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WO2003012108A2 - Utilisations d'un polypeptide thyx d'un acide nucleique codant un tel polypeptide, notamment pour le criblage de composes anti-bacteriens ou anti-viraux. - Google Patents

Utilisations d'un polypeptide thyx d'un acide nucleique codant un tel polypeptide, notamment pour le criblage de composes anti-bacteriens ou anti-viraux. Download PDF

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Publication number
WO2003012108A2
WO2003012108A2 PCT/FR2002/002795 FR0202795W WO03012108A2 WO 2003012108 A2 WO2003012108 A2 WO 2003012108A2 FR 0202795 W FR0202795 W FR 0202795W WO 03012108 A2 WO03012108 A2 WO 03012108A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
thyx
polypeptide
nucleic acid
thymidylate synthase
screening
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/002795
Other languages
English (en)
Other versions
WO2003012108A3 (fr
Inventor
Hannu Myllykallio
Ursula Liebl
Damien Leduc
Gérard LIPOWSKI
Jean-Louis Martin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Sud
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Sud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR0110401A external-priority patent/FR2828211B1/fr
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Sud filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to US10/485,106 priority Critical patent/US20040248195A1/en
Priority to EP02772483A priority patent/EP1414972A2/fr
Publication of WO2003012108A2 publication Critical patent/WO2003012108A2/fr
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Publication of WO2003012108A3 publication Critical patent/WO2003012108A3/fr
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/91005—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • G01N2333/91011—Methyltransferases (general) (2.1.1.)

Definitions

  • THYX polypeptide or of a nucleic acid encoding such a polypeptide, in particular for the screening of anti-bacterial or anti-viral compounds
  • the present invention relates to the field of enzymes involved in DNA synthesis, and more specifically in the synthesis of an intermediate compound, thymidine 5'-monophosphate (dTMP), required for the production of thymidine 5'- triphosphate (dTTP) constituting the DNA molecule.
  • dTMP thymidine 5'-monophosphate
  • dTTP thymidine 5'- triphosphate
  • THYX a new family of enzymes, designated THYX, capable of catalyzing the synthesis of thymidine 5'-monophosphate in the absence of an active thymidylate synthase enzyme (ThyA).
  • the invention also relates to reaction media for the thymidylate synthase activity of a THYX polypeptide as well as screening methods using said reaction media, as well as kits for carrying out these methods.
  • Thymidine 5'-monophosphate is described in the prior art as being the end product of the methylation of uridine 5'-monophosphate (dUMP), methylation which is catalyzed by a thymidylate synthase of the THYA type, both in eucar otes and in bacteria (Carreras and Santi, 1995).
  • Thymidylate synthase THYA which is also expressed in mammals, has been considered as a potential target for inhibitors of DNA synthesis, which can be used in particular in the treatment of colorectal cancer (Papamichael, 2000).
  • Diagram 1 A simplified illustration of the production of dTMP in the cell by methylation of dUMP is represented in diagram 1 below.
  • Diagram 1 A simplified illustration of the production of dTMP in the cell by methylation of dUMP is represented in diagram 1 below.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • thymidylate synthase inhibitors for the treatment of advanced colorectal cancer specifies that “an important characteristic of nucleotide metabolism is the duplication of metabolic pathways; inhibition of any enzyme can be bypassed by one or more alternative routes.
  • thymidylate synthase thyA which is an essential enzyme constituting the only means of adding a methyl group in position 5 of the pyrimidine cycle in the de novo synthesis of thymidine (Papamichael, 1999).
  • THYX a family of polypeptides, designated THYX, which are of a structure completely distinct from the polypeptides coded by the thyA genes, possess the capacity to synthesize dTMP in cells.
  • the thyX genes are found in the genome of many bacteria, bacteriophages and bacterial or eukaryotic viruses, while they are absent in the mammalian genome, in particular in the human genome.
  • the characterization, according to the invention, of a new synthesis pathway for dTMP, thanks to the THYX family of proteins, has made accessible for the first time to those skilled in the art the numerous applications which result directly therefrom and which are exposed in this description.
  • the different uses of a THYX polypeptide or of a nucleic acid encoding a THYX polypeptide described in the present patent application are technically linked due to the common functional and structural characteristics of the THYX polypeptides defined below.
  • THYX polypeptide comprising the following amino acid sequence: X 1 HR (X) 7 S, in which:
  • Xi represents the amino acid R (Arginine or Arg) or K (Lysine or Lys), and - (X) 7 is a chain of seven consecutive amino acids in which each X represents, independently of one another, any of the 20 natural amino acids, in a process for the in vitro synthesis of thymidine 5 ' -monophosphate (dTMP).
  • dTMP thymidine 5 ' -monophosphate
  • - S represents the amino acid Serine or Ser, according to the letter code conforming to the international nomenclature.
  • Xi represents the amino acid R.
  • THYX polypeptide is chosen from polypeptides comprising the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined above for the production of said THYX polypeptide.
  • the nucleic acid is chosen from nucleic acids comprising the nucleotide sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64.
  • the invention also relates to the use of a THYX polypeptide as defined above in a method for screening for thymidylate synthase inhibitor compounds, in particular antibacterial or antiviral compounds.
  • a nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined above in a method for screening for thymidylate synthase inhibitor compounds, in particular for anti-bacterial or anti-viral compounds.
  • RNA coding for a THYX polypeptide it also relates to the use of an antisense oligonucleotide specifically hybridizing with the messenger RNA coding for a THYX polypeptide to inhibit in vitro the synthesis of DNA in a bacterium or a virus. It also relates to the use of a nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined above as a marker for the selection of a genetic recombination event.
  • a probe or of a nucleotide primer specific for a nucleic acid coding for a THYX polypeptide for detecting a bacterium or a virus, particularly a bacteria or a virus pathogenic for mammals, and more specifically for humans, as well as a kit or kit for detecting this bacteria or this virus, comprising a probe or a nucleotide primer specific for a nucleic acid coding for a THYX polypeptide .
  • the work of the inventors on the activity of ThyX made it possible to identify the enzymatic mechanism and thus to optimize the conditions of the reaction by highlighting the importance of the addition of certain compounds in the reaction medium.
  • the object of the invention is therefore the use of such media and their application.
  • Figure 1 illustrates an alignment of the amino acid sequences of various THYX polypeptides.
  • the left column shows the names of the organisms from which each of the amino acid sequences originates.
  • the numbers identify the serial number of the amino acid at the start of the corresponding line, in the body's THYX polypeptide sequence.
  • FIG. 2A represents immuno-fingerprint gels produced on cell extracts obtained from E.co// X2913 bacteria ( ⁇ fhyA) transfected with the ThyX gene of P.abyssi (tracks number 1 and number
  • the transforming E. coli bacteria were cultivated in the absence of Araj / nose (tracks number 1 and 3) or in the presence of 0.2% in'Arabinose (tracks number 2 and 4).
  • the bands visible on the immunoblotting gel (3Westem blot ") correspond respectively to the THYX polypeptide from P.abyssi (lane number 2) and to the THYX polypeptide from H. pylori (lane number 4).
  • FIG. 2B illustrates photographic photographs of Petri dishes which have been sown:
  • the photo on the left shows the growth results of the transformed E. coli bacterium cultivated on agar (agar) in minimum M9 medium supplemented with 0.2%. Only the E. coli bacteria transformed with the thyX gene of H. pylori multiply.
  • the picture on the right represents the same bacteria cultivated in the agar in the presence of minimal medium M9 in the absence of Arabinose. No bacterial growth is observed, regardless of the transfected bacteria.
  • Figure 3 Migration on SDS PAGE gel stained with Comassie Blue.
  • the first well corresponds to the PROMEGA Mid-Range marker.
  • the arrows show the molecular weights which correspond to the bands of the marker.
  • the second well contains the sample of our protein, after having purified it on a Ni-NTA column, its band is around 28 kDa.
  • FIG. 4 Western blotting fractions after protein purification on a Ni-NTA column demonstrate purification of THYX.
  • Figure 6 illustrates the dTMP formation activity of the ThyX protein of H. pylori.
  • THYX a family of polypeptides, designated THYX, distinct from the family of polypeptides encoded by the thyA genes, possesses catalytic activity of the thymidylate synthase type.
  • the applicant has cloned the thyX gene from H. Pylori into a functional expression vector in Escherichia coli. This expression vector was used to transform a strain of Escherichia coli auxotrophic for thymidine, more specifically the strain of E. coli X2913 (MhyA572), whose genetic background is precisely characterized and in which the thyA gene is deleted.
  • results presented in the examples show that the expression of the thyX gene which was artificially introduced into the strain X2913 ( ⁇ fhyA) made it possible to restore the capacity of E.coli to synthesize de novo dTMP. Due to the great knowledge accumulated on the characteristics of the E. coli genome as well as on the normal synthesis route of dTMP via the expression of thymidylate synthase THYA, the results obtained show that the expression product of the myX gene of H. Pylori directly remedies the defect in the production of the THYA polypeptide in this bacterial organism.
  • polypeptides having sequences homologous to the THYX polypeptides of Helicobacter pylori were also encoded by the genome of numerous bacteria, bacteriophage Archaebacteria as well as in some viruses.
  • thyA and thyX genes in the genome of the organisms mentioned above clearly shows that thyX supplements the thymidylate synthase function which is no longer ensured in the absence of thyA.
  • thyA gene is systematically absent from the genome of bacteria with the thyX gene, while other genes involved in nucleotide metabolism are either present or absent in the genome of these organisms.
  • the bacteria deficient in thyA and in which the thyX gene is present are, for the most part, bacteria pathogenic for mammals.
  • Campylobacter jejuni which causes food poisoning
  • Helicobacter pylori which is a causative agent of ulcers
  • Rickettsia prowazekii which is a causative agent of typhus
  • Borrelia burgdorferi which is implicated in Lyme disease
  • Treponema pallidum which is the agent causative of syphilis
  • bacteria of the genus Chlamydiae which are obligate intracellular pathogens as well as eukaryotic DNA viruses such as Chorella virus.
  • bacteria in which the thyX gene has been inactivated become auxotrophs for thymidine, that is to say that they multiply only if exogenous thymidine is added to the medium. culture..
  • Xi represents the amino acid R (Arginine or Arg) or K (Lysine or Lys), and
  • - (X) is a chain of seven consecutive amino acids in which each X represents, independently of one another, any of the 20 natural amino acids.
  • Xi represents the amino acid R.
  • Xi represents K, in particular for the THYX polypeptide encoded by the genome of Roseophage S101.
  • THYX polypeptides do not have conserved cysteine amino acid residues in their sequences, unlike polypeptides encoded by the thyA genes, in which the conserved cysteine residue has an essential nucleophilic role in the methylation reaction catalyzed by the THYA polypeptides .
  • a THYX polypeptide according to the invention is capable of catalyzing the oxidation of methylene tetrahydrofolate to tetrahydrofolate, which is a characteristic of the catalytic activity of the thymidylate synthase type, and shows that the THYX polypeptides belong to the class of thymidylate synthase enzymes.
  • a thyX gene can be inhibited by a high concentration of trimethoprim, which is a specific inhibitor of dihydrofolate reductase; the fact that only high concentrations of trimethoprim inhibit THYX suggests that there are functional differences between the metabolic pathways of formation thymidylate in which thyA and thyX are involved respectively.
  • trimethoprim which is a specific inhibitor of dihydrofolate reductase
  • polypeptides coded by the thyA genes are active without requiring the presence of flavin;
  • THYX polypeptides belonging to the family of THYX polypeptides having structural and functional characteristics defined above are the THYX polypeptides comprising the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37.
  • THYX polypeptides of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37 have been made accessible to the public in particular by their publication in the amino acid sequence databases.
  • THYX polypeptide comprising the following amino acid sequence: Xi HR (X) 7 S, in which - Xi represents the amino acid R (Arginine or Arg) or K (Lysine or
  • - (X) 7 is a chain of seven consecutive amino acids in which each X represents, independently of one another, any of the 20 natural amino acids, in a process for the in vitro synthesis of thymidine 5 ' -monophosphate (dTMP).
  • the amino acid Xi represents the amino acid R.
  • a person skilled in the art can in particular refer to the examples of the present patent application, in which the thymidylate synthase activity of the THYX polypeptide of Helicobacter pylori (SEQ ID No. 21) is demonstrated in cellular extracts by the detection of the oxidation reaction of the methylene tetrahydrofolate compound.
  • the above use is characterized in that the THYX polypeptide is chosen from polypeptides comprising the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37.
  • the above use is characterized in that the THYX polypeptide is chosen from the polypeptides consisting of the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to seq id No. 37.
  • amino acid sequence THYX polypeptide SEQ ID No. 5 is encoded by a gene from the organism Dictyostelium discodideum which was described in 1989 by Dynes and Firtel, and designated "Thy1" by these authors.
  • Thy1 gene from Dictyostelium discoideum could code for a thymidylate synthase.
  • the pathway for the biosynthesis of thymidine by Oictyostelium discoideum was a fortiori unknown in 1989, as were also the molecular bases causative of the autotrophy of thymidine.
  • the organism Oictyostelium discoideum has not yet been the subject of systematic sequencing of its genome.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid encoding a THYX polypeptide as defined above in order to produce said THYX polypeptide for its use in different uses of a THYX polypeptide described in the present description.
  • nucleotide sequences SEQ ID N ° 44 to SEQ ID N ° 64 From the amino acid sequences SEQ ID N ° 1, to SEQ ID N ° 37 and / or the nucleotide sequences SEQ ID N ° 44 to SEQ ID N ° 64, the person skilled in the art is capable of detecting, isolating, cloning and characterize any nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined above, for example by synthesizing nucleotide probes specific for a nucleic acid coding for the peptide X ⁇ HR (X) 7 S or RHR (X) 7 S. To construct such probes, those skilled in the art can adapt their sequence according to the use of the codon for a given organism. The detection of a thyX gene can be carried out by hybridization on a DNA gel (“Southern Bot”) or else by PCR amplification, for example using the probe defined above as a nucleotide primer.
  • the thyX gene of H. Pylori can be isolated using the nucleotide primers of sequences SEQ ID No. 38 and SEQ ID No. 39 and the thyX gene of P.abyssi can be isolated using the primers nucleotides of sequences SEQ ID No. 40 and SEQ ID No. 41.
  • the thyX gene of Campylobacter jejuni can be isolated using the nucleotide primers of sequences SEQ ID No. 42 and SEQ ID No. 43.
  • the nucleic acid coding for a THYX polypeptide is chosen from nucleic acids coding for a THYX polypeptide comprising one of the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37.
  • the nucleic acid is chosen from the nucleic acids coding for a THYX polypeptide consisting of one of the amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37.
  • the nucleic acid is chosen from nucleic acids comprising the nucleotide sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64.
  • THYX polypeptides which can be used according to the invention include THYX polypeptides having at least 95% identity in amino acids with a THYX polypeptide chosen from the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37.
  • THYX capable of being used according to the invention a nucleic acid having at least 95% nucleotide identity with a nucleic acid chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64.
  • nucleotide sequence is used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not limited to information regarding its sequence.
  • a first nucleic acid having at least 95% identity with a second reference nucleic acid will have at least 95%, preferably at least 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99 %, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% identity nucleotides with this second reference polynucleotide, the percentage of identity between two sequences being determined as described below.
  • a first polypeptide having at least 95% identity with a second reference polypeptide will have at least 95%, preferably at least 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% or 99.9% amino acid identity with this second reference polypeptide, the percentage of identity between two sequences being determined as described below.
  • the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences within the meaning of the present invention, can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues compared, by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by one hundred to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out by computer using known algorithms.
  • the percentage of sequence identity is determined using the BLAST software (BLAST version 2.06 of September 1998), using exclusively the default parameters.
  • a nucleic acid having at least 95% nucleotide identity with a nucleic acid according to the invention includes the "variants" of a nucleic acid according to the invention.
  • variant of a nucleic acid according to the invention is meant a nucleic acid which differs from the reference nucleic acid by one or more substitutions, additions or deletions of a nucleotide, relative to the nucleic acid of reference.
  • a variant of a nucleic acid according to the invention can be of natural origin, such as an allelic variant which exists naturally. Such a variant nucleic acid can also be an unnatural nucleic acid obtained, for example, by mutagenesis techniques.
  • the differences between the reference nucleic acid and the "variant" nucleic acid are reduced so that the reference nucleic acid and the variant nucleic acid have very similar nucleotide sequences and, in many regions , identical.
  • the nucleotide modifications present in a variant nucleic acid can be silent, which means that they do not affect the amino acid sequence which can be encoded by this variant nucleic acid.
  • Changes in nucleotides in the variant nucleic acid can also result in substitutions, additions or deletions of one or more amino acids in the sequence of the polypeptide which can be encoded by this variant nucleic acid.
  • a variant nucleic acid according to the invention comprising an open reading phase, code for a polypeptide which retains the same function or the same biological activity as the polypeptide coded by the reference nucleic acid.
  • a variant nucleic acid according to the invention and which comprises an open reading phase codes for a THYX polypeptide which retains the catalytic activity of a thymidylate synthase, which can in particular be detected by the capacity of the THYX polypeptide to oxidize methylene-tetradihydrofolate in vitro or to restore the capacity of a bacteria or a eukaryotic cell deficient in thymidylate synthase THYA to synthesize DNA, as described in the examples.
  • a variant THYX polypeptide will not include any amino acid modification on the X ⁇ HR (X) 7 S motif, and the conserved amino acid Serine is present.
  • the THYX polypeptides capable of being used according to the invention, the THYX polypeptides encoded by a nucleic acid as defined above.
  • THYX polypeptides comprising one or more amino acid substitutions in one of the sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37 with an amino acid "equivalent ".
  • amino acids D and E
  • basic K, R and H
  • non-polar A, V, L , I, P, M, F and W
  • uncharged polar G, S, T, C, Y, N and Q.
  • homologous polypeptides have amino acid sequences having one or more substitutions of an amino acid with an equivalent amino acid, relative to the reference polypeptides.
  • the equivalent amino acid according to the present invention will be understood, for example replacement of a residue in the L form with a residue in the D form or alternatively the replacement of a glutamic acid (E) by a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
  • E glutamic acid
  • a pyro-glutamic acid a pyro-glutamic acid according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the synthesis of peptide containing at least one residue in the D form is described by KOCH (1977).
