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WO2003012447A2 - Nachweis lebender mikroorganismen, eukaryotischer zellen oder organellen - Google Patents

Nachweis lebender mikroorganismen, eukaryotischer zellen oder organellen Download PDF

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WO2003012447A2
WO2003012447A2 PCT/DE2002/002702 DE0202702W WO03012447A2 WO 2003012447 A2 WO2003012447 A2 WO 2003012447A2 DE 0202702 W DE0202702 W DE 0202702W WO 03012447 A2 WO03012447 A2 WO 03012447A2
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WO
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magnetizable particles
organelles
sensor
eukaryotic cells
microorganisms
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PCT/DE2002/002702
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Rainer FELDBRÜGGE
Christiane Zaborosch
Andreas Katerkamp
Maik Brinkmann
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Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
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Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)

Definitions

  • the invention relates to a device and a
  • Method for the detection of living microorganisms, eukaryotic cells or organelles in a sample volume which is particularly suitable for the detection of living cells of the genus Salmonella. It should also be possible to detect metabolically active cell components.
  • this object is achieved with a device having the features of claim 1 and a method with the features of claim 16.
  • magnetizable particles on the surface thereof are placed in a sample volume, which can be, for example, a certain amount (mass or volume) of a sample in a suitable medium, for example a nutrient liquid the particular microorganisms, eukaryotic cells or organelles to be detected are bound specific binding molecules.
  • a suitable medium for example a nutrient liquid
  • the magnetizable particles contained in the respective sample volume should, for example, be brought into contact with the microorganisms, eukaryotic cells or organelles which may be present in the sample volume and bound to the magnetizable particles with the aid of the appropriately selected binding molecules.
  • the magnetizable particles from the sample volume can then be locally concentrated on the permanent magnet or electromagnet using a permanent magnet or electromagnet.
  • the metabolic activity of the microorganisms, eukaryotic cells or organelles which may be present can then be detected with at least one suitable sensor.
  • at least one sensor is selected with which a substance concentration that can be changed depending on the metabolism can be determined.
  • magnetizable particles consisting predominantly of a polymer, e.g. Polystyrene and in addition to ensure the magnetizable properties magnetite with a proportion between 20 and 70% can be used. In addition to these super-paramagnetic substances, particles with ferromagnetic properties can also be used.
  • specific binding molecules for example mono- or polyclonal antibodies, DNA or RNA fragments, biotin, avidin and others which are known in immunotechnology, can be used.
  • one type of specific binding molecule or two or more such types can be used at the same time for detection.
  • the magnetizable particles and consequently also on the microorganisms, eukaryotic cells or organelles present in the sample, with the help of the specific binding molecules, can be concentrated locally by means of the electromagnetic or magnetic forces.
  • the metabolic activity should be carried out with at least one suitable sensor by measuring a metabolically dependent, variable substance concentration in the immediate vicinity of the locally concentrated, magnetizable particles.
  • a suitable sensor for measuring a metabolically dependent, variable substance concentration in the immediate vicinity of the locally concentrated, magnetizable particles.
  • the actual detection of living microorganisms, eukaryotic cells or organelles can also be carried out outside the sample volume.
  • Liquid sample volumes containing organelles are discharged from a vessel or container via a channel and passed past the permanent magnet or electromagnet, the local concentration being achieved when the liquid sample volume flows past the permanent magnet or electromagnet can.
  • Such a rinsing solution should contain at least one substance required for the metabolism of the respective microorganisms or cells and, if appropriate, also additional oxygen. Suitable substances are, for example, peptone, glucose, yeast or malt extract, which can each be contained alone or as a mixture in a rinsing solution.
  • the rinsing solution should be directed as directly as possible to the locally concentrated magnetizable particles, but at least in the vicinity thereof.
  • the rinsing solution can also contain a medium that is selective for these cells and with which other cells are suppressed.
  • the area should not be larger than 10 mm 2 , which can be achieved by appropriate selection and design of the permanent magnet or electromagnet used. Smaller areas in the range ⁇ 0.5 mm 2 are favorable.
  • eukaryotic cells or organelles For the detection of living microorganisms, eukaryotic cells or organelles, which is checked by Whether these are metabolically active, different sensors can be used alone or in combination.
  • the oxygen and the CO 2 concentration can be determined.
  • glucose consumption or a lactate sensor can also be used. Under certain circumstances, however, it is also possible to determine the correspondingly changing pH value.
  • a potentiometrically measuring C0 2 sensor can advantageously be used.
  • Oxygen-sensitive sensors in which a membrane contains a fluorescent substance whose fluorescence intensity changes as a function of the oxygen concentration are particularly suitable.
  • Such sensors also referred to as optodes, are known from the prior art and are e.g. described in DE 198 31 770.0 with a special embodiment of such a membrane.
  • the membranes of these sensors are irradiated with a suitable light for fluorescence excitation and thereby the ruthenium complexes usually used, and fluorescence is excited.
  • the fluorescence intensity decreases with increasing oxygen concentration in the immediate vicinity of such a membrane.
  • the oxygen concentration can be deduced from the fluorescence intensity detected with a suitable optical sensor.
