un promoteur et en aval à un terminateur. De manière tout à fait préférée, la cassette d'expression comprend le promoteur de l'alcool déshydrogénase spécifique du système vasculaire, l'ADNc de la methyltransferase (COMT ou AldOMT) et le terminateur de la Nopaline synthase, comme cela est montré dans l'exemple 1.
Vecteurs d'expression
Les cassettes d'expression ou les constructions d'ADN telles que définies ci-dessus peuvent être incluses dans des vecteurs d'expression utilisables pour transformer une cellule de Agrobacterium tumefaciens ou une cellule hôte de maïs. Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322 (ATCC n°37 017) ou encore les vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, Etats-Unis). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Quiagen), psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI et pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs du type Baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711) dérivée de Spodoptera frugiperda.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants: - vecteur pBIN19 (BEVAN et al.), commercialisé par la Société
CLONTECH (Palo Alto, Californie, USA);
- vecteur pB1 101 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH ;
- vecteur pBI121 (JEFFERSON, 1987), commercialisé par la Société CLONTECH;
- vecteur pEGFP; Yang et al. (1996), commercialisé par la Société CLONTECH;
- vecteur pCAMBIA 1302 (HAJDUKIIEWICZ et al., 1994)
- vecteurs intermédiaires et superbinaires dérivés des vecteurs pSB12 et pSB1 décrits par Japan Tobacco (EP-0.672.752 et Ishida et ai,
1996).
Un premier vecteur tout à fait préféré est le plasmide pAlix représenté à la figure 5, dans lequel a été inséré le polynucleotide antisens de séquence SEQ ID N°2 inhibant la synthèse de la methyltransferase COMT de maïs..
Un second vecteur tout à fait préféré est le plasmide pProsper représenté à la figure 5, dans lequel a été inséré le polynucleotide de séquence SEQ ID N°1 codant la methyltransferase COMT de mais. Transformation des plants de maïs
Une augmentation de la synthèse des unités S et/ou G de la lignine et/ou de la teneur en lignine dans la plante peut être obtenue en intégrant dans la phase ouverte de lecture une construction d'ADN en orientation sens, en particulier la séquence SEQ ID n°1. La transformation d'une plante cible avec une telle construction aboutit à une augmentation du nombre de copies du transcrit et donc à une augmentation de la quantité d'enzyme. Par exemple, une augmentation de la synthèse d'unités S peut être obtenue en intégrant dans le génome de la plante cible la séquence sens de la O methyltransferase codée par la SEQ ID n°1.
Une réduction de la synthèse d'unités S et/ou G de la lignine et/ou de la teneur en lignine dans la plante peut être obtenue en introduisant dans la phase de lecture ouverte une construction d'ADN en orientation antisens, en particulier toute ou partie de la séquence SEQ ID n°2. L'ARN transcrit est complémentaire de la séquence endogène d'ARNm ce qui aura pour conséquence de diminuer le nombre de copies du transcrit et donc de diminuer la quantité d'enzyme. Par exemple, une diminution de la synthèse d'unités S peut être obtenue en intégrant dans le génome de la plante cible la séquence antisens de la methyltransferase COMT codée par la SEQ ID n°2. Les constructions d'ADN peuvent également comporter une séquence nucléotidique comprenant une région non-codante du gène de la methyltransferase COMT. Les exemples de régions non-codantes pouvant être utilisées dans de telles constructions incluent les introns et les séquences 5' ou 3' non-codantes. La transformation de plantes cibles avec de telles constructions d'ADN peut aboutir à une réduction de la synthèse d'unités S et/ou G de lignine et/ou de la teneur en lignine par le processus de co- suppression, comme l'ont décrit par exemple Napoli et al. (1990) ou Carvalho Niebel et al. (1995).
La régulation de la synthèse d'unités S et/ou G de lignine et/ou de la teneur en lignine peut aussi être réalisée en insérant lesdites séquences en tout ou partie (par exemple ADN ou ARN) dans des constructions de ribozyme (Haseloff et al., 1988). Utilisation d'un second polynucleotide modulant la synthèse d'une enzyme impliquée dans la biosynthèse de la lignine, autre que la methyltransferase COMT
Selon encore un autre aspect du procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, tel que défini ci-dessus, l'effet du polynucleotide antisens ou du polynucleotide codant la methyltransferase COMT du maïs peut être complété par l'insertion dans le génome de la même plante de maïs d'un second polynucleotide dérivé du gène codant une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse de la lignine, autre que la methyltransferase COMT.
Ainsi, le procédé ci-dessus peut aussi être caractérisé en ce qu'à l'étape a), la cellule hôte de maïs est aussi transformée avec au moins un second polynucleotide, modulant spécifiquement l'expression d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs.
Selon cet aspect particulier, ledit procédé est caractérisé en ce que le second polynucleotide est choisi parmi : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs.
L'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs est choisie parmi :(a) l'enzyme CAD du maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès Y13733, (b) l 'enzyme CCR1 de maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès X98083 et (c) l'enzyme F5H de Arabidopsis thaliana dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès U38416.
L'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs peut être aussi choisie parmi (d) l'enzyme CCoAOMTI du maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès AJ242980 et (e) l'enzyme CCoAOMT2 du maïs dont la séquence est référencée dans la base de données GenBank sous le n° d'accès AJ242981.