  • two amino acids belonging to the same class are also considered to be equivalent amino acids, that is to say two amino acids, basic, non-polar or even uncharged polar.
  • polypeptides according to the invention comprising one or more additions, deletions, substitutions of at least one amino acid will retain their capacity to be recognized by antibodies directed against the unmodified polypeptides.
  • polypeptides will also retain their catalytic activity thymidylate synthase.
  • a THYX polypeptide or a nucleic acid coding for a THYX polypeptide capable of being used according to the invention is in isolated or purified form.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a polypeptide or a polynucleotide present in the natural state in an animal or a plant is not isolated.
  • the same polypeptide separated from its natural environment or the same polynucleotide separated from adjacent nucleic acids within which it is naturally inserted into the genome of the animal or plant is isolated.
  • Such a polynucleotide may be included in a vector and / or such a polynucleotide may be included in a composition and nevertheless remain in an isolated state, since the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of others compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polypeptide or a polynucleotide is in the purified state after purification of the starting material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
  • THYX polypeptides of sequence SEQ ID No. 1 to SEQ ID No.
  • a THYX polypeptide capable of being used according to the invention retains the catalytic activity of a thymidylate synthase, which can in particular be detected by the capacity of the THYX polypeptide to oxidize methylene-tetradihydrofolate in vitro or still to restore the capacity of a bacteria or of a eukaryotic cell deficient in thymidylate synthase THYA to synthesize DNA, as described in the examples.
  • the invention also relates to a process for the production of one of the THYX polypeptides as defined above, in particular of a polypeptide chosen from the THYX polypeptides of amino acid sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID No. 37 or a variant thereof, said method comprising the steps of: a) inserting a nucleic acid encoding said polypeptide into an appropriate vector; b) cultivating, in an appropriate culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the recombinant vector of step a); c) recovering the conditioned culture medium or lysing the host cell, for example by sonication or by osmotic shock; d) separating and purifying from said culture medium or also from the cell lysates obtained in step c), said polypeptide; e) where appropriate, characterize the recombinant polypeptide produced.
  • THYX polypeptides according to the invention can be characterized by attachment to an immunoaffinity chromatography column on which the antibodies directed against this polypeptide or against a fragment or a variant of the latter have been immobilized beforehand.
  • a recombinant THYX polypeptide according to the invention can be purified by passage through an appropriate series of chromatography columns, according to methods known to those skilled in the art.
  • a THYX polypeptide according to the invention can also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis either in homogeneous solution or solid phase.
  • a THYX polypeptide according to the invention may be prepared by the technique or in a homogeneous solution described by HOUBEN WEYL (1974) or also the solid phase synthesis technique described by MERRIFIELD (1965a; 1965b).
  • the thyX genes are found in many bacteria pathogenic for mammals, in particular pathogenic for humans and in certain viruses.
  • the fhyX genes are not found in the mammalian genome.
  • the human genome lacks an fhyX gene.
  • the THYX polypeptides and the nucleic acids coding for the THYX polypeptides constitute preferred targets for compounds specifically inhibiting the expression of the thyx genes or specifically inhibiting the thymidylate synthase activity of the THYX polypeptides.
  • Such inhibitor compounds are capable of inhibiting the synthesis of DNA in numerous bacteria, bacteriophages and viruses, in particular those which are pathogenic for mammals, including humans, as well as the multiplication of these bacteria, these bacteria and these viruses, while not causing adverse effects in mammals, or at least causing severely reduced side effects in mammals, including humans, whose genome contains no copies of a thyX gene.
  • the invention also relates to the use of a THYX polypeptide as defined in the description in a method for screening for antibacterial or anti-viral compounds.
  • a THYX polypeptide as defined in the description can be used to screen for molecules which bind to it.
  • the binding of the polypeptide with the molecule or substance can either inhibit (antagonistic molecule) the thymidylate synthase activity of said polypeptide.
  • Such molecules capable of binding to any one of the polypeptides according to the invention include antibodies, oligonucleotides, other proteins and in general small molecules of any kind.
  • a screening test for a candidate molecule capable of binding to a polypeptide according to the invention may advantageously comprise a first step during which the polypeptide of interest or the candidate molecule is immobilized on a support. , a second step during which the second partner (candidate molecule or polypeptide of interest) is placed in the presence of the first compound previously immobilized on the support, a third step during which one or more washes are carried out under appropriate conditions elimination of the compounds which are not specifically linked, and finally a fourth stage during which the any complex formed between the polypeptide of interest and the candidate molecule is detected.
  • the detection of the complex formed by the candidate molecule and the polypeptide of interest according to the invention may advantageously be carried out using an antibody as described above.
  • the candidate molecule will advantageously be labeled with the aid of a detectable marker prior to its brought into contact with the immobilized polypeptide of interest.
  • Such a detectable marker can be radioactive or non-radioactive, for example fluorescent or correspond to a ligand for a third partner used for detection such as a biotin molecule.
  • the subject of the invention is also a process for screening a molecule or a candidate substance interacting with a polypeptide according to the invention, said method comprising the steps of: a) bringing into contact a polypeptide in accordance with invention with the candidate substance or molecule to be tested; b) detecting the complexes possibly formed between said polypeptide and said substance or candidate molecule.
  • the invention also relates to a kit or kit for screening a molecule or a candidate substance interacting with a polypeptide according to the invention, said kit comprising: a) a polypeptide according to the invention; b) if necessary, means necessary for the detection of the complex formed between said polypeptide and the candidate molecule or substance.
  • the test for inhibition of the thymidylate synthase activity of a THYX polypeptide is carried out in an acellular system, for example in a culture lysate of cells expressing the THYX polypeptide and which does not simultaneously express a polypeptide encoded by a thyA gene.
  • the cells from which the cell lysate is obtained are preferably cells having the same characteristics as those which are used in the method of screening in an acellular system which has been described in detail above in the description.
  • the cells from which the cell lysate is obtained are respectively:
  • the cell lysate can be obtained from a culture of the cells described above, for example by sonication or by osmotic shock, according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the cell debris can be eliminated by a centrifugation step at the end of which these cell debris are found in the pellet, the centrifugation supernatant comprising in particular all of the proteins including the protein THYX, and which is recovered for the implementation of the screening process.
  • the thymidylate synthase activity is quantified respectively in control samples containing only the cell lysate and in test samples containing a candidate inhibitor compound, if necessary for a series of increasing concentrations of the compound. candidate inhibitor.
  • a series of test samples comprising a given candidate inhibitor compound will be used, at increasing concentrations.
  • the thymidylate synthase activity can be quantified in particular by detecting the oxidation of methylene tetrahydrofolate, as described in the examples.
  • the subject of the invention is also a method of screening an antibacterial or antiviral compound in vitro in an acellular system, characterized in that said method comprises the following steps: a) preparing a cell lysate from a cell culture expressing a THYX polypeptide in the absence of a polypeptide encoded by a thyA gene. b) add to the cell lysate obtained in step a) the inhibitor compound to be tested; c) compare the thymidylate synthase activity respectively in the cell lysate obtained in step a) and in the cell lysate obtained in step b); and d) selecting the candidate compounds for which inhibition of thymidylate synthase activity has been detected.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the screening of a thymidylate synthase inhibitor compound characterized in that it comprises: a) a composition comprising a THYX polypeptide in solution or in lyophilized form; b) optionally, one or more reagents necessary for the quantification of the thymidylate synthase activity.
  • the composition containing the THYX polypeptide consists of a cell lysate prepared as described above.
  • the composition comprising the THYX polypeptide comprises an amount of the THYX polypeptide in purified form suitable for obtaining a test sample in solution comprising a concentration of the THYX polypeptide between 10 "10 and 10 " 2 M, preferably 10 "8 to 10 " 3M and most preferably between 10 "7 M and 10 " 5 M .. Method of . screening of antibacterial or antiviral compounds in a cellular system
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined in the description in a method for screening for antibacterial or antiviral compounds.
  • nucleic acid codes for a THYX polypeptide chosen from polypeptides comprising the amino acid sequences
  • nucleic acid is chosen from nucleic acids comprising the nucleotide sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 37.
  • nucleic acid is chosen from nucleic acids comprising the nucleotide sequences SEQ ID N ° 1 to SEQ ID N ° 37.
  • the invention also relates to a kit or kit for the screening of an antibacterial or antiviral compound, characterized in that it comprises: a) a recombinant expression vector comprising a nucleic acid encoding a THYX polypeptide as defined in the present description, under the control of a functional promoter in a host cell in which its expression is sought or a host cell transfected with such a recombinant vector; b) optionally, one or more reagents necessary for the quantification of the thymidylate synthase activity.
  • the activity of the compounds inhibiting the thimydylate synthase activity of THYX can be tested in cultures of cells expressing THYX, by absence of expression of thyA.
  • such a screening method can be carried out on cell cultures for the genome having a copy of a THYX gene but not of a thyA gene, such as for example cultures of Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Rickettsia prowazekii, Borrelia burgdorferi or Chlamydia.
  • such a method of screening for antibacterial or antiviral compounds in a cellular system can be carried out using cell cultures in which the thyA gene has been inactivated. and which have been transfected with a nucleic acid or a recombinant vector expressing a thyX gene in these cells, such as for example the strain of E. coli no X 2913 (MhyA) which has been transfected with an expression vector encoding a polypeptide THYX.
  • the subject of the invention is also a method for screening an antibacterial or antiviral compound characterized in that it comprises the following steps: a) culturing cells expressing the thyX gene in the absence of expression of the thyA gene in a appropriate culture medium; b) bringing the cells into contact with a candidate compound to be tested; and c) selecting the candidate compounds inhibiting the thimydylate synthase activity of the polypeptide encoded by the thyX gene.
  • the compounds selected according to the screening method above are those for which an inhibition of thymidylate synthase activity is observed in cells, compared with the thymidylate synthase activity observed in cultures of control cells which are not used. presence of the candidate compounds to be tested.
  • the quantification of the thymidylate synthase activity can be carried out for example by incorporating radiolabelled uracil into the DNA of the cultured cells, according to techniques well known to those skilled in the art, the amount of radiolabelled dTTP in the DNA reflecting the level of thymidylate synthase activity in cell culture.
  • the cells cultured in step a) of the method are incubated in the presence of radiolabelled uracil, for example ( 3 H) -uracil or ( 1 C) -uracil.
  • radioactivity of dTTP in DNA is measured after hydrolysis of purified DNA using standard techniques (radioactivity counter).
  • the cell lysates are filtered on a nitrocellulose membrane retaining the DNA, then the radioactivity contained on the filter is measured using a suitable radioactivity counter.
  • the recombinant vector will be chosen so as to allow the expression of the THYX polypeptide in the host cell which is cultured during the process.
  • the invention also relates to the use of a recombinant vector comprising a nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined above or a variant of this polypeptide.
  • such a recombinant vector will comprise a nucleic acid chosen from the following nucleic acids: a) a nucleic acid coding for a polypeptide having an amino acid sequence chosen from the group of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37 or a variant of this polypeptide, optionally fused to a heterologous polypeptide; b) a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64, or a variant of the latter
  • vector within the meaning of the present invention is meant a circular or linear DNA or RNA molecule which is either in the form of single strand or double strand.
  • expression vectors comprising, in addition to a nucleic acid encoding a THYX polypeptide according to the invention, regulatory sequences making it possible to direct its transcription and / or its translation.
  • a recombinant vector according to the invention will notably comprise the following elements:
  • elements for regulating the expression of the nucleic acid to be inserted such as promoters and enhancers;
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in the cellular hosts in which their expression is sought, one or more selection markers.
  • the bacterial promoters could be the Lacl, LacZ promoters, the RNA polymerase promoters of bacteriophage T3 or T7, the PR or PL promoters of phage lambda.
  • Promoters for eukaryotic cells will include the HSV virus thymidine kinase promoter or the mouse metallothionein-L promoter.
  • HSV virus thymidine kinase promoter or the mouse metallothionein-L promoter.
  • those skilled in the art may advantageously refer to the work by SAMBROOK et al. (1989) cited above or to the techniques described by FULLER et al. (1996).
  • Vectors particularly suitable for expression of the nucleic acids according to the invention in bacteria are, for example, the vectors pQE70, pQE60 or pQE-9 (marketed by the company QIAGEN), the vectors pBluescript, Page script, pNH8A; pNH16a, pNH18a, pNH46A (sold by the company Stratagene), the vectors pKK223-3, pKK233-3, pDR540 and pRIT5 (sold by the company Pharmacia).
  • Vectors particularly suitable for expression in eukaryotic cells are for example the vectors pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG (sold by the company Stratagene), the vectors pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL (sold by the company Pharmacia)
  • a first vector preferably used in the context of the invention is the vector pcDNA3 sold by the company Invitrogen.
  • a second particularly preferred vector is the vector pBluescript SK (-), sold by the company Stratagene.
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the vectors pBR322 (ATCC37017) or also vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, USA). Mention may also be made of other commercial vectors such as the psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene) vectors.
  • baculovirus type vectors such as the vector pVL1392 / 1393 (Pharmingen) used to transfect cells of the Sf9 line (ATCC No. CRL 1711) derived from Spodoptera frugiperda.
  • adenoviral vectors such as human adenovirus type 2 or 5.
  • a recombinant vector according to the invention can also be a retroviral vector or also an adeno-associated vector (AAV).
  • AAV adeno-associated vector
  • Such adeno-associated vectors are for example described by FLOTTE et al.
  • the vector pBAD TOPO sold by the company Invitrogen is used, which allows expression of the thyX gene in E. coli which is precisely regulated by the presence or absence of arabinose in the medium of culture of cells transfected with such a recombinant vector, since the vector pBAD TOPO comprises the promoter PBAD which is inducible by arabinose. Examples of compounds inhibiting the thymidylate synthase activity of a THYX polypeptide.
  • THYX polypeptides inhibiting the thymidylate synthase activity of a THYX polypeptide are potentially anti-bacterial and / or antiviral compounds without undesirable effects or with reduced undesirable effects for mammals, including humans.
  • trimethoprim which is a specific inhibitor of dihydrofolate reductase. This fact indicates that growth is dependent on folate.
  • the invention also relates to the use of an antisense polynucleotide or oligonucleotide, capable of hybridizing specifically with the messenger RNA coding for a THYX polypeptide and capable of inhibiting or blocking its transcription and / or its translation.
  • an antisense polynucleotide or oligonucleotide capable of hybridizing specifically with the messenger RNA coding for a THYX polypeptide and capable of inhibiting or blocking its transcription and / or its translation.
  • Such a polynucleotide has the general structure which is defined in the present description for the probes and the primers according to the invention.
  • an antisense polynucleotide capable of being used according to the invention comprises a sequence corresponding to a sequence located in the region of the 5 ′ end of the messenger RNA, and most preferably near the translation initiation codon (ATG) of the nucleic acid encoding the THYX polypeptide.
  • ATG translation initiation codon
  • an antisense polynucleotide according to the invention comprises a sequence corresponding to one of the sequences located at the exon / intron junctions of a gene coding for the THYX polypeptide and quite preferably sequences corresponding to a splicing site.
  • An antisense polynucleotide according to the invention can be prepared from a nucleic acid encoding a THYX polypeptide chosen from the polypeptides of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37.
  • An antisense polynucleotide according to the invention can be prepared from a nucleic acid chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64.
  • the antisense polynucleotides must have a sufficient length and melting temperature to allow the formation of an intracellular duplex hybrid having sufficient stability to inhibit the expression of the mRNA encoding the THYX polypeptide considered.
  • Strategies for constructing antisense polynucleotides are notably described by Green et al. (1986) and Izant and Weintraub (1984).
  • an antisense polynucleotide according to the invention has a length of 15 to 200 nucleotides.
  • a sense polynucleotide of the invention thus has a length ranging from 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 to 75, 100, 150 or 200 nucleotides.
  • each of the antisense polynucleotides hybridizing with a region distinct from the gene or its messenger RNA.
  • Other methods of implementing the antisense polynucleotides are for example those described by Sczakiel et al. (1995) or those described in PCT application No. WO 95/24223.
  • THYX polypeptides as defined according to the invention in particular the polypeptides of amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 37, or the variants thereof as well as the homologous peptides, can be used for the preparation antibodies which can be selected for their ability to inhibit or block their thymidylate synthase activity.
  • the invention also relates to the use of antibodies directed against a THYX polypeptide to inhibit or block the thymidylate syn thase activity of this polypeptide.
  • Such antibodies directed specifically against a THYX polypeptide constitute a new illustrative example of a compound inhibiting the thymidylate synthase activity of a THYX polypeptide according to the invention.
  • Such antibodies potentially represent antibacterial or antiviral compounds.
  • antibody within the meaning of the present invention, is meant in particular polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example fragments F (ab) ' 2 , Fab) or any polypeptide comprising a domain of the initial antibody recognizing the polypeptide or the target polypeptide fragment according to the invention.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from hybridomas using the technique described by KOHLER and M1LSTEIN (1975).
  • the present invention also relates to antibodies directed against a polypeptide as described above or a fragment or a variant thereof, as produced in the trioma technique or also the hybridoma technique described by KOZBOR et al. (1983).
  • the invention also relates to fragments of single chain Fv antibody (ScFv) as described in US Patent No. 4,946,778 or by MARTINEAU et al. (1998).
  • the antibodies according to the invention also include fragments of antibodies obtained using phage banks RIDDER et al., (1995) or even humanized antibodies (REIMANN et al., 1997; LEGER et al., 1997) .
  • the invention also relates to an antibacterial or antiviral pharmaceutical composition
  • an antibacterial or antiviral pharmaceutical composition comprising, as active principle an antisense oligonucleotide specifically hybridizing with a messenger RNA coding for a THYX polypeptide as defined in the present description, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • an antisense oligonucleotide specifically hybridizing with the messenger RNA coding for a THYX polypeptide as defined in the present description for the manufacture of an antibacterial or antiviral drug.
  • Such a pharmaceutical composition will preferably comprise concentrations of antisense oligonucleotides which are at least equimolar to those of the corresponding messenger RNA in the cell.
  • excipients which can be used in combination with an antisense oligonucleotide as defined above, mention may be made of synthetic cationic molecules which bind to the anionic sites of the antisense oligonucleotide, which facilitates the passage of the antisense oligonucleotide through the cell membrane by non-specific endositosis, such as those described by Schofield in 1995 or those described by BEHR IN 1994.