  • the excitation and the actual fluo- Resence light directed onto the membrane and the optical detector via optical fibers, such light guidance also being possible via a single optical fiber.
  • At least one optical fiber can be arranged under the membrane, that is, between the membrane and permanent magnets or electromagnets, with light inlet and outlet openings below the membrane on the opposite side, on which the magnetizable particles are locally concentrated are arranged.
  • a membrane can advantageously be enclosed in the wall of a vessel containing the sample volume and thus represent part of the vessel wall.
  • the local concentration of the magnetizable particles is carried out with a movement of a permanent magnet or electromagnet towards the outside of the membrane and the permanent or electromagnet is held there.
  • the membrane separates the possibly critical sample volume and the magnet, so that contamination of the permanent magnet or electromagnet can be prevented.
  • the vessel can then be designed such that a supply for rinsing solution can be connected and also at least one optical fiber via the
  • Fluorescence excitation light directed into the correspondingly sensitive membrane and the excited fluorescence light can be guided to an optical detector can also be applied from the outside. This also applies to any additional mirrors or lenses that may be used. With such a design of a device according to the invention, it is possible to dispose of the vessels used for the detection with the appropriate means after a single use without any risk to the environment and consequently to use a new vessel for each individual detection.
  • the magnet or an electromagnet generally forms a flat surface, in which a groove can optionally also be formed, into which an optical fiber is inserted, and this surface is covered by the sensitive membrane, it is advantageous to insert the light - And light exit surfaces of the optical fiber (s) to be designed as inclined surfaces in order to direct the excitation light emerging from the optical fiber onto the sensitive membrane and from there to be able to couple the fluorescent light into an optical fiber.
  • the light can also be directed to such a sensitive membrane by means of a mirror and, if necessary, a focusing lens for each optical fiber, or fluorescent light emitted from there can be coupled into an optical fiber.
  • the oxygen-sensitive membrane can be used to indirectly detect products arising from the metabolism of microorganisms, eukaryotic cells or organelles that are enzymatically converted with an oxidoreductase membrane outside the microorganisms, eukaryotic cells or organelles using oxygen.
  • a changing oxygen concentration depending on the metabolism can also be determined amperometrically.
  • an oxygen-permeable membrane instead of the membrane containing a fluorescent substance, an oxygen-permeable membrane can be used, which separates the locally concentrated magnetizable particles and a unit containing two electrodes and an electrolyte, and in which the electrical flowing between the electrodes via the electrolyte separates Current changes depending on the oxygen passing through the oxygen-permeable membrane.
  • Magnetizable particles with a maximum diameter of 5000 ⁇ m, preferably in the range between 2 and 3 ⁇ m, can be used for the detection. Concentrations of magnetizable particles in the range between 0.1 ⁇ g / ml and a maximum of 100 mg / ml, preferably up to 10 mg / ml, should be maintained in the defined sample volume.
  • magnetizable particles or these are deposited on the previously locally concentrated magnetizable particles, to which microorganisms or cells may be bound, and form a diffusion barrier for the concentration-changing substance (e.g. oxygen), the diameter of these magnetizable particles being adjusted due to the function can be. Diameter fractions of such magnetizable particles with different diameters can also be used for this purpose make sense.
  • concentration-changing substance e.g. oxygen
  • Specific antibodies can be bound to the magnetisable particles and mono- or polyclonal Salmonella antibodies for the detection of cells of the genus Salmonella can be bound to the magnetisable particles for the use of the invention mentioned as preferred. With the solution according to the invention, such cells can be detected reliably and in a significantly shorter time. The very rapidly progressing cell division and consequently the relatively rapid increase in the number of metabolically active Salmonella have a particularly favorable effect.
  • the locally concentrated magnetizable particles can be resuspended and the process repeated with these magnetizable particles from the sample volume, by reconnecting microorganisms, eukaryotic cells or organelles.
  • the detection can also be carried out in such a way that microorganisms, eukaryotic cells or organelles which may be present in a sample volume absorb a substance which is enzymatically broken down in the cells and thereby becomes polar.
  • This substance as a metabolic product formed inside cells, can then be excited with electromagnetic waves, so that excited fluorescent light can be optically detected. Since a corresponding enzymatic breakdown can only be carried out by metabolically active, ie living microorganisms, eukaryotic cells or organelles, this procedure is also suitable for the detection.
  • appropriately suitable substances in which fluorescence can be excited can also be fixed on the surface of the magnetizable particles, and after irradiation with electromagnetic waves suitable for fluorescence excitation, the fluorescent light can be detected with an optical sensor and, if necessary, used as a reference signal become.
  • Figure 1 shows an example of a device according to the invention in two views in schematic form.
  • FIG. 1 shows in schematic form two views of an example of a device according to the invention.
  • the oxygen concentration which changes depending on the metabolism, is measured.
  • a sample volume 2 is contained in a vessel 1.
  • magnetizable particles were bound to the specific binding molecules for the microorganisms to be detected, eukaryotic cells or organelles, for example Salmonella antibodies.
  • the sample volume 2 was then stirred, which can be done in a form not shown by simply moving it back and forth or rotating about an axis of the vessel 1.
