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WO2003006639A1 - Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations - Google Patents

Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations Download PDF

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WO2003006639A1
WO2003006639A1 PCT/FR2002/002475 FR0202475W WO03006639A1 WO 2003006639 A1 WO2003006639 A1 WO 2003006639A1 FR 0202475 W FR0202475 W FR 0202475W WO 03006639 A1 WO03006639 A1 WO 03006639A1
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WO
WIPO (PCT)
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cell
animal
hla
cells
human
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2002/002475
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English (en)
Inventor
Kader Thiam
Frédérique RATTIS
Fabien Bertaux
Alexandre Fraichard
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Genoway SA
Original Assignee
Genoway SA
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Publication date
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Priority to US10/483,569 priority patent/US20050066375A1/en
Priority to EP02784869A priority patent/EP1414949A1/fr
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    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology and more particularly the field of animal transgenesis and immunology.
  • the invention relates to an isolated animal cell comprising at least one transgene comprising at least one nucleotide sequence coding for at least one human polypeptide involved in the antigenic recognition and / or in the cellular activation of T cells, characterized in that that said cell, or a descendant of said cell, expresses at least all or part of said human polypeptide (s), and characterized in that the endogenous homologous animal gene coding for an animal polypeptide homologous to said human polypeptide is invalid .
  • the invention also relates to the corresponding transgenic animal.
  • the cell and the transgenic animal according to the invention can be used in a method for screening for compounds which modulate an immune reaction in humans.
  • the invention also relates to the use of the cell according to the invention as an autologous cell or one tolerated by the immune system for the preparation of a medicament intended for the treatment of patients requiring a cell and / or tissue transplant.
  • Recognition of an antigen by T cells involves a tripartite complex composed of the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) located on the surface of antigen presenting cells (APC), the antigenic peptide and the T cell receptor (TCR).
  • MHC major histocompatibility complex
  • APC antigen presenting cells
  • TCR T cell receptor
  • the peptide is correctly primed by the APCs, then associated with the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) (called H-2 in mice, HLA in humans) and finally expressed on the surface of the APCs, so that the peptide-MHC complex presented can be recognized by the specific TCR.
  • MHC major histocompatibility complex
  • MHC molecules are made up of two chains ⁇ and ⁇ . Each of these chains can be encoded by different alleles present on the short arm of chromosome 6 (6p21.3) in humans.
  • the loci encoding the genes for class II molecules are centromeric and are located in the HLA-D region (approximately 900 kb).
  • HLA-A contains at least 20 class II genes, 9 of which are functional: DPB1, DPA1, DQB1, DQB2, DRB1, DRB2, DRB4, DRB5, DRA.
  • the class I region (approximately 1600 kb) contains approximately 20 class genes
  • MHC class I molecules are formed from an ⁇ chain associated noncovalently with a polypeptide, beta 2 microglobulin ( ⁇ 2m).
  • the HLA polymorphism represents variations within a locus in a population. Each variation represents an HLA allele. For example, the association of an ⁇ chain with a ⁇ chain allows the expression of a functional MHC class II protein, having a peptide binding site where the majority of the polymorphic variations will be concentrated.
  • mice This phenomenon, defined as gene restriction, influences peptide-MHC interactions and partly explains why certain individuals respond or not to a given antigen.
  • Animal models initially made it possible to study the nature of the immune response implemented (for example, Thl versus Th2, cellular response versus humoral, etc.). However, they have shown their limits, particularly in studies looking for a "vaccine candidate" that can be extrapolated to humans.
  • transgenic mice expressing a given allele of the MHC were used. In most cases, these models were obtained by conventional transgenesis. This means that the gene coding for the HLA molecule is randomly integrated into the mouse genome, the effect of the integration site on the biological activity of the transgene cannot be ignored.
  • transgene encoding human HLA is randomly integrated into the genome, such integration necessarily having consequences on the regulation and expression of endogenous genes at the integration site as well as on the fine regulation of the expression of the transgene.
  • multi-transgenic animals mice or other
  • these animals would constitute tools of considerable value for a pre-evaluation of the capacity of certain molecules to trigger an immune response in humans. This is the technical problem which the present invention proposes to solve.
  • the inventors intend to introduce several human HLA alleles into the genome of laboratory animals, preferably in mice, and thus cover a wide range of human gene restriction linked to MHC.
  • the multigene HLA mouse models developed by the inventors express one to two HLA class I and / or class II molecules.
  • the association of a class I HLA molecule and one to two class II HLA molecules in the same model would be an appreciable tool for vaccinology studies.
  • the MHC class I molecules will present the exogenous peptides to CD8 T lymphocytes, responsible for a CTL type response (cytotoxic T lymphocytes).
  • HLA class II molecules will present peptides to CD4 T lymphocytes which, following their activation, will produce cytokines and thus allow the development of a cellular and / or humoral immune response.
  • a transgenic animal for human class I and II molecules the two components necessary for the study of an immune response will be combined, and the model obtained will make it possible to study an antigen (restricted class I) in association with a peptide (restricted class II) which promotes the development of an overall T response.
  • an antigen restricted class I
  • peptide restricted class II
  • the inventors propose to suppress the expression of murine MHC in order to allow only the human HLA genes to be expressed, thereby increasing the quality of the model.
  • Targeted insertion technology Knock-In
  • Knock-In is used for this purpose and avoids the drawbacks of random insertion of the transgene obtained by conventional transgenesis by microinjection of DNA into the pronucleus, for example.
  • the murine MHC molecules will be invalidated at the same time as the human HLA molecules will be introduced.
  • These human genes in place of their murine equivalents benefit from the endogenous regulation exerted normally on the expression of MHC molecules during the development of an immune response.
  • the inventors propose to humanize the ⁇ 2m molecule to eliminate the possibilities of association between human HLA class I molecules and murine ⁇ 2m.
  • the presentation of antigen restricted to MHC class I molecules will then be as close as possible to that observed in human cells.
  • the inventors propose to humanize, in addition to the MHC molecules, other molecules playing an important role in the recognition of antigens as CD4 and CD8 co-receptors.
  • the CD4 and CD8 molecules have been shown to associate in the form of a quaternary complex with the TCR-MHC-peptide complex. This association does not take place under satisfactory conditions between xenogenic molecules, this was highlighted in the first models of transgenic mice carrying a human HLA incapable of interacting with the murine CD4
  • CD8s involved in conjunction with the TCR in binding MHC-peptide complexes can stimulate intracellular signals essential in the lymphocyte activation process.
  • the invention also relates to a multi-transgenic mouse model HLA into which is introduced by targeted insertion into the murine locus CD4 and CD8 corresponding, a chimeric gene preferably coding for the extracellular part of the molecule CD4 or Human CD8 and for the transmembrane and intracellular part of the murine molecule; MHC / CD4 or CD8 recognition is therefore, in such an animal, human model, while signal transduction within the T lymphocyte is murine.
  • the present invention therefore proposes to provide animal models, preferably mouse, multi-transgenic HLA humanized for all molecules playing a key role in the initiation of an immune response, while preserving signaling in the murine T lymphocyte .
  • the invention therefore aims to provide a collection of multi-transgenic HLA laboratory animals in different genetic backgrounds which will be as many experimental models for a pre-evaluation of molecules of interest (antigens or others). The evaluation thus carried out will be very relevant insofar as the presentation of the antigen will be done in a humanized context in an optimal manner.
  • the models according to the invention constitute refined models useful for the study of antigenic tolerance (induction or rupture), vaccinology, allergic and / or inflammatory phenomena
  • the multi-transgenic HLA animals according to the invention will also make it possible to reproduce experimental models of autoimmune pathologies described in humans and associated with one or more given HLAs: for example by expressing HLAs which are observed in linkage disequilibrium in populations and associated with phenotypes of autoimmune pathology.
  • the invention relates to an isolated animal cell comprising at least one transgene comprising at least one nucleotide sequence coding for at least one human polypeptide involved in the antigenic recognition and / or in the cellular activation of T cells, characterized in that said cell, or a descendant of said cell, expresses at least all or part of said human polypeptide (s), and characterized in that said nucleotide sequence is stably integrated into the genome of said cell by targeted insertion by homologous recombination (“Knock-In”) at at least one, preferably two alleles of said endogenous animal gene, the integration of said sequence invalidating said homologous endogenous animal gene.
  • Knock-In homologous recombination
  • homologous polypeptide within the meaning of the present invention is intended to denote polypeptides of different animal species, one being human, optionally having substantial sequence homology and coding for functionally equivalent polypeptides in the two animal species.
  • human polypeptide involved in the antigenic recognition and / or in the cellular activation of T cells is intended to denote all of the molecules involved in the antigenic recognition and / or in the cellular activation of the T lymphocytes. intends to designate the presentation of the antigen to T cells by a MHC molecule causing activation of said T cells and therefore the initiation and development of an immune response.
  • T lymphocytes By cellular activation of T lymphocytes is meant the entire reaction cascade, induced following priming of the immune or pathological response.
  • the human polypeptide involved in the recognition and / or antigenic activation by T cells is selected from the group consisting of antigens of the major histocompatibility complex.
  • HLA ⁇ 2-microglobulin
  • T cell receptor chains TCR
  • CD3 complex polypeptides CD4 and CD8 co-receptors
  • costimulatory molecules ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, LFA- 1, CD28, CD80, CD86, CD40, CD40L, CD5, CD72, CTLA-4, CD2, LFA-3.
  • said major histocompatibility complex antigen is selected from the group consisting of HLA type I, type II, type III antigens.
  • said human polypeptide is a human HLA class I antigen which is preferably chosen from functional human HLA class I antigens, more preferably from the group consisting of HLA-A2, HLA- A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B35, HLA-Cw7, HLA-Cw3 and said invalidated homologous animal polypeptide is an MHC I animal antigen which is preferably a functional animal MHC class I molecule. More preferably, the animal is the mouse.
  • the murine antigen of the major invalidated class I histocompatibility complex is therefore chosen according to the murine genetic background. So the H2K and H2D antigens are preferably inactivated in mice of strain 129 or C57 / B16, and the H2L antigen in Balb / c mice.
  • said human polypeptide is a human HLA class II antigen which is preferably chosen from functional human HLA class II antigens, more preferably from the group consisting of HLA-DR4, HLA- DR1, HLA-DRU, HLA-DR7, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DQ8, HLA-DQ3, HLA-DP4 and said invalidated homologous animal polypeptide is an animal CMHII antigen which is preferably a MHC molecule of class II functional animal.
  • the animal preferably being an inbred mouse ("In bred")
  • the murine MHC II antigen to be invalidated is chosen according to the murine genetic background; thus, the IE beta antigen, which is not expressed and therefore non-functional in the murine strain 129, is not chosen when the targeted transgenesis is carried out in the strain 129.
  • the antigens IA alpha, IA beta and IE alpha are disabled in mice 129.
  • the invention can be carried out in any mammalian cell competent for homologous recombination.
  • these are rodent cells, in particular mice, rats, hamsters, guinea pigs.
  • these are mouse cells.
  • these are primate cells - including human cells -, such as monkeys, chimpanzees, macaques, baboons. It can also be cells of cattle, goats, sheep, pigs, in particular mini-pigs, equines such as the horse, lagomorphs such as the rabbit.
  • the cells according to the invention can be defined functionally as being capable of carrying out the homologous recombination of the fragment (s) of exogenous DNA which contains at least one, preferably two, region (s) having sequence homologies with a endogenous cellular DNA sequence.
  • Such cells naturally contain endogenous recombinases or have been genetically modified to contain them or to contain the compounds necessary for carrying out the recombination of DNA.
  • the cells according to the invention Preferably, among the cells according to the invention, mention should be made of all cell types naturally expressing specific proteins involved in the recognition and / or activation of antigen by T cells. It is worth mentioning cells of the immune system , professional and non-professional antigen presenting cells, hematopoietic stem cells.
  • T lymphocytes a subset of T lymphocytes
  • thymocytes dendritic cells
  • intraepithelial lymphocytes NK cells
  • B lymphocytes basophils
  • mast cells macrophages, eosinophils, monocytes, platelets, Langerhans cells, dendritic cells, professional and non-professional antigen presenting cells.
  • the cells according to the invention can also be for example neuronal cells. Mention should also be made of cells which, under certain culture conditions, or after genetic differentiation or manipulation, are capable of expressing specific proteins involved in the recognition and / or antigenic activation by T cells.
  • stem cells hematopoietic, totipotent embryonic stem cells (ES cells) or pluripotent. These stem cells can differentiate into a cell expressing the specific proteins according to the invention.
  • stem cells is intended to denote all the types of undifferentiated multipotent or pluripotent cells, which can be cultivated in vitro for a long time without losing their characteristics, and which are capable of differentiating into one or more cell types when they are placed under conditions of defined culture.
  • the cell according to the invention is an ES cell or a hematopoietic cell
  • T cells such as for example cells of the immune system, and more precisely mast cells, basophils, monocytes, eosinophils, mature and immature T lymphocytes, thymocytes, dendritic cells, NK cells , B lymphocytes, Langerhans cells, platelets, monocytes, dendritic cells, professional and non-professional antigen presenting cells.
  • an ES cell cell line can be used or embryonic cells can be obtained fresh from a host animal according to the invention, generally a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig. Such cells are cultured on a layer of suitable nourishing fibroblasts or on gelatin, in the presence of appropriate growth factors such as leukemia inhibitor factor (LIF).
  • LIF leukemia inhibitor factor
  • the cells according to the invention correspond to all animal cells, preferably mammalian cells, with the exception of human cells.
  • mammalian cells competent for recombination therefore include fibroblasts, endothelial cells, epithelial cells, cells usually cultivated in the laboratory such as Hela cells, CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, Dorris, AE7, D10. .64, DAX, Dl.l, CDC25 for example.
  • transgenic is intended to denote a cell comprising a transgene.
  • the expression “transgene” or by exogenous nucleic acid sequence or by exogenous gene is intended to denote genetic material which has been or which is going to be inserted artificially in the genome of a mammal, particularly in a mammalian cell cultivated in vitro or in a living mammalian cell, or one which will remain in said cell in episodic form.
  • the transgene according to the The present invention comprises at least one sequence capable of being transcribed or transcribed and translated into protein.
  • the transgenic or transgenes according to the invention or their expression does not affect (s) the functioning of the biological network of the immune system, nor more generally the functioning of the biological network of the cell.
  • the transgene can be cloned into a cloning vector which makes it possible to ensure its propagation in a host cell, and / or optionally in an expression vector to ensure the expression of the transgene.
  • the recombinant DNA technologies used for the construction of the cloning and / or expression vector according to the invention are those known and commonly used by those skilled in the art.
  • the vectors include plasmids, cosmids, phagemids, bacteriophages, retroviruses and other animal viruses, artificial chromosomes, such as YAC, BAC, HAC and the like.
  • transgenic cells according to the invention are well known to those skilled in the art (Gordon et al., 1989). Various techniques for transfecting mammalian cells have been described (for review, see Keon et al., 1990).
  • the transgene according to the invention optionally included in a linearized vector or not, or in the form of a vector fragment, can be introduced into the host cell by standard methods such as for example micro-injection into the nucleus (US 4,873,191), transfection by calcium phosphate precipitation, lipofection, electroporation (Lo, 1983), thermal shock, transformation with cationic polymers (PEG, polybrene, DEAE-
  • the transgenic cell according to the invention is obtained by gene targeting (“gene targeting”) of the transgene (s) at the level of one or more sequences of the genome of the host cell . More specifically, the transgene is stably inserted by homologous recombination at the level of homologous sequences in the genome of the host cell.
  • the host cell is preferably an embryonic stem cell (ES cell) (Thompson et al., 1989).
  • Gene targeting represents the directed modification of a chromosomal locus by homologous recombination with an exogenous DNA sequence having a sequence homology with the targeted endogenous sequence.
  • gene targeting can be used to modify, in general increase the expression of one or more endogenous gene (s), or to replace an endogenous gene with an exogenous gene, or to place an exogenous gene under the control of regulatory elements gene expression of a particular endogenous gene which remains active.
  • gene targeting is called “Knock-in” (Kl).