  • excipient which can be used in combination with an antisense oligonucleotide according to the invention is the compound lipofectin TM, which is composed of a 1: 1 formulation DOTMA quaternary ammonium compound and dioleoylphosphatidylethalolamine, sonicated in the form of small unilamellar vesicles in water.
  • a subject of the invention is also an antibacterial or antiviral pharmaceutical composition comprising, as active principle, an antibody directed specifically against a THYX polypeptide as defined in the description, in association with one or more physiologically compatible excipients.
  • the invention also relates to the use of an antibody directed specifically against a THYX polypeptide as defined in the description for the manufacture of an antibacterial or antiviral drug.
  • the invention also relates to a method for the prevention or treatment of a bacterial or viral condition, said method comprising a step of administration of a therapeutically effective amount of an antisense oligonucleotide or of an antibody specific for a THYX polypeptide as described above.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be administered by any route, for example by intravenous, intramuscular, oral or mucausal route, in combination with a physiologically compatible vehicle and / or an adjuvant or excipient.
  • An antibody directed specifically against a THYX polypeptide is present in a pharmaceutical composition according to the invention in amounts suitable for daily administration of 10 nanograms to 10 mg of antibody, preferably from 100 nanograms to 1 mg and completely preferred from 1 ⁇ g to 100 ⁇ g of antibody.
  • the thyX genes have been found according to the invention in various bacteria and viruses pathogens for mammals, especially bacteria pathogens for humans, and viruses.
  • probes or primers derived from genomic nucleic acids or from messenger RNA encoding a THYX polypeptide constitute means for detecting the presence of a bacterium or a pathogenic virus in a sample, and more specifically d '' a biological sample taken from humans or animals, for example a sample of saliva, tears, blood, plasma or serum or a biopsy sample or a smear.
  • the nucleic acids derived from any of the nucleotide sequences encoding a THYX polypeptide as defined in the description, in particular the nucleic acids of sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64 are useful for detecting the presence of 'at least one copy of a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No 44 to SEQ ID No 64 or a fragment or a variant thereof in a sample.
  • nucleotide probes or primers according to the invention will have a length of 10, 12, 15, 18 or 20 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 10 ⁇ 0, 1500 consecutive nucleotides d 'a nucleic acid encoding a THYX polypeptide or a nucleic acid of complementary sequence.
  • a probe or a nucleotide primer according to the invention will consist and / or include fragments with a length of 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucleotides consecutive of a nucleic acid encoding a THYX polypeptide according to the invention, more particularly of a nucleic acid chosen from the sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • a probe and of a nucleotide primer according to the invention includes oligonucleotides which hybridize, under the conditions of high stringency hybridization defined below, with a nucleic acid coding for a THYX polypeptide, in particular a nucleic acid. chosen from the sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64 or with a sequence complementary to the latter. Definition of hybridization conditions
  • hybridization conditions within the meaning of the invention, is meant the following hybridization conditions:
  • Prehybridization same conditions as for hybridization duration: 1 night.
  • Tm temperature at which 50% of the paired strands separate
  • Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) +16.6 Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - (600 / number of bases) (SAMBROOK et al., (1989) , pages 9.54-9.62).
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the hybridization temperature is approximately 5 to 30 ° C, preferably 5 to 10 ° C below Tm.
  • the hybridization conditions described above are used for the hybridization of a nucleic acid 200 bases in length and can be adapted as a function of the length of the nucleic acid whose hybridization is sought or of the type chosen marking, according to techniques known to those skilled in the art.
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (1985) or also in the work of AUSUBEL et al. (1989).
  • the level and the specificity of hybridization depends on various parameters, such as: a) the purity of the preparation of the nucleic acid on which the probe or the primer must hybridize; b) the base composition of the probe or of the primer, the base pairs G-C having greater thermal stability than the base pairs A-T or A-U; c) the length of the homologous base sequence between the probe or the primer and the nucleic acid; d) ionic strength: the rate of hybridization increases with increasing ionic strength and the duration of the incubation time; e) the incubation temperature; f) the concentration of the nucleic acid on which the probe or the primer is to hybridize; g) the presence of denaturing agents, such as agents promoting the breaking of hydrogen bonds, such as formamide or urea, which increase the stringency of the hybridization; h) the incubation time, the incubation rate increasing with the duration of the incubation; i) the presence of bulk exclusion agents, such as dex
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method at phosphodiester from NARANG et al. (1979) or BROWN et al. (1979), the diethylphosphoramidite method of BEAUCAGE et al. (1980) or the solid support technique described in EU patent N ⁇ P 0 707 592.
  • Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a marker detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers can consist of radioactive isotopes ( 32 P, 33 P,, 3 H, 35 S,), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin .
  • the labeling of the probes is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers, or else by adding to the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in Southern type hybridizations with genomic DNA or also in hybridizations with the corresponding messenger RNA when the expression of the corresponding transcript is sought in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • Nucleotide probes or primers according to the invention can be immobilized on a solid support.
  • Such solid supports are well known to those skilled in the art and include surfaces of the wells of microtiter plates, polystyrene beds, magnetic beds, nitrocellulose strips, or even microparticles such as latex particles.
  • the subject of the invention is also the use of a sodium hydroxide or a nucleic acid primer hybridizing with a nucleic acid coding for a THYX polypeptide, as defined in the description, in a method for detecting a bacterium or a virus, especially a bacteria or virus pathogenic to mammals, including humans.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid as described above in a sample, said method comprising the steps of:
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support.
  • the oligonucleotide probes include a detectable marker.
  • the invention further relates to a kit or kit for detecting the presence of a nucleic acid according to the invention in a sample, said kit comprising: a) one or more nucleotide probes as described above; b) where appropriate, the reagents necessary for the hybridization reaction.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which can be used to detect target sequences of interest or alternatively to detect mutations in the coding regions or the non-coding regions of the nucleic acids according to the invention, more particularly of the acids nucleic acids of sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64 or the nucleic acids of complementary sequence.
  • the probes according to the invention immobilized on a support can be ordered in matrices such as "DNA chips". Such ordered matrices have been described in particular in the patent.
  • nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any of the nucleic acids according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 44 to SEQ ID No. 64, or again a variant of it.
  • Another subject of the invention relates to a method for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly a nucleic acid of sequences SEQ ID No. 44 to SEQ
  • ID No. 64 or a fragment or variant thereof contained in a sample, said method comprising the steps of: a) contacting the sample in which the presence of the target nucleic acid is suspected with a pair of 'nucleotide primers whose hybridization position is located respectively on the 5' side and on the 3 'side of the region of the target nucleic acid whose amplification is sought, in the presence of the reagents necessary for the amplification reaction; and b) detection of the amplified nucleic acids.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID N ° 44 to SEQ ID N ° 64 , said kit or kit comprising: a) a pair of nucleotide primers in accordance with the invention, the hybridization position of which is located respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the target nucleic acid, the amplification of which is sought; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
  • Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as described above.
  • the selection marker genes which are carried by the DNA molecule encoding the gene or genes of interest which it is desired to introduce into the host organism or the host cell, and which are consequently introduced into the host cell simultaneously to the genes of interest, make it possible to select the recombinant host cells.
  • a nucleic acid encoding a THYX polypeptide when used for the transfection of auxotrophic host cells for the synthesis of thymidine, constitutes an excellent marker for the selection of a transformation, transfection or recombination event of the host cell. Indeed, the introduction of a nucleic acid encoding a THYX polypeptide simultaneously with one or more genes of interest into the host cell restores the autotrophy of the host cell having successfully undergone transfection, transformation or recombination. In this way, one can select host cells having undergone the transfection, transformation or recombination event by pressure of selection of the medium, in particular by culturing the host cells in the absence of thymidine. In this case, only the host cells which have been recombined survive in the absence of thymidine in the culture medium. In addition, a nucleic acid encoding a THYX polypeptide is completely harmless to the environment.
  • Vectors comprising a nucleic acid encoding a THYX polypeptide as a selection marker gene can be prepared from conventional vectors according to techniques well known to those skilled in the art, for example from the preferred vectors according to the invention.
  • Another subject of the invention is the use of a nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined in the description as a marker for the selection of a transfection, transformation or genetic recombination event of a host cell or of 'a host organism.
  • a cloning and / or expression vector comprising a nucleic acid coding for a THYX polypeptide as defined in the description as marker genes for selection of a transfection, transformation or genetic recombination event.
  • ThyX The work of the inventors on the activity of ThyX has made it possible to identify the enzymatic mechanism and thus to optimize the reaction conditions by highlighting the importance of the addition of certain compounds in the reaction medium.
  • the invention therefore also aims at the use of such media and their application.
  • ThyX a reaction medium for the thymidylate synthase activity of ThyX, characterized in that it contains reduced flavins and CH 2 H 4 folate.
  • the reduced flavins of this medium are obtained by in situ reduction of oxidized flavins.
  • concentration of oxidized flavins is then from 50 ⁇ M to 1 mM, preferably 0.5 mM.
  • the oxidized flavins are mononucleotide flavins (FMN) and / or flavin adenine dinucleotides (FAD).
  • FMN mononucleotide flavins
  • FAD flavin adenine dinucleotides
  • the reduction of flavins can be carried out chemically, enzymatically, photochemically or electrochemically and more particularly, with
  • the concentration of CH 2 H 4 folate is from 50 ⁇ M to 2 mM, preferably 1 mM.
  • the medium can also comprise dUMP (uridine 5'-monophosphate), at a concentration ranging from 1 ⁇ M to
  • the concentration of NADH is 0.1 to 1 mM, and that in
  • NADPH from 0.5 to 5mM.
  • the invention further relates to screening methods.
  • it aims to provide a method for screening an antibacterial or antiviral compound in vitro in an acellular system characterized in that said method comprises the following steps: a) preparing a cell lysate from a culture of cells expressing a THYX polypeptide in the absence of a polypeptide encoded by a thyA gene and comprising a medium according to the invention; b) add to the cell lysate obtained in step a) the inhibitor compound to be tested; c) comparing the thymidylate synthase ThyX activity respectively in the cell lysate obtained in step a) and in the cell lysate obtained in step b); and d) selecting the candidate compounds for which an inhibition of ThyX thymidylate synthase activity has been detected.
  • dTMP is preferably used and
  • kits or kits for the screening of a ThyX thymidylate synthase inhibitor compound characterized in that it comprises: a) a composition comprising a THYX polypeptide and a medium according to the invention, in solution or in lyophilized form; b) optionally, one or more reagents necessary for the quantification of the ThyX thymidylate synthase activity.
  • the kit or kit necessary for the screening of an antibacterial or antiviral compound can also comprise: a) a recombinant expression vector comprising a nucleic acid encoding a ThyX polypeptide under the control of a functional promoter in a cell host in which its expression is sought or a host cell transfected with such a recombinant vector; b) a medium according to the invention; c) optionally, one or more reagents necessary for the quantification of ThyX thymidylate synthase activity.
  • Figure 5 presents biochemical analyzes of the ThyX of H.
  • ThyX spectroscopic analyzes of H. pylori indicate that ThyX is a flavoprotein.
  • the window shows the spectrum for the oxidized enzyme and the reduced dithionic protein.
  • Figure 6 illustrates the dTMP formation activity of the ThyX protein of H. pylori.
  • the enzymatic reactions were carried out as described in Table 1, using dUMP labeled in position 6.
  • the reaction products were analyzed using a C 18 reverse phase column by isocratic elution, using 10 mM phosphate buffer. .
  • the elution times for dUMP and dTMP were determined using the authentic references.
  • EXAMPLE 1 Expression of the THYX polypeptide of Helicobacter pylori in E. coli.
  • the DNAs comprising the open reading frame coding for the THYX polypeptide of Helicobacter pylori (strain 26.695) (sequence SEQ ID No. 21) was obtained by PCR amplification using the primers specific for sequences SEQ ID No. 38 and SEQ ID N ° 39 from the clone GHPEH26 publicly accessible from the AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION under the access number n ° 628.507.
  • DNA comprising the open reading frame encoding the THYX polypeptide of Pyrococcus. abyssi (ORSAY strain) (SEQ ID No. 12) was prepared by PCR amplification using primers specific for sequences SEQ ID No. 40 and SEQ ID No.
  • the DNA comprising the open reading frame coding for the THYX polypeptide of Campylobacter jejuni (strain NCTC 11168) (SEQ ID No. 27) was prepared by PCR amplification using primers specific for sequences SEQ ID No. 42 and SEQ ID No. 43 from genomic DNA publicly available from the ATCC (Aerican Culture Collection) under access number 7008199.
  • PCR amplification products were cloned into the vector pBAD TOPO TA activated by topoisomerase-1, marketed by the
  • the E. coli clones were characterized by sequencing the DNA inserts contained in the vector pBADTOPOTA.
  • FIG. 2A show that the expression of the THYX polypeptide is induced in the presence of 0.2% of> Arafo ⁇ ose in the culture medium, as has been detected using anti-V5 monoclonal antibodies marketed by the
  • the growth capacity of the E. coli strains expressing the THYX polypeptides of H. pylori and P. abyssi was determined after culturing the recombinant E. coli cells for 3 to 4 days in the presence or in the absence of a 0.2% concentration of Arabinose on a minimal M9 agar medium devoid of thymidine (Michaels et al., 1990).
  • the expression of the thyX gene of H. pylori in the strain of E. coli X2193 which was induced by Arabinosis made it possible to complement this strain of E.coli initially deficient in thymidylate synthase activity and restore the prototrophy of this strain of E.coli for thymidine.
  • the two recombinant E. coli strains were nevertheless capable of multiplying in a minimal agar medium in the presence of thymidine at the final concentration of 50 ⁇ g / ml.
  • the Helicobacter pylori GHPEH26 clone contains a 1.521 kb DNA insert corresponding to nucleotides 1613133-1611.613 of the ORF reference AE00511, locus 10, HP 1533, referenced in databases as DNA seq. Ace: AE000 511.
  • the clone GHPEH26 is marketed by the company TIGR / ATCC
  • the H. pylori thyX gene obtained by PCR from this clone represents a DNA fragment with a length of 693 bp.
  • the SDS PAGE electrophoresis gel results illustrated in FIG. 3 show that the strain of E. coli transformed with the DNA of Campylobacter jejuni produces a THYX polypeptide of the expected molecular weight.
  • ⁇ thyA gene encoding thymidylate synthase necessary for the synthesis of NOVO from dTMP; thyX, a new gene family involved in the biosynthesis of pyrimidines; DHFR, essential dihydrofolate reductase for recycling an essential methyl donor in the synthesis of dTMP; tdki thymidine kinase required for the rescue of exogenous thymidine which is then converted to dTMP; UPP, uracylphosphoribosyl transferase (UPRTase) required for the rescue of uracyl.
  • Table 2 the results of the tests for the presence in particular of the thyX and thyA genes are presented in some of the organisms listed in Table 1.
  • thyX gene in many bacteria and the eukaryotic DNA virus as well as in many bacteria pathogenic to humans makes it a preferred target for antibacterial or antiviral compounds that do not interfere with the metabolic pathway of the thymidylate synthase THYA present in humans.
  • DHFR genes encoding a dihydrofolate reductase, which is required for the recycling of an essential cofactor of thymidylate metabolism, CH 2 H -folate.
  • the starting DNA (“Template”) used is the plasmid pBAD TOPO, sold by the company InVitrogen, into which the thyX gene Helicobacter pylori 26695 has been inserted.
  • TAC Tyrosine 1 residue 10
  • ACT threonine
  • TTC phenylalanine
  • Glutamate 142 residue (codon “GAA”) was replaced respectively by the Alanine residues (codon “GCT”) and Aspartate (codon “GAT”), using the appropriate mutagenic oligonucleotides.
  • Glutamate 205 residue (codon "GAA") was replaced by the Leucine residue (codon "TTA”), using the appropriate mutagenic oligonucleotides.
  • a mutation by replacing histidine 71 with Glutamine leads to the production of a polypeptide capable of interacting with co- flavin factor, but which does not complement bacteria for thymidylate synthase activity.
  • Rhodobacter capsulatus has been inactivated (by "knock out”).
  • the bacteria deficient in THYX protein have expressed a phenotypic character of auxotrophy for thymidine, that is to say that they multiply only in the presence of thymidine.
  • These latest results clearly show that the THYX proteins are essential for the metabolism of thymidine.
  • These experiments show that the thyX proteins are essential for bacterial growth in the absence of thymidine, which proves the usefulness of the thyX gene or of the THYX polypeptide as a therapeutic target.
  • ThYX from H. pylori carrying a histidine marker on its carboxy terminus was purified from acellular extracts of strain ⁇ 2913 of E. coli subjected to arabinose induction by immobilized nickel affinity chromatography.
  • the expected molecular weights of PAB0861 and HP1533, comprising an amino-terminal translational activator sequence and a carboxy-terminal V5 region and epitopes of hexahistidine, are 33.7 and 31.5 kDa, respectively.
  • Protein expression was induced with 0.2% L-arabinose.
  • the proteins expressed were detected using V5-specific monoclonal antibodies (Invitrogen) according to the manufacturer's recommendations.
  • the ThyX protein with an antigenic site marked with H. pylori and biologically active was purified from 200 ml of cultures of pGL2 / E. coli X2913 [MhyA (Table 3)] after 2 hours of induction with 0.2% L-arabinose.
  • a QIA expression kit (Qiagen) under standard endogenous conditions was used for the purification as indicated by the manufacturer, comprising 10% (volume / volume) of glycerol in all the buffers.
  • the protein samples obtained were dialyzed against 50 mM of phosphate buffer, pH 7.4 and 10% glycerol (volume / volume) after elution to remove the imidazole.
  • the protein concentration in pure samples was estimated by reading A 2 8o, justifying the absorbance A 2 8o of the cofactor of flavin with non-covalent bond, at 35560 M "1 cm '1 , calculated with respect to the known sequence of amino acids, and was used for the ThyX apoprotein from H. pylori.
  • the protein preparations obtained usually contained 1 to 2 mg / ml of protein, with a molecular mass of approximately 31 kDa on SDS-PAGE gels (the expected molecular mass of ThyX from H. pylori is 31 , 5 kDa) ( Figure 5A), and had a light yellow color.
