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WO2003018778A2 - Procede de preparation d'une composition lyophilisee contenant des bacteries lactiques a viabilite et activite bacteriennes ameliorees lors d'un stockage a temperature ambiante et composition obtenue - Google Patents

Procede de preparation d'une composition lyophilisee contenant des bacteries lactiques a viabilite et activite bacteriennes ameliorees lors d'un stockage a temperature ambiante et composition obtenue Download PDF

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Publication number
WO2003018778A2
WO2003018778A2 PCT/FR2002/002983 FR0202983W WO03018778A2 WO 2003018778 A2 WO2003018778 A2 WO 2003018778A2 FR 0202983 W FR0202983 W FR 0202983W WO 03018778 A2 WO03018778 A2 WO 03018778A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lactic acid
temperature
storage
acid bacteria
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/002983
Other languages
English (en)
Other versions
WO2003018778A3 (fr
Inventor
Catherine Beal
Michèle MARIN
Georges Corrieu
Fernanda Fonseca
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of WO2003018778A2 publication Critical patent/WO2003018778A2/fr
Publication of WO2003018778A3 publication Critical patent/WO2003018778A3/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to the field of production and storage of lyophilized lactic acid bacteria, usable by various industries for transformation by fermentation.
  • Lactic acid bacteria are widely used in the organic and food industries. Their main applications concern the dairy industry (production of cheese and fermented milk). They also participate in the transformation of plants, meat products and certain wines. Finally, more recently, their interest has widened due to their therapeutic potential.
  • lactic acid bacteria are produced commercially in a concentrated, frozen or lyophilized form.
  • the cells gradually lose their activity and their viability. This is detrimental for the industrial producers and for the users since the ferments must meet the requirements of quality and technological performance, if possible for several months.
  • the biological activity of the lactic acid bacteria on the market is highly dependent on the storage temperature: the lower the temperature, the better the preservation and the longer the shelf life of the product.
  • they are stored at a temperature less than or equal to -40 ° C. whereas, in lyophilized form, keeping at a storage temperature of 4 ° C. is commonly applied.
  • the production of lyophilized ferments therefore constitutes an interesting alternative to the production of frozen ferments since it involves a higher storage temperature, therefore less costly.
  • the volumes of product distributed are much lower, which generates savings in transport.
  • the usual mode of production and preservation of lyophilized concentrated lactic acid bacteria comprises three stages (Lejard et al. 1994): (i) a fermentation stage allowing the multiplication of bacteria in a culture medium, (ii) the concentration of the bacteria multiplied in step (i) and (iii) the lyophilization step.
  • Fermentation is carried out in batch culture, at regulated temperature.
  • the pH is regulated, by adding neutralizer, to a value generally between 5.5 and 7.0, depending on the bacteria considered.
  • the culture medium is cooled to a temperature between 4 ° C and 15 ° C, in order to slow down metabolic activities.
  • the biomass is then concentrated by centrifugation or by tangential filtration. This stage of the procedure makes it possible to partially separate the cells from the culture medium, also called fermented medium or supernatant at the end of culture.
  • the concentrated cells are taken up in a suitable conditioning medium serving to protect the bacteria against the damaging effects of subsequent conservation treatments.
  • This conditioning medium is called cryoprotection and / or lyoprotection medium. It is composed of part of the fermented medium, which is not completely eliminated by the concentration step, and of protection molecules which allow better preservation of cell viability.
  • the molecules cited in the literature are numerous; they are mono- or disaccharides, polymers, polyols, organic acids or their salts, amino acids or their salts, proteins, vitamins (Porubcan and Sellars 1975; Amen and Cabau 1983 ; Barach et al. 1987; Brousse et al. 1987).
  • bacterial suspensions are also supplemented with a cryoprotective agent, such as inositol, sorbitol, mannitol, glucose, sucrose, corn syrup, dimethyl sulfoxide, starches, modified starches, polyvinylpyrrolidone, maltose or other mono- or di-osides (mono- or di-saccharides).
  • a cryoprotective agent such as inositol, sorbitol, mannitol, glucose, sucrose, corn syrup, dimethyl sulfoxide, starches, modified starches, polyvinylpyrrolidone, maltose or other mono- or di-osides (mono- or di-saccharides).
  • ascorbate can be added at a rate of 4 to 20 parts per 100 parts by weight of dry matter of the culture medium, glutamate or aspartate is added at a rate of 1.5 to 20 parts per 100 parts by weight of dry matter and the cryoprotective agent is added in an amount of 1 to 300 grams per liter of culture medium.
  • the addition of these molecules is always based on empirical considerations rather than a reasoned formulation taking into account the possible protection mechanisms. In fact, there are currently no clearly established formulation rules for these complex biological media. Consequently, the differences in survival observed in these environments, according to the authors and according to the strains, are significant and difficult to explain.
  • the concentration and protection step the cell suspension is distributed in a thin layer (1 to 3 cm) and then frozen. Lyophilization is then carried out, under dry inert gas (nitrogen or argon), under conditions which make it possible to achieve advanced dehydration of the samples (Sandine and Vedamuthu 1978).
  • the lyophilization cycle lasting 10 to 30 hours, includes two phases: the sublimation of the ice (primary drying), then the desorption of most of the water which has not crystallized during the freezing (secondary drying).
  • the operating conditions temperature, pressure
  • the bacteria contained in the lyophilized powders are optionally mixed with others, in adequate proportions, for the direct or semi-direct inoculation of the manufacturing tanks.
  • the final packaging is carried out, under vacuum or under an inert gas, in packages which are sealed against light and water vapor. Storage is carried out under isothermal conditions for several weeks, usually at 4 ° C.
  • the conservation of these products at room temperature is an important industrial issue: it would lead to a reduction in storage and transport costs, it would facilitate handling and would allow the use of lactic acid powders to be extended to many products.
  • food milk powder, cookies, cereals, ...) and of pharmaceutical and / or medical interest. It follows from the analysis of the above state of the art that the production of lyophilized concentrated lactic ferments is marked by a strong empiricism, in particular at the level of the formulation of the protection media and the conduct of the lyophilization processes.
  • the invention provides, for the first time, a process for lyophilization of lactic acid bacteria allowing their storage for several months at high temperature, and compositions of bacteria freeze-dried lactics capable of being obtained by this freeze-drying process.
  • the subject of the invention is a process for the reproducible preparation of a lyophilized composition containing viable and active bacteria after storage for several months at a storage temperature.
  • Ts predetermined high
  • said method comprises the following steps: a) preparation of a concentrate of lactic acid bacteria in a liquid medium, said liquid medium comprising: (i) a water-soluble antioxidant compound or a combination of antioxidant compounds water soluble; and (ii) a compound or a combination of compounds increasing the glass transition temperature of the lyophilized product; b) lyophilization of the concentrated lactic acid bacteria prepared in step a), according to the following lyophilization steps:
  • the invention also relates to a composition containing viable and active lactic acid bacteria after storage at an elevated temperature (Ts), characterized in that:
  • (b) it comprises a compound increasing the glass transition temperature such that the glass transition temperature (Tg) of said composition is at least 20 ° C above the storage temperature (Ts);
  • composition at a water activity value of approximately 0.1.
  • It also relates to a concentrate of lactic acid bacteria capable of being used in the dairy industry, characterized in that it comprises a lyophilized composition as defined above. It also relates to the use of a lyophilized composition as defined above for the transformation of dairy products, plants, meat products and wine products, by fermentation.
  • It also relates to the use of a lyophilized composition as defined above in a fermentation process, particularly a fermentation process involving the production of lactic acid.
  • the lactic acid bacteria contained in said lyophilized composition were transformed with a nucleic acid allowing expression of a gene of therapeutic interest by these bacteria, for example a growth factor, a hormone or even a cytokine.
  • lactic acid bacteria could be stored at a high storage temperature (Ts) and remain viable and active for several months at the storage temperature (Ts), provided that the final lyophilized composition containing the bacteria lactic acid has a glass transition temperature (Tg) having a value at least 20 ° C above the predetermined storage temperature (Ts) provided that the water activity of this final lyophilized composition is approximately 0 , 1 and provided that this lyophilized composition is protected from oxidation phenomena by the addition of antioxidants.
  • Tg glass transition temperature
  • the invention therefore provides a process for the preparation of such a lyophilized composition, including the combination of the composition parameters of the bacteria concentrate in the liquid medium (antioxidant and lyoprotection medium), and the temperature and pressure parameters of the lyophilization step are adapted in order to achieve the characteristics of composition, temperature of glass transition (Tg) and water activity (aw) of the final lyophilized composition.
  • Tg temperature of glass transition
  • aw water activity
  • the invention provides a process for lyophilization of a composition containing lactic acid bacteria allowing the manufacture of a final lyophilized composition which can be stored at a predetermined high temperature (Ts) for several months, without significant loss of viability or metabolic activity of bacterial cells.
  • the invention relates to a process for the reproducible preparation of a lyophilized composition containing viable and active bacteria after storage for several months at a predetermined high storage temperature (Ts), characterized in that said process comprises the following steps: a) preparation a concentrate of lactic acid bacteria in a liquid medium, said liquid medium comprising:
  • step a) lyophilization of the concentrated lactic acid bacteria prepared in step a), according to the following lyophilization steps: (b1) freezing of the bacteria concentrate;
  • Tg glass transition temperature
  • Ts storage temperature
  • the glass transition temperature (Tg) of the final lyophilized composition is at least 20 ° C. higher, preferably at least 25 ° C, at the value of the storage temperature (Ts) sought.
  • the glass transition temperature (Tg) is measured by differential enthalpy analysis in a Pyris 1 Cryofill calorimeter (Perkin-Elmer, USA), during heating at a speed of 10 ° C / min.
  • the Tg value is determined for a 50% variation in the specific heat increase (ASTM, Standard Method E 1356-91).
  • ASTM Standard Method E 1356-91
  • the glass transition is carried out characterized by a temperature interval (of several degrees) around the estimated value of TG (Fonseca et al. 2001).
  • the glass transition temperature (Tg) of the final lyophilized composition is a function of the contribution of each of the compounds present in the concentrate of lactic bacteria, after addition of the antioxidant compound (s) of Tg from the starting concentrate.