  • Kl gene targeting
  • gene targeting can be used to decrease or suppress the expression of one or more genes. This then involves gene targeting called “Knock-Out” (KO) (see Bolkey et al., 1989).
  • the integration into the genome of said cell of said transgene coding for at least one human polypeptide involved in the recognition and / or antigenic activation by T cells constitutes a "knock-in”; it is carried out at the level of said endogenous gene or genes coding for a homologous animal coding for an or said animal polypeptide (s) so that said transgene invalidates the expression of said endogenous gene.
  • the cell according to the invention is characterized in that the transgene is stably integrated into the genome of said cell, and in that its expression is controlled by the regulatory elements of the endogenous gene.
  • stable integration is meant the insertion of the transgene into the genomic DNA of the cell according to the invention.
  • the transgene thus inserted is then transmitted to the cell descendants. Integration of the transgene is carried out upstream, downstream or in the middle of the target endogenous gene.
  • the cell according to the invention expresses one or more transgenes, each coding for at least one human polypeptide involved in the antigenic recognition and / or the cellular activation of T cells.
  • the transgene to contain at least one DNA sequence comprising all or part of at least the gene coding for the human polypeptide involved in the antigenic recognition and / or the activation of T cells, with possibly the desired genetic modifications and optionally one or more positive or negative selection genes, and also DNA regions of homology with the target locus, preferably two in number, located on either side of the portion of the reporter gene.
  • homologous DNA regions or “homologous or substantially homologous DNA sequences” is intended to denote two DNA sequences which, after optimal alignment and after comparison, are identical for approximately at least approximately 75% of the nucleotides, at least about 80% of the nucleotides, usually at least about 90% to 95% of the nucleotides and, more preferably, at least about 98 to 99.5% of the nucleotides.
  • percentage of identity between two nucleic acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • sequence comparisons between two nucleic acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned, said comparison being performed by segment or by “comparison window” in order to identify and compare the local regions of sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, besides manually, by means of the local omology algorithm of Smith and aterman (1981), by means of the local homology algorithm of Neddleman and unsch (1970 ), using the similarity search method of Pearson and Lip an (1988), using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • the BLAST program is preferably used with the BLOSUM 62 matrix.
  • the PAM or PAM250 matrices can also be used.
  • the percentage of identity between two nucleic acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences, the nucleic acid or amino acid sequence to be compared being able to comprise additions or deletions with respect to the sequence of. benchmark for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences presenting a percentage identity of at least 85%, preferably at least 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a reference sequence
  • nucleic sequences having, with respect to the sequence reference nucleic acid, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular point, and whose nucleic sequence has at least 85%, preferably at least 90%, 95 %, 98% and 99% identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence.
  • the length of the regions of homology is partially dependent on the degree of homology.
  • the DNA fragments are of any what size.
  • the minimum size required is subject to the need to have at least one region of homology long enough to facilitate homologous recombination.
  • the DNA fragments are at least about 2 kb in size, preferably at least about 3 kb, 5 kb, ⁇ kb in size.
  • the transgene is not limited to a particular DNA sequence.
  • the DNA sequences of homology present in the transgene may be of a purely synthetic origin (for example routinely produced from a DNA synthesizer), or may be derived from mRNA sequences by reverse transcription, or can be derived directly from genomic DNA sequences.
  • the DNA sequence of homology derives from RNA sequences by reverse transcription, this may or may not contain all or part of non-coding sequences such as introns, depending on whether the corresponding RNA molecule has been subjected or not, partially or totally, splicing.
  • the homologous DNA sequences used to carry out the homologous recombination comprise genomic DNA sequences rather than cDNA .
  • genomic DNA sequences include a sequence encoding a transcript of RNA.
  • the RNA transcript encodes all or part of a polypeptide; preferably, they are human polypeptides involved in antigenic recognition and / or cellular activation of T cells.
  • the transgene codes for a part of the polypeptide, it is preferably one or more exons; thus, in the context of the humanization of the murine gene for beta-2 ⁇ microglobulin, the transgene preferably comprises an exon; in this case, the Knock-in is preferably an exchange of exons.
  • the same transgene can code for several human genes.
  • the human genes are preferably in the form of cDNA and are placed under the control of human promoter regions. When several human genes are thus contiguously linked, they are either arranged in the form of multiple distinct gene entities, each comprising at least one promoter, regulatory sequences, a coding sequence, the termination signals, or the coding sequences are dispersed.
  • the IRES are selected from the IRES of the myocardial encephalitis virus (EMCV), of the cardiovirus, of the aphtovirus, of the enterovirus, of the rhinovirus, in particular of the human rhinovirus (HCV), of the virus. hepatitis A, poliovirus type I, foot and tongue disease virus (FMDV), ECHO virus, murine leukemia virus (MLV) from cMyc.
  • EMCV myocardial encephalitis virus
  • EMCV myocardial encephalitis virus
  • cardiovirus of the aphtovirus
  • HCV human rhinovirus
  • HCV human rhinovirus
  • HCV human rhinovirus
  • hepatitis A poliovirus type I
  • FMDV foot and tongue disease virus
  • ECHO virus murine leukemia virus
  • MMV murine leukemia virus
  • the transgene comprises at least one nucleotide sequence coding for at least all or part of a human polypeptide involved in the antigenic recognition and / or the cellular activation of T cells, a framed positive selection cassette or no sites-specific to the action of recombinases, for example a Lox / Neo-TK / Lox or lox / Neo / lox or FRT / Neo-TK / FRT or FRT / Neo / FRT cassette which may also be present in position 5 'of the said nucleotide sequence, and characterized in that a negative selection cassette containing for example the gene or genes DTA and / or TK is present at at least one of the ends of the transgene.
  • a negative selection cassette containing for example the gene or genes DTA and / or TK is present at at least one of the ends of the transgene.
  • the transgene may be as small as a few hundred DNA base pairs or c as large as hundreds of thousands of basepairs of a gene locus comprising the coding sequence exonique- intronic and regulatory sequences necessary for the '' obtaining a spatio-temporally controlled expression.
  • the recombinant DNA segment has a size of between 2.5 kb and 1000 kb. In any case, the recombined DNA segments can be less than 2.5 kb and more than 1000 kb.
  • the transgene of the present invention is preferably in native form, that is to say derived directly from an exogenous DNA sequence naturally present in an animal cell.
  • This DNA sequence in native form can be modified for example by insertion of restriction sites necessary for cloning and / or by insertion of site-specific recombination sites (lox and flp sequences).
  • the transgene of the present invention may have been created artificially in vitro by recombinant DNA techniques, for example by combining portions of genomic DNA and / or cDNA . These are chimeric transgene.
  • the DNA sequence according to the invention, in native or chimeric form can be mutated using the techniques well known to those skilled in the art. For coding sequences, these mutations can affect the amino acid sequence.
  • the cells When the cells have been transformed by the transgene, they can be cultured in vitro or else used to produce transgenic animals. After transformation, the cells are seeded on a feeder layer and / or in an appropriate medium. Cells containing the construct can be detected using a selective medium. After sufficient time to allow the colonies to grow, they are collected and analyzed to determine if a homologous recombination event and / or integration of the construct has occurred. In order to screen the clones capable of satisfying homologous recombination, positive and negative markers, also called selection genes, can be inserted into the homologous recombination vector.
  • selection gene is intended to denote a gene which allows the cells which possess it to be selected specifically for or against the presence of a corresponding selective agent.
  • an antibiotic resistance gene can be used as a positive selection marker gene which allows a host cell to be positively selected in the presence of the corresponding antibiotic.
  • positive and negative markers are known to those skilled in the art (for review see US Patent 5,627,059). This selection gene can be found either inside or outside the linearized transgene.
  • the selection gene When the selection gene is located inside the transgene, that is to say between the 5 ′ and 3 ′ ends of the transgene, this can be present in the form of a gene entity distinct from the coding gene. for at least one human polypeptide involved in antigenic recognition and cell activation of T cells according to the invention.
  • the selection gene is operably linked with DNA sequences making it possible to control its expression; alternatively, the selection gene can be placed under the control of the sequences for regulating the expression of said human gene.
  • sequences known to those skilled in the art, correspond in particular to promoter sequences, optionally to activator sequences and to transcription termination signals.
  • the selection gene can constitute a gene for fusion with the human gene.
  • the selection gene is located at the 5 ′ or 3 ′ ends of the transgene so that if a homologous recombination event occurs, the selection gene is not integrated into the Cellular genomic DNA; in this case, the selection gene is a negative selection gene (for a review, see US Pat. No. 5,627,059).
  • Said positive selection gene according to the invention is preferably chosen from the antibiotic resistance genes.
  • antibiotics non-exhaustive mention should be made of neomycin, tetracycline, ampicillin, kanamycin, phleomycin, bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, carbenicillin, geneticin, puromycin.
  • the resistance genes corresponding to these antibiotics are known to those skilled in the art; for example, the neomycin gene makes cells resistant to the presence of the antibiotic G418 in the culture medium.
  • the positive selection gene can also be selected from the HisD gene, the corresponding selective agent being histidinol.
  • the positive selection gene can also be selected from the guanine phosphoribosyl transferase (GpT) gene, the corresponding selective agent being xanthine.
  • the positive selection gene can also be selected from the hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) gene, the corresponding selective agent being hypoxanthine.
  • Said negative selection gene according to the invention is preferably chosen from the 6-thioxanthine or thymidine kinase (TK) gene (Mzoz et al., 1993), the genes coding for bacterial or viral toxins such as, for example, Pseudomonas exotoxin A, diphtheria toxin (DTA), cholera toxin, Bacillus anthrox toxin, Pertussis toxin, Shiga toxin Shiga, toxin related to Shiga toxin, Escherichia coli toxins, colicin A, d-endotoxin.
  • TK 6-thioxanthine or thymidine kinase
  • cytochrome p450 and cyclophosphophamide Mention may also be made of rat cytochrome p450 and cyclophosphophamide (Wei et al., 1994), purine nucleoside phosphorylase from Escherichia coli (E. coli) and 6-methylpurine deoxyribonucleoside (Sorscher et al., 1994), cytosine deaminases (Cdase) or uracil phosphoribosyl transferase (UPRTase) which can be used with 5-fluorocytosine (5-FC).
  • E. coli E. coli
  • 6-methylpurine deoxyribonucleoside Sorscher et al., 1994
  • cytosine deaminases Cdase
  • UPRTase uracil phosphoribosyl transferase
  • the selection marker (s) used to identify homologous recombination events can subsequently affect gene expression, and can be eliminated, if necessary, by the use of site-specific recombinases such as specific Cre recombinase. Lox sites (Sauer, 1994; Rajewsky et al., 1996; Sauer, 1998) or specific FLP for FRT sites (Kilby et al., 1993).
  • Positive colonies that is to say containing cells in which at least one homologous recombination event has occurred, are identified by analysis by southern blotting and / or by PCR techniques.
  • the level of expression, in the isolated cells or cells of the transgenic animal according to the invention, of the mRNA corresponding to the transgene can also be determined by techniques including analysis by northern blotting, analysis by hybridization in si tu, by RT-PCR. Also animal cells or tissues expressing the transgene can be identified using an antibody directed against the reporter protein. The positive cells can then be used to carry out the manipulations on the embryo and in particular the injection of the modified cells by homologous recombination into the blastocysts.
  • the blastocysts are obtained from 4 to 6 week old superovulated females.
  • the cells are trypsinized and the modified cells are injected into the blastocele of a blastocyst.
  • the blastocysts are introduced into the uterine horn of pseudo-pregnant females.
  • the females are then allowed to go to term and the resulting litters are analyzed to determine the presence of mutant cells having the construct.
  • Analysis of a different phenotype between cells of the newborn embryo and cells of the blastocyst or ES cells makes it possible to detect chimeric newborns.
  • the chimeric embryos are then reared until adulthood.
  • Chimeras, or chimeric animals are animals in which only a subpopulation of cells has an altered genome.
  • the chimeric animals presenting the modified gene or genes are generally crossed with each other or with a wild type animal in order to obtain heterozygous or homozygous progeny.
  • the male and female heterozygotes are then crossed to generate homozygous animals.
  • the transgenic animal according to the invention comprises stable changes in the nucleotide sequence of cells of the germ line.
  • the non-human transgenic cell according to the invention can serve as a nucleus donor cell in the context of a nuclear transfer or nuclear transfer.
  • nuclear transfer is intended to denote the transfer of the nucleus of a living vertebrate donor cell, from an adult organism or from the fetal stage, into the cytoplasm of an enucleated recipient cell of the same or a different species.
  • the transferred nucleus is reprogrammed to direct the development of cloned embryos which can then be transferred into carrier females to produce fetuses and newborns, or used to produce cells from the cultured internal cell mass.
  • gene targeting according to the present invention constitutes a "Knock-In" (KI).
  • the transgene or the exogenous gene or the nucleotide sequence according to the invention coding for at least all or part of a human polypeptide involved in the recognition and / or in the antigenic activation of T cells according to the invention is targeted by homologous recombination in the organism's genome.
  • the nucleotide sequence is stably integrated into the genome of said cell by targeted insertion by homologous recombination ("Knock-In”) at the level of at least one allele of said animal gene, and its integration invalidates said homologous endogenous animal gene.
  • Knock-In homologous recombination
  • the transgene or the nucleotide sequence is devoid of regulatory elements for gene expression and is operably linked to sequences for regulating the expression of said homologous endogenous animal gene.
  • the transgene or the nucleotide sequence comprises elements for regulating gene expression and is operably linked to exogenous sequences for regulating expression.
  • said sequences for regulating exogenous expression are the sequences for regulating the expression of said human gene coding for the human polypeptide.
  • the transgene comprises at least one gene, human, which codes for the human polypeptide involved in antigenic recognition and / or in the cellular activation of T cells.
  • Said human gene comprises either all of the sequences containing the information for production regulated the corresponding RNA
  • Said human gene can be a "wild type" gene exhibiting a natural polymorphism or a genetically manipulated DNA sequence, for example having deletions, substitutions or insertions in the coding or non-coding regions.
  • the human gene (s) lack the regulatory sequences necessary to direct and control their expression in an appropriate cell type (s); in fact, they are placed after homologous recombination under the control of endogenous animal sequences for regulating the expression of the target animal endogenous gene which preferably remains active following the event of homologous recombination and the integration of the human gene.
  • the transgene according to the invention may contain regulatory sequences suitable for directing and controlling the expression of said human protein or proteins involved in recognition and / or in antigenic activation by T cells in the cell.
  • the transgene is integrated in a targeted or random manner in the genome, or is present in episomal form in the cell.
  • the appropriate regulatory sequences are sequences inducible by one or more proteins.
  • elements for regulating gene expression is intended to denote all the DNA sequences involved in the regulation of gene expression, that is to say essentially the regulatory sequences for transcription, splicing, the translation.
  • DNA sequences which regulate transcription mention should be made of the minimum promoter sequence, the upstream sequences (for example, the SP1 box, the IRE for “interferon responsive element”, etc.), the activator sequences ( “Enhancers”), possibly the inhibitor sequences ("silencers”), the insulator sequences (“insulator”), the splicing sequences.
  • These expression regulation sequences are operably linked to the human gene (s).
  • a nucleic acid sequence is "operably linked” when it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence.
  • a promoter or activator is operably linked to a coding sequence, if it affects the transcription of said coding sequence.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequences are contiguous, and when it comes to linking two regions coding for proteins, contiguous and in reading phase.
  • the transgenic cell and / or the non-human transgenic animal according to the invention is obtained by introducing at least one transgene coding for a human polypeptide involved in the antigenic recognition and / or in the cellular activation of T cells, in a cell, a zygote or early embryo of the non-human animal.
  • the introduction of different transgenes into the cell according to the invention can also be carried out simultaneously or in a time-delayed manner.
  • the cell contains several transgenes, it can be obtained directly by simultaneous introduction of the DNA fragments necessary for homologous recombination in said cell using methods promoting the co-transformation of multiple DNA molecules.
  • the cells are then selected for the multiple recombination events expected using a suitable selection system.
  • the multi-cell transgenic can be achieved by performing homologous recombination events separately and time-shifted.