  • Spectroscopic analyzes of the isolated (oxidized) protein showed absorbance characteristics typical of a flavoprotein ( Figure 5B), with large peaks at 447.5 and 375 nm. These absorption peaks were found to be absent in the enzyme reduced to dithionite. Similar absorption characteristics were found for the cofactor after it was released from the protein by heat denaturation at 80 ° C for 5 minutes.
  • the cofactor associated with the ThyX of H. pylori was identified as a FAD (flavin-adenine dinucleotide). It has been estimated that the various ThyX enzyme preparations of H. pylori contain 0.4 to 0.5 molecules of FAD per monomer. In all, these spectroscopic properties indicate that H. pylori ThyX is a flavoprotein and or uses flavin cofactors in catalysis.
  • the loss of [5-H] dUMP tritium in the solvent is a compulsory intermediate, making it possible to quantify the activity of thymidylate synthetase after elimination of the radioactive nucleotides from the reaction mixtures (ROBERTS, 1966).
  • the purified ThyX protein was used to the same extent.
  • the N 5 , N 10 -CH 2 H folate was formed in a non-enzymatic manner, by incubation of 2 mM of tetrahydrofolic acid (Sigma®) with 100 mM of ⁇ -mercaptoethanol and 20 mM of formalin for 30 minutes in the dark and at room temperature.
  • the tritium release assays with a purified enzyme were carried out in 50 mM Tris-CI, pH 7.9, comprising a preparation of 1 mM CH 2 H 4 folate obtained as described above.
  • the control reactions were carried out under analogous conditions, without tetrahydrofolic acid.
  • the reactions at 50 ⁇ l were started by adding 6 ⁇ M of [5- 3 H] dUMP, the specific activity at 16.2 Ci / mmol (Amersham) and stopped after 60 minutes at 37 ° C by two extractions with 250 ⁇ l activated carbon [10% (weight / volume) of Norit A] in 2% trichloroacetic acid to remove the nucleotides from the reaction mixtures.
  • the residual radioactivity in the supernatant was determined according to MYLLYKALLIO (2000).
  • ThyX catalyzes in vitro the release of tritium from (5- 3 H) dUMP as a function of the protein concentration and in a CH 2 H dependent folate manner, which demonstrates the biochemical activity of the proteins ThyX.
  • Optimized reaction conditions are reported in Table 3. Table 3. Optimization of the reaction conditions for the ThyX protein from H. pylori
  • the complete test contains 50 mM Tris-HCI, pH 7.0, 1 mM CH 2 H 4 folate preparation, 10 mM MgCl 2 , 2 mM NADPH, 1 mM NADH, 0.5 mM FMN and 9 ⁇ M 3H-dUMP (specific activity 1, 7357 Ci / mmol).
  • the preparation of CH 2 H folate is obtained by incubation for 30 minutes in the dark of 2 mM of H -folate, of 96 mM of 2-mercaptoethanol and of 42 mM of formaldehyde and of 50 mM of Tris-HCl.
  • the FMN can be effectively replaced by FAD (flavin adenine di-nucleotide).
  • 20 ⁇ M of dUMP and 100 ⁇ M of CH 2 H folate are sufficient to saturate the tritium release activity of the ThyX protein of H. pylori during an incubation of 60 minutes.
  • fluoro-dUMP has also been shown to act as an inhibitor of THYX proteins. These results show that deoxynucleotides monophosphates can be used to identify new THYX inhibitors. For practical application, these results also show that the tests are also useful for targeting the THYX proteins.
  • ThyA uses H folate electrons for the formation of the methyl functional group.
  • CH 2 H 4 folate functions in the reaction catalyzed by ThyX only as a carbon donor, thereby causing the formation of H 4 folate as a reaction product.
  • This reaction mechanism clearly explains why dihydrofolate reductase is not essential for the formation of thymidylate by the ThyX proteins (Table 4).
  • Tdk thymidine kinase, necessary for the recovery of. exogenous thymidine.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the Serine residue is either absent or located at the amino terminal end of the protein.

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Abstract

L'invention est relative aux diverses utilisations d'une nouvelle famille d'enzymes, désignée THYX, capables de catalyser la synthèse de la thymidine 5'-monophosphate en l'absence d'une enzyme thymidylate synthase (ThyA) active. L'invention concerne aussi des milieux de réaction pour l'activité thymidylate synthase d'un polypeptide THYX ainsi que des procédés de criblage mettant en uvre lesdits milieux réactionnels, ainsi que des kits pour la mise en luvre de ces procédés.

Description

Utilisations d'un polypeptide THYX ou d'un acide nucléique codant un tel polypeptide, notamment pour le criblage de composés anti-bactériens ou anti-viraux
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine des enzymes participant à la synthèse de l'ADN, et plus spécifiquement à la synthèse d'un composé intermédiaire, la thymidine 5'-monophosphate (dTMP), requis pour la production de la thymidine 5'-triphosphate (dTTP) constitutive de la molécule d'ADN.
Elle est également relative aux diverses utilisations d'une nouvelle famille d'enzymes, désignée THYX, capables de catalyser la synthèse de la thymidine 5'-monophosphate en l'absence d'une enzyme thymidylate synthase (ThyA) active. L'invention concerne aussi des milieux de réaction pour l'activité thymidylate synthase d'un polypeptide THYX ainsi que des procédés de criblage mettant en œuvre lesdits milieux réactionnels, ainsi que des kits pour la mise en œuvre de ces procédés.
ART ANTERIEUR
Le déoxythymidylate, au contraire des autres déoxynucléotides, n'est pas produit directement par une ribonucléotide réductase. Le thymidine 5'-monophosphate (dTMP) est décrit dans l'état de la technique comme étant le produit final de la méthylation de l'uridine 5'- monophosphate (dUMP), méthylation qui est catalysée par une thymidylate synthase de type THYA, aussi bien chez les eucar otes que chez les bactéries (Carreras et Santi, 1995). La thymidylate synthase THYA, qui est également exprimée chez les mammifères, a été envisagée comme cible potentielle de composés inhibiteurs de la synthèse d'ADN , utilisables notamment dans le traitement du cancer colorectal (Papamichael, 2000).
Une illustration simplifiée de la production dTMP dans la cellule par méthylation du dUMP est représentée dans le schéma 1 ci-après. Schéma 1
F-dUMP (de 5-FU) (-) Thymidylate synthase dUMP dTMP
+ +
H2-Folate <~ <- H4 folate
dihydrofolate réductase ; (-) amethop tterine ; aminopterine; trimethoprim
Dans le Schéma 1 , on représente la synthèse de dTMP chez les bactéries et l'ensemble des eucaryotes par méthylation réductrice du dUMP sous l'action de la thymidylate synthase THYA.
Un autre composant, essentiel pour la synthèse de dTMP, est l'enzyme dihydrofolate réductase (DHFR), dont l'activité catalytique est nécessaire pour le recyclage du dihydrofolate via la formation d'un cofacteur actif, le CH2H4 folate, qui agit comme un donneur de méthyle. La thymidylate synthase peut être inactivée par un fluoro-dUMP et la DHFR peut être inactivée notamment par l'améthopterine et l'aminopterine et le trimethoprim, qui sont des dérivés du folate. (voir Schéma 1).
Les nombreux travaux de recherche réalisés sur la voie de synthèse des composés pyrimidine ont tous montré que la synthèse intracellulaire de dTMP ne pouvait être catalysée que par une seule enzyme, la thymidylate synthase codée par le gène thyA (voir Annual. Reviews on Biochemistry, 1995, vol. 64:721-762; Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2001 , vol.2, 147-151 ).
De plus, des travaux réalisés sur les inhibiteurs de la thymidylate synthase pour le traitement du cancer colorectal avancé précisent que « une caractéristique importante du métabolisme des nucléotides est la duplication des voies métaboliques ; l'inhibition de n'importe quelle enzyme peut être contournée par une ou plusieurs voies alternatives. Toutefois, une exception notable à cette règle est la thymidylate synthase thyA, qui est une enzyme incontournable constituant le seul moyen d'ajouter un groupe méthyle en position 5 du cycle pyrimidine dans la synthèse de novo de la thymidine (Papamichael, 1999).
SOMMAIRE DE L'INVENTION De manière surprenante, il a été montré selon l'invention qu'une famille de polypeptides, désignés THYX , qui sont d'une structure complètement distincte des polypeptides codés par les gènes thyA, possèdent la capacité de synthétiser le dTMP dans les cellules.
En particulier, il a été montré selon l'invention que des cellules possédant un gène codant pour un polypeptide THYX possédait une activité thymidylate synthase, en l'absence de gène thyA. Il a aussi été montré que l'introduction d'une copie d'un gène thyX, codant pour un polypeptide THYX dans une cellule auxotrophe pour la thymidine permettait de restaurer, dans cette cellule, la capacité de synthétiser de novo le dTMP et finalement le thymidylate.
Il a aussi été montré selon l'invention que les gènes thyX sont retrouvés dans le génome de nombreuses bactéries, bactériophages et virus bactériens ou eucaryotes, alors qu'ils sont absents dans le génome des mammifères, en particulier dans le génome humain. La caractérisation, selon l'invention, d'une nouvelle voie de synthèse du dTMP, grâce à la famille des protéines THYX a rendu pour la première fois accessible à l'homme du métier les nombreuses applications qui en découlent directement et qui sont exposées dans la présente description. Les différentes utilisations d'un polypeptide THYX ou d'un acide nucléique codant un polypeptide THYX exposées dans la présente demande de brevet sont liées techniquement du fait des caractéristiques fonctionnelles et structurales communes des polypeptides THYX définis ci-dessous.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide THYX comprenant la séquence d'acides aminés suivante : X1HR(X)7S, dans laquelle :
- Xi représente l'acide aminé R (Arginine ou Arg) ou K (Lysine ou Lys), et - (X)7 est une chaîne de sept acides aminés consécutifs dans laquelle chaque X représente, indépendamment l'un de l'autre, l'un quelconque des 20 acides aminés naturels, dans un procédé de synthèse in vitro de la thymidine 5'-monophosphate (dTMP).
- S représente l'acide aminé Serine ou Ser, selon le code à une lettre conforme à la nomenclature internationale.
De préférence, Xi représente l'acide aminé R. De préférence, le polypeptide THYX est choisi parmi les polypeptides comprenant les séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini ci-dessus pour la production dudit polypeptide THYX. De préférence, l'acide nucléique est choisi parmi les acides nucléiques comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un polypeptide THYX tel que défini ci-dessus dans un procédé de criblage de composés inhibiteurs de thymidylate synthase, notamment de composés antibactériens ou antiviraux.
Elle est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini ci-dessus dans un procédé de criblage de composés inhibiteurs de thymidylate synthase, notamment de composés anti-bactériens ou anti-viraux.
Elle a aussi pour objet l'utilisation d'un oligonucléotide antisens hybridant spécifiquement avec l'ARN messager codant pour un polypeptide THYX pour inhiber in vitro la synthèse d'ADN dans une bactérie ou un virus. Elle est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini ci-dessus comme marqueur de sélection d'un événement de recombinaison génétique.
Elle concerne aussi l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique spécifique d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX pour détecter une bactérie ou un virus, particulièrement une bactérie ou un virus pathogène pour les mammifères, et plus spécifiquement pour l'homme, ainsi qu'un nécessaire ou kit pour détecter cette bactérie ou ce virus, comprenant une sonde ou une amorce nucléotidique spécifique d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX .
Egalement, les travaux des inventeurs sur l'activité de ThyX ont permis d'identifier le mécanisme enzymatique et ainsi d'optimiser les conditions de la réaction en mettant en évidence l'importance de l'addition de certains composés dans le milieu réactionnel. L'invention a donc pour but l'utilisation de tels milieux et leur application.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 illustre un alignement des séquences d'acides aminés de divers polypeptides THYX.
Dans la colonne de gauche sont indiqués le nom des organismes desquels proviennent chacune des séquences d'acides aminés.
Les numéros identifient le numéro d'ordre de l'acide aminé du début de la lignée correspondante, dans la séquence du polypeptide THYX de l'organisme.
La figure 2A représente des gels d'immunoempreintes réalisés sur des extraits cellulaires obtenus à partir de bactéries E.co// X2913(ΔfhyA) transfectées avec le gène ThyX de P.abyssi (pistes numéro 1 et numéro
2) ou de bactéries E. coli X 2913 (ΔthyA) transfectées avec le gène thyX de H.pylori (pistes numéro 3 et numéro 4).
Les bactéries E.coli transformantes ont été cultivées en l'absence d'Araj /nose (pistes numéro 1 et 3) ou en présence de 0,2% ά'Arabinose (pistes numéro 2 et 4). Les bandes visibles sur le gel d' immunoempreintes (3Westem blot ») correspondent respectivement au polypeptide THYX de P.abyssi (piste numéro 2) et au polypeptide THYX de H.pylori (piste numéro 4).
La figure 2B illustre des clichés photographiques de boîtes de Pétri qui ont été ensemencées :
- sur la partie gauche, par une bactérie E.coli X2193 (ùάhyA) transformée avec le gène thyX de H.pylori ; et - sur la partie droite, avec des bactéries E.coli X2193 (AthyA) transformées avec le gène thyX de P.abyssi.
Le cliché de gauche montre les résultats de croissance de la bactérie E.coli transformée cultivée sur de la gélose (agar) en milieu minimum M9 additionné de 0,2%
Figure imgf000007_0001
Seules les bactéries E.coli transformées avec le gène thyX de H.pylori se multiplient.
Le cliché de droite représente les mêmes bactéries cultivées dans la gélose en présence de milieu minimal M9 en l'absence d'Arabinose. Aucune croissance bactérienne n'est observée, quelle que soit la bactérie transfectée.
La figure 3 : Migration sur gel SDS PAGE coloré avec Bleu de Comassie. Le premier puits correspond au marqueur Mid-Range de PROMEGA. Les flèches montrent les poids moléculaires qui correspondent aux bandes du marqueur. Le deuxième puits contient l'échantillon de notre protéine, après l'avoir purifiée sur une colonne de Ni-NTA, sa bande se trouve à environ 28 kDa.
La figure 4 : Western Blot des fractions après la purification de la protéine sur une colonne de Ni-NTA démontrent purification de THYX.
M = marqueur Mid-Range PROMEGA,
TF = la première fraction après l'incubation de la protéine avec la résine, L = fraction après le lavage E1 = protéine éluée. La figure 5 présente des analyses biochimiques de la ThyX de H.
Pylori.
La figure 6 illustre l'activité de formation du dTMP de la protéine ThyX de H. pylori.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il a été montré pour la première fois selon l'invention qu'une famille de polypeptides, désignée THYX, distincte de la famille des polypeptides codés par les gènes thyA , possédait une activité catalytique du type thymidylate synthase. Le demandeur a clone le gène thyX de H. Pylori dans un vecteur d'expression fonctionnel dans Escherichia coli. Ce vecteur d'expression a été utilisé pour transformer une souche de Escherichia coli auxotrophe pour la thymidine, plus spécifiquement la souche de E. coli X2913 (MhyA572), dont le fond génétique est précisément caractérisé et dans laquelle le gène thyA est délété. Les résultats présentés dans les exemples montrent que l'expression du gène thyX qui a été artificiellement introduit dans la souche X2913(ΔfhyA) a permis de restaurer la capacité de E.coli à synthétiser de novo le dTMP. Du fait de la grande connaissance accumulée sur les caractéristiques du génome de E.coli ainsi que sur la voie de synthèse normale du dTMP via l'expression de la thymidylate synthase THYA, les résultats obtenus montrent que le produit d'expression du gène myX de H. Pylori pallie directement le défaut de production du polypeptide THYA dans cet organisme bactérien.
Par une étude d'homologie de séquences, il est montré selon l'invention que des polypeptides possédant des séquences homologues aux polypeptides THYX de Helicobacter pylori (SEQ ID n°21) étaient également codés par le génome de nombreuses bactéries, Archaebacteries bactériophages ainsi que dans certains virus.
De manière surprenante, il est aussi montré selon l'invention que toutes les bactéries, Archae bactérie et virus possédant dans leur génome une copie d'un gène thyX ne possèdent pas simultanément le gène thyA, antérieurement connu comme le seul gène capable d'assurer la synthèse du dTMP. Ces organismes possédant le gène myX en l'absence du gène thyA ne comprennent pas non plus de copie du gène tdk codant la thymidine kinase requise pour l'incorporation intracellulaire de thymidine exogène qui est ensuite convertie dans la cellule en dTMP, à l'exception notable de la bactérie Mycobacterium tuberculosis. La présence simultanée des gènes thyA et thyX chez M.tuberculosis est probablement due à un événement de transfert de gène.
L'exclusion mutuelle des gènes thyA et thyX dans le génome des organismes mentionnés ci-dessus montre clairement que thyX supplée la fonction thymidylate synthase qui n'est plus assurée en l'absence de thyA. De plus, seul le gène thyA est systématiquement absent du génome des bactéries possédant le gène thyX , alors que d'autres gènes impliqués dans le métabolisme des nucléotides sont indifféremment présents ou absents dans le génome de ces organismes.
Il est aussi montré selon l'invention que les bactéries déficientes en thyA et dans lesquelles est présent le gène thyX sont, pour la plupart, des bactéries pathogènes pour les mammifères. On peut citer notamment Campylobacter jejuni qui provoque des intoxications alimentaires, Helicobacter pylori qui est un agent causal des ulcères, Rickettsia prowazekii qui est un agent causal du typhus, Borrelia burgdorferi qui est impliqué dans la maladie de Lyme, Treponema pallidum qui est l'agent causal de la syphilis, les bactéries du genre Chlamydiae qui sont des pathogènes intracellulaires obligatoires ainsi que des virus à ADN eucaryotes tels que le Chorella virus.
On a aussi montré selon l'invention que des bactéries dans lesquelles le gène thyX a été inactivé deviennent auxotrophes pour la thymidine, c'est à dire qu'elles ne se multiplient que si l'on ajoute de la thymidine exogène dans le milieu de culture..
Toutes les protéines appartenant à la famille THYX possédant une activité thymidylate synthase nouvellement identifiée selon l'invention possède en commun les caractéristiques structurales et fonctionnelles indiquées ci-dessous :
Caractéristiques structurales : a) Les gènes thyX codent, tous sans exception, pour un polypeptide THYX comprenant la séquence d'acides minés suivante : Xi H R(X)7 S, dans laquelle :
- Xi représente l'acide aminé R (Arginine ou Arg) ou K (Lysine ou Lys), et
- (X) est une chaîne de sept acides aminés consécutifs dans laquelle chaque X représente, indépendamment l'un de l'autre, l'un quelconque des 20 acides aminés naturels.