  • the Tg value of the final freeze-dried composition cannot be calculated precisely. Its evolution depending on the nature of the solutes present in the composition can however be predicted (Fonseca et al. 2001). Validation is obtained experimentally, preferably by the above technique.
  • the process of the invention implies that the person skilled in the art who implements it first of all performs a test by adding increasing concentrations of the judiciously chosen lyoprotective compound (s) to the step a) of the process, and experimentally determines the glass transition temperature (Tg) of the final lyophilized composition, it being understood that, for a storage temperature (Ts) which it will have predetermined, the skilled person knows, thanks according to the invention, that the value of Tg must be at least 20 ° C. and better still at least 25 ° C., than the value of the storage temperature (Ts), to achieve the conservation objectives viability and activity of lactic acid bacteria freeze-dried for several months, at storage temperature (Ts).
  • the appropriate amounts of water-soluble antioxidant compound (s) and compound (s) increasing the glass transition temperature are added before stage b) of lyophilization, that is to say after the phase of production of lactic acid bacteria in the conventional culture medium (or fermentation medium).
  • stage b) of lyophilization that is to say after the phase of production of lactic acid bacteria in the conventional culture medium (or fermentation medium).
  • the skilled person can prepare, in step a) of the process, a lyoprotected concentrate of Lactobacillus delbrueckii subsp.
  • bulgaricus comprising respectively 25 g / L of a mixture of lactose and galactose, 12 g / L of sodium lactate, 25 g / L of maltose, 25 g / L of maltodextrin (DE 7-10) and 10 g / L an antioxidant such as sodium ascorbate.
  • the culture medium used for the multiplication of lactic acid bacteria is a conventional medium already containing the concentrations specified above of lactose, galactose and sodium lactate, the glass transition temperature sought for the final lyophilized composition is reached by adding the above final concentrations of maltose, maltodextrin and antioxidants.
  • a person skilled in the art may prepare, in step a) of the process, a concentrate. lyoprotected from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus comprising respectively 25 g / L of a mixture of lactose and galactose, 12 g / L of sodium lactate, 25 g / L of glucose and 25 g / L of maltodextrin (DE 7-10) and 10 g / L sodium ascorbate.
  • the culture medium used for the fermentation of lactic acid bacteria consists of whey (60 g / L), lactose (20 g / L), yeast extract (5 g / L) and a conventional anti-foam compound (1 g / L).
  • step a) of the process according to the invention the necessary quantity of at least one lyoprotective compound is added, the final concentration of which will allow the desired Tg value to be obtained in the final lyophilized composition.
  • a lyoprotective compound within the meaning of the invention, can be any compound, compatible with human or animal food, capable of increasing the glass transition temperature.
  • Such compounds are generally represented by carbohydrates, in particular mono, di and tri-saccharides (glucose, galactose, sucrose, trehalose, lactose, maltotriose) and polysaccharides (maltodextrins) (Levine and Slade, 1988). According to the invention it is shown that the best bacterial viability results are obtained with maltose and glucose respectively, while a compound such as glycerol is significantly less well suited (very low Tg) for the lyophilized product.
  • the method according to the invention is characterized in that the compounds increasing the glass transition temperature are chosen from glucose, or maltose and a maltodextrin.
  • the water-soluble antioxidant compound or the association of water-soluble antioxidant compounds is present in the starting liquid medium at a concentration of between 1 and 20 g / L, preferably between 5 and 15 g / L. Any type of water-soluble antioxidant compound known in the state of the art can be used. However, ascorbic acid and / or erythorbic acid are preferably used, optionally in the form of a salt, for example in the form of a sodium salt.
  • antioxidants mention may be made of: ascorbic acid and ascorbates, erythorbic acid, citric acid and citrates, cysteine, gallates, mannitol, tocopherols (extracts of natural and synthetic origin, vitamin E and Trolox, butylhydroxyanisole (BHT), butylhydroxytoluene (BHA).
  • the lyophilization times will be greatly lengthened (secondary desiccation longer by several hours and further evacuation). It is further recognized that the very weak Water activities are favorable to oxidation reactions and can adversely affect the cell viability and activity of the lyophilized composition of lactic acid bacteria.
  • a water activity of approximately 0.1 is a water activity of between 0.06 and 0.2, preferably between 0.08 and 0.15.
  • the water activity accounts for the partial pressure of the water vapor, at a fixed temperature, in equilibrium with the lyophilized composition obtained according to the above process.
  • the measurement of the water activity of the lyophilized samples is obtained using an FA-st / 1 device (GBX Scientific Instrumentation, Romans sur Isère), which operates according to the principle of l 'mirror hygrometry.
  • the relative humidity at equilibrium in a sealed system is obtained by measuring the dew point, at a fixed temperature of 20 ° C.
  • step b) of lyophilization the freezing step (b1) is carried out in a manner known in the prior art.
  • the freezing step (b1) is carried out by placing a thin layer of the culture medium containing the lactic acid bacteria on a plate maintained at the temperature of approximately -65 ° C., for the time necessary for the freezing of the medium.
  • step (b2) is important for maintaining the structure of the product and more generally for preserving its quality.
  • High values of the plate temperature (40 ° C to 60 ° C) and the total pressure (70 to 100 Pa) lead to an alteration of the structure of the biological products accompanied by degradation due to the Maillard reactions and / or oxidation.
  • very low values of plate temperature (-40 ° C.) and total pressure (5 Pa) result in very high freeze-drying residence times, which become difficult to comply with the industrial constraints of productivity. The advantage in terms of quality is more difficult to demonstrate for these very low values of operating conditions.
  • the primary drying step (b2) is preferably carried out under mild operating conditions, that is to say at a plate temperature ⁇ 20 ° C. and at a total pressure ⁇ 50 Pa.
  • This primary drying step (b2) is generally preferably carried out at a plate temperature between - 20 ° C and 20 ° C, better still between - 15 ° C and - 5 ° C on the one hand, and at total pressure between 5 Pa and 50 Pa, better between 10 Pa and 20 Pa on the other hand.
  • the primary drying step (b2) can typically be carried out at a plate temperature of - 10 ° C at a total pressure of 15 Pa.
  • the secondary drying step (b3) is essential to obtain a water activity of approximately 0.1 in the final lyophilized composition.
  • the conditions for freezing and primary drying can be easily adapted by a person skilled in the art, using his general knowledge of lyophilization processes, depending in particular on the thickness of the product which is to be lyophilized, and on the characteristics of the product. lyophilization device.
  • the secondary drying step (b3) can be carried out at a temperature of 25 ° C., at a pressure of 13 Pa and for a time necessary and sufficient to obtain a final lyophilized composition having water activity d 'about 0.1.
  • the duration of the secondary drying step (b3), under the above temperature and pressure conditions is advantageously 6 hours in a sample 1 cm thick.
  • Obtaining a water activity of approximately 0.1 makes it possible to sufficiently increase the glass transition temperature values of the lyoprotective mixtures so that the cell viability is substantially equivalent during storage of the lyophilized composition at 4 ° C and 25 ° C, this over several months of storage, for example three months of storage at these respective temperatures.
  • Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus delbrueckii subsp lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helvitusus Lactobacillus Lactobacillus Lactobac lactis, Lactocococcus lactis subsp. cremoris Lactococcus lactis subsp.
  • lactis biovar diacetylactis Leuconostroc mesenteroides subsp. cremoris, Leucoconostoc mesentoroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc lactis, Oenococcus oeni, Streptococcus thermophilus, Streptococcus macedonicus.
  • the starting fermented bacterial concentrate preferably contains between 10 8 and 10 11 viable lactic acid bacteria per milliliter.
  • steps (b1) to (b3) of step b) of the process can easily be adapted by those skilled in the art in the light of their general technical knowledge in the field of freezing and freeze-drying.
  • a lyophilized composition as defined above had improved characteristics of viability and acidifying activity of the lactic acid bacteria which it contains, during storage for several months, in particular for three months , at a high temperature (Ts), in particular 25 ° C.
  • Ts high temperature
  • the viability of lactic acid bacteria is directly linked to their acidifying activity (Fonseca et al., 2001).
  • the activity of lactic acid bacteria is preferably estimated by their capacity to acidify a culture medium is inoculated with a sample of the lyophilized composition according to the invention.
  • the loss of viability of lactic acid bacteria can then be expressed as the loss of the acidifying activity of a sample of a determined weight of a lyophilized composition according to the invention, firstly at the end of step b) of lyophilization, then later as a function of the storage time at a predetermined temperature, as shown in the examples.
  • K 0 min / day is accessible during storage at 4 ° C as at 25 ° C, if the criteria defined according to the invention are respected;
  • Figure 1 shows the curves of evolution of the acidifying activity, observed for the Lactobacillus acidophilus strain under different conditions.
  • the ordinate axis represents the time necessary for the reference culture medium to reach a pH of 5.5. The time corresponds to the acidifying activity of the bacterial concentrate tested as defined by the protocol used.
  • the abscissa axis represents the storage time of the lyophilized composition according to the invention, expressed in days.
  • the loss of activity is translated by the increase in the time necessary for a culture, under standard conditions, to reach a pH of 5.5.
  • the curve with the solid diamond symbols represents the measurements carried out on a lyophilized composition according to the invention stored at the temperature of 4 ° C.
  • the curve with the symbols in full squares represents the measurements carried out on a lyophilized composition according to the invention stored at the temperature of 25 ° C.
  • the curve with the symbols in solid triangles represents the measurements carried out on a lyophilized composition according to the invention stored at the temperature of 37 ° C.
  • the slope of the straight lines obtained for each of the three storage temperatures reflects the rate of loss of acidifying activity (K).
  • K loss of acidifying activity
  • FIG. 2 illustrates the values of the rates of loss of acidifying activity (K) observed during storage of the lyophilized compositions described in examples 1 to 4.
  • the abscissa axis represents the value of the difference between the glass transition temperature ( Tg) and that of the storage temperature (Ts), expressed in degrees Celsius.
  • the ordinate axis represents the rate of loss of acidifying activity, expressed as a normalized value for each strain (K / Kmax).
  • Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus is a thermophilic lactic acid bacterium widely used, especially in the manufacture of yogurt and well known for its limited resistance to conservation treatments. Lactobacillus acidophilus is also thermophilic. It is used in fermented milk preparations containing probiotics. Lactococcus lactis subsp. lactis is a mesophilic bacterium, mainly involved in the development of cheeses. Finally, Lactobacillus paracasei is a mesophilic bacterium, used in various products including fermented milk preparations containing probiotics and fermented plant products. Over there diversity of the strains studied in these 5 examples, it is considered that the entire field of lactic acid bacteria is covered by the invention.
  • the bacteria are produced by fermentation, with pH regulation by adding 10M sodium hydroxide, under culture conditions specified for each case.
  • the cells are concentrated and packaged in different lyoprotection media, the composition of which is described in each example.
  • the final formula of the product before lyophilization is as follows:
  • Lyoprotective medium (approximately 5 to 6% of dry matter), with or without antioxidant, containing maltodextrins and comprising maltotriose, maltose, glucose or glycerol, in variable proportions.
  • the same freeze-drying cycle is applied in each example. After freezing on a plate cooled to -
  • lyophilization includes a primary drying phase, at a pressure of 40 Pa and a plate temperature of 20 ° C. This phase is followed by a secondary desiccation lasting 6 hours, at a plate temperature of 25 ° C and a final total pressure of 13 Pa. Under these conditions, the final product reaches a water activity d 'about 0.1.
  • the effects described in the examples are based on the comparison of the biological activity of cell suspensions. The method for measuring this biological activity is described below. The methods of physical characterization of the samples (measurement of the glass transition temperature and measurement of the water activity) are also presented.
  • the determination of the biological activity of lactic acid bacteria at the various stages of their production and during their storage is important to characterize their resistance to these treatments.
  • This biological activity is often associated with acidifying activity, which is the most important technological function of lactic acid bacteria and which expresses their entire metabolism.
  • This biological activity is determined here using the method proposed by (Fonseca et al. 2000). The method consists in measuring the time necessary for the ferment incubated in milk, under standardized conditions, to reach a predetermined pH, for example 5.5. This measurement is carried out after freezing and after lyophilization, which makes it possible, by difference, to determine the loss of activity occurring during lyophilization (denoted dtl, in min). Measurements are made after different periods of isothermal storage in lyophilized form.
  • FIG. 1 illustrates the losses of acidifying activity observed for the Lactobacillus acidophilus strain under different conditions.
  • the water activity of the lyophilized samples and the glass transition temperature (Tg) are measured as indicated above.
  • Tg glass transition temperatures
  • the results correspond to the average of 2 independent measurements.
  • Table 5 shows, for L. bulgaricus, that the glass transition temperature of the lyoprotection medium does not influence the loss of acidifying activity during lyophilization (dtl).
  • Tg the loss of acidifying activity during lyophilization
  • Tg-Ts For media supplemented with glucose and maltose, maintaining the activity is equivalent to the storage temperatures of 4 ° C and 25 ° C.
  • Table 5 the difference Tg-Ts between the Tg of the final mixture and the storage temperature (Ts) is sufficiently large (between 20 ° C and 50 ° C) at temperatures of 4 ° C and 25 ° vs. Such a difference therefore seems necessary to ensure good storage stability of the bacteria for several months.
  • the differences (Tg-Ts) are only 10 ° C to 15 ° C and remain insufficient to ensure the biological stability of the product.
  • Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 (INRA, Grignon)
  • composition and characteristics of the final lyoprotective media are identical to those mentioned in Example 2.
  • the so-called reference cycle achieves a low water activity (aw of the order of 0.1) in the final lyophilized composition.
  • the product achieves a water activity of approximately 0.3.
  • the glass transition temperature decreases significantly when the aw increases, which corresponds to the plasticizing effect of water.
  • the two media containing maltose and glucose, have final Tg values considered to be little different, given the spreading of the shoulder observed in complex medium.
  • the results correspond to the average of 2 independent measurements.
  • the activity of the water in the final mixture influences the loss of acidifying activity during lyophilization (dtl).
  • the reduction in the duration and the temperature of the plaque during secondary drying would induce less cellular degradation and therefore, better resistance of the bacteria to lyophilization.
  • the rate of loss of acidifying activity (K) is lower if the aw of the medium is 0.1 (cycle 1) instead of 0.3 (cycle 2). This indicates that a low aw is necessary to maintain the acidifying activity during storage.
  • an aw of 0.3 induces better biological stability after lyophilization, it is the aw of 0.1 which is the most favorable for maintaining activity during storage. For example, after 4 weeks of storage at 25 ° C., the bacterial concentrates characterized by an aw of 0.3 have an activity much lower than the initial activity measured on the samples defined by an aw of 0.1.
  • difference Tg-Ts greater than 20 ° C, Table 8
  • Example 4 Effect of the difference between the glass transition temperature and the storage temperature on the storage in the lyophilized state of Lactococcus lactis subsp. lactis A. Materials and Methods
  • Table 10 Effect of the glass transition temperature of the medium on the loss of activity occurring during lyophilization (dtl) and on the rate of loss of acidifying activity observed during storage in lyophilized form (K, in min / day).
  • Tg-Ts (° C)
  • the results correspond to the average of 2 independent measurements.
  • the values of the rates of loss of acidifying activity, observed during storage in lyophilized form in examples 1 to 4, are shown in FIG. 2 as a function of the difference Tg-Ts.
  • Tg glass transition temperature of the final mixture
  • Ts maximum storage temperature
  • L. bulgaricus is the bacteria most sensitive to conservation treatments. These differences highlight the need to determine, for each species of microorganism, the conditions to be implemented during their lyophilization: formulation of the lyoprotection medium, operating conditions of the secondary drying phase and maximum storage temperature. However, the conditions recommended by the invention (difference Tg-Ts greater than 20 ° C) allow, in all cases, to reduce the effects of biological variability.
  • Lactobacillus paracasei CFP1 (INRA, Grignon)
  • Lyophilization conditions Two pairs of 'plate temperature and total pressure' during the primary drying stage are tested, namely:
  • the secondary drying conditions are the same for the two cycles (25 ° C and 13 Pa) and the physical properties of the final lyophilized compositions are close (Tg of 45 ° C ⁇ 2 ° C).
  • the total duration of the lyophilization cycle varies little, of the order of 1 p.m. to 3 p.m. depending on the operating conditions.
  • the loss of activity during storage at 25 ° C. for 30 days also decreases significantly (difference of 30 min) when the couple of values of plate temperature and total pressure is lowered during the step of primary drying.
  • the choice of a “plate temperature and total pressure” couple at low values (mild conditions) leads to better respect for the quality of the biological material, due to the slowing down of the reaction kinetics during the entire drying time. primary (several hours).
  • the stability during storage of the lyophilized product keeping it below the transition temperature the entire layer frozen during the primary drying is also a favorable condition for the stability of the product during the lyophilization process.
  • mild operating conditions of plate temperature and total pressure can improve storage stability.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation d'une composition lyophilisée qui comprend les étapes suivantes :a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant : (i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles ; et (ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé; b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques lioprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes de lyophilisation suivantes : (b1) congélation du concentré de bactéries ; (b2) dessication primaire, de préférence dans des conditions opératoires douces ; (b3) dessication secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20°C à la température de stockage (Ts) prédéterminée. Application aux industries biologiques et alimentaires.

Description

Procédé de préparation d'une composition lyophilisée contenant des bactéries lactiques à viabilité et activité bactériennes améliorées lors d'un stockage à température ambiante et composition obtenue
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la production et du stockage des bactéries lactiques lyophilisées, utilisables par diverses industries pour la transformation par fermentation.
ART ANTERIEUR
Les bactéries lactiques sont très largement employées dans les industries biologiques et alimentaires. Leurs principales applications concernent l'industrie laitière (production de fromages et de laits fermentes). Elles participent également à la transformation de végétaux, de produits carnés et de certains vins. Enfin, plus récemment, leur intérêt s'élargit en raison de leur potentiel thérapeutique.
Actuellement, les bactéries lactiques sont produites, de façon commerciale, sous une forme concentrée, congelée ou lyophilisée. Cependant, au cours de leur préparation et, plus particulièrement au cours de leur stockage, les cellules perdent peu à peu leur activité et leur viabilité. Cela est préjudiciable pour les industriels producteurs et pour les utilisateurs car les ferments doivent satisfaire aux exigences de qualité et de performances technologiques, si possible pendant plusieurs mois.
L'activité biologique des bactéries lactiques commercialisées est fortement dépendante de la température de stockage : plus la température est basse, meilleure est la conservation et plus longue est la durée de vie du produit. Ainsi, sous forme congelée, elles sont conservées, à une température inférieure ou égale à -40°C alors que, sous forme lyophilisée, un maintien à une température de stockage de 4°C est couramment appliqué. La production de ferments lyophilisés constitue donc une alternative intéressante à la production de ferments congelés puisqu'elle implique une température de conservation plus élevée, donc moins coûteuse. De plus, les volumes de produit distribué sont beaucoup plus faibles, ce qui génère des économies au niveau du transport.
Pratiquement, le mode habituel de production et de conservation des bactéries lactiques concentrées lyophilisées, bien connu de l'homme de l'art, comporte trois étapes (Lejard et al. 1994) : (i) une étape de fermentation permettant la multiplication des bactéries dans un milieu de culture, (ii) la concentration des bactéries multipliées à l'étape (i) et (iii) l'étape de lyophilisation.
La fermentation est réalisée en culture discontinue, à température régulée. Le pH est régulé, par addition de neutralisant, à une valeur généralement comprise entre 5,5 et 7,0, selon la bactérie considérée. Dans certains cas, il est possible de coupler à la fermentation un traitement d'ultrafiltration afin d'éliminer les produits inhibiteurs (acide lactique principalement) formés par les bactéries (Amen et Cabau 1983). Lorsqu'un niveau élevé de population bactérienne est atteint (de 109 à 1010 cellules par mL), le milieu de culture est refroidi à une température comprise entre 4°C et 15°C, afin de ralentir les activités métaboliques. La biomasse est ensuite concentrée par centrifugation ou par filtration tangentielle. Cette étape de la procédure permet de séparer partiellement les cellules du milieu de culture, également appelé milieu fermenté ou surnageant de fin de culture.