  • the cell after introduction of a first homologous recombination vector, is selected for the first homologous recombination event, using a suitable selection system; this newly transgenic cell is then transformed with a second homologous recombination vector, then selected for the second homologous recombination event using an identical or different selection system.
  • this double transgenic cell can then be transformed with a third homologous recombination vector, then selected for the third homologous recombination event using the same or different selection system, and so on.
  • the double, triple or multitransgenic cell according to the invention can be obtained by successive crossing of transgenic animals.
  • a double transgenic cell can be obtained by crossing two single homozygous transgenic animals; it can be obtained by crossing and then selecting two simple heterozygous transgenic animals, or by crossing and selecting a single homozygous transgenic animal and a single heterozygous transgenic animal.
  • the cell according to the invention is characterized in that it further comprises at least one transgene comprising at least all or part of a nucleotide sequence coding for at least all or part of 'a human polypeptide involved in antigenic recognition and / or cellular activation of T cells present in episomal form in said cell, and in that said homologous endogenous animal gene is invalidated in said cell.
  • said homologous endogenous animal gene is invalidated by targeted homologous recombination ("knockout"). It is within the capacity of a person skilled in the art to define the nature and the characteristics of the expression vector used to allow the maintenance and the expression in episomal form of the transgene in the cell of the invention.
  • the cell according to the invention is characterized in that it further comprises at least one transgene comprising at least all or part of a nucleotide sequence coding for at least all or part of a human polypeptide involved in antigenic recognition and / or cellular activation of T cells randomly integrated into the genome; in this case, the transgene is preferably integrated into a non-coding region of the genome, under the dependence of response elements on proteins involved in the recognition and / or activation of antigen by T cells.
  • the cell according to the invention is characterized in that the said nucleotide sequence (s) encode all or part of a human HLA class I antigen and is or are inserted by targeted insertion by homologous recombination (“Knock-In”) at the level of the homologous animal gene (s) encoding the animal antigen (s) of the major histocompatibility class I complex (MHC I).
  • Knock-In homologous recombination
  • the cell according to the invention is characterized in that the said nucleotide sequence (s) encode all or part of the HLA class II molecules and is or are inserted by targeted insertion by homologous recombination ("Knock-In ”) At the level of the homologous animal gene (s) encoding the animal antigens of the major class II histocompatibility complex (MHC)
  • Knock-In homologous recombination
  • the cell according to the invention is characterized in that the said nucleotide sequence (s) encode all or part of the HLA class I and class II molecules and is or are inserted by targeted insertion by homologous recombination (“Knock-In”) at the level of the homologous animal gene (s) encoding the animal antigen (s) of the major histocompatibility complex of class I (MHC I) and of class II (MHC II).
  • Knock-In homologous recombination
  • Said human HLA class I antigen is selected from the group consisting of HLA-A2, HLA-A24, HLA-Al, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B35 , HLA-Cw7, HLA-Cw3, and said MHC I animal antigen is selected from H2K, H2D and H2L.
  • Said human HLA class II antigen is chosen from the group consisting of HLA-DR4, HLA-DR1, HLA-DRU, HLA-DR7, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DQ8, HLA-DQ3, HLA-DP4, and said MHC II animal antigen is selected from IA alpha, IA beta, IE alpha and IE beta.
  • the cell according to the invention is characterized in that said nucleotide sequence codes for all or part of the ⁇ 2-human microglobulin, and is inserted by targeted insertion by homologous recombination ("Knock-In") at the level of the homologous animal gene coding for ⁇ 2-microglobulin.
  • the cell according to the invention is characterized in that the said nucleotide sequence (s) encode all or part of at least one of the polypeptides of the human CD3 complex and is or are inserted by targeted insertion by homologous recombination (“Knock-In”) at the level of the homologous animal gene (s) coding for the polypeptide (s) of the CD3 complex.
  • Knock-In homologous recombination
  • the cell according to the invention is characterized in that said nucleotide sequence codes for all or part of the human CD4 polypeptide and is inserted by targeted insertion by homologous recombination ("Knock-In”) at the level of the gene homologous animal coding for the CD4 polypeptide.
  • the cell according to the invention is characterized in that said nucleotide sequence codes for all or part of the human CD8 polypeptide and is inserted by targeted insertion by homologous recombination ("Knock-In”) at the gene level homologous animal coding for the CD8 polypeptide.
  • the cell according to the invention is characterized in that it comprises (a) said nucleotide sequence coding for all or part of human ⁇ 2-microglobulin, inserted by targeted insertion by homologous recombination ("Knock- In ”) at the level of the homologous animal gene encoding ⁇ 2- microglobulin; and / or (b) said nucleotide sequence coding for all or part of the human CD4 polypeptide, inserted by targeted insertion by homologous recombination ("Knock-In”) at the level of the homologous animal gene coding for the CD4 polypeptide; and / or (c) said nucleotide sequence coding for all or part of the human CD8 polypeptide, inserted by targeted insertion by homologous recombination ("Knock-In”) at the level of the homologous animal gene coding for the CD8 polypeptide.
  • Knock- In homologous recombination
  • the cell according to the invention further comprises said nucleotide sequence (s) coding for all or part of at least one of the polypeptides of the human CD3 complex, inserted by targeted insertion by homologous recombination
  • the present invention also relates to the non-human transgenic animal comprising at least one cell according to the invention.
  • the term “transgenic animal” is intended to denote a non-human animal, preferably a mammal chosen from the group of rodents, and in particular mice, rats, hamsters and guinea pigs. The mouse is particularly appreciated because its immune system has been studied in depth.
  • the transgenic animal is chosen from farm animals and in particular pigs, sheep, goats, cattle, horses, especially horses, lagomorphs, especially rabbits.
  • the transgenic animal according to the invention can also be chosen from primates, in particular monkeys, such as the macaque, the chimpanzee, the baboon.
  • mice according to the invention can be selected from inbred murine lines ("inbred”) 129Sv, 12901a, C57B16, BalB / C, DBA / 2, but also from non-inbred lines ("outbred”) or lines hybrids.
  • inbred inbred murine lines
  • 129Sv inbred murine lines
  • 12901a C57B16
  • BalB / C BalB / C
  • DBA / 2 non-inbred lines
  • the transgenic animal according to the invention comprises at least one cell whose genome comprises at least one transgene or nucleotide sequence according to the invention integrated by targeted insertion ("knock-in”), and optionally at least one transgene or nucleotide sequence present either as an extra-chromosomal element, or randomly integrated into chromosomal DNA.
  • knock-in targeted insertion
  • transgenes according to the invention are integrated by targeted homologous recombination (“Knock-In”) into the genome of the cell according to the invention.
  • Knock-In targeted homologous recombination
  • all of the animal's cells and in particular its cells of the germ line are transgenic.
  • the transgenic animal according to the invention is characterized in that the cells of its immune system express at least one functional human HLA antigen; cells in his immune system can also express humanized and functional co-receptor and co-stimulatory molecules.
  • the invention also relates to the use of a cell and or of an animal according to the invention for the screening of compounds modulating the human immune response. It is therefore an object of the invention to provide a method for screening for compounds which modulate, that is to say inducing, stimulating, inhibiting, suppressing an immune reaction in humans, characterized in that it comprises steps of (a) bringing a cell and / or an animal according to the invention into contact with an immunogen responsible for triggering an immune response, (b) bringing a cell into contact and / or of an animal according to the invention with an immunogen responsible for triggering an immune response and, simultaneously or delayed in time, with said compound, (c) the determination and qualitative evaluation, optionally quantitative, if an immune reaction occurs, (d) then the identification of the compound which selectively modulates the immune reaction.
  • the determination and / or evaluation of said immune reaction is carried out according to a technique chosen from (a) determining the production of soluble factors such as chemokines and cytokines, (b) determining the presence of receptors on the cell surface, (c) determining cell proliferation, (d) determining the effector functions of T cells (CTL, Helper, etc.), (e) determining the production of antibodies by B cells.
  • said determination and / or evaluation of said immune reaction is carried out by measuring the level of expression of a reporter gene.
  • reporter gene is intended to denote a gene which allows cells containing this gene to be detected specifically following the expression of the latter, that is to say to be distinguished other cells that do not carry this marker gene.
  • Said reporter gene according to the invention codes for a reporter protein preferably chosen from the group composed of auto-fluorescent proteins, such as the Green Fluorescence Protein (GFP), the augmented Green Fluorescence Protein (EGFP), yellow fluorescence protein (YFP for “Yellow Fluorescence Protein”), blue fluorescence protein (CFP, for “Cyan fluorescence protein”), red fluorescence protein (RFP for “Red Fluorescence Protein”), as well as variants of these fluorescence proteins obtained by mutagenesis to generate fluorescence of a different color.
  • GFP Green Fluorescence Protein
  • EGFP augmented Green Fluorescence Protein
  • YFP yellow fluorescence protein
  • CFP blue fluorescence protein
  • RFP red fluorescence protein
  • Said "reporter” gene also codes for any enzyme detectable in a fluorescent, phosphorescent or visible manner by a histochemical process on living cells or any other methods of cell analysis, or by microscopy.
  • ⁇ -galactosidase ⁇ -GAL
  • ⁇ -glucoronidase ⁇ -GAL
  • ⁇ -GUS alkaline phosphatase, especially placental alkaline phosphatase (PLAP), alcoholic dehydrogenase, especially dehydrogenase Drosophila alcoholic (DHA), luciferase, in particular "Firefly Luciferase", chloramphenicol-acetyl-transferase (CAT), growth hormone (GH).
  • PLAP placental alkaline phosphatase
  • DHA dehydrogenase Drosophila alcoholic
  • luciferase in particular "Firefly Luciferase", chloramphenicol-acetyl-transferase (CAT), growth hormone (GH).
  • the invention also relates to the use of a composition comprising a compound modulating the immune reaction and a pharmaceutically acceptable vehicle as a medicament for the preventive and / or curative treatment of a man or an animal requiring a such treatment, characterized in that the ability of said compound to modulate, that is to say to inhibit, activate, selectively annihilate the immune response is determined by (a) bringing a cell into contact and / or an animal according to the invention with an immunogen responsible for triggering an immune response, (b) bringing a cell and / or an animal according to the invention into contact with an immunogen responsible for triggering an '' an immune response and, simultaneously or staggered in time, with said compound, (c) the qualitative determination and evaluation, optionally quantitative, if an immune reaction occurs, (d) then the identification of the compound which modulates the immune reaction.
  • antigen within the meaning of the present invention is intended to denote a compound capable of triggering an immune response and / or to be recognized by an antibody or a T lymphocyte.
  • immunogen is meant to denote a compound capable of triggering an immune response.
  • allergens mitogens, pathogens, or one of their constituents, of viral, bacterial, parasitic, fungal, mycoplasmic origin, vaccines and vaccine compositions, adjuvants, drugs, chemical compounds or agents.
  • the contacting of a specific antigen with a cell or an animal according to the invention can be done by various routes such as for example a conventional infection by a pathogenic microorganism, or via a biological delivery vector (mosquito, tick, bacterium, virus and parasites or recombinant commensal agent, naked DNA ...), by inhalation, in aerosol, by food.
  • the immunogen can be brought into contact with the animal by administration by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route, skin contact or by oral route.
  • the compounds obtained by the screening methods of the invention and which induce an immune reaction in humans constitute excellent vaccines. These compounds thus identified can for example be vaccines with a minimal epitope for diseases of viral origin such as the human immunodeficiency syndrome (AIDS) caused by an HIV infection.
  • AIDS human immunodeficiency syndrome
  • hepatitis B human immunodeficiency virus
  • hepatitis C for diseases of bacterial origin such as tuberculosis, or of parasitic origin such as malaria.
  • the compound obtained by the screening method according to the invention or the composition according to the invention can be used not only in preventive treatment, but also in curative treatment of a number of pathologies for which there is a dysfunction of antigenic recognition and / or cellular activation of T cells. This is particularly the case in the context of a bacterial, viral, fungal or parasitic infection or in the case of cancer and autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases mention should be made in a non-exhaustive manner of uveitis, Bechet's disease, Sarcoidosis, Sjôgren syndrome, rheumatoid arthritis, juvenile polyarthritis, Fiessinger-Leroy-Reiter syndrome, gout, osteoarthritis, systemic lupus erythematosus, polymyositis, myocarditis, primary biliary cirrhosis, Crohn's disease, ulcerative colitis, multiple sclerosis and other demyelinating diseases, aplastic anemia, essential thrombocytopenic purpura , multiple myeloma and B-cell lymphoma, Simmonds panhypopituitarism, Graves 'disease and Graves' ophthalmopathy, subacute thyroiditis and Hashimoto's disease, Addison's disease and insulin-dependent diabetes mellitus (type 1).
  • pharmaceutically acceptable vehicle is intended to denote any type of vehicle usually used in the preparation of pharmaceutical and vaccine compositions, that is to say a diluent, synthetic or biological vector, a suspending agent such as an isotonic or buffered saline solution.
  • these compounds will administered systemically, in particular intravenously, intramuscularly, intradermally or orally.
  • Their optimal methods of administration, dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in establishing a treatment adapted to a patient such as for example the patient's age or body weight, the severity of his general condition, tolerance to treatment and side effects observed, etc.
  • the agent when the agent is a polypeptide, an antagonist, a ligand, a polynucleotide, for example an antisense composition, a vector, for example an antisense vector, it can be introduced into host tissues or cells by a number of ways , including viral infection, microinjection, or fusion of vesicles. Jet injection can also be used for intramuscular administration.
  • the invention relates to the use of a cell or an animal according to the invention for the purposes of experimental research for the analysis, study and modeling of molecular, biological, biochemical, physiological and / or physiopathological mechanisms. of the immune reaction in humans and in particular of the antigenic recognition and / or the cellular activation of T cells.
  • These cells can either be isolated freshly from the animal or can be immortalized in culture, either by multiplying the passages, or by transforming the cells with viruses such as the virus. SV40 or the Epstein-Bahr virus.
  • viruses such as the virus. SV40 or the Epstein-Bahr virus.
  • the cells and animals according to the invention are particularly useful for studying the molecular bases necessary for the establishment and development of autoimmune diseases, allergic or inflammatory phenomena, rejection of grafts.
  • the invention relates to the use of a cell or an animal according to the invention for the screening of therapeutically active biological or chemical compounds, in particular of compounds modulating the human immune response.
  • the invention also relates to the use of a genetically modified cell ex vivo according to the invention for the preparation of a cell and or tissue graft for the preventive and curative treatment of a man or an animal requiring such treatment. , characterized in that, when an allogenic host is transplanted with said cell, the latter is less strongly rejected or tolerated than the same cell which has not been genetically modified, by the immune system of said host.
  • said cell is a mouse, pig, bovine, primate cell.
  • it is a pig cell.
  • Such cells are capable of constituting universal and / or personalized donor cells by the nature of the human HLA molecules expressed.
  • the cells of particular interest are Langerhans cells, cells of the adrenal medulla which can secrete dopamine, osteoblasts, osteoclasts, epithelial cells, endothelial cells, T lymphocytes, neurons, glial cells, ganglion cells, kidney cells, retinal cells, embryonic stem cells, liver cells, bone marrow cells and myoblasts.
  • Said cell also expresses at least one protein intended for the preventive and curative treatment of a man or an animal in need of such treatment, said protein preferably being selected from the group composed of cytokines, interleukins, chemokines, factors growth hormones, antibodies.
  • IL2 interleukin 2
  • GM-CSF granulocytes-macrophages colonies stimulating factor
  • the gene coding for beta 2 microglobulin in mice is composed of 4 exons, exon 2 coding for almost all of the protein. Its humanization is carried out by knocking in the second exon coding for the human protein in place of the second murine exon.
  • the homologous recombination vector corresponds to a fragment of genomic DNA at the level of the gene beyond beta 2 murine microglobulin in which exon 2 is replaced by its human counterpart by enzymatic digestion at the level of intronic sites.
  • the CD8 molecule is a heterodimer formed from an alpha subunit and a beta subunit. The two genes coding for these proteins are located on a region of 60 Kb.
  • Hybridization with probes specific to each of the constructs or by any other discriminative method (for example, chromosomal segregation).