Une fois obtenues, les constructions servent à transformer les cellules végétales. Avantageusement, la transformation des cellules végétales peut être réalisée par transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes végétaux, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca 2+) (Schocher ef al., 1986).
La transformation des cellules végétales peut avantageusement être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de Fromm et al. (1985).
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par utilisation d'un canon à particules permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi les séquences à l'intérieur du noyau cellulaire (Fromm et al. 1990, Finer et al., 1992).
Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire (Neuhaus et al., 1987). Une des méthodes de transformation de cellules végétales pouvant être utilisée dans le cadre de l'invention est l'infection des cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur contenant la séquence d'intérêt. Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacte um tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'An et al. (1986), ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Guerche et al. (1987).
De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobactenum tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al., 1994). Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN- T mais contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium. Selon un mode préféré, la méthode décrite par Ishida et al. (1996) peut être appliquée pour la transformation des monocotylédones, en particulier le maïs.
Selon un autre protocole, la transformation est réalisée selon la méthode décrite par Finer et al. (1992) utilisant le canon à particules de tungstène ou d'or.
Selon encore un autre aspect, le procédé d'obtention de plants de maïs transformé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape b) ou à l'étape c) avec un second plant de maïs ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène ou les transgènes.
Selon encore un autre aspect, le procédé d'obtention de plants de maïs transformés selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'un plant de maïs transformé obtenu à l'étape c) avec un second plant de maïs ; g) sélection des plantes de maïs issues du croisement de l'étape f) et ayant conservé le transgène. Un des modes de réalisation du procédé objet de l'invention concerne l'obtention de plants de maïs transgéniques à partir de cellules végétales transformées avec une construction comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n°1 ou SEQ ID n°2.
Cellules hôtes transformées par un polynucleotide antisens ou par un polynucleotide codant la methyltransferase COMT et plants de mais transformés obtenus à partir des cellules hôtes transformées.
L'invention a aussi pour objet une cellule hôte de maïs ou une cellule de Agrobacterium tumefaciens transformée avec : a) soit un polynucleotide antisens inhibant la synthèse de la methyltransferase COMT dans une cellule de maïs ; b) soit un polynucleotide codant la methyltransferase COMT, ledit polynucleotide (a) ou ledit polynucleotide (b) étant préférentiellement placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle dans une cellule de maïs, par exemple dans une cassette d'expression ou encore dans un vecteur d'expression tels définis précédemment.
La présente invention concerne les cellules de plantes transformées ainsi obtenues. En particulier, les cellules de maïs ayant intégré de manière stable dans leur génome les constructions comprenant toute ou partie des séquences SEQ ID n°1 ou n°2.
Les cellules transformées par les constructions objets de la présente invention sont sélectionnées au moyen du marqueur de sélection par exemple la résistance au BASTA®. Les cellules transgéniques sont ensuite cultivées sur un milieu approprié pour régénérer des plantes entières grâce aux méthodes bien connues de l'homme de métier. Dans le cas des protoplastes, la paroi cellulaire peut se reformer sous l'effet de conditions osmotiques appropriées. Dans le cas de graines ou d'embryons, un milieu favorable à la germination ou à l'initiation de cals est employé. Pour les explants, le milieu employé doit permettre la régénération.
Le principe de régénération in vitro de cellules végétales de maïs est bien connu de l'homme de métier. Les plantes sont régénérées à partir de cals obtenus après culture de cellules d'anthères, de grains de pollen, d'embryons ou de protoplastes. Les cellules sont cultivées sur des milieux nutritifs géloses adaptés à chaque type cellulaire en conditions stériles dans des boîtes de Pétri ou des tubes de cultures en chambre climatique dans des conditions environnementales favorables (température et luminosité adaptées). Après repiquage, les vitroplants sont transplantés en serre.
En particulier, selon un des aspects de l'invention, les plants de maïs offrant une meilleure digestibilité et dont la teneur en unités S et/ou G est modifiée, notamment possédant un rapport S/G inférieur à celui des plantes dont le rapport n'est pas modifié peuvent être obtenus après hybridation avec un individu dont l'activité de la methyltransferase COMT est modifiée par les principes de sélection variétale bien connus de l'homme du métier.
L'homme du métier peut également employer les méthodes de multiplication végétative à partir des plants de maïs dont l'activité methyltransferase COMT est modifiée, en particulier afin de modifier le rapport en unités S/unités G et/ou la teneur en lignine. Ces méthodes peuvent avantageusement comporter certaines étapes in vitro. Ce peut être des étapes de régénération de cellules possédant une activité methyltransferase COMT modifiée. Ce peut être des méthodes de culture tissulaire, de micro-bouturage, de culture de méristèmes, de culture d'embryons, de plants de maïs possédant une activité methyltransferase COMT modifiée. Ce peut être des méthodes de régénération de protoplastes issus de plants de maïs possédant une activité methyltransferase COMT modifiée ou issus de fusion avec des protoplastes issus de plants de maïs possédant une activité methyltransferase COMT modifiée.
L'invention a aussi pour objet un plant de maïs transformé, susceptible d'être obtenu par le procédé tel que défini ci-dessus, qui est caractérisé par des caractéristiques de digestibilité. améliorées.