De préférence, Xi représente l'acide aminé R. Xi représente K, notamment pour le polypeptide THYX codé par le génome du Roseophage S101. b) Comme le montre clairement l'alignement des séquences d'acides aminés de protéines THYX d'origines diverses représenté à la figure 1 , les polypeptides THYX possèdent un résidu d'acide aminé serine conservé. De plus, les résultats des expériences de mutagenèse réalisés sur le gène thyX de Helicobacter pylori, présentés dans les exemples, montrent que l'acide aminé conservé serine est indispensable à l'activité catalytique du polypeptide THYX, puisque le remplacement du résidu serine respectivement par un résidu cystéine ou par un résidu alanine aboutit à la production d'un polypeptide qui est incapable de complémenter la déficience en polypeptide THYA dans la souche de E.coli X de 2913 (ΔthyA). c) Les polypeptides THYX ne possèdent pas de résidus d'acides aminés cystéines conservés dans leurs séquences, contrairement aux polypeptides codés par les gènes thyA , dans lesquels le résidu cystéine conservé a un rôle essentiel nucléophile dans la réaction de méthylation catalysée par les polypeptides THYA. d) En utilisant le logiciel BLAST (version 2.0) avec les paramètres par défaut, puis le module Psi-BLAST pour réaliser des cycles itératifs de recherche d'homologie avec la séquence du polypeptide THYX de H. Pylori comme « appât », aucune séquence cible de thymidylate synthase thyA n'a été sélectionnée, ce qui montre l'absence d'homoogie entre les gènes thya et thyX.
Caractéristiques fonctionnelles a) Un polypeptide THYX selon l'invention est capable de catalyser l'oxydation du méthylène tétrahydrofolate en tétrahydrofolate, ce qui est une caractéristique de l'activité catalytique du type thymidylate synthase, et montre que les polypeptides THYX appartiennent à la classe des enzymes de type thymidylate synthase. b) la croissance de microoganismes transformés par un gène thyX peut être inhibée par une forte concentration de trimethoprim, qui est un inhibiteur spécifique de la dihydrofolate réductase ; le fait que seules de fortes concentrations de trimethoprim inhibent THYX suggère qu'il existe des différences fonctionnelles entre les voies métaboliques de formation du thymidylate dans lesquelles sont impliquées respectivement thyA et thyX. c) des bactéries dans lesquelles le gène thyX a été inactivé deviennent auxotrophes pour la thymidine ; d) un polypeptide THYX selon l'invention n'est catalytiquement actif qu'en présence d'un co-facteur du type flavine. On peut noter que les polypeptides codés par les gènes thyA, antérieurement connus comme les seuls gènes codant pour des enzymes du type thymidylate synthase, sont actifs sans requérir la présence de flavine ; Sont inclus dans les polypeptides appartenant à la famille de polypeptides THYX possédant des caractéristiques structurales et fonctionnelles définies ci-dessus les polypeptides THYX comprenant les séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37.
Les polypeptides THYX de séquences SEQ ID n°1 à SEQ ID n°37 ont été rendus accessibles au public notamment par leur publication dans les bases de données de séquences d'acides aminés.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un polypeptide THYX comprenant la séquence d'acides aminés suivante : Xi HR(X)7 S, dans laquelle - Xi représente l'acide aminé R (Arginine ou Arg) ou K (Lysine ou
Lys), et
- (X)7 est une chaîne de sept acides aminés consécutifs dans laquelle chaque X représente, indépendamment l'un de l'autre, l'un quelconque des 20 acides aminés naturels, dans un procédé de synthèse in vitro de la thymidine 5'-monophosphate (dTMP).
De préférence, l'acide aminé Xi représente l'acide aminé R. Afin de réaliser la synthèse in vitro de dTMP à l'aide d'un polypeptide THYX selon l'invention, l'homme du métier peut notamment se référer aux exemples de la présente demande de brevet, dans lesquels l'activité thymidylate synthase du polypeptide THYX de Helicobacter pylori (SEQ ID N°21) est mise en évidence dans des extraits cellulaires par la détection de la réaction d'oxydation du composé méthylène tétrahydrofolate. De préférence, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce que le polypeptide THYX est choisi parmi les polypeptides comprenant les séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37.
Selon un autre aspect, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce que le polypeptide THYX est choisi parmi les polypeptides consistant en les séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à seq id N°37.
Le polypeptide THYX de séquences en acides aminés SEQ ID N°5 est codé par un gène provenant de l'organisme Dictyostelium discodideum qui a été décrit en 1989 par Dynes et Firtel, et désigné « Thy1 » par ces auteurs.
Cependant, DYNES et FIRTEL avaient explicitement exclu que le gène Thy1 de Dictyostelium discoideum, puisse coder une thymidylate synthase. La voie de biosynthèse de la thymidine par Oictyostelium discoideum, qui n'est toujours pas connue à ce jour, était a fortiori inconnue en 1989, comme étaient inconnues aussi les bases moléculaires causales de l'autotrophie de la thymidine. De plus, l'organisme Oictyostelium discoideum n'a pas encore fait l'objet de travaux de séquençage systématique de son génome. A fortiori, en 1989, on ne disposait d'aucune donnée concernant la caractérisation du fond génétique de cet organisme, ce qui constitue encore aujourd'hui une barrière technique insurmontable pour identifier le rôle fonctionnel direct d'une mutation, en particulier d'une mutation provoquant une altération d'une voie métabolique aussi complexe que celle des nucléotides, en particulier du nucléotide thymidine. De fait, DYNES et FIRTEL n'avaient pas caractérisé la nature de la mutation chez Dictyostelium discoideum. La fonction de l'insert d'ADN du clone permettant de complémenter l'organisme afin de restaurer l'autotrophie par la thymidine était totalement inconnue. De plus, depuis 1989, les nombreuses équipes de recherches étudiant la voie de biosynthèse cellulaire du dTMP ont continué d'accumuler des résultats expérimentaux montrant que la thymidilate synthase codée par les gènes thyA serait l'unique voie de synthèse du dTMP (D. PAPAMICHAELThe Oncologist , 1989, précité).
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini ci-dessus en vue de produire ledit polypeptide THYX pour sa mise en œuvre dans les différentes utilisations d'un polypeptide THYX décrites dans la présente description.
A partir des séquences en acides aminés SEQ ID N°1 , à SEQ ID N°37 et/ou des séquences nucléotidiques SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64, l'homme du métier est capable de détecter, isoler, cloner et caractériser tout acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini ci- dessus, par exemple en synthétisant des sondes nucléotidiques spécifiques d'un acide nucléique codant le peptide XιHR(X)7S ou RHR(X)7 S. Pour construire de telles sondes, l'homme du métier peut adapter leur séquence en fonction de l'usage du codon pour un organisme déterminé. La détection d'un gène thyX peut être réalisée par hybridation sur un gel d'ADN (« Southern Bot ») ou encore par amplification PCR, par exemple en utilisant la sonde définie ci-dessus comme amorce nucléotidique.
Par exemple, le gène thyX de H. Pylori peut être isolé à l'aide des amorces nucléotidiques de séquences SEQ ID N°38 et SEQ ID N°39 et le gène thyX de P.abyssi peut être isolé à l'aide des amorces nucléotidiques de séquences SEQ ID N°40 et SEQ ID N°41. Le gène thyX de Campylobacter jejuni peut être isolé à l'aide des amorces nucléotidiques de séquences SEQ ID N°42 et SEQ ID N°43.
De préférence, l'acide nucléique codant pour un polypeptide THYX est choisi parmi les acides nucléiques codant pour un polypeptide THYX comprenant l'une des séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37.
Selon un autre aspect, l'acide nucléique est choisi parmi les acides nucléiques codant pour un polypeptide THYX consistant en une des séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37. Avantageusement, l'acide nucléique est choisi parmi les acides nucléiques comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64.
Font partie des polypeptides THYX susceptibles d'être mis en œuvre selon l'invention les polypeptides THYX possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide THYX choisi parmi les séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37.
Font partie des acides nucléiques codant pour un polypeptide
THYX susceptible d'être mis en œuvre selon l'invention un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64.
Identité entre deux acides nucléiques ou entre deux polypeptides
Aux fins de la présente description, l'expression « séquence nucléotidique » est employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression « séquence nucléotidique » englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 95% d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 95%, de préférence au moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en nucléotides avec ce second polynucléotide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous.
Selon l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 95% d'identité avec un second polypeptide de référence, possédera au moins 95%, de préférence au moins 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1 %, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec ce second polypeptide de référence, le pourcentage d'identité entre deux séquences étant déterminé comme décrit ci-dessous. Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides comparés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière préférée, le pourcentage d'identité de séquences est déterminé à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2.06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Un acide nucléique possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique selon l'invention englobe les " variants " d'un acide nucléique selon l'invention.
Par " variant " d'un acide nucléique selon l'invention, on entend un acide nucléique qui diffère de l'acide nucléique de référence par une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'un nucléotide, par rapport à l'acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant allélique qui existe naturellement. Un tel acide nucléique variant peut être également un acide nucléique non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagenèse.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique " variant " sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant. Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant. De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide THYX qui conserve l'activité catalytique d'une thymidylate synthase, qui peut notamment être détectée par la capacité du polypeptide THYX à oxyder le methylene-tetradihydrofolate in vitro ou encore à restaurer la capacité d'une bactérie ou d'une cellule eucaryote déficiente en thymidylate synthase THYA à synthétiser l'ADN, comme cela est décrit dans les exemples.
De manière tout à fait préférée, un polypeptide THYX variant ne comprendra aucune modification d'acide aminé sur le motif XιHR(X)7S, et l'acide aminé Serine conservé est présent. Font partie des polypeptides THYX susceptibles d'être mis en œuvre selon l'invention, les polypeptides THYX codés par un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Sont également inclus dans la définition d'un polypeptide THYX selon l'invention les polypeptides THYX comprenant une ou plusieurs substitutions d'acides aminés dans l'une des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37 par une acide aminé « équivalent ». Sont compris dans la définition d'acides aminés "équivalents" les acides aminés appartenant à la même classe, tels que les acides aminés acides (D et E), basiques (K, R et H), non polaires (A, V, L, I, P, M, F et W) ou encore polaires non chargés (G, S, T, C, Y, N et Q).
Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues " à l'un quelconque des polypeptides THYX de séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37, ou de leurs variants. De tels polypeptides homologues ont des séquences d'acides aminés possédant une ou plusieurs substitutions d'un acide aminé par un acide aminé équivalent, par rapport aux polypeptides de référence.
On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par KOCH (1977). Selon un autre aspect, sont également considérés comme des acides aminés équivalents deux acides aminés appartenant à la même classe, c'est-à-dire deux acides aminés acide, basique, non polaire ou encore polaire non chargé.
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés. Ces polypeptides conserveront également leur activité catalytique thymidylate synthase.
De préférence, un polypeptide THYX ou un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX susceptible d'être mis en œuvre selon l'invention se présente sous la forme isolée ou purifiée.
Le terme "isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polypeptide ou un polynucléotide présent à l'état naturel dans un animal ou une plante n'est pas isolé. Le même polypeptide séparé de son environnement naturel ou le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de l'animal ou de la plante est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé, du fait que le vecteur ou la composition ne constituent pas son environnement naturel.
Le terme "purifié" ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative. Un polypeptide ou un polynucléotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur. Font également partie de l'invention les polypeptides THYX de séquence SEQ ID N°1 à SEQ ID N° 37 rendus résistants à la protéolyse par l'introduction d'une ou plusieurs liaisons non peptidiques, telles qu'une liaison réduite (CH2NH), une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison méthylène-oxy (CH2-O), une liaison thiométhylène (CH2-S), une liaison carba (CH2-CH2), une liaison cétométhylène (CO-CH2), une liaison hydroxyéthylène (CHOH-CH2) ou encore une liaison CH=CH.
Dans tous les cas, un polypeptide THYX susceptible d'être mis en œuvre selon l'invention conserve l'activité catalytique d'une thymidylate synthase, qui peut notamment être détectée par la capacité du polypeptide THYX à oxyder le methylene-tetradihydrofolate in vitro ou encore à restaurer la capacité d'une bactérie ou d'une cellule eucaryote déficiente en thymidylate synthase THYA à synthétiser l'ADN, comme cela est décrit dans les exemples.
Production d'un polypeptide THYX susceptible d'être mis en œuyre selon l'invention.
L'invention est également relative à un procédé pour la production de l'un des polypeptides THYX tels que définis ci-dessus, en particulier d'un polypeptide choisi parmi les polypeptides THYX de séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37 ou d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Les polypeptides THYX selon l'invention peuvent être caractérisés par fixation sur une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre ce polypeptide ou contre un fragment ou un variant de ce dernier ont été préalablement immobilisés.
Selon un autre aspect, un polypeptide THYX recombinant selon l'invention peut être purifié par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art. Un polypeptide THYX selon l'invention peut être également préparé par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.
A titre illustratif, un polypeptide THYX selon l'invention pourra être préparé par la technique ou en solution homogène décrite par HOUBEN WEYL (1974) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par MERRIFIELD (1965a; 1965b).
PROCEDES DE CRIBLAGE DE COMPOSES INHIBITEURS DE THYMIDYLATE SYNTHASE Comme cela a déjà été exposé précédemment, les gènes thyX sont retrouvés dans de nombreuses bactéries pathogènes pour les mammifères, en particulier pathogènes pour l'homme et dans certains virus. De plus, au contraire des gènes thyA, les gènes fhyX ne sont pas retrouvés dans le génome des mammifères. En particulier, le génome humain est dépourvu d'un gène fhyX.
En conséquence, les polypeptides THYX et les acides nucléiques codant pour les polypeptides THYX constituent des cibles privilégiées pour des composés inhibant spécifiquement l'expression des gènes thyx ou inhibant spécifiquement l'activité thymidylate synthase des polypeptides THYX. De tels composés inhibiteurs sont susceptibles d'inhiber la synthèse d'ADN dans de nombreuses bactéries, bactériophages et virus, en particulier ceux qui sont pathogènes pour les mammifères, y compris l'homme, ainsi que la multiplication de ces bactéries, ces bactéries et ces virus, tout en ne provoquant pas d'effets indésirables chez les mammifères, ou tout au moins en provoquant des effets indésirables très réduits chez les mammifères, y compris l'homme, dont le génome ne comprend aucune copie d'un gène thyX.
Procédé de criblage de composés inhibiteurs du polypeptide thyX L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un polypeptide THYX tel que défini dans la description dans un procédé de criblage de composés antibactériens ou anti-viraux.
Selon un premier mode de réalisation d'un procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral selon l'invention un polypeptide THYX tel que défini dans la description peut être utilisé pour cribler des molécules se fixant sur celui-ci.
La fixation du polypeptide avec la molécule ou substance peut ou inhiber (molécule antagoniste) l'activité thymidylate synthase dudit polypeptide. De telles molécules capables de se fixer sur l'un quelconque des polypeptides selon l'invention comprennent des anticorps, des oligonucléotides, d'autres protéines et de manière générale des petites molécules de toute nature.
Dans un tel test de criblage, on peut simplement mettre en évidence la fixation de la molécule candidate aux polypeptides, l'un des deux partenaires étant marqué par un composé détectable (polypeptide d'intérêt ou molécule candidate), la visualisation du complexe polypeptide THYX/molécule candidate étant alors visualisée par détection du marqueur détectable, après élimination des molécules candidates non liées spécifiquement.
A titre d'exemple, un test de criblage d'une molécule candidate capable de se fixer sur un polypeptide selon l'invention pourra comprendre avantageusement une première étape au cours de laquelle le polypeptide d'intérêt ou la molécule candidate est immobilisé sur un support, une seconde étape au cours de laquelle le second partenaire (molécule candidate ou polypeptide d'intérêt) est mis en présence du premier composé préalablement immobilisé sur le support, une troisième étape au cours de laquelle un ou plusieurs lavages sont effectués dans des conditions appropriées à l'élimination des composés n'étant pas lié spécifiquement, et enfin une quatrième étape au cours de laquelle le complexe éventuellement formé entre le polypeptide d'intérêt et la molécule candidate est détecté.
Dans le mode de réalisation du test de criblage selon lequel la molécule candidate est préalablement immobilisée sur un support, puis mise en présence du polypeptide d'intérêt selon l'invention, la détection du complexe formé par la molécule candidate et le polypeptide d'intérêt selon l'invention pourra être avantageusement réalisée à l'aide d'un anticorps tel que décrit ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation du test de criblage selon lequel c'est le polypeptide d'intérêt selon l'invention qui est préalablement immobilisé sur un support, la molécule candidate sera avantageusement marquée à l'aide d'un marqueur détectable préalablement à sa mise en contact avec le polypeptide d'intérêt immobilisé.
Un tel marqueur détectable peut être radioactif ou non radioactif, par exemple fluorescent ou correspondre à un ligand pour un troisième partenaire utilisé pour la détection comme une molécule de biotine.
En conséquence, l'invention a également pour objet un procédé de criblage d'une molécule ou d'une substance candidate interagissant avec un polypeptide selon l'invention, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mettre en contact un polypeptide conforme à l'invention avec la substance ou molécule candidate à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit polypeptide et ladite substance ou molécule candidate.
L'invention concerne également un nécessaire ou kit pour le criblage d'une molécule ou d'une substance candidate interagissant avec un polypeptide selon l'invention, ledit nécessaire comprenant : a) un polypeptide conforme à l'invention ; b) le cas échéant, des moyens nécessaires à la détection du complexe formé entre ledit polypeptide et la molécule ou substance candidate. Procédé de criblage de composés antibactériens ou antiviraux dans un système acellulaire.
Selon cet autre procédé de criblage de composés antibactériens ou antiviraux selon l'invention, le test d'inhibition de l'activité thymidylate synthase d'un polypeptide THYX est réalisé dans un système acellulaire, par exemple dans un lysat de culture de cellules exprimant le polypeptide THYX et qui n'exprime pas simultanément de polypeptide codé par un gène thyA.