  • the two CD8 alpha and CD8 beta genes are invalidated by targeted insertion into the first coding exon of a chimeric cDNA molecule comprising the human extracytoplasmic part associated with a cDNA sequence coding for the transmembrane and intracytoplasmic parts of the murine molecule.
  • the two homologous recombinations are carried out at the same time by co-electroporation of the two vectors to avoid two successive stages of homologous recombination.
  • the selection cassettes are flanked by site-specific recombinases, allowing their elimination once the homologous recombination event has been selected.
  • H2-K is invalidated by deletion of exons 1 and 2.
  • the H2-D gene is invalidated by insertion of a selection cassette flanked by specific sites of the Cre recombinase so as to carry out an exchange.
  • the insertion of one or more selected HLA genes into the H2-D locus is carried out by simple exchange of a cassette containing the human cDNA. Initially, the inventors introduced the cDNA of the HLA-A1 molecule.
  • the ES cells of genetic background 129Sv / J or C57BL / 6J are cultured on layers of feeder cells (embryonic fibroblasts of mouse MEFs) as described previously (Fraîchard et al., 1997).
  • ES cells are trypsinized, washed and resuspended at a concentration of 6.25.10 ES / ml in culture medium without serum and electroporated in the presence of 25 to 50 ⁇ g / ml linearized homology vector.
  • a voltage of 260V associated with a capacitance 500 ⁇ F is optimal for a 4 mm thick electroporation tank.
  • 1 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 6 electroporated ES cells are then seeded on irradiated neo-resistant MEFs. 36 hours after culturing the electroporated ES cells, the selection of the resistant clones begins by adding geneticin (G418 at 250 ⁇ g / ml) to the culture medium.
  • the ES cells are resuspended by adding 10 ⁇ l of sterile H2O. After thermal shock to burst the cells (2 minutes at 65 ° C), 4 ⁇ l are used for the PCR reaction. The recombinant clones isolated by PCR are confirmed by Southern blot.
  • Blastocysts are isolated from female donors C57BL / 6J (Charles River Iffa Credo) 3.5 days after fertilization.
  • the blastocysts are recovered by rinsing the uterine horns with 1 ml of M2 medium. Some blastocysts are deposited in the injection chamber, in a drop of M2 covered with mineral oil. 3 to 5 ES cells are injected into the blastocoel. 4 hours after the injection, 5 to 9 blastocysts are reimplanted in each of the uterine horns of pseudogestant females mated with a vasectomized male 2.5 days previously.
  • the 129Sv / J genetic background ES cells as well as all the mice derived from these ES cells carry the markers characteristic of the strain, that is to say homozygous for the agouti locus A / A giving an agouti colored fur.
  • non-agouti can be quickly assessed at the coat level.
  • the mice obtained have an agouti and black chimeric coat which is very easily identifiable from small, entirely black, derived from host embryos not colonized by ES cells.
  • the recombinant ES cells C57BL / 6J (black) are injected into genetic background blastocysts BALB / c (albino).
  • C57BL / 6J females Males with a high rate of chimerism are mated with C57BL / 6J females.
  • chimeras obtained by injection of C57BL / 6 ES cells are also mated with C57BL / 6J females.
  • the set of the first generation is screened by PCR for the homologous recombination event. Heterozygous animals positive by PCR are systematically confirmed by Southern blot. DNA for genotyping descendants is obtained from mouse tail biopsies.
  • mice expressing human polypeptides involved in the recognition and / or activation of antigen by T cells will be produced independently.
  • the homozygotes and / or heterozygotes for each type of transgenic will then be crossed and the progeny will be tested in order to select the animals expressing the two transgenics.
  • the genetic background of transgenic animals can also be changed by successive crosses with animals of a different genetic background than that used initially.

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Abstract

L'invention se rapporte à une cellule animale, isolée, comprenant au moins un transgène comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance et/ou dans l'activation antigénique par les cellules T, caractérisée en ce que ladite cellule, ou une descendante de ladite cellule, exprime au moins tout ou partie du ou desdits polypeptide(s) humain(s) , et caractérisée en ce que le gène animal endogène homologue codant pour un polypeptide animal homologue audit peptide humain est invalide. L'invention porte également sur l'animal transgénique correspondant. La cellule et l'animal transgénique selon l'invention peuvent être mis en oeuvre dans un procédé de criblage de composés qui modulent une réaction immune chez l'homme. L'invention porte également sur l'utilisation de la cellule selon l'invention comme cellule rendue autologue ou tolérée par le système immunitaire.

Description

Cellule et animal transgénique modélisant la présentation antigénique humaine et leurs utilisations
La présente invention concerne le domaine de la biologie et plus particulièrement le domaine de la transgenèse animale et de l'immunologie. L'invention se rapporte à une cellule animale, isolée, comprenant au moins un transgène comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou dans l' activation cellulaire des cellules T, caractérisée en ce que ladite cellule, ou une descendante de ladite cellule, exprime au moins tout ou partie du ou desdits polypeptide (s) humain (s), et caractérisée en ce que le gène animal endogène homologue codant pour un polypeptide animal homologue audit polypeptide humain est invalide. L'invention porte également sur l'animal transgénique correspondant. La cellule et l'animal transgénique selon l'invention peuvent être mis en œuvre dans un procédé de criblage de composés qui modulent une réaction immune chez l'homme. L'invention porte également sur l'utilisation de la cellule selon l'invention comme cellule autologue ou tolérée par le système immunitaire pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de patients nécessitant une greffe cellulaire et/ou tissulaire. La reconnaissance d'un antigène par les cellules T fait intervenir un complexe tripartite composé des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) situées à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (APC), le peptide antigénique et le récepteur des cellules T (TCR) . Ainsi, pour avoir une activation lymphocytaire T, il est nécessaire que le peptide soit correctement apprêté par les APC, puis associé aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) (nommées H-2 chez la souris, HLA chez l'homme) et enfin exprimé à la surface des APC, pour que le complexe peptide-CMH présenté puisse être reconnu par le TCR spécifique.
Les molécules de CMH sont constituées de deux chaînes α et β. Chacune de ces chaînes pouvant être codée par différents allèles présents sur le bras court du chromosome 6 (6p21.3) chez l'homme. Les loci codant pour les gènes des molécules de classe II sont centromériques et sont situés dans la région HLA-D (environ 900 kb) . HLA-A contient au moins 20 gènes de classe II dont 9 sont fonctionnels : DPB1, DPA1, DQBl, DQB2, DRB1, DRB2, DRB4, DRB5, DRA. La région de classe I (environ 1600 kb) contient environ 20 gènes de classe
I dont 8 sont officialisés par une nomenclature précise
(A, B, C, D, E, F, G, H, J) ; seuls les produits A, B,
C sont extensivement étudiés. Au niveau structural, les molécules du CMH de classe I sont formées d'une chaîne α associée de façon non covalente à un polypeptide, la bêta 2 microglobuline (β2m) .
Le polymorphisme HLA représente les variations au sein d'un locus dans une population. Chaque variation représente un allèle HLA. Par exemple, l'association d'une chaîne α avec une chaîne β permet l'expression d'une protéine de CMH de classe II fonctionnelle, possédant un site de liaison peptidique où vont se concentrer la majorité des variations polymorphes.
Ce phénomène, défini comme la restriction génique, influence les interactions peptide-CMH et explique en partie que certains individus répondent ou non à un antigène donné. Les modèles animaux (souris) ont permis dans un premier temps d'étudier la nature de la réponse immune mise en place (par exemple, Thl versus Th2, réponse cellulaire versus humorale...) . Cependant, ils ont montré leurs limites notamment dans les études de recherche d'un "candidat vaccinal" qui soit extrapolable à l'homme. Pour contourner en partie la restriction génique du CMH, des souris transgéniques exprimant un allèle donné du CMH ont été utilisées. Dans la plupart des cas, ces modèles ont été obtenus par transgenèse classique. Ceci signifie que le gène codant pour la molécule HLA est intégré de façon aléatoire dans le génome de la souris, l'effet du site d'intégration sur l'activité biologique du transgène ne pouvant pas être ignoré. De plus, ces premiers modèles obtenus par transgenèse classique effectuée pour des souris sauvages, expriment en plus de la molécule du CMH humain, les molécules du CMH murines endogènes. La réaction immune observée en réponse à un protocole de vaccination reflète alors la présentation de l'antigène par l'ensemble de ces deux types de molécules du CMH, humaine et urine. Une alternative à ce problème a consisté à croiser des souris transgéniques avec des souris présentant une inactivation ciblée de gènes du CMH murin (CMH I : Pascolo et al . , 1997 ; CMH II : Ito et al . , 1996) . Ces modèles, qui ne prennent en compte qu'un HLA donné, sont très réducteurs car naturellement un même individu exprime différents HLA. De plus, ces modèles ne sont pas pertinents car le transgène codant pour le HLA humain est intégré de manière aléatoire dans le génome, une telle intégration ayant nécessairement des conséquences sur la régulation et l'expression des gènes endogènes du site d'intégration ainsi que sur la régulation fine de l'expression du transgène. Ainsi, il existe un réel besoin de disposer d'animaux (souris ou autres) multi-transgéniques pour plusieurs molécules de CMH de classe I et/ou de classe II humaines décrites comme les plus représentatives d'une population donnée ; ces animaux constitueraient des outils d'une valeur considérable pour une pré-évaluation de la capacité de certaines molécules à déclencher une réponse immune chez l'homme. C'est le problème technique que se propose de résoudre la présente invention. Afin de contourner les restrictions précitées, les inventeurs se proposent d'introduire plusieurs allèles HLA humains dans le génome d'animaux de laboratoire, de préférence chez la souris, et de couvrir ainsi un large éventail de la restriction génique humaine lié au CMH. De préférence, les modèles de souris HLA multigéniques développées par les inventeurs expriment une à deux molécules HLA de classe I et/ou de classe II. En effet, l'association d'une molécule HLA de classe I et d'une à deux molécules HLA de classe II dans le même modèle serait un outil appréciable pour des études de vaccinologie. En effet, les molécules de classe I du CMH vont présenter les peptides exogènes aux lymphocytes T CD8 , responsables d'une réponse de type CTL (lymphocytes T cytotoxiques) . Les molécules HLA de classe II vont présenter des peptides aux lymphocytes T CD4 qui, suite à leur activation, vont produire des cytokines et permettront ainsi le développement d'une réponse immune cellulaire et/ou humorale. En disposant d'un animal transgénique pour des molécules de classe I et II humaines, les deux composantes nécessaires à l'étude d'une réponse immune seront réunies, et le modèle obtenu permettra d'étudier un antigène (restreint classe I ) en association avec un peptide (restreint classe II) qui favorise le développement d'une réponse T globale. Malgré le fait que toutes les étapes précédant la présentation antigénique (apprêtement de l'antigène...) restent entièrement " urinisé", un tel modèle double transgénique présente une amélioration forte de sa relevance biologique.
Les inventeurs se proposent de supprimer l'expression des CMH murins afin de ne laisser s'exprimer que les gènes HLA humains introduits, augmentant d'autant la qualité du modèle. La technologie d'insertion ciblée (Knock-In) , par exemple, est utilisée dans cette optique et évite les inconvénients d'une insertion aléatoire du transgène obtenue par transgenèse classique par microinjection d'ADN dans le pronucleus par exemple. Ainsi, les molécules du CMH murins seront invalidées en même temps que les molécules HLA humaines seront introduites . Ces gènes humains en lieu et place de leurs équivalents murins bénéficient de la régulation endogène s 'exerçant normalement sur l'expression des molécules du CMH pendant le développement d'une réponse immune.
Par cette même technique d'insertion ciblée, les inventeurs proposent d'humaniser la molécule β2m pour éliminer les possibilités d'association entre molécules HLA classe I humaine et β2m murine. La présentation d'antigène restreint aux molécules du CMH de classe I sera alors le plus proche possible de celle observée dans des cellules humaines. Enfin, toujours dans l'optique d'augmenter la pertinence du modèle en fonction de ces applications potentielles, les inventeurs se proposent d'humaniser, en plus des molécules du CMH, d'autres molécules jouant un rôle important dans la reconnaissance des antigènes comme les co-récepteurs CD4 et CD8. Il a été démontré que les molécules CD4 et CD8 s'associent sous forme d'un complexe quaternaire avec le complexe TCR-CMH- peptide. Cette association n'a pas lieu dans des conditions satisfaisantes entre des molécules xénogéniques, ceci a été mis en évidence dans les premiers modèles de souris transgéniques portant un HLA humain incapable d' interagir avec le CD4 murin
(Barzaga-Gilbert et al . , 1992). Les molécules CD4 et
CD8 engagées conjointement avec le TCR dans la liaison des complexes CMH-peptide peuvent stimuler des signaux intracellulaires essentiels dans le processus d' activation lymphocytaire . C'est pourquoi, l'invention concerne également un modèle de souris multi- transgénique HLA dans lequel est introduit par insertion ciblée dans le locus murin CD4 et CD8 correspondant, un gène chimère codant de préférence pour la partie extracellulaire de la molécule CD4 ou CD8 humaine et pour la partie transmembranaire et intracellulaire de la molécule murine ; la reconnaissance CMH/CD4 ou CD8 est donc, dans un tel modèle animal, humaine, alors que la transduction du signal au sein du lymphocyte T est murine.
La présente invention se propose donc de fournir des modèles animaux, de préférence de souris, HLA multi-transgéniques humanisées pour toutes les molécules jouant un rôle clé dans l'initiation d'une réponse immune, tout en préservant la signalisation dans le lymphocyte T murin. L'invention vise donc à fournir une collection d'animaux de laboratoire multi- transgéniques HLA dans différents fonds génétiques qui seront autant de modèles expérimentaux pour une pré- évaluation de molécules d'intérêt (antigènes ou autres). L'évaluation ainsi réalisée sera très pertinente dans la mesure où la présentation de l'antigène se fera dans un contexte humanisé de manière optimale . Les modèles selon l'invention constituent des modèles raffinés utiles à l'étude de la tolérance antigénique (induction ou rupture) , la vaccinologie, les phénomènes allergiques et/ou inflammatoires
(hypersensibilité retardée) . Les animaux multi- transgéniques HLA selon l'invention permettront également de reproduire des modèles expérimentaux de pathologies auto-immunes décrites chez l'homme et associées à un ou plusieurs HLA donnés : par exemple en faisant exprimer des HLA qui sont observés en déséquilibre de liaison dans des populations et associés à des phénotypes de pathologie auto-immune. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à une cellule animale, isolée, comprenant au moins un transgène comprenant au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou dans l' activation cellulaire des cellules T, caractérisée en ce que ladite cellule, ou une descendante de ladite cellule, exprime au moins tout ou partie du ou desdits polypeptide (s) humain (s), et caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique est intégrée de manière stable dans le génome de ladite cellule par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'au moins un, de préférence deux allèles dudit gène animal endogène, l'intégration de ladite séquence invalidant ledit gène animal endogène homologue .
Par polypeptide homologue au sens de la présente invention, on entend désigner des polypeptides d'espèces animales différentes, l'un étant humain, ayant facultativement une homologie de séquence substantielle et codant pour des polypeptides fonctionnellement équivalent dans les deux espèces animales .
Par polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou dans l' activation cellulaire des cellules T, on entend désigner l'ensemble des molécules impliquées dans la reconnaissance antigénique et/ou dans l' activation cellulaire des lymphocytes T. Par reconnaissance antigénique, on entend désigner la présentation de l'antigène aux cellules T par une molécule du CMH entraînant une activation desdites cellules T et donc l'initiation et le développement d'une réponse immune.
Par activation cellulaire des lymphocytes T, on entend désigner l'ensemble de la cascade réactionnelle, induite suite à l'amorçage ("priming") de la réponse immune ou pathologique.