Selon une première caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs transformé conformément à l'invention possède des caractéristiques de digestibilité améliorées et une valeur de l'indice « dndf » d'au moins 80. Selon une seconde caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs selon l'invention possède une teneur en lignine Klason, mesurée à partir des tiges et des feuilles, qui est inférieure à 8,5, de préférence inférieure à 8, à 7,5, à ,7,0, à 6,9 ou à 6,8, et de préférence inférieure à 6,7. Un plant de maïs préféré selon l'invention possède une teneur en lignine Klason comprise entre 6,1 et 6,6.
Selon une troisième caractéristique pouvant le définir, un plant de maïs transformé selon l'invention possède un rapport S/G de la lignine inférieur à 40/60. L'invention est également relative à une partie d'un plant de maïs transformé tel que défini ci-dessus, par exemple une racine, une graine, une feuille, une tige ou une fleur.
Elle a également trait à des cellules de maïs isolées obtenues à partir d'un plant de maïs transformé tel que défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi un vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucleotide choisi parmi : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant la methyltransferase COMT ; ledit polynucleotide étant placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs.
La présente invention a aussi pour objet une construction d'ADN comprenant un polynucleotide sens ou un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement la transcription ou la traduction du gène COMT de séquence SEQ ID N°1, placé sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez le maïs.
Elle concerne également une construction d'ADN comprenant un polynucleotide codant la methyltransferase COMT, placée sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez le maïs pour augmenter l'expression de ladite enzyme.
L'invention est également relative à un produit de transformation obtenu à partir d'un plant de maïs transformé ou d'une partie d'un plant de maïs transformé, tels que définis ci-dessus. Un tel produit de transformation est caractérisé notamment en ce que la lignine qu'il contient présente un rapport modifié entre les unités S et les unités G. Préférentiellement, le rapport S/G est inférieur à 40/60. Ledit produit de transformation inclut les aliments pour le bétail, obtenus à partir des plants de maïs dont les teneurs en unités S ou en unités G sont modifiées et/ou dont la teneur en lignine est modifiée.
L'invention a aussi pour objet une lignine purifiée à partir d'un plant de maïs transformé ou d'une partie de plant de maïs tels que définis ci- dessus, caractérisée en ce qu'elle présente notamment un rapport entre les unités S et les unités G qui est modifié, par rapport au rapport S/G retrouvé dans la lignine de plants de maïs sauvages. Préférentiellement la lignine purifiée ci-dessus est caractérisée en ce que le rapport S/G est inférieur à 40/60.
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitées, aux exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Construction des vecteurs de transformation :
Plusieurs vecteurs ont été construits afin d'obtenir le vecteur de transformation.
- Plasmide pProsper [Figure 5]
Un fragment Pstl-Hindlll de 0.26 Kpb correspondant au terminateur du gène de la nopaline synthase (T-Nos) est sous-cloné dans pUC18 (Yannisch-Perron C. et al., 1985) entre les sites PstI et Hindlll, donnant ainsi le vecteur pUC18-Nos. Le plasmide pMC1 (Collazo P. et ai, 1992), correspondant à l'ADNc de la C-OMT (1.4 kb) inséré au site pstl de pUC18. Une amplification PCR est réalisée sur ce plasmide avec les oligonucléotides TOM22 (5'-CTGCTGGAGGTGCTGCAGAAG-3' - SEQ ID N°3) et TOM23 (5'-CTCCTTGCCCCCGGGGTTGTG-3 - SEQ ID N°4'), permettant d'introduire respectivement les sites PstI et Smal, en 5' et en 3' d'un fragment de 0.85 Kpb compris entre les positions 0.17 et 1.04 Kpb de l'ADNc. Ce fragment est ensuite sous-cloné dans le vecteur pGemT (Promega), et le plasmide obtenu est digéré par PstI et Smal. Le fragment libéré est sous clone dans pUC18-Nos aux sites PstI et Smal, générant ainsi le plasmide pTMO-Nos.
Le plasmide pBARGUS (Fromm et a/., 1990) contient une cassette promoteur CaMV35S-intron Adhl-BAR-Tnos ainsi qu'une cassette promoteur AdhI-Intron AdhI-GUS-Tnos. Cette dernière est libérée par une digestion EcoRI et Hindlll. Dans un deuxième temps, une digestion partielle EcoRI / Pvull du même fragment permet de libérer un fragment de 1.75 Kpb correspondant au promoteur Adhl couplé à l'intron Adhl. Ce fragment est alors sous-cloné dans pTMO-Nos entre EcoRI et Smal. Le plasmide obtenu est le pProsper. - Plasmide pAlix [Figure 5]
Le plasmide PMC1 est digéré par Hindlll et Xbal pour libérer l'ADNc pleine longueur (1.4 Kpb) de la C-OMT. Le plasmide pActine-BAR (Wu, (Cornell University, New York) est constitué du plasmide psP72 contenant une cassette promoteur actine - Intron actine - BAR - Tnos. Ce plasmide est digéré par Hindlll et Xbal pour éliminer le fragment BAR, puis le fragment Hindlll-Xbal de 1.4 Kpb de la C-OMT est sous-cloné entre ces deux sites, donnant ainsi le plasmide pAlix.
- Plasmide pBar2 [Figure 5]
Le plasmide pBARGUS est digéré par Hindlll, pour libérer la cassette promoteur CaMV35S - Intron Adhl - BAR - Tnos de 2.13 Kpb. La cassette ainsi libérée est sous-clonée dans pUC18 au site Hindlll, pour donner le plasmide pBar2.