  • An oxygen-sensitive membrane 4 is enclosed in the wall of the vessel 1. Binding can be done by gluing, welding to the vessel wall or by appropriately sealed clamp connections. A suitable fluorescent substance, for example a ruthenium complex known for this purpose, is contained in the oxygen-sensitive membrane 4. One side of the oxygen-sensitive membrane 4 is in contact with the sample volume 2. After a certain predeterminable time and proper mixing of the magnetizable particles in the sample volume 2, a local concentration of the magnetizable particles on the oxygen sensor becomes
  • Membrane 4 is carried out by appropriate movement of the permanent magnet 3, as indicated by the double arrow, and the permanent magnet 3 touches the outer side of the oxygen-sensitive membrane 4 or is held at a small distance from the membrane 4.
  • the magnetizable particles are locally concentrated on the surface of the oxygen-sensitive membrane 4 arranged opposite the permanent magnet 3.
  • oxygen is consumed by the metabolism. This oxygen consumption increases successively by increasing the number of cells due to cell division and by measuring the correspondingly changing oxygen concentration, the detection of living microorganisms, eukaryotic cells or organelles can be carried out.
  • organelles e.g. Salmonella
  • monochromatic light from a light source (not shown) is directed through the optical fiber 6 onto the oxygen-sensitive membrane 4, various alternatives having been mentioned in the general part of the description.
  • This excitation light excites fluorescent light in the oxygen-sensitive membrane 4 and the intensity. changed this fluorescent light as a function of the oxygen concentration in the immediate vicinity of the oxygen-sensitive membrane 4, that is to say where the magnetizable particles with the living microorganisms, eukaryotic cells or organelles possibly bound to them have been concentrated locally.
  • the fluorescent light can be directed through an optical fiber 6 but also through an additional optical fiber (not shown) to an optical sensor.
  • the fluorescence intensities measured with this optical sensor can then be evaluated in a wide variety of ways in order to determine the respective eukaryotic effects, as a result of the metabolism of the microorganisms
  • the changing fluorescence intensity can be used directly for this.
  • the phase shift which changes as a function of the instantaneous oxygen concentration, in the case of frequency-modulated excitation light between the light used for the fluorescence excitation and the fluorescence light, or the decay behavior of the fluorescence light in the case of, for example, pulsed fluorescence excitation.
  • a rinsing solution can be fed directly to the locally concentrated magnetizable particles on the oxygen-sensitive membrane 4 via a supply line 5, a rinsing solution as mentioned in the general part of the description being able to be used.
  • the measurement of the oxygen concentration can be carried out continuously, but also in more or less large time intervals.
  • a membrane filter 7 To avoid Contamination can be provided in the feed line 5, a membrane filter 7.
  • a corresponding device can be arranged in a conventional incubator or an appropriately temperature-controlled vessel 1 can be used.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren für de n Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen. Die Erfindung ist insbesondere für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmonella geeignet. Mit der Erfindung soll eine Nachweismöglichkeit für lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen geschaffen werden, bei der der Zeit- und Kostenaufwand, bei gleichzeitig guter Nachweisgenauigkeit verringert werden kann. Zur Lösung dieser Aufgabe werden magnetisierbare Partikel verwendet, an deren Oberfläche für mindestens Mikroorganismus, eukaryotische Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind. Die magnetisierbaren Partikel werden in das Probenvolumen zu einer lokalen Konzentration mit Hilfe eines Permanent- oder Elektromagneten gegeben und für den Nachweis mindestens ein Sensor zur Bestimmung von sich stoffwechselabhängig veranderbaren Stoffkonzentrationen oder der Bildung von Stoffwechselprodukten in den Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen verwendet.

Description

Vorrichtung und Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein
Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen, die insbesondere für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmonella geeignet ist. Es sollen außerdem stoffwechselaktive Zellkomponenten nachgewiesen werden können.
Solche Nachweisverfahren werden bisher nach § 35 LMBG der Bundesrepublik Deutschland bzw. ISO 6579 durchge- führt, wobei für die dabei durchzuführende Voranreicherung, selektive Anreicherung, Isolierung und Identifizierung ein Zeitraum von mehreren Tagen erforderlich ist und ein solches Vorgehen von sehr qualifiziertem Fachpersonal durchgeführt werden muss. Insbe- sondere diese lange Zeitdauer ist für viele Anwen- dungsbereiche, beispielsweise der Lebensmitteltechnik oder im Pharmaziebereich eigentlich nicht vertretbar.
Neben den hohen Kosten für die erforderliche Labor- technik müssen Fehler bei einigen Nachweisverfahren in Kauf genommen werden, da eine sichere Trennung in lebende bzw. tote Mikroorganismen oder Zellen nicht ohne weiteres erfolgen kann und demzufolge auch das unkritische Vorhandensein toter Mikroorganismen oder Zellen zu Fehlentscheidungen führt.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung eine Nachweismöglichkeit für lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen zu schaffen, bei der der er- forderliche Zeit- und Kostenaufwand, bei guter Nachweisgenauigkeit verringert werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit einer Vorrichtung, die die Merkmale des Anspruchs 1 und einem Ver- fahren, mit den Merkmalen des Anspruchs 16 gelöst.
•Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung können mit den in den untergeordneten Ansprüchen enthaltenen Merkmalen erreicht werden. Ein vorteilhafte Verwendung ist mit dem Anspruch 27 gege- ben.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen werden in ein Probenvolumen, das bei- spielsweise eine bestimmte Menge (Masse oder Volumen) einer Probe in einem geeigneten Medium, beispielsweise einer Nährflüssigkeit sein kann, magnetisierbare Partikel an deren Oberfläche für die jeweils nachzuweisenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, zugegeben. Die in dem jeweiligen Probenvolumen enthaltenen ma- gnetisierbaren Partikel sollten beispielsweise durch rühren mit den gegebenenfalls im Probenvolumen ent- haltenen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen in Kontakt gebracht werden und diese mit Hilfe der entsprechend ausgewählten Bindungsmoleküle an die magnetisierbaren Partikel gebunden.
Mit einem Permanentmagneten oder Elektromagneten können dann die magnetisierbaren Partikel aus dem Probenvolumen am Permanentmagneten oder Elektromagneten lokal konzentriert werden.
Im Nachgang zu dieser lokalen Konzentration kann dann mit mindestens einem geeigneten Sensor die Stoffwechselaktivität der gegebenenfalls vorhandenen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen nachgewiesen werden. Hierzu wird mindestens ein Sensor ausgewählt, mit dem eine sich stoffwechselabhängig veränderbare Stoffkonzentration bestimmt werden kann.
Es können an sich bekannte magnetisierbare Partikel, die überwiegend aus einem Polymer, z.B. Polystyrol und zusätzlich zur Sicherung der magnetisierbaren Eigenschaften Magnetit mit einem Anteil zwischen 20 und 70% enthalten, verwendet werden. Neben diesen super- paramagnetisehen Stoffen können auch Partikel mit ferromagnetischen Eigenschaften eingesetzt werden.
Je nach gewünschtem Nachweis können als spezifische Bindungsmoleküle, z.B. mono- oder polyklonale Antikörper, DNA- oder RNA-Fragmente, Biotin, Avidin und andere, die in der Immunotechnik bekannt sind, einge- setzt werden. So können bei einem Nachweis eine Art spezifischer Bindungsmoleküle aber auch zwei oder mehrere solcher Arten gleichzeitig eingesetzt werden.
Mit Hilfe eines Permanentmagneten oder Elektromagneten können die magnetisierbaren Partikel und demzufolge auch an die mit Hilfe der spezifischen Bindungsmoleküle, gegebenenfalls in der Probe vorhandene Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organel- len mittels der elektromagnetischen oder magnetischen Kräfte lokal konzentriert werden.
Für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen soll mit mindestens ei- nem geeigneten Sensor die Stoffwechselaktivität durch Messung einer sich stoffwechselabhängig veränderbaren Stoffkonzentration in unmittelbarer Nähe der lokal konzentrierten magentisierbaren Partikel durchgeführt werden. Hierzu ist es vorteilhaft, eine sensitive bzw. permeable Membran eines Sensors so anzuordnen und auszubilden, dass diese Membran zwischen den verwendeten Permanentmagneten oder Elektromagneten und der Fläche, auf der die magnetisierbaren Partikel lokal konzentriert sind, angeordnet ist.
Der eigentliche Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen kann auch außerhalb des Probenvolumens durchgeführt werden. Hierzu kann das die magnetisierbaren Partikel und gegebe- nenfalls Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder
Organellen enthaltene flüssige Probenvolumen aus einem Gefäß oder Behälter über einen Kanal abgelassen und am Permanentmagneten oder Elektromagneten vorbei geführt werden, wobei die lokale Konzentration beim Vorbeiströmen des flüssigen Probenvolumens am Permanentmagneten oder Elektromagneten erreicht werden kann .
Es besteht aber auch die Möglichkeit, den Permanentmagneten oder Elektromagneten im Nachgang zur lokalen Konzentration der magnetisierbaren Partikel aus dem Probenvolumen zu entfernen und die für den Nachweis erforderlichen Messungen außerhalb in einem gesonderten Gefäß oder Behältnis durchzuführen.
Ganz besonders vorteilhaft ist es, während der Messungen der Stoffwechselaktivitäten eine Spüllösung zuzuführen. Eine solche Spüllösung sollte mindestens einen für den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen oder Zellen erforderlich Stoff und gegebenen- falls auch zusätzlich Sauerstoff enthalten. Geeignete Stoffe sind beispielsweise Pepton, Glucose, Hefeoder Malzextrakt, die jeweils allein oder als Mischung in einer Spüllösung enthalten sein können. Die Spüllösung sollte möglichst unmittelbar auf die lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel zumindest jedoch in deren Nähe gerichtet werden. Für den Nachweis von Salmonellen kann in der Spüllösung auch ein für diese Zellen selektives Medium, mit dem andere Zellen unterdrückt werden, enthalten sein.
Für die lokale Konzentration der magnetisierbaren Partikel, an die gegebenenfalls lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen gebunden sind, sollte die Fläche nicht größer als 10 mm2 sein, wobei dies über eine entsprechende Auswahl und Gestaltung des verwendeten Permanentmagneten oder Elektromagneten erreicht werden kann. Günstig sind kleinere Flächen im Bereich < 0,5 mm2.