Les cellules à partir desquelles est obtenu le lysat cellulaire sont de préférence des cellules possédant les mêmes caractéristiques que celles qui sont mises en œuvre dans le procédé de criblage dans un système acellulaire qui a été décrit en détail précédemment dans la description.
Brièvement, les cellules à partir desquelles est obtenu le lysat cellulaire sont respectivement :
- soit des cellules exprimant naturellement THYX en l'absence de THYA ;
- soit des cellules dont le génome desquelles le gène thyA a été inactivé et qui sont transfectées avec un vecteur recombinant exprimant un gène thyX.
Le lysat cellulaire peut être obtenu à partir d'une culture des cellules décrites ci-dessus, par exemple par sonication ou par choc osmotique, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Après l'étape de lyse cellulaire proprement dite, les débris cellulaires peuvent être éliminés par une étape de centrifugation à l'issue de laquelle ces débris cellulaires sont retrouvés en culot, le surnageant de centrifugation comprenant notamment l'ensemble des protéines y compris la protéine THYX, et qui est récupérée pour la mise en œuvre du procédé de criblage. Selon le procédé de criblage dans un système acellulaire, l'activité thymidylate synthase est quantifiée respectivement dans des échantillons témoins contenant seulement le lysat cellulaire et dans des échantillons de tests contenant un composé inhibiteur candidat, le cas échéant pour une série de concentrations croissantes du composé inhibiteur candidat. De préférence, on mettra en œuvre une série d'échantillons de tests comprenant un composé inhibiteur candidat donné, à des concentrations croissantes.
L'activité thymidylate synthase peut être quantifiée notamment par la détection de l'oxydation du méthylène-tétrahydrofolate, comme cela est décrit dans les exemples.
L'invention a encore pour objet un procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral in vitro dans un système acellulaire, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer un lysat cellulaire à partir d'une culture de cellules exprimant un polypeptide THYX en l'absence d'un polypeptide codé par un gène thyA. b) ajouter au lysat cellulaire obtenu à l'étape a) le composé inhibiteur à tester ; c) comparer l'activité thymidylate synthase respectivement dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape a) et dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape b) ; et d) sélectionner les composés candidats pour lesquels une inhibition de l'activité thymidylate synthase a été détectée. L'invention a également pour objet un kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé inhibiteur de la thymidylate synthase caractérisé en ce qu'il comprend : a) une composition comprenant un polypeptide THYX en solution ou sous forme lyophilisée ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase.
Selon un premier mode de réalisation, la composition contenant le polypeptide THYX consiste en un lysat cellulaire préparé comme décrit ci-dessus. Selon un second mode de réalisation, la composition comprenant le polypeptide THYX comprend une quantité du polypeptide THYX sous forme purifiée adaptée à l'obtention d'un échantillon d'essai en solution comprenant une concentration du polypeptide THYX comprise entre 10"10 et 10"2M, de préférence 10"8 à 10"3M et de manière tout à fait préférée entre 10"7M et 10"5M.. Procédé de. criblage de composés antibactériens ou antiviraux dans un système cellulaire
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans la description dans un procédé de criblage de composés antibactériens ou antiviraux.
De préférence l'acide nucléique code pour un polypeptide THYX choisi parmi les polypeptides comprenant les séquences d'acides aminés
SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37. De manière tout à fait préférée, l'acide nucléique est choisi parmi les acides nucléiques comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID
N°44 à SEQ ID N°64.
L'invention a également trait à un kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé antibactérien ou antiviral, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un vecteur d'expression recombinant comprenant un acide nucléique codant un polypeptide THYX tel que défini dans la présente description, sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule hôte dans laquelle son expression est recherchée ou une cellule hôte transfectée avec un tel vecteur recombinant ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaire à la quantification de l'activité thymidylate synthase.
Selon un second mode de réalisation d'un procédé de criblage de composés antibactériens ou antiviraux selon l'invention, l'activité des composés inhibiteurs de l'activité thimydylate synthase de THYX peut être testée dans des cultures de cellules exprimant THYX , en l'absence d'expression de thyA.
Selon un premier aspect, un tel procédé de criblage peut être réalisé sur des cultures de cellules pour le génome possède une copie d'un gène THYX mais pas de gène thyA, comme par exemple des cultures de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Rickettsia prowazekii, Borrelia burgdorferi ou Chlamydia.
Selon un second aspect, un tel procédé de criblage de composés antibactériens ou antiviraux dans un système cellulaire peut être réalisé à l'aide de cultures de cellules dans lesquelles le gène thyA a été inactivé et qui ont été transfectés par un acide nucléique ou un vecteur recombinant exprimant un gène thyX dans ces cellules, comme par exemple la souche de E.coli n°X 2913 (MhyA) qui a été transfectée avec un vecteur d'expression codant un polypeptide THYX. >
L'invention a aussi pour objet un procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) cultiver des cellules exprimant le gène thyX en l'absence d'expression du gène thyA dans un milieu de culture approprié ; b) mettre en contact les cellules avec un composé candidat à tester ; et c) sélectionner les composés candidats inhibant l'activité thimydylate synthase du polypeptide codé par le gène thyX.
Les composés sélectionnés selon le procédé de criblage ci-dessus sont ceux pour lesquels est observée une inhibition de l'activité thymidylate synthase dans les cellules, par rapport à l'activité thymidylate synthase observée dans des cultures de cellules témoins qui ne sont pas mises en présence des composés candidats à tester.
La quantification de l'activité thymidylate synthase peut être réalisée par exemple par incorporation d'uracile radiomarquée dans l'ADN des cellules en culture, selon les techniques bien connues de l'homme du métier, la quantité de dTTP radiomarquée dans l'ADN reflétant le niveau d'activité thymidylate synthase dans la culture cellulaire. Dans ce cas, les cellules cultivées à l'étape a) du procédé sont incubées en présence d'uracil radiomarquée, par exemple de (3H)-uracile ou (1 C)-uracile.
La radioactivité de dTTP dans l'ADN est mesurée après hydrolyse d'ADN purifié à l'aide des techniques standard (compteur de radioactivité).
Après lyse des cellules, par exemple par sonication ou par choc osmotique, les lysats cellulaires sont filtrés sur une membrane de nitrocellulose retenant l'ADN, puis la radioactivité contenue sur le filtre est mesurée à l'aide d'un compteur de radioactivité adapté. Dans le mode de réalisation du procédé de criblage ci-dessus dans lequel les cellules cultivées consistent en des cellules dont le génome ne comprend aucune copie active d'un gène thyA et qui ont été transfectées avec un vecteur recombinant comprenant un insert d'ADN codant un polypeptide thyX, le vecteur recombinant sera choisi de telle manière à permettre l'expression du polypeptide THYX dans la cellule hôte qui est cultivée durant le procédé.
Des exemples de vecteurs recombinants utilisables pour la mise en œuvre du procédé de criblage ci-dessus sont détaillés ci-après.
Vecteurs recombinants susceptibles d'être utilisés selon l'invention
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini ci-dessus ou un variant de ce polypeptide.
Avantageusement, un tel vecteur recombinant comprendra un acide nucléique choisi parmi les acides nucléiques suivants : a) un acide nucléique codant pour un polypeptide ayant une séquence en acides aminés choisie dans le groupe des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37 ou un variant de ce polypeptide, éventuellement fusionné à un polypeptide hétérologue ; b) un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi parmi les séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64, ou un variant de ce dernier
c) un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37 ou un variant de ce dernier ; d) un acide nucléique ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64 ou un variant de ce dernier ;
Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin. Sont préférés les vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique codant un polypeptide THYX conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger sa transcription et/ou sa traduction. Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants :
(1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des enhanceurs ;
(2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1 ) ; et
(3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur expression est recherchée, un ou plusieurs marqueurs de sélection.
A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris. De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par FULLER et al. (1996).
Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression des acides nucléiques selon l'invention dans des bactéries sont par exemple les vecteurs pQE70, pQE60 ou pQE-9 (commercialisés par la société QIAGEN), les vecteurs pBluescript, Page script, pNH8A ; pNH16a, pNH18a, pNH46A (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pKK223-3, pKK233-3, pDR540 et pRIT5 (commercialisés par la société Pharmacia) . Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression dans cellules eucaryotes sont par exemple les vecteurs pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 et pSG (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pSVK3, pBPV, pMSG et pSVL (commercialisés par la société Pharmacia)
Un premier vecteur préférentiellement mis en œuvre dans le cadre de l'invention est le vecteur pcDNA3 commercialisé par la société Invitrogen .
Un second vecteur particulièrement préféré est le vecteur pBluescript SK (-), commercialisé par la société Stratagene.
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATS-UNIS). On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene).
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N°CRL 1711 ) dérivées de Spodoptera frugiperda.
Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.
Un vecteur recombinant selon l'invention peut aussi être un vecteur rétroviral ou encore un vecteur adéno-associé (AAV). De tels vecteurs adéno-associés sont par exemple décrits par FLOTTE et al.
(1992), SAMULSKI et al. (1989), ou encore McLAUGHLIN BA et al.
(1996).
De manière tout à fait préférée, on met en œuvre le vecteur pBAD TOPO commercialisé par la Société Invitrogen, qui permet une expression du gène thyX chez E. Coli qui est précisément régulée par la présence ou l'absence d'arabinose dans le milieu de culture des cellules transfectées avec un tel vecteur recombinant, du fait que le vecteur pBAD TOPO comprend le promoteur PBAD qui est inductible par l'arabinose. Exemples de composés inhibiteurs de l'activité thymidylate synthase d'un polypeptide THYX.
Ces composés inhibiteurs de l'activité thymidylate synthase d'un polypeptide THYX sont potentiellement des composés anti-bactériens et/ou antiviraux sans effets indésirables ou avec des effets indésirables réduits pour les mammifères, y compris l'homme.
La croissance de transformants contenant thyX dans la souche E.coli X2913(ΔfhyA) peut être inhibée par le trimethoprim, qui est un inhibiteur spécifique de la dihydrofolate réductase. Ce fait indique que la croissance est dépendante des folates.
De même, il est montré selon l'invention que l'activité thymidylate synthase du polypeptide codé par le gène THYX de
Pyrococcus abyssi est inhibé par un dérivé métabolique du 5- fluorouracile, ce qui suggère que le polypeptide THYX interagit avec le composé fluoro-dUMP.
D'autres composés susceptibles d'inhiber l'activité thymidylate synthase d'un polypeptide THYX sont respectivement les acides nucléiques antisens hybridant spécifiquement avec l'ARN messager codant pour un polypeptide THYX et les anticorps dirigés contre un polypeptide THYX.
Acides nucléiques antisens
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression d'un acide nucléique codant un polypeptide THYX, l'homme du métier pourra recourir l'utilisation de polynucléotides antisens.
Ainsi, l'invention concerne aussi l'utilisation d'un polynucléotide ou oligonucléotide antisens, capable de s'hybrider spécifiquement avec l'ARN messager codant pour un polypeptide THYX et capable d'inhiber ou de bloquer sa transcription et/ou sa traduction. Un tel polynucléotide a la structure générale qui est définie dans la présente description pour les sondes et les amorces selon l'invention.
De préférence, un polynucléotide antisens susceptible d'être utilisé selon l'invention comprend une séquence correspondant à une séquence localisée dans la région de l'extrémité 5' de l'ARN messager , et de manière tout à fait préférée à proximité du codon d'initiation de la traduction (ATG) de l'acide nucléique codant le polypeptide THYX.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence correspondant à l'une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron d'un gène codant le polypeptide THYX et de manière tout à fait préférée des séquences correspondant à un site d'épissage.
Un polynucléotide antisens selon l'invention peut être préparé à partir d'un acide nucléique codant un polypeptide THYX choisi parmi les polypeptides de séquences SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37.
Un polynucléotide antisens selon l'invention peut être préparé à partir d'un acide nucléique choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64.
De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisante pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm codant le polypeptide THYX considéré. Des stratégies pour construire des polynucléotides antisens sont notamment décrites par Green et al. (1986) et Izant et Weintraub (1984).
Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par Rossi et al. (1991) ainsi que dans les demandes PCT N° WO 94/23026, WO 95/04141 , WO 9218522 et dans la demande de brevet européen n° EP 0 572 287. Avantageusement, un polynucléotide antisens selon l'invention a une longueur de 15 à 200 nucléotides. Un polynucléotide sens de l'invention a ainsi une longueur allant de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 à 75, 100, 150 ou 200 nucléotides.
Afin d'inhiber ou de bloquer l'expression d'un acide nucléique codant un polypeptide THYX tel que défini dans la description, on peut aussi avoir recours simultanément à une pluralité de polynucléotides antisens tels que définis ci-dessus, chacun des polynucléotides antisens hybridant avec une région distincte du gène ou de son ARN messager. D'autres méthodes de mise en œuvre des polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par Sczakiel et al. (1995) ou encore celles décrites dans la demande PCT n° WO 95/24223.
Anticorps
Les polypeptides THYX tels que définis selon l'invention, en particulier les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37, ou les variants de ces derniers ainsi que les peptides homologues, peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps qui peuvent être sélectionner pour leur capacité à inhiber ou à bloquer leur activité thymidylate synthase.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'anticorps dirigés contre un polypeptide THYX pour inhiber ou bloquer l'activité thymidylate syn thase de ce polypeptide.
De tels anticorps dirigés spécifiquement contre un polypeptide THYX constituent un nouvel exemple illustratif d'un composé inhibiteur de l'activité thymidylate synthase d'un polypeptide THYX selon l'invention. De tels anticorps représentent potentiellement des composés antibactériens ou antiviraux.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F (ab)'2, Fab) ou encore tout polypeptide comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention .
Des anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par KOHLER et M1LSTEIN (1975). La présente invention concerne également des anticorps dirigés contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un variant de ce dernier, tels que produits dans la technique du trioma ou encore la technique d'hybridome décrite par KOZBOR et al. (1983). L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N° 4,946,778 ou encore par MARTINEAU et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages RIDDER et al., (1995) ou encore des anticorps humanisés (REIMANN et al. ,1997; LEGER et al., 1997).
COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique antibactérienne ou antivirale comprenant, à titre de principe actif un oligonucleotide antisens hybridant spécifiquement avec un ARN messager codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans la présente description, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Elle est également relative à l'utilisation d'un oligonucleotide antisens hybridant spécifiquement avec l'ARN messager codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans la présente description pour la fabrication d'un médicament antibactérien ou anti-viral. Une telle composition pharmaceutique comprendra de préférence des concentrations d'oligonucléotides antisens qui sont au moins équimolaires à celles de l'ARN messager correspondant dans la cellule.
Parmi les excipients utilisables en association avec un oligonucleotide antisens tel que défini ci-dessus, on peut citer les molécules cationiques synthétiques se liant aux sites anioniques de l'oligonucléotide antisens, qui facilite le passage de l'oligonucléotide antisens à travers la membrane cellulaire par endositose non spécifique, tels que ceux décrits par Schofield en 1995 ou ceux décrits par BEHR EN 1994. Un autre excipient utilisable en association avec un oligonucleotide antisens selon l'invention est le composé lipofectin™ , qui est composé d'une formulation 1 :1 du composé d'ammonium quaternaire DOTMA et de dioleoylphosphatidylethalolamine, soniqués sous la forme de petites vésicules unilamellaires dans l'eau. L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique antibactérienne ou antivirale comprenant, à titre de principe actif, un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide THYX tel que défini dans la description, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Elle est également relative à l'utilisation d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide THYX tel que défini dans la description pour la fabrication d'un médicament antibactérien ou antiviral. L'invention est également relative à un procédé pour la prévention ou le traitement d'une affection bactérienne ou virale, ledit procédé comprenant une étape d'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un oligonucleotide antisens ou d'un anticorps spécifique d'un polypeptide THYX tel que décrit ci-dessus.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire, orale ou mucausale, en association avec un véhicule et/ou un adjuvant ou excipient physiologiquement compatible.
Un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide THYX est présent dans une composition pharmaceutique selon l'invention en des quantités adaptées pour une administration quotidienne de 10 nanogrammes à 10 mg d'anticorps, de préférence de 100 nanogrammes à 1 mg et de manière tout à fait préférée de 1 μg à 100μg d'anticorps.
Des techniques de formulation et d'administration de composés inhibiteurs de la thymidylate synthase d'un polypeptide THYX peuvent être retrouvées par l'homme du métier dans l'ouvrage suivant :
« REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES-MACK publication co., Easton, PA », dans sa dernière édition.
UTILISATION DE SONDES ET D'AMORCES NUCLEOTIDIQUES HYBRIDANT AVEC UN ACIDE NUCLEIQUE CODANT UN POLYPEPTIDE THYX
Comme cela a déjà été exposé précédemment, les gènes thyX ont été retrouvés selon l'invention dans diverses bactéries et virus pathogènes pour les mammifères, en particulier des bactéries pathogènes pour l'homme, et des virus.
En conséquence, des sondes ou des amorces dérivées des acides nucléiques génomique ou de l'ARN messager codant pour un polypeptide THYX constituent des moyens de détection de la présence d'une bactérie ou d'un virus pathogène dans un échantillon, et plus spécifiquement d'un échantillon biologique prélevé sur l'homme ou l'animal, par exemple un échantillon de salive, de larmes, de sang, de plasma ou de sérum ou encore un prélèvement de biopsie ou un frottis. Les acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques codant un polypeptide THYX tel que défini dans la description, en particulier les acides nucléiques de séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64 sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64 ou encore d'un fragment ou d'un variant de cette dernière dans un échantillon.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention auront une longueur de 10, 12, 15, 18 ou 20 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 10Ô0, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique codant un polypeptide THYX ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Alternativement, une sonde ou une amorce nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra les fragments d'une longueur de 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique codant un polypeptide THYX selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-après, avec un acide nucléique codant un polypeptide THYX, en particulier un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64 ou avec une séquence complémentaire de ces derniers. Définition des conditions d'hybridation
Par conditions d'hybridation de forte stringence, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes:
Préhybridation: mêmes conditions que pour l'hybridation durée: 1 nuit.
Hybridation:
5 x SSPE (0.9 M NaCl, 50 mM phosphate de sodium pH 7.7, 5 mM EDTA)
5 x Denhardt's (0.2% PVP, 0.2% Ficoll, 0.2% SAB)
100 μg/ml ADN de sperme de saumon 0.1% SDS durée: 1 nuit. Lavages:
2 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C
1 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C 0.5 x SSC, 0.1 % SDS 10 min 65°C
0.1 x SSC, 0.1% SDS 10 min 65°C.
Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 360 bases, Tm est définie par la relation:
Tm= 81 ,5 + 0,41 (%G+C)+16,6 Log(concentration en cations) - 0,63 (% formamide)-(600/nombre de bases) (SAMBROOK et al., (1989), pages 9.54-9.62). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation: Tm= 4(G+C) + 2(A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, dans lesquelles les séquences aspecifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en- dessous de Tm. Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites sont mises en œuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique de 200 bases de longueur et peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al. (1989).
En particulier, il faut prendre en compte que le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en base de la sonde ou de l'amorce, les paires de bases G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologue entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants, tels que des agents favorisant la rupture de liaisons hydrogène , comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'incubation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume , tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou de l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode aux diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU NΕP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peuvent être marqués, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques. Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, , 3H, 35S, ), des molécules fluorescentes (5- bromodeoxyuridine, fluorescéine , acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'
Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou encore dans des hybridations à l'ARN messager correspondant lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements. Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration, des lits de polystyrène, des lits magnétiques, des bandes de nitrocellulose, ou encore des microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une soude ou d'une amorce nucléique hybridant avec un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX, tel que défini dans la description, dans un procédé de détection d'une bactérie ou d'un virus, en particulier d'une bactérie ou d'un virus pathogène pour les mammifères, y compris l'homme.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de :
1) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ;
2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support.
Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites ci- dessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support. Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet
US N° 5,143,854, dans les demandes PCT N° WO 90/150 70 et
92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N°5,412,087 et dans la demande
PCT N°WO 95/11995.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N °64, ou encore un variant de celui-ci.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID N°44 à SEQ
ID N°64 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci- dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques décrites ci-avant.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID N°44 à SEQ ID N°64, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.
UTILISATION D'UN ACIDE NUCLEIQUE CODANT UN POLYPEPTIDE THYX COMME MARQUEUR DE SELECTION.
Il existe un besoin constant dans l'état de la technique pour de nouveaux gènes marqueurs de sélection, particulièrement dans des procédés visant à introduire un ou plusieurs gènes d'intérêt dans un organisme hôte, par exemple une cellule hôte.
Les gènes marqueurs de sélection, qui sont portés par la molécule d'ADN codant le ou les gènes d'intérêt que l'on souhaite introduire dans l'organisme hôte ou la cellule hôte, et qui sont en conséquence introduits dans la cellule hôte simultanément aux gènes d'intérêt, permettent de sélectionner les cellules hôtes recombinantes.
Un acide nucléique codant un polypeptide THYX , lorsqu'il est utilisé pour la transfection de cellules hôtes auxotrophes pour la synthèse de la thymidine, constitue un excellent marqueur de sélection d'un événement de transformation, de transfection ou de recombinaison de la cellule hôte. En effet, l'introduction d'un acide nucléique codant un polypeptide THYX simultanément à un ou plusieurs gènes d'intérêt dans la cellule hôte restaure l'autotrophie de la cellule hôte ayant subi avec succès la transfection, la transformation ou la recombinaison. De cette manière, on peut sélectionner des cellules hôtes ayant subi l'événement de transfection, de transformation ou de recombinaison par pression de sélection du milieu, notamment en cultivant les cellules hôtes en l'absence de thymidine. Dans ce cas, seules les cellules hôtes ayant été recombinées survivent en l'absence de thymidine dans le milieu de culture. De plus, un acide nucléique codant un polypeptide THYX est d'une totale innocuité pour l'environnement.
Des vecteurs comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX comme gène marqueur de sélection peuvent être préparés à partir de vecteurs conventionnels selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple à partir des vecteurs préférés selon l'invention.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans la description comme marqueur de sélection d'un événement de transfection, de transformation ou de recombinaison génétique d'une cellule hôte ou d'un organisme hôte.
Elle est également relative à un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans la description à titre de gènes marqueurs de sélection d'un événement de transfection, de transformation ou de recombinaison génétique.
MILIEUX DE REACTION POUR L'ACTIVITE THYMIDYLATE SYNTHASE DE THYX ET LEURS UTILISATIONS, NOTAMMENT DANS DES PROCEDES DE CRIBLAGE
Les travaux des inventeurs sur l'activité de ThyX ont permis d'identifier le mécanisme enzymatique et ainsi d'optimiser les conditions de la réaction en mettant en évidence l'importance de l'addition de certains composés dans le milieu réactionnel.
L'invention a donc aussi pour but l'utilisation de tels milieux et leur application.
Elle vise aussi un milieu de réaction pour l'activité thymidylate synthase de la ThyX caractérisé en ce qu'il comporte des flavines réduites et du CH2H4folate.
Plus particulièrement, les flavines réduites de ce milieu sont obtenues par réduction in situ de flavines oxydées. La concentration en flavines oxydées est alors de 50μM à 1 mM, de préférence, 0,5mM. De préférence, les flavines oxydées sont des flavines mononucléotides (FMN) et/ou de dinucléotides flavine adénine (FAD). La réduction des flavines peut être effectuée par voie chimique, enzymatique, photochimique ou électrochimique et plus particulièrement, avec du
NADH (β-nicotinamide adénine dinucléotide) et/ou du NADPH (β- nicotinamide adénine dinucléotide phosphate). Par ailleurs, la concentration en CH2H4folate est de 50μM à 2mM, de préférence, 1mM.
De manière préférentielle, le milieu peut comporter en outre du dUMP (uridine 5'-monophosphate), à une concentration allant de 1μM à
800μM, de préférence, 500μM. Lorsque la réduction des flavines est effectuée par du NADH et/ou du NADPH, la concentration en NADH est de 0,1 à 1mM, et celle en
NADPH, de 0,5 à 5mM.
L'invention vise d'autre part des procédés de criblage. En particulier, elle a pour objet de fournir un procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral in vitro dans un système acellulaire caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer un lysat cellulaire à partir d'une culture de cellules exprimant un polypeptide THYX en l'absence d'un polypeptide codé par un gène thyA et comportant un milieu selon l'invention; b) ajouter au lysat cellulaire obtenu à l'étape a) le composé inhibiteur à tester ; c) comparer l'activité thymidylate synthase ThyX respectivement dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape a) et dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape b) ; et d) sélectionner les composés candidats pour lesquels une inhibition de l'activité thymidylate synthase ThyX a été détectée. Dans ce procédé de criblage, on utilise de préférence le dTMP et
3H comme marqueurs de l'activité thymidylate synthase ThyX.
L'invention couvre également des kits ou nécessaires pour le criblage d'un composé inhibiteur de la thymidylate synthase ThyX caractérisé en ce qu'il comprend : a) une composition comprenant un polypeptide THYX ainsi qu'un milieu selon invention, en solution ou sous forme lyophilisée ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.
De manière alternative, le kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé antibactérien ou antiviral, peut également comprendre : a) un vecteur d'expression recombinant comprenant un acide nucléique codant un polypeptide ThyX sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule hôte dans laquelle son expression est recherchée ou une cellule hôte transfectée avec un tel vecteur recombinant ; b) un milieu selon l'invention; c) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés, à titre illustratif dans les exemples suivants avec références aux figures. La figure 5 présente des analyses biochimiques de la ThyX de H.
Pylori.
(A) 12% SDS-PAGE et analyses immunoblot de protéine isolée ThyX de H. pylori. 1 ,5 (Coomassie) et 0,3 (anti-V5) μg de protéine pure ont été détectés respectivement par coloration au Bleu de Coomassie ou utilisation d'anticorps monoclonaux contre un épitope anti-V5 (Invitrogen), par détection chimioluminescente. Le poids moléculaire attendu de la ThyX de H. pylori est de 31 ,5 kDa
(B) Les analyses spectroscopiques de la ThyX de H. pylori indiquent que ThyX est une flavoprotéine. Le spectre absolu de 10 μM d' enzyme isolée (ligne continue) et de co-facteur après sa libération de la protéine (ligne pointillée). La fenêtre montre le spectre pour l'enzyme oxydée et la protéine dithionique réduite.
(C) L'activité de libération du Tritium de la protéine ThyX purifiée de H. pylori a été enregistrée en présence (+MTHF) et en l'absence (-MTHF) de CH2H4tétrahydrofolate .
La figure 6 illustre l'activité de formation du dTMP de la protéine ThyX de H. pylori. Les réactions enzymatiques ont été réalisées comme décrit dans le tableau 1 , en utilisant du dUMP marqué en position 6. Les produits de réaction ont été analysés en utilisant une colonne à phase inversée C 18 par élution isocratique, en utilisant 10 mM de tampon de phosphate. Les durées d'élution pour dUMP et dTMP ont été déterminées en utilisant les références authentiques.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, aux exemples suivants :
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Expression du polypeptide THYX de Helicobacter pylori dans E.coli.
Les ADNs comprenant le cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide THYX de Helicobacter pylori (souche 26.695) (séquence SEQ ID n°21 ) à été obtenue par amplification PCR à l'aide des amorces spécifiques de séquences SEQ ID N°38 et SEQ ID N°39 à partir du clone GHPEH26 publiquement accessible auprès de l' AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION sous le numéro d'accès n°628.507. L'ADN comprenant le cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide THYX de Pyrococcus. abyssi (souche ORSAY) (SEQ ID n°12) a été préparé par amplification PCR à l'aide d'amorces spécifiques de séquences SEQ ID N°40 et SEQ ID N°41 à partir de l'ADN chromosomique de H. pylori (HP 1533). L'ADN comprenant le cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide THYX de Campylobacter jejuni (souche NCTC 11168) (SEQ ID N°27) a été préparé par amplification PCR à l'aide d'amorces spécifiques de séquences SEQ ID N°42 et SEQ ID N°43 à partir de l'ADN génomique publiquement accessible auprès de l'ATCC (Aerican Culture Collection) sous le n° d'accès 7008199.
Les produits d'amplification PCR ont été clones dans le vecteur pBAD TOPO TA activé par la topoisomérase-l, commercialisée par la
Société Invitrogen, qui permet une expression strictement régulée du gène d'intérêt artificiellement inséré dans le vecteur, dans la bactérie
E.coli.
Les clones de E.coli ont été caractérisés par séquençage des inserts d'ADN contenus dans le vecteur pBADTOPOTA.
Les poids moléculaires théoriques des polypeptides THYX de H . pylori (HP1533), de P.abyssi (PAB 0861 ) et de C. jejuni (NCTC 11168) y compris un activateur de traduction amino-terminal et des épitopes carboxy-terminaux V5 et histidine, sont respectivement de 31 ,5 kDa, de
33,7 kDa et de 28 kDA.
Les résultats présentés dans la figure 2A montrent que l'expression du polypeptide THYX est induite en présence de 0,2% d'>Arafo πose dans le milieu de culture, comme cela a été détecté en utilisant des anticorps monoclonaux anti-V5 commercialisés par la
Société Invitrogen et utilisés selon les recommandations du fabricant.
Puis on a testé la capacité des polypeptides THYX de H.pylori et de P.abyssi a permettre la croissance de la souche de E.coli X2913 (Δthya572), auxotrophe pour la thymidine, à se multiplier en l'absence de thymidine.
La capacité de croissance des souches de E.coli exprimant les polypeptides THYX de H.pylori et de P.abyssi a été déterminée après culture des cellules de E.coli recombinantes pendant 3 à 4 jours en présence ou en l'absence d'une concentration de 0,2% d'Arabinose sur un milieu agar minimal M9 dépourvu de thymidine (Michaels et al., 1990).
Les résultats sont présentés dans la figure 2B.
Comme le montrent les résultats de la figure 2B, l'expression du gène thyX de H.pylori dans la souche de E.coli X2193 qui a été induite par l'Arabinose, a permis de complémenter cette souche de E.coli initialement déficiente en activité thymidylate synthase et restaurer la prototrophie de cette souche de E.coli pour la thymidine.
En revanche, le gène myX de P.abyssi, après induction par l'Arabinose, n'a pas permis de complémenter la souche de E.co/i X 2193, ce qui reflète l'incapacité d'une protéine hyperthermophile d'être fonctionnelle dans un hôte mésophile.
Les deux souches de E.coli recombinantes étaient néanmoins capables de se multiplier dans un milieu agar minimal en présence de thymidine à la concentration finale de 50μg/ml.
Le clone d'Helicobacter pylori GHPEH26 contient un insert d'ADN de 1 ,5421 kb correspondant aux nucléotides 1613133-1611.613 de l'ORF référence AE00511, locus 10, HP 1533, référencé dans les bases de données comme DNA seq. Ace : AE000 511. Le clone GHPEH26 est commercialisé par la Société TIGR/ATCC
Microbial Génome Spécial Collection. Le gène thyX de H.pylori obtenu par PCR à partir de ce clone représente un fragment d'ADN d'une longueur de 693 pb.
Les résultats de gel d'électrophorèse SDS PAGE illustrés à la figure 3 montrent que la souche de E. coli transformée avec l'ADN de Campylobacter jejuni produit un polypeptide THYX du poids moléculaire attendu.
De plus, les résultats d'immunoempreintes illustrés à la figure 4 montrent que la protéine THYX de Campylobacter jejuni peut être efficacement purifiée sur une colonne de Nickel Ni-NTA.
Les résultats décrits ci-dessus représentent la première démonstration expérimentale que la réaction de conversion du dUMP en dTMP peut être réalisée dans la cellule par une thymidylate synthase autre qu'une thymidylate synthase codée par un gène thyA, c'est-à-dire par la thymidylate synthase codée par un gène thyX. EXEMPLE 2 :
Identification d'une famille de polypeptides THYX
Par l'analyse des séquences d'environ 50.000 gènes référencée dans la base de données des « clusters » de protéines orthologues (Tatuson et al., 2000) par une méthode itérative de recherche de similarité (Altschul et al., 1997) il a été montré que les séquences THYX, similaires à la séquence THY1 de H. pylori (HP 1533) étaient la seule famille de gènes présentant une distribution mutuellement exclusive avec thyA, à l'exception unique de Mycobacterium tuberculosis qui comprend simultanément un gène thyX et un gène thyA.
La recherche itérative de similarité a été réalisée à l'aide du programme itératif PSI-BLAST .(Version 2.0) en utilisant diverses séquences THYA comme séquences « appâts ». Des sélections (« hits ») ayant une valeur attendue inférieure à 1.10"5 ont été considérées comme statistiquement significatives. Une valeur de seuil pour le recrutement des alignements dans les itérations successives était de 0,02. Des résultats non exhaustifs de l'analyse de similarité protéique ci- dessus sont représentés dans les tableaux 1 et 2 ci-après.
Tableau 1
Figure imgf000048_0001
% Les pourcentages d'identité et de similarité représentés dans le tableau 1 ci-dessus ont été obtenus après recherches itératives en utilisant les logiciels BLAST ou Psi-BLAST, en utilisant exclusivement les paramètres par défaut. Les résultats non exhaustives du Tableau 1 montrant que de nombreuses bactéries bactériophages et virus possèdent une copie d'un gène codant pour un polypeptide THYX..
Tableau 1 (suite)
Figure imgf000049_0001
Tableau 2
Figure imgf000050_0001
^thyA, gène codant la thymidylate synthase nécessaire pour la synthèse de NOVO du dTMP ; thyX, nouvelle famille de gène impliquée dans la biosynthèse des pyrimidines ; DHFR, dihydrofolate réductase essentielle pour le recyclage d'un donneur de méthyl essentiel dans la synthèse du dTMP ; tdki thymidine kinase requise pour le sauvetage de la thymidine exogène qui est ensuite convertie en dTMP ; UPP, uracylphosphoribosyl transferase ( UPRTase) requise pour le sauvetage de l'uracyle. Dans le tableau 2 ci-dessus, on présente les résultats des tests de la présence notamment des gènes thyX et thyA dans certains des organismes listés dans le tableau 1.
Les résultats présentés dans le tableau 1 ci-dessus montrent que les gènes thyX sont présents à la fois dans les bactéries, les bactériophages et les virus. Parmi les eucaryotes, l'organisme D.dyscoidum est le seul organisme a porté une copie d'un gène thyX.
La présence unique d'un gène thyX dans de nombreuses bactéries et le virus à ADN eucaryote ainsi que dans de nombreuses bactéries pathogènes pour l'homme en fait une cible privilégiée pour des composés antibactériens ou antiviraux n'interférant pas avec la voie métabolique de la thymidylate synthase THYA présente chez l'homme.
De plus, parmi les organismes listés dans le tableau 1 ci-dessus, nombre d'entre eux ne comprennent pas de gènes DHFR codant une dihydrofolate réductase, qui est requise pour le recyclage d'un cofacteur essentiel du métabolisme du thymidylate, le CH2H -folate.
EXEMPLE 3 :
Mutagénèse dirigée du gène THYX de Helicobacter pylori
A. MATERIELS ET METHODES
Pour l'obtention des mutants 1 à 6 décrits dans la Section « Résultats », la mutagénèse dirigée a été réalisée avec le kit « Quick Change ™ » commercialisé par la Société Stratagene, selon les recommandations du fabricant.
Pour l'obtention des mutants 7 et 8 décrits dans la Section « Résultats », la mutagénèse dirigée a été réalisée avec le kit « QuickChange™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit » commercialisé par la Société Stratagene, selon les recommandations du fabricant.
L'ADN de départ (« Template ») utilisé est le plasmide pBAD TOPO, commercialisé par la Société InVitrogen, dans lequel a été inséré le gène thyX e Helicobacter pylori 26695.
Le résidu serine 107 (codon « AGT ») conservé a été remplacé respectivement par les résidus cystéine (codon « TGC ») ou alanine (codon « GCT »), en utilisant les oligonucléotides mutagéniques appropriés.
Le résidu Tyrosine 1 10 (codon « TAC ») a été remplacé respectivement par les résidus thréonine (codon « ACT ») et phénylalanine (codon « TTC »), en utilisant les oligonucléotides mutagéniques appropriés.
Le résidu Glutamate 142 (codon « GAA ») a été remplacé respectivement par les résidus Alanine (codon « GCT ») et Aspartate (codon « GAT »), en utilisant les oligonucléotides mutagéniques appropriés.