- Plasmide pBar [Figure 5]
La construction du plasmide pBar est décrite par Peter Eckes (Biology Research Center H 872 N, Hoechst AG 6230 Frankfurt 80 / EP- 0.275.957).
Exemple 2 : Transformation par Agrobacterium tumefaciens
La technique de transformation décrite par Ishida et al. (1996) est utilisée à partir d'embryons immatures de 10 jours après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la référence citée.
La transformation débute avec une phase de co-culture où les embryons immatures des plantes de maïs sont mis en contact pendant au moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T contenant le gène d'intérêt et/ou le marqueur de sélection dérivé des plasmides décrits dans les exemples précédents, et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les gènes virB et virG du plasmide pTiBo542 présent dans la souche supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette recombinaison homologue.
Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une première sélection est effectuée sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/l et de la céfotaxime à 250 mg/l (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium tumefaciens). Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25°C. La deuxième étape de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés sur milieu LSD5, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/l) en présence de céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals de type I (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et à 25°C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals de type I qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence de phosphinotricine à 5 mg/l et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22°C et sous lumière continue.
Les plantules régénérées sont transférées sur milieu RM + G2 contenant 100mg/l d'Augmentin pendant 2 semaines à 22°C et sous illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
Exemple 3 : Transformation par bombardement
Des cals du génotype I2, âgés de 2 mois, obtenus après la mise en culture d'embryons immatures sur un milieu de callogénèse sont utilisés pour la transformation. Un traitement plasmolysant permet de réduire le volume de la vacuole et limite ainsi les éclatements cellulaires lors du tir (prétraitement de 4 heures et un post-traitement de 16 heures sur un milieu Sorbitol 0.2M et Mannitol 0.2M).
Le matériel végétal est réparti de façon homogène sur l'ensemble de chacune des boîtes.
15 mg de microbilles de tungstène stériles sont mélangées dans 150μl d'eau milliQ stérile.
Pour 5 tirs, le mélange suivant est préparé :
25μl de microbilles de tungstène,
2,5 μl d'ADN du plasmide portant le gène d'intérêt (à1μg/μl),
2,5 μl d'ADN du plasmide portant le gène de sélection (à 1 μg/μl), - 25 μl de CaCI2 à 2,5M,
10 μl de spermidine à 0,1 M, Ce mélange est laissé à décanter dans la glace pendant au moins 5 minutes.
Cinq boîtes de Pétri contenant le matériel à bombarder sont placées sur des boîtes Agar à 15g/L.
50μl de surnageant du tube décanté sont éliminés et le mélange restant est bien vortéxé, puis 2 μl de celui-ci est déposé sur la grille de la seringue stérile, qui est vissée sur le support dans le canon.
Un filtre de gaze stérile est placé sur la boîte de pétri qui est disposée à 19 cm dans l'enceinte du canon. Le vide est poussé à l'intérieur de l'enceinte à la pression de 25 mbars
Le tir est déclenché. La pression de l'hélium dans le canon est de 8 bars.
Le matériel végétal bombardé est remis sur sa boîte de pétri d'origine (Mannitol/Sorbitol). Les boîtes sont placées à 26°C et à l'obscurité pendant 16 heures pour un traitement plasmolysant post-bombardement (mannitol/sorbitol).
La pression de sélection est appliquée 16 heures après le tir et est maintenue à la même concentration de l'agent sélectif (bialaphos à 5mg/L) pendant toutes les étapes de régénération. Les plantules sont ensuite repiquées dans du terreau (petits pots) pendant 1 semaine puis transférées en pots de 20 litres (mélange tourbe-pouzzolane) dans la serre transgénique ou en chambre climatisée (Température 24°C jour/ 20°C nuit; photopériode 16h jour/ 8h nuit, hygrométrie 80%). Les plantes sont autofécondées ou croisées.
Exemple 4 : Analyse des ARNs par Northern Blot et de l'ADN qénomique par Southern Blot
A. Matériels et Méthodes
Les ARN sont isolés par la solution Extract-all (Eurobio), selon le protocole du fournisseur. Une précipitation supplémentaire avec 0.2 M de NaCI avec 2 volumes d'éthanol absolu est effectuée. 10μg d'ARN sont séparés sur gels au formaldehyde (Sambrook et a/.,1989). L'ADN génomique total est extrait à partir de 1g de feuilles par la méthode décrite dans Dellaporta et al. (1983). Après une étape de purification au phénol-chloroforme, 10μg d'ADN sont digérés avec 40 unités d'enzyme de restriction (Promega), et séparés sur gel TAE d'agarose à 1% (m/v). Les ARNs ou les ADNs sont transférés sur membranes de nylon (Hybond-N+, Amersham), et hybrides avec des sondes ADN marquées au 32P-dCTP par le kit " prime-a-gene labelling system " de Promega. Le signal d'hybridation est déterminé en mettant en contact les membranes avec des films Biomax-MS de Kodak dans une cassette d'autoradiographie.
B. Résultats
La Figure 6A représente une analyse Northern blot de la lignée de maïs C-OMT 225 au stade 20 jours. Des ARNs de racines (r), collet (c), et feuilles enroulées (H) de la lignée 225 et de la lignée témoin I2 ont été déposés dur gel d'électrophorèse d'agarose.