Für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen, bei dem überprüft wird, ob diese stoffwechselaktiv sind, können unterschiedliche Sensoren allein oder in Kombination eingesetzt werden .
So kann beispielsweise die Sauerstoff- und die C02- Konzentration bestimmt werden. Es kann aber auch der Glucose-Verbrauch oder ein Lactatsensor eingesetzt werden. Unter Umständen besteht aber auch die Möglichkeit den sich entsprechend verändernden pH-Wert zu bestimmen.
Soll eine sich stoffwechselabhängig verändernde C02- Konzentration gemessen werden, kann vorteilhaft ein potentiometrisch messender C02-Sensor eingesetzt wer- den.
Besonders geeignet sind Sauerstoffsensitive Sensoren, bei denen in einer Membran ein fluoreszierender Stoff enthalten ist, dessen Fluoreszenzintensität sich in Abhängigkeit der Sauerstoffkonzentration verändert. Solche Sensoren, auch als Optoden bezeichnet, sind aus dem Stand der Technik bekannt und z.B. in DE 198 31 770.0 mit einer speziellen Ausführung einer solchen Membran beschrieben.
Die Membranen dieser Sensoren werden für eine Fluoreszenzanregung und dabei der üblicherweise verwendeten Ruthenium-Komplexe mit entsprechendem Licht bestrahlt und Fluoreszenz angeregt. Die Fluoreszenzin- tensität verringert sich mit steigender Sauerstoff- konzentration in unmittelbarer Nähe einer solchen Membran. Mittels der mit einem geeigneten optischen Sensor erfassten Fluoreszenzintensität kann auf die Sauerstoffkonzentration geschlossen werden.
Häufig wird das Anregungs- und das eigentliche Fluo- reszenzlicht über Lichtleitfasern auf die Membran und den optischen Detektor gerichtet, wobei eine solche Lichtführung auch über eine einzige Lichtleitfaser möglich ist.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann mindestens eine Lichtleitfaser unter der Membran, also zwischen Membran und Permanentmagneten bzw. Elektromagneten angeordnet werden, wobei Lichtein- und -austrittsöff- nung(en) unterhalb der Membran auf der gegenüberliegenden Seite, auf der die magnetisierbaren Partikel lokal konzentriert sind, angeordnet sind.
Vorteilhaft kann eine Membran in der Wand eines das Probenvolumen enthaltenden Gefäßes eingefasst sein und so einen Teil der Gefäßwand darstellen. Für den Nachweis der lebenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen wird die lokale Konzentration der magnetisierbaren Partikel mit einer Bewegung ei- nes Permanentmagneten oder Elektromagneten in Richtung auf die Außenseite der Membran durchgeführt und der Permanent- oder Elektromagnet dort gehalten wird. Dabei trennt die Membran das gegebenenfalls kritische Probenvolumen und den Magneten, so dass eine Kontami- nation des Permanentmagneten oder Elektromagneten verhindert werden kann.
Das Gefäß kann dann so ausgebildet sein, dass eine Zufuhr für Spüllösung angeschlossen werden kann und außerdem mindestens eine Lichtleitfaser über die
Fluoreszenzanregungslicht in die entsprechend sensitive Membran gerichtet und das angeregte Fluoreszenzlicht zu einem optischen Detektor geführt werden kann, ebenfalls von außen angesetzt werden. Dies trifft auch auf gegebenenfalls zusätzlich verwendete Spiegel oder Linsen zu. Mit einer solchen Ausbildung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, die für den Nachweis genutzten Gefäße nach einmaliger Nutzung ohne Gefahr für die Umwelt mit entsprechenden Mitteln zu entsorgen und demzufolge für jeden einzelnen Nachweis ein neues Gefäß zu verwenden.
Da der Magnet bzw. ein Elektromagnet in der Regel ei- ne ebene Fläche bildet, in denen gegebenenfalls auch eine Nut ausgebildet sein kann, in die eine Lichtleitfaser eingeführt ist, und diese Fläche von der sensitiven Membran überdeckt ist, ist es vorteilhaft, die Lichtein- und Lichtaustrittsflächen der Licht- leitfaser(n) als schräg geneigte Flächen auszubilden, um das aus der Lichtleitfaser austretende Anregungs- licht auf die sensitive Membran zu richten und von dort das Fluoreszenzlicht in eine Lichtleitfaser einkoppeln zu können. Das Licht kann aber auch mittels eines Spiegels und falls erforderlich einer fokussie- renden Linse für jede Lichtleitfaser auf eine solche sensitive Membran gerichtet bzw. von dort emittiertes Fluoreszenzlicht in eine Lichtleitfaser eingekoppelt werden.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, auf einer solchen Sauerstoffsensitiven Membran eine zweite Oxido- reduktasemembran anzuordnen, wie dies beispielsweise in DE 199 03 506 AI beschrieben ist. Mit einer sol- chen Ausbildung kann indirekt über durch den Stoffwechsel von Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen entstehende Produkte, die außerhalb der Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen mit einer Oxidoreduktasemembran enzymatisch unter Sauerstoffverbrauch umgewandelt werden, mit der Sauerstoffsensitiven Membran der Nachweis erfolgen. Eine sich stoffwechselabhängig ändernde Sauerstoff- konzentration kann aber auch amperometrisch bestimmt werden. In diesem Fall kann anstelle der einen fluo- reszierenden Stoff enthaltenden Membran eine sauer- stoffpermeable Membran verwendet werden, die die lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel und eine zwei Elektroden und einen Elektrolyten enthaltende Einheit trennt und bei der sich der zwischen den Elektroden über den Elektrolyten fließende elektrische Strom in Abhängigkeit des durch die Sauerstoff- permeable Membran gelangenden Sauerstoffes verändert.