Les cellules concentrées sont reprises dans un milieu de conditionnement adapté servant à protéger les bactéries contre les effets dommageables des traitements de conservation ultérieurs. Ce milieu de conditionnement est appelé milieu de cryoprotection et/ou de lyoprotection. Il est composé d'une partie du milieu fermenté, qui n'est pas totalement éliminé par l'étape de concentration, et de molécules de protection qui permettent une meilleure préservation de la viabilité cellulaire. Les molécules citées dans la littérature sont nombreuses ; il s'agit de mono- ou de disaccharides, de polymères, de polyols, d'acides organiques ou de leurs sels, d'acides aminés ou de leurs sels, de protéines, de vitamines (Porubcan and Sellars 1975; Amen and Cabau 1983; Barach et al. 1987; Brousse et al. 1987).
Des documents de l'état de la technique proposent d'améliorer la viabilité des bactéries au cours du stockage dans le temps, dans les concentrés bactériens. Dans la demande de brevet européen n° EP 0 259 739, publiée le 16 mars 1988, il est proposé de lyophiliser le milieu de culture contenant les bactéries avec une quantité de molécules protectrices susceptible de réduire substantiellement la perte de viabilité cellulaire. Ce document suggère l'utilisation d'agents cryoprotecteurs tels que le sucrose, les peptones, la casitone, un sel d'acide glutamique, le glycérol, le diméthylsufloxyde, le lait en poudre écrémé, ou encore un produit laitier, tel que la caséine ou le petit lait, le fructose ou le maltose, ledit agent cryoprotecteur étant présent à raison de 3,3 à 67 pour cent en poids de matière sèche stabilisée des cellules. Selon ce document, l'acide citrique potentialise l'effet de l'agent cryoprotecteur sur la viabilité des cellules bactériennes.
Le brevet américain n° US 3,897,307, publié le 29 juillet 1975, décrit un procédé de lyophilisation de cultures de bactéries lactiques dont la stabilité dans le temps est améliorée en incorporant la suspension de cellules en fin de fermentation, (avant la lyophilisation), une association d'ascorbate avec le glutamate ou l'aspartate. Selon ce document, les suspensions bactériennes sont aussi additionnées d'un agent cryoprotecteur, tel que l'inositol, le sorbitol, le mannitol, le glucose, le sucrose, le sirop de maïs, le diméthylsulfoxyde, des amidons, des amidons modifiés, de la polyvinylpyrrolidone, du maltose ou d'autres mono- ou di-osides (mono- ou di-saccharides). Selon ce document, l'ascorbate peut être ajouté à raison de 4 à 20 parties pour 100 parties en poids de matière sèche du milieu de culture, le glutamate ou l'aspartate est ajouté à raison de 1,5 à 20 parties pour 100 parties en poids de matière sèche et l'agent cryoprotecteur est ajouté à raison de 1 à 300 grammes par litre de milieu de culture.
Toutefois, l'ajout de ces molécules relève toujours de considérations empiriques plutôt que d'une formulation raisonnée prenant en compte les mécanismes de protection possibles. En fait, il n'existe pas, actuellement, de règles de formulation clairement établies pour ces milieux biologiques complexes. En conséquence, les différences de survie observées dans ces milieux, selon les auteurs et selon les souches, sont importantes et difficilement explicables. Après l'étape de concentration et de protection, la suspension cellulaire est répartie en couche mince (1 à 3 cm) puis congelée. La lyophilisation est ensuite effectuée, sous gaz inerte (azote ou argon) sec, dans des conditions qui permettent d'atteindre une déshydratation poussée des échantillons (Sandine et Vedamuthu 1978). Le cycle de lyophilisation, d'une durée de 10 à 30 heures, comprend deux phases : la sublimation de la glace (dessiccation primaire), puis la désorption de la majeure partie de l'eau qui n'a pas cristallisé au cours de la congélation (dessiccation secondaire). Cependant, peu d'informations sur les conditions opératoires (température, pression) au cours du cycle de lyophilisation sont données dans les brevets relatifs à la préservation des concentrés bactériens lyophilisés (Porubcan et Sellars 1975; Sandine et Vedamuthu 1978; Barach et al. 1987; Enders et al. 1988; Saniez et Serpelloni 1993). Le niveau de déshydratation, atteint en fin de lyophilisation, affecte la survie des bactéries lyophilisées au cours de leur stockage. Une teneur en eau résiduelle élevée est favorable aux réactions de dégradation cellulaire. A l'opposé, une teneur en eau résiduelle trop faible peut entraîner une dégradation des protéines membranaires et l'exposition de leurs sites hydrophiles aux gaz, notamment à l'oxygène (Brennan et al. 1986). Des phénomènes d'oxydation, auxquels les bactéries lactiques sont particulièrement sensibles, peuvent alors se produire. Des teneurs en eau de 2,5% à 3% (fraction massique) sont préconisées pour les bactéries lactiques lyophilisées (Porubcan et Sellars 1975). Cependant, en pratique, la teneur en eau, pour les faibles valeurs caractéristiques des produits lyophilisés, est difficilement mesurable. Par ailleurs, la notion d'activité de l'eau dans les produits biologiques et alimentaires a largement supplanté, depuis près de 25 ans, la teneur en eau, en tant qu'indicateur de stabilité. A l'issue de l'étape de lyophilisation, les bactéries contenues dans les poudres lyophilisées sont éventuellement mélangées avec d'autres, en proportions adéquates, pour l'ensemencement direct ou semi-direct des cuves de fabrication. Le conditionnement final est effectué, sous vide ou sous un gaz inerte, dans des emballages étanches à la lumière et à la vapeur d'eau. Le stockage est réalisé, en conditions isothermes, pendant plusieurs semaines, habituellement à 4°C. Or la conservation de ces produits à température ambiante, constitue un enjeu industriel important : elle conduirait à une réduction des coûts de stockage et de transport, elle faciliterait la manutention et permettrait d'étendre l'utilisation des poudres de bactéries lactiques à de nombreux produits alimentaires (lait en poudre, biscuits, céréales, ...) et d'intérêt pharmaceutique et/ou médical. Il résulte de l'analyse de l'état de la technique ci-dessus que la production de ferments lactiques concentrés lyophilisés est marquée par un fort empirisme, notamment au niveau de la formulation des milieux de protection et de la conduite des procédés de lyophilisation.
Notamment, bien que le principe d'addition d'un agent cryoprotecteur soit admis, les larges gammes de concentrations possibles, qui vont de un à trois cents dans un même document, montrent que l'homme du métier qui voudrait reproduire l'enseignement des procédés de lyophilisation décrits dans l'état de la technique serait obligé de faire lui-même preuve d'empirisme et de réaliser, pour chaque cas d'espèce, de nombreux essais afin de retenir la meilleure combinaison de composition du milieu de culture de départ et de paramètres, notamment de temps, de température et de pression, pour l'étape de lyophilisation proprement dite.
Il existe donc un besoin, dans l'état de la technique, pour la mise au point d'un procédé de lyophilisation de bactéries lactiques qui soit simple, d'une grande reproductibilité, permettant à l'homme du métier, dans tous les cas de figures, c'est à dire notamment quelles que soient les conditions de température de stockage envisagées ou quelque soit la souche de bactérie lactique dont la conservation est recherchée, d'obtenir une composition lyophilisée de bactéries lactiques dont l'activité ou la viabilité des cellules soit peu ou pas du tout altérée après stockage pendant plusieurs mois à température élevée.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention fournit, pour la première fois, un procédé de lyophilisation de bactéries lactiques permettant leur stockage pendant plusieurs mois à température élevée, et des compositions de bactéries lactiques lyophilisées susceptibles d'être obtenues par ce procédé de lyophilisation.
L'invention a pour objet un procédé de préparation reproductible d'une composition lyophilisée contenant des bactéries viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à une température de stockage
(Ts) élevée prédéterminée, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant : (i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles ; et (ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé; b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques lioprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes de lyophilisation suivantes :
(b1 ) congélation du concentré de bactéries ; (b2) dessication primaire de préférence selon des conditions opératoires douces (température de plaque < 20°C et pression totale < 50 Pa). (b3) dessication secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20°C à la température de stockage (Ts) prédéterminée.
L'invention est également relative à une composition contenant des bactéries lactiques viables et actives après stockage à une température élevée (Ts), caractérisée en ce que :
(a) elle comprend un composé antioxydant hydrosoluble ;
(b) elle comprend un composé augmentant la température de transition vitreuse telle que la température de transition vitreuse (Tg) de ladite composition est supérieure d'au moins 20°C la température de stockage (Ts);
(c) ladite composition à une valeur d'activité de l'eau d'environ 0,1.
Elle concerne aussi un concentré de bactéries lactiques susceptible d'être utilisé dans l'industrie laitière, caractérisé en ce qu'il comprend une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus. Elle est aussi relative à l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus pour la transformation de produits laitiers, de végétaux, de produits carnés et de produits vinicoles, par fermentation.
Elle a aussi pour objet l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus dans un procédé de fermentation, particulièrement un procédé de fermentation impliquant la production d'acide lactique.
Elle a encore pour objet l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus pour la préparation d'une composition de complément alimentaire ou alicament.
Elle a également trait à l'utilisation d'une composition lyophilisée tele que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament.
Dans cette dernière utilisation, les bactéries lactiques contenues dans ladite composition lyophilisée ont été transformées avec un aacide nucléique permettant l'expression d'un gène d'intérêt thérapeutique par ces bactéries, par exemple un facteur de croissance, une hormone ou encore une cytokine. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est montré selon l'invention que des bactéries lactiques pouvaient être conservées à une température de stockage élevée (Ts) et rester viables et actives pendant plusieurs mois à la température de stockage (Ts), à condition que la composition lyophilisée finale contenant les bactéries lactiques possède une température de transition vitreuse (Tg) ayant une valeur supérieure d'au moins 20°C à la température de stockage (Ts) prédéterminé à condition que l'activité de l'eau de cette composition lyophilisée finale soit d'environ 0,1 et à condition que cette composition lyophilisée soit protégée des phénomènes d'oxydation par l'ajout d'anti-oxydants.