Après migration et incubation pendant 10 minutes dans une solution de BET à 0,1 μg/ml, le gel a été photographié sous UV dans le but d'estimer les quantités relatives des ARNs ribosomiques (rRNA). L'hybridation de la membrane après transfert avec une sonde ADNc marquée au 32P permet d'observer une forte diminution des transcrits C- OMT dans tous dans tous les organes testés (R, C, H) chez la lignée 225, par rapport à I2.
La Figure 6B représente une analyse Southern blot comparative entre la lignée antisens 225 et la lignée I2, en utilisant quatre enzymes de restriction distinctes, respectivement : EcoRV, Kpnl, EcoRI et Sacl.
La sonde utilisée est un fragment de 1 ,2 Kb localisé dans la région 3' de l'ADNc C-OMT de maïs.
Les bandes révélées sur la lignée I2 sont dues au gène endogène C-OMT.
Les bandes surnuméraires présentes pour la lignée 225 correspondent aux séquences transgéniques : les enzymes EcoRV, Kpnl et Sacl ne coupent pas dans le transgène. Un site EcoRI est présent dans la partie 5' de la construction transgénique. Selon les cas, 3 bandes (EcoRI, EcoRV) ou 2 bandes (Kpnl, Sacl) surnuméraires apparaissent pour la lignée 225.
Les résultats montrent que la lignée 225 a été transformée avec 2 ou 3 copies du transgène.
Exemple 5 : Analyse enzymatique de la COMT
A. Matériels et Méthodes Le protocole utilisé est dérivé d'Atanassova et al. (1995).
Brièvement, de jeunes plantes de 20 jours (post-semis) sont récoltées en coupant au niveau du collet, puis les feuilles sont éliminées de la partie aérienne (coupure au niveau de la ligule). Le fragment restant, d'environs 15 cm de long est fixé dans l'azote liquide et broyé dans un mortier avec un pilon. La poudre obtenue est homogénéisée dans le tampon d'extraction Na2HP04/NaH2P04 0.1 M pH7.5, PVPP 5% (m/v), DTT (10mM) à raison de 1 mL de tampon pour 300 mg de poudre. Après V_ heure d'incubation à 4°C, deux centrifugations successives (3000 g / 10 min / 4°C) sont réalisées pour éliminer le matériel insoluble. 40 μL d'extrait brut ainsi obtenu est ajouté à 960 μL de mélange réactionnel (Acide caféique 3mM, 3H-SAM 0.1 μCi, SAM 50μM, DTT 10mM, Tampon Na2HP04/ NaH2P04 0.1 M pH7.5 qsp 960μL) et l'ensemble est incubé 1h à 37°C. La réaction est arrêtée avec 100μL d'acide sulfurique 9N et 5 mL de scintillant organique (OCS, Amersham) sont ajoutés au mélange. L'ensemble est homogénéisé pour faire passer l'acide férulique tritié, produit de la réaction, dans le scintillant organique. La quantification de la radioactivité de l'acide férulique est réalisée avec un compteur à scintillation Beckman. Les protéines sont dosées selon la méthode de Bradford (1976) avec le réactif de Biorad.
B. Résultats
Criblage des plantes transgéniques sur la base de l'activité C-OMT
(figure 7)
1 - Choix de la partie de la plante utilisée pour la mesure de l'activité C-OMT
Les plantes ont été récoltées à un stade jeune (âgées de 20 jours après semis), ce qui implique un délai court entre semis et analyse, et ce qui permet de cultiver un grand nombre de plantes simultanément. La tige et les jeunes feuilles enroulées ont été utilisés en mélange pour ce travail. Les feuilles ligulées ont été éliminées.
2 - Activité C-OMT chez les plantes témoins utilisées pour le criblage La lignée utilisée comme témoin dans le criblage est I2. La barre d'histogramme des témoins I2 résulte de la moyenne des résultats obtenus sur 12 plantes analysées deux fois. On a pour ces témoins des valeurs d'activité qui varient de 4385 à 7225 cpm/mg de protéine, la moyenne se situant à 5998 cpm/mg avec un écart type de 1039. Ce premier résultat permet d'estimer la variabilité de l'activité C-OMT entre des plantes différentes récoltées au même moment. On voit que celle-ci est relativement réduite.
La lignée de maïs mutante bm3 a été utilisée pour la comparaison. Il était intéressant de valider le protocole de mesure de l'activité C-OMT, utilisé pour la première fois sur le maïs, à l'aide du mutant bm3, qui présente une activité C-OMT nulle. Trois plantes bm3 ont été analysées, et on observe un niveau d'activité très faible correspondant au bruit de fond. Les extraits bruts de protéines des plantes bm3 constituent donc d'excellents témoins négatifs dans ce travail.
3 - Activité C-OMT dans les populations transgéniques
Les résultats portant sur l'analyse de 32 événements de transformation différents sont résumés sur la figure 7. Puisque l'analyse a été faite dans certains cas sur deux lots de graines du même événement de transformation. Trois plantes du même lot ont été analysées de façon à pouvoir établir un écart-type. Chaque extrait brut a été utilisé pour deux déterminations d'activité.
Un total de 20 événements avec le promoteur ADH-ASOMT (pProsper et pProsper-Bar) ont été analysés. Une réduction significative de l'activité COMT, de l'ordre de 70%, a été obtenue pour certains événements.