Le polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance et/ou l' activation antigénique par les cellules T est sélectionné dans le groupe composé des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité
(HLA) , de la β2-microglobuline, les chaînes des récepteurs des cellules T (TCR) , les polypeptides du complexe CD3, des co-récepteurs CD4 et CD8, les molécules costimulatrices ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, LFA- 1, CD28, CD80, CD86, CD40, CD40L, CD5, CD72, CTLA-4, CD2, LFA-3. Plus précisément, ledit antigène du complexe majeur d'histocompatibilité est sélectionné dans le groupe composé des antigènes HLA de type I, de type II, de type III. De préférence, mais de manière non limitative, ledit polypeptide humain est un antigène HLA de classe I humain qui est choisi de préférence parmi les antigènes HLA de classe I humain fonctionnels, de manière plus préférée dans le groupe composé de HLA-A2, HLA-A24, HLA-Al, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-B44, HLA- B8, HLA-B35, HLA-Cw7, HLA-Cw3 et ledit polypeptide animal homologue invalidé est un antigène animal du CMH I qui est de préférence une molécule du CMH de classe I animal fonctionnel. De manière plus préférée, l'animal est la souris. L'antigène murin du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I invalidé est donc choisi en fonction du fond génétique murin. Ainsi, les antigènes H2K et H2D sont de préférence inactivés chez les souris de souche 129 ou C57/B16, et l'antigène H2L chez les souris Balb/c.
De préférence, mais de manière non limitative, ledit polypeptide humain est un antigène HLA de classe II humain qui est choisi de préférence parmi les antigènes HLA de classe II humains fonctionnels, de manière plus préférée dans le groupe composé de HLA- DR4, HLA-DR1, HLA-DRU, HLA-DR7, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA- DQ8, HLA-DQ3, HLA-DP4 et ledit polypeptide animal homologue invalidé est un antigène animal du CMHII qui est de préférence une molécule du CMH de classe II animal fonctionnel. L'animal étant de préférence une souris consanguine ("In bred"), l'antigène murin du CMH II a invalider est choisi en fonction du fond génétique murin ; ainsi, l'antigène I-E bêta, qui n'est pas exprimé et donc non fonctionnel dans la souche murine 129, n'est pas choisi lorsque la transgenèse ciblée est réalisée dans la souche 129. De préférence, les antigènes I-A alpha, I-A bêta et I-E alpha sont invalidés dans les souris 129.
L' invention peut être réalisée dans n' importe quelle cellule de mammifère compétente pour la recombinaison homologue. De préférence, il s'agit de cellules de rongeurs, notamment de souris, de rat, de hamster, de cobaye. De préférence, il s'agit de cellules de souris. Alternativement, il s'agit de cellules de primates - dont les cellules humaines -, tels que les singes, chimpanzés, macaques, babouins. Il peut également s'agir de cellules de bovins, de caprins, d'ovins, de porcins, notamment de mini-porcs, d'équidés tels que le cheval, de lagomorphes tels que le lapin.
Les cellules selon l'invention peuvent être définies fonctionnellement comme étant capables de réaliser la recombinaison homologue du ou des fragment (s) d'ADN exogène qui contient au moins une, de préférence deux, région (s) ayant des homologies de séquences avec une séquence d'ADN cellulaire endogène. De telles cellules contiennent naturellement des recombinases endogènes ou ont été génétiquement modifiées pour en contenir ou pour contenir les composés nécessaires pour réaliser la recombinaison de l'ADN.
De manière préférée, parmi les cellules selon l'invention, il convient de citer tous les types cellulaires exprimant naturellement des protéines spécifiques impliquées dans la reconnaissance et/ou 1' activation antigénique par les cellules T. Il convient de citer les cellules du système immunitaire, les cellules présentatrices de l'antigène professionnelles et non professionnelles, les cellules souches hématopoïétiques .
Parmi ces cellules, il convient de citer les cellules du système immunitaire et de manière non exhaustive, les lymphocytes T matures et immatures, les thymocytes, les cellules dendritiques, les lymphocytes intra-épithéliaux, les cellules NK, les lymphocytes B, les basophiles, les mastocytes, les macrophages, les éosinophiles, les monocytes, les plaquettes, les cellules de Langerhans, les cellules dendritiques, les cellules présentatrices de l'antigène professionnelles et non professionnelles. Les cellules selon l'invention peuvent également être par exemple des cellules neuronales . Il convient également de citer les cellules qui dans certaines conditions de culture, ou après différenciation ou manipulation génétique sont capables d' exprimer des protéines spécifiques impliquées dans la reconnaissance et/ou l' activation antigénique par les cellules T. On peut citer les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches embryonnaires totipotentes (cellules ES) ou pluripotentes . Ces cellules souches peuvent se différencier en une cellule exprimant les protéines spécifiques selon l'invention. Par cellules souches, on entend désigner tous les types de cellules indifférenciées multipotentes ou pluripotentes, cultivables in vitro de façon prolongée sans perdre leurs caractéristiques, et qui sont susceptibles de se différencier en un ou plusieurs types cellulaires lorsqu' elles sont placées dans des conditions de culture définies. Ainsi, lorsque la cellule selon l'invention est une cellule ES ou une cellule hematopoïetique, on peut envisager d'induire la différenciation de celle-ci en différents types cellulaires susceptibles d' exprimer la ou les protéines spécifiques de la reconnaissance et/ou de l' activation antigénique par les cellules T, telles par exemple les cellules du système immunitaire, et plus précisément les mastocytes, les basophiles, les monocytes, les éosinophiles, les lymphocytes T matures et immatures, les thymocytes, les cellules dendritiques, les cellules NK, les lymphocytes B, les cellules de Langerhans, les plaquettes, les monocytes, les cellules dendritiques, les cellules présentatrices de l'antigène professionnelles et non professionnelles. Lorsqu'il est nécessaire d'employer des cellules souches embryonnaires (ES) , pour la production de l'animal transgénique selon l'invention par exemple, une lignée cellulaire de cellules ES peut être employée ou des cellules embryonnaires peuvent être obtenues fraîchement à partir d'un animal hôte selon l'invention, en général d'une souris, d'un rat, d'un hamster, d'un cobaye. De telles cellules sont cultivées sur une couche de fibroblastes nourriciers appropriés ou sur de la gélatine, en présence de facteurs de croissance appropriés tels que du facteur inhibiteur de leucémie (LIF pour « Leukemia Inhibitory Factor ») .
Plus généralement les cellules selon l'invention correspondent à toutes les cellules animales, de préférence de mammifères, à l'exception des cellules humaines. Des exemples de cellules de mammifères compétentes pour la recombinaison comprennent donc les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les cellules habituellement cultivées en laboratoire telles les cellules Hela, les cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary ») , Dorris, AE7, D10.64, DAX, Dl.l, CDC25 par exemple.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par transgénique une cellule comportant un transgène. On entend désigner par « transgène » ou par séquence d' acides nucléiques exogène ou par gène exogène du matériel génétique qui a été ou qui va être inséré artificiellement dans le génome d'un mammifère, particulièrement dans une cellule de mammifère cultivée in vitro ou dans une cellule de mammifère vivant, ou qui va se maintenir dans ladite cellule sous forme épiso ale. De manière préférée, le transgène selon la présente invention comprend au moins une séquence susceptible d'être transcrite ou transcrite et traduite en protéine. Le ou les transgènes selon l'invention ou leur expression n' affecte (nt) pas le fonctionnement du réseau biologique du système immunitaire, ni plus généralement le fonctionnement du réseau biologique de la cellule. Le transgène peut être clone dans un vecteur de clonage qui permet d'en assurer sa propagation dans une cellule hôte, et/ou facultativement dans un vecteur d'expression pour assurer l'expression du transgène. Les technologies de l'ADN recombinant utilisées pour la construction du vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention sont celles connues et communément utilisées par les hommes de l'art. Les techniques standard sont utilisées pour le clonage, l'isolement de l'ADN, l'amplification, et la purification ; les réactions enzymatiques impliquant l'ADN ligase, l'ADN polymérase, les endonucléases de restriction sont effectuées selon les recommandations du fabricant. Ces techniques et les autres sont généralement réalisées selon Sambrook et al . , 1989). Les vecteurs incluent des plasmides, les cosmides, les phagemides, les bactériophages, les rétrovirus et autres virus animaux, les chromosomes artificiels, tels les YAC, BAC, HAC et autres vecteurs analogues .
Les méthodes pour générer des cellules transgéniques selon l'invention sont bien connues de l'homme de l'art (Gordon et al . , 1989). Diverses techniques pour transfecter des cellules de mammifères ont été décrites (pour revue, voir Keon et al . , 1990). Le transgène selon l'invention, facultativement compris dans un vecteur linéarisé ou non, ou sous la forme d'un fragment de vecteur, peut être introduit dans la cellule hôte par des méthodes standard telles que par exemple la micro-injection dans le noyau (US 4 873 191) , la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l' electroporation (Lo, 1983) , le choc thermique, la transformation avec des polymères cationiques (PEG, polybrène, DEAE-
Dextran...), l'infection virale (Van der Putten et al . , 1985), le sperme (Lavitrano et al . , 1989).
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cellule transgénique selon l'invention est obtenue par ciblage génique (« gène targeting »)du ou des transgène (s) au niveau d'une ou des séquences du génome de la cellule hôte. Plus précisément, le transgène est inséré de manière stable par recombinaison homologue au niveau de séquences homologues dans le génome de la cellule hôte. Lorsqu'il s'agit d'obtenir une cellule transgénique en vue de produire un animal transgénique, la cellule hôte est de préférence une cellule souche embryonnaire (cellule ES) (Thompson et al . , 1989) .
Le ciblage génique représente la modification dirigée d'un locus chromosomique par recombinaison homologue avec une séquence d'ADN exogène ayant une homologie de séquence avec la séquence endogène ciblée. On distingue différents types de ciblage génétique. Ainsi le ciblage génique peut être utilisé pour modifier, en général augmente l'expression d'un ou de plusieurs gène (s) endogène (s), ou pour remplacer un gène endogène par un gène exogène, ou pour placer un gène exogène sous le contrôle d' éléments de régulation de l' expression génique de gène endogène particulier qui reste actif. Dans ce cas, il le ciblage génique est appelé « Knock-in » (Kl) . Alternativement, le ciblage génique peut être utilisé pour diminuer ou annihiler l'expression d'un ou plusieurs gènes. Il s'agit alors de ciblage génique appelé « Knock-Out » (KO) (voir Bolkey et al . , 1989) .
Selon la présente invention, l'intégration dans le génome de ladite cellule dudit transgène codant pour au moins un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance et/ou l' activation antigénique par les cellules T, constitue un « Knock-in » ; il est réalisé au niveau dudit ou desdits gènes endogènes codant pour un animal homologue codant pour undit ou desdits polypeptide (s) animal (animaux) de telle sorte que ledit transgène invalide l'expression dudit gène endogène. La cellule selon l'invention se caractérise en ce que le transgène est intégré de manière stable dans le génome de ladite cellule, et en ce que son expression est contrôlée par les éléments de régulation du gène endogène. Par intégration de manière stable, on entend signifier l'insertion du transgène dans l'ADN génomique de la cellule selon l'invention. Le transgène ainsi inséré est ensuite transmis à la descendance cellulaire. L'intégration du transgène est réalisée en amont, en aval ou au milieu du gène endogène cible. Selon un mode préféré de réalisation, la cellule selon l'invention exprime un ou plusieurs transgènes, codant chacun pour au moins un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou l' activation cellulaire des cellules T. Pour réaliser la recombinaison homologue, il est nécessaire que le transgène contienne au moins une séquence d'ADN comprenant tout ou partie d'au moins le gène codant pour le polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou l' activation des cellules T, avec éventuellement les modifications génétiques désirées et facultativement un ou plusieurs gènes de sélection positive ou négative, et également des régions d'ADN d' homologie avec le locus cible, de préférence au nombre de deux, situé de part et d'autre de la portion du gène rapporteur. Par «régions d'ADN d'homologies » ou «séquences d'ADN homologues ou substantiellement homologues », on entend désigner deux séquences d'ADN qui, après un alignement optimal et après comparaison, sont identiques pour environ au moins environ 75% des nucléotides, au moins environ 80% des nucléotides, habituellement au moins environ 90% à 95% des nucléotides et, de manière plus préférée, au moins environ 98 à 99,5% des nucléotides. Par «pourcentage d'identité» entre deux séquences d'acides nucléiques au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d' acides nucléiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d' omologie locale de Smith et aterman (1981) , au moyen de l'algorithme d' homologie locale de Neddleman et unsch (1970) , au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lip an (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) . Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250. Le pourcentage d' identité entre deux séquences d' acides nucléiques est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d' acides nucléiques ou d' acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d' acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%, 95%, 98% et 99% après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 85%, de préférence au moins 90%, 95%, 98% et 99% d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. La longueur des régions d' homologie est partiellement dépendante du degré d' homologie. Ceci est dû au fait qu'une diminution de la quantité d' homologie résulte dans une diminution de la fréquence de recombinaison homologue. Si des régions de non homologie existent entre les portions de séquences homologues, il est préférable que cette non homologie ne s'étale pas sur toute la portion de séquence homologue mais plutôt dans des portions discrètes. Dans tous les cas, plus le degré d' homologie est faible, plus la région d' homologie doit être longue pour faciliter la recombinaison homologue. Bien que aussi peu que 14 pb homologue à 100% soient suffisantes pour réaliser la recombinaison homologue dans les bactéries, dans les cellules de mammifère, des portions de séquences homologues plus longues sont préférées, en général. Ces portions font au moins 250 pb, 500 pb, 750 pb, 1 000 pb, 1500 pb, 1750 pb, 2000 pb, 2500 pb, 3000pb, 4000 pb de préférence au moins 5 000 pb pour chaque portion de séquence homologue. Selon l'invention, les fragments d'ADN sont de n'importe quelle taille. La taille minimale requise est subordonnée à la nécessité d'avoir au moins une région d' homologie suffisamment longue pour faciliter la recombinaison homologue. Les fragments d'ADN ont une taille d'au moins environ 2 kb, de manière préférée d'au moins environ 3 kb, 5 kb, β kb.
Le transgène n' est pas limité à une séquence particulière d'ADN. Ainsi les séquences d'ADN d' homologie présentes dans le transgène peuvent être d'une origine purement synthétique (par exemple réalisée en routine à partir d'un synthétiseur d'ADN), ou peuvent dériver de séquences d'ARNm par reverse transcription, ou peuvent dériver directement de séquences d'ADN génomique . Lorsque la séquence d'ADN d' homologie dérive de séquences d'ARN par reverse transcription, celle-ci peut contenir ou non tout ou partie de séquences non codantes telles les introns, selon que la molécule d'ARN correspondante a ou non subi, partiellement ou totalement, un épissage. De préférence, les séquences d'ADN homologue utilisées pour réaliser la recombinaison homologue comprennent des séquences d'ADN génomique plutôt que de l'ADNc. En effet, d'importantes séquences cis-régulatrices présentes dans les introns, les régions distales, les régions promotrices peuvent être présentes. Les séquences dérivant d'ADN génomique codent généralement au moins pour une portion de gène mais peuvent alternativement coder pour des régions non transcrites ou des régions d'un locus génétique non réarrangé telles que les loci des immunoglobulines ou du récepteur des cellules T. Généralement, les séquences d'ADN génomique incluent une séquence codant pour un transcrit d'ARN. De préférence, le transcrit d'ARN code pour tout ou partie d'un polypeptide ; de préférence, il s'agit de polypeptides humains impliqués dans la reconnaissance antigénique et/ou l' activation cellulaire des cellules T. Lorsque le transgène code pour une partie de polypeptide, il s'agit de préférence d'un ou de plusieurs exons ; ainsi, dans le cadre de l'humanisation du gène murin de la bêta-2~ microglobuline, le transgène utilise comprend de préférence un exon ; dans ce cas, le Knock-in est de préférence un échange d' exons. Alternativement, un même transgène peut coder pour plusieurs gènes humains. Dans ce cas, les gènes humains sont de préférence sous la forme d'ADNc et sont placés sous le contrôle de régions promotrices humaines. Lorsque plusieurs gènes humains sont ainsi liés de manière contiguë, ils sont soit disposés sous la forme de multiples entités géniques distinctes, comprenant chacun au moins un promoteur, des séquences régulatrices, une séquence codante, les signaux de terminaison, soit les séquences codantes sont dispersées en CIS, séparées par des « Internai ribosomal entry site » (IRES) et sont placées sous le contrôle d'un même groupe de séquences de régulation de la transcription et de la traduction. De préférence, les IRES sont sélectionnés parmi l'IRES du virus de l'encéphalite du myocarde (EMCV) , du cardiovirus, de l' aphtovirus, de l' entérovirus, du rhinovirus, notamment du rhinovirus humain (HCV) , du virus de l'hépatite A, du poliovirus de type I, du virus de la maladie du pied et de la langue (FMDV, Foot and mouth disease virus) , du virus ECHO, du virus de la leucémie murine (MLV) de cMyc. Selon un mode préféré de réalisation, le transgène comprend au moins une séquence nucléotidique codant pour au moins tout ou partie d' un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou 1' activation cellulaire des cellules T, une cassette de sélection positive encadrée ou non de sites-spécifiques à l'action des recombinases, par exemple une cassette Lox/Néo-TK/Lox ou lox/Néo/lox ou FRT/Néo-TK/FRT ou FRT/Néo/FRT pouvant être également présente en position 5' de la dite séquence nucléotidique, et caractérisé en ce que une cassette de sélection négative contenant par exemple le ou les gènes DTA et/ou TK est présente à au moins une des extrémités du transgène.