Le résidu Histidine 71 (codon « CAT ») a été remplacé par le résidu Glutamine (codon « CAA »), en utilisant les oligonucléotides mutagéniques appropriés.
Le résidu Glutamate 205 (codon « GAA ») a été remplacé par le résidu Leucine (codon « TTA »), en utilisant les oligonucléotides mutagéniques appropriés.
B. Résultats
Les expériences de mutagénèse ont montré que les bactéries de
E.coli Chi2193 transformées par les vecteurs pBAD TOTO TA contenant respectivement des inserts d'ADN codant pour la protéine THYX dans lequel le résidu d'acide aminé serine conservé a été remplacé respectivement par un résidu de cystéine ou d'alanine exprimait une protéine THYX mutée contenant une flavine.
En revanche, les deux bactéries transformées mutantes ont perdu leur capacité de restauration de la prototrophie pour la thymidine.
Ces résultats montrent que le résidu d'acide aminé serine conservé est essentiel pour l'activité catalytique de la protéine THYX. De plus, la capacité du gène thyX de complémenter les bactéries pour l'activité thymidylate synthase est perdue lorsque les résidus Tyrosine 1 10 et Glutamate 142 sont mutés.
Une mutation par remplacement de l'histidine 71 par la Glutamine conduit à la production d'un polypeptide capable d'interagir avec le co- facteur flavine, mais qui ne complémente pas les bactéries pour l'activité thymidylate synthase.
Le remplacement du résidu Glutamate 205 par un résidu Leucine bloque la production du polypeptide THYX. Dans des expériences additionnelles, le gène thyX de la bactérie
Rhodobacter capsulatus a été inactivé (par « knock out »). Les bactéries déficientes en protéine THYX ont exprimé un caractère phénotypique d'auxotrophie pour la thymidine, c'est à dire qu'elles ne se multiplient qu'en présence de thymidine. Ces derniers résultats montrent clairement que les protéines THYX sont essentielles pour le métabolisme de la thymidine. Ces expériences montrent que les protéines thyX sont essentielles pour la croissance bactérienne en l'absence de thymidine, ce qui prouve l'utilité du gène thyX ou du polypeptide THYX comme cible thérapeutique.
EXEMPLE 5 : Identification du mécanisme de réaction de ThyX
Pour identifier les réactions biochimiques catalysées par les protéines ThyX, une ThYX de H. pylori portant un marqueur d'histidine sur sa terminaison carboxy a été purifiée à partir d'extraits acellulaires de souche χ2913 d'E. coli soumis à une induction par de l'arabinose en chromatographie d'affinité de nickel immobilisé .
Des cadres de lecture ouverts codant pour des protéines hypothétiques, apparaissant maintenant correspondre aux gènes thyX de P. abyssi (PAB0861) et H. pylori (HP1533), ont été obtenus par PCR, en utilisant des amorces spécifiques et de l'ADN chromosomique de P. abyssi et le clone GHPEH26 (American Type Culture Collection n° 628507), respectivement, comme matrices. Les produits PCR ont été clones dans le vecteur l-activé pBAD TOPO® TA de topoisomérase (Invitrogen), permettant l'expression strictement contrôlée du gène dans E. coli. Tous les clones plasmidiques ont été confirmés par sequençage d'ADN. Les masses moléculaires attendues de PAB0861 et HP1533, comprenant une séquence activatrice de traduction amino-terminale et une région V5 carboxy-terminale et des épitopes d'hexahistidine, sont respectivement de 33,7 et de 31 ,5 kDa. L'expression de la protéine a été induite avec 0,2% de L-arabinose. Les protéines exprimées ont été détectées par utilisation d'anticorps monoclonaux V5-spécifiques (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant.
La protéine ThyX à site antigénique marqué de H. pylori et biologiquement active a été purifiée à partir de 200ml de cultures de pGL2/E. coli X2913 [MhyA (tableau 3)] après 2 heures d'induction par 0,2% de L-arabinose. Un kit d'expression QIA (Qiagen) sous conditions endogènes standard a été utilisé pour la purification comme indiqué par le fabricant, comprenant 10% (volume/volume) de glycérol dans tous les tampons. Les échantillons de protéine obtenus ont été dialyses contre 50mM d'un tampon de phosphate, à pH 7,4 et de glycérol à 10% (volume/volume) après élution pour éliminer l'imidazole. La concentration de protéine dans des échantillons purs a été estimée par lecture A28o, justifiant l'absorbance A28o du cofacteur de flavine à liaison non covalente, à 35560 M"1 cm'1, calculée par rapport à la séquence connue d'acides aminés, et a été utilisée pour l'apoprotéine ThyX de H. pylori.
Les préparations de protéines obtenues (pureté > 95%) contenaient habituellement 1 à 2 mg/ml de protéine, avec une masse moléculaire d'environ 31 kDa sur gels SDS-PAGE (la masse moléculaire attendue de ThyX de H. pylori est de 31 ,5 kDa) (Figure 5A), et avaient une couleur jaune clair. La chromatographie par exclusion de taille au Superdex 200 utilisant des marqueurs de poids moléculaire standards, a révélé une masse moléculaire endogène de 111 kDa (r=0,9874) pour cette protéine, suggérant que sa forme active pouvait correspondre à un homotétramère. Des analyses spectroscopiques de la protéine isolée (oxydée) ont montré des caractéristiques d'absorbance typiques d'une flavoprotéine (figure 5B), avec de larges pics à 447,5 et 375 nm. Ces pics d'absorption se sont révélés absents dans l'enzyme réduite au dithionite. Des caractéristiques d'absorption similaires ont été trouvées pour le cofacteur après sa libération de la protéine par dénaturation à la chaleur à 80°C pendant 5 minutes. Par chromatographie HPLC, le cofacteur associé à la ThyX de H. pylori a été identifié comme un FAD (flavine- adénine dinucléotide). Il a été estimé que les différentes préparations d'enzyme de ThyX de H. pylori contiennent de 0,4 à 0,5 molécules de FAD par monomère. En tout, ces propriétés spectroscopiques indiquent que la ThyX de H. pylori est une flavoprotéine et ou utilise les cofacteurs de flavine dans la catalyse.
Dans la formation de dTMP, la perte de tritium du [5-H]dUMP dans le solvant est un intermédiaire obligatoire, permettant de quantifier l'activité de la thymidylate-synthétase après élimination des nucléotides radioactifs des mélanges réactionnels (ROBERTS, 1966). Pour aborder le mécanisme biochimique, par lequel la ThyX peut circonvenir l'exigence pour la ThyA dans la synthèse de novo du thymydilate, la protéine ThyX purifiée a été utilisée dans la même mesure.
EXEMPLE 6: Optimisation des conditions de réaction de ThyX
Le N5,N10-CH2H folate a été formé de manière non-enzymatique, par incubation de 2mM d'acide tétrahydrofolique (Sigma®) avec 100 mM de β-mercaptoéthanol et 20 mM de formol pendant 30 minutes dans l'obscurité et à température ambiante. Les dosages de libération de tritium avec une enzyme purifiée ont été réalisés dans 50 mM de Tris-CI, à pH 7,9, comprenant une préparation de 1 mM de CH2H4folate obtenue comme décrit ci-dessus. Les réactions de contrôle ont été réalisées sous des conditions analogues, sans acide tétrahydrofolique. Les réactions à 50 μl ont été démarrées par addition de 6 μM de [5-3H]dUMP, l'activité spécifique à 16,2 Ci/mmol (Amersham) et arrêtées après 60 minutes à 37°C par deux extractions avec 250μl de charbon actif [10% (poids/volume) de Norit A] dans 2% d'acide trichloroacétique pour éliminer les nucléotides des mélanges réactionnels. La radioactivité rémanente dans le surnageant a été déterminée selon MYLLYKALLIO (2000).
Comme l'indique la figure 5C, la ThyX catalyse in vitro la libération de tritium du (5-3H)dUMP en fonction de la concentration en protéine et de manière CH2H folate dépendante, ce qui démontre l'activité biochimique des protéines ThyX. Des conditions optimisées de réaction sont rapportées dans le tableau 3. Tableau 3. Optimisation des conditions de réaction pour la protéine ThyX d'H. pylori
Figure imgf000056_0001
1 Le test complet contient 50 mM de Tris-HCI, pH 7.0, 1 mM de préparation de CH2H4folate, 10 mM de MgCI2, 2 mM de NADPH, 1 mM de NADH, 0.5 mM de FMN et 9 μM de 3H-dUMP (activité spécifique 1 ,7357 Ci/mmol). La préparation de CH2H folate est obtenue par incubation 30 minutes dans l'obscurité de 2 mM de H -folate, de 96 mM de 2-mercaptoethanol et de 42 mM de formaldéhyde et de 50 mM de Tris-HCI. Dans la réaction, le FMN peut être replacée efficacement par du FAD (flavine adénine di-nucléotide). Dans ces conditions de réactions, 20 μM de dUMP et 100 μM de CH2H folate sont suffisant pour saturer l'activité de libération de tritium de la protéine ThyX de H. pylori lors d'une incubation de 60 minutes.
De manière surprenante, il a été trouvé que l'addition de nucléotides réduits de flavine augmente drastiquement l'activité de libération de tritium de la ThyX de H. pylori (=0,01 μmol de H2O formée par min et par mg de protéine, tel que mesuré lors d'expériences supplémentaires de temps d'absorption).
De même, il a été démontré par de simples expériences de compétition, que l'activité de la ThyX n'utilise pas UMP comme substrat (tableau 3) et que cette activité est inhibée par des concentrations micromoléculaires de dTMP. L'activité libératoire de tritium de la ThyX de H. pylori est directement liée à la formation de dTMP (figure 6).
Les résultats expérimentaux ont donc clairement établi que les protéines ThyX fonctionnent comme une thymidilate-synthétase dUMP dépendante (figures 5, 6).
De plus, on a aussi montré que le fluoro-dUMP agit en tant qu'inhibiteur des protéines THYX . Ces résultats montrent que les déoxynucleotides monophosphates peuvent être utilisés pour identifier de nouveaux inhibiteurs des THYX. Pour une application pratique, ces résultats montrent aussi que les tests sont aussi utiles pour le ciblage des protéines THYX.
Par conséquent, alors que la catalyse par ThyX est dépendante des nucléotides de flavine réduite, la ThyA utilise des électrons du H folate pour la formation du groupe fonctionnel méthyle. Le CH2H4folate fonctionne dans la réaction catalysée par ThyX uniquement comme donneur d'un carbone, provoquant ainsi la formation de H4folate comme produit de la réaction. Ce mécanisme de réaction explique clairement pourquoi la dihydrofolate-réductase n'est pas indispensable à la formation de thymidylate par les protéines ThyX (tableau 4).
Tableau 4
Figure imgf000058_0001
Tdk : thymidine kinase, nécessaire à la récupération de. thymidine exogène.
DHFR : dihydrofolate réductase.
On notera que, dans la séquence de Chlamydia, le résidue Serine est soit absent, soit localisé à l'extrémité aminoterminale de la protéine.
Les différences dans le mécanisme enzymatique des deux différentes classes de thymidylate-synthétases sont aussi dues à l'absence de motifs de séquence essentiels pour la catalyse dans les protéines ThyA et ThyX. Ces données ont permis d'identifier des analogues de dUMP, de dTMP, de folate et de nucléotides de flavine comme candidats idéaux pour des composés clés pour identifier des composés nouveaux inhibant l'activité de la ThyX.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un polypeptide THYX comprenant la séquence d'acides aminés suivante :
X1HR(X)7S, dans laquelle : - Xi est l'acide aminé R ( Arginine ou Arg) ou K (Lysine ou Lys), et
- (X)7 est une chaîne de sept acides aminés consécutifs dans laquelle chaque X représente, indépendamment l'un de l'autre, l'un quelconque des 20 acides aminés naturels, dans un procédé de synthèse in vitro de la thymidine 5'-monophosphate (dTMP).
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le polypeptide THYX est choisi parmi les polypeptides comprenant les séquences d'acides aminés SEQ ID N°1 à SEQ ID N°37.
3. Utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX selon l'une des revendications 1 ou 2, pour produire ledit polypeptide THYX.
4. Utilisation selon la revendication 3 , caractérisée en ce que l'acide nucléique est choisi parmi les acides nucléiques comprenant les séquences nucléotidiques SEQ ID n°44 à SEQ ID n°64 .
5. Procédé de criblage d'une molécule ou d'une substance candidate interagissant avec un polypeptide selon l'invention, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mettre en contact un polypeptide selon l'une des revendications 1 ou 2 avec la substance ou molécule candidate à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit polypeptide et ladite substance ou molécule candidate.
6. Nécessaire ou kit pour le criblage d'une molécule ou d'une substance candidate interagissant avec un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2, ledit nécessaire comprenant : a) un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 ; b) le cas échéant, des moyens nécessaires à la détection du complexe formé entre ledit polypeptide et la molécule ou substance candidate.
7. Procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral in vitro dans un système acellulaire caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer un lysat cellulaire à partir d'une culture de cellules exprimant un polypeptide THYX tel que défini dans l'une revendications 1 ou 2 en l'absence d'un polypeptide codé par un gène thyA ; b) ajouter au lysat cellulaire obtenu à l'étape a) le composé inhibiteur à tester ; c) comparer l'activité thymidylate synthase respectivement dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape a) et dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape b) ; et d) sélectionner les composés candidats pour lesquels une inhibition de l'activité thymidylate synthase a été détectée.
8. Kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé inhibiteur de la thymidylate synthase caractérisé en ce qu'il comprend : a) une composition comprenant un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 en solution ou sous forme lyophilisée ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase.
9. Utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 dans un procédé de criblage de composés antibactériens ou antiviraux.
10. Kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé antibactérien ou antiviral, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un vecteur d'expression recombinant comprenant un acide nucléique codant un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule hôte dans laquelle son expression est recherchée ou une cellule hôte transfectée avec un tel vecteur recombinant ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaire à la quantification de l'activité thymidylate synthase.
11. Utilisation d'un oligonucleotide antisens s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique codant pour un polypeptide
THYX tel que défini selon l'une des revendications 1 ou 2 pour inhiber ou bloquer la transcription et/ou la traduction dudit acide nucléique.
12. Utilisation d'un anticorps dirigé contre un polypeptide THYX tel que défini selon l'une des revendications 1 ou 2 pour inhiber ou bloquer l'activité thymidylate synthase dudit polypeptide.
13. Composition pharmaceutique antibactérienne ou antivirale comprenant, à titre de principe actif un oligonucleotide antisens hybridant spécifiquement avec un ARN messager codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
14. Utilisation d'un oligonucleotide antisens hybridant spécifiquement avec l'ARN messager codant pour un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 pour la fabrication d'un médicament antibactérien ou anti-viral.
15. Composition pharmaceutique antibactérienne ou antivirale comprenant, à titre de principe actif, un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
16. Utilisation d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un polypeptide THYX tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 pour la fabrication d'un médicament antibactérien ou antiviral.
17. Utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléique hybridant avec un acide nucléique codant pour un polypeptide THYX, tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2, dans un procédé de détection d'une bactérie ou d'un virus.
18. Utilisation d'un acide nucléique codant pour un polypeptide
THYX, tel que défini dans l'une des revendications 1 ou 2 comme marqueur de sélection d'un événement de transfection, de transformation ou de recombinaison génétique d'une cellule hôte ou d'un organisme hôte.
19. Milieu de réaction pour l'activité thymidylate synthase de la ThyX caractérisé en ce qu'il comporte des flavines réduites et du CH2H4folate.
20. Milieu selon la revendication 19, caractérisé en ce que les flavines réduites sont obtenues par réduction in situ de flavines oxydées.
21. Milieu selon l'une quelconque des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que la concentration en flavines oxydées est de 50μM à 1mM, de préférence, 0,5mM.
22. Milieu selon l'une quelconque des revendications 19 à 21 , caractérisé en ce que la concentration en CH2H4folate est de 50μM à 2mM, de préférence, 1mM.
23. Milieu selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, caractérisé en ce qu'il comporte en outre du dUMP, à une concentration allant de 1 μM à 800μM, de préférence, 500μM.
24. Milieu selon l'une quelconque des revendications 19 à 23, caractérisé en ce que les flavines oxydées sont des flavines mononucléotides et/ou de dinucléotides flavine adénine.
25. Milieu selon l'une quelconque des revendications 19 à 24, caractérisé en ce que la réduction des flavines est effectuée par voie chimique, enzymatique, photochimique ou électrochimique.
26. Milieu selon l'une quelconque des revendications 19 à 25, caractérisé en ce que la réduction des flavines est effectuée avec du
NADH et/ou du NADPH.
27. Milieu selon la revendication 26, caractérisé en ce que la concentration en NADH est de 0,1 à 1mM, et celle en NADPH, de 0,5 à 5mM.
28. Procédé de criblage d'un composé antibactérien ou antiviral in vitro dans un système acellulaire caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer un lysat cellulaire à partir d'une culture de cellules exprimant un polypeptide THYX en l'absence d'un polypeptide codé par un gène thyA et comportant un milieu selon l'une des revendications 19 à 27; b) ajouter au lysat cellulaire obtenu à l'étape a) le composé inhibiteur à tester ; c) comparer l'activité thymidylate synthase ThyX respectivement dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape a) et dans le lysat cellulaire obtenu à l'étape b) ; et d) sélectionner les composés candidats pour lesquels une inhibition de l'activité thymidylate synthase ThyX a été détectée.
29. Procédé de criblage selon la revendication 28, caractérisé en ce que on utilise le dTMP et 3H comme marqueurs de l'activité thymidylate synthase ThyX.
30. Kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé inhibiteur de la thymidylate synthase ThyX caractérisé en ce qu'il comprend : a) une composition comprenant un polypeptide THYX ainsi qu'un milieu selon l'une quelconque des revendications 19 à 27, en solution ou sous forme lyophilisée ; b) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.
31. Kit ou nécessaire pour le criblage d'un composé antibactérien ou antiviral, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un vecteur d'expression recombinant comprenant un acide nucléique codant un polypeptide ThyX sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans une cellule hôte dans laquelle son expression est recherchée ou une cellule hôte transfectée avec un tel vecteur recombinant ; b) un milieu selon l'une quelconque des revendications 19 à 27 ; c) facultativement, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la quantification de l'activité thymidylate synthase ThyX.
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