Exemple 6 : Analyse histolo ique
A. Matériels et Méthodes
Coloration de Maϋle : Les coupes sont incubées dans une solution de KMnθ4 à 1% (m/v) pendant 5 minutes, rincées dans de l'eau distillée, décolorées avec une solution de HCI 15N pendant 3 minutes, rincées dans de l'eau distillée, et incubées dans une solution de NaHC03 à 5% (m/v).
Coloration au phloroglucinol : Les coupes sont immergées dans une solution de phloroglucinol en solution chlorhydrique (Prolabo). Les photographies sont réalisées avec une caméra. B. Résultats
Les résultats sont représentés sur la Figure 8, qui représente des clichés de microscopie photonique de faisceaux cribro-vasculaires de feuilles adultes de maïs, respectivement de la lignée I2 de maïs témoin et de la lignée de maïs 225, qui a été transformée avec un polynucleotide antiens inhibant la methyltransferase COMT.
Sur la Figure 8, on voit que la coloration est moins intense dans le sclérenchyme et dans le xylème de la lignée 225 que dans le sclérenchyme et le xylème de la lignée I2 témoin. Cela reflète une diminution des unités S dans les lignines de la variété transgénique de maïs 225.
Exemple 7 : Test de digestibilité des plantes par évaluation de la solubilité enzymatique
A. Matériels et Méthodes
Cette méthode permet d'estimer une digestibilité potentielle par l'activité d'enzymes cellulolytiques sur la paroi végétale. Les échantillons sont placés dans des sachets scellés et plongés dans les solutions enzymatiques. Les réactions ont lieu dans un incubateur DAIZY pouvant contenir quatre flacons de 2 litres, agités par rotation , maintenus à 40°C et pouvant contenir de 20 à 80 sachets. Les échantillons de poudre lyophilisée sont incubés une nuit à 70°C dans un cristallisoir. Puis, 0.5 g de poudre (masse initiale) sont déposés dans un sachet (F57, Ankom) qui est fermé par soudure, incubé 24 h à 70°C puis pesé après refroidissement (P1). Le sachet est ensuite incubé dans une solution de pepsine (Merck) à 20 g / L de HCL 0,1 N, à 40°C pendant 24 h, puis à 80°C pendant Vz heure. L'ensemble est alors rincé à l'eau à 35°C et essoré. Cette étape est répétée une fois. Le sachet est ensuite incubé dans une solution de cellulase (Onozuka R10 Yakult, Biochemical Co,Ltd.) à 1 g/L avec de l'amyloglucosidase (Merck) à 0.1g / L dans un tampon acétate de sodium / acide acétique (2.95 mL d'acide acétique à 96% et 6.8 g de d'acétate de sodium dans 1L d'eau déminéralisée), à 40°C pendant 24 h, puis rincé et essoré deux fois, avant d'être séché à l'étuve à 70°C pendant 24 heures. Le sachet est pesé (P2). La solubilité (en % de la masse sèche) est égale à (P1-P2) / (masse initiale x 100).
B. Résultats Les résultats comparés de digestibilité sont présentés dans le
Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 : Indice de digestibilité des plants de maïs
Figure imgf000038_0001
Dans le Tableau 1, l'indice ndf représente le pourcentage de fraction non digestible mesuré à partir de poudre lyophilisée de plantes entières récoltées au stade floraison.
Dans le Tableau 1 , l'indice dndf représente l'indice de digestibilité calculé à partir de la valeur de ndf (neutral détergent fiber) et du dms (solubilité enzymatique Aufrère) selon la formule de Struik (1985).
Les résultats du Tableau 1 montrent la digestibilité plus élevée des deux lignées de maïs transgéniques 225(1) et 225(2) qui ont été transformées avec une construction antisens selon l'invention, par rapport à la variété de maïs « WT » témoin, la lignée de maïs I2.
Exemple 8 : Evaluation de la teneur, la composition et de la structure en lignine de maïs transgéniques sous-exprimant la COMT : évaluation par CPG-SM des produits monomères issus de leur thioacidolvse
11 Etude des lignines: teneur et structure
Trois lignées de maïs, un témoin (WT) et deux lignées anti-sens COMT du même événement de transformation présentant une activité résiduelle de 40 % (3.2 et 1.2) récoltées au stade floraison, lyophilisées et broyées ont été analysées.
Les échantillons ont été extraits par un mélange acétone/eau (5/1) afin d'éliminer l'essentiel des composés solubles (pigments, lipides...) par un protocole relativement rapide. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 : le "résidu" de l'extraction représente à peu près le pourcentage de parois dans l'échantillon.
Tableau 2 : Résultats de l'extraction des échantillons de maïs témoin (WT) et transgéniques
Figure imgf000039_0001
La teneur assez élevée en extractibles est imputable à la présence des feuilles.
Les valeurs observées sont assez semblables pour les 3 lignées.
Le dosage de la lignine Klason a été réalisé sur les échantillons extraits. Il est exprimé en pourcentage pondéral de ces échantillons (tableau 3).
Tableau 3: Teneur en lignine Klason des échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits. Résultats exprimés en % pondéral des parois extraites
Figure imgf000039_0002
Les teneurs en lignine sont plus faibles que dans le cas de tiges récoltées à maturité : les échantillons extraits proviennent en effet de (feuilles + tiges) récoltées au stade floraison. Les deux lignées transgéniques présentent une teneur en lignine plus faible (25 à 30% en moins) que la lignée témoin.