Für den Nachweis können magnetisierbare Partikel mit maximalem Durchmesser von 5000 μm, bevorzugt im Bereich zwischen 2 und 3 μm eingesetzt werden. Im definierten Probenvolumen sollten Konzentrationen von magnetisierbaren Partikeln im Bereich zwischen 0,1 μg/ml bis maximal 100 mg/ml, bevorzugt bis zu 10 mg/ml eingehalten werden.
Zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit ist es vorteilhaft, mit der bereits vorab erwähnten Spüllösung zusätzliche magnetisierbare Partikel oder diese in anderer Form zuzuführen, die frei von Bindungsmolekülen sind. Diese bindungs olekülfreien magnetisierbaren Partikel lagern sich auf den vorab lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikeln ab, an denen gegebenenfalls Mikroorganismen oder Zellen gebunden sind und bilden eine Diffusionssperre für den sich in seiner Konzentration stoffwechselabhängig ändernden Stoff (beispielsweise Sauerstoff) , wobei die Durchmesser dieser magnetisierbaren Partikel funktionsbedingt angepasst werden können. So können hierfür auch Durchmesserfraktionen solcher magnetisierbaren Partikel mit unterschiedlichen Durchmessern ohne weiteres sinnvoll sein.
An die magnetisierbaren Partikel können spezifische Antikörper und für die bevorzugt genannte Verwendung der Erfindung können an die magnetisierbaren Partikel mono- oder polyklonale Salmonella Antikörper für den Nachweis von Zellen der Gattung Salmonella gebunden werden. Mit der erfindungsgemäßen Lösung können solche Zellen sicher und in wesentlich kürzerer Zeit nachgewiesen werden. Dabei wirkt sich besonders günstig die sehr schnell fortschreitende Zellteilung und demzufolge die relativ schnelle Erhöhung der Anzahl von stoffwechselaktiven Salmonellen aus.
Da auch andere Einflüsse eine sich verändernde Konzentration des entsprechend detektierten Stoffes hervorrufen können, wie dies beispielsweise das Eindiffundieren von Sauerstoff sein kann, ist es vorteilhaft, jeweils eine Referenzmessung mit einem gleichen Sensor unter vom Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen unbe- einflussten Bedingungen durchzuführen und die bei der Referenzmessung gewonnen Messwerte mit den eigentlichen Messwerten zu vergleichen bzw. zu verrechnen.
Es besteht aber auch die Möglichkeit, den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen aus einem Probenvolumen mehrfach durchzuführen. Hierfür kann eine Resuspendierung der lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel vorgenommen werden und mit diesen magnetisierbaren Partikeln aus dem Probenvolumen, durch erneute Anbindung von Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen der Vorgang wiederholt wird.
In einer anderen möglichen Alternative besteht aber auch die Möglichkeit, aus dem Probenvolumen im Nachgang zu einer ersten lokalen Konzentration magneti- sierbarer Partikel, durch Zugabe weiterer agneti- sierbarer Partikel an die spezifische Bindungsmolekü- le gebunden sind, eine weitere lokale Konzentration und anschließende Messung durchzuführen.
In einer weiteren Alternative kann der Nachweis aber auch so geführt werden, dass von gegebenenfalls in einem Probenvolumen enthaltenen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen ein Stoff aufgenommen wird, der in den Zellen enzymatisch aufgespalten und dadurch polar wird. Dieser Stoff, als ein im Inneren von Zellen gebildetes Stoffwechselprodukt, kann dann mit elektromagnetischen Wellen angeregt werden, so dass angeregtes Fluoreszenzlicht optisch detektiert werden kann. Da eine entsprechende enzyma- tische Aufspaltung lediglich von stoffwechselaktiven, also lebenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen durchgeführt werden kann, ist auch dieses Vorgehen für den Nachweis geeignet .
In anderer Form können aber auch entsprechend geeignete Stoffe, bei denen Fluoreszenz angeregt werden kann, auf der Oberfläche der magnetisierbaren Partikel fixiert werden, und nach Bestrahlung mit entsprechend für Fluoreszenzanregung geeigneten elektromagnetischen Wellen das Fluoreszenzlicht mit einem optischen Sensor erfasst und gegebenenfalls als Refe- renzsignal genutzt werden.
Selbstverständlich erfolgt die Messung von Fluoreszenzlicht in jedem Falle entsprechend wellenlängenselektiv, wofür beispielsweise geeignete Filter ein- setzbar sind. Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden.
Dabei zeigt :
Figur 1 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in zwei Ansichten in schematischer Form.