L'invention fournit en conséquence un procédé de préparation d'une telle composition lyophilisée, dont la combinaison des paramètres de composition du concentré de bactéries dans le milieu liquide (antioxydant et milieu de lyoprotection), et les paramètres de température et de pression de l'étape de lyophilisation sont adaptés en vue d'atteindre les caractéristiques de composition, de température de transition vitreuse (Tg) et d'activité de l'eau (aw) de la composition lyophilisée finale.
Ces paramètres au cours de la dessiccation primaire peuvent également être choisis pour améliorer directement la stabilité de la composition finale lyophilisée.
Grâce à une combinaison adéquate de ces paramètres, l'invention fournit un procédé de lyophilisation d'une composition contenant des bactéries lactiques permettant la fabrication d'une composition lyophilisée finale pouvant être conservée à température élevée (Ts), prédéterminée, pendant plusieurs mois, sans perte significative de viabilité ni d'activité métabolique des cellules bactériennes.
L'invention concerne un procédé de préparation reproductible d'une composition lyophilisée contenant des bactéries viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à une température de stockage (Ts) élevée prédéterminée, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant :
(i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles ; et
(ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé; b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques lioprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes de lyophilisation suivantes : (b1 ) congélation du concentré de bactéries ;
(b2) dessication primaire de préférence selon des conditions opératoires douces ( température de plaque ≤ 20°C et pression totale < 50 Pa) ; (b3) dessication secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20°C à la température de stockage (Ts) prédéterminée.
Il est montré selon l'invention que l'addition, dans le milieu de culture de départ, qui contient les bactéries lactiques à lyophiliser, d'un agent antioxydant et d'un composé ou d'une association de composés lyoprotecteurs dans des quantités telles que la température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale soit supérieure d'au moins 20°C, de préférence d'au moins 25°C à la température de stockage (Ts) de la composition lyophilisée finale, associée aux autres étapes du procédé permettant l'obtention d'une composition lyophilisée finale ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 , permettait de conférer à la composition lyophilisée finale des propriétés de conservation optimales de la viabilité et de l'activité biologique des bactéries lactiques lors d'un stockage à température élevée.
Etape a) du procédé : Composition de départ contenant un ou plusieurs antioxydants et un ou plusieurs composés lyoprotecteurs augmentant la Tg.
Selon l'invention, il a été trouvé qu'une conservation optimale des caractéristiques de viabilité des bactéries est atteinte lorsque la température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale était supérieure d'au moins 20°C, de préférence d'au moins 25°C, à la valeur de la température dé stockage (Ts) recherchée.
La température de transition vitreuse (Tg) est mesurée par analyse enthalpique différentielle dans un calorimètre Pyris 1 Cryofill (Perkin-Elmer, USA), lors du réchauffement à une vitesse de 10°C/min. La valeur de Tg est déterminée pour une variation de 50% de l'augmentation de chaleur spécifique (ASTM, Standard Method E 1356- 91). Dans les produits complexes, tels que les suspensions bactériennes concentrées, la transition vitreuse est réalisé caractérisée par un intervalle de température (de plusieurs degrés) autour de la valeur estimée de TG (Fonseca et al. 2001).
La température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale est fonction de contribution de chacun des composés présents dans le concentré de bactéries lactiques, après addition du ou des composés(s) antioxydants de Tg du concentré de départ. Dans des milieux aussi complexes que les milieux de fermentation de bactéries lactiques concentrées, la valeur de la Tg de la composition lyophilisée finale ne peut être calculée précisément. Son évolution en fonction de la nature des solutés présents dans la composition peut cependant être prédite (Fonseca et al. 2001). La validation est obtenue par voie expérimentale, préférentiellement par la technique ci-dessus.
En conséquence, le procédé de l'invention implique que l'homme du métier qui le met en œuvre procède tout d'abord à un essai en ajoutant des concentrations croissantes du ou des composé(s) lyoprotecteur(s) judicieusement choisis, à l'étape a) du procédé, et détermine expérimentalement la température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale, étant entendu que, pour une température de stockage (Ts) qu'il aura prédéterminée, l'homme du métier sait, grâce à l'invention, que la valeur de Tg doit être supérieure d'au moins 20°C, et mieux d'au moins à 25°C, à la valeur de la température de stockage (Ts), pour atteindre les objectifs de conservation de la viabilité et de l'activité des bactéries lactiques lyophilisées pendant plusieurs mois, à la température de stockage (Ts). Dans la pratique, on ajoute les quantités adéquates de composé(s) antioxydant(s) hydrosoluble(s) et de composé(s) augmentant la température de transition vitreuse avant l'étape b) de lyophilsation, c'est à dire après la phase de production des bactéries lactiques dans le milieu de culture conventionnel (ou milieu de fermentation). Par exemple, pour obtenir une température de transition vitreuse de la composition lyophilisée finale de 52°C , l'homme du métier pourra préparer, à l'étape a) du procédé, un concentré lyoprotégé de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus comprenant respectivement 25 g/L d'un mélange de lactose et de galactose, 12 g/L de lactate de sodium, 25 g/L de maltose, 25 g/L de maltodextrine (DE 7-10) et 10 g/L d'un antyoxydant tel que l'ascorbate de sodium. Si le milieu de culture utilisé pour la multiplication des bactéries lactiques est un milieu conventionnel contenant déjà les concentrations spécifiées ci-dessus de lactose, de galactose et de lactate de sodium, la température de transition vitreuse recherchée pour la composition lyophilisée finale est atteinte en ajoutant les concentrations finales ci-dessus de maltose, de maltodextrine et d'antioxydants.
Egalement à titre illustratif, pour obtenir une température de transition vitreuse de la composition lyophilisée finale de 47°C , l'homme du métier pourra préparer, à l'étape a) du procédé, un concentré lyoprotégé de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus comprenant respectivement 25 g/L d'un mélange de lactose et de galactose, 12 g/L de lactate de sodium, 25 g/L de glucose et 25 g/L de maltodextrine (DE 7-10) et 10 g/L d'ascorbate de sodium. Dans les deux exemples indicatifs ci-dessus, le milieu de culture utilisé pour la fermentation des bactéries lactiques est constitué de lactosérum (60 g/L), lactose (20 g/L), d'extrait de levure (5 g/L) et d'un composé anti-mousse conventionnel (1 g/L).
Pour la mise en œuvre de l'étape a) du procédé selon l'invention, on ajoute la quantité nécessaire d'au moins un composé lyoprotecteur, dont la concentration finale permettra l'obtention de la valeur de Tg désirée dans la composition lyophilisée finale.
Un composé lyoprotecteur, au sens de l'invention, peut être tout composé, compatible avec l'alimentation humaine ou animale, capable d'augmenter la température de transition vitreuse.
De tels composés sont représentés en général par les hydrates de carbone, en particulier les mono, di et tri-saccharides (glucose, galactose, saccharose, tréhalose, lactose, maltotriose) et des polyosides (maltodextrines) (Levine et Slade, 1988). Selon l'invention on montre que les résultats de viablilité bactérienne les meilleurs sont obtenus avec respectivement le maltose et le glucose, alors qu'un composé comme le glycérol est sensiblement moins bien adapté (très faible Tg) pour le produit lyophilisé.
De préférence, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les composés augmentant la température de transition vitreuse sont choisis parmi le glucose, ou le maltose et une maltodextrine.
Ces propriétés de conservation de la viabilité et de l'activité cellulaire, qui caractérisent les compositions lyophilisées susceptibles d'être obtenues selon le procédé décrit ci-dessus, sont atteintes grâce à la présence d'un ou des composé(s) antixoydant(s) hydrosoluble(s), qui bloque(nt), ou tout au moins réduise(nt) fortement l'oxydation des lipides membranaires cellulaires qui peuvent se produire autrement au cours de la lyophilisation et surtout au cours du stockage, et qui induisent une mortalité cellulaire, spécialement dans des compositions dont l'activité de l'eau est aussi faible qu'environ 0,1. Selon le procédé, le composé antioxydant hydrosoluble ou l'association de composés antioxydants hydrosolubles est présent dans le milieu liquide de départ à une concentration comprise entre 1 et 20 g/L, de préférence entre 5 et 15 g/L. On peut utiliser tout type de composé antioxydant hydrosoluble connu dans l'état de la technique. Toutefois, on utilise de préférence l'acide ascorbique et/ou l'acide erythorbique, éventuellement sous la forme d'un sel, par exemple sous la forme d'un sel de sodium.
Parmi les antioxydants on peut citer : l'acide ascorbique et les ascorbates, l'acide erythorbique, l'acide citrique et les citrates, la cistéine, les gallates, le mannitol, les tocophérols (extraits d'origine naturelle et de synthèse, la vitamine E et Trolox, le butylhydroxyanisole (BHT), le butylhydroxytoluène (BHA).
Etape b) du procédé : l'étape de lyophilisation
Il est aussi été montré selon l'invention qu'un procédé de lyophilisation optimal, du point de vue des caractéristiques de maintien de la viabilité et de l'activité des bactéries lactiques à long terme à température de stockage (Ts) élevée, devait impérativement aboutir à la production d'une composition lyophilisée finale ayant une activité de l'eau suffisamment faible. En effet, la température de transition vitreuse diminue de manière significative lorsque l'activité de l'eau augmente, ce qui correspond à l'observation d'un effet « plastifiant » de l'eau.
Des activités de l'eau de la composition lyophilisée finale supérieures nuisent significativement à la viabilité des bactéries lyophilisées. Pour une activité de l'eau de 0,3 de la composition lyophilisée finale, par exemple après 4 semaines de conservation à 25°C, la viabilité des bactéries, estimée par la perte d'activité acidifiante, est fortement affectée, ce qui est incompatible avec les objectifs de viabilité et d'activité cellulaire recherchés, comme cela est montré dans les exemples.