Le transgène peut être aussi petit que quelques centaines de paires de bases d'ADNc ou aussi large qu'une centaine de milliers de paires de bases d'un locus génique comprenant la séquence codante exonique- intronique et les séquences de régulation nécessaires à l'obtention d'une expression contrôlée de manière spatio-temporelle. De préférence, le segment d'ADN recombiné a une taille comprise entre 2,5 kb et 1 000 kb. Quoi qu'il en soit, les segments d'ADN recombinés peuvent être inférieurs à 2,5 kb et supérieurs à 1 000 kb. Le transgène de la présente invention est de préférence sous forme native, c'est-à-dire dérivé directement d'une séquence d'ADN exogène présente naturellement dans une cellule animale. Cette séquence d'ADN sous forme native peut être modifiée par exemple par insertion de sites de restriction nécessaires au clonage et/ou par insertion de sites de recombinaison site-spécifiques (séquences lox et flp) • Alternativement, le transgène de la présente invention peut avoir été créé artificiellement in vitro par les techniques de l'ADN recombinant, en associant par exemple des portions d'ADN génomique et/ou d'ADNc. Il s'agit là de transgène chimérique. La séquence d'ADN selon l'invention, sous forme native ou chimérique, peut être mutée en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier. Pour les séquences codantes, ces mutations peuvent affecter la séquence d'acides aminés.
Lorsque les cellules ont été transformées par le transgène, elles peuvent être cultivées in vitro ou bien être utilisées pour produire des animaux transgéniques. Après transformation, les cellules sont ensemencées sur une couche nourricière et/ou dans un milieu approprié. Les cellules contenant la construction peuvent être détectées en utilisant un milieu sélectif. Après un temps suffisant pour laisser les colonies pousser, celles-ci sont récupérées et analysées pour déterminer si un événement de recombinaison homologue et/ou une intégration de la construction s'est produite. Pour réaliser le criblage des clones susceptibles de satisfaire à la recombinaison homologue, des marqueurs positifs et négatifs, encore appelés gènes de sélection, peuvent être insérés dans le vecteur de recombinaison homologue. Différents systèmes de sélection des cellules ayant réalisé l'événement de recombinaison homologue ont été décrits ; il convient de citer le premier système décrit qui utilise des vecteurs de sélection positif/négatif (Mansour et al . , 1988 ; Capecchi, 1989) . Par gène de sélection, on entend désigner un gène qui permet aux cellules qui le possèdent d' être sélectionnées spécifiquement pour ou contre la présence d'un agent sélectif correspondant. Pour illustrer ce propos, un gène de résistance aux antibiotiques peut être utilisé comme un gène marqueur de sélection positif qui permet à une cellule hôte d'être sélectionnée positivement en présence de l'antibiotique correspondant. Une variété de marqueurs positifs et négatifs sont connus de l'homme du métier (pour revue voir brevet US 5 627 059) . Ce gène de sélection peut se trouver soit à l'intérieur ou à l'extérieur du transgène linéarisé. Lorsque le gène de sélection se trouve à l'intérieur du transgène, c'est-à-dire entre les extrémités 5' et 3' du transgène, celui-ci peut être présent sous la forme d'une entité génique distincte du gène codant pour au moins un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et 1' activation cellulaire des cellules T selon l'invention. Dans ce cas, le gène de sélection est lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler son expression ; alternativement le gène de sélection peut être mis sous le contrôle des séquences de régulation de l'expression dudit gène humain. Ces séquences, connues de l'homme du métier, correspondent notamment aux séquences promotrices, facultativement aux séquences activatrices et aux signaux de terminaison de la transcription. Facultativement, le gène de sélection peut constituer un gène de fusion avec le gène humain. Ledit gène de fusion est alors lié de manière opérationnelle avec des séquences d'ADN permettant de contrôler l'expression dudit gène de fusion. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le gène de sélection est situé aux extrémités 5' ou 3' du transgène de sorte que si un événement de recombinaison homologue se produit, le gène de sélection n'est pas intégré dans l'ADN génomique cellulaire; dans ce cas, le gène de sélection est un gène de sélection négatif (pour revue voir brevet US 5 627 059) .
Ledit gène de sélection positive selon l'invention est de préférence choisi parmi les gènes de résistance aux antibiotiques. Parmi les antibiotiques, il convient de citer de manière non exhaustive la néomycine, la tétracycline, l' ampicilline, la kanamycine, la phléomycine, la bléomycine, l' hygromycine, le chloramphenicol, la carbénicilline, la généticine, la puromycine . Les gènes de résistance correspondant à ces antibiotiques sont connus de l'homme du métier ; à titre d'exemple, le gène de la néomycine rend les cellules résistantes à la présence de l'antibiotique G418 dans le milieu de culture. Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène HisD, l'agent sélectif correspondant étant l' histidinol . Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène de la guanine- phosphoribosyl-transférase (GpT) , l'agent sélectif correspondant étant la xanthine . Le gène de sélection positif peut également être sélectionné parmi le gène de l' hypoxanthine-phosphoribosyl-transférase (HPRT) , l'agent sélectif correspondant étant l' hypoxanthine . Ledit gène de sélection négative selon l'invention est de préférence choisi parmi le gène de la 6- thioxanthine ou thymidine kinase (TK) (Mzoz et al . , 1993) , les gènes codant pour des toxines bactériennes ou virales telles par exemple l'exotoxine A de Pseudomonas, la toxine diphtérique (DTA) , la toxine cholérique, la toxine anthrox de Bacillus, la toxine Pertussis, la toxine Shiga de Shigella, la toxine apparentée à la toxine Shiga, les toxines d' Escherichia coli, la colicine A, la d-endotoxine . On peut également citer le cytochrome p450 de rat et la cyclophosphophamide (Wei et al . , 1994), la purine nucléoside phosphorylase d' Escherichia coli (E. coli ) et la 6-methylpurine déoxyribonucléoside (Sorscher et al .- , 1994), les cytosines déaminases (Cdase) ou uracil phosphoribosyl transférase (UPRTase) qui peuvent être utilisées avec la 5-fluorocytosine (5-FC) . Le ou les marqueurs de sélection utilisés pour permettre d' identifier les événements de recombinaison homologue peuvent affecter par la suite l'expression génique, et peuvent être éliminés, si nécessaire, par la mise en œuvre de recombinases site-spécifiques telle la recombinase Cre spécifique des sites Lox (Sauer, 1994 ; Rajewsky et al . , 1996; Sauer, 1998) ou FLP spécifique des sites FRT (Kilby et al . , 1993).
Les colonies positives, c'est-à-dire contenant des cellules dans lesquelles au moins un événement de recombinaison homologue s'est produit sont identifiées par une analyse par southern blotting et/ou par des techniques de PCR. Le taux d'expression, dans les cellules isolées ou les cellules de l'animal transgénique selon l'invention, de l'ARNm correspondant au transgène peut également être déterminé par des techniques comprenant l'analyse par northern blotting, l'analyse par hybridation in si tu, par RT-PCR. Egalement les cellules ou tissus animaux exprimant le transgène peuvent être identifiés en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine rapporteuse. Les cellules positives peuvent ensuite être utilisées pour réaliser les manipulations sur l'embryon et notamment l'injection des cellules modifiées par recombinaison homologue dans les blastocystes . Pour ce qui concerne la souris, les blastocystes sont obtenus à partir de femelles superovulées de 4 à 6 semaines. Les cellules sont trypsinées et les cellules modifiées sont injectées dans le blastocèle d'un blastocyste. Après l'injection, les blastocystes sont introduits dans la corne utérine de femelles pseudo-gestantes . On laisse ensuite les femelles aller jusqu'à leur terme et les portées résultantes sont analysées pour déterminer la présence de cellules mutantes possédant la construction. L'analyse d'un phénotype différent entre les cellules de l'embryon nouveau-né et les cellules du blastocyste ou des cellules ES permet de détecter les nouveau-nés chimériques. Les embryons chimériques sont ensuite élevés jusqu'à l'âge adulte. Les chimères ou animaux chimériques, sont des animaux dans lesquels seule une sous-population de cellules possède un génome altéré. Les animaux chimériques présentant le gène ou les gènes modifiés, sont en général croisés entre eux ou avec un animal de type sauvage afin d' obtenir une descendance hétérozygote ou homozygote. Les hétérozygotes mâles et femelles sont ensuite croisés pour générer des animaux homozygotes. A moins qu'il ne soit indiqué, l'animal transgénique selon l'invention comprend des changements stables de la séquence nucléotidique des cellules de la lignée germinale. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule transgénique non humaine selon l'invention peut servir de cellule donneuse de noyau dans le cadre d'un transfert de noyau ou transfert nucléaire. Par transfert nucléaire, on entend désigner le transfert de noyau d'une cellule vivante donneuse de vertébré, d'un organisme adulte ou au stade fœtal, dans le cytoplasme d'une cellule receveuse énucléée de la même espèce ou d'une espèce différente. Le noyau transféré est reprogrammé pour diriger le développement des embryons clones qui peuvent ensuite être transférés dans des femelles porteuses pour produire les fœtus et les nouveau-nés, ou utilisés pour produire des cellules de la masse cellulaire interne en culture. Différentes techniques de clonage nucléaire sont susceptibles d'être utilisées ; parmi celles-ci, il convient de citer de manière non exhaustive celles qui font l'objet des demandes de brevet WO 95 17500, WO 97 07668, WO 97 07669, WO 98 30683, WO 99 01163, WO 99 37143. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le ciblage génique selon la présente invention constitue un « Knock-In » (K-I) . Le transgène ou le gène exogène ou la séquence nucléotidique selon l'invention codant pour au moins tout ou partie d'un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance et/ou dans l' activation antigénique des cellules T selon l' invention est ciblée par recombinaison homologue dans le génome de l'organisme. Selon un mode préféré de réalisation, la séquence nucléotidique est intégrée de manière stable dans le génome de ladite cellule par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'au moins un allèle dudit gène animal, et son intégration invalide ledit gène animal endogène homologue.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le transgène ou la séquence nucléotidique est dépourvu d'éléments de régulation de l'expression génique et est lié de manière opérationnelle à des séquences de régulation de l'expression dudit gène animal endogène homologue.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, le transgène ou la séquence nucléotidique comprend des éléments de régulation de l'expression génique et est lié de manière opérationnelle à des séquences exogènes de régulation de l'expression. Selon un mode préféré de réalisation, les dites séquences de régulation de l'expression exogènes sont les séquences de régulation de l'expression du dit gène humain codant pour le polypeptide humain.
Le transgène comprend au moins un gène, humain, qui code pour le polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou dans l' activation cellulaire des cellules T. Ledit gène humain comprend soit l'ensemble des séquences contenant l'information pour la production régulée de l'ARN correspondant
(transcription) soit de la chaîne polypeptidique correspondante (transcription-traduction) . Ledit gène humain peut être un gène de type "sauvage" présentant un polymorphisme naturel ou une séquence d'ADN manipulée génétiquement, par exemple ayant des délétions, substitutions ou insertions dans les régions codantes ou non codantes. De manière préférée, le ou les gènes humain (s) sont dépourvus de séquences de régulation nécessaires pour diriger et contrôler leur expression dans un ou des type (s) cellulaire (s) approprié (s) ; en effet, ils sont placés après recombinaison homologue sous le contrôle des séquences animales endogènes de régulation de l'expression du gène endogène animal cible qui demeure de préférence actif suite à l'événement de recombinaison homologue et l'intégration du gène humain.
Alternativement, le transgène selon l'invention peut contenir des séquences de régulation appropriées pour diriger et contrôler l'expression dudit ou desdits protéines humaines impliquées dans la reconnaissance et/ou dans l' activation antigénique par les cellules T dans la cellule. Dans ce cas, le transgène est intégré de manière ciblée ou aléatoire dans le génome, ou est présent sous forme episomale dans la cellule. Dans ce cas de figure, les séquences de régulation appropriées sont des séquences inductibles par une ou plusieurs protéines .
Par éléments de régulation de l'expression du gène, on entend désigner toutes les séquences d'ADN impliquées dans la régulation de l'expression génique c'est-à-dire essentiellement les séquences régulatrices de la transcription, de l'épissage, de la traduction. Parmi les séquences d'ADN régulatrices de la transcription, il convient de citer la séquence promotrice minimale, les séquences amonts (par exemple, la boîte SPl, l'IRE pour « interferon responsive élément »,...), les séquences activatrices (« enhancers ») , éventuellement les séquences inhibitrices (« silencers ») , les séquences insulateurs (« insulator ») , les séquences d'épissage. Ces séquences de régulation de l'expression sont liées de manière opérationnelle au(x) gène (s) humain (s). Une séquence nucléique est « liée de manière opérationnelle » lorsqu'elle est placée dans une relation fonctionnelle avec une autre séquence d' acide nucléique. Par exemple, un promoteur ou un activateur (« enhancer ») est lié de manière opérationnelle à une séquence codante, s'il affecte la transcription de ladite séquence codante. Concernant les séquences régulatrices de la transcription, « lié de manière opérationnelle » signifie que les séquences d'ADN liées sont contiguës, et lorsqu'il s'agit de lier deux régions codantes pour des protéines, contiguës et en phase de lecture. La cellule transgénique et/ou l'animal transgénique non humain selon l'invention est obtenu en introduisant au moins un transgène codant pour un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou dans 1' activation cellulaire des cellules T, dans une cellule, un zygote ou un embryon précoce de l'animal non humain. L'introduction de différents transgènes dans la cellule selon l'invention peut également être réalisée de manière simultanée ou de manière décalée dans le temps. Lorsque la cellule contient plusieurs transgènes, elle peut être obtenue directement par introduction simultanée des fragments d'ADN nécessaires à la recombinaison homologue dans ladite cellule en utilisant des méthodes favorisant la co-transformation de molécules d'ADN multiples. Les cellules sont alors sélectionnées pour les multiples événements de recombinaison attendus en utilisant un système de sélection adapté. Alternativement, la cellule multi- transgénique peut être obtenue en réalisant les événements de recombinaison homologue séparément et de manière décalée dans le temps. Ainsi, la cellule, après introduction d'un premier vecteur de recombinaison homologue, est sélectionnée pour le premier événement de recombinaison homologue, en utilisant un système de sélection adaptée ; cette cellule nouvellement transgénique est ensuite transformée avec un second vecteur de recombinaison homologue, puis sélectionnée pour le second événement de recombinaison homologue en utilisant un système de sélection identique ou différent. Facultativement, cette cellule double transgénique peut ensuite être transformée avec un troisième vecteur de recombinaison homologue, puis sélectionnée pour le troisième événement de recombinaison homologue en utilisant un système de sélection identique ou différent, et ainsi de suite. Alternativement, la cellule double, triple ou multi- transgénique selon l'invention peut être obtenue par croisement successif d'animaux transgéniques. Par exemple, une cellule double transgénique peut être obtenue par croisement de deux animaux simples transgéniques homozygotes ; elle peut être obtenue par croisement puis sélection de deux animaux simples transgéniques hétérozygotes, ou par croisement et sélection d'un animal simple transgénique homozygote et d'un animal simple transgénique hétérozygote.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule selon l' invention se caractérise en ce qu'elle comprend en outre au moins un transgène comprenant au moins tout ou partie d' une séquence nucléotidique codant pour au moins tout ou partie d'un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou l' activation cellulaire des cellules T présent sous forme episomale dans la dite cellule, et en ce que le dit gène animal endogène homologue est invalidé dans la dite cellule. De préférence, le dit gène animal endogène homologue est invalidé par recombinaison homologue ciblée (« knock-out ») . Il est à la portée de l'homme du métier de définir la nature et les caractéristiques du vecteur d' expression utilisé pour permettre le maintien et l'expression sous forme episomale du transgène dans la cellule de l'invention.