In der Figur 1 sind in schematischer Form zwei Ansichten eines Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Wobei bei diesem Beispiel die sich stoffwechselabhängig verändernde Sauerstoffkonzentration gemessen wird.
In einem Gefäß 1 ist ein Probenvolumen 2 enthalten. In das Probenvolumen 2 wurden magnetisierbare Partikel an die spezifische Bindungsmoleküle für die nachzuweisenden Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen, beispielsweise Salmonella-Antikörper gebunden .
Das Probenvolumen 2 wurde dann verrührt, was in nicht dargestellter Form durch einfache Hin- und Herbewe- gung oder Drehung um eine Achse des Gefäßes 1 erfolgen kann.
In der Wandung des Gefäßes 1 ist eine Sauerstoffsensitive Membran 4 eingefasst. Das Einfassen kann durch Einkleben, Verschweißen mit der Gefäßwand oder durch entsprechend abgedichtete Klemmverbindungen erfolgen. In der Sauerstoffsensitiven Membran 4 ist ein geeigneter fluoreszierender Stoff, beispielsweise ein für diesen Einsatzzweck bekannter Ruthenium-Komplex ent- halten. Eine Seite der Sauerstoffsensitiven Membran 4 steht dabei mit dem Probenvolumen 2 in Kontakt. Nach einer bestimmten vorgebbaren Zeit und ordentlichem Vermischen der magnetisierbaren Partikel im Probenvolumen 2 wird eine lokale Konzentration der ma- gnetisierbaren Partikel an der Sauerstoffsensitiven
Membran 4 durch entsprechende Bewegung des Permanentmagneten 3, wie dies mit dem Doppelpfeil angedeutet ist, durchgeführt und der Permanentmagnet 3 berührt dabei die außenliegende Seite der sauerstoffsensiti- ven Membran 4 oder wird in einem kleinem Abstand zur Membran 4 gehalten.
Durch die magnetischen Kräfte werden die magnetisierbaren Partikel an der entgegengesetzt zum Permanent- magneten 3 angeordneten Fläche der sauerstoffsensitiven Membran 4 lokal konzentriert .
Sind an die magnetisierbaren Partikel lebende Mikroorganismen, eukaryotische Zellen oder Organellen (z.B. Salmonella) gebunden, wird durch den Stoffwechsel Sauerstoff verbraucht . Dieser Sauerstoffverbrauch erhöht sich sukzessive durch die Erhöhung der zellteilungsbedingten Anzahl der Zellen und durch Messung der sich entsprechend verändernden Sauerstoffkonzen- tration kann der Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen durchgeführt werden .
Für einen solchen Nachweis wird monochromatisches Licht einer nicht dargestellten Lichtquelle durch die Lichtleitfaser 6 auf die sauerstoffsensitive Membran 4 gerichtet, wobei hierfür verschiedene Alternativen im allgemeinen Teil der Beschreibung erwähnt worden sind. Mit diesem Anregungslicht wird Fluoreszenzlicht in der sauerstoffsensitiven Membran 4 angeregt und die Intensität . dieses Fluoreszenzlichtes verändert sich in Abhängigkeit der Sauerstoffkonzentration in unmittelbarer Nähe der sauerstoffsensitiven Membran 4, also dort, wo die magnetisierbaren Partikel mit den gegebenenfalls daran gebundenen lebenden Mikroor- ganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen lokal konzentriert worden sind.
Das Fluoreszenlicht kann durch die eine Lichtleitfaser 6 aber auch durch eine zusätzliche Lichtleitfaser (nicht dargestellt) auf einen optischen Sensor gerichtet werden. Die mit diesem optischen Sensor gemessenen Fluoreszenzintensitäten können dann auf unterschiedlichste Art und Weise ausgewertet werden, um auf die jeweilige sich gegebenenfalls infolge des Stoffwechsels der Mikroorganismen, eukaryotischen
Zellen oder Organellen verändernden Sauerstoffkonzentration zu schließen. So kann die sich ändernde Fluoreszenzintensität unmittelbar hierfür genutzt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit die sich in Ab- hängigkeit der momentanen Sauerstoffkonzentration verändernde Phasenverschiebung bei frequenzmodelier- te Anregungslicht zwischen dem für die Fluoreszenzanregung genutzten Licht und dem Fluoreszenzlicht oder das Abklingverhalten des Fluoreszenzlichtes bei beispielsweise einer gepulsten Fluoreszenzanregung auszunutzen.
Vor oder während der Messungen kann über eine Zuführleitung 5 Spüllösung unmittelbar zu den lokal onzen- trierten magnetisierbaren Partikeln an der sauerstoffsenistiven Membran 4 herangeführt werden, wobei eine Spüllösung, wie sie im allgemeinen Teil der Beschreibung erwähnt worden ist, eingesetzt werden kann. Die Messung der Sauerstoffkonzentration kann kontinuierlich, aber auch in mehr oder weniger großen Zeitabständen durchgeführt werden. Zur Vermeidung von Kontaminationen kann in der Zuführleitung 5 ein Membranfilter 7 vorgesehen werden.
Für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmo- nella ist ein Zeitraum zwischen 3 und 8 h ausreichend, um eine sichere Nachweisgenauigkeit zu gewährleisten, was eine erhebliche Verkürzung gegenüber den herkömmlichen Nachweisverfahren ist.