A l'inverse, pour une activité d'eau significativement inférieure à 0,1 (0,05 par exemple), les temps de lyophilisation vont être fortement allongés (dessication secondaire plus longue de plusieurs heures et mise sous vide plus poussée). Il est de plus reconnu que les très faibles activités d'eau sont favorables aux réactions d'oxydation et peuvent nuire à la viabilité et à l'activité cellulaires de la composition lyophilisée de bactéries lactiques.
Selon l'invention, une activité de l'eau d'environ 0,1 est une activité de l'eau comprise entre 0,06 et 0,2, de préférence entre 0,08 et 0,15.
L'activité de l'eau rend compte de la pression partielle de la vapeur d'eau, à température fixée, en équilibre avec la composition lyophilisée obtenue selon le procédé ci-dessus. Selon l'invention, la mesure de l'activité de l'eau des échantillons lyophilisés est obtenue à l'aide d'un appareil FA-st/1 (GBX Instrumentation Scientifique, Romans sur Isère), qui fonctionne selon le principe de l'hygrométrie à miroir. L'humidité relative à l'équilibre dans un système étanche est obtenue par la mesure du point de rosée, à une température fixée de 20°C.
Selon l'étape b) de lyophilisation, l'étape (b1) de congélation est réalisée de manière connue dans l'état de la technique.
Avantageusement, l'étape (b1) de congélation est réalisée en disposant une couche mince du milieu de culture contenant les bactéries lactiques sur une plaque maintenue à la température d'environ -65°C, pendant le temps nécessaire à la congélation du milieu.
Ces conditions de congélation peuvent être aisément adaptées par l'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales des procédés de lyophilisation, en fonction notamment de l'épaisseur du produit qui doit être lyophilisé, et des caractéristiques du dispositif de lyophilisation.
La conduite de l'étape (b2) est importante pour le maintien de la structure du produit et plus globalement pour préserver sa qualité. Des valeurs élevées de la température de plaque (40°C à 60°C) et de la pression totale (70 à 100 Pa) conduisent à une altération de la structure des produits biologiques accompagnée d'une dégradation en raison des réactions de Maillard et/ou d'oxydation. En revanche, des valeurs très faibles de température de plaque (-40°C) et de pression totale (5 Pa) se traduisent par des temps de séjour de lyophilisation très élevés, qui deviennent difficilement compatibles avec les contraintes industrielles de productivité. L'avantage au plan de la qualité est de plus difficile à démontrer pour ces valeurs très basses de conditions opératoires.
En conséquence, l'étape (b2) de dessication primaire est de préférence réalisée dans des conditions opératoires douces, c'est-à-dire à une température de plaque < 20°C et à une pression totale < 50 Pa.
Cette étape (b2) de dessiccation primaire est généralement de préférence réalisée à une température de plaque comprise entre - 20°C et 20°C, mieux entre - 15°C et - 5°C d'une part, et à une pression totale comprise entre 5 Pa et 50 Pa, mieux entre 10 Pa et 20 Pa d'autre part. Selon l'invention, à titre illustratif l'étape ~(b2) de dessiccation primaire peut être typiquement réalisée à la température de plaque de - 10°C à une pression totale de 15 Pa.
En outre, l'étape (b3) de dessiccation secondaire est essentielle pour obtenir une activité de l'eau d'environ 0,1 dans la composition lyophilisée finale.
Les conditions de congélation et de dessiccation primaire peuvent être aisément adaptées par l'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales des procédés de lyophilisation, en fonction notamment de l'épaisseur du produit qui doit être lyophilisé, et des caractéristiques du dispositif de lyophilisation.
C'est l'étape (b3) de dessiccation secondaire qui est essentielle pour obtenir une activité de l'eau d'environ 0,1 dans la composition lyophilisée finale.
Pour (b3) de dessiccation secondaire, l'homme du métier pourra conduire une série d'essais afin de déterminer les conditions optimales de température, de pression et de durée nécessaires à l'obtention d'une composition finale ayant une activité de l'eau d'environ 0,1.
Par exemple, l'étape (b3) de dessiccation secondaire peut être réalisée à la température de 25°C, à une pression de 13 Pa et pendant une durée nécessaire et suffisante pour obtenir une composition lyophilisée finale ayant une activité de l'eau d'environ 0,1.
A titre illustratif, la durée de l'étape (b3) de dessiccation secondaire, aux conditions de température et de pression ci-dessus, est avantageusement de 6 heures dans un échantillon de 1 cm d'épaisseur. L'obtention d'une activité de l'eau à environ 0,1 permet d'augmenter suffisamment les valeurs de température de transition vitreuse des mélanges lyoprotecteurs de sorte que la viabilité cellulaire soit sensiblement équivalente lors d'un stockage de la composition lyophilisée à 4°C et à 25°C, ceci sur plusieurs mois de stockage, par exemple trois mois de stockage à ces températures respectives.
Parmi les bactéries lactiques convenant pour la présente invention, on peut citer : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helviticus Lactobacillus jugurti, Lactobacillus kefir, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactocococcus lactis subsp. cremoris Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostroc mesenteroides subsp. cremoris, Leucoconostoc mesentoroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc lactis, Oenococcus oeni, Streptococcus thermophilus, Streptococcus macedonicus.
Pour la mise en œuvre du procédé de préparation d'une composition lyophilisée contenant des bactéries lactiques défini ci- dessus, le concentré bactérien fermenté de départ contient de préférence entre 108 et 1011 bactéries lactiques viables par millilitre.
Les durées des étapes (b1) à (b3) de l'étape b) du procédé peuvent aisément être adaptées par l'homme du métier au vu de ses connaissances techniques générales dans le domaine de la congélation et de la lyophilisation.
Il est montré selon l'invention qu'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus présentait des caractéristiques améliorées de viabilité et d'activité acidifiante des bactéries lactiques qu'elle contient, lors d'un stockage pendant plusieurs mois, notamment pendant trois mois, à une température (Ts) élevée, notamment de 25°C. La viabilité des bactéries lactiques est directement liée à leur activité acidifiante (Fonseca et al., 2001). L'activité des bactéries lactiques est estimée de préférence par leur capacité à acidifier un milieu de culture est inoculé par un échantillon de la composition lyophilisée selon l'invention. La perte de viabilité des bactéries lactiques peut alors être exprimée comme la perte de l'activité acidifiante d'un échantillon d'un poids déterminé d'une composition lyophilisée selon l'invention, en premier lieu à l'issue de l'étape b) de lyophilisation, puis ultérieurement en fonction de la durée de stockage à une température prédéterminée, comme cela est montré dans les exemples.
On considère que la vitesse de perte d'activité acidifiante (K) lors du stockage de la composition lyophilisée doit être la plus faible possible :
- une valeur de K égale à 0 min/jour est accessible lors des stockages à 4°C comme à 25°C, si les critères définis selon l'invention sont respectés;
- une valeur de K comprise entre 0,5 à 2 min/jour est acceptable, surtout dans des cas de souches sensibles et/ou difficiles à protéger. Elles sont observées tant à 4°C qu'à 25°C, si les critères définis selon l'invention sont respectés;
- des valeurs de K supérieures à 2 min/jour ne sont jamais observées si les critères définis selon l'invention sont respectés, alors qu'elles sont très fréquentes dans les autres situations.
La présente invention est aussi illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre les courbes d'évolution de l'activité acidifiante, observées pour la souche Lactobacillus acidophilus dans différentes conditions. L'axe des ordonnées représente le temps nécessaire pour que le milieu de culture de référence atteigne un pH de 5,5. Le temps correspond à l'activité acidifiante du concentré bactérien testé tel que définie par le protocole mis en oeuvre. L'axe des abscisses représente le temps de stockage de la composition lyophilisée selon l'invention, exprimé en jours.
La perte d'activité est traduite par l'augmentation du temps nécessaire pour qu'une culture, en conditions standards, atteigne un pH de 5,5. La courbe avec les symboles en losanges pleins représente les mesures réalisées sur une composition lyophilisée selon l'invention conservée à la température de 4°C.
La courbe avec les symboles en carrés pleins représente les mesures réalisées sur une composition lyophilisée selon l'invention conservée à la température de 25°C.
La courbe avec les symboles en triangles pleins représente les mesures réalisées sur une composition lyophilisée selon l'invention conservée à la température de 37°C. La pente des droites obtenues pour chacune des trois températures de stockage traduit la vitesse de perte d'activité acidifiante (K). Leurs valeurs respectives, dans l'exemple représenté, sont de 0, 0,46 et 2, 08 min/jour.
La Figure 2 illustre les valeurs des vitesses de perte d'activité acidifiante (K) observées lors du stockage des compositions lyophilisées décrites dans les exemples 1 à 4. L'axe des abscisses représente la valeur de la différence entre la température de transition vitreuse (Tg) et celle de la température de stockage (Ts), exprimée en degrés Celsius. L'axe des ordonnées représente la vitesse de perte d'activité acidifiante, exprimée en valeur normalisée pour chaque souche (K/Kmax). EXEMPLES Méthodes générales
Des illustrations de l'invention sont présentées dans les exemples 1 à 5. Les résultats correspondants ont été obtenus avec quatre souches de bactéries lactiques différentes. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus est une bactérie lactique thermophile très utilisée, notamment en fabrication de yaourt et bien connue pour sa résistance limitée aux traitements de conservation. Lactobacillus acidophilus est également thermophile. Elle est utilisée dans les préparations laitières fermentées comportant des probiotiques. Lactococcus lactis subsp. lactis est une bactérie mésophile, principalement impliquée dans l'élaboration des fromages. Enfin, Lactobacillus paracasei est une bactérie mésophile, utilisée dans divers produits dont les préparations laitières fermentées comportant des probiotiques et les produits végétaux fermentes. Par la diversité des souches étudiées dans ces 5 exemples, il est considéré que tout le champ des bactéries lactiques est couvert par l'invention.