Alternativement, la cellule selon l'invention se caractérise en ce qu' elle comprend en outre au moins un transgène comprenant au moins tout ou partie d'une séquence nucléotidique codant pour au moins tout ou partie d'un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou l' activation cellulaire des cellules T intégré de manière aléatoire dans le génome ; dans ce cas, le transgène est de préférence intégré dans une région non codante du génome, sous la dépendance d'éléments de réponse à des protéines impliquées dans la reconnaissance et/ou 1' activation antigénique par les cellules T.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la cellule selon l'invention est caractérisée en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie d'un antigène HLA de classe I humain et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock- In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant le ou les antigènes animaux du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) . Selon un autre mode de réalisation, la cellule selon l'invention est caractérisée en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie des molécules HLA de classe II et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant les antigènes animaux du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH
II) - Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la cellule selon l'invention se caractérise en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie des molécules HLA de classe I et de classe II et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant le ou les antigènes animaux du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) et de classe II (CMH II) . Le dit antigène HLA de classe I humain est choisi dans le groupe composé de HLA-A2, HLA-A24, HLA-Al, HLA- A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B35, HLA-Cw7, HLA-Cw3, et ledit antigène animal du CMH I est choisi parmi H2K, H2D et H2L. Ledit antigène HLA de classe II humain est choisi dans le groupe composé de HLA-DR4, HLA-DR1, HLA-DRU, HLA-DR7, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DQ8, HLA-DQ3, HLA-DP4, et ledit antigène animal du CMH II est choisi parmi I-A alpha, I-A bêta, I-E alpha et I-E bêta. Selon un autre mode de réalisation, la cellule selon l'invention se caractérise en ce que ladite séquence nucléotidique code pour tout ou partie de la β2-microglobuline humaine, et est insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant la β2- microglobuline . Selon un autre mode de réalisation, la cellule selon l'invention se caractérise en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie d' au moins une des polypeptides du complexe CD3 humain et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant pour le ou les polypeptides du complexe CD3.
Selon un autre mode de réalisation, la cellule selon l'invention se caractérise en ce que ladite séquence nucléotidique code pour tout ou partie du polypeptide CD4 humain et est insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD4. Selon un autre mode de réalisation, la cellule selon l' invention se caractérise en ce que ladite séquence nucléotidique code pour tout ou partie du polypeptide CD8 humain et est insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD8.
Selon un autre mode de réalisation, la cellule selon l'invention se caractérise en ce qu'elle comporte (a) ladite séquence nucléotidique codant pour tout ou partie de la β2-microglobuline humaine, insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock- In ») au niveau du gène animal homologue codant la β2- microglobuline ; et/ou (b) ladite séquence nucléotidique codant pour tout ou partie du polypeptide CD4 humain, insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD4 ; et/ou (c) ladite séquence nucléotidique codant pour tout ou partie du polypeptide CD8 humain, insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock- In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD8. Selon un mode préféré de réalisation, seule la partie extracellulaire des polypeptides CD4 et CD8 est humanisée. Optionnellement, la cellule selon l'invention comporte en outre la ou lesdites séquences nucléotidiques codant pour tout ou partie d'au moins une des polypeptides du complexe CD3 humain, insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue
(« Knock-In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant pour le ou les polypeptides du complexe CD3.
La présente invention porte également sur l'animal transgénique non-humain comprenant au moins une cellule selon l'invention. Par « animal transgénique », on entend désigner un animal non humain, de préférence un mammifère choisi dans le groupe des rongeurs et notamment de la souris, du rat, du hamster, du cobaye. La souris est particulièrement appréciée car son système immunitaire a été étudié en profondeur. Alternativement, l'animal transgénique est choisi parmi les animaux d'élevage et notamment les porcins, ovins, caprins, bovins, équidés, notamment le cheval, les lagomorphes, notamment le lapin. L'animal transgénique selon l'invention peut également être choisi parmi les primates, notamment les singes, tels le macaque, le chimpanzé, le babouin.
Compte tenu des polymorphismes génétiques présents dans la population, il peut être intéressant pour analyser ou obtenir une réponse physiologique ou comportementale caractéristique que les animaux transgéniques selon l'invention, et notamment les souris transgéniques selon l'invention présentent des fonds génétiques différents. Ainsi, les souris selon 1' invention peuvent être sélectionnées dans les lignées murines consanguines (« inbred ») 129Sv, 12901a, C57B16, BalB/C, DBA/2, mais également dans les lignées non consanguines (« outbred ») ou des lignées hybrides. L'animal transgénique selon l'invention comprend au moins une cellule dont le génome comprend au moins un transgène ou séquence nucléotidique selon l'invention intégrée par insertion ciblée (« knock-in ») , et facultativement au moins un transgène ou séquence nucléotidique présent soit sous forme d'élément extra- chromosomal, soit intégré de manière aléatoire dans l'ADN chromosomique. De préférence, l'ensemble des transgènes selon l'invention sont intégrés par recombinaison homologue ciblée (« Knock-In ») dans le génome de la cellule selon l'invention. De préférence, l'ensemble des cellules de l'animal et notamment ses cellules de la lignée germinale sont transgéniques.
L'animal transgénique selon l'invention se caractérise en ce que les cellules de son système immunitaire expriment au moins un antigène HLA humain fonctionnel ; les cellules de son système immunitaire peuvent exprimer en outre des molécules co-réceptrices et co-stimulatrices humanisées et fonctionnelles.
L'invention vise également l'utilisation d'une cellule et ou d'un animal selon l'invention pour le criblage de composés modulant la réponse immune humaine. C'est donc un objet de l'invention de fournir un procédé de criblage de composés modulant, c'est-à- dire induisant, stimulant, inhibant, annihilant une réaction immune chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (a) la mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un immunogène responsable du déclenchement d'une réponse immune, (b) la mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un immunogène responsable du déclenchement d'une réponse immune et, de manière simultanée ou décalée dans le temps, avec ledit composé, (c) la détermination et évaluation qualitative, facultativement quantitative, si une réaction immune se produit, (d) puis l'identification du composé qui module sélectivement la réaction immune.
Selon un mode de réalisation, la détermination et/ou l'évaluation de ladite réaction immune est réalisée selon une technique choisie parmi (a) la détermination de la production de facteurs solubles tels que les chimiokines et les cytokines, (b) la détermination de la présence de récepteurs à la surface cellulaire, (c) la détermination de la prolifération cellulaire, (d) la détermination des fonctions effectrices des cellules T (CTL, Helper...) , (e) la détermination de la production d'anticorps par les cellules B. Alternativement, ladite détermination et/ou l'évaluation de ladite réaction immune est réalisée par la mesure du taux d'expression d'un gène rapporteur. Au sens de la présente invention, on entend désigner par gène rapporteur, un gène qui permet aux cellules comportant ce gène d' être détectées de manière spécifique suite à l'expression de ce dernier, c'est-à- dire d'être distinguées des autres cellules qui ne portent pas ce gène marqueur. Ledit gène rapporteur selon l' invention code pour une protéine rapporteuse choisie de préférence dans le groupe composé des protéines auto-fluorescentes, telles que la protéine de fluorescence verte (GFP, pour « Green Fluorescence Protein ») , la protéine de fluorescence verte augmentée (EGFP) , la protéine de fluorescence jaune (YFP pour « Yellow Fluorescence Protein ») , la protéine de fluorescence bleue (CFP, pour « Cyan fluorescence protein ») , la protéine de fluorescence rouge (RFP pour « Red Fluorescence Protein ») , ainsi que les variants de ces protéines de fluorescence obtenues par mutagenèse pour générer une fluorescence de couleur différente. Ledit gène « reporter » code également pour toute enzyme détectable de manière fluorescente, phosphorescente, ou visible par un procédé histochimique sur des cellules vivantes ou toutes autres méthodes d'analyse cellulaire, ou par microscopie. De façon non exhaustive, il convient de citer la β-galactosidase (β-GAL) , la β-glucoronidase
(β-GUS) , la phosphatase alcaline, notamment la phosphatase alcaline placentaire (PLAP) , la déshydrogénase alcoolique, notamment la déshydrogénase alcoolique de drosophile (ADH) , la luciférase, notamment la « Firefly Luciférase », la chloramphénicol-acétyl-transférase (CAT) , l'hormone de croissance (GH) . Enfin, l'invention porte également sur l'utilisation d'une composition comprenant un composé modulant la réaction immune et un véhicule pharmaceutiquement acceptable à titre de médicament pour le traitement préventif et/ou curatif d'un homme ou d'un animal nécessitant un tel traitement, caractérisé en ce que l'aptitude dudit composé à moduler, c'est-à-dire à inhiber, à activer, à annihiler sélectivement la réponse immune est déterminée par (a) la mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un immunogène responsable du déclenchement d'une réponse immune, (b) la mise en contact d'une cellule et/ou d'un animal selon l'invention avec un immunogène responsable du déclenchement d'une réponse immune et, de manière simultanée ou décalée dans le temps, avec ledit composé, (c) la détermination et évaluation qualitative, facultativement quantitative, si une réaction immune se produit, (d) puis l'identification du composé qui module sélectivement la réaction immune. Par antigène au sens de la présente invention, on entend désigner un composé capable de déclencher une réponse immune et/ou d'être reconnu par un anticorps ou un lymphocyte T. Par immunogène, on entend désigner un composé capable de déclencher une réponse immune. Parmi les antigènes qui réagissent avec les récepteurs des cellules T ou avec tous autres types de récepteurs exprimés sur les cellules impliquées dans la mise en place et le développement d'une réponse immune innée ou spécifique, on peut citer les allergènes, les mitogènes, les agents pathogènes, ou l'un de leurs constituants, d'origine virale, bactérienne, parasitaire, fongique, mycoplasmique, les vaccins et compositions vaccinales, les adjuvants, les médicaments, les composés ou agents chimiques. La mise en contact d'un antigène spécifique avec une cellule ou un animal selon l'invention peut se faire par diverses voies telles par exemple une infection classique par un microorganisme pathogène, ou via un vecteur biologique de délivrance (moustique, tique, bactérie, virus et parasites ou agent commensale recombinant, ADN nu...) , par inhalation, en aérosol, par la nourriture. Expérimentalement, l' immunogène peut être mis en contact avec l'animal par une administration par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, contact cutané ou par voie orale. Les composés obtenus par les procédés de criblage de l'invention et qui induisent une réaction immune chez l'homme constituent d'excellent vaccins. Ces composés ainsi identifiés peuvent être par exemple des vaccins à épitope minimal pour des maladies d' origine virale telles que le syndrome d' immunodéficience humaine (SIDA) provoquée par une infection par le VIH
(virus de l' immunodéficience humaine), l'hépatite B, l'hépatite C, pour des maladies d'origine bactériennes telles la tuberculose, ou d'origine parasitaire telle que la malaria.
Le composé obtenu par le procédé de criblage selon l'invention ou la composition selon l'invention peut être utilisée non seulement dans un traitement préventif, mais également dans un traitement curatif d'un certain nombre de pathologies pour lesquelles existent un dysfonctionnement de la reconnaissance antigénique et/ou de l' activation cellulaire des cellules T. C'est le cas notamment dans le contexte d'une infection bactérienne, virale, fongique ou parasitaire ou dans le cas de l'établissement d'un cancer et de maladies auto-immunes . Parmi les maladies auto-immunes, il convient de citer de manière non exhaustive l'uvéite, la maladie de Bechet, la Sarcoïdose, le syndrome de Sjôgren, la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite juvénile, le syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter, la goutte, l' ostéoarthrose, le lupus érythemateux aigu disséminé, la polymyosite, la myocardite, la cirrhose biliaire primitive, la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, la sclérose en plaques et autres maladies démyélinisantes, l'anémie aplasique, le purpura thrombocytopénique essentiel, le myélome multiple et le lymphome à lymphocytes B, le panhypopituitarisme de Simmonds, la maladie de Basedow- Graves et l' ophtalmopathie de Graves, la thyroïdite subaiguë et la maladie de Hashimoto, la maladie d'Addison et le diabète sucré insulino-dépendant (type 1) .
Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions pharmaceutiques et vaccinales, c'est-à-dire un diluant, vecteur synthétique ou biologique, un agent de suspension telle une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. Quand l'agent est un polypeptide, un antagoniste, un ligand, un polynucléotide, par exemple une composition antisens, un vecteur, par exemple un vecteur antisens, on peut l'introduire dans des tissus ou des cellules hôtes par un certain nombre de façons, incluant l'infection virale, la micro-injection ou la fusion de vésicules. On peut également utiliser l'injection par jet pour une administration intramusculaire.
L'invention concerne l'utilisation d'une cellule ou d'un animal selon l'invention à des fins de recherches expérimentales pour l'analyse, l'étude et la modélisation des mécanismes moléculaires, biologiques, biochimiques, physiologiques et/ou physiopathologiques de la réaction immune chez l'homme et notamment de la reconnaissance antigénique et/ou de l' activation cellulaire des cellules T. En fonction du type de recherche que l'on veut développer, on utilise soit l'animal entier, soit des cellules dérivées dudit animal. Ces cellules peuvent être soit isolées fraîchement de l'animal ou peuvent être immortalisées en culture, soit en multipliant les passages, soit en transformant les cellules par des virus tels le virus SV40 ou le virus d' Epstein-Bahr. Ainsi, les cellules et les animaux selon l' invention sont particulièrement utiles pour étudier les bases moléculaires nécessaires à la mise en place et au développement de maladies auto-immunes, des phénomènes allergiques ou inflammatoires, des rejets de greffes.
L'invention concerne l'utilisation d'une cellule ou d'un animal selon l'invention pour le criblage de composés biologiques ou chimiques thérapeutiquement actifs, notamment de composés modulant la réponse immune humaine.
L'invention concerne également l'utilisation d'une cellule génétiquement modifiée ex vivo selon l'invention pour la préparation d'une greffe cellulaire et ou tissulaire pour le traitement préventif et curatif d'un homme ou d'un animal nécessitant un tel traitement, caractérisée en ce que, lorsqu'un hôte allogénique est transplanté avec ladite cellule, celle- ci est moins fortement rejetée ou tolérée qu'une même cellule n'ayant pas été génétiquement modifiée, par le système immunitaire dudit hôte. De préférence, ladite cellule est une cellule de souris, de porc, de bovin, de primate. De manière préférée il s'agit d'une cellule de porc. De telles cellules sont susceptibles de constituer des cellules donneuses universelles et/ou personnalisées par la nature des molécules HLA humaines exprimées. Les cellules particulièrement intéressantes sont les cellules de Langerhans, les cellules de la medulla surrénale qui peuvent sécrétées de la dopamine, les ostéoblastes, les ostéoclastes, les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les lymphocytes T, les neurons, les cellules gliales, les cellules ganglionnaires, les cellules rénales, les cellules de la rétine, les cellules souches embryonnaires, les cellules hépatiques, les cellules de la moelle osseuse et les myoblastes. Ladite cellule exprime en outre au moins une protéine destinée au traitement préventif et curatif d'un homme ou d'un animal nécessitant un tel traitement, ladite protéine étant sélectionnée de préférence dans le groupe composé des cytokines, des interleukines, des chimiokines, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps. Ainsi pour le traitement du cancer, il peut être intéressant de greffer à un patient atteint de cancer des cellules selon l'invention exprimant de l' interleukine 2 (IL2) ou du GM-CSF (« granulocytes- macrophages colonies stimulating factor » ) . Ainsi pour le traitement du diabète, il peut être intéressant de greffer à un patient atteint de diabète des cellules selon l'invention exprimant de l'insuline.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples représentés ci-après.