La teneur en extractibles étant similaire pour les 3 lignées (Tableau 2), l'écart entre WT et antisens est maintenu lorsque le calcul est réalisé sur l'échantillon non extrait
Afin d'évaluer l'impact de la transformation sur la structure des lignines, les plantes entières (feuilles+tiges) ont été soumises à thioacidolyse (Lapierre et al., Plant Physiol 119, 153-163, 1999), suivie de l'analyse CPG-SM de leurs dérivés triméthylsilylés (Satum Varian , impact électronique, 45-650 m/z). La fréquence relative des unités p- hydroxyphényles H, guaiacyles G, syringyles S et 5-hydroxyguaiacyles 5- OH G engagées uniquement dans des liaisons -0-4 a été déterminée sur les chromatogrammes reconstruits sur les ions les plus spécifiques des dérivés qu'ils génèrent (Figure 2). Ces ions, correspondant au pic de base du spectre de masse, permettent d'évaluer sans équivoque les proportions des unités H/G/S/5-OHG liées en -0-4.
Les résultats rapportés dans le Tableau 4 et en Figure 3 révèlent sans équivoque l'efficacité de la transformation visant à sous-exprimer l'activité COMT. Les lignées transgéniques 3.2 et 1.2 présentent un effondrement de la fréquence des unités S (divisée par 2) et surtout l'apparition dans leurs lignines d'unités 5 OH-G en quantité substantielle (multipliée par un facteur compris entre 10 et 20). L'effet est un peu plus marqué dans le cas de la lignée 1.2. Les écarts observés entre Tableaux 3 et 4 pour les témoins sont imputables aux différences d'organes analysés, de stade de récolte et de lignée. Tableau 4. Structure des lignines de maïs (tiges + feuilles récoltées à la floraison) de lignées témoin et sous-exprimant la COMT : Fréquence relative des unités H, G, S et 5-OHG liées en -0-4
Figure imgf000041_0001
21 Etude des esters p-OH cinnamiques liés aux parois de maïs extraites
Les esters p-hydroxycinnamiques liés aux parois ont été libérés par hydrolyse alcaline (NaOH 1 M, 2.5 h, 40°C, 20 mg d'échantillon extrait traité par 2 ml de soude, en présence de 0.2 mg étalon interne éthylvanilline, avec agitation magnétique et sous N2). L'hydrolysat a été acidifié par HCI 2 M (1.5 ml), ultrafiltré sur Millex H25 NS (Millipore). Les composés phénoliques ont été extraits par extraction en phase solide sur Sep-Pak C1.8 (Classic, Waters Millipore), selon un protocole adapté de Beveridge et al. (2000, Food Res. Internat., 33, 775-783). Le conditionnement de la cartouche Sep-pak a été réalisé par 2*5 ml MeOH, 2*5ml eau (milliQ), 2*5 ml tampon formiate pH 3, avant passage de l'hydrolysat acidifié, suivi d'un lavage par 3 ml tampon formiate. L'élution des composés phénoliques retenus intégralement sur la cartouche (nous l'avons vérifié) a été réalisée par 1 ml CH3CN. L'échantillon recueilli a été dilué v/v par le solvant de CLHP avant d'être ultrafiltré à nouveau et analysé par CLHP en phase inverse (20 μl injectés). Un traitement identique a été réalisé sur un mélange étalon témoin contenant des quantités équipondérales d'acide p-coumarique (PC), d'acide férulique (Fe) et d'éthylvanilline (EtV), pour réaliser la calibration. L'analyse CLHP a été réalisée sur colonne Lichrocart RP18 Merck (5 μm, 250 * 4 mm), utilisée en conditions isocratiques, avec élution par le mélange eau/CH3CN/CH3COOH (78/20/2, v/v) à un débit de 1.3 ml/min et avec détection en sortie de colonne à 280 nm. Les résultats sont rapportés dans le tableau 5 et illustrés en Figure 4.
Tableau 5 : Quantité d'acides p-coumarique (PC) et féruliques (FE) libérés par hydrolyse alcaline douce (NaOH 1M, 2.5h, 40°C) d'échantillons de maïs (tiges + feuilles) extraits. Résultats exprimés en % pondéral des parois extraites
Figure imgf000042_0001
A nouveau, les résultats présentent une plus faible teneur en esters p- coumariques que les lignées témoins analogues, tandis que les teneurs en esters féruliques sont peu affectées par la déficience en activité COMT. Le résultat global est une diminution du rapport PC/FE. Ralph et al. ont démontré à plusieurs reprises qu'une partie de l'acide p- coumarique acyle les unités S des lignines (par RMN et par thioacidolyse) : la baisse en esters PC observée ici va donc de paire avec la baisse des unités S.
Les esters féruliques sont associés aux polysaccharides et peuvent être liés aux lignines par liaisons éthers (Jacquet et al., 1995). La teneur plus faible des maïs transgéniques en lignines limite cet arrimage et rend compte, vraisemblablement, du fait qu'on libère davantage d'acide férulique par hydrolyse alcaline des lignées transgéniques, par rapport au témoin. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un polynucleotide modulant la synthèse de la methyltransferase COMT de maïs codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°1, dans un procédé d'obtention de plants de maïs à caractéristiques de digestibilité améliorées ayant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou ayant une teneur en lignine modifiée restant compatible avec le développement normal de la plante.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polynucleotide est un polynucleotide antisens inhibant la synthèse de la methyltransferase COMT de maïs.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que le polynucleotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID
N°2.