Les bactéries sont produites par fermentation, avec régulation du pH par apport de soude 10M, dans des conditions de culture précisées pour chaque cas. Les cellules sont concentrées et conditionnées dans différents milieux de lyoprotection dont la composition est décrite dans chaque exemple. La formule finale du produit avant lyophilisation est la suivante :
• Culot de bactéries lactiques centrifugé (environ 14 à 17% de matières sèches)
" Milieu fermenté (surnageant de fin de culture) (environ 5 à 7,5 % de matières sèches)
• Milieu lyoprotecteur (environ 5 à 6 % de matières sèches), avec ou sans antioxydant, contenant des maltodextrines et comportant du maltotriose, du maltose, du glucose ou du glycérol, en proportions variables.
Le même cycle de lyophilisation, dit de référence, est appliqué dans chaque exemple. Après une congélation sur une plaque refroidie à -
65°C, la lyophilisation comprend une phase de dessiccation primaire, à une pression de 40 Pa et une température de plaque de 20°C. Cette phase est suivie d'une dessiccation secondaire d'une durée de 6 heures, à une température de plaque de 25°C et une pression totale finale de 13 Pa. Dans ces conditions, le produit final atteint une activité de l'eau d'environ 0,1. Les effets décrits dans les exemples se basent sur la comparaison de l'activité biologique des suspensions cellulaires. La méthode de mesure de cette activité biologique est décrite ci-dessous. Les méthodes de caractérisation physique des échantillons (mesure de la température de transition vitreuse et mesure de l'activité de l'eau) sont également présentées.
Méthode de caractérisation de l'activité biologique des bactéries lactiques
La détermination de l'activité biologique des bactéries lactiques aux différentes étapes de leur production et au cours de leur stockage est importante pour caractériser leur résistance à ces traitements. Cette activité biologique est souvent associée à l'activité acidifiante, qui constitue la fonction technologique la plus importante des bactéries lactiques et qui exprime l'ensemble de leur métabolisme. Cette activité biologique est déterminée ici à l'aide de la méthode proposée par (Fonseca et al. 2000). La méthode consiste à mesurer le temps nécessaire au ferment incubé dans du lait, dans des conditions standardisées, pour atteindre un pH prédéterminé, par exemple de 5,5. Cette mesure est réalisée après congélation et après lyophilisation, ce qui permet, par différence, de déterminer la perte d'activité intervenue lors de la lyophilisation (notée dtl, en min). Des mesures sont réalisées après différentes durées de stockage isotherme sous forme lyophilisée. Au cours du stockage, la méthode propose de déterminer la vitesse de perte d'activité acidifiante (K, en min/j) (Fonseca et al. 2000). A titre d'exemple, la figure 1 illustre les pertes d'activité acidifiante observées pour la souche Lactobacillus acidophilus dans différentes conditions.
Caractérisation des propriétés physiques des suspensions cellulaires L'activité de l'eau et la température de transition vitreuse sont les deux principales propriétés physiques des suspensions cellulaires concentrées lyophilisées traduisant leur stabilité.
L'activité de l'eau des échantillons lyophilisés et la température de transition vitreuse (Tg) sont mesurées comme indiqué précédemment.
Exemple 1 : Effet de l'antioxydant sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactobacillus acidophilus A. Matériel et Méthodes
Souche ; Lactobacillus acidophilus CF1 (INRA, Grignon) Conditions de culture : température = 42°C et pH = 6,3 Tableau 1 : Composition et caractéristiques . des milieux lyoprotecteurs finaux (en g/L :
Figure imgf000022_0001
B. Résultats Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 Effet de l'addition d'un anti-oxydant sur la perte d'activité acidifiante intervenue lors de la lyophilisation (dtl, en min) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/jour).
Figure imgf000022_0002
Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses) Selon le tableau 2, pour L. acidophilus, l'ajout d'un anti-oxydant limite la perte d'activité acidifiante en cours de lyophilisation (dtl) et réduit la vitesse de perte d'activité acidifiante lors du stockage sous forme lyophilisée (K). Les deux anti-oxydants utilisés protègent les cellules de façon sensiblement équivalente.
La conservation à basse température (4°C) est toujours plus favorable. Toutefois, les résultats montrent qu'il est possible de conserver les concentrés bactériens lyophilisés à 25°C si le milieu contient un anti- oxydant (ascorbate ou erythorbate) : la perte d'activité est alors équivalente à celle observée à 4°C en absence d'anti-oxydant. Par contre, à 37°C, la perte d'activité est trois à cinq fois plus rapide qu'à 25°C.
Exemple 2 : Effet de la température de transition vitreuse (Tg) sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactobacillus bulgaricus
A. Matériel et Méthodes
Souches : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 (INRA, Grignon) Conditions de culture : pH = 5,5 ; température = 42°C
Tableau 3 : Composition et caractéristiques des milieux lyoprotecteurs finaux (en g/L) :
Figure imgf000024_0001
Les températures de transition vitreuse (Tg) des 3 milieux sont différentes selon qu'ils comportent du maltose, du glucose ou du glycérol. Ces résultats sont en accord avec les valeurs de Tg de chacune de ces molécules pures : Tg maltose ≈ 87°C, Tg glucose = 38°C et Tg glycérol = -90°C (Roos 1997) ; (Bandhari and Howes 1999). Les moindres écarts observés pour les trois milieux sont liés à la présence des autres composés du mélange (apportés notamment par le surnageant) qui tendent à réduire les différences.
B. Résultats Tableau 4. Effet de la température de transition vitreuse du milieu sur la perte d'activité acidifiante intervenue lors de la lyophilisation (dtl, en min) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/jour).
Figure imgf000025_0001
Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses)
Figure imgf000025_0002
Les résultats correspondent à la moyenne de 2 mesures indépendantes.
Le tableau 5 montre, pour L. bulgaricus, que la température de transition vitreuse du milieu de lyoprotection n'influe par sur la perte d'activité acidifiante lors de la lyophilisation (dtl). Par contre, on observe un effet de la Tg du milieu de conditionnement sur K. Lors du stockage à 4°C ou à 25°C, il n'y a pas de différence d'efficacité entre les milieux comportant du glucose et du maltose. Aucune perte d'activité n'est observée. On peut choisir indifféremment l'une des deux molécules. En revanche, quelle que soit la température de stockage considérée, le glycérol n'est pas un bon stabilisateur de produits lyophilisés, en raison de sa capacité trop importante à mobiliser l'eau. Pour les milieux additionnés de glucose et de maltose, le maintien de l'activité est équivalent aux températures de stockage de 4°C et 25°C. D'après le tableau 5, l'écart Tg-Ts entre la Tg du mélange final et la température de stockage (Ts) est suffisamment grand (compris entre 20°C et 50°C) aux températures de 4°C et 25°C. Un tel écart paraît donc nécessaire pour assurer une bonne stabilité au stockage des bactéries pendant plusieurs mois. A une température de stockage de 37°C, les écarts (Tg-Ts) ne sont plus que de 10°C à 15°C et demeurent insuffisant pour assurer la stabilité biologique du produit.
Exemple 3 : Effet de l'activité de l'eau sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactobacillus bulgaricus A. Matériel et Méthodes
Souche utilisée : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 (INRA, Grignon)
Conditions de culture : température = 42°C et pH = 5.5
La composition et les caractéristiques des milieux lyoprotecteurs finaux sont identiques à ceux cités dans l'exemple 2.
Deux cycles de lyophilisation différents sont conduits afin d'obtenir deux valeurs finales distinctes d'activité de l'eau. Le cycle dit de référence permet d'atteindre une activité d'eau faible (aw de l'ordre de 0,1) dans la composition lyophilisée finale. Avec des conditions opératoires assurant une dessiccation secondaire moins poussée (durée totale de 2 heures, température de plaque de 20°C et une pression totale de 40 Pa), le produit atteint une activité de l'eau d'environ 0,3.
Tableau 6 : Propriétés physiques d'une, composition lyophilisée selon deux cycles de lyophilisation
Figure imgf000026_0001
Ainsi, pour un milieu donné, la température de transition vitreuse diminue de façon significative lorsque l'aw augmente, ce qui correspond à l'effet plastifiant de l'eau. Toutefois, les deux milieux, contenant du maltose et du glucose, présentent des Tg finales jugées peu différentes, compte- tenu de l'étalement de l'épaulement observé en milieu complexe.
B. Résultats
Tableau 7. Effet de l'activité de l'eau du milieu sur la perte d'activité intervenue lors de la lyophilisation (dtl) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/jour).
Figure imgf000027_0001
Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes, (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses) Tableau 8. Différence entre la température de transition vitreuse (Tg) des milieux de lyoprotection et la température de stockage (Ts) : Tg-Ts (°Q
Figure imgf000027_0002
Les résultats correspondent à la moyenne de 2 mesures indépendantes.
D'après le tableau 7, pour L. bulgaricus, l'activité de l'eau du mélange final influe sur la perte d'activité acidifiante lors de la lyophilisation (dtl). L'activité acidifiante des cellules lyophilisées selon le cycle 2 (aw = 0,3) est meilleure que celle des bactéries traitées selon le cycle 1 (aw = 0,1) : Un gain est de 30 min, pour atteindre pH 5,5, est observé. Ainsi, la réduction de la durée et de la température de plaque lors de la dessiccation secondaire induiraient une moindre dégradation cellulaire et donc, une meilleure résistance des bactéries à la lyophilisation.
Par contre, la vitesse de perte d'activité acidifiante (K) est plus faible si l'aw du milieu est de 0,1 (cycle 1) au lieu de 0,3 (cycle 2). Cela indique qu'une faible aw est nécessaire au maintien de l'activité acidifiante au cours du stockage. Il faut préciser ici que, bien qu'une aw de 0,3 induit une meilleure stabilité biologique après lyophilisation, c'est l'aw de 0,1 qui est la plus favorable au maintien de l'activité lors du stockage. Par exemple, après 4 semaines d'un stockage à 25°C, les concentrés bactériens caractérisés par une aw de 0,3 présentent une activité très inférieure à l'activité initiale mesurée sur les échantillons définis par une aw de 0,1. Le maintien d'une activité de l'eau faible (aw = 0,1) permet d'augmenter suffisamment les valeurs des températures de transition vitreuse des mélanges lyoprotecteurs de sorte que les températures de conservation de 4°C et de 25°C donnent des résultats équivalents au cours du stockage (écart Tg-Ts supérieur à 20°C, tableau 8) c'est à dire une absence quasi-totale de perte d'activité biologique pendant trois mois de stockage. En revanche, lorsque l'écart entre Tg et Ts tombe au- dessous de 20°C (aw = 0,1 et Ts = 37°C ou aw = 0,3 et toutes les valeurs de Ts), l'activité acidifiante se dégrade de façon significative.