Der Nachweis sollte unter klimatisierten Bedingungen erfolgen. Hierfür kann eine entsprechende Vorrichtung in einem herkömmlichen Brutschrank angeordnet werden oder ein entsprechend temperierbares Gefäß 1 eingesetzt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen (2) , in dem magnetisierbare Partikel, an deren Oberfläche für mindestens einen Mikroorganismus, eukaryotische Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, enthalten sind,
mit einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten zur lokalen Konzentration und Halten der magnetisierbaren Partikel und
mindestens einem Sensor zur Bestimmung von sich stoffwechselabhängig veränderbaren Stoffkonzentrationen oder der Bildung von Sto fwechselprodukten in Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten und der Fläche, auf der die magnetisierbaren Partikel und gegebenenfalls nachzuweisende Mikroorganis- men, eukaryotische Zellen oder Organellen gehalten sind, mindestens eine Membran (4) eines Sensors angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Spüllösungszu- führung (5) für die Zufuhr einer Spüllösung vorhanden is .
4. Vorrichtung nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche, auf der die magnetisierbaren Partikel lokal konzentriert gehalten sind, kleiner als 10 mm2 ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Sensor ein Sauerstoff-, C02-, Glucose-, Laktatsensor und/oder optischer Sensor ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein potentiome- trisch messender C02-Sensor vorhanden ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (4) eines Sensors in eine Wandung eines das Probenvolumen (2) enthaltenden Gefäßes (1) eingefasst ist .
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Sauerstoffsen- sor eine einen sauerstoffsensitiven, fluoreszierenden Stoff enthaltende Membran (4) aufweist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Lichtleitfaser (6) zur Membran (4) des Sensors geführt ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Membran (4) des Sauerstoffsensors eine Oxidoreduktasemembran angeordnet ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein amperometrisch messender Sauerstoffsensor vorhanden ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass an die magnetisierbaren Partikel Antikörper gebunden sind.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass an die magnetisierbaren Partikel Salmonella-Antikörper gebunden sind.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetisierbaren Partikel einen maximalen Durchmesser von 5000 μm aufweisen.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Konzentration der magnetisierbaren Partikel im Probenvolumen (2) kleiner als 100 mg/ml eingehalten ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass in der Spüllösung zusätzliche, bindungsmolekülfreie magnetisierbare Partikel enthalten sind.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein zweiter Sensor zur Durchführung einer vom Stoff - Wechsel der Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen unbeeinflussten Referenzmessung vorhanden ist.
18. Verfahren für den Nachweis lebender Mikroorganismen, eukaryotischer Zellen oder Organellen in einem Probenvolumen, bei dem
magnetisierbare Partikel an die für mindestens einen Mikroorganismus, eukaryotische Zellen oder Organellen spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, zugegeben und verrührt werden,
die magnetisierbaren Partikel dann mit einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten lokal konzentriert und gehalten sowie
mit mindestens einem Sensor (4) , mit dem sich eine infolge lebender Mikroorganismen, eukaryo- tischen Zellen oder Organellen stoffwechselabhängig verändernde Stoffkonzentration über ein vorgebbares Zeitintervall gemessen wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Sauerstoffkon- zentration gemessen wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass Spüllösung vor oder während der Messung zugeführt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sauerstoff und mindestens einen für den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen erforderlichen Stoff enthaltende Spüllösung verwendet wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Spüllösung zusätzliche magnetisierbare Partikel zugeführt werden .
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass mit mindestens einem zweiten Sensor eine vom Stoffwechsel der Mikroorganismen, eukaryotischen Zellen oder Organellen unbeeinflusste Referenzmessung durchgeführt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die lokal konzentrierten magnetisierbaren Partikel resuspen- siert, mit dem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten erneut lokal konzentriert und die Messung der sich stoffwechselabhängig verändernden Stoffkonzentration erneut durchgeführt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass nach einer ersten lokalen Konzentration magnetisierbarer Partikel mit einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten aus dem Probenvolumen (2) weitere agne- tisierbare Partikel an die spezifische Bindungsmoleküle gebunden sind, dem Probenvolumen zugegeben, verrührt und mit einem Permanentmagneten (3) oder Elektromagneten lokal konzentriert und mit mindestens einem Sensor eine sich stoffwech- seiabhängig ändernde Stoffkonzentration gemessen wird.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung im An- schluss an die lokale Konzentration der magneti- sierbaren Partikel außerhalb des Probenvolumens durchgeführt wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Magnet (3) oder Elektromagnet zur lokalen Konzentration magneti- sierbarer Partikel von außen an eine in eine Gefäßwand eines das Probenvolumen (2) enthaltenden Gefäßes (1) eingefasste Membran (4) geführt und dort gehalten wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass mit einem optischen
Sensor Fluoreszenzlicht eines auf der Oberfläche von magnetisierbaren Partikeln fixierten fluoreszierten Stoffes oder eines von Zellen aufge- nommenen durch enzymmatische Aufspaltung polarisierten fluoreszierenden Stoffes detektiert wird.
29. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 für den Nachweis lebender Zellen der Gattung Salmonella .
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