4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit polynucleotide code la methyltransferase COMTde maïs, et provoque une production .plus élevée de cette enzyme dans la plante.
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que le polynucleotide codant la methyltransferase COMT comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
6. Procédé d'obtention de plants de maïs possédant des caractéristiques de digestibilité améliorées, possédant un rapport entre les unités S et G de la lignine modifié et/ou dont la teneur en lignine est modifiée et compatible avec le développement normal de la plante, ledit procédé comportant une étape de transformation d'une cellule hôte de maïs avec un polynucleotide choisi parmi les polynucléotides suivants : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement la traduction du gène codant pour la methyltransferase COMT de maïs.; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polynucleotide antisens comprend la séquence nucléotidique SEQ ID
N°2.
9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) transformer une cellule hôte de maïs avec un polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs; b) régénérer une plante entière à partir de la cellule hôte recombinante obtenue à l'étape a) ;
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) sélectionner les plants de maïs ayant intégré dans leur génome au moins une copie du polynucleotide antisens ou au moins une copie du polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11 , caractérisé en ce que le polynucleotide antisens ou le polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs est intégré dans une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique régulant l'expression dudit polynucleotide dans les cellules de maïs.
13. Procédé selon l'une des revendications 6 à 12, caractérisé en ce que le polynucleotide antisens ou le polynucleotide codant la methyltransferase COMT de maïs est artificiellement inséré dans une cellule de Agrobacterium tumefaciens.
14. Procédé selon l'une des revendications 6 à 13, caractérisé en ce qu'à l'étape a), la cellule hôte de maïs est aussi transformée avec au moins un second polynucleotide, modulant spécifiquement l'expression d'une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le second polynucleotide est choisi parmi : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs.
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines code pour une enzyme autre que la methyltransferase COMT de maïs.
17. Procédé selon l'une des revendications 6 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : d) croisement entre elles de deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape b) ou à l'étape c) avec un second plant de maïs ; e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène ou les transgènes.
18. Procédé d'obtention d'une plante transformée selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes additionnelles suivantes : f) croisement d'un plant de maïs transformé obtenu à l'étape c) avec un second plant de maïs ; g) sélection des plante de maïs issus du croisement de l'étape f) et ayant conservé le transgène.
19. Cellules de maïs susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une des revendications 6 à 18.
20. Plant de maïs transformé susceptible d'être obtenu à partir des cellules selon la revendication 19.
21. Partie d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, notamment, racine, graine, tige, feuille ou fleur.
22. Construit d'ADN comprenant un polynucleotide modulant la synthèse de la methyltransferase COMT de maïs, choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°1 ou SEQ ID N°2 ou un fragment de celles-ci, sous le contrôle de séquences régulatrices liées de façon opérationnelle à la séquence d'ADN devant être transcrite.
23. Construit d'ADN selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il comprend également un second polynucleotide codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs.
24. Vecteur d'expression recombinant comprenant un polynucleotide choisi parmi : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant la methyltransferase COMT ; ledit polynucleotide étant placé sous le contrôle d'une séquence de régulation fonctionnelle chez le maïs.
25. Vecteur d'expression recombinant selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend un second polynucleotide, ledit polynucleotide étant choisi parmi : a) un polynucleotide antisens inhibant spécifiquement l'expression du gène codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs ; b) un polynucleotide codant l'enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des lignines, autre que la methyltransferase COMT de maïs.
26. Cellule hôte de maïs ou une cellule de Agrobacterium tumefaciens transformée avec : a) soit un polynucleotide antisens inhibant la synthèse de la methyltransferase COMT dans une cellule de maïs ; b) soit un polynucleotide codant la methyltransferase COMT, ledit polynucleotide (a) ou ledit polynucleotide (b) étant préférentiellement placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice fonctionnelle dans une cellule de maïs, par exemple dans un vecteur d'expression selon l'une des revendications 24 ou 25.
27. Produit de transformation obtenu à partir d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, d'une partie d'un plant de maïs selon la revendication 21 , ou à partir d'une cellule de maïs transformée selon l'un des revendications 19 ou 26, caractérisé en ce qu'il possède des caractéristiques de digestibilité améliorées et qu'il présente un rapport modifié entre les unités S et les unités G de la lignine et une teneur modifiée en lignine.
28. Produit de transformation selon la revendication 27, caractérisé en ce que le rapport entre les unités S et les unités G est inférieur à 40/60.
29. Produit de transformation selon l'une des revendications 27 et 28, caractérisé en ce qu'il est du fourrage.
30. Lignine purifiée obtenue à partir d'un plant de maïs transformé selon la revendication 20, d'une partie d'un plant de maïs selon la revendication 21 , ou d'une cellule de maïs selon l'une des revendications 19 ou 26, caractérisée en ce qu'elle présente notamment un rapport modifié entre les unités S et les unités G.
31. Lignine purifiée selon la revendication 30, caractérisée en ce que le rapport entre les unités S et les unités G est inférieur à 40/60.
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