Exemple 4 : Effet de la différence entre la température de transition vitreuse et la température de stockage sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactococcus lactis subsp. lactis A. Matériel et Méthodes
Souche : Lactococcus lactis CFL4 (INRA, Grignon) Conditions de culture : pH = 6,0 et température = 30°C Tableau 9 : Composition et caractéristiques des milieux lyoprotecteurs finaux (en g/L) :
Figure imgf000029_0001
B. Résultats
Tableau 10. Tableau 10. Effet de la température de transition vitreuse du milieu sur la perte d'activité intervenue lors de la lyophilisation (dtl) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/jour).
Figure imgf000029_0002
Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes, (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses)
Tableau 11. Différence entre la température de transition vitreuse (Tg) des milieux de lyoprotection et la température de stockage (Ts) : Tg-Ts (°C)
Figure imgf000030_0001
Les résultats correspondent à la moyenne de 2 mesures indépendantes.
Selon le tableau 11 , pour L. lactis, les écarts importants Tg-Ts (supérieurs à 20°C) observés à 4°C et à 25°C expliquent la bonne résistance des cellules à ces deux températures de stockage (tableau 10). A 37°C, avec un écart Tg-Ts inférieur à 20°C, la perte d'activité acidifiante est rapide, quel que soit le milieu considéré.
Les valeurs des vitesses de perte d'activité acidifiante, observées lors du stockage sous forme lyophilisée dans les exemples 1 à 4, sont représentées à la figure 2 en fonction de l'écart Tg-Ts. Les vitesses ont été représentées en valeur normalisée pour chaque souche (K/Kmax pour chaque souche), afin de comparer les résultats obtenus pour les trois bactéries lactiques étudiées (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus et Lactococcus lactis subsp. lactis), et ce pour deux activités d'eau finales différentes (aw = 0,1 ou 0,3, soit deux cycles de lyophilisation différents), et à trois températures de stockage à l'état lyophilisé considérées (4°C, 25°C et 37°C). Il apparaît clairement que la température de transition vitreuse du mélange final (Tg), résultant de la formulation et de la conduite du procédé, permet de définir la température maximale de stockage (Ts). Pour obtenir une bonne stabilité des bactéries lactiques concentrées lyophilisées à température élevée, cette température de stockage doit être inférieure de 20°C à la température de transition vitreuse du produit lyophilisé.
Enfin, la comparaison des résultats obtenus sur le milieu A (contenant du maltose), à une activité de l'eau de 0,1 et avec les trois bactéries lactiques étudiées, confirme l'existence de différences importantes de comportement selon l'espèce considérée. Ainsi, la perte d'activité acidifiante intervenue lors de la lyophilisation varie de 7 min pour L. acidophilus à 21 min pour L. lactis et à 169 min pour L. bulgaricus. Lors du stockage sous forme lyophilisée, la vitesse de perte d'activité acidifiante diffère peu à 4°C et à 25°C (de 0 min/j à 1 ,78 min/j selon la bactérie considérée) mais beaucoup à 37°C (de 1,76 min/j à 12,63 min/j) (tableaux 4, 7 et 10). Dans tous les cas, L. bulgaricus est la bactérie la plus sensible aux traitements de conservation. Ces différences mettent en exergue la nécessité de déterminer, pour chaque espèce de microorganisme, les conditions à mettre en œuvre lors de leur lyophilisation : formulation du milieu de lyoprotection, conditions opératoires de la phase de dessiccation secondaire et température maximale de stockage. Cependant, les conditions préconisées par l'invention (écart Tg-Ts supérieur à 20°C) permettent, dans tous les cas, de réduire les effets de la variabilité biologique.
Exemple 5 : Effet des conditions opératoires lors de la dessiccation primaire au cours de la lyophilisation sur la conservation à l'état lyophilisé de souches de Lactobacillus
A. Matériel et Méthodes
Souches : Lactobacillus paracasei CFP1 (INRA, Grignon)
Conditions de culture : pH = 6,0 et T = 37°C Conditions de cryoprotection : Milieu A
Conditions de lyophilisation : Deux couples de 'température de plaque et pression totale' lors de l'étape de dessiccation primaire sont testées, à savoir :
T1 = + 20°C / P1 = 40 Pa T2 = -10°C / P2 = 15 Pa. Les conditions de dessiccation secondaire sont les mêmes pour les deux cycles (25°C et 13 Pa) et les propriétés physiques des compositions lyophilisées finales sont voisines (Tg de 45 °C ± 2°C). La durée totale du cycle de lyophilisation varie peu, de l'ordre de 13h00 à 15h00 selon les conditions opératoires.
B. Résultats
Tableau 12. Effet des conditions opératoires lors de la dessiccation primaire sur les pertes d'activité intervenues lors de la lyophilisation (dtl, en min) et lors du stockage sous la forme lyophilisée au bout 30 jours à
Figure imgf000032_0002
Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses).
Selon le tableau 12, l'abaissement des valeurs de température de plaque (de +20°C à -10°C) et de pression totale (de 40 Pa à 15 Pa) au cours de la phase de dessiccation primaire de la lyophilisation, permet de réduire significativement la perte d'activité liée à la lyophilisation (écart de 40 minutes).
La perte d'activité au cours du stockage à 25°C pendant 30 jours diminue également de manière significative (écart de 30 min) lorsque l'on abaisse le couple des valeurs de température de plaque et de pression totale lors de l'étape de dessiccation primaire. Le choix d'un couple « température de plaque et pression totale » à des valeurs peu élevées (conditions douces) conduit à un meilleur respect de la qualité du matériau biologique, en raison du ralentissement des cinétiques de réaction pendant toute la durée de la dessiccation primaire (plusieurs heures). De plus, comme évoqué pour la stabilité au cours du stockage du produit lyophilisé, le maintien au dessous de la température de transition vitreuse de l'ensemble de la couche congelée au cours de la dessiccation primaire est également une condition favorable à la stabilité du produit dès le processus de lyophilisation. En conclusion, des conditions opératoires douces de température de plaque et de pression totale peuvent améliorer la stabilité au stockage.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation reproductible d'une composition lyophilisée contenant des bactéries viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à une température de stockage (Ts) élevée prédéterminée, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant :
(i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles ; et
(ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé; b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques lioprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes de lyophilisation suivantes : (b1) congélation du concentré de bactéries ;
(b2) dessication primaire, de préférence dans des conditions opératoires douces ;
(b3) dessication secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20°C à la température de stockage (Ts) prédéterminée.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape (b3) de dessiccation secondaire est réalisée à une température d'environ 25°C à une pression d'environ 13 Pa.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape (b1) de congélation est réalisée à une température d'environ -65°C.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape (b2) de dessiccation primaire est réalisée à une température de -20°C à 20°C de préférence de -15°C à - 5°C, d'une part, et à une pression totale de 5 à 50 Pa, de préférence 10 à 20 Pa, d'autre part.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le composé antioxydant hydrosoluble, ou l'association de composés antioxydants hydrosolubles, est présent dans la solution liquide de départ à une concentration comprise entre 1 et 20 g/L, de préférence entre 5 et 15 g/L.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le(s) composé(s) antioxydant(s) est (sont) choisi(s) parmi l'acide ascorbique et les ascorbates, l'acide erythorbique, l'acide citrique et les citrates, la cistéine, les gallates, le mannitol, les tocophérols, la vitamine E et Trolox, le butylhydroxyanisole (BHT), le butylhydroxytoluène.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la nature et la préparation des composés augmentant la température de transition vitreuse dans la solution liquide de départ est ajustée de manière à ce que la composition lyophilisée finale ait une température de transition vitreuse (Tg) d'au moins 20°C, de préférence d'au moins 25°C, supérieure à la température de stockage (Ts).
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le(s) composé(s) augmentant la température de transition vitreuse est (sont) choisi(s) parmi les sucres tels que le glucose, le maltose, le lactose, le saccharose, le tréhalose et le maltotriose.
9. Composition lyophilisée contenant des bactéries lactiques viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à température élevée (Ts), caractérisée en ce que :
(a) elle comprend au moins un composé antioxydant hydrosoluble ;
(b) elle comprend au moins deux composés lyoprotecteurs augmentant la température de transition vitreuse telle que la température de transition vitreuse (Tg) de ladite composition est supérieure d'au moins 20°C la température de stockage (Ts);
(c) ladite composition à une valeur d'activité de l'eau d'environ 0,1.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la perte d'activité acidifiante des bactéries lactiques de départ exprimée en vitesse de perte d'activité acidifiante lors du stockage (K, en minute(s)/jour), est égale ou inférieure à 2 min/jour pour un stockage jusqu'à 25°C.
11. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la perte d'activité acidifiante des bactéries lactiques de départ, exprimée en vitesse de perte d'activité acitifiante lors du stockage (K, en minute(s)/jour), est d'environ 0,5 à 2 min/jour pour un stockage jusqu'à 25°C.
12. Concentré de bactéries lactiques susceptible d'être utilisé dans l'industrie laitière, caractérisé en ce qu'il comprend une composition selon l'une des revendications 9 à 11.
13. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 9 à 11 dans un procédé de fermentation.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisé en ce que le procédé de fermentation implique la production d'acide lactique.
15. Utilisation d'une composition selon l'une des revendications 9 à 11 pour la transformation de produits laitiers, de végétaux, de produits carnés et de produits vinicoles, par fermentation.
16. Utilisation d'une composition lyophilisée selon l'une des revendications 9 à 11 pour la préparation d'une composition de complément alimentaire ou alicament.
17. Utilisation d'une composition lyophilisée selon l'une des revendications 9 à 11 pour la préparation d'un médicament..
18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que les bactéries lactiques contenues dans ladite composition lyophilisée ont été transformées avec un acide nucléique permettant l'expression d'un gène d'intérêt thérapeutique par ces bactéries.
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