EXEMPLES MATERIEL ET METHODES
Vecteurs Le gène codant pour la bêta 2 microglobuline chez la souris est composé de 4 exons, l'exon 2 codant pour la quasi totalité de la protéine. Son humanisation est réalisée par knock-in du second exon codant pour la protéine humaine en lieu et place du second exon murin. Le vecteur de recombinaison homologue correspond à un fragment d'ADN génomique au niveau du gène delà bêta 2 microglobuline murin dans lequel l'exon 2 est remplacé par son homologue humain par digestion enzymatique au niveau de sites introniques . La molécule CD8 est un hétérodimère formé d'une sous-unité alpha et une sous-unité bêta. Les deux gènes codant pour ces protéines sont situés sur une région de 60 Kb. Cette proximité oblige les inventeurs à réaliser de manière impérative les knock-in de ces gènes sur le même clone de cellules ES et de vérifier que les deux recombinaisons homologues ont eu lieu sur le même chromosome par FISH (« Fluorescent In Situ
Hybridization ») avec des sondes spécifiques de chacune des constructions ou par toutes autres méthodes discriminatives (par exemple, ségrégation chromosomique) .
Les deux gènes CD8 alpha et CD8 bêta sont invalidés par insertion ciblée dans le premier exon codant d' une molécule d'ADNc chimère comprenant la partie extracytoplasmique humaine associée à une séquence ADNc codant pour les parties transmembranaires et intracytoplasmiques de la molécule murine. Les deux recombinaisons homologues sont réalisées en même temps par co-électroporation des deux vecteurs et ce pour éviter deux étapes successives de recombinaison homologues .
Pour l'ensemble de ces vecteurs, les cassettes de sélection sont flanquées de recombinases sites- spécifiques, permettant leur élimination une fois l'événement de recombinaison homologue sélectionné.
En ce qui concerne les gènes murins codant pour les molécules du CMH de classe I chez la souris, H2-K est invalidé par délétion des exons 1 et 2. Le gène H2-D est invalidé par insertion d'une cassette de sélection flanquée de sites spécifiques de la recombinase Cre de manière à effectuer un échange. L'insertion d'un ou plusieurs gènes HLA choisis, dans le locus H2-D, est réalisée par simple échange de cassette contenant l'ADNc humain. Dans un premier temps, les inventeurs ont introduit l'ADNc de la molécule HLA-A1.
Culture, electroporation et sélection des cellules souches embryonnaires
Les cellules ES de fond génétique 129Sv/J ou C57BL/6J sont cultivées sur couches de cellules nourricières (fibroblastes embryonnaires de souris MEFs) comme décrit précédemment (Fraîchard et al . , 1997) .
Les cellules ES sont trypsinées, lavées et resuspendues à une concentration de 6,25.10 ES/ml dans du milieu de culture sans sérum et électroporées en présence de 25 à 50 μg/ml vecteur d' homologie linéarisé. Un voltage de 260V associé à une capacitance de 500μF est optimal pour une cuve d' electroporation de 4 mm d'épaisseur. lxlO6 à 5xl06 cellules ES électroporées sont ensuite ensemencés sur MEFs Néo résistants irradiés. 36 heures après mise en culture des cellules ES électroporées, la sélection des clones résistants commence par ajout de généticine (G418 à 250 μg/ml) dans le milieu de culture .
Pour la co-électroporation, un mélange équimolaire des deux vecteurs de recombinaison homologue sont électroporés dans les mêmes conditions.
Analyse des clones antibiotiques résistants par criblage par PCR et Southern blot Les clones de cellules ES visibles 10 à 12 jours de culture en présence de G418 sont prélevés.
Les trois quarts des cellules restantes sont mis en culture sur couches de cellules nourricières en plaques 96 puits. Le quart restant est manipulé en plaques 96 puits, ce qui permet l'analyse simultanée de 80 clones.
Les cellules ES sont resuspendues par ajout de 10 μl d'H20 stérile. Après choc thermique pour éclater les cellules (2 minutes à 65°C) , 4 μl sont utilisés pour la réaction de PCR. Les clones recombinants isolés par PCR sont confirmés par Southern blot.
Production de souris chimères par injection de cellules ES dans des blastocystes
Les blastocystes sont isolés à partir de femelles donneuses C57BL/6J (Charles River Iffa Credo) 3,5 jours après fécondation. Les blastocystes sont récupérés par rinçage des cornes utérines avec 1 ml milieu M2. Quelques blastocystes sont déposés dans la chambre d'injection, dans une goutte de M2 recouverte d'huile minérale. 3 à 5 cellules ES sont injectées dans le blastocœle. 4 heures après l'injection, 5 à 9 blastocystes sont réimplantés dans chacune des cornes utérines de femelles pseudogestantes accouplées avec un mâle vasectomisé 2,5 jours auparavant. Les cellules ES de fond génétique 129Sv/J ainsi que toutes les souris dérivées de ces cellules ES portent les marqueurs caractéristiques de la souche c' est-à- dire homozygote pour le locus agouti A/A donnant une fourrure de couleur agouti. La contribution des cellules ES au développement de l'embryon hôte C57BL/6J
(non-agouti) peut être rapidement évaluée au niveau du pelage. En effet, si les cellules ES injectées ont participé au développement embryonnaire présentent les souris obtenues présentent un pelage chimère agouti et noir très facilement identifiable des petits entièrement noirs issus d'embryons hôtes non colonisés par les cellules ES. Suivant le même principe, les cellules ES C57BL/6J (noir) recombinantes sont injectés dans des blastocystes de fond génétiques BALB/c (albino) .
Génération d' animaux hétérozygotes
Les mâles présentant un fort taux de chimérisme sont mis en accouplement avec des femelles C57BL/6J. Pour les chimères obtenues par injection de cellules ES C57BL/6 sont également mise en accouplement avec des femelles C57BL/6J. Dans ce cas, l'ensemble de la première génération est criblé par PCR pour l'événement de recombinaison homologue. Les animaux hétérozygotes positifs par PCR sont systématiquement confirmés par Southern blot. L'ADN pour le génotypage des descendants est obtenu à partir de biopsies de queue de souris.
Génération d' nimaux homozygotes
Mâles et femelles hétérozygotes sont mis en accouplement, les portées sont analysées pour la présence de deux allèles recombinants. Comme attendu, un quart de la descendance sont homozygotes. Ces animaux représentent alors une nouvelle lignée de souris transgéniques. Des souris transgéniques exprimant des polypeptides humains impliqués dans la reconnaissance et/ou 1' activation antigénique par les cellules T seront produites de façon indépendante. Les homozygotes et/ou hétérozygotes pour chaque type de transgénique seront ensuite croisés et la descendance sera testée afin de sélectionner les animaux exprimant les deux transgéniques .
Le fond génétique des animaux transgéniques pourra également être changé par croisements successifs avec des animaux d'un autre fond génétique que celui utilisé initialement . REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule animale, isolée, comprenant au moins un transgène comprenant au moins une séquence nucléotidique codant au moins pour tout ou partie d' un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou dans l' activation cellulaire des cellules T, caractérisée en ce que ladite cellule, ou une descendante de ladite cellule, exprime au moins tout ou partie du ou desdits polypeptide (s) humain(s), et caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique est intégrée de manière stable dans le génome de ladite cellule par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau d'au moins un allèle dudit gène animal endogène, l'intégration de ladite séquence invalidant ledit gène animal endogène homologue .
2. Cellule selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance et/ou l' activation cellulaire des cellules T est sélectionné dans le groupe composé des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité
(HLA) , de la β2-microglobuline, les chaînes des récepteurs des cellules T (TCR) , les polypeptides du complexe CD3, des co-récepteurs CD4 et CD8, les molécules costimulatrices ICAM-1, CD80, CD86, CD40,
CTLA-4, CD28, LFA-3.
3. Cellule selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit antigène du complexe majeur d'histocompatibilité est sélectionnée dans le groupe composé des antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type I, de type II, de type III.
4. Cellule selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique est liée de manière opérationnelle à des séquences de régulation de l'expression dudit gène animal endogène homologue.
5. Cellule selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique est liée de manière opérationnelle à des séquences exogènes de régulation de l'expression.
6. Cellule selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites séquences de régulation de l'expression exogènes sont les séquences de régulation de l'expression dudit gène humain codant pour le polypeptide humain.
7. Cellule selon les revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un transgène comprenant au moins tout ou partie d'une séquence nucléotidique codant pour au moins tout ou partie d'un polypeptide humain impliqué dans la reconnaissance antigénique et/ou l' activation cellulaire des cellules T présent sous forme episomale dans ladite cellule, et en ce que ledit gène animal endogène homologue est invalidé dans ladite cellule.
8. Cellule selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit gène animal endogène homologue est invalidé par recombinaison homologue ciblée (« Knock- Out ») .
9. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie d'un antigène HLA de classe I humain et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock- In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant le ou les antigènes animaux du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I).
10. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie des molécules HLA de classe II et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant les antigènes animaux du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II).
11. Cellule selon l'une des revendications 1 à β, caractérisée en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie des molécules HLA de classe I et de classe II et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue
(« Knock-In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant le ou les antigènes animaux du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) et de classe II (CMH II) .
12. Cellule selon l'une des revendications 9 et 11, caractérisée en ce que ledit antigène HLA de classe I humain est choisi dans le groupe composé de HLA-A2, HLA-A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B27, HLA-B44, HLA- B8, HLA-B35, HLA-Cw7, HLA-C 3, et caractérisée en ce que ledit antigène animal du CMH I est choisi parmi H2K, H2D et H2L.
13. Cellule selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisée en ce que ledit antigène HLA de classe
II humain est choisi dans le groupe composé de HLA-DR4, HLA-DR1, HLA-DRU, HLA-DR7, HLA-DR2, HLA-DR3, HLA-DQ8, HLA-DQ3, HLA-DP4, et caractérisée en ce que ledit antigène animal du CMH II est choisi parmi I-A alpha, I-A bêta, I-E alpha et I-E bêta.
14. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique code pour tout ou partie de la β2-microglobuline humaine, et est insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant la β2-microglobuline .
15. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la ou lesdites séquences nucléotidiques codent pour tout ou partie d' au moins un des polypeptides du complexe CD3 humain et est ou sont insérées par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du ou des gènes animaux homologues codant pour le ou les polypeptides du complexe CD3.
16. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique code pour tout ou partie du polypeptide CD4 humain et est insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD4.
17. Cellule selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique code pour tout ou partie du polypeptide CD8 humain et est insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD8.
18. Cellule selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre : a) ladite séquence nucléotidique codant pour tout ou partie de la β2-microglobuline humaine, insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant la β2-microglobuline ; et/ou b) ladite séquence nucléotidique codant pour tout ou partie du polypeptide CD4 humain, insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD4 ; et/ou c) ladite séquence nucléotidique codant pour tout ou partie du polypeptide CD8 humain, insérée par insertion ciblée par recombinaison homologue (« Knock-In ») au niveau du gène animal homologue codant pour le polypeptide CD8.
19. Cellule selon les revendications 16 à 18, caractérisée en ce que seule la partie extracellulaire des polypeptides CD4 et CD8 est humanisée.
20. Cellule selon les revendications 1 à 19, choisie dans le groupe composé des cellules de souris, rat, hamster, cobaye, lagomorphes, primates, dont l'homme, porcin, ovin, caprin, bovin, cheval.
21. Cellule de souris selon la revendication 20.
22. Cellule selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elles sont sélectionnées parmi les cellules des lignées murines consanguines (« inbred ») 129Sv, 12901a, C57B16, BalB/C, DBA/2, les lignées non consanguines (« outbred ») et les lignées hybrides.
23. Cellule selon les revendications 1 à 22, caractérisée en ce que ladite cellule est choisie parmi les cellules du système immunitaire, les cellules présentatrices de l'antigène professionnelles et non professionnelles, les cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches embryonnaires.
24. Cellule selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite cellule du système immunitaire est choisie parmi tous types de lymphocytes T matures et immatures, les thymocytes, les cellules dendritiques, les lymphocytes intra-épithéliaux, les cellules NK, les cellules B, monocytes, les cellules présentatrices de l'antigène professionnelles et non professionnelles.
25. Cellule souche selon la revendication 23, caractérisée en ce que ladite cellule souche est subséquemment différenciée en une cellule choisie parmi les cellules du système immunitaire selon la revendication 23.
26. Animal transgénique, non humain, comprenant au moins une cellule selon les revendications 1 à 25.
27. Animal selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi la souris, le rat, le hamster, le cobaye, le lapin, les primates, les porcins, les ovins, les caprins, les bovins, le cheval.
28. Animal selon la revendication 27, caractérisé en ce que l'animal est une souris.
29. Animal selon les revendications 26 à 28, caractérisé en ce que les cellules de son système immunitaire expriment au moins un antigène HLA humain fonctionnel .
30. Animal selon la revendication 29, caractérisé en ce que les cellules de son système immunitaire expriment en outre des molécules co-réceptrices et co- stimulatrices humanisées et fonctionnelles .
31. Procédé de criblage d'un composé modulant une réaction immune chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : a) la mise en contact d'une cellule selon les revendications 1 à 25 et/ou d'un animal selon l'une des revendications 26 à 30 avec un immunogène responsable du déclenchement d'une réponse immune ; b) la mise en contact d'une cellule selon les revendications 1 à 25 et/ou d'un animal selon l'une des revendications 26 à 30 avec un immunogène responsable du déclenchement d'une réponse immune et, de manière simultanée ou décalée dans le temps, avec ledit composé ; c) la détermination et évaluation qualitative, facultativement quantitative, si une réaction immune se produit ; d) puis l'identification du composé qui induit sélectivement la réaction immune.
32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que ladite détermination et/ou évaluation de ladite réaction immune est réalisée selon une technique choisie parmi : a) la détermination de la production de facteurs solubles tels que les chimiokines et les cytokines ; b) la détermination de la présence de récepteurs à la surface cellulaire ; c) la détermination de la prolifération cellulaire ; d) la détermination des fonctions effectrices des cellules T (CTL, Helper...) ; e) la détermination de la production d'anticorps par les cellules B.
33. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que ladite détermination et/ou évaluation de ladite réaction immune est réalisée par la mesure du taux d'expression d'un gène rapporteur.
34. Utilisation d'une cellule selon les revendications 1 à 25 et/ou d'un animal selon les revendications 26 à 30 pour l'analyse, l'étude et la modélisation des mécanismes moléculaires, biologiques, biochimiques, physiologiques et/ou physiopathologiques de la réaction immune chez l'homme.
35. Utilisation d'une cellule selon l'une des revendications 1 à 25, et ou d'un animal selon l'une des revendications 26 à 30 pour le criblage de composés modulant la réponse immune humaine.
36. Utilisation d'une cellule génétiquement modifiée ex vivo selon les revendications 1 à 25 pour la préparation d'une greffe cellulaire et ou tissulaire pour le traitement préventif et curatif d'un homme ou d'un animal nécessitant un tel traitement, caractérisée en ce que, lorsqu'un hôte allogénique est transplanté avec ladite cellule, celle-ci est moins fortement rejetée ou tolérée qu'une même cellule n'ayant pas été génétiquement modifiée, par le système immunitaire dudit hôte.
37. Utilisation selon la revendication 36, caractérisée en ce que ladite cellule est une cellule de souris, de porc, de bovin, de primate.
38. Utilisation selon les revendications 36 et 37, caractérisée en ce que ladite cellule selon les revendications 1 à 25 exprime en outre au moins une protéine destinée au traitement préventif et curatif d'un homme ou d'un animal nécessitant un tel traitement, ladite protéine étant sélectionnée dans le groupe composé des cytokines, des interleukines, des chimiokines, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